BR112013021372B1 - Uso de uma semente de canola produzida pela planta de canola de semente escura para a produção de farelo de canola, farelo de canola e seu método de produção - Google Patents

Abstract

campo compreendendo plantas de canola, uso das referidas plantas, método para a produção de um farelo de canola, farelo de canola, uso do mesmo, método de introdução de um traço em um cultivar de canola, bem como produto de base vegetal. a presente invenção refere-se a um germoplasma de canola, que confere a uma semente de canola os traços de alto teor de proteína e baixo teor de fibras, em que a planta de canola produz uma semana tendo, em média, pelo menos 68% de ácido oleico (c18:1) e menos que 3% de ácido linolênico (c18:3). os traços da semente de canola pode também incluir teor de proteína bruta de pelo menos 45% e de fibra em detergente ácido de não mais do que 18% com base em matéria seca livre de óleo. certas concretizações compreendem ainda um ou mais traços selecionados a partir do grupo constituído por teor polifenólico reduzido e teor aumentado de fósforo. em determinadas concretizações, a invenção diz respeito a plantas de canola compreendendo tal germoplasma e produtos de base vegetal (por exemplo, sementes) gerados a partir destas plantas. as plantas de canola que compreendem um germoplasma da invenção podem exibir características favoráveis de composição da semente que as torna de especial valor como fonte para obtenção de farelo de canola.

Description

Reivindicação de Benefício de Prioridade

[0001] Este pedido de patente reivindica, segundo o estatuto 35U.S.C. § 119(e), o benefício de prioridade deste ao Pedido de Patente U.S. Provisório No 61/445 426, depositado em 22 de fevereiro de 2011, intitulado "Canola Germoplasm Exhibiting Seed Compositional Attributes that Deliver Enhanced Canola Meal Nutritional Value Having Omega-9 Traits" [Germoplasma de canola exibindo atributos na composição da semente para intensificar o valor nutricional do farelo de canela tendo traços de Omega-9].

Campo Técnico da Invenção

[0002] A presente invenção diz respeito a um germoplasma e acultivares de canola. Em algumas concretizações, a invenção diz respeito a um germoplasma de canola tendo atributos na composição do farelo (por exemplo, níveis reduzidos de fatores antinutricionais e níveis aumentados de proteínas) que são modificados independentemente da cor de tegumento da semente. Concretizações específicas dizem respeito a um germoplasma de canola que demonstra cor escura de semente em combinação com, por exemplo, níveis reduzidos de fatores antinutricionais (por exemplo, de fibra em detergente ácido (ADF) e de compostos polifenólicos) e níveis aumentados de proteínas e de fósforo.

Antecedentes da Invenção

[0003] "Canola" refere-se à semente de colza (Brassica spp.) comteor de ácido erúcico (C22:1) de no máximo 2 por cento em peso (quando comparado ao teor de ácidos graxos totais de uma semente),e que produz (depois da trituração) um farelo seco ao ar contendo menos de 30 micromoles (μmol) de glucosinolatos por grama de farelo desengordurado (livre de óleo). Esses tipos de semente de colza se distinguem por sua comestibilidade em comparação a variedades mais tradicionais da espécie. O óleo de canola é considerado um óleo comestível superior por exibir baixos níveis de ácidos graxos saturados.

[0004] Embora o farelo de semente de colza seja relativamente ricoem proteína, seu alto teor de fibra reduz sua digestibilidade e seu valor como ração para animais. Em comparação ao farelo de soja, o farelo de canola e de semente de colza contêm valores mais altos de fibra alimentar e porcentagem mais baixa de proteína. Por causa de seu alto teor de fibra alimentar, o farelo de canola possui cerca de 20% menos energia metabolizável (ME) do que o farelo de soja. Como resultado, o valor do farelo permaneceu baixo em relação a farelos de outras sementes de oleaginosas como farelo de soja, especialmente em rações para suínos e aves. Rakow (2004a) Canola meal quality improvement through the breeding of yellow-seeded varieties - an historical perspective, no AAFC Sustainable Production Systems Bulletin [Boletim de Sistemas de Produção Sustentável do Ministério de Agricultura e de Agroalimentos do Canadá]. Adicionalmente, a presença de glucosinolatos em alguns farelos de canola também diminui seu valor em virtude dos efeitos negativos que esses compostos exercem sobre o crescimento e a reprodução de rebanhos.

[0005] As variedades de canola se diferenciam em parte pela cor dotegumento de suas sementes. A cor do tegumento das sementes é em geral dividida em duas classes principais: amarela e preta (ou marrom escuro). Tonalidades variáveis destas cores, como marrom avermelhado e marrom amarelado, são também encontradas. Foi amplamente observado que, nas variedades de canola com tegumento da semente de cor mais clara, as cascas são mais finas e, consequentemente, contêm menos fibra e mais óleo e proteína do que variedades com tegumentos da semente de cor escura. Stringam et al. (1974) Chemical and morphological characteristics associated with seed coat color in rapeseed, nos Proceedings of the 4th International Rapeseed Congress [Anais do 4o Congresso Internacional de Semente de Colza], Giessen, Alemanha, pág. 99-108; Bell e Shires (1982) Can. J. Animal Science 62:557-65; Shirzadegan e Robbelen (1985) Gotingen Fette Seifen Anstrichmittel 87:235-7; Simbaya et al. (1995) J. Agr. Food Chem. 43:2062-6; Rakow (2004b) Yellow-seeded Brassica napuscanola for the Canadian canola Industry, no AAFC Sustainable Production Systems Bulletin. Uma possível explicação para isso é que a planta de canola pode gastar mais energia na produção de proteínas e óleos, se não houver necessidade desta energia para a produção de componentes fibrosos no tegumento das sementes. Foi também relatado que linhagens de canola de sementes amarelas possuem teor mais baixo de glucosinolatos do que linhagens de canola de sementes pretas. Rakow et al. (1999b) Proc. 10th Int. Rapeseed Congress,Canberra, Austrália, 26-29 de setembro de 1999, cartaz no 9. Dessa forma, historicamente, o desenvolvimento de variedades de canola de sementes amarelas tem sido buscado como uma maneira potencial para aumentar o valor alimentar do farelo de canola. Bell (1995) Meal and byproduct utilization in animal nutrition, em Brassica oilseeds, production and utilization.Eds. Kimber and McGregor, Cab International, Wallingford, Oxon, OX108DE, Reino Unido, pág.301-37; Rakow (2004b), supra; Rakow & Raney (2003).

[0006] Algumas formas da espécie Brassica de sementes amarelas,estreitamente relacionadas à B. napus (por exemplo, B. rapa e B. juncea), demonstraram a presença de níveis mais baixos de fibra em suas sementes e no farelo subsequente. O desenvolvimento de germoplasma de B. napus de sementes amarelas demonstrou que o teor de fibras pode ser reduzido na B. napus através da integração de genes que controlam a pigmentação da semente a partir da espécie Brassica correlata. Contudo, a integração de genes controladores da pigmentação da semente a partir da espécie Brassica correlata em variedades de Brassica com sementes oleaginosas de valor, como variedades de canola, é dificultada pelo fato de múltiplos alelos recessivos estarem envolvidos na herança de tegumentos de sementes de cor amarela nas linhagens de sementes amarelas presentemente disponíveis. Além do mais, a "ondulação deficiente" é também um problema comumente encontrado durante a integração de cor do tegumento de sementes amarelas a partir de outras espécies de Brassica, como juncea e carinata.

[0007] Há muito poucas informações disponíveis sobre o nívelexistente de variabilidade em relação ao teor de fibras no germoplasma de B. napus de sementes escuras, não havendo ainda relatos sobre o desenvolvimento de linhagens de canola de sementes escuras que contenham níveis reduzidos de fatores antinutricionais (por exemplo, de fibra e de compostos polifenólicos) e níveis aumentados de proteínas. Descrição da Invenção

[0008] A presente invenção descreve cultivares de canola (Brassicanapus) de polinização aberta (CL044864, CL065620) e de híbridos (CL166102H, CL121460H e CL121466H), compreendendo um germoplasma que propicia uma nova combinação de alterações na composição do farelo de canola, cujo impacto sobre o valor nutricional foi demonstrado. Em algumas concretizações, plantas de canola compreendendo o germoplasma da invenção podem produzir sementes com, por exemplo, novas combinações de níveis de proteína, fibra e de fósforo de tal modo que esses componentes da semente independam da cor de tegumento da semente. Em concretizações específicas, tais plantas podem produzir sementes com teor mais alto de proteína e mais baixo de fibra do que tipos convencionais de canola, bem como níveis de fósforo que são semelhantes ou mais altos do que os níveis de fósforo em tipos convencionais de canola. Linhagens endogâmicas e híbridas de canola, compreendendo o germoplasma da invenção, podem, em algumas concretizações, incrementar as propriedades nutricionais do farelo quando utilizadas diretamente como ração ou ingrediente alimentar, e/ou quando utilizadas como matéria-prima para o processamento de isolados e concentrados proteicos. Tais sementes podem ser de cor escura (por exemplo, pretas, escuras e mosqueadas) ou de clara.

[0009] Dessa forma, a presente invenção descreve umgermoplasma de Brassica que pode ser usado para obter plantas de canola tendo traços desejáveis nos componentes da semente em maneira independente da cor da semente. Em algumas concretizações, plantas compreendendo tal germoplasma podem ser usadas para produzir um farelo de canola com qualidades nutricionais desejadas. Em concretizações específicas, são providas linhagens endogâmicas de canola (e suas plantas) compreendendo um germoplasma da invenção. Em concretizações adicionais, são providas linhagens híbridas de canola (e suas plantas), tendo uma planta endogâmica de canola compreendendo um germoplasma da invenção como genitor. As variedades de canola da invenção incluem, por exemplo, entre outras: CL044864; CL065620; CL166102H; CL121460H; e CL121466H.

[00010] Concretizações específicas da invenção incluem um germoplasma de canola que confere a uma semente de canola os traços de alto teor de proteína e baixo teor de fibra, em que a planta de canola produz uma semente tendo, em média, pelo menos 68% de ácido oleico (C18:1) e menos que 3% de ácido linolênico (C18:3). Em outras concretizações, uma planta de canola inclui o germoplasma de canola.Sementes produzidas pela planta de canola são também descritas.Concretizações adicionais incluem uma planta de progênie cultivada a partir da semente da planta de canola. Métodos para introduzir em um cultivar de canola ao menos um traço, selecionado a partir do grupo constituído por alto teor de proteína, baixo teor de fibra, pelo menos 68% de ácido oleico (C18:1) e menos que 3% de ácido linolênico (C18:3), em uma maneira independente da cor de tegumento da semente são também descritos.

[00011] A presente invenção também descreve produtos de base vegetal que são obtidos a partir de plantas endogâmicas ou híbridas de canola compreendendo um germoplasma da invenção. Concretizações específicas incluem farelo ou semente de canola obtido a partir de tal planta endogâmica ou híbrida de canola.

[00012] Adicionalmente, são descritos métodos para melhorar o valor nutricional de farelo de canola. Por exemplo, são descritos métodos de introgressão de uma combinação de características na composição de farelo de canola em um germoplasma de Brassica em maneira independente da cor da semente. Em concretizações específicas, um germoplasma da invenção pode ser combinado com um germoplasma de canola, que seja caracterizado por um tegumento amarelo de sementes, para produzir um germoplasma que seja capaz de realçar, no farelo de canola, características desejadas transmitidas por cada um dos germoplasmas.

[00013] As características precedentes e outras se tornarão mais evidentes a partir da descrição detalhada a seguir de diversas concretizações, a qual prossegue com referência às figuras que a acompanham.

Descrição da Invenção dos Desenhos

[00014] A Figura 1 inclui imagens de diversas variedades de canola com cor escura de tegumento das sementes.

[00015] A Figura 2 inclui dados obtidos da análise da composição de sementes de certas linhagens endogâmicas e híbridas de B. napus. As amostras de sementes provinham de estudos replicados em áreas do oeste canadense. Os dados da composição das sementes foram previstos com base no infravermelho próximo (NIR) e, subsequentemente, verificados por meio de métodos químicos de referência.

Modo(s) para Execução da Invenção I. Visão geral de diversas concretizações

[00016] O farelo de canola é a fração restante da semente de canola depois do processo de extração de óleo. O farelo de canola é uma fonte de proteína e, portanto, utilizado em diversas aplicações, incluindo a formulação de rações para animais e o isolamento de concentrados e isolados proteicos de alto valor. A fibra no interior do tegumento de sementes, cotilédones e embriões que resta ao final no farelo limita as taxas de inclusão do farelo de canola em espécies de animais monogástricos e, dessa forma, os farelos de canola tipicamente não fornecem o mesmo valor nutricional que farelos preparados a partir de outras fontes (por exemplo, soja). Formas de sementes amarelas em espécies estreitamente relacionadas à B. napus (por exemplo, B. rapa e B. juncea) demonstraram ter níveis mais baixos de fibra em sua semente e no farelo subsequente. Essa observação motivou tentativas para introduzir o traço de baixo teor de fibra de semente em B. napus em maneira dependente da cor amarela de sementes. O desenvolvimento do germoplasma de B. napus de sementes amarelas demonstrou que o teor de fibra pode ser reduzido em B. napus através dessa abordagem.

[00017] Antes desta invenção, não se pensava que variedades de canola de sementes escuras exibiriam teor de fibra de semente que fosse tão baixo como fora observado em variedades de sementes amarelas. Além disso, linhagens de canola de sementes escuras, contendo níveis reduzidos de fatores antinutricionais (por exemplo, de fibra e de compostos polifenólicos) e níveis aumentados de proteína e fósforo que representassem fontes para farelo melhorado de canola, não foram descritas. Em algumas concretizações, germoplasmas de canola aqui descritos permitem combinar diversos atributos essenciais visando melhorar a composição do farelo, cuja expressão independente da cor de tegumento da semente. Em concretizações específicas, farelos de canola preparados a partir de sementes de canola compreendendo um germoplasma da invenção podem atingir taxas mais altas de inclusão dietética, por exemplo, em dietas para suínos e aves.

[00018] Os germoplasmas da invenção podem ser usados (por exemplo, através de melhoramento genético seletivo) para o desenvolvimento de canola, exibindo traços desejados de componentes da semente, com um ou mais outros traços desejados (por exemplo, composição melhorada do óleo, produção aumentada de óleo, composição modificada de proteínas, teor aumentado de proteína, resistência à doença, resistência a parasitas, resistência a herbicidas, etc.). Os germoplasmas da invenção podem ser usados como germoplasma de partida, mediante o qual alterações adicionais em composição da semente podem ser introduzidas, de tal modo que linhagens e híbridos de canola possam ser desenvolvidos e cujos farelos de canola resultantes tenham maior número de características melhoradas do tipo das descritas neste pedido de patente. II. Abreviações ADF fibra em detergente ácido ADL lignina em detergente ácido AID digestibilidade ileal aparente AME energia metabolizável aparente BSC canola de sementes pretas CP porcentagem de proteína bruta DM concentração de matéria seca ECM farelo de canola melhorado da presente invenção FAME ácido graxo/ésteres metílicos de ácidos graxos GE energia bruta HT Processamento a "Alta Temperatura" LT Processamento a "Baixa Temperatura" NDF fibra em detergente neutro NMR ressonância magnética nuclear NIR Espectroscopia no infravermelho próximo SAE éster do ácido sinápico SBM farelo de soja SER resíduo solúvel extraído SID digestibilidade padronizada TAAA disponibilidade verdadeira de aminoácidos TDF fibra alimentar total TME energia metabolizável verdadeira WF escama branca

III. Termos

[00019] Retrocruzamento: Métodos de retrocruzamento podem ser empregados para introduzir uma sequência de ácido nucleico em vegetais. A técnica do retrocruzamento tem sido amplamente utilizada há décadas para introduzir novos traços em vegetais. Jensen, N., Ed. Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc., 1988.Em um protocolo típico de retrocruzamento, a variedade original de interesse (genitor recorrente) é cruzada com uma segunda variedade (genitor não recorrente) que carrega um gene de interesse a ser transferido. A progênie resultante deste cruzamento é então cruzada mais uma vez com o genitor recorrente, e o processo é repetido até ser obtida uma planta na qual essencialmente todas as características morfológicas efisiológicas desejadas da planta recorrente estejam recuperadas na planta convertida, além do gene transferido do genitor não recorrente.

[00020] Óleo de canola: Óleo de canola refere-se ao óleo extraído a partir de variedades comerciais de semente de colza. Para produzir o óleo de canola, a semente é tipicamente classificada por grau e misturada em elevadores de grãos para produzir um produtoaceitavelmente uniforme.As sementes misturadas são depois esmagadas e o óleo é tipicamente extraído com hexano esubsequentemente refinado. O óleo resultante pode então ser vendido para uso. O teor de óleo é tipicamente medido em porcentagem da semente seca inteira, e teores específicos de óleo são característicos de diferentes variedades de canola. O teor de óleo pode ser rápido e rotineiramente determinado utilizando várias técnicas analíticas, por exemplo, entre outras: NMR; NIR; extração por Soxhlet ou por outros métodos amplamente disponíveis aos técnicos no assunto. Ver Bailey, Industrial Oil & Fat Products (1996), 5th Ed. Wiley Interscience Publication, Nova York, Nova York. A composição percentual de ácidos graxos totais é tipicamente determinada pela coleta de uma amostra de óleo extraído da semente, a produção de ésteres metílicos dos ácidos graxos presentes na amostra de óleo e a análise das proporções dos vários ácidos graxos na amostra por cromatografia gasosa. A composição de ácidos graxos pode também ser uma característica que permite distinguir variedades específicas.

[00021] Comercialmente útil: Neste relatório descritivo, o termo "comercialmente útil" refere-se a linhagens vegetais e de híbridos que possuem vigor vegetal e fertilidade suficientes, de tal modo que uma colheita da linhagem vegetal ou do híbrido possa ser produzida por agricultores usando equipamento agrícola convencional. Em concretizações específicas, produtos de base vegetal com os componentes e/ou as qualidades descritas podem ser extraídos a partir de plantas ou materiais vegetais da variedade comercialmente útil. Por exemplo, óleo que contenha os componentes desejados pode ser extraído a partir da semente de uma linhagem vegetal ou de híbrido utilizando equipamento convencional de esmagamento e extração.Em certas concretizações, uma linhagem vegetal comercialmente útil é uma linhagem endogâmica ou uma linhagem híbrida. As linhagens e os híbridos "agronomicamente elites" possuem tipicamente características agronômicas desejáveis; por exemplo, entre outras: melhorado rendimento de ao menos um produto de base vegetal; maturação; resistência à doença; e menor grau de acamamento (standability).

[00022] Linhagem elite: Qualquer linhagem vegetal resultante do melhoramento genético e da seleção para desempenho agronômico superior. Uma planta elite é qualquer planta derivada de uma linhagem elite.

[00023] Farelo de canola melhorado: Neste relatório descritivo, o termo "farelo de canola melhorado" significa um farelo de canola com composição melhorada, derivado do processamento de sementes de canola que exibem níveis aumentados de proteína e níveis reduzidos de ao menos alguns componentes antinutricionais. O farelo de canola melhorado da presente invenção pode ser variavelmente designado neste relatório descritivo como "ECM", "ECM de canola de sementes pretas", "BSC ECM" ou "DAS BSC ECM". Contudo, a presente invenção não pretende restringir-se exclusivamente ao germoplasma ECM de canola de sementes pretas.

[00024] Essencialmente derivado: Em algumas concretizações, manipulações de vegetais, sementes ou de suas partes podem levar à criação de variedades essencialmente derivadas. Neste relatório descritivo, o termo "essencialmente derivado" adota a convenção apresentada pela International Union for the Protection of New Varieties of Plants (UPOV, União Internacional para a Proteção de NovasVariedades Vegetais): [A] A variedade será considerada essencialmente derivada de outra variedade ("a variedade inicial") quando (i) for predominantemente derivada da variedade inicial, ou de uma variedade que seja ela mesma predominantemente derivada da variedade inicial, ao mesmo tempo em que retendo a expressão das características essenciais da variedade inicial que resultam do genótipo ou da combinação de genótipos da variedade inicial; (ii) se distinguir claramente da variedade inicial; e (iii) exceto no que diz respeito a diferenças que resultam do ato de derivação, corresponder à variedade inicial quanto à expressão das características essenciais da variedade inicial que resultam do genótipo ou da combinação de genótipos da variedade inicial.

(UPOV, VI Reunião com Organizações Internacionais, Genebra, 30 de outubro de 1992 (documento preparado pelo Escritório da União)).

[00025] Produto de base vegetal: Neste relatório descritivo, o termo "produto de base vegetal" refere-se a produtos de base obtidos a partir de um determinado vegetal ou parte vegetal (por exemplo, uma planta compreendendo um germoplasma da invenção, e uma parte vegetal obtida a partir de uma planta compreendendo um germoplasma da invenção). Um produto de base pode ser, por exemplo, entre outros: grão; farelo; proteína; proteína isolada; farinha; óleo; grãos ou sementes esmagados ou inteiros; qualquer produto alimentício compreendendo qualquer farelo, óleo ou grão esmagado ou inteiro; ou silagem.

[00026] Linhagem vegetal: Neste relatório descritivo, uma "linhagem" refere-se a um grupo de plantas que exibem pouca variação genética (por exemplo, nenhuma variação genética) individualmente entre si em relação ao menos a um traço. Linhagens endogâmicas podem ser criadas por várias gerações de autofecundação e seleção ou, alternativamente, por propagação vegetativa a partir de um único genitor utilizando técnicas de cultura de tecido ou celular. Neste relatório descritivo, os termos "cultivar", "variedade" e "tipo" são sinônimos, e estes termos referem-se a uma linhagem que é utilizada para produção comercial.

[00027] Material vegetal: Neste relatório descritivo, o termo "material vegetal" refere-se a qualquer material processado ou não processado derivado, no todo ou em parte, de uma planta. Por exemplo, entre outros, um material vegetal pode ser uma parte vegetal, uma semente, um fruto, uma folha, uma raiz, um tecido vegetal, uma cultura de tecido vegetal, um explante vegetal ou uma célula vegetal.

[00028] Estabilidade: Neste relatório descritivo, o termo"estabilidade" ou "estável" refere-se a um dado componente ou traço vegetal que possa ser herdado e que é mantido em substancialmente o mesmo nível através de múltiplas gerações de sementes. Por exemplo, um componente estável pode ser mantido por pelo menos três gerações em substancialmente o mesmo nível. Nesse contexto, o termo "substancialmente o mesmo" pode referir-se, em algumas concretizações, a um componente mantido dentro de 25% entre duas gerações diferentes; dentro de 20%; dentro de 15%; dentro de 10%; dentro de 5%; dentro de 3%; dentro de 2%; e/ou dentro de 1%, bem como um componente que é mantido em seu estado perfeito entre duas gerações diferentes. Em algumas concretizações, um componente vegetal estável pode ser, por exemplo, entre outros, componente óleo; componente proteína; componente fibra; componente pigmento; componente glucosinolato; e componente lignina.A estabilidade de um componente pode ser afetada por um ou mais fatores ambientais. Por exemplo, a estabilidade de um componente óleo pode ser afetada, por exemplo, entre outros, por: temperatura; localização; estresse; e o tempo de plantio. Gerações subsequentes de uma planta com um componente estável em condições no campo supostamente produzirão o componente vegetal em maneira semelhante, por exemplo, conforme apresentado acima.

[00029] Traço ou fenótipo: Os termos "traço" e "fenótipo" são usados alternadamente neste relatório descritivo.

[00030] Variedade ou cultivar: Os termos "variedade" ou "cultivar" referem-se, neste relatório descritivo, a uma linhagem vegetal que seja utilizada para produção comercial e cujas características sejam distintas, estáveis e uniformes quando propagadas. No caso de uma variedade ou cultivar híbrido, as linhagens genitoras são distintas, estáveis e uniformes em suas características.

[00031] A menos que indicado de outra forma, os termos "um" e "uma", neste relatório descritivo, referem-se ao menos a uma unidade.

IV. Germoplasma de canola que confere traços desejados em componentes da semente em maneira independente da cor da semente

[00032] Em uma concretização preferida, a invenção provê um germoplasma de Brassica que pode ser usado para obter plantas de canola com traços desejáveis em componentes da semente em maneira independente da cor da semente. Adicionalmente, são providas linhagens endogâmicas e híbridas especiais exemplares de canola compreendendo este germoplasma.

[00033] O óleo de canola tem sido em geral reconhecido como um óleo muito saudável, tanto para consumo humano como para animal. Contudo, o componente farelo da semente de canola, que é deixado depois que o componente óleo é extraído, é inferior ao farelo de soja por causa de seu alto teor de fibra e valor nutricional reduzido. Em algumas concretizações, plantas de canola compreendendo um germoplasma da invenção podem abrandar ou superar essas deficiências, e podem fornecer farelos de canola como fonte altamente nutritiva e econômica de ração para animais. O farelo de canola é um subproduto da produção de óleo de canola e, dessa forma, os farelos de canola providos por esta invenção poupam recursos de valor ao permitirem que este subproduto possa ser usado de modo competitivo junto com outros farelos.

[00034] Acreditava-se anteriormente que a cor amarela da semente de canola fosse por si mesma significante, pois segundo supunha-se esta corresponderia a características nutricionais melhoradas do componente farelo obtido depois da extração do óleo. Algumas concretizações podem prover, pela primeira vez, um germoplasma para canola de sementes escuras (por exemplo, sementes escuras, pretas e mosqueadas) com baixo teor de fibra que também propicia um óleo superior com alto teor oleico e baixo linolênico, sendo que este germoplasma também dá origem a um farelo de canola com características nutricionais melhoradas (por exemplo, componentes melhorados da semente). Em algumas concretizações, uma planta compreendendo um germoplasma da invenção podesupreendentemente ainda conferir esses traços combinados a outros traços de valor (por exemplo, entre outros, excelente rendimento, alto teor de proteína, alto teor de óleo e alta qualidade do óleo). Sementes com tegumento escuro, em concretizações específicas, podem ter um tegumento consideravelmente mais fino da semente do que sementes produzidas por variedades padrão de canola de sementes escuras. O tegumento mais fino da semente pode resultar em teor reduzido de fibra no farelo e aumento em óleo e teor de proteína da semente, quando comparados aos níveis de óleo e proteína em uma variedade padrão de sementes escuras. As sementes escuras produzidas por plantas compreendendo um germoplasma da invenção podem, portanto, apresentar concentrações mais altas de óleo e de proteína do que as observadas em sementes produzidas por uma planta de canola padrãode sementes escuras.

[00035] Em concretizações, uma planta compreendendo um germoplasma da invenção não exibe limitações agronômicas substanciais e/ou impostas à semente. Por exemplo, tal planta pode exibir qualidades agronômicas e/ou de semente (por exemplo, germinação; vigor no início da temporada; efeito de tratamentos em sementes; colheita de sementes e potencial de armazenamento) que são ao menos tão favoráveis quanto às exibidas por variedades padrão de canola. Em concretizações específicas, uma planta compreendendo um germoplasma da invenção pode também compreender um ou mais traços favoráveis exibidos por uma linhagem endogâmica pré-existente de canola, por exemplo, entre outros, um perfil favorável de ácidos graxos.

[00036] Em concretizações, uma planta compreendendo um germoplasma da invenção pode produzir sementes compreendendo ao menos uma de diversas características nutricionais. Em concretizações específicas, uma semente produzida por tal planta de canola pode compreender ao menos uma característica nutricional selecionada a partir do grupo constituído por: perfil favorável de óleo; alto teor de proteína; baixo teor de fibra (por exemplo, ADF e NDF (incluindo baixo teor polifenólico)); (baixo teor de fibra e alto teor de proteína conferem nível mais alto de energia metabolizável); alto teor de fósforo; e baixo teor de éster do ácido sinápico (SAE); Em certas concretizações, "alto" ou "baixo" teor de componentes refere-se a uma comparação entre uma semente produzida por uma planta de referência compreendendo um germoplasma da invenção e uma semente produzida por variedades padrão de canola. Dessa forma, uma planta produzindo uma semente com "baixo" teor de fibra pode produzir uma semente com teor mais baixo de fibra do que o observado em uma semente produzida por variedades padrão de canola. E, uma planta produzindo uma semente com "alto" teor de proteína pode produzir uma semente com teor mais alto de proteína do que o observado em uma semente produzida por variedades padrão de canola.

[00037] Em algumas concretizações, um conjunto substancialmente uniforme, montado com uma semente de colza produzida por uma planta de canola compreendendo ao menos uma característica nutricional selecionada a partir do grupo supracitado, pode ser produzido. Tal semente pode ser utilizada para produzir um campo substancialmente uniforme de plantações de colza.Concretizações específicas provêm sementes de canola compreendendo combinações que identificam as características supracitadas. Por exemplo, o teor total combinado de óleo e proteína de uma semente pode ser uma medida útil e característica única da semente.

[00038] Algumas concretizações provêm uma canola (por exemplo, canola de sementes escuras) compreendendo um germoplasma da invenção que seja capaz de produzir óleo de canola com perfil de óleo tipo NATREON ou perfil de óleo "Ômega-9". Um perfil de óleo "tipo NATREON", "semelhante ao NATREON" ou "ômega-9" pode significar teor de ácido oleico em uma faixa de, por exemplo, 68-80%; 70-78%; 71-77%; e 72-75%, com teor de ácido linolênico alfa abaixo de, por exemplo, 3%. Em concretizações específicas, uma semente obtida a partir de uma planta de canola compreendendo um germoplasma da invenção pode produzir óleo contendo acima de 68%, acima de 70%, acima de 71%, acima de 71,5% e/ou acima de 72% (por exemplo, 72,4% ou 72,7%) de ácido oleico, enquanto tendo teor de ácido linolênico inferior a 3%, inferior a 2,4%, inferior a 2%, inferior a 1,9% e/ou inferior a 1,8% (por exemplo, 1,7%). Em concretizações adicionais, contudo, uma canola compreendendo um germoplasma da invenção pode produzir óleos tendo, por exemplo, teor de ácido oleico superior a 80%. Em certas concretizações, um óleo de canola produzido a partir de uma canola compreendendo um germoplasma da invenção pode ser naturalmente estável (por exemplo, não hidrogenado artificialmente). O teor de ácidos graxos de óleo de canola pode ser rápido e rotineiramente determinado de acordo com métodos conhecidos.

[00039] Deste modo, algumas concretizações provêm uma semente de canola (por exemplo, uma semente escura de canola) compreendendo uma fração de óleo e uma fração de farelo, em que a fração de óleo pode ter teor de ácido a-linolênico de, por exemplo, 3% ou menos (em relação ao teor de ácidos graxos totais da semente), e teor de ácido oleico de, por exemplo, 68% ou menos (em relação ao teor de ácidos graxos totais da semente). Por definição, o teor de ácido erúcico (C22:1) de tal semente pode ser inferior a 2% em peso (quando comparado ao teor de ácidos graxos totais da semente). Em exemplos específicos, o teor de óleo de uma semente de canola pode compreender 48%-50% do peso da semente.

[00040] O termo "alto oleico" refere-se à espécie Brassica juncea ou outras de Brassica conforme o contexto possa indicar, com teor de ácido oleico mais alto do que o de uma variedade ou linhagem do tipo selvagem ou outra de referência, mais geralmente este indica uma composição de ácidos graxos compreendendo pelo menos 68,0% em peso de ácido oleico.

[00041] "Saturados totais" refere-se às porcentagens combinadas dos ácidos graxos palmítico (C16:0), esteárico (C18:0), araquídico (C20:0), behênico (C22:0) e tetracosanoico (C24:0). As concentrações de ácidos graxos, discutidas neste relatório descritivo, são determinadas de acordo com procedimentos padrão bem conhecidos pelos técnicos no assunto.A elucidação de procedimentos específicos é apresentada nos exemplos. As concentrações de ácidos graxos são expressas em porcentagem em peso do teor de ácidos graxos totais.

[00042] O termo "estabilidade" ou "estável", neste relatório descritivo, com respeito a um dado componente de ácido graxo geneticamente controlado, significa que o componente de ácido graxo é mantido de geração para geração por pelo menos duas gerações e, de preferência, por pelo menos três gerações em substancialmente o mesmo nível, por exemplo, de preferência ± 5%. Os métodos da invenção são capazes de criar linhagens de Brassica juncea com composições melhoradas de ácidos graxos, estáveis até ± 5% de geração para geração. Os técnicos no assunto entendem que a estabilidade da referência acima pode ser afetada por temperatura, localização, estresse e tempo de plantio. Assim, comparações de perfis de ácidos graxos devem ser efetuadas usando sementes produzidas em condições semelhantes de crescimento.

[00043] Quando o termo "planta Brassica" é usado no contexto da presente invenção, este também inclui quaisquer conversões de um único gene daquele grupo. O termo "planta convertida em um único gene", neste relatório descritivo, refere-se às plantas Brassica que são desenvolvidas por uma técnica de melhoramento genético vegetal que é denominada retrocruzamento, em que essencialmente todas as características morfológicas e fisiológicas desejadas de uma variedade são recuperadas, além do único gene transferido na variedade através da técnica de retrocruzamento. Métodos de retrocruzamento podem ser empregados com a presente invenção para melhorar ou introduzir uma característica na variedade. O termo "retrocruzamento", neste relatório descritivo, refere-se ao cruzamento repetido de uma progênie híbrida de volta com o genitor recorrente, ou seja, o retrocruzamento uma ou mais vezes com o genitor recorrente (identificado como "BC1", "BC2", etc.). A planta Brassica genitora que contribui com o gene para as características desejadas é denominada "genitor não recorrente" ou "genitor doador". Essa terminologia refere-se ao fato de que o genitor não recorrente é usado uma vez no protocolo do retrocruzamento e, por conseguinte, não recorre. A planta Brassica genitora para a qual o gene ou genes do genitor não recorrente são transferidos é conhecida como genitor recorrente, pois é usada para vários ciclos no protocolo de retrocruzamento (Poehiman & Sleper, 1994; Fehr, 1987). Em um protocolo típico de retrocruzamento, a variedade original de interesse (genitor recorrente) é cruzada com uma segunda variedade (genitor não recorrente) que carrega o gene único de interesse a ser transferido. A progênie resultante deste cruzamento é depois cruzada novamente com o genitor recorrente, e o processo é repetido até que uma planta Brassica seja obtida na qual essencialmente todas as características morfológicas e fisiológicas desejadas do genitor recorrente sejam recuperadas na planta convertida, além do gene único transferido a partir do genitor não recorrente, conforme determinado no nível de significância de 5%, quando cultivada nas mesmas condições ambientais. Neste pedido de patente, o termo "Brassica" pode compreender todas ou quaisquer das espécies incluídas no gênero Brassica, incluindo Brassica napus, Brassica juncea, Brassica nigra, Brassica carinata, Brassica oleracea e Brassica rapa.

[00044] Brassica juncea de canola, neste pedido de patente, refere- se à Brassica juncea que produz sementes com qualidade de óleo e farelo que atende às exigências para designação comercial como óleo ou farelo de "canola", respectivamente (ou seja, plantas da espécie Brassica juncea que possuem menos que 2% de ácido erúcico (Δ13-22:1), em peso no óleo da semente e menos de 30 micromoles de glucosinolatos por grama de farelo livre de óleo).

[00045] Em um aspecto, a invenção provê plantas Brassica, taiscomo plantas Brassica juncea, capazes de produzir sementes com teor de ácidos graxos endógenos compreendendo alta porcentagem de ácido oleico e baixa porcentagem de ácido linolênico em peso. Em concretizações específicas, o ácido oleico pode compreender mais de aproximadamente 68,0%, 69,0%, 70,0%, 71,0%, 72,0%, 73,0%, 74,0%, 75,0%, 76,0%, 77,0%, 78,0%, 79,0%, 80,0%, 81,0%, 82,0%, 83,0%, 84,0% ou 85,0%, incluindo todos os números inteiros e suas frações ou qualquer número inteiro com valor maior que 85% de ácido oleico. Em concretizações específicas, o teor de ácido linolênico dos ácidos graxos pode ser inferior a aproximadamente 5%, 4%, 3%, 2,5%, 2,0%, 1,5%, 1,0%, 0,5% ou 0%, e incluindo todos os números inteiros e suas frações. Em uma concretização exemplar, a planta é Brassica juncea, cujas sementes possuem teor de ácidos graxos endógenos compreendendo pelo menos 68% de ácido oleico em peso e menos que 3% de ácido linolênico em peso. Em uma concretização adicional, a planta é uma planta Brassica juncea cujas sementes possuem teor de ácidos graxos endógenos compreendendo pelo menos 68,0% de ácido oleico em peso e no máximo aproximadamente 5% de ácido linolênico em peso.

[00046] Em um aspecto, a invenção provê plantas Brassica, tais como plantas Brassica juncea, capazes de produzir uma semente com teor de ácidos graxos endógenos que compreende alta porcentagem de ácido oleico e baixa porcentagem de ácido linolênico em peso e baixo teor de ácidos graxos saturados totais ou alto teor de ácidos graxos saturados totais, o qual pode compreender menos de aproximadamente 5,5% de ácidos graxos saturados totais ou >10% de ácidos graxos saturados totais, respectivamente.

[00047] É sabido que a composição de óleo proveniente de sementes de Brassica juncea difere daquela de Brassica napus em termos de componentes de ácidos graxos (por exemplo, teor mais alto de ácido erúcico), óleos essenciais (por exemplo, isotiocianato de alila) e constituintes secundários (por exemplo, tocoferóis, metais, taninos, fenólicos, fosfolipídeos, corpos coloridos e os semelhantes). Óleos em sementes (incluindo óleos extraídos) de Brassica juncea demonstraram estabilidade oxidativa mais alta quando comparados a óleos derivados de Brassica napus, ainda que óleos derivados de Brassica juncea contenham tipicamente níveis mais altos de C18:3. (C. Wijesundera et al., "Canola Quality Indian Mustard oil (Brassica juncea) is More Stable to Oxidation than Conventional Canola oil (Brassica napus)," J. Am. Oil Chem. Soc. (2008) 85:693-699).

[00048] Em um aspecto alternativo, a invenção provê métodos para aumentar o teor de ácido oleico e reduzir o teor de ácido linolênico de plantas Brassica. Tais métodos podem envolver: (a) induzir a mutagênese em pelo menos algumas células de uma linhagem de Brassica que tenha teor de ácido oleico superior a 55% e teor de ácido linolênico inferior a 14%; (b) regenerar plantas a partir de ao menos uma das referidas células transformadas por mutagênese e selecionar plantas regeneradas que contenham teor de ácidos graxos compreendendo pelo menos 68% de ácido oleico (ou um limiar alternativo de concentração de ácido oleico que o estipulado acima) e menos que 3% de ácido linolênico (ou um limiar alternativo de concentração de ácido linolênico que o estipulado acima); e (c) derivar gerações posteriores de plantas a partir das referidas plantas regeneradas, as plantas individuais das referidas gerações posteriores com teor de ácidos graxos compreendendo pelo menos 68% de ácido oleico (ou o limiar alternativo de concentração) e menos que 3% de ácido linolênico (ou o limiar alternativo de concentração). Em algumas concretizações, a Brassica pode ser Brassica juncea. O termo "alto teor de ácido oleico" e "baixo teor de ácido linolênico" abrange a faixa completa de valores possíveis descritos acima. Em concretizações alternativas, os métodos da invenção podem compreender ainda selecionar uma ou mais das linhagens, das plantas regeneradas e das gerações posteriores de plantas que tenham teor reduzido de ácido linoleico, tal como na faixa de valores possíveis descritos acima. Em concretizações adicionais, a etapa (c) pode envolver selecionar e cultivar sementes a partir das plantas regeneradas da etapa (b). Em concretizações adicionais, os métodos da invenção podem compreender repetir as etapas especificadas até que o teor desejado de ácido oleico, o teor de ácido linoleico, ou ambos sejam conseguidos.

[00049] Em concretizações alternativas, são providos métodos para rastrear sementes individuais quanto ao teor aumentado de ácido oleico e ao teor diminuído de ácido linoleico, compreendendo: determinar um ou mais entre o teor de ácido oleico; ou o teor de ácido linoleico; ou o teor de ácido oleico e o teor de ácido linoleico dos ácidos graxos de uma parte do germinado da semente, comparar um ou mais dos teores com um valor de referência; e inferir o teor relativo provável de ácido oleico, de ácido linoleico, ou de oleico e de ácido linoleico da semente. Em concretizações específicas, a parte da planta usada para análise pode ser parte ou toda uma folha, cotilédone, caule, pecíolo, haste ou qualquer outro tecido ou fragmento de tecido, tal como tecidos com uma composição que demonstre uma correlação confiável com a composição da semente. Em uma série de concretizações, a parte do germinado pode ser parte de uma folha. Em certas concretizações, a etapa de inferir a composição de ácidos graxos da semente pode compreender supor que um nível significativamente alterado de um dado ácido na referida planta reflete uma alteração relativa semelhante ao nível daquele ácido na semente. Em uma concretização específica desta invenção, é provido um método para rastrear plantas Brassica quanto a uma linhagem vegetal individual cujas sementes tenham teor de ácidos graxos endógenos compreendendo pelo menos 68% de ácido oleico e menos que 3% de ácido linolênico em peso pela análise de tecido da folha. Adicionalmente, o tecido de folha pode ser analisado quanto à composição de ácidos graxos por cromatografia líquida gasosa, em que a extração dos ácidos graxos pode correr por métodos tais como análise de semente a granel ou análise de metade dasemente.

[00050] Em concretizações alternativas, a invenção provê plantas Brassica, as quais podem ser plantas Brassica juncea, compreendendo os alelos de genes previamente descritos de linhagens de Brassica juncea. Em certas concretizações, a planta pode ser homozigota nos loci fad2-a e fad3-a, representados pelos alelos mutantes. Em uma concretização adicional, a planta Brassica juncea, célula da planta ou uma parte desta contém os alelos de genes com sequências de ácidos nucleicos das sequências previamente descritas reveladas neste pedido de patente.

[00051] Em algumas concretizações, a invenção pode envolver distinguir o HOLL, qualidade de canola da Brassica juncea da presente invenção (>68% de ácido oleico e <5% de ácido linolênico), da Brassica juncea com baixo ácido oleico/alto ácido linolênico (“45% de ácido oleico e “14% de ácido linolênico), examinando a presença ou ausência do gene BJfad2b (ver, para referência, a Publicação da Patente U.S. No 20030221217, Yao et al.). Essa distinção pode envolver confirmar se o gene BJfad2a é o único gene funcional de oleato desaturase de ácidos graxos em uma linhagem de Brassica juncea da qualidade de canola, conforme é conhecido na técnica.

[00052] Em uma concretização, a linhagem de Brassica juncea contém os genes fad2 e fad3, conforme descrito na Publicação Internacional No. U.S 2006/0248611 A1, que estão exemplificados nas Figuras 1 e 3 neste documento. Os genes fad2 e fad3 estão exemplificados neste relatório descritivo pelas SEQ ID NOS:1-4. Os alelos resultantes codificam proteínas delta-12 ácido graxo desaturase, os quais estão na Figura 2 da Publicação Internacional Publication No U.S. 2006/0248611 A1. Em outras concretizações, a linhagem deBrassica juncea pode conter mutações nos loci dos genes fad2-a e fad3- a e os alelos mutantes resultantes podem codificar uma ou mais mutações na sequência das proteínas preditas BJFAD2-a e BJFAD3-a. Exemplos representativos de genes fad2-a e fad3-a mutantes e de proteínas adequadas para uso na presente invenção também incluem, entre outros, os descritos em: Publicação Internacional No WO 2006/079567 A2 (por exemplo, Figuras 1 e 2), tais como as SEQ ID NOS:8 e 9; Publicação Internacional No WO 2007/107590 A2, tais como as SEQ ID NOS:10-21; Patente U.S. No 6 967 243 B2 (por exemplo, Figuras 2 e 3), tais como as SEQ ID NOS:22-27; e Publicação Europeia No 1 862 551 A1 (por exemplo, Figuras 1 até 10), tais como as SEQ ID NOS:28-39.

[00053] Em concretizações selecionadas, a invenção provê sequências isoladas de DNA que compreendem quadros de leitura aberta (ORFs) completos e/ou regiões em sentido ascendente a 5‘ dos genes fad2 e fad3 mutantes previamente descritos. A invenção, dessa forma, também provê sequências polipeptídicas das proteínas mutantes preditas, contendo mutações resultantes dos alelos mutantes previamente descritos. É sabido que desaturases ligadas à membrana como, por exemplo, FAD2, possuem boxes conservados de histidina. Alterações em resíduos de aminoácidos fora destes boxes de histidina podem também afetar a atividade enzimática de FAD2 (Tanhuanpaa et al., Molecular Breeding 4:543-550, 1998).

[00054] Em um aspecto da invenção, os alelos mutantes aqui descritos podem ser usados no melhoramento genético de vegetais. Especificamente, os alelos da invenção podem ser usados para o melhoramento de espécies de Brassica com alto teor de ácido oleico, tais como Brassica juncea, Brassica napus, Brassica rapa, Brassica nigra e Brassica carinata. A invenção provê marcadores moleculares para distinguir alelos mutantes dentre sequências alternativas. A invenção, por meio disso, provê métodos para segregação e análise seletiva de cruzamentos genéticos envolvendo plantas contendo alelos da invenção. A invenção, por meio disso, provê métodos para segregação e análise seletiva de progênies derivadas de cruzamentos genéticos envolvendo plantas contendo alelos da invenção.

[00055] Em concretizações alternativas, a invenção provê métodos para identificar plantas Brassica, tais como plantas Brassica juncea, com uma composição desejável de ácidos graxos ou uma característica genômica desejada. Os métodos da invenção podem, por exemplo, envolver determinar a presença em um genoma de determinados alelos de FAD2 e/ou FAD3, tais como os alelos da invenção, ou o alelo J96D- 4830/BJfad2a do tipo selvagem. Em concretizações específicas, os métodos podem compreender identificar a presença de um polimorfismo de ácido nucleico associado com um dos alelos identificados ou um determinante antigênico associado com um dos alelos da invenção. Tal determinação pode, por exemplo, ser conseguida com uma gama de técnicas, tal como amplificação por PCR do fragmento pertinente do DNA, impressão digital (fingerprinting) do DNA, impressão digital do RNA, análise por transferência (Blotting) em gel e de RFLP, ensaios de proteção de nucleases, sequenciamento do fragmento pertinente do ácido nucleico, a geração de anticorpos (monoclonais ou policlonais), ou métodos alternativos adaptados para distinguir a proteína produzida pelos alelos pertinentes de outras variantes ou formas do tipo selvagem daquela proteína. Esta invenção também provê um método para identificar plantas B. juncea, cujas sementes tenham um teor de ácidos graxos endógenos compreendendo pelo menos 68% de ácido oleico em peso, pela determinação da presença dos alelos mutantes da invenção.

[00056] Em concretizações alternativas, a invenção provê plantas Brassica compreendendo as sequências codificadoras de fad2 e fad3 que codificam proteínas FAD2 e FAD3 mutantes. Tais proteínas FAD2/FAD3 mutantes podem conter uma única alteração em aminoácido, quando comparadas à proteína FAD2 do tipo selvagem. Em concretizações representativas, várias linhagens de Brassica juncea contêm as proteínas FAD2 mutantes previamente descritas, codificadas pelos alelos previamente descritos.Tais alelos podem ser selecionados para serem eficazes em conferir teor aumentado de ácido oleico e teor reduzido de ácido linolênico a plantas da invenção.Em concretizações específicas, o alelo desejado pode ser introduzido em plantas por técnicas de melhoramento genético.Em concretizações alternativas, alelos da invenção podem ser introduzidos por técnicas de biologia molecular, incluindo transformação vegetal. Em tais concretizações, as plantas da invenção podem produzir sementes com teor de ácidos graxos endógenos que compreende: pelo menos aproximadamente 68% de ácido oleico em peso e menos que aproximadamente 3% de ácido linolênico em peso, ou qualquer outro limiar para teor de ácido oleico e ácido linolênico conforme estipulado acima. As plantas da invenção podem também conter de aproximadamente 68% a aproximadamente 85% em peso de ácido oleico, de aproximadamente 70% a aproximadamente 78% de ácido oleico, e de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 3% de ácido linoleico, em que a composição do óleo é geneticamente derivada da linhagem genitora. As plantas da invenção pode também exibir teor de ácidos graxos totais de menos que 7,1% a menos que aproximadamente 6,2% em peso. Em uma concretização, a planta produz sementes com teor de ácidos graxos endógenos que compreende pelo menos aproximadamente 68% de ácido oleico e menos que 3% de ácido linoleico, em que a composição do óleo é geneticamente derivada da linhagem genitora.

[00057] Em concretizações selecionadas, a invenção provê sementes de Brassica, as quais podem ser sementes de Brassica juncea, tendo teor de óleo endógeno com a composição de ácidos graxos apresentada para uma ou mais das concretizações precedentes e em que os determinantes genéticos para teor de óleo endógeno sãoderivados dos alelos mutantes da invenção. Tais sementes podem ser obtidas, por exemplo, por autofecundação de cada uma das linhagens de alelos mutantes da invenção. Alternativamente, tais sementes podem ser obtidas, por exemplo, por cruzamento das linhagens de alelos mutantes com uma segunda genitora, seguido por seleção, em que a segunda genitora pode ser quaisquer outras linhagens de Brassica tais como uma linhagem de Brassica juncea, sendo de Brassica juncea da qualidade de canola ou Brassica juncea não da qualidade de canola, ou de quaisquer outras espécies de Brassica tais como Brassica napus, Brassica rapa, Brassica nigra e Brassica carinata. Estas técnicas de melhoramento genético são bem conhecidas pelos técnicos no assunto.

[00058] Em concretizações alternativas a invenção provê plantas geneticamente estáveis do gênero Brassica, tais como plantas Brassica juncea que desenvolvem sementes maduras tendo uma composição descrita em uma ou mais das concretizações precedentes. Tais plantas podem ser derivadas a partir de linhagens de Brassica juncea com alelos mutantes da invenção. A composição do óleo de tais plantas pode ser geneticamente derivada das linhagens genitoras.

[00059] Em concretizações alternativas, a invenção provê processos para produzir uma planta Brassica geneticamente estável, tal como uma planta Brassica juncea, que produz sementes maduras com teor de ácidos graxos endógenos compreendendo a composição especificada para uma ou mais das concretizações precedentes. Os processos da invenção podem envolver as etapas de: cruzar genes de Ômega-9 (por exemplo, fad2a e fad3a) de Brassica napus com outras plantas Brassica, tais como Brassica juncea, para formar progênies F1. As progênies F1 podem ser propagadas, por exemplo, por meios que podem incluir autofecundação ou o desenvolvimento de plantas duplo- haploide. Combinar alelos mutantes de FAD2 com alelos mutantes de FAD3 permite a plantas que tenham alelos duplos mutantes de genes (fad2 e fad3) exibam perfil de ácidos graxos no óleo superior ao de plantas com um único mutante. As progênies resultantes podem ser submetidas à seleção quanto a plantas geneticamente estáveis que gerem sementes com uma composição descrita para uma ou mais das concretizações precedentes. Tais sementes podem, por exemplo, ter um perfil estabilizado de ácidos graxos que inclua teor de saturados totais de aproximadamente 7,1% a aproximadamente 6,5% em óleos totais extraíveis. Em certas variantes, a progênie pode por si mesma produzir sementes ou óleo que possua uma composição conforme apresentada acima para concretizações alternativas. Ter um teor de ácido oleico superior a aproximadamente 68% em peso e um teor de ácido linolênico inferior a aproximadamente 3% em peso.

[00060] Em um aspecto, a invenção provê plantas com fenótipo estável que pode ser herdado de alto ácido oleico e de baixo ácido linolênico. Por exemplo, o fenótipo de alto ácido oleico e de baixo ácido linolênico, resultantes dos alelos mutantes da invenção, podem ser geneticamente herdados através das gerações M2, M3 e M4.

[00061] Em concretizações alternativas, a invenção provê plantas Brassica juncea, em que a atividade de uma ácido graxo desaturase está alterada, o teor de ácido oleico está alterado ou o teor de ácido linolênico está alterado em relação à B. juncea do tipo selvagem que foi usada para o experimento de mutagênese. Ácido graxo desaturase ("FAD") significa, neste relatório descritivo, uma proteína que exibe a atividade de introduzir uma ligação dupla na biossíntese de um ácido graxo. Por exemplo, as enzimas FAD2/FAD3 podem ser caracterizadas pela atividade de introduzir a segunda ligação dupla na biossíntese de ácido linoleico a partir de ácido oleico. Atividade alterada de desaturase pode incluir aumento, redução ou eliminação da atividade de uma desaturase em comparação a uma planta, célula ou amostra dereferência.

[00062] Em outros aspectos, a redução de atividade da desaturase pode incluir a eliminação da expressão de uma sequência de ácido nucleico que codifica uma desaturase, tal como uma sequência de ácido nucleico da invenção. Eliminação da expressão, neste relatório descritivo, significa que uma sequência funcional de aminoácidos, codificada pela sequência de ácido nucleico, não é produzida em nível detectável. Redução de atividade de desaturase pode incluir a eliminação da transcrição de uma sequência de ácido nucleico que codifica uma desaturase, tal como uma sequência da invenção que codifica uma enzima FAD2 ou uma enzima FAD3. Eliminação da transcrição, neste relatório descritivo, significa que a sequência de mRNA codificada pela sequência de ácido nucleico não é transcrita em níveis detectáveis.Redução de atividade de desaturase pode também incluir a produção de uma sequência trucada de aminoácidos a partir de uma sequência de ácido nucleico que codifica uma desaturase. Produção de uma sequência trucada de aminoácidos, neste relatório descritivo, significa que a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de ácido nucleico não contém um ou mais aminoácidos presentes na sequência funcional de aminoácidos codificada por uma sequência de ácido nucleico do tipo selvagem. Adicionalmente, redução de atividade de desaturase pode incluir uma sequência variante de aminoácidos de desaturase. Produção de uma sequência variante de aminoácidos, neste relatório descritivo, significa que a sequência de aminoácidos possui um ou mais aminoácidos que são diferentes da sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de ácido nucleico do tipo selvagem. Conforme discutido mais detalhadamente neste relatório descritivo, a presente invenção revela que as linhagens mutantes da invenção produzem enzimas FAD2 e FAD3 com aminoácidos variantes, quando comparadas à linhagem J96D-4830 do tipo selvagem. Uma variedade de tipos de mutação pode ser introduzida em uma sequência de ácido nucleico visando reduzir a atividade de desaturases, tais como mutações frameshift (deslocamento do modo de leitura), por substituições e deleções.

[00063] Em algumas concretizações, a invenção provê novas sequências polipeptídicas de FAD2/FAD3, as quais podem ser modificadas de acordo com concretizações alternativas da invenção. É bem sabido na técnica que algumas modificações e alterações podem ser efetuadas na estrutura de um polipeptídeo sem alterar substancialmente a função biológica daquele peptídeo para obter um polipeptídeo biologicamente equivalente. Neste relatório descritivo, o termo "substituições conservadoras de aminoácidos" refere-se à substituição de um aminoácido por outro em um dado local no peptídeo, no qual a substituição pode ser efetuada sem qualquer perda ou ganho apreciável de função para obter um polipeptídeo biologicamente equivalente. Em tais alterações, substituições de resíduos de aminoácidos de tipo semelhante podem ser efetuadas com base na similaridade relativa de substituintes na cadeia lateral, por exemplo, seu tamanho, carga, hidrofobicidade, hidrofilicidade e os semelhantes, e tais substituições podem ser avaliadas quanto ao seu efeito sobre a função do peptídeo por testes de rotina. Por outro lado, neste relatório descritivo, o termo "substituições não conservadoras de aminoácidos" refere-se à substituição de um aminoácido por outro em um dado local no peptídeo, onde a substituição causa perda ou ganho apreciável de função do peptídeo, para obter um polipeptídeo que não é biologicamente equivalente.

[00064] Fibra é um componente da parede celular dos vegetais, e inclui polímeros de carboidratos (por exemplo, celulose (cadeias poliméricas lineares de glicose)); hemicelulose (cadeias ramificadas de heteropolímeros de, por exemplo, galactose, xilose, arabinose, ramnose, com moléculas fenólicas anexadas); e pectinas (polímeros solúveis em água de ácido galacturônico, xilose, arabinose, com diferentes graus de metilação).Fibra também inclui polímeros polifenólicos (por exemplo, polímeros do tipo lignina e taninos condensados).Em teoria, a fibra ADF é formada por celulose e lignina.Taninos condensados estão tipicamente incluídos em uma fração de ADF, mas o teor de taninos condensados varia independentemente de ADF. Em contraste, TDF é o farelo a partir do qual proteína, solúveis e amido e amido foram removidos, e é composto por componentes insolúveis da parede celular (por exemplo, celulose, hemicelulose, polifenólicos e lignina).

[00065] Em concretizações específicas, uma semente de uma planta de canola (por exemplo, planta de canola de sementes escuras), compreendendo um germoplasma da invenção, pode ter menor teor de ADF, em comparação a uma variedade de canola. Em exemplos específicos, o teor de fibra do farelo de canola (semente inteira, óleo removido, com base em matéria seca) pode ser, por exemplo, entre outros: inferior a aproximadamente 18% de ADF (por exemplo, aproximadamente 18% de ADF, aproximadamente 17% de ADFaproximadamente 16% de ADF, aproximadamente 15% de ADF,aproximadamente 14% de ADF, aproximadamente 13% de ADF,aproximadamente 12% de ADF, aproximadamente 11% de ADF e aproximadamente 10% de ADF) e/ou inferior a aproximadamente 22% de NDF (por exemplo, aproximadamente 22,0% de NDF, aproximadamente 21% de NDF, aproximadamente 20% de NDF, aproximadamente 19% de NDF, aproximadamente 18% de NDF e aproximadamente 17% de NDF).

[00066] Em concretizações específicas, a semente de uma planta de canola compreendendo um germoplasma da invenção pode ter teor aumentado de proteína, em comparação a uma variedade padrão de canola de sementes escuras. Em exemplos específicos, o teor de proteína do farelo de canola (semente inteira, óleo removido, com base em matéria seca) pode ser, por exemplo, entre outros, superior aaproximadamente 45% (por exemplo, aproximadamente 45%,aproximadamente 46%, aproximadamente 47%, aproximadamente48%, aproximadamente 49%, aproximadamente 50%, aproximadamente 51%, aproximadamente 52%, aproximadamente53%, aproximadamente 54%, aproximadamente 55%,aproximadamente 56%, aproximadamente 57% e aproximadamente 58%) de proteína bruta. Diferentes variedades de canola são caracterizadas por teores específicos de proteína. O teor de proteína (% de nitrogênio x 6,25) pode ser determinado por várias técnicas analíticas bem conhecidas e rotineiras, por exemplo, NIR e de Kjeldahl.

[00067] O teor de fósforo pode também ser usado para definirsementes, plantas e linhagens de variedades de canola em algumas concretizações.Tais variedades de canola podem produzir farelo de canola (semente inteira, óleo removido, com base em matéria seca) com teor aumentado de fósforo quando comparado ao farelo produzido a partir de variedades padrão de canola. Por exemplo, o farelo de canola da invenção pode compreender um teor de fósforo acima de 1,2%; acima de 1,3%; acima de 1,4%; acima de 1,5%; acima de 1,6%, acima de 1,7% e/ou acima de 1,8%.

[00068] Várias combinações dos traços supracitados podem também ser identificadas, e por estas exemplificadas, nas linhagens endogâmicas de canola e híbridos fornecidos nos diversos Exemplos.Estas linhagens ilustram que o germoplasma da invenção pode ser utilizado para prover e obter várias novas combinações de uma ampla variedade de características e/ou traços vantajosos de canola.Por exemplo, uma linhagem endogâmica de canola, compreendendo um germoplasma da invenção, pode ser cruzada com outra linhagem de canola que compreende uma característica e/ou traço desejado para introduzir características desejáveis em componentes da semente da linhagem endogâmica de canola que compreende um germoplasma da invenção.Cálculos de componentes da semente (por exemplo, teor de fibra, teor de glucosinolatos, teor de óleo, etc.) e de outros traços vegetais podem ser obtidos utilizando técnicas que são bem conhecidas no campo específico e aceitas no setor. A seleção e a propagação de plantas da progênie resultante do cruzamento, que compreendam as características e/ou os traços desejados das variedades genitoras, permitem criar novas variedades que compreendem a combinação desejada de características e/ou traços.

V. Farelos de canola com características nutricionais melhoradas

[00069] Algumas concretizações provêm farelos compreendendo semente de canola, em que a semente de canola possui características relativas ao óleo e ao farelo conforme discutidas acima.Por exemplo, algumas concretizações incluem farelo de canola extraído com hexano, seco ao ar (Floco Branco ou WF) compreendendo uma nova combinação de características (por exemplo, componentes da semente) conforme discutidas acima.Concretizações específicas incluem farelo compreendendo semente de canola produzida a partir de uma planta compreendendo um germoplasma da invenção, e farelo compreendendo sementes da progênie de uma planta compreendendo um germoplasma da invenção.

[00070] Linhagens endogâmicas e híbridos de canola compreendendo o germoplasma da invenção podem, em algumas concretizações, intensificar propriedades nutricionais do farelo quando utilizado diretamente como ração ou ingrediente alimentar, e/ou quando utilizado como matéria-prima para o processamento de isolados e concentrados proteicos. Por exemplo, tais linhagens endogâmicas e híbridos de canola podem levar a um desempenho como ração para animais superior ao de farelo de canola padrão. Em algumas concretizações, os componentes do farelo de canola (e rações para animais os compreendendo) podem ser utilizados para proporcionar boa nutrição a um animal monogástrico (por exemplo, suíno e ave doméstica).

[00071] Em algumas concretizações, os componentes do farelo de canola (e rações para animais os compreendendo) podem ser utilizados ainda para proporcionar boa nutrição a um animal ruminante (por exemplo, animais bovinos, ovinos, caprinos e outros animais da subordem Ruminantia). A alimentação de ruminantes apresenta problemas especiais e oportunidades especiais. As oportunidades especiais surgem da capacidade de ruminantes utilizarem fibra celulósica insolúvel, as quais podem ser decompostas por certos microrganismos no rume destes animais, mas que em geral não é digerível por mamíferos monogástricos, como os suínos. Os problemas especiais têm origem na tendência de certas rações para inibir a digestão de fibras no rume, e na tendência do rume para limitar a utilização de alguns dos componentes de certas rações, tais como gordura e proteína.

[00072] Sementes de Brassica depois do óleo extraído representam uma fonte potencial de proteína de alta qualidade a ser utilizada em rações para animais. Depois da extração do óleo, produto de base farelo de canola compreende em torno de 37% de proteína, em comparação a aproximadamente 44 - 48% no farelo de soja, o qual é atualmente preferido em grande medida para fins relacionados à produção de rações e alimentos. As proteínas contidas na canola são ricas em metionina e contêm quantidades adequadas de lisina, ambas as quais são aminoácidos com presença limitada na maioria das proteínas de cereais e de sementes oleaginosas. Contudo, o uso de farelo de canola, como fonte de proteína, tem sido de certa forma limitado em certas rações para animais, pois contém constituintes indesejados como fibra, glucosinolatos e fenólicos.

[00073] Um aspecto nutricional da semente de colza, a partir da qual a canola era derivada, é seu alto nível (30-55 μmol/g) de glucosinolatos, um composto à base de enxofre. Quando a folhagem ou sementes de canola são esmagadas, ésteres de isotiocianato são produzidos pela ação da mirosinase nos glucosinolatos.Esses produtos inibem a síntese de tiroxina pela tireoide e possuem outros efeitos antimetabólicos.Paul et al. (1986) Theor. Appl. Genet. 72:706-9. Dessa forma, para o uso em alimentos destinados a seres humanos, o teor de glucosinolatos, por exemplo, de proteínas derivadas a partir do farelo de sementes de colza, deve ser reduzido ou eliminado para conferir segurança ao produto.

[00074] Uma semente de canola melhorada com, por exemplo, perfil favorável de óleo e baixo teor de glucosinolatos na semente reduziria significativamente a necessidade de hidrogenação. Por exemplo, o teor mais alto de ácido oleico e mais baixo de ácido a-linolênico de tal óleo pode transmitir maior estabilidade oxidativa, assim reduzindo a exigência para hidrogenação e a produção de ácidos graxos trans. A redução de glucosinolatos na semente reduziria significativamente o teor de enxofre residual no óleo. O enxofre envenena o catalisador de níquel comumente usado para hidrogenação. Koseoglu et al., Capítulo 8, em Canola and Rapeseed: Production, Chemistry, Nutrition, and Processing Technology, Ed. Shahidi, Van Nostrand Reinhold, N.Y., 1990, pág. 123-48. Adicionalmente, o óleo derivado de uma variedade de canola com baixo teor de glucosinolatos na sementes acarretaria menos custos para ser hidrogenado.

[00075] Os compostos fenólicos no farelo de canola transmitem um sabor amargo, e acredita-se que estejam necessariamente associados a uma cor escura em produtos proteicos finais. Cascas de sementes, presentes em grandes quantidades em farelos de canola padrão, não conseguem ser digeridas por seres humanos e outros animais monogástricos, e também resultam em um produto heterogêneo de aparência ruim.

[00076] O componente farelo de uma semente produzida por uma planta de canola compreendendo um germoplasma da invenção pode apresentar, por exemplo, entre outros: alto teor de proteína; baixo de fibra; mais alto de fósforo; e/ou baixo de SAEs. A fibra e polifenólicos insolúveis são antinutricionais e comprometem a digestão de proteínas e aminoácidos. Dessa forma, farelos de canola e rações para animais compreendendo farelos de canola tendo ao menos uma característica em componentes da semente, selecionada a partir do grupo constituído por teor reduzido de fibra, teor aumentado de proteína, teor reduzido de polifenólicos e teor aumentado de fósforo, podem ser desejáveis em algumas aplicações.

[00077] Em exemplos específicos, um farelo de canola (com base em matéria seca livre de óleo) pode compreender um teor de proteína de ao menos aproximadamente 45% (por exemplo, aproximadamente 45%, aproximadamente 46%, aproximadamente 47%,aproximadamente 48%, aproximadamente 49%, aproximadamente 50%, aproximadamente 51%, aproximadamente 52%, aproximadamente 53%, aproximadamente 54%, aproximadamente 55%, aproximadamente 56%, aproximadamente 57% e aproximadamente 58%).

[00078] As variedades de canola compreendendo um germoplasma da invenção podem ter bons rendimentos e produzir sementes com teor muito mais baixo de fibra em detergente ácido (ADF), em comparação a uma linhagem de canola de referência. Quaisquer valores empíricos determinados para um componente de uma semente produzida por uma variedade vegetal compreendendo um germoplasma da invenção podem ser utilizados em algumas concretizações para definir plantas, sementes e óleo da variedade vegetal. Em alguns de tais exemplos, números específicos podem ser utilizados como desfechos para definir faixas acima, abaixo ou intermediárias entre qualquer um dos valores determinados. Faixas exemplares para características do óleo e de outros componentes da semente foram apresentadas acima. Linhagens e suas sementes podem também ser definidas por combinações de tais faixas. Por exemplo, as características do óleo discutidas acima, juntamente com níveis característicos de fibra, níveis de polifenólicos, níveis de glucosinolatos, níveis de proteína e níveis de fósforo, por exemplo, podem ser utilizados para definir linhagens e suas sementes em particular.

[00079] Nem todas as características citadas acima (por exemplo, características de componentes da semente) são necessárias para definir linhagens e sementes de algumas concretizações, mas características adicionais podem ser utilizadas para definir tais linhagens e sementes (por exemplo, entre outras, energia metabolizável, energia digestível, energia biológica e energia líquida).

VI. Plantas compreendendo um germoplasma que confere traços desejáveis a componentes da semente em maneira independente da cor da semente

[00080] Traços desejáveis de determinadas linhagens endogâmicas e híbridos de canola compreendendo um germoplasma da invenção podem ser transferidos para outros tipos de Brassica (através do melhoramento genético convencional e os semelhantes), por exemplo, B. rapa e B. juncea, com as plantas resultantes produzindo sementes com características desejadas (por exemplo, características de componentes da semente) expressas independentemente da cor da semente. Desse modo, uma variedade de Brassica, para a qual um ou mais traços desejáveis de uma determinada linhagem endogâmica ou híbrido de canola foram transferidos, pode produzir sementes com características desejadas pertencentes a sementes amarelas ou a sementes escuras. Farelos e sementes de tais novas ou modificadas variedades de Brassica podem exibir nível reduzido de fibra na semente, nível aumentado de proteína, nível aumentado de fósforo e/ou nível diminuído de polifenólicos.

[00081] Algumas concretizações incluem não só sementes amarelas e escuras de canola compreendendo um germoplasma conforme descrito e exemplificado neste relatório, mas também plantas cultivadas ou de outra forma produzidas a partir de tais sementes, e culturas de tecido de células capazes de se regenerar das plantas de canola em questão. As linhagens e os híbridos exemplificados foram obtidos sem engenharia genética e sem mutagênese, assim demonstrando a utilidade do germoplasma para produzir novas e modificadas variedades de canola.

[00082] Em algumas concretizações específicas, linhagens endogâmicas e híbridos específicos exemplares de canola são providos. Como parte da presente invenção, ao menos 2500 sementes de cada CL065620, CL044864, CL121460H, CL166102H e CL121466H foram depositadas e disponibilizadas para o público, subordinado aos direitos de patente, mas de contrário sem restrição (exceto aquelas restrições expressamente permitidas pelas normas 37 C.F.R. § 1.808(b)), na American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Md. 20852. Os depósitos receberam as designações ATCC Nos de Depósito PTA-11697, PTA-11696, PTA-11698, PTA- e PTA-11699_,respectivamente, com data do depósito de 22 de fevereiro de 2011 para PTA11696 até PTA11699 e de 21 de fevereiro de 2012 para PTA . Os depósitos serão mantidos, conforme apresentado acima, no repositório da ATCC, o qual é um repositório público, por um período de 30 anos, ou de cinco anos depois da solicitação mais recente, ou pelo prazo de validade da patente, o que for mais longo, e será substituído odepósito que se tornar não viável durante o período citado.

[00083] Algumas concretizações incluem uma semente de qualquer uma das variedades de Brassica napus aqui descritas. Algumas concretizações também incluem plantas Brassica napus produzidas por tal semente, bem como culturas de tecido de células capazes de se regenerar de tais plantas. Além disso, está incluída uma planta Brassica napus regenerada a partir de tal cultura de tecido. Em concretizações específicas, tal planta pode ser capaz de expressar todas as propriedades morfológicas e fisiológicas de uma variedade exemplificada. Plantas Brassica napus das concretizações específicas podem ter características fisiológicas e/ou morfológicas identificadoras de uma planta cultivada a partir da semente depositada.

[00084] Adicionalmente, são providos processos para efetuar cruzamentos utilizando um germoplasma da invenção (por exemplo, conforme é encontrado em linhagens endogâmicas e em híbridos exemplares de canola aqui providos) em ao menos um genitor da progênie das sementes descritas acima. Por exemplo, algumas concretizações incluem uma planta híbrida F1 de B. napus tendo como um ou ambos os genitores qualquer uma das plantas exemplificadas neste relatório descritivo. Concretizações adicionais incluem uma semente de B. napus produzida por tal híbrido F1. Em concretizações específicas, um método para produzir uma semente do híbrido F1 de B. napus compreende cruzar uma planta exemplificada com uma planta de linhagem endogâmica genitora diferente de canola, e colher a semente híbrida resultante. As plantas de canola da invenção (por exemplo, planta genitora de canola e planta de canola produzida por tal método para produzir um híbrido F1) podem ser uma planta fêmea ou uma planta macho.

[00085] As características de plantas de canola em algumas concretizações (por exemplo, níveis e/ou perfis de óleo e proteína) podem ser ainda modificadas e/ou melhoradas pelo cruzamento de uma planta da invenção com outra linhagem que tenha uma característica modificada (por exemplo, altos níveis de óleo e proteína). Do mesmo modo, outras características podem ser melhoradas por consideração cuidadosa da planta genitora. Linhagens de canola compreendendo um germoplasma da invenção podem ser benéficas para cruzar suas características desejáveis em componentes da semente para outras linhagens de colza ou de canola em maneira independente da cor da semente.Os germoplasmas da invenção permitem que esses traços sejam transferidos para outras plantas dentro da mesma espécie por técnicas convencionais de melhoramento genético vegetal, incluindo fecundação cruzada e seleção de progênie.Em algumas concretizações, os traços desejados podem ser transferidos entre espécies usando técnicas convencionais de melhoramento genético vegetal, envolvendo transferência de pólen e seleção. Ver, por exemplo, Brassica crops and wild allies biology and breeding, Eds. Tsunada et al., Japan Scientific Press, Tóquio (1980); Physiological Potentials for Yield Improvement of Annual Oil and Protein Crops, Eds. Diepenbrock and Becker, Blackwell Wissenschafts-Verlag Berlin, Viena (1995); Canola and Rapeseed, Ed. Shahidi, Van Nostrand Reinhold, N.Y. (1990); e Breeding Oilseed Brassicas, Eds. Labana et al., Narosa Publishing House, Nova Deli (1993).

[00086] Em algumas concretizações, um método para transferir ao menos uma característica desejável para componentes da semente em maneira independente da cor da semente compreende, após o cruzamento interespecífico, autofecundar membros da geração F1 para produzir semente F2.Em seguida, pode ser conduzido o retrocruzamento para obter linhagens exibindo a(s) característica(s) desejada(s) em componentes da semente.Adicionalmente, métodos de fusão de protoplastos e de transplante nuclear podem ser empregados para transferir um traço de uma espécie para outra. Ver, por exemplo, Ruesink, "Fusion of Higher Plant Protoplasts", Methods in Enzymology, Vol. LVIII, Eds. Jakoby and Pastan, Academic Press, Inc., Nova York, N.Y. (1979), e as referências ali citadas; e Carlson et al. (1972) Proc. Natl. Acad Sci. USA 69:2292.

[00087] Tendo obtido e produzido linhagens exemplares de canola compreendendo um germoplasma da invenção, uma cor escura de tegumento da semente pode agora ser rapidamente transferida com características desejáveis em componentes da semente para outra espécie de Brassica, por técnicas convencionais de melhoramento genético vegetal conforme apresentado acima. Por exemplo, uma cor escura de tegumento da semente pode agora ser rapidamente transferida com características desejáveis em componentes da semente para variedades disponíveis comercialmente de B. rapa, por exemplo, entre outras, Tobin, Horizon e Colt. É entendido que a cor escura da semente não precisa ser transferida juntamente com outras características da semente.

[00088] Estabelecendo uma das variedades exemplares como ponto de partida, benefícios específicos conferidos pela variedade podem ser manipulados em uma série de maneiras pelo técnico no assunto sem se desviar do âmbito da presente invenção. Por exemplo, o perfil de óleo da semente, presente em uma variedade exemplar, pode ser transferido para outra variedade agronomicamente desejável de B. napus por técnicas convencionais de melhoramento genético vegetal, envolvendo fecundação cruzada e seleção da progênie, por exemplo, em que o germoplasma da variedade exemplar é incorporado na outra variedade agronomicamente desejável.

[00089] Concretizações específicas podem incluir variedades exemplares de B. napus, bem como variedades essencialmente derivadas que tenham sido essencialmente derivadas a partir de ao menos uma das variedades exemplificadas. Além disso, as concretizações da invenção podem incluir uma planta de ao menos uma das variedades exemplificadas, uma planta de tal variedade essencialmente derivada e/ou uma planta de colza regenerada a partir de plantas ou tecido (incluindo pólen, sementes e células) a partir delas produzidos.

[00090] Materiais vegetais podem ser selecionados que sejam capazes de regeneração, por exemplo, sementes, micrósporos, óvulos, pólen, partes vegetativas e micrósporos. Em geral, tais células vegetais podem ser selecionadas a partir de qualquer variedade de Brassica, incluindo as que tenham traços agronômicos desejados.

[00091] Técnicas de regeneração são bem conhecidas no campo específico.Células capazes de regeneração (por exemplo, sementes, micrósporos, óvulos, pólen e partes vegetativas) podem ser selecionadas inicialmente a partir de uma planta ou variedade selecionada.Estas células podem ser opcionalmente submetidas à mutagênese.Uma planta pode então ser desenvolvida a partir das células por meio de técnicas de regeneração, fertilização e/ou cultivo, de acordo com o tipo de células (e se sofreram mutações ou não).Manipulações de plantas ou sementes, ou de suas partes, podem levar à criação de variedades essencialmente derivadas.

[00092] Em algumas concretizações, características desejadas em componentes da semente, exibidas por plantas compreendendo um germoplasma da invenção, podem ser introduzidas em uma planta que compreende uma pluralidade de traços desejáveis adicionais em maneira independente da cor da semente, visando produzir uma planta com ambas, as características desejadas em componentes da semente e a pluralidade de traços desejáveis. O processo para introduzir as características desejadas em componentes da semente em uma planta que compreende um ou mais traços desejáveis em maneira independente da cor da semente é designado de "empilhamento" (stacking) destes traços. Em alguns exemplos, o empilhamento das características desejadas em componentes da semente com uma pluralidade de traços desejáveis pode resultar em melhoras adicionais em características de componentes da semente.Em alguns exemplos, o empilhamento das características desejadas em componentes da semente com uma pluralidade de traços desejáveis pode resultar em uma planta de canola tendo as características desejadas em componentes da semente além de um ou mais (por exemplo, todos) da pluralidade de traços desejáveis.

[00093] Exemplos de traços que podem ser desejáveis em combinação com características desejadas em componentes da semente incluem, por exemplo, entre outros: genes de resistência a doenças em vegetais (Ver, por exemplo, Jones et al. (1994) Science 266:789 (gene Cf-9 do tomate para resistência contra Cladosporium fulvum); Martin et al. (1993) Science 262:1432 (gene Pto do tomate para resistência contra Pseudomonas syringae); e Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089 (gene RSP2 para resistência contra Pseudomonas syringae)); gene que confira resistência a um herbicida; proteína de Bacillus thuringiensis, um derivado desta ou um polipeptídeo que a tenha como modelo (Ver, por exemplo, Geiser et al. (1986) Gene 48:109 (gene da Bt δ-endotoxina; moléculas de DNA que codificam genes da δ- endotoxina podem ser adquiridos da American Type Culture Collection (Manassas, VA), por exemplo, sob os Nos de Acesso ATCC 40098; 67136; 31995; e 31998)); uma lectina (Ver, por exemplo, Van Damme et al. (1994) Plant Molec. Biol. 24:25 (genes de lectina que se liga à manose de Clivia miniata)); uma proteína que se liga a vitaminas, por exemplo, avidina (Ver a Publicação Internacional PCT US93/06487 (uso de avidina e homólogos da avidina como larvicidas contra insetos pragas)); um inibidor de enzimas; um inibidor de proteases ou proteinases (Ver, por exemplo, Abe et al. (1987) J. Biol. Chem.262:16793 (inibidor de cisteína proteinase do arroz)); Huub et al. (1993) Plant Molec. Biol. 21:985 (inibidor da proteinase I do tabaco; e Patente U.S. No 5 494 813); um inibidor da amilase (Ver Sumitani et al. (1993) Biosci.Biotech.Biochem. 57:1243 (inibidor da alfa-amilase de Streptomyces nitrosporeus)); um hormônio ou feromônio específico de insetos, por exemplo, hormônio ecdisteroide ou juvenil, uma variante deste, um mimético com base neste ou um antagonista ou agonista deste (Ver, por exemplo, Hammock et al. (1990) Nature 344:458(inativador de hormônio juvenil)); um peptídeo ou neuropeptídeo específico para inseto que altere a fisiologia da praga afetada (Ver, por exemplo, Regan (1994) J. Biol. Chem. 269:9 (receptor do hormônio diurético de insetos); Pratt et al. (1989) Biochem. Biophys.Res. Comm. 163:1243 (alostatina de Diploptera puntata); Patente U.S. No 5 266 317 (neurotoxinas paralíticas específicas para insetos)); um veneno específico para insetos produzido na natureza por cobra, vespa ou outro organismo (Ver, por exemplo, Pang et al. (1992) Gene 116:165 (um peptídeo inseto-tóxico do escorpião)); uma enzima responsável por acúmulo exagerado de um monoterpeno, um sesquiterpeno, um esteroide, ácido hidroxâmico, um derivado fenilpropanoide ou outra molécula não proteica com atividade inseticida; uma enzima envolvida na modificação, incluindo a modificação pós-traducional, de uma molécula biologicamente ativa, por exemplo, uma enzima glicolítica; uma enzima proteolítica; uma enzima lipolítica; uma nuclease; uma ciclase; uma transaminase; uma esterase; uma hidrolase; uma fosfatase; uma quinase; uma fosforilase; uma pomerase; uma elastase; uma quitinase; ou uma glucanase, seja natural ou sintética (Ver Publicação Internacional PCT WO 93/02197 (um gene da calase); moléculas de DNA que contenham sequências codificadoras de quitinase (por exemplo, da ATCC, sob os Nos de Acesso 39637 e67152)); Kramer et al. (1993) Insect Biochem. Molec.Biol. 23:691 (quitinase da lagarta de chifre do tabaco); e Kawalleck et al. (1993) Plant Molec.Biol. 21:673 (gene da ubi4-2 poliubiquitina da salsinha); uma molécula que estimule a transdução de sinal (Ver, por exemplo, Botella et al. (1994) Plant Molec. Biol. 24:757 (calmodulina); e Griess et al. (1994) Plant Physiol. 104:1467 (calmodulina do milho)); um peptídeo de momento hidrofóbico (Ver, por exemplo, Publicação Internacional PCT WO 95/16776 (derivados peptídicos de Taquiplesina que inibem patógenos fúngicos de vegetais); e Publicação Internacional PCT WO 95/18855 (peptídeos antimicrobianos sintéticos que conferem resistência a doenças)); uma permease da membrana, um formador de canal ou um bloqueador de canal (Ver, por exemplo, Jaynes et al. (1993) Plant Sci 89:43 (peptídeo análogo lítico de cecropina-β para tornar plantas transgênicas resistentes a Pseudomonas solanacearum); uma proteína invasiva viral ou toxina em complexo derivada da proteína (Ver, por exemplo, Beachy et al. (1990) Ann. rev. Phytopathol. 28:451(resistência mediada por proteína do revestimento contra o vírus mosaico da alfafa, o vírus mosaico do pepino, o vírus do listrado do tabaco, o vírus X da batata, o vírus Y da batata, o vírus ETCH do tabaco, o vírus rattle do tabaco e vírus mosaico do tabaco)); um anticorpo específico contra inseto ou uma imunotoxina dele derivada (Ver, por exemplo, Tayloretal., Resumo no 497, VII Simpósio Internacional sobre Interações Moleculares Vegetais-Micróbios (Edinburgo, Escócia) (1994) (inativação enzimática via a produção de fragmentos de anticorpos de cadeia única); um anticorpo específico contra vírus (Ver, por exemplo, Tavladoraki et al. (1993) Nature 366:469 (genes de anticorposrecombinantes para proteção contra ataque viral)); uma proteína causadora de parada do desenvolvimento, produzida na natureza por patógeno ou parasita (Ver, por exemplo, Lamb et al. (1992)Bio/Technology 10:1436 (α-1,4-D-poligalacturonases endógenas fúngicas que facilitam a colonização por fungos e que liberam nutrientes vegetais quando solubilizam homo-α-1,4-D-galacturonase da parede de vegetais; Toubart et al. (1992) Plant J. 2:367 (proteína inibidora de endopoligalacturonases); e uma proteína causadora da parada do desenvolvimento produzida na natureza por um vegetal (Ver, por exemplo, Logemann et al. (1992) Bio/Technology 10:305 (geneinativador de ribossomos da cevada que aumenta a resistência contra doença por fungos)).

[00094] Exemplos adicionais de traços que podem ser desejáveis para combinação com características desejadas em componentes da semente incluem, por exemplo, entre outros: genes que conferem resistência a um herbicida (Lee et al. (1988) EMBO J. 7:1241 (enzima ALS mutante); Miki et al. (1990) Theor. Appl. Genet. 80:449 (enzima AHAS mutante); Patentes U.S. Nos 4 940 835 e 6 248 876 (genes mutantes de 5-enolpiruvilshikimate-3-fosfato sintase (EPSPs) que conferem resistência ao glifosato); Patente U.S. No 4 769 061 e número de acesso ATCC 39256 (genes aroA); genes da glifosato acetil transferase (resistência ao glifosato); outros compostos fosfônicos da espécie Streptomyces, incluindo Streptomyces hygroscopicus e Streptomyces viridichromogenes) tais como os descritos no Pedido de Patente Europeia No 0 242 246 e DeGreef et al. (1989) Bio/Technology 7:61 (genes da glufosinato fosfinotricina acetil transferase (PAT) que conferem resistência ao glifosato); ácidos piridinoxi ou fenóxi propiônico e ciclohexonas (resistência ao glifosato); Pedido de Patente Europeia No 0 333 033 e Patente U.S. No 4 975 374 (genes da glutamina sintetase que conferem resistência a herbicidas como L-fosfinotricina); Marshall et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435 (genes Acc1-S1, Acc1-S2 e Acc1-S3 que conferem resistência contra ácidos fenóxi propiônicos e ciclohexonas, como sethoxydim e haloxyfop); WO 2005012515 (genes GAT que conferem resistência ao glifosato); WO 2005107437 (Genes que conferem resistência aos herbicidas 2,4-D, fop e piridiloxi auxina); e um herbicida que inibe a fotossíntese, como triazina (genes psbA e gs+) ou benzonitrila (gene da nitrilase) (Ver, por exemplo, Przibila et al. (1991) Plant Cell 3:169 (genes psbA mutantes); sequências de nucleotídeos para genes da nitrilase estão descritas na Patente U.S. No 4 810 648, e moléculas de DNA contendo estes genes estão disponíveis sob os Nos de Acesso 53435, 67441 e 67442; e Hayes et al. (1992) Biochem. J. 285:173 (glutationa S-transferase)).

[00095] Exemplos adicionais de traços que podem ser desejáveis para combinação com características desejadas em componentes da semente incluem, por exemplo, entre outros: genes que conferem ou contribuem para um traço de valor agregado, por exemplo, metabolismo modificado de ácidos graxos (Ver, por exemplo, Knultzon et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:2624 (um gene antisense da estearil- ACP desaturase para aumentar o teor de ácido esteárico da planta)); teor reduzido de fitato (Ver, por exemplo, Van Hartingsveldt et al. (1993) Gene 127:87 (um gene da fitase de Aspergillus niger que intensifica a decomposição de fitato, adicionando mais fosfatos livres à planta transformada); e Raboy et al. (1990) Maydica 35:383 (clonagem e reintrodução de DNA associado com um alelo responsável por mutantes de milho com baixos níveis de ácido fítico)); e composição modificada de carboidratos efetuada, por exemplo, por plantas em transformação com um gene codificador de uma enzima que altera o padrão de ramificação de amido (Ver, por exemplo, Shiroza et al. (1988) J. Bacteol. 170:810 (gene mutante da frutosiltransferase de Streptococcus); Steinmetz et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 20:220 (gene dalevanasacarase); Pen et al. (1992) Bio/Technology 10:292 (α-amilase); Elliot et al. (1993) Plant Molec. Biol. 21:515 (genes de invertases do tomate); Sogaard et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:22480 (gene da α- amilase da cevada); e Fisher et al. (1993) Plant Physiol. 102:1045 (enzima II da ramificação de amido de endosperma do milho)).

[00096] As referências discutidas neste relatório descritivo são fornecidas exclusivamente por sua divulgação anterior à data de depósito do presente pedido de patente. Nada neste relatório descritivo deverá ser considerado como admissão de que os inventores não façam jus ao direito de antedatar tal divulgação em virtude de invenção anterior.

[00097] Os Exemplos a seguir destinam-se a ilustrar certas características e/ou aspectos em particular da invenção reivindicada. Estes Exemplos não devem ser interpretados como limitação à divulgação das características ou dos aspectos especialmente descritos.

Exemplos Exemplo 1: Composição média de nutrientes e valor do farelo de canola melhorado (ECM) e do farelo de canola convencional

[00098] Diversos estudos analíticos e funcionais foram conduzidos entre 2009 e 2012 para avaliar a composição de nutrientes e o valor de linhagens e híbridos de ECM da presente invenção. Os testes foram conduzidos em semente inteira não processada, farelo parcialmente processado e farelo completamente processado para refletir os possíveis efeitos do processamento sobre a composição e o valor nutricional. As amostras foram analisadas nas Universidades de Illinois, Missouri, Geórgia e de Manitoba. Essas informações relativas à composição foram utilizadas para estimar o valor energético do farelo de canola melhorado em comparação ao farelo de canola convencional por meio de equações padrão de predição. A avaliação biológica das amostras da energia e da digestibilidade de aminoácidos para aves foi efetuada nas Universidades de Illinois e da Geórgia. A avaliação biológica das amostras da energia e da digestibilidade de aminoácidos para suínos foi conduzida na Universidade de Illinois. O resumo das diferenças em composição de nutrientes entre as linhagens de ECM e (faixas ou em média) e farelo de canola convencional é mostrado na Tabela 1. Os detalhes dos procedimentos e estudos relevantes estão descritos em exemplos seguintes.Tabela 1. Composição de nutrientes em média de ECM e farelo de canola convencional

* O número em parênteses é a méd ia ** Previsto a partir da composição de nutrientes

[00099] As linhagens de ECM mostram diversas melhoras distintas na composição de nutrientes que acrescentam valor na alimentação de animais. Como ilustrado na Tabela 1, o valor relativo à proteína de ECM é aproximadamente 7% mais alto em pontos do que o do farelo de canola convencional. Além do mais, o balanço de aminoácidos essenciais (em porcentagem de proteína) é mantido nos níveis mais altos de proteína. A digestibilidade dos aminoácidos no ECM por aves e para suínos é pelo menos tão boa como no farelo de canola convencional, e o aminoácido fundamental lisina parece ter uma digestibilidade ligeiramente mais alta. As linhagens de ECM mostraram níveis mais baixos de componentes de fibra que são encontrados em paredes celulares e na casca, especificamente níveis 2% mais baixo em pontos de lignina/polifenóis, 1% mais baixo em pontos de celulose, 3% mais baixo em pontos de ADF (3% em pontos) e 5% mais baixo em pontos de ADF.

[000100] Os níveis mais altos de proteína e os níveis mais baixos de componentes de fibra se correlacionam com aumento de aproximadamente 10% da energia biológica nas linhagens de ECM.Estas linhagens também mostraram níveis mais altos de fósforo, nutriente cujo custo é alto para que seja adicionado a rações para animais. O teor mais alto de proteína (aminoácidos), energia e fósforo correlacionaram-se com aumento de aproximadamente 20-32% em valor ($/t) para farelo de canola em rações para suínos e aves, conforme refletido em preços de oportunidade maiores em ração para crescimento de frangos e porcos. Tabela 1.

Exemplo 2: Processos LT e HT na POS para farelos em escamas brancas (WF)

[000101] Semente de ECM e semente convencional de canola foram processadas na Fábrica Piloto POS em Saskatoon, CA de acordo com os seguintes procedimentos:

Materiais

[000102] Aproximadamente 1,5 MT da linhagem em teste de ECM (CL44864) de sementes de canola foram recebidos na POS em 02 de agosto de 2011. Aproximadamente 3,0 MT de sementes de canola do produto de base de controle foram recebidos na POS em 03 de agosto de 2011. As origens para os principais materiais foram. Hexano/iso-hexano: Univar, Saskatoon, SK. Auxiliar de filtro Hyflo Super-cel: Manville Products Corp., Denver, CO. Nitrogênio: Air Liquide, Saskatoon, SK. Pano de filtro, monofilamento: Porritts and Spensor, Pointe Claire, PQ. Papel-filtro, 55 libras (24,95 kg), modelo escuro 1138-55: Porritts and Spensor, Pointe Claire, PQ.

Métodos - Processamento na Fábrica Piloto

[000103] Entre cada variedade de canola, todos os equipamentos na fábrica de processamento "Primário" eram limpos a vácuo ou varridos. Por ser inflamável, o extrator não era desligado entre os testes.Contudo, a cadeia do extrator, Schnecken, e os sistemas de recuperação de solventes eram mantidos operantes para esvaziar o equipamento entre as variedades de canola. O vácuo não era desligado para que todos os vapores fossem retirados do condensador, condensados e descarregados no tanque de solventes de trabalho. Isso impedia que a água no Schnecken condensasse e obstruísse a esteira. As amostras de canola foram prensadas/extraídas na seguinte ordem: 1. HT de controle 2. LT de controle 3. LT de linhagem em teste de ECM (CL44864)

Formação de escamas

[000104] A formação de escamas é executada para romper células oleosas e preparar uma escama fina com área de superfície grande para o cozimento/pré-prensagem pela passagem da semente através de um conjunto de rolos lisos. A espessura e a umidade das escamas são ajustadas para minimizar a quantidade de finas produzidas. Níveis altos de finas resultam em um bolo prensado com propriedades deficientes de percolação do solvente.

[000105] A semente de canola foi transformada em escamas usando a configuração de espaço mínimo entre os rolos. A faixa de espessura da escama para cada lote foi como segue: 1. HT de controle 0,21 - 0,23 mm 2. LT de controle 0,19 - 0,23 mm 3. LT de linhagem em teste de ECM (CL44864) 0,21 - 0,23 mm

[000106] A taxa de alimentação foi controlada pela taxa de prensagem e foi de aproximadamente 133-150 kg/h.

[000107] Escamador: Moinho de formação de escamas Lauhoff Flakmaster, Modelo S-28, No de série 7801, 14" de diâmetro x 28" de largura, fabricado pela Lauhoff Corporation.

Cozimento

[000108] O cozimento é realizado para romper mais ainda as células oleosas, tornar as escamas flexíveis e para aumentar a eficiência do produto expelido ao diminuir a viscosidade do óleo contido. O cozimento é realizado tampem para desativar enzimas na semente. O forno era pré-aquecido antes do início de cada corrida. As pressões do vapor eram ajustadas durante a operação para manter as temperaturas desejadas nas escamas.

[000109] As temperaturas nas bandejas para o lote de HT de controle foram como segue: Bandeja superior 60 + 5 °C Bandeja inferior 97 + 3 °C

[000110] As temperaturas nas bandejas para o lote de LT de controle mais o de LT da linhagem em teste de ECM (CL44864) foram comosegue: Bandeja superior 60 + 5 °C Bandeja inferior 93 + 2 °C

[000111] Forno: Dois fornos com bandejas Simon-Rosedown foram utilizados. Cada compartimento tinha 36 cm de altura (21 cm de altura de trabalho) e 91 cm de diâmetro, e equipado com um braço de varredura para agitação do material. No interior do revestimento, foi usado vapor para gerar calor seco; vapor direto pode ser adicionado ao conteúdo do vaso também. O forno foi montado sobre a prensa de rosca para alimentação direta.

Prensagem

[000112] A prensagem remove aproximadamente 2/3 do óleo e produz um bolo prensado adequado para extração com solvente. O bolo prensado requer resistência ao esmagamento para que se mantenha no extrator e porosidade para boa transferência de massa e drenagem. A semente cozida em escamas foi prensada utilizando uma pré-prensa Simon-Rosedown.

[000113] O óleo bruto da prensagem foi recolhido em um tanque.

[000114] Pré-prensa: Prensa de rosca Simon-Rosedowns, 9,5 cm de diâmetro por 94 cm de comprimento. Uma velocidade operacional da rosca de 17 rpm foi empregada.

Extração com solvente e dessolventização

[000115] A extração com solvente é o contato do bolo prensado com hexano para remover o óleo da massa do bolo. Dois mecanismos estavam em operação: lixiviação do óleo para o solvente e a lavagem do bagaço (hexano-sólidos) com micelas (hexano-óleo) progressivamente mais fracas. A extração é normalmente um processo contínuo contracorrente.

[000116] O bolo prensado de HT de controle de canola foi extraído com iso-hexano-hexano empregando tempo total de residência de aproximadamente 90 minutos (da entrada no circuito à saída do circuito), razão de solvente para sólido de aproximadamente 2,5:1 (p/p) e temperatura de micela de 52 + 5 °C. (A taxa de alimentação do bolo prensado de canola era de aproximadamente 90 kg/h com o tempo de retenção de 90 minutos e a taxa de fluxo do solvente era de 220 + 10 kg/h).

[000117] Uma amostra de canola em escamas brancas (WF) de produto de base foi removida antes da dessolventização e foi seca ao ar.

[000118] O óleo bruto foi dessolventizado em um evaporador de película ascendente e um raspador a vapor.

[000119] A dessolventização do bagaço (hexano-sólidos) foi realizada em um tostador-dessolventizador de rosca com duas bandejas Schnecken com revestimento contendo vapor. Vapor de injeção foi adicionado à bandeja superior DT. As temperaturas alvo nas bandejas foram como segue: Saída do Schnecken: <60 °C Bandeja dessolventizada: 102 + 3 °C Bandeja de tostagem: 102 + 3 °C

[000120] O bolo prensado de canola do lote de LT de controle e do LT da linhagem em teste de ECM (CL44864) foi extraído com iso- hexano/hexano empregando tempo total de residência de aproximadamente 110 minutos (da entrada no circuito à saída do circuito), razão de solvente para sólidos de aproximadamente 2,5:1 (w:w) e temperatura de micela de 52 + 5 °C. (A taxa de alimentação do bolo prensado de canola era de aproximadamente 80 kg/h com o tempo de retenção de 110 minutos e a taxa de fluxo do solvente era de 220 + 10 kg/h).

[000121] Uma amostra da linhagem em teste de ECM em escamas brancas (WF) foi removida antes da dessolventização, e seca ao ar.

[000122] O óleo bruto foi dessolventizado em um evaporador de película ascendente e raspador a vapor.

[000123] A dessolvetização do bagaço (hexano-sólidos) foi realizada em um tostador-dessolventizador com duas bandejas e de rosca Schnecken com revestimento preenchido com vapor. Vapor de injeção foi adicionado à bandeja superior DT. As temperaturas alvo nas bandejas foram como segue: Saída do Schnecken: <60 °C Bandeja dessolventizada: 93 + 2 °C Bandeja de tostagem: 93 + 2 °C

[000124] Extrator: Extrator Crown Iron Works Loop (Tipo II) inteiramente de aço inoxidável. O leito de extração tinha 20,3 cm de largura x 12,7 cm de profundidade por 680 cm de comprimento. Adicionalmente, a unidade inclui a dessolventização de micelas, utilizando um evaporador de película ascendente e raspador a vapor e a dessolventização de bagaço (sólidos mais o solvente) utilizando um tostador-dessolventizador de rosca com duas bandejas Schnecken com revestimento contendo vapor. O solvente recuperado foi coletado e reciclado.

Secagem a vácuo

[000125] A secagem a vácuo é efetuada para secar o farelo de canola LT desengordurado até <12% de umidade.

[000126] O único lote de farelo de canola desengordurado que necessitou a secagem foi o lote de LT de controle.Aproximadamente 225 kg de farelo desengordurado foram carregados no Secador Reator Littleford. O farelo foi depois aquecido para 75 ± 2 °C sob vácuo de 1015" HG. A amostragem do farelo para análise de umidade iniciou a ~60 °C, ocorrendo a cada 15 minutos até que umidade estivesse <12%. O farelo foi então descarregado para um saco a granel. O procedimento acima foi repetido até que todo o farelo estivesse seco.

[000127] Secador a vácuo: Modelo de Reator FKM600-D (2Z) Littleford de 600 litros, no de séria 5132, Littleford Day, Florence, KY.

Trituração em moinho de martelo

[000128] A trituração em moinho de martelo foi realizada para produzir um tamanho uniforme de partículas.

[000129] O farelo seco foi triturado em moinho de martelo utilizando uma tela de 8/64". O moinho de martelo foi seco a vácuo entre cada lote de farelo. O farelo foi embalado em tambores de fibra e armazenado à temperatura ambiente até sua remessa.

[000130] A ordem na qual o farelo de canola foi triturado no moinho de martelo foi como segue: 1. HT de controle 2. LT de linhagem em teste de ECM (CL44864). 3. LT de controle. Moinho de martelo: Prater Industries, Modelo G5HFSI, no de série 5075, Chicago, IL

Exemplo 3: Processo para escamas brancas de Indianápolis

[000131] A semente de canola da presente invenção pode ser processada para produzir escamas brancas de canola utilizando o procedimento originalmente descrito por Bailey em Industrial Oil & Fat Products (1996), 5a Ed., Capítulo 2, Wiley Interscience Publication, Nova York, Nova York.

[000132] Para extrair o óleo da semente de canola, a semente de canola é primeiramente transformada em escamas por trituração em máquina para café e calor e tratada com calor em um forno de 85 °C ± 10 °C por pelo menos 20 minutos. Depois do tratamento térmico, a semente triturada é prensada utilizando uma Prensa Taby Tipo-20A (Taby Skeppsta, Orebro, Suécia). O bolo prensado resultante da Prensa Taby é extraído com solvente para remover qualquer óleo residual restante.

[000133] O bolo prensado da etapa de prensagem de sementes oleaginosas é depois extraído com solvente para remover e coletar qualquer óleo residual restante. O bolo prensado é colocado em cartuchos de aço inoxidável que são carregados em um extrator Soxhlet™ feito sob encomenda pela LaSalle Glassware (Guelph, ON). Hexano pode ser como o solvente de extração e o sistema extrator Soxhlet™ é deixado operando por 9-10 horas. O bolo prensado extraído com solvente é então retirado dos cartuchos e espalhado através de uma bandeja até que a espessura do bolo inferior atinja uma polegada. O bolo extraído com solvente é deixado ao ar para dessolventizar por 24 antes da moagem. A escama branca dessolventizada é depois moída utilizando, por exemplo, um Robot Coupe R2N Ultra B (Jackson, MS).

Exemplo 4: Análise de amostras

[000134] As análises químicas e de nutrientes de amostras de ECM e de canola convencional podem ser variavelmente realizadas utilizando os métodos descritos abaixo. As amostras de farelo de canola foram analisadas quanto à matéria seca (Método 930.15; AOAC International. 2007. Official Methods Of Analysis of AOAC Int. 18a ed. Rev. 2. W. Hortwitz e G. W. Latimer Jr., eds. Assoc. Off. Anal. Chem. Int., Gaithersburg. MD. (a seguir "AOAC Int., 2007")), cinza (Método 942.05; AOAC Int.) e GE por meio de calorímetro de bomba (Modelo 6300, Parr Instruments, Moline, IL). AOAC International (2007) Official Methods of Analysis of AOAC Int., 18a ed. Rev. 2., Hortwitz and Latimer, eds. Assoc. Off. Anal. Chem. Int., Gaithersburg. MD. O extrato de éter hidrolisado (AEE) por ácido foi determinado pela hidrólise ácida utilizando HCl 3N (Sanderson) seguida pela extração de gordura bruta com éter de petróleo (Método 954.02; AOAC Int.) em um analisador automático Soxtec 2050 (FOSS North America, Eden Prairie, MN). Sanderson (1986), "A new method of analysis of feeding stuffs for the determination of crude oils and fats", páginas 77-81, em Recent Advances in Animal Nutrition, Haresign and Cole, eds. Butterworths, Londres, Reino Unido. A proteína bruta foi medida por combustão (Método 990.03; AOAC Int.) em um aparelho Elementar Rapid N-cube para proteína/nitrogênio (Elementar Americas Inc., Mt. Laurel, NJ); aminoácidos de acordo com o Método 982.30 E (A, B e C) [AOAC Int.]; fibra bruta de acordo com o Método 978.10 (AOAC Int.); ADF e lignina de acordo com o Método 973.18 (AOAC Int.); e NDF de acordo com Holst (Holst, D. O. 1973. Holst filtration apparatus for Van Soest detergent fiber analysis. J. AOAC. 56:1352-1356). O perfil de açúcares (glicose, frutose, sacarose, lactose, maltose) seguiu o procedimento de Churms (Churms, 1982, Carbohydrates in Handbook of Chromatography.Zweig and Sherma, eds. CRC Press, Boca Raton, FL.), e Kakehi e Honda (1989.Silyl ethers of carbohydrates. Página 43-85 em Analysis of Carbohydrates by GLC and MS. C. J. Biermann and G. D. McGinnis, eds. CRC Press, Boca Raton, FL). Os oligossacarídeos (rafinose, estaquiose, verbascose) foram analisados de acordo com Churms; os minerais (Ca, P, Fe, Mg, Mn, Cu, Na, K, S, Mo, Zn, Se, Co, Cr) por meio de Espectroscopia de Emissão Óptica por Plasma com Acoplamento Indutivo (ICP-OES) [Método 985.01 (A, B, and C); AOAC Int.], e fitato de acordo com Ellis et al (1977. Quantitative determination of phytate in the presence of high inorganic phosphate. Anal.Biochem. 77:536-539.)

Exemplo 5: Resultados analíticos basais em amostras de Escamas Brancas de Indianápolis de ECM e de farelo de canola convencional

[000135] Composição de nutrientes de ECM e farelo de canola convencional tostado, preparados na fábrica piloto. Diversas linhagens de ECM (44864, 121460, 121466 e 65620) foram processadas nolaboratório da Dow AgroSciences em Indianápolis utilizando um processo semelhante ao processamento comercial de farelo de canola, mas sem a etapa final de dessolventização/tostagem depois da extração com solvente do óleo da semente. Este processo e as amostrasresultantes são designados como "Escama branca de Indianápolis". Os parâmetros do processamento estão descritos no Exemplo 3. Estas amostras de escamas brancas de Indianápolis de ECM foram testadas nas Universidades de Illinois e Missouri e os resultados são mostrados nas Tabelas 2a, 2b e 2c. O farelo de canola de controle é um farelo de canola preparado comercialmente que foi tostado. Os valores estão expressos com base em matéria seca, mas incluindo óleo.Tabela 2a. Composição de nutrientes de amostras de farelo de canola em Escamas Brancas Indianápolis de ECM em comparação a farelo de canola convencional

[000136] Os resultados analíticos em amostras de escamas brancas Indianápolis de ECM das Universidades de Illinois e Missouri foram semelhantes aos resultados em semente inteira da Universidade de Manitoba. Os oligossacarídeos estavam mais baixos e os açúcares simples estavam mais altos na amostra 44864 (2010) do que nas outras amostras de ECM, incluindo a 44864 que foi cultivada em 2011. Parece que, para a amostra de 2010, a planta em crescimento catabolizou alguma sacarose e oligossacarídeos para açúcares simples próximo da época da colheita.

[000137] A proteína mais alta, o ADF mais baixo e a lignina e polifenóis mais baixos, vistos nas linhagens de ECM quando comparado ao farelo de canola convencional, usando o protocolo para escamas brancas de Indianápolis, são semelhantes aos resultados vistos com a semente inteira. O valor de 33% de NDF para o farelo comercial está na extremidade mais alta da faixa típica.Tabela 2b. Composição de aminoácidos (% de proteína bruta) de amostras de Escamas Brancas Indianápolis de ECM em comparação com farelo de canola convencional

* Considerados como os principais aminoácidos essenciais limitantes em rações para aves e suínos

[000138] Tal como fora o caso com a semente inteira, os resultados na Tabela 2b mostram que a composição de aminoácidos (em porcentagem de proteína bruta) é semelhante tanto para amostras de escamas brancas Indianápolis de ECM como para de farelo de canola convencional. Isso indica que, como a proteína aumentou nas linhagens de ECM, os aminoácidos importantes aumentaram proporcionalmente. Tabela 2c. Composição de minerais de amostras de escamas brancas Indianápolis de ECM em comparação com canola convencional

[000139] O teor de minerais das amostras de escamas brancas Indianápolis de ECM é semelhante ao do farelo de canola convencional com duas exceções: fósforo e sódio. Tal como fora o caso com os resultados da Universidade de Manitoba em amostra inteira, o fósforo nas linhagens de ECM parece ser sistematicamente mais alto do que no farelo de canola convencional. O sódio extra no farelo de canola convencional deve-se sem dúvida ao sódio adicionado durante o processamento convencional de canola.

Exemplo 6: Processamento de ECM na Fábrica Piloto POS em Saskatoon, Canadá para simular o processamento comercial

[000140] No preparo para avaliação do ECM em rações para animais, foi determinado que, as amostras de farelo de canola deviam ser preparadas em condições do processamento comercial, dado o efeito do processamento sobre o valor nutricional. Consequentemente, amostras foram processadas na Fábrica Piloto POS em Saskatoon. Duas condições de processamento foram utilizadas: temperatura regular (HT) no dessolventizador/tostador e uma temperatura mais baixa (LT), para assegurar que as condições do processamento não exercessem influência dominante sobre o valor nutricional. As condições de processamento usadas na POS estão descritas no Exemplo 2.Tabela 3. Composição de nutrientes de ECM e de farelo de canola convencional, preparados em condições comerciais simuladas do processamento na Fábrica Piloto POS em Saskatoon, Canadá (Análises conduzidas nas Universidades de Illinois e Missouri)

[000141] Os farelos processados na fábrica piloto mostraram uma composição semelhante à da semente inteira e a de amostras de escamas brancas Indianápolis, e as diferenças entre a amostra de ECM e a canola convencional condizem com a análise descrita na Tabela 2a e 2b: proteína 7% mais alta em pontos, ADF 5% mais baixo em pontos, lignina e polifenóis 4% mais baixos em pontos e fósforo 0,35% mais alto em pontos.

Exemplo 7: Análise completa de semente não processada de ECM e de canola convencional

[000142] Composição de nutrientes de semente não processada de canola. Cinco amostras de semente inteira de linhagens de ECM da produção de 2010 e 2011 foram analisadas na Universidade de Manitoba. Estas foram comparadas com a amostra de semente composta oficial da Comissão Canadense de Grãos (CGC) para a produção de 2011 production, a qual, por definição, é a qualidade média das variedades atuais de canola comercial que estão sendo cultivadas na região oeste do Canadá durante aquela temporada. Os resultados da composição de nutrientes são expressos com base em matéria seca livre de óleo e são mostrados na Tabela 4a e 4b.Tabela 4a. Composição de nutrientes de amostras de semente de ECM em comparação com semente de canola convencional

[000143] Os resultados mostram que a diferença maior entre ECM e canola convencional é o teor mais alto de proteína. ECM é 7,2% mais alto em pontos em teor de proteína (51,1% versus 43,9%) com base em matéria seca livre de óleo e 6,1% mais alto em pontos (43,5% versus 37,4%) com base em 3% de óleo, 88% de matéria seca (base típica para especificação de farelo de canola comercial). Ver a Tabela 4a, 4b. A proteína mais alta parece ser responsável pelo teor 2% mais baixo de lignina e polifenóis no ECM e 3% mais baixo de resíduo de ADF (ADF - lignina/polifenóis - celulose). O resíduo de ADF é provavelmente uma combinação de componentes glicoproteína e hemicelulose. Os componentes de fibra são encontrados principalmente nas paredes celulares e na casca. O teor de fósforo de ECM é quase que 30% mais alto do que na canola convencional, e parece uniformemente distribuído entre formas com fitato e sem fitato. O fósforo é um nutriente de valor em rações para animais e ainda que o fosforo ligado ao fitato não seja bem diferido por aves e suínos, o uso comum da enzima fitase em rações para animais disponibilizará este fósforo para o animal. A Tabela 4b fornece uma comparação semelhante de composições de aminoácidos em amostras de semente inteira.Tabela 4b. Composição de aminoácidos (% de proteína bruta) de amostras de semente de ECM em comparação com semente de canola convencional

* Considerados como os principais aminoácidos essenciais limitantes em rações para aves e suínos

[000144] Os resultados na Tabela 4b mostram que a composição de aminoácidos (em porcentagem de proteína bruta) é semelhante entre ECM de farelo de canola comercial. Isso indica que, conforme a proteína aumentava nas linhagens de ECM, do mesmo modo ocorria com os importantes aminoácidos.

Exemplo 8: TME e digestibilidade de aminoácidos para suínos

[000145] Os ensaios de energia metabolizável verdadeira (TME) e de verdadeiros aminoácidos disponíveis (TAAA) foram desenvolvidos em 1976 e 1981, respectivamente, pelo Dr. Ian Sibbald do Agriculture Canada em Ottawa. Em virtude de sua natureza direta e não destrutiva, os ensaios tornaram-se os métodos de escolha para determinar a disponibilidade de energia e de aminoácidos em ingredientes de rações para aves em muitas partes do mundo, incluindo os Estados Unidos.

[000146] Frangos maduros da variedade Single Comb White leghorn (SCWL) foram usados como o animal experimental de escolha em estudos separados conduzidos na Universidade de Illinois e na Universidade da Geórgia. É bem sabido que as aves possuem um tempo de esvaziamento gástrico rápido.A retirada de ração por um período de 24 horas permite supor com confiabilidade que o trato digestivo dos animais em teste está vazio, não contendo resíduos alimentares previamente consumidos.

[000147] Cada ave (em geral 8 animais por tratamento) é alimentada precisamente com 35 gramas da ração em teste, colocada diretamente no papo por meio de intubação.Os ingredientes com alto teor de fibra são normalmente alimentados em 25 em vez de 35 gramas, o volume espacial sendo semelhante. Após a intubação, o acesso à água foi permitido às aves, mas não à ração adicional, por um período de 40 horas, durante o qual o material excretado foi recolhido quantitativamente. Depois da coleta, o material excretado é seco em um forno com entrada forçada de ar, normalmente a 80 °C. Este material é subsequentemente pesado e triturado para determinação da energia bruta (GE) em ensaios de TME, ou para determinar o teor de aminoácidos. A GE e a composição de aminoácidos dos ingredientes são determinadas do mesmo modo. Uma vez pesadas, as amostras de material excretado são em geral agrupadas e homogeneizadas para uma única determinação de GE ou dos aminoácidos. A massa de material excretado por ave varia muito mais do que a GE ou a composição de aminoácidos do material excretado específico. Essa observação, e a despesa e o tempo de espera de determinações de GE e de aminoácidos, justifica o agrupamento.

[000148] A digestibilidade é calculada usando método bem conhecidos na técnica para energia ou para cada aminoácido individualmente. Estimativas da perda endógena de GE e de aminoácidos são usadas para corrigir artefatos experimentais.

Exemplo 9: Energia digestível (DE), energia metabolizável (ME) para suínosDE e ME.

[000149] Quarenta e oito leitões em crescimento (Peso corporal inicial: 20 kg) serão distribuídos para um estudo com delineamento em blocos completos aleatórios na Universidade de Illinois. Os porcos serão designados para 1 de 6 dietas, com 8 porcos repetidos por dieta. Os porcos serão colocados em jaulas metabólicas que estarão equipadas com comedor e bebedouro do tipo nipple, pisos completamente ripados, piso com tela e bandejas para urina. Isso permitirá a coleta total, mas separada, de urina e materiais fecais de cada porco.

[000150] A quantidade de ração fornecida diariamente por porco será calculada em 3 vezes a demanda estimada para a manutenção de energia (ou seja, 106 kcal ME por kg 0,75; NRC, 1998) para o menor porco em cada réplica, e dividida em 2 refeições iguais. NRC 1998, Nutrient requirements of swine, 10a edição revisada.National Academy Press. Washington, DC. Água estará sempre disponível. O experimento durará 14 dias. Os 5 dias iniciais serão considerados um período de adaptação à dieta, com a urina e os materiais fecais coletados durante os 5 dias seguintes de acordo com procedimentos padrão, usando a abordagem marcador para marcador (Adeola, O. 2001, Digestion and balance techniques in pigs, páginas 903-916 em Swine Nutrition. 2a ed. A. J. Lewis e L. L. Southern, ed. CRC Press, Nova York, NY. NRC. 1998.Nutrient Requirements of Swine. 10a ed. rev. Natl. Acad. Press,Washington DC.). Amostras de urina serão coletadas em baldes para urina sobre um conservante de 50 mL de ácido clorídrico.Amostras fecais e 10% da urina coletada serão armazenadas a -20 oC imediatamente após a coleta. Na conclusão do experimento, as amostras de urina serão descongeladas e misturadas dentro do mesmo animal e mesma dieta, e uma amostra será retirada para análise química.

[000151] As amostras fecais serão secas em forno com entrada forçada de ar e finamente trituradas antes da análise. As amostras fecais, de urina e de rações serão analisadas em duplicata quanto à DM e à energia bruta usando calorimetria de bomba (Parr Instruments, Moline, IL). Após a análise química, valores de digestibilidade total no trato serão calculados para energia em cada dieta por meio de procedimentos previamente descritos (Widmer, M. R., L. M. McGinnis, and H. H. Stein. 2007. Energy, phosphorus, and amino acid digestibility of high-protein distillers dried grains and corn germ fed to growing pigs. J. Anim. Sci. 85:2994-3003). A quantidade de energia perdida nas fezes e na urina, respectivamente, será calculada, e as quantidades de DE e ME em cada uma das 24 dietas serão calculadas (Widmer et al., 2007). A DE e a ME no milho será calculada dividindo os valores de DE e ME para a dieta com milho pela taxa de inclusão do milho nesta dieta. Estes valores serão então usados para calcular a contribuição do milho para a DE e a ME nas dietas com milho-farelo de canola e na dieta com milho- farelo de soja, e a DE e a ME em cada fonte de farelo de canola e na amostra de farelo de soja serão então calculadas pela diferença conforme previamente descrito (Widmer et al., 2007).

[000152] Os dados serão analisados utilizando o procedimento Proc Mixed Procedure no SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC). Os dados obtidos para cada dieta e para cada ingrediente serão comparados por meio de análise ANOVA. A homogeneidade das variâncias será confirmada utilizando o procedimento UNIVARIATE no Proc Mixed. Dieta ou ingrediente serão o efeito fixo e porco e réplica serão os efeitos aleatórios. Médias dos mínimos quadrados serão calculadas usando um teste LSD, e as médias serão separadas usando a afirmação pdiff no Proc Mixed. O porco será a unidade experimental para todos os cálculos, e um nível alfa de 0,05 será utilizado para avaliar a significância entre as médias.

Exemplo 10: Digestibilidade de aminoácidos para suínos (AID e SID)

[000153] A AID e SID para suínos foram analisadas em um estudo na Universidade de Illinois. Doze leitões em crescimento (Peso corporal inicial: 34,0 ± 1,41 kg) tiveram uma cânula em T inserida próxima ao íleo distal e foram distribuídos para um delineamento experimental de quadrado latino 6 x 6 repetido com 6 dietas e 6 períodos em cada quadrado. Os porcos foram abrigados individualmente em currais de 1,2 x 1,5 m em uma sala com controle ambiental. Os currais tinham laterais sólidas, pisos completamente ripados, e foram instalados um comedor e um bebedouro do tipo nipple em cada um dos currais.

[000154] Seis dietas foram preparadas. Cinco dietas eram à base de amido de milho, açúcar e SBM ou farelo de canola, e SBM ou farelo de canola eram as únicas fontes de AA nestas dietas. A última dieta era uma dieta livre de N que foi usada para estimar as perdas endógenas basais no íleo de CP e AA. Vitaminas e minerais foram incluídos em todas as dietas para atender ou ultrapassar as demandas atuais estimadas para porcos em crescimento (NRC, 1998). Todas as dietas também continham óxido crômico 0,4% como marcador não digerível.

[000155] Os pesos dos porcos foram registrados no início e no final de cada período, e a quantidade de ração fornecida a cada dia foi também registrada. Todos os porcos foram alimentados a um nível de 2,5 vezes a demanda energética diária para manutenção, e água estava disponível sempre por todo o experimento. Os 5 dias iniciais de cada período foram considerados um período de adaptação à dieta. Amostras do material digerido no íleo foram coletadas por 8 horas no Dia 6 e 7 utilizando procedimentos padrão. Um saco plástico foi preso ao cano da cânula usando um fio tipo cable tie, e o material digerido fluindo para o saco foi coletado. Os sacos eram retirados sempre que ficavam cheios com material digerido, ou ao menos a cada 30 minutos, e imediatamente congelados a -20 °C para impedir a degradação bacteriana dos aminoácidos no material digerido. Na conclusão de um período experimental, os animais eram privados de ração durante a noite e na manhã seguinte, e uma nova dieta experimental era oferecida.

[000156] Na conclusão do experimento, as amostras ileais foram descongeladas, agrupadas dentro do mesmo animal e mesma dieta, e uma subamostra foi coletada para análise química.Uma amostra de cada dieta e de cada uma das amostras de farelo de canola e de SBM foi coletada também.As amostras de material digerido foram liofilizadas e finamente trituradas antes da análise química. Todas as amostras de dietas e de material digerido foram analisadas quanto a DM, cromo, proteína bruta e AA, e a de farelo de canola e de SBM foram analisadas quanto à proteína bruta e AA.

[000157] Valores para digestibilidade ileal aparente (AID) de AA em cada dieta foram calculados usando a equação [1]: AID, (%) = [1-(AAd/AAf) x (Crf/Crd)] x 100, [1] onde AID é o valor de digestibilidade ileal aparente de um AA (%), AAd é a concentração daquele AA na DM do material digerido ileal, AAf é a concentração de AA daquele AA na DM da ração, Crf é a concentração de cromo na DM da ração e Crd é a concentração de cromo na DMA do material digerido ileal. A AID para CP será também calculada usando esta equação.

[000158] O fluxo endógeno basal para o íleo distal de todo AA foi determinado com base no fluxo obtido depois da alimentação com a dieta livre de N usando a equação [2]: IAAfinal = AAd x (Crf/Crd) [2] onde IAAfinal é a perda endógena basal de um AA (mg por kg DMI). A perda endógena basal de CP será determinada usando a mesma equação.

[000159] A correção da AID com a IAAfinal de todo AA permitiu calcular valores padronizados de digestibilidade ileal de AA usando a equação [3]: SID, (%) = AID + [(IAAfinal/AAf) x 100] [3] onde SID é o valor padronizado de digestibilidade ileal (%).

[000160] Os dados foram analisados usando o procedimento Proc GLM do SAS (SAS inst. Inc., Cary, NC). As 5 dietas contendo farelo de canola ou SBM foram comparadas por meio de ANOVA com fonte de farelo de canola, porcos e período como os principais efeitos. Um teste LSD foi utilizado para separar as médias. Um nível alfa de 0,05 foi usado para avaliar a significância entre as médias. O porco individual representava a unidade experimental para todas as análises.

Exemplo 11: Degradabilidade de AA em lácteos

[000161] A degradabilidade de aminoácidos de ECM será avaliada por incubação in situ de amostras de farelo ECM em animais com cânulas inseridas no rume, como gado leiteiro, para estimar os teores de proteína solúvel e degradável e para determinar a taxa de degradação (Kd) da fração degradável.

[000162] O gado será alimentado com uma dieta mista em forma de ração mista total (TMR) contendo 28,1% de silagem de milho, 13,0% de silagem de alfafa, 7,4% de feno de alfafa, 20,4% de milho triturado, 14,8% resíduo úmido de cervejaria, 5,6% de semente inteira do algodão, 3,7% de cascas de soja e 7,0% de suplementos (proteína, minerais, vitaminas). Sacos padrão de poliéster in situ (R510, 5 cm x 10 cm, tamanho de poros de 50 micra) contendo aproximadamente 6 g de matéria seca (DM) de farelo de soja (SBM), farelo de canola convencional (CM) ou farelo de canola melhorado (ECM) serão incubados no rume por 0, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 32, 40, 48 e 64 horas. Sacos em duplicata serão retirados em cada momento e lavados com água corrente até que o fluxo de saída fique claro. Os sacos serão secos a 55 °C por 3 dias e, depois, e o resíduo será removido e pesado para determinar o desaparecimento de matéria seca (DM). Os resíduos serão analisados quanto ao teor de N usando o método de combustão de Leco.Amostras do tempo zero não serão incubadas no rume, mas serão lavadas e processadas na mesma maneira que as amostras incubadas no rume.

[000163] Amostras de resíduo do tempo zero e do resíduo restante depois de 16 horas de incubação no rume serão analisadas quanto aos constituintes aproximados (DM, gordura bruta, fibra bruta e cinza) e à composição de aminoácidos (AA) (sem triptofano). Esses parâmetros podem ser usados para gerar estimativas de proteína degradável no rume (RDP) e proteína não degradável no rume (RUP), conforme utilizados nas diretrizes do National Research Council (2001) para demandas de nutrientes de gado leiteiro.

[000164] A porcentagem de N restante da amostra original em cada momento pode ser calculada, e a média dos valores reproduzidos para cada momento na mesma vaca é calculada. Os valores das três vacas serão ajustados à equação não linear descrita por 0rskov e McDonald (1979). Nessa abordagem, o desaparecimento ruminal de CP supostamente segue a cinética de primeira ordem conforme definida pela equação, desaparecimento de CP = A + B x (1 - e-Kd x t), onde A é a fração de CP solúvel (% de CP), B é a fração de CP potencialmente degradável (% de CP), Kd é constante da taxa de degradação (h-1) e t é o tempo de incubação ruminal (h). A fração C (não degradável no rume) é calculada como fração A menos fração B. As equações serão ajustadas usando o PROC NLIN do SAS (versão 9.2; SAS Institute Inc., Cary, NC), com o método de cálculo de Marquardt.

[000165] As equações para computar os valores de RDP e RUP (em porcentagens de CP) são: RDP = A + B[Kd/(Kd + Kp)], e RUP = B[Kp/(Kd + Kp)] + C, onde Kp é a taxa de passagem a partir do rume. Por não se puder calcular a taxa de passagem diretamente a partir desses dados (em que os substratos estão contidos no rume e impedidos de passarem para o trato inferior), uma taxa para Kp precisa ser suposta. Neste estudo, um valor de 0,07 será usado para Kp, o qual é semelhante ao valor calculado de acordo com equações no NRC (2001) para uma vaca leiteira com alta produção consumindo uma dieta típica de lactação. Considerando que esse projeto visa comparar fontes de proteína e estimativas de degradabilidade ruminal sob as mesmas condições, a escolha de uma taxa de passagem para determinar RDP e RUP é arbitrária.

[000166] A equação final para cada amostra será gerada usando amostras incubadas por 0, 2, 4, 8, 16, 24 e 48 h de acordo com as recomendações do NRC (2001). Dados para os momentos adicionais de incubação neste estudo (ou seja, 12, 20, 32, 40 e 64 h) poderão ser utilizados para verificar a cinética do sistema e para assegurar que o farelo de canola modificado corresponde com as suposições em especificações do NRC (2001).

Exemplo 12: TME e TAAA para aves, incluindo uma comparação da TME real com a TME prevista com base em resultados analíticos das Universidades de Illinois, Missouri e Manitoba

[000167] Avaliações de energia metabolizável verdadeira (TME) para aves em amostras de ECM foram conduzidas na Universidade de Illinois e na Universidade da Geórgia. Os protocolos estão descritos no Exemplo 8.Tabela 5. Teor de TME de ECM e de farelo de canola convencional em estudos na Universidade de Illinois e na Universidade da Geórgia.

* significa dentro de uma coluna e grupo com dil terentes letras sãosignificativamente diferentes (p<0,05)** (SE)*** (diferença percentual)

[000168] No caso das amostras de ECM e de farelo de canola preparadas na POS, a comparação apropriada é entre os dois farelos LT, para eliminar efeitos do processamento. Os resultados foram comparáveis em ambos os estudos da Universidade de Illinois e da Universidade da Geórgia. A TME para aves é significativamente mais alta para o ECM (LT) do que para o farelo de canola convencional (LT) - 9% mais alta no estudo da Universidade de Illinois e 14% mais alta no estudo da Universidade da Geórgia. Estes resultados confirmam os resultados da equação de predição abaixo. Tabela 4. As amostras de escamas brancas de ECM e de farelos de canola convencionais foram também coletadas na POS imediatamente depois do estágio do extrator com solvente e antes do estágio de DT. A TME para aves destes farelos WF foi comparada em um estudo separado na Universidade da Geórgia e, tal como com as amostras LT, a WF de ECM apresentava TME significativamente mais alta do que a WF de farelos de canola convencionais. Tabela 4.

[000169] Quatro variedades de ECM foram independentemente processadas nos laboratórios da Dow AgroSciences em Indianápolis usando os métodos de processamento para escama branca descritos no Exemplo 3.Essas amostras foram depois submetidas à análise de TME para aves nas duas universidades. Não houve diferença significativa entre as linhagens testadas de ECM, com a exceção de que a linhagem 121460 pareceu ter TME mais baixa do que as linhagens 121466 ou 65620.

[000170] Os valores observados de TME, provenientes destes estudos, eram compatíveis com os teores previstos de energia metabolizável abaixo. As Demandas de Nutrientes para Aves do National Research Council (NRC, 1984, Nutrient requirements of poultry. Nona edição revisada.National Academy Press. Washington, DC) possuem uma equação de predição para ME em farelo de canola(farelo de semente de colza duplo zero): ME kcal/kg = (32,76 x CP%) + (64,96 x EE%) + (13,24 x NFE%)

[000171] Por cálculo, CP 7% mais alta deve ser compensada por NFE 7% mais baixa, de modo que o coeficiente líquido para CP deve ser: 32,76 - 13,24 = 19,52. Isso resulta em 137 kcal/kg mais de ME em ECM do que no farelo de canola (7% x 19,52 = 137). O problema com esta equação é que NFE é uma estimativa ruim para valor energético de açúcar e amido.

[000172] Uma equação alternativa é a equação de predição de EEC para ME para aves (adultas). (Fisher, C and J.M. McNab. 1987. Techniques for determining the ME content of poultry feeds. Em: Haresign and D.J.A. Cole (Eds), Recent Advances in Animal Nutrition - 1987. Butterworths, Londres. P. 3-17): ME, kcal/kg = (81,97 x EE%) + (37,05 x CP%) + (39,87 x Amido %) + (31,08 x Açúcares %)

[000173] A equação de EEC é uma equação de "contribuição positiva" que fornece o valor para nutrientes digeríveis em farelo de canola, tais como proteína, gordura, amido e açúcares livres. Dado que a única diferença analítica entre ECM e farelo de canola é proteína, o coeficiente 37,05 pode ser usado para calcular a energia extra:

[000174] 37,05 x 7% = 259 kcal/kg.A equação de EEC é destinada arações completas, as quais geralmente possuem uma digestibilidade mais alta do que o farelo de canola. Por conseguinte, o coeficiente 37,05 é alto demais.

[000175] Uma abordagem alternativa é usar primeiramente os princípios para o valor energético de proteína. Uma estimativa aproximada é 4 calorias de energia bruta por grama de proteína x 80% de digestibilidade de proteína x 5% de perda por excreção de nitrogênio = aproximadamente 75% de calorias brutas por grama (3 calorias de energia metabolizável por grama ou 30 x proteína %. Isso produz uma energia metabolizável de: 30 x 7% = 210 kcal/kg de ME extra em ECM.

[000176] Em suma, prevê-se que o farelo ECM teria entre 140 - 260 kcal/kg de mais ME para aves do que o farelo de canola convencional. O valor de 140 kcal/kg está provavelmente grosseiramente subestimado, e o de 260 kcal/kg pode tender para otimista. Um aumento de 200 - 220 kcal/kg de mais ME para aves é mais provável.Se expresso com base em "no estado" (Tabela 1), o ECM comercial teria provavelmente uma ME para aves de 2200 kcal/kg contra 2000 kcal/kg para farelo de canola convencional.Este aumento é de 10% em energia.

[000177] A digestibilidade verdadeira de aminoácidos (TAAA) para aves foi também medida na Universidade de Illinois e na Universidade da Geórgia. Nesse caso, somente amostras de farelo preparadas na POS foram analisadas porque a digestibilidade de aminoácidos muito mais alta da escama branca contra o farelo de canola testado não foi considerada comercialmente relevante. Tabela 6.Tabela 6. Disponibilidade verdadeira de aminoácidos (TAAA) para aves de aminoácidos importantes em ECM e farelos de canola convencionais preparados na POS em estudos

[000178] Não houve diferenças estatisticamente significantes em disponibilidade verdadeira de aminoácidos para aves entre as diferentes amostras de farelo de canola.Tabela 6.

Exemplo 13: Digestibilidade de aminoácidos (AID e SID) para suínos e NE predita

[000179] Estudos de digestibilidade ileal de aminoácidos para suínos foram conduzidos na Universidade de Illinois. Farelos preparados na Fábrica Piloto POS foram usados para a comparação.Tabela 7. Digestibilidade ileal aparente de aminoácidos (AID) para suínos e digestibilidade ileal padronizada de aminoácidos (SID) para suínos de proteína e aminoácidos importantes em ECM e farelos de canola convencionais preparados na POS em um estudo na Universidade de Illinois.

* significa dentro de uma linha e grupo com diferentes letras são significativamente diferentes (p<0,05)

[000180] Algumas diferenças estatisticamente significantes em digestibilidade de proteína e de aminoácidos entre amostras de ECM e de farelo de canola foram notadas. O ECM apresentou AID de proteína bruta mais alta do que o farelo de canola, mas a diferença em SID de proteína não foi significante. Para ambas, AID e SID, lisina é mais digerível no ECM do que no farelo de canola convencional que foi submetido ao mesmo tratamento térmico. Tabela 7.

[000181] Para suínos, as equações geralmente aceitas para predizer DE, ME e NE em suínos são as de Noblet conforme descritas em EvaPig (2008, Versão 1.0. INRA, AFZ, Ajinomoto Eurolisina) e nas Demandas de Nutrientes de Suínos do NRC (NRC, 1998, Nutrient requirements of swine; Décima edição revisada; National Academy Press. Washington, DC): Equação 1-4. DE, kcal/kg = 4151 - (122 x Cinza %) + (23 x CP%) + (38 x EE%) - (64 x CF%) Equação 1-14. NE, kcal/kg = 2790 + (41,22 x EE%) +(8,1 x Amido %) - (66,5 x Cinza %) - (47.2 x ADF%)

[000182] As equações de Noblet são um híbrido de fatores positivos e negativos de contribuição: gordura, proteína e amido possuem coeficientes positivos, enquanto cinza, CF e ADF possuem coeficientes negativos. Proteína não é usada na equação para Energia Líquida (NE), mas as diferenças entre ECM e farelo de canola podem ser capturadas pelas diferenças em ADF. Como amido e cinza são iguais em ECM e farelo de canola, então a diferença principal é ADF. Uma ADF 5% mais baixa em pontos resulta em 47,2 x 5% = 236 kcal/kg de mais NE em ECM. Esse número predito é semelhante ao número de ME para aves, assim, mais uma vez um aumento em energia líquida para suínos de 200 kcal/kg para ECM com base em "no estado" (Tabela 1) é provável. Isso deve resultar em 12% de aumento em energia.

Exemplo 14: Híbridos adicionais de ECM

[000183] Um novo híbrido de canola CL166102H também exibiu as propriedades de farelo melhorado (ECM). Os traços de desempenho e qualidade medidos na semente deste híbrido, colhido a partir de testes em pequenas parcelas realizados em 2011, incluem óleo, proteína de farelo, ADF e glucosinolatos totais (Tgluc). Ver a Tabela 8.

[000184] Os resultados na Tabela 8 indicam claramente que esta nova linhagem DAS ECM é superior à variedade comercial com respeito a atributos do farelo.Tabela 8b: Desempenho agronômico de linhagens de ECM (TestesC3B03)

Claims (11)

1. Uso de uma semente de canola produzida por uma planta de canola de semente escura, caracterizado pelo fato de que é para a produção de farelo de canola, em que a planta de canola de semente escura compreende as seguintes características de semente: teor de proteínas de pelo menos 45%; teor de fibra de detergente ácido (ADF) não superior a 18% em massa seca, isenta de óleo; óleo de semente compreendendo pelo menos 68% de ácido oleico (C18:1) e menos de 3% de ácido linolênico (C18:3); e um teor combinado de lignina e polifenólicos de 5,2% ou menos ou um teor de fósforo de pelo menos 1,3% livre de óleo, massa seca; ainda em que a planta de canola de semente escura é selecionada do grupo que consiste em CL065620, CL044864, CL121460H, CL166102H e CL121466H.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a planta de canola de semente escura compreende a característica de semente de um óleo de semente compreendendo menos de 2% de ácido erúcico.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a planta de canola de semente escura compreende tanto as características de uma lignina combinada quanto o conteúdo polifenólico de 5,2% ou menos e um teor de fósforo de pelo menos 1,3% livre de óleo, massa seca.

4. Método para a produção de um farelo de canola, caracterizado pelo fato de que compreende processar as sementes de uma planta de canola de semente escura que compreende as seguintes características de sementes: teor de proteínas de pelo menos 45%, teor de fibra de detergente ácido (ADF) não superior a 18% livre de óleo, massa seca, óleo de semente compreendendo pelo menos 68% de ácido oleico (C18:1) e menos de 3% de ácido linolênico (C18:3), e um teor combinado de lignina e polifenólicos de 5,2% ou menos ou um teor de fósforo de pelo menos 1,3% de massa seca livre de óleo; em que a planta de canola de semente escura é selecionada do grupo que consiste em CL065620, CL044864, CL121460H, CL166102H e CL121466H.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o processamento da semente da planta de canola de semente escura compreende extrair um componente de óleo da semente com um solvente para produzir um componente de farelo.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o processamento da semente da planta de canola de semente escura compreende ainda a secagem do componente de farelo.

7. Farelo de canola extraído e seco, produzido a partir de sementes de planta de canola de semente escura, caracterizado pelo fato de que o farelo de canola compreende: teor de proteínas de pelo menos 45%; teor de fibra de detergente ácido (ADF) não superior a 18% livre de óleo, massa seca; um teor combinado de lignina e polifenólico de 5,2% ou menos livre de óleo, massa seca; e um teor de fósforo de pelo menos 1,3% livre de óleo, massa seca ainda em que a planta de canola de semente escura é selecionada do grupo que consiste em CL065620, CL044864, CL121460H, CL166102H e CL121466H.

8. Farelo de canola, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que possui uma energia metabolizável média verdadeira de pelo menos 2400 kcal/kg.

9. Farelo de canola, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que possui pelo menos uma das seguintes propriedades: um perfil favorável de digestibilidade de aminoácidos; uma digestibilidade de aminoácidos de ao menos aproximadamente 90% da exibida pelo farelo de soja (10% de teor de umidade); e um teor de energia digestível ou teor de energia metabolizável de ao menos aproximadamente 80% do exibido pelo farelo de soja.

10. Farelo de canola, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que o farelo de canola é extraído com solvente.

11. Farelo de canola, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizado pelo fato de que a farinha de canola é extraída com óleo.

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