JP2014500867A - 皮膚浸透性および細胞侵入性（ｓｐａｃｅ）ペプチドとその使用法 - Google Patents

皮膚浸透性および細胞侵入性（ｓｐａｃｅ）ペプチドとその使用法 Download PDF

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Abstract

本開示は、活性物質または活性物質担体の送達を容易にする、ペプチドおよびペプチド組成物であって、角質層（ＳＣ）および／または生細胞の細胞膜を透過することができる組成物を提供する。
【選択図】図１１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年１１月９日に出願された米国仮特許出願第６１／４１１，８８４号「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｏ Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、２０１１年８月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／５２７，５７４号「Ｓｋｉｎ Ｐｅｒｍｅａｔｉｎｇ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｅｎｔｅｒｉｎｇ（ＳＰＡＣＥ） Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｕｓｅ Ｔｈｅｒｅｏｆ」、および２０１１年８月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／５２８，０３６号「Ｓｋｉｎ Ｐｅｒｍｅａｔｉｎｇ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｅｎｔｅｒｉｎｇ（ＳＰＡＣＥ） Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｕｓｅ Ｔｈｅｒｅｏｆ」に基づく優先権を主張し、当該出願の全ての記載内容をあらゆる目的で参照により本明細書に援用するものである。
政府の権利
本発明は、国立衛生研究所により授与された連邦補助金番号１ＵＯ１ ＨＬ０８０７１８および国立研究資源センターにより授与された連邦補助金番号１Ｓ１０ＲＲ０１７７５３−０１の下、合衆国政府の支援を受けてなされた。合衆国政府は、本発明に関し所定の権利を有する。
ヒトの身体の中で最大の器官である皮膚は数々の皮膚科疾患の宿主であり、これらの疾患はまとめてヒトの健康上の症状の大きな１つのカテゴリーをなす。したがって、治療薬、例えばｓｉＲＮＡなどの高分子の皮膚内への送達の成功は、積極的な研究開発のテーマとなっている。しかしながら、局所ｓｉＲＮＡ送達という目標は極めて困難であり、多少の例外はあるものの、達成は非常に難しい。主な難関は高分子の皮膚透過の悪さである。高分子の透過を促進するために提案されている様々な物理化学的方法の中でも、ペプチド担体は、その使用の簡易性、多様性、および皮膚内の細胞サブタイプを標的とする潜在的能力により、有力候補として浮上してきた。細胞の細胞質中に薬物を送達するために初期に同定された、ＴＡＴ、ポリアルギニン、マガイニン、およびペネトラチンを含む数種のペプチドは、角質層（ＳＣ）を超える透過について試験され、その少数は小分子の表皮内への送達において多少の有効性を示した。対照的に、１種類のペプチド、ＴＤ−１のみは、ＳＣを透過し、局所的に塗布した薬物の全身への取り込みを促進する能力を有することを明確に示した。いくつかのペプチドが細胞膜を透過し、少数のペプチドがＳＣを透過することは知られているが、ＳＣを超える、および／または表皮および真皮生細胞の細胞膜を超える、高分子および他の活性物の透過を同時に促進するペプチドが必要とされている。
本開示は、活性物質または活性物質担体の送達を容易にするペプチドおよびペプチド組成物であって、ＳＣおよび／または生細胞の細胞膜を透過することができる組成物を提供する。
第１の態様において、本開示は、アミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、またはＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）を含むペプチドであって、活性物質またはその活性物質を含む活性物質担体と共役するペプチドを含む組成物であって、角質層（ＳＣ）の層と接触したときにその層を透過することができる、または細胞と接触したときにその細胞を透過することができる組成物を提供する。
第１の態様の一実施形態において、この組成物は、角質層（ＳＣ）の層を透過することができ、かつ細胞を透過することができる。
第１の態様の一実施形態において、アミノ酸配列は、ＣＴＧＳＴＱＨＱＣ（配列番号７）、ＣＨＳＡＬＴＫＨＣ（配列番号８）、ＣＫＴＧＳＨＮＱＣ（配列番号９）、ＣＭＧＰＳＳＭＬＣ（配列番号１０）、ＣＴＤＰＮＱＬＱＣ（配列番号１１）、またはＣＳＴＨＦＩＤＴＣ（配列番号１２）を含む。
第１の態様の一実施形態において、アミノ酸配列は、ＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、またはＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）を含む。アミノ酸配列が、ＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、またはＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）を含む一実施形態において、ペプチドは、Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を含む環状ペプチドである。
第１の態様の一実施形態において、組成物は、非ヒト動物生細胞の細胞膜を透過することができる。
第１の態様の一実施形態において、組成物は、ヒト生細胞の細胞膜を透過することができる。
第１の態様の一実施形態において、組成物は、表皮または真皮の生細胞の細胞膜を透過することができる。
第１の態様の一実施形態において、組成物は、生免疫細胞の細胞膜を透過することができる。
第１の態様の一実施形態において、活性物質は高分子を含む。一実施形態において、高分子はタンパク質を含む。一実施形態において、タンパク質は、抗体または少なくとも１つのパラトープを含むその断片を含む。
活性物質が高分子を含む第１の態様の一実施形態において、高分子は核酸を含む。一実施形態において、核酸はＤＮＡである。一実施形態において、核酸はＲＮＡである。核酸がＲＮＡである一実施形態において、ＲＮＡは干渉ＲＮＡである。ＲＮＡが干渉ＲＮＡである一実施形態において、干渉ＲＮＡはｓｈＲＮＡである。ＲＮＡが干渉ＲＮＡである一実施形態において、干渉ＲＮＡはｍｉＲＮＡである。ＲＮＡが干渉ＲＮＡである一実施形態において、干渉ＲＮＡはｓｉＲＮＡである。干渉ＲＮＡがｓｉＲＮＡである一実施形態において、ｓｉＲＮＡはＩＬ−１０ ｓｉＲＮＡである。干渉ＲＮＡがｓｉＲＮＡである一実施形態において、ｓｉＲＮＡはＣＤ８６ ｓｉＲＮＡである。干渉ＲＮＡがｓｉＲＮＡである一実施形態において、ｓｉＲＮＡはＫＲＴ６ａ ｓｉＲＮＡである。干渉ＲＮＡがｓｉＲＮＡである一実施形態において、ｓｉＲＮＡはＴＮＦＲ１ ｓｉＲＮＡである。干渉ＲＮＡがｓｉＲＮＡである一実施形態において、ｓｉＲＮＡはＴＡＣＥ ｓｉＲＮＡである。干渉ＲＮＡがｓｉＲＮＡである一実施形態において、ｓｉＲＮＡは変異特異的ｓｉＲＮＡである。
第１の態様の一実施形態において、活性物質は薬学的化合物である。
第１の態様の一実施形態において、活性物質は検出可能な物質を含む。活性物質が検出可能な物質を含む一実施形態において、検出可能な物質は蛍光標識を含む。活性物質が検出可能な物質を含む一実施形態において、検出可能な物質は放射性標識を含む。
第１の態様の一実施形態において、活性物質はナノ粒子である。
第１の態様の一実施形態において、活性物質は低分子量化合物である。
第１の態様の一実施形態において、活性物質は、ＩＬ−１０生物活性の阻害剤である。活性物質がＩＬ−１０生物活性の阻害剤である一実施形態において、活性物質は、ＩＬ−１０ ｓｉＲＮＡおよびＩＬ−１０に結合する抗体またはその断片から選択される。
第１の態様の一実施形態において、ペプチドは活性物質と共役する。
第１の態様の一実施形態において、ペプチドは、活性物質を含む活性物質担体と共役する。ペプチドが活性物質を含む活性物質担体と共役する一実施形態において、活性物質担体はリポソームである。ペプチドが活性物質を含む活性物質担体と共役する一実施形態において、活性物質担体はナノ粒子である。ペプチドが活性物質を含む活性物質担体と共役する一実施形態において、活性物質担体は高分子ミセルである。
第２の態様において、本開示は、アミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、またはＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）を含むペプチドを含む組成物であって、このペプチドが活性物質または活性物質を含む活性物質担体と会合し、この会合が、疎水性相互作用、静電相互作用、またはファン・デル・ワールス相互作用によって生じる、角質層（ＳＣ）の層と接触したときにその層を透過することができる、または細胞と接触したときにその細胞を透過することができる、組成物を提供する。
第２の態様の一実施形態において、組成物は角質層（ＳＣ）の層を透過することができ、かつ細胞を透過することができる。
第２の態様の一実施形態において、アミノ酸配列は、ＣＴＧＳＴＱＨＱＣ（配列番号７）、ＣＨＳＡＬＴＫＨＣ（配列番号８）、ＣＫＴＧＳＨＮＱＣ（配列番号９）、ＣＭＧＰＳＳＭＬＣ（配列番号１０）、ＣＴＤＰＮＱＬＱＣ（配列番号１１）、またはＣＳＴＨＦＩＤＴＣ（配列番号１２）を含む。
第２の態様の一実施形態において、アミノ酸配列は、ＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、またはＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）を含む。アミノ酸配列が、ＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、またはＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）を含む一実施形態において、ペプチドは、Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を含む環状ペプチドである。
第３の態様において、本開示は、アミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、またはＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）のうちの１つから選択される一連の３個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むペプチドであって、活性物質または活性物質を含む活性物質担体と共役するペプチドを含む組成物であって、角質層（ＳＣ）の層と接触したときにその層を透過することができる、または細胞と接触したときにその細胞を透過することができる、組成物を提供する。
第３の態様の一実施形態において、組成物は角質層（ＳＣ）の層を透過することができ、かつ細胞を透過することができる。
第３の態様の一実施形態において、アミノ酸配列は、アミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、またはＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）のうちの１つから選択される一連の４個の連続するアミノ酸を含む。
第３の態様の一実施形態において、アミノ酸配列は、アミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、またはＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）のうちの１つから選択される一連の５個の連続するアミノ酸を含む。
第３の態様の一実施形態において、アミノ酸配列は、アミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、またはＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）のうちの１つから選択される一連の６個の連続するアミノ酸を含む。
第４の態様において、本開示は、アミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、またはＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）のうちの１つから選択される一連の３個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むペプチドを含む組成物であって、このペプチドが、活性物質または活性物質を含む活性物質担体と会合し、この会合が、疎水性相互作用、静電相互作用、またはファン・デル・ワールス相互作用によって生じる、角質層（ＳＣ）の層と接触したときに前記層を透過することができる、または細胞と接触したときに前記細胞を透過することができる組成物を提供する。
第４の態様の一実施形態において、組成物は角質層（ＳＣ）の層を透過することができ、かつ細胞を透過することができる。
第４の態様の一実施形態において、アミノ酸配列は、アミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、またはＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）のうちの１つから選択される一連の４個の連続するアミノ酸を含む。
第４の態様の一実施形態において、アミノ酸配列は、アミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、またはＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）のうちの１つから選択される一連の５個の連続するアミノ酸を含む。
第４の態様の一実施形態において、アミノ酸配列は、アミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、またはＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）のうちの１つから選択される一連の６個の連続するアミノ酸を含む。
第５の態様において、本開示は、ＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、およびＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）の配列のうちの１つから選択されるアミノ酸配列を含む単離ペプチドを提供する。
第５の態様の一実施形態において、ペプチドは、ＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、およびＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）のうちの１つまたは複数の繰り返し単位を含む。ペプチドがＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、およびＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）のうちの１つまたは複数の繰り返し単位を含む一実施形態において、単位は２〜５０回繰り返される。ペプチドがＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、およびＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）のうちの１つまたは複数の繰り返し単位を含む一実施形態において、各単位は介在ペプチド配列によって分離される。
第５の態様の一実施形態において、ペプチドは、Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を含む環状ペプチドである。
第６の態様において、本開示は、ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、およびＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）のうちの１つまたは複数の繰り返し単位を含む単離ポリペプチドを提供する。
第６の態様の一実施形態において、単位は２〜５０回繰り返される。
第６の態様の一実施形態において、各単位は介在ペプチド配列によって分離される。
第７の態様において、本開示は、ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、およびＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）のうちの１つまたは複数の繰り返し単位から本質的になる単離ポリペプチドを提供する。単離ポリペプチドがＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、およびＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）のうちの１つまたは複数の繰り返し単位から本質的になる一実施形態において。
第８の態様において、本開示は、活性物質を対象に送達する方法であって、アミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、またはＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）を含むペプチドを含む組成物を対象に投与することを含み、このペプチドが、活性物質または活性物質を含む活性物質担体と共役し、この組成物が、対象の角質層（ＳＣ）を透過することができる、または前記対象の細胞を透過することができる方法を提供する。
第８の態様の一実施形態において、組成物は対象の角質層（ＳＣ）を透過することができ、かつ対象の細胞を透過することができる。
第８の態様の一実施形態において、投与は局所投与である。
第８の態様の一実施形態において、アミノ酸配列は、ＣＴＧＳＴＱＨＱＣ（配列番号７）、ＣＨＳＡＬＴＫＨＣ（配列番号８）、ＣＫＴＧＳＨＮＱＣ（配列番号９）、ＣＭＧＰＳＳＭＬＣ（配列番号１０）、ＣＴＤＰＮＱＬＱＣ（配列番号１１）、またはＣＳＴＨＦＩＤＴＣ（配列番号１２）を含む。
第８の態様の一実施形態において、アミノ酸配列は、ＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、またはＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）を含む。アミノ酸配列ＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、またはＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）を含む一実施形態において、ペプチドはＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を含む環状ペプチドである。
第８の態様の一実施形態において、組成物は、非ヒト動物生細胞の細胞膜を透過することができる。
第８の態様の一実施形態において、組成物は、ヒト生細胞の細胞膜を透過することができる。
第８の態様の一実施形態において、組成物は、表皮または真皮の生細胞の細胞膜を透過することができる。
第８の態様の一実施形態において、組成物は、生免疫細胞の細胞膜を透過することができる。
第８の態様の一実施形態において、活性物質は高分子を含む。一実施形態において、高分子はタンパク質を含む。一実施形態において、タンパク質は、抗体または少なくとも１つのパラトープを含むその断片を含む。
活性物質が高分子を含む第８の態様の一実施形態において、高分子は核酸を含む。一実施形態において、核酸はＤＮＡである。一実施形態において、核酸はＲＮＡである。核酸がＲＮＡである一実施形態において、ＲＮＡは干渉ＲＮＡである。ＲＮＡが干渉ＲＮＡである一実施形態において、干渉ＲＮＡはｓｈＲＮＡである。ＲＮＡが干渉ＲＮＡである一実施形態において、干渉ＲＮＡはｍｉＲＮＡである。ＲＮＡが干渉ＲＮＡである一実施形態において、干渉ＲＮＡはｓｉＲＮＡである。干渉ＲＮＡがｓｉＲＮＡである一実施形態において、ｓｉＲＮＡはＩＬ−１０ ｓｉＲＮＡである。干渉ＲＮＡがｓｉＲＮＡである一実施形態において、ｓｉＲＮＡはＣＤ８６ ｓｉＲＮＡである。干渉ＲＮＡがｓｉＲＮＡである一実施形態において、ｓｉＲＮＡはＫＲＴ６ａ ｓｉＲＮＡである。干渉ＲＮＡがｓｉＲＮＡである一実施形態において、ｓｉＲＮＡはＴＮＦＲ１ ｓｉＲＮＡである。干渉ＲＮＡがｓｉＲＮＡである一実施形態において、ｓｉＲＮＡはＴＡＣＥ ｓｉＲＮＡである。干渉ＲＮＡがｓｉＲＮＡである一実施形態において、ｓｉＲＮＡは変異特異的ｓｉＲＮＡである。
第８の態様の一実施形態において、活性物質は薬学的化合物である。
第８の態様の一実施形態において、活性物質は検出可能な物質を含む。活性物質が検出可能な物質を含む一実施形態において、検出可能な物質は蛍光標識を含む。活性物質が検出可能な物質を含む一実施形態において、検出可能な物質は放射性標識を含む。
第８の態様の一実施形態において、活性物質はナノ粒子である。
第８の態様の一実施形態において、活性物質は低分子量化合物である。
第８の態様の一実施形態において、活性物質は、ＩＬ−１０生物活性の阻害剤である。活性物質がＩＬ−１０生物活性の阻害剤である一実施形態において、活性物質は、ＩＬ−１０ ｓｉＲＮＡおよびＩＬ−１０に結合する抗体またはその断片から選択される。
第８の態様の一実施形態において、ペプチドは活性物質と共役する。
第８の態様の一実施形態において、ペプチドは、活性物質を含む活性物質担体と共役する。ペプチドが活性物質を含む活性物質担体と共役する一実施形態において、活性物質担体はリポソームである。ペプチドが活性物質を含む活性物質担体と共役する一実施形態において、活性物質担体はナノ粒子である。ペプチドが活性物質を含む活性物質担体と共役する一実施形態において、活性物質担体は高分子ミセルである。
第９の態様において、本開示は、活性物質を対象に送達する方法であって、アミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、またはＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）を含むペプチドを含む組成物を対象に投与することを含み、このペプチドは、活性物質またはこの活性物質を含む活性物質担体と会合し、この会合は、疎水性相互作用、静電相互作用、またはファン・デル・ワールス相互作用によって生じ、この組成物は、対象の角質層（ＳＣ）を透過することができる、または対象の細胞を透過することができる方法を提供する。
第９の態様の一実施形態において、組成物は対象の角質層（ＳＣ）を透過することができ、かつ対象の細胞を透過することができる。
第９の態様の一実施形態において、投与は局所投与である。
第９の態様の一実施形態において、アミノ酸配列は、ＣＴＧＳＴＱＨＱＣ（配列番号７）、ＣＨＳＡＬＴＫＨＣ（配列番号８）、ＣＫＴＧＳＨＮＱＣ（配列番号９）、ＣＭＧＰＳＳＭＬＣ（配列番号１０）、ＣＴＤＰＮＱＬＱＣ（配列番号１１）、またはＣＳＴＨＦＩＤＴＣ（配列番号１２）を含む。
第９の態様の一実施形態において、アミノ酸配列は、ＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、またはＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）を含む。アミノ酸配列ＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、またはＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）を含む一実施形態において、ペプチドはＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を含む環状ペプチドである。
第１０の態様において、本開示は、皮膚科疾患を有する対象を治療する方法であって、アミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、またはＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）を含むペプチドを含む組成物を対象に投与することを含み、このペプチドは、皮膚科用活性物質またはこの活性物質を含む皮膚科用活性物質担体と共役し、この組成物は、対象の角質層（ＳＣ）を透過することができる、または対象の細胞を透過することができる方法を提供する。
第１０の態様の一実施形態において、組成物は対象の角質層（ＳＣ）を透過することができ、かつ対象の細胞を透過することができる。
第１０の態様の一実施形態において、投与は局所投与である。
第１０の態様の一実施形態において、アミノ酸配列は、ＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、またはＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）を含む。アミノ酸配列ＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、またはＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）を含む一実施形態において、ペプチドはＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を含む環状ペプチドである。
第１１の態様において、本開示は、皮膚科疾患を有する対象を治療する方法であって、アミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、またはＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）を含むペプチドを含む組成物を対象に投与することを含み、このペプチドは、皮膚科用活性物質またはこの活性物質を含む皮膚科用活性物質担体と会合し、この会合は、疎水性相互作用、静電相互作用、またはファン・デル・ワールス相互作用によって生じ、この組成物は、対象の角質層（ＳＣ）を透過することができる、または対象の細胞を透過することができる方法を提供する。
第１１の態様の一実施形態において、組成物は対象の角質層（ＳＣ）を透過することができ、かつ対象の細胞を透過することができる。
第１１の態様の一実施形態において、投与は局所投与である。
第１１の態様の一実施形態において、アミノ酸配列は、ＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、またはＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）を含む。アミノ酸配列ＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、またはＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）を含む一実施形態において、ペプチドはＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を含む環状ペプチドである。
第１２の態様において、本開示は、ｍＲＮＡの発現に少なくとも部分的に起因する障害を有する、有することが疑われる、または発症しやすい対象を治療する方法であって、アミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、またはＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）を含むペプチドを含む組成物を対象に投与することを含み、このペプチドは、前記ｍＲＮＡを標的とする干渉ＲＮＡまたは前記干渉ＲＮＡを含む担体と共役し、この組成物は、対象の角質層（ＳＣ）または対象の細胞を透過することができ、前記ｍＲＮＡの発現がそれによって減弱される方法を提供する。
第１２の態様の一実施形態において、組成物は対象の角質層（ＳＣ）を透過することができ、かつ対象の細胞を透過することができる。
第１２の態様の一実施形態において、投与は局所投与である。
第１２の態様の一実施形態において、アミノ酸配列は、ＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、またはＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）を含む。アミノ酸配列ＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、またはＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）を含む一実施形態において、ペプチドはＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を含む環状ペプチドである。
第１３の態様において、本開示は、ｍＲＮＡの発現に少なくとも部分的に起因する障害を有する、有することが疑われる、または発症しやすい対象を治療する方法であって、アミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、またはＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）を含むペプチドを含む組成物を対象に投与することを含み、このペプチドは、前記ｍＲＮＡを標的とする干渉ＲＮＡまたは前記干渉ＲＮＡを含む担体と会合し、この会合は、疎水性相互作用、静電相互作用、またはファン・デル・ワールス相互作用によって生じ、この組成物は、この組成物は、対象の角質層（ＳＣ）または対象の細胞を透過することができ、前記ｍＲＮＡの発現がそれによって減弱される方法を提供する。
第１３の態様の一実施形態において、組成物は対象の角質層（ＳＣ）を透過することができ、かつ対象の細胞を透過することができる。
第１３の態様の一実施形態において、投与は局所投与である。
第１３の態様の一実施形態において、アミノ酸配列は、ＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、またはＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）を含む。アミノ酸配列ＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、またはＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）を含む一実施形態において、ペプチドはＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を含む環状ペプチドである。
第１４の態様において、本開示は、必要性のある対象のｍＲＮＡ発現を減弱する方法であって、アミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、またはＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）を含むペプチドを含む組成物を対象に投与することを含み、このペプチドは、前記ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡまたは前記ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを含む担体と共役し、この組成物は、対象の角質層（ＳＣ）または対象の細胞を透過することができ、前記ｍＲＮＡの発現がそれによって減弱される方法を提供する。
第１４の態様の一実施形態において、ｍＲＮＡはＩＬ−１０ ｍＲＮＡであり、ｓｉＲＮＡはＩＬ−１０ ｓｉＲＮＡである。
第１４の態様の一実施形態において、ｍＲＮＡはＣＤ８６ ｍＲＮＡであり、ｓｉＲＮＡはＣＤ８６ ｓｉＲＮＡである。
第１４の態様の一実施形態において、ｍＲＮＡはＫＲＴ６ａ ｍＲＮＡであり、ｓｉＲＮＡはＫＲＴ６ａ ｓｉＲＮＡである。
第１４の態様の一実施形態において、ｍＲＮＡはＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡであり、ｓｉＲＮＡはＴＮＦＲ１ ｓｉＲＮＡである。
第１４の態様の一実施形態において、ｍＲＮＡはＴＡＣＥ ｍＲＮＡであり、ｓｉＲＮＡはＴＡＣＥ ｓｉＲＮＡである。
第１４の態様の一実施形態において、組成物は、対象の質層（ＳＣ）を透過することができ、かつ細胞を透過することができる。
第１４の態様の一実施形態において、投与は局所投与である。
第１４の態様の一実施形態において、アミノ酸配列は、ＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、またはＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）を含む。アミノ酸配列ＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、またはＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）を含む一実施形態において、ペプチドはＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を含む環状ペプチドである。
第１５の態様において、本開示は、必要性のある対象のｍＲＮＡ発現を減弱する方法であって、アミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、またはＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）を含むペプチドを含む組成物を対象に投与することを含み、このペプチドは、前記ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡまたは前記ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを含む担体と会合し、この会合は、疎水性相互作用、静電相互作用、またはファン・デル・ワールス相互作用によって生じ、この組成物は、対象の角質層（ＳＣ）または対象の細胞を透過することができ、前記ｍＲＮＡの発現がそれによって減弱される方法を提供する。
第１５の態様の一実施形態において、ｍＲＮＡはＩＬ−１０ ｍＲＮＡであり、ｓｉＲＮＡはＩＬ−１０ ｓｉＲＮＡである。
第１５の態様の一実施形態において、ｍＲＮＡはＣＤ８６ ｍＲＮＡであり、ｓｉＲＮＡはＣＤ８６ ｓｉＲＮＡである。
第１５の態様の一実施形態において、ｍＲＮＡはＫＲＴ６ａ ｍＲＮＡであり、ｓｉＲＮＡはＫＲＴ６ａ ｓｉＲＮＡである。
第１５の態様の一実施形態において、ｍＲＮＡはＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡであり、ｓｉＲＮＡはＴＮＦＲ１ ｓｉＲＮＡである。
第１５の態様の一実施形態において、ｍＲＮＡはＴＡＣＥ ｍＲＮＡであり、ｓｉＲＮＡはＴＡＣＥ ｓｉＲＮＡである。
第１５の態様の一実施形態において、組成物は対象の角質層（ＳＣ）を透過することができ、かつ対象の細胞を透過することができる。
第１５の態様の一実施形態において、投与は局所投与である。
第１５の態様の一実施形態において、アミノ酸配列は、ＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、またはＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）を含む。アミノ酸配列ＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、またはＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）を含む一実施形態において、ペプチドはＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を含む環状ペプチドである。
第１６の態様において、本開示は、アミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、またはＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）から本質的になるペプチドであって、活性物質またはその活性物質を含む活性物質担体と共役するペプチドを含む組成物であって、角質層（ＳＣ）の層と接触したときにその層を透過することができる、または細胞と接触したときにその細胞を透過することができる組成物を提供する。
他の態様および実施形態は、本明細書を読むことで、当業者に容易に明らかになるであろう。
ブタ皮膚におけるインビトロファージディスプレイによる、皮膚透過ペプチドの同定を示す。（ａ）ファージライブラリをＦＤＣのドナー区画に適用した。皮膚を通ってレシーバ区画まで透過することが認められたファージを回収し、増幅し、その後の一連のスクリーニングに使用した。個々のクローンの皮膚透過能を拡散実験および共焦点顕微鏡法によって確認した。ペプチドの皮膚を透過する能力を確認するために、ファージからペプチドを単離し、その皮膚内への透過を共焦点顕微鏡法によって視覚的に確認した。（ｂ）ファージディスプレイスクリーニングのラウンド３〜５からの頻度の高い各ペプチド配列の出現率。（ｃ、ｄ）ＳＰＡＣＥおよび対照ペプチドそれぞれのブタ皮膚内への皮膚透過プロファイルの共焦点顕微鏡画像。（ｅ、ｆ）ビオチン化ＳＰＡＣＥペプチドと共役したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識したストレプトアビジンおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ストレプトアビジン単体のそれぞれの皮膚透過プロファイルである。挿入画像は、主画像中で強調表示された部分の拡大図を示す。スケールバー＝２００μｍ。 蛍光標識した分子の皮膚透過を表す共焦点顕微鏡画像を示す。（ａ，ｂ）ペプチドを提示する蛍光標識したファージのブタ皮膚内への透過。（ｃ、ｄ）ビオチン化ペプチド−ストレプトアビジンで被覆した量子ドットのブタ皮膚内への透過。（ｅ、ｆ）蛍光標識したペプチドのヒト皮膚内への透過。（ｇ、ｈ）ヒト皮膚中の蛍光標識したペプチドの上面図（ＳＣを見下ろす）。（ａ、ｃ、ｅ、ｇ）は、ＳＰＡＣＥペプチドの画像を示し、（ｂ、ｄ、ｆ、ｈ）は、対照ペプチドの画像を示す。スケールバー＝２００μｍ。 蛍光標識したペプチドのインビボでのマウス皮膚内への３０分後の透過の画像を示す。各例に対して３つの代表画像を提示する。（ａ〜ｃ）蛍光標識した対照ペプチドおよび（ｄ〜ｆ）蛍光標識したＳＰＡＣＥペプチドの透過。スケールバー＝５０μｍ。 蛍光標識したペプチドのインビボでのマウス皮膚内への２時間後の透過の画像を示す。各例に対して３つの代表画像を提示する。（ａ〜ｃ）蛍光標識した対照ペプチドおよび（ｄ〜ｆ）蛍光標識したＳＰＡＣＥペプチドの透過。スケールバー＝５０μｍ。 蛍光標識したペプチドの脱脂した角質層への結合の画像結果（ａ、ｂ）、およびペプチドによる処理前後の角質層のＦＴＩＲスペクトル（ｃ〜ｆ）を示す。ＵＶ（ａ）および可視光（異なる試料）（ｂ）下での脱脂ＳＣの画像。（ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ）ＳＰＡＣＥペプチド、対照ペプチド、およびペプチド不在をそれぞれ示す。スケールバー＝１ｃｍ。上記に示す角質層試料は、ペプチドの輸送能ではなく、結合能の比較を確実にするために脱脂されていることに留意する。したがって、上記に見られる対照とＳＰＡＣＥペプチドとの差は、皮膚透過に対するそれらの効果を直接表してはいないかもしれない。（ｃ、ｄ）ＳＰＡＣＥペプチドおよび対照ペプチドそれぞれの１４００〜１７００ｃｍ−１スペクトル領域。（ｅ、ｆ）ＳＰＡＣＥペプチドおよび対照ペプチドそれぞれの２８００〜３０００ｃｍ−１スペクトル領域。初期スペクトルおよび最終スペクトルを矢印で示す。 ペプチドによる処理前後の角質層のＦＴＩＲスペクトルのアミドＩおよびアミドＩＩ領域を提示する。 対照ペプチド（ＣＰ）およびＳＰＡＣＥペプチドとの共インキュベーション後のブタ皮膚のイヌリン浸透性および導電率の向上の結果のグラフを示す。 ＳＰＡＣＥペプチドの様々な細胞株内への細胞透過を示す。（ａ、ｃ、ｅ）ペプチドで処理していない細胞（ｂ、ｄ、ｆ）、および蛍光標識したＳＰＡＣＥペプチドとともに２４時間インキュベートした細胞の共焦点像。（ａ、ｂ）ヒト角化細胞、（ｃ、ｄ）ヒト線維芽細胞、および（ｅ、ｆ）ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）。（ｇ）ヒト角化細胞におけるＳＰＡＣＥペプチド内部移行の拡大像。（ｈ）ＨＵＶＥＣ、線維芽細胞、および角化細胞における、２４時間後の対照ペプチド（白抜きバー）およびＳＰＡＣＥペプチド（塗りつぶしバー）の内部移行の平均蛍光強度。エラーバーは、ＳＤ（Ｎ≧３０）を示す。スケールバー＝１００μｍ（ａ〜ｆ）および２０μｍ（ｇ）。 蛍光標識したペプチドのＭＤＡ−ＭＢＡ−２３１ヒト乳癌細胞内への６時間後の透過の画像結果を示す（ａ〜ｃ）。ペプチドを含まない（ａ）、対照ペプチドを含む（ｂ）、およびＳＰＡＣＥペプチドを含む（ｃ）細胞の画像。スケールバー＝５０μｍ。図７は、リポフェクタミンと複合体化したＧＦＰ ｓｉＲＮＡでの処理後のＧＦＰ発現内皮細胞の共焦点像も示す（ｄ〜ｆ）。（ｄ）リポフェクタミン単体（ｓｉＲＮＡ不在）、（ｅ）ＧＦＰ ｓｉＲＮＡと複合体化したリポフェクタミン、および（ｆ）ＳＰＡＣＥ−ＧＦＰ ｓｉＲＮＡと複合体化したリポフェクタミンによる細胞の処理。スケールバー＝２００μｍ。 細胞機序および毒性研究の結果を示す。（ａ）ヒト角化細胞における、４℃での、エンドサイトーシス阻害剤のデオキシ−Ｄ−グルコース、クロルプロマジン、ナイスタチン、およびＥＩＰＡによる、対照ペプチドおよびＳＰＡＣＥペプチドのペプチド内部移行（対照に対する割合）（ｂ）０．１ｍｇ／ｍＬおよび１．０ｍｇ／ｍＬの対照ペプチド（白抜きバー）またはＳＰＡＣＥペプチド（塗りつぶしバー）の存在下でのヒト角化細胞の細胞増殖。エラーバーは、ＳＤ（Ｎ＝４）を示す。 ＳＰＡＣＥペプチドを用いたｓｉＲＮＡの送達の結果を示す。（ａ）ＧＦＰ発現内皮細胞におけるＧＰＦのノックダウン率。エラーバーは、ＳＤ（Ｎ≧３０）を示す。（ｂ）マウスにおける、処置２４時間後のＩＬ−１０タンパク質レベルのノックダウン率。エラーバーは、ＳＥ（Ｎ≧３）を示し、ＮＳは有意に異ならない（ｐ＞０．１５）。（ｃ）マウスにおける、処置７２時間後のＧＡＰＤＨタンパク質レベルのノックダウン率。エラーバーは、ＳＥ（Ｎ≧３）を示す。（ｄ）局所ｓｉＲＮＡ適用時のＧＡＰＤＨノックダウンの用量依存性。エラーバーは、ＳＥ（Ｎ≧３）を示す。 ペプチド共役ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡを用いた、様々な適用時間でのＧＡＰＤＨノックダウンの結果を示す。４時間、２４時間、および７２時間のＳＰＡＣＥ−ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ適用時間後のＧＡＰＤＨタンパク質レベルの低下
定義
本発明をさらに説明する前に、本発明が記載される特定の実施形態に限定されず、したがって当然異なってもよいことは理解されるものとする。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって限定されることから、本明細書において使用する用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定を意図するものではないことも理解すべきである。
値の範囲が示される場合、文脈上明確な指示がない限り、下限の単位の１／１０まで、その範囲の上限と下限の間の介在する各値およびその定められた範囲内の他のいかなる定められた値または介在する値も本発明に包含されると理解される。定められた範囲に特に除外される境界値がある場合、これらのより小さい範囲の上限および下限は独立してその小さい範囲に含まれてもよく、これも本発明に包含される。定められた範囲が、一方または両方の境界値を含む場合、それらの含まれる境界値の一方または両方を除外する範囲も本発明に含まれる。
別段の定めがない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。本発明の実施または試験において、本明細書に記載するものと類似または同等の任意の方法および材料の使用が可能であるが、例示的な方法および材料をこれから記載する。本明細書で言及される全ての刊行物および出願は、その刊行物から引用されるものに関連する方法および／または材料を開示し、説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。参照により本明細書に組み込まれる出願または刊行物のいずれかが本開示と矛盾する場合には、本開示が支配する。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形（「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」）は、文脈上明らかに異なる場合を除き、複数の指示対象を包含することに留意しなければならない。したがって、例えば、「ペプチド」への言及は、複数のそのようなペプチドを含み、また「薬剤」への言及は、１つまたは複数の薬剤および当業者に知られるその同等物への言及を含む。
本明細書で考察する刊行物は、本出願の出願日以前のそれらの開示に関してのみ提供される。本明細書中のいずれの記載も本発明が先行発明の理由でかかる刊行物に先行する権利を有さないことを承認するものと解釈されるべきではない。さらに、提示される刊行物の日付は、実際の公開日とは異なる可能性があり、これは個別に確認する必要があることもある。
本開示全体を通して、１文字コードまたは３文字コードによって、アミノ酸に言及していることに気付くであろう。読者の便宜のために、下記に１文字および３文字のアミノ酸コードを提示する。
本明細書で使用する際、用語「活性物質」は、対象、例えばヒトまたは非ヒト動物に、単独でまたは他の活性もしくは不活性要素と組み合わせて投与したときに所望の薬理的効果を提供する物質、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸（例えば、ヌクレオチド、ヌクレオシド、およびそれらの類似体を含む）、または小分子薬物を意味する。上記の定義に含まれるものは、活性物質の前駆体、誘導体、類似体、およびプロドラッグである。また、本明細書において、用語「活性物質」は、本明細書に記載するような透過性ペプチドと共役または会合した、あるいは本明細書に記載するような活性物質担体に結合するか、または包囲された任意の物質、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸（例えば、ヌクレオチド、ヌクレオシド、およびそれらの類似体を含む）、または小分子薬物を広く指して使用されることもある。
用語「共役した」は、本明細書に記載する透過性ペプチド組成物に関して使用する際、２つの実体、例えば、分子、化合物、またはそれらの組み合わせの間の共有結合性もしくはイオン性相互作用を指す。
用語「会合した」は、本明細書に記載する透過性ペプチド組成物に関して使用する際、２つの実体、例えば、分子、化合物、またはそれらの組み合わせの間の疎水性相互作用、静電相互作用、およびファン・デル・ワールス相互作用のうちの１つまたは複数によって仲介される、非共有結合性相互作用を指す。
本明細書において互換的に使用する用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、これはコード化および非コード化アミノ酸、化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸、および修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る。この用語は、異種アミノ酸配列との融合タンパク質、場合によってＮ末端メチオニン残基を含む異種および天然リーダー配列との融合体、免疫学的にタグを付けたタンパク質、検出可能な融合パートナーとの融合タンパク質、例えば融合パートナーとして蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどを含む融合タンパク質などを含むがそれらに限定されない融合タンパク質を含む。
用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、任意のアイソタイプの抗体または免疫グロブリン、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、およびＦｄ断片を含むがそれらに限定されない、抗原との特異的結合を保持する抗体の断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、および抗体の抗原結合部と非抗体タンパク質を含む融合タンパク質を含む。抗体は、例えば放射性同位体、検出可能な産物を生成する酵素、蛍光タンパク質などで、検出可能に標識されていてもよい。抗体は、特異的結合対のメンバー、例えばビオチン（ビオチン−アビジン特異的結合対のメンバー）など、他の部分とさらに共役していてもよい。また、この用語には、抗原との特異的結合を保持する、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２、および他の抗体断片も含まれる。
抗体は、Ｆｖ、Ｆａｂ、および（Ｆａｂ’）２、ならびに二官能性（すなわち二重特異的）ハイブリッド抗体（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７，１０５（１９８７））を含む、様々な他の形態で、また一本鎖（例えば、参照により本明細書に援用される、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５，５８７９−５８８３（１９８８）およびＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６（１９８８））として存在してもよい。（Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｎ．Ｙ．，２ｎｄ ｅｄ．（１９８４）およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｏｄ，Ｎａｔｕｒｅ，３２３，１５−１６（１９８６）を全般的に参照）。
用語「核酸」、「核酸分子」、および「ポリヌクレオチド」は、互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、あるいはそれらの類似体のいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。この用語は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの修飾形態を包含する。ポリヌクレオチドは、いかなる三次元構造を有してもよく、既知または未知のいかなる機能を果たしてもよい。ポリヌクレオチドの非限定的な例には、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、調節領域、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーがある。核酸分子は、線状または環状であってよい。
「ＲＮＡ干渉」（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を用いて遺伝子発現を停止させるため過程である。いかなる特定の理論に拘束されることも意図しないが、ＲＮＡｉは、ＲＮａｓｅＩＩＩ様酵素であるダイサーによって、長いｄｓＲＮＡを小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に切断することから始まる。ｓｉＲＮＡは、一般に、約１９〜２８ヌクレオチド長、または２０〜２５ヌクレオチド長、または２１〜２３ヌクレオチド長であり、しばしば２〜３個のヌクレオチド３’オーバーハング、ならびに５’リン酸塩末端および３’水酸基末端を含むｄｓＲＮＡである。ｓｉＲＮＡの一方の鎖は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られるリボ核タンパク質複合体に取り込まれる。ＲＩＳＣは、このｓｉＲＮＡ鎖を用いて、この取り込まれたｓｉＲＮＡ鎖に少なくとも部分的に相補的なｍＲＮＡ分子を同定し、次いでこれらの標的ｍＲＮＡを切断する、またはそれらの翻訳を阻害する。ＲＩＳＣに取り込まれたｓｉＲＮＡ鎖は、ガイド鎖またはアンチセンス鎖として知られている。パッセンジャー鎖またはセンス鎖として知られる他方のｓｉＲＮＡ鎖は、ｓｉＲＮＡから排除され、これは標的ｍＲＮＡと少なくとも部分的に相同である。当業者は、原則として、ｓｉＲＮＡのいずれの鎖がＲＩＳＣに組み込まれて、ガイド鎖として機能してもよいことを認識するであろう。しかしながら、ｓｉＲＮＡは、アンチセンス鎖のＲＩＳＣへの組込みを促すように設計することもできる（例えば、アンチセンス鎖の５’末端におけるｓｉＲＮＡ二重鎖安定性を減少させることによって）。
ガイド鎖に少なくとも部分的に相補的な配列を有するｍＲＮＡのＲＩＳＣ媒介切断は、そのｍＲＮＡおよびこのｍＲＮＡによってコードされる対応するタンパク質の定常状態レベルの減少をもたらす。あるいは、ＲＩＳＣは、翻訳抑制によって、標的ｍＲＮＡを切断せずに対応するタンパク質の発現を減少させることもできる。他のＲＮＡ分子は、ＲＩＳＣと相互作用し、遺伝子発現を停止させることができる。ＲＩＳＣとの相互作用が可能な他のＲＮＡ分子の例には、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡｓ）、一本鎖ｓｉＲＮＡ、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、およびダイサー基質２７量体二重鎖、１つまたは複数の化学修飾ヌクレオチド、１つまたは複数のデオキシリボヌクレオチド、および／または１つまたは複数の非ホスホジエステル結合を含むＲＮＡ分子がある。用語「ｓｉＲＮＡ」は、本明細書において使用する際、特に断りのない限り、二本鎖干渉ＲＮＡを指す。本考察の目的で、ＲＩＳＣと相互作用し、ＲＩＳＣが媒介する遺伝子発現の変化に関与することができる全てのＲＮＡ分子を「干渉ＲＮＡ」と称することとする。したがって、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびダイサー基質２７量体二重鎖は、「干渉ＲＮＡ」のサブセットである。
「置換」は、ポリペプチドのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比べて異なるアミノ酸またはヌクレオチドによって、１つまたは複数のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ置き換えた結果生じる。置換が保存的である場合、置換されてポリペプチドに入るアミノ酸は、それが置き換えるアミノ酸と類似する構造的または化学的特性（例えば、電荷、極性、疎水性など）を有する。天然アミノ酸の保存的置換は、通常は、第１のアミノ酸の第１のアミノ酸と同じ群の第２のアミノ酸による置換をもたらし、このとき例示的アミノ酸群は、（１）酸性（負に荷電した）アミノ酸、例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸、（２）塩基性（正に荷電した）アミノ酸、例えばアルギニン、ヒスチジン、およびリジン、（３）中性極性アミノ酸、例えばグリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミン、ならびに（４）中世非極性アミノ酸、例えばアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンである。一部の実施形態において、ポリペプチド変異体は、置換されたアミノ酸が構造的および／または化学的特性において異なる、「非保存的」変化を有してもよい。
「欠失」は、天然ポリペプチドのアミノ酸またはヌクレオチド配列と比べて、１つまたは複数のアミノ酸またはヌクレオチド残基がそれぞれ不在である、アミノ酸またはヌクレオチド配列のいずれかの変化と定義される。ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列に関して、欠失は、修飾されるポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の長さを考慮に入れて、２個、５個、１０個、最大２０個、最大３０個または最大５０個あるいはそれ以上のアミノ酸の欠失を含み得る。
「挿入」または「付加」は、天然ポリペプチドのアミノ酸またはヌクレオチド配列と比べて、それぞれ１つまたは複数のアミノ酸またはヌクレオチド残基の付加をもたらしたアミノ酸またはヌクレオチド配列の変化である。「挿入」は、概して、ポリペプチドのアミノ酸配列内の１つまたは複数のアミノ酸残基への付加を指し、一方「付加」は、挿入であってもよく、またはＮ末端もしくはＣ末端に付加されたアミノ酸残基を指す。ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列に関して、挿入または付加は、最大１０個、最大２０個、最大３０個、または最大５０個あるいはそれ以上のアミノ酸の挿入または付加であってよい。
「非天然」、「非内因性」、および「異種」は、ポリペプチドに関して、本明細書において互換的に使用され、自然で認められるものとは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指し、あるいは発現系またはウイルス粒子に関しては、自然で認められるものとは異なる環境に存在するポリペプチドを指す。
核酸またはポリペプチドに関して、「外因性」とは、宿主細胞に導入された核酸またはポリペプチドを指して使用される。「外因性」の核酸およびポリペプチドは、宿主細胞にとって天然であっても、非天然であってもよく、外因性の天然核酸またはポリペプチドは、外因性分子の導入前に宿主細胞に認められるものと比較して上昇したレベルのコードされた遺伝子産物またはポリペプチドを組換え宿主細胞に提供する。
本明細書において使用する際、用語「決定する」、「測定する」、「評価する」、または「アッセイする」は、互換的に使用され、定量的決定および定性的決定の双方を含む。
本明細書で使用する用語「単離された」は、単離化合物に関して使用する場合、その化合物が天然に生じる環境と異なる環境に存在する当該化合物を指す。「単離された」は、対象化合物を実質的に濃縮した、および／または当該化合物が部分的または実質的に精製された試料中の化合物を含むことを意味する。
本明細書において使用する際、用語「実質的に純粋な」は、その自然環境から取り除かれた化合物であって、それが自然に結合する他の要素を少なくとも６０％、７５％、または９０％含まない化合物を指す。
「コード配列」または選択されるポリペプチドを「コードする」配列は、例えばインビボで適切な調節配列（または「制御要素」）の制御下に置かれたとき、ポリペプチドに転写され（ＤＮＡの場合）、翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子である。コード配列の境界は、通常は、５’（アミノ）末端の開始コドンと３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンとによって決定される。コード配列は、ウイルス、原核生物、または真核生物のｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、ウイルスまたは原核生物ＤＮＡに由来するゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列を含みうるが、これらに限定されない。転写終結配列は、コード配列の３’側に位置してよい。他の「制御要素」もコード配列と結合していてよい。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、所望のポリペプチドコード配列のＤＮＡコピーを表すために選択された細胞にとって好ましいコドンを使用することによって選択された細胞における発現に対して最適化することができる。
「によってコードされる」は、ポリペプチドなどの遺伝子産物をコードする核酸配列を指す。遺伝子産物がポリペプチドである場合、ポリペプチド配列またはその一部は、その核酸配列によってコードされるポリペプチドに由来する少なくとも３〜５個のアミノ酸、８〜１０個のアミノ酸、または少なくとも１５〜２０個のアミノ酸のアミノ酸配列を含む。
「作用可能に連結した」は、そのように記載された成分がその通常の機能を実行できるように構成される要素の配置を指す。プロモーターの場合、コード配列に作用可能に連結したプロモーターは、コード配列の発現に対して影響を有することになる。プロモーターまたは他の制御要素は、コード配列の発現を指示するように機能する限り、そのコード配列と隣接する必要はない。例えば、介在する翻訳されていないが転写された配列がプロモーター配列とコード配列との間に存在していてもよく、このプロモーター配列は、依然としてコード配列と「作用可能に連結」しているとみなすことができる。
「核酸構築物」は、自然では一緒に見られない１つまたは複数の機能単位を含むように構築された核酸配列を意味する。例には、環状、線状、二本鎖、染色体外ＤＮＡ分子（プラスミド）、コスミド（ラムダファージ由来のＣＯＳ配列を含有するプラスミド）、非天然核酸配列を含むウイルスゲノムなどが含まれる。
「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に移動させることができる。通常は、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、および「遺伝子導入ベクター」は、当該遺伝子の発現を指示することができ、遺伝子配列を標的細胞に移動させることができるあらゆる核酸構築物を意味し、これはベクターの全てまたは一部分のゲノム組込み、または染色体外要素としてのベクターの一過性または遺伝性維持によって達成可能である。したがって、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびに組込み型ベクターを含む。
「発現カセット」は、この発現カセットのプロモーターに作用可能に連結した、当該遺伝子／コード配列の発現を指示することができるあらゆる核酸構築物を含む。このようなカセットは、「ベクター」、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、または「遺伝子導入ベクター」内に構築して、この発現カセットを標的細胞内に移動させることができる。したがって、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。
核酸およびアミノ酸「配列同一性」を決定するための手法は、当分野で知られている。通常は、そのような手法には、遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること、および／またはそれによってコードされるアミノ酸配列を決定することと、これらの配列を第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することとが含まれる。一般的には、「同一性」は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のそれぞれヌクレオチドとヌクレオチドまたはアミノ酸とアミノ酸の正確な一致を指す。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）をそれらの「同一性パーセント」を決定することによって比較することもできる。２つの配列の同一性パーセントは、核酸配列であってもアミノ酸配列であっても、２つのアラインした配列間の正確なマッチの数を短い方の配列の長さで除し、１００を乗じたものである。核酸配列の近似アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，２：４８２−４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｄ．，５ ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡによって開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）によって正規化されたスコアリング行列を使用することによって、アミノ酸配列に適用することができる。
配列の同一性パーセントを決定するためのこのアルゴリズムの例示的な実行は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により、「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティアプリケーションで提供される。この方法のためのデフォルトパラメータは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）に記載される。本発明の文脈で同一性パーセントを確立する別の方法は、Ｊｏｈｎ Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋにより開発され、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈにより著作権が保護され、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）により販売されるＭＰＳＲＣＨプログラムパッケージを使用することである。この一連のパッケージから、スコアリングテーブルにデフォルトパラメータ（例えば、ギャップオープンペナルティが１２、ギャップ伸長ペナルティが１、およびギャップが６）が使用される、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用することができる。生成されたデータから、「マッチ」の値は「配列同一性」を反映する。配列間のパーセント同一性または類似性パーセントを算出するための他の好適なプログラムは、一般に当分野で公知であり、例えば、別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータで使用するＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメータを用いて使用することができる：遺伝子コード＝標準；フィルタ＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；分類＝高スコア；データベース＝非重複、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、インターネットアドレスｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉに記載される。
あるいは、ポリヌクレオチドに関して、相同性は、相同領域間に安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、その後一本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化、消化断片のサイズ決定によって決定することもできる。
２つのＤＮＡ、または２つのポリペプチド配列は、上記の方法を用いて決定したときに、それらの配列が、分子の規定の長さにわたって、少なくとも約８０％〜８５％、少なくとも約８５％〜９０％、少なくとも約９０％〜９５％、または少なくとも約９５％〜９８％の配列同一性を示す場合、互いに「実質的に相同」である。本明細書において使用する際、実質的に相同とは、指定されたＤＮＡまたはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列も意味する。実質的に相同なＤＮＡ配列は、例えば、個々の系について定義されたストリンジェント条件下で、サウザンハイブリダイゼーション実験において同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件を定義することは、当業者の技術範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００１） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照されたい。
第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチド、そのｃＤＮＡ、その相補体の領域と同じまたは実質的に同じヌクレオチド配列を有する場合、または上述のような配列同一性を示す場合、第２のポリヌクレオチドに「由来」する。この用語は、ポリヌクレオチドが、前述の起源から取得されなければならないことを（これも含まれるが）要求または示唆するものではなく、むしろポリヌクレオチドは好適な方法で作成することができる。
第１のポリペプチド（またはペプチド）は、（ｉ）第２のポリヌクレオチドに由来する第１のポリヌクレオチドによってコードされる場合、または（ｉｉ）上述のように第２のポリペプチドに対する配列同一性を示す場合に、第２のポリペプチド（またはペプチド）に「由来」する。この用語は、ポリペプチドが、前述の起源から取得されなければならないことを要求または示唆するものではなく（ただしこれも含まれる）、むしろポリペプチドは好適な方法で作成することができる。
本明細書において使用する際、用語「〜と組み合わせて」は、例えば、第１の療法が第２の療法の全投与過程において投与される、第１の療法が第２の療法の投与と重複する期間に投与される、例えば、第１の療法の投与が第２の療法の投与前に開始して、第１の療法の投与が第２の療法の投与の終了前に終了する、第２の療法の投与が第１の療法の投与前に開始して、第２の療法の投与が第１の療法の投与終了前に終了する、第１の療法の投与が第２の療法の投与開始前に開始して、第２の療法の投与が第１の療法の投与終了前に終了する、第２の療法の投与が第１の療法の投与開始前に開始して、第１の療法の投与が第２の療法の投与終了前に終了する、使用を指す。したがって、「組み合わせて」とは、２つ以上の療法の投与を含む投与計画も指すことができる。本明細書において使用する際、用語「〜と組み合わせて」は、同じまたは異なる製剤として、同じまたは異なる経路で、同じまたは異なる剤形タイプで投与してもよい、２つ以上の療法の投与も指す。
用語「治療」、「治療すること」、「治療する」などは、所望の薬理的および／または生理的効果を得ることを指す。この効果は、疾患またはその症状を完全または部分的に防止するという点で予防的であってもよく、ならびに／または疾患および／もしくはその疾患に起因する有害効果の部分的または完全治癒の点で治療的であってもよい。「治療」は、本明細書において使用する際、哺乳動物、特にヒトにおける疾患のあらゆる治療を包含し、（ａ）その疾患を発症しやすい恐れがあるが、まだその疾患を有すると診断されていない対象において、疾患の発生を防止すること、（ｂ）疾患を抑制する、すなわちその発生または進行を阻むこと、および（ｃ）疾患を軽減する、すなわちその疾患の退行を生じること、および／または１つまたは複数の病徴を軽減することを含む。また、「治療」は、疾患または状態が存在しなくても、薬理的効果を提供するための薬剤の送達も包含する。例えば、「治療」は、例えばワクチンの場合など、病徴の不在時に免疫応答を引き出す、または免疫を与えることができる、透過性ペプチド組成物の送達を包含する。
「対象」、「宿主」、および「患者」は、本明細書において互換的に使用され、本開示の方法による療法に適している、または所望の効果を達成するために本開示によるペプチド組成物を投与することができる、動物（ヒトまたは非ヒト）を指す。一般に、対象は哺乳動物対象である。
本明細書において使用する際、用語「皮膚炎」は、皮膚の炎症を指し、例えば、アレルギー性接触皮膚炎、蕁麻疹、皮脂欠乏性皮膚炎（下肢の乾燥肌）、アトピー性皮膚炎、刺激性接触皮膚炎およびウルシオール誘発性接触皮膚炎を含む接触皮膚炎、湿疹、重力性皮膚炎、貨幣状皮膚炎、外耳炎、口囲皮膚炎、および脂漏性皮膚炎を含む。
用語「角質層」は、扁平細胞、角化細胞、無核細胞、死細胞、または剥離細胞の複数の層からなる、表皮の角質外層を指す。
特許請求の範囲において使用する際、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含有する）」、および「ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ（特徴とする）」と同義の用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（備える）」は、包括的または非限定的であり、付加的な列挙されていない要素および／または方法のステップを排除しない。「Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（備える）」は、指定された要素および／またはステップが存在するが、他の要素および／またはステップを追加してもよく、依然として関連主題の範囲内に含まれることを意味する専門用語である。
本明細書において使用する際、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ（〜からなる）」は、具体的に列挙されていないいかなる要素、ステップ、および／または成分も排除する。例えば、「〜からなる」という表現が、プリアンブルの直後ではなく、特許請求の範囲の本文の条項中に見られる場合、これはその条項に記載される要素のみを限定し、他の要素は、特許請求の範囲全体から排除されない。
本明細書において使用する際、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ（〜から本質的になる）」という表現は、関連する開示または請求の範囲を指定された材料および／またはステップ、さらに開示および／または請求される主題の基本的および新規の特徴に実質的に影響を与えないものに限定する。例えば、一部の実施形態における本開示の主題のペプチドは、コアのアミノ酸配列「から本質的になる」ことが可能であり、これはそのペプチドが、その存在がペプチドの所望の生物活性に実質的に影響を与えない、１つまたは複数（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、またはそれ以上）のＮ−末端および／またはＣ−末端アミノ酸を含んでもよいことを意味する。
用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（備える）」、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ（〜から本質的になる）」、および「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ」に関して、これらの用語のうちの１つが本明細書において使用される場合、本開示の主題は、他の２つの用語のいずれかの使用を含み得る。例えば、本開示の主題は、一部の実施形態において、アミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）を含む組成物に関する。したがって、本開示の主題は、一部の実施形態においてアミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）から本質的になるペプチドを含み、また一部の実施形態においてアミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）からなるペプチドを含むことが理解される。同様に、本開示の主題の方法が、一部の実施形態において、本明細書において開示されるステップおよび／または特許請求の範囲に列挙されるステップを含むこと、これらの方法が、一部の実施形態において、本明細書において開示されるステップおよび／または特許請求の範囲に列挙されるステップから本質的になること、ならびにこれらの方法が、一部の実施形態において、本明細書において開示されるステップおよび／または特許請求の範囲に列挙されるステップからなることも理解される。
発明の例示的実施形態の詳細な説明
本開示は、単体で、および活性物質もしくは活性物質担体と共役または会合して、ＳＣおよび／または生細胞、例えば表皮細胞および真皮細胞の細胞膜を透過することができるペプチドを対象にする。関連する組成物および方法も本明細書において開示される。
透過性ペプチド
本開示は、投与時に、ＳＣを透過することができる、および／または生細胞を透過することができるペプチドを提供する。このようなペプチドは、本明細書において、「透過性ペプチド」と称する。一部の実施形態において、このような透過性ペプチドは、表皮および真皮生細胞の細胞膜を透過することができる。本開示による透過性ペプチドは、例えば、下記の表１に提示するアミノ酸配列のうちの１つまたは複数を含んでもよい。
一部の実施形態において、本開示による透過性ペプチドは、アミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、およびＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）のうちの１つから選択される、一連の３個、４個、５個、６個、または７個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、本開示による透過性ペプチドは、ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、およびＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）のうちの１つから選択されるアミノ酸配列を含む８〜１１、１２〜１５、または１６〜１９アミノ酸長のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態において、本開示による透過性ペプチドは、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、または少なくとも１００個のアミノ酸のアミノ酸配列を有する。本開示による透過性ペプチドは、様々な公知の架橋法のいずれによって環化してもよい。一部の実施形態において、本開示による透過性ペプチドは、Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合が存在する環化された配座で（すなわち、環状ペプチドとして）提供してもよい。一部の実施形態において、本開示による透過性ペプチドは、アミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、およびＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）のうちの１つから選択される内部アミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有し、このペプチドのアミノ酸配列は、内部配列のＣ末端方向の外部に位置する少なくとも第１のＣｙｓと、内部配列のＮ末端方向の外部に位置する少なくとも第２のＣｙｓとを含む。
一部の実施形態において、本開示による透過性ペプチドは、アミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、およびＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）のうちの１つから選択される、内部の一連の３個、４個、５個、または６個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含み、内部配列のＮ末端方向の外部に位置する少なくとも第１のＣｙｓと、内部配列のＣ末端方向の外部に位置する少なくとも第２のＣｙｓとをさらに含む。
本明細書において開示される透過性ペプチドは、提供されるアミノ酸配列を有するもの、ならびに提供される配列に対して、１つまたは複数のアミノ酸置換、例えば、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を有するペプチドであって、ＳＣを透過する能力または細胞を透過する能力を保持するペプチドを含む。
活性物質
カーゴ分子、例えば低分子量化合物または高分子と共役または会合して、局所投与後にＳＣを透過する、および／または生細胞、例えば表皮細胞および真皮細胞の細胞膜を透過する上記のペプチドの能力により、これらのペプチドは当分野で公知の多様な活性物質の送達を促進するのに好適となる。
送達することができる活性物質の一般的種類には、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、およびそれらの類似体、ならびに薬学的化合物、例えば、低分子量化合物がある。
本明細書において開示される透過性ペプチドを用いて送達することができる活性物質には、末梢神経、アドレナリン受容体、コリン受容体、骨格筋、心血管系、平滑筋、血液循環系、シナプス部位、神経効果器接合部位、内分泌およびホルモン系、免疫系、生殖器系、骨格系、オータコイド系、消化器および排泄系、ヒスタミン系、および中枢神経系に作用する薬剤がある。
好適な活性物質は、とりわけ、例えば、皮膚科用薬剤、抗腫瘍薬、心血管作用薬、腎臓作用薬、消化器作用薬、リウマチ薬、免疫学的薬剤、および神経薬から選択することができる。
好適な皮膚科用薬剤には、とりわけ、例えば、局所麻酔薬、抗炎症薬、抗感染症薬、にきび治療薬、抗ウイルス薬、抗真菌薬、外用コルチコステロイドなどの乾癬治療薬を含んでもよい。
一部の実施形態において、好適な皮膚科用薬剤は、以下の一覧から選択される：１６−１７Ａ−エポキシプロパン（ＣＡＳ登録番号：１０９７−５１−４）、Ｐ−メトキシケイ皮酸／４−メトキシケイ皮酸（ＣＡＳ登録番号：８３０−０９−１）、オクチルメトキシシンナメート（ＣＡＳ登録番号：５４６６−７７−３）、オクチルメトキシシンナメート（ＣＡＳ登録番号：５４６６−７７−３）、メチル−ｐ−メトキシシンナメート（ＣＡＳ登録番号：８３２−０１−９）、４−エストレン−１７β−オール−３−オン（ＣＡＳ登録番号：６２−９０−８）、エチル−ｐ−アニソイルアセテート（ＣＡＳ登録番号：２８８１−８３−６）、ジヒドロウラシル（ＣＡＳ登録番号：１９０４−９８−９）、ロピナビル（ＣＡＳ登録番号：１９２７２５−１７−０）、リタンセリン（ＣＡＳ登録番号：８７０５１−４３−２）、ニロチニブ（ＣＡＳ登録番号：６４１５７１−１０−０）；臭化ロクロニウム（ＣＡＳ登録番号：１１９３０２−９１−９）、ｐ−ニトロベンジル−６−（１−ヒドロキシエチル）−１−アザビシクロ（３．２．０）ヘプタン−３，７−ジオン−２−カルボキシレート（ＣＡＳ登録番号：７４２８８−４０−７）、アバメクチン（ＣＡＳ登録番号：７１７５１−４１−２）、パリペリドン（ＣＡＳ登録番号：１４４５９８−７５−４）、ゲミフロキサシン（ＣＡＳ登録番号：１７５４６３−１４−６）、バルルビシン（ＣＡＳ登録番号：５６１２４−６２−０）、ミゾリビン（ＣＡＳ登録番号：５０９２４−４９−７）、コハク酸ソリフェナシン（ＣＡＳ登録番号：２４２４７８−３８−２）、ラパチニブ（ＣＡＳ登録番号：２３１２７７−９２−２）、ジドロゲステロン（ＣＡＳ登録番号：１５２−６２−５）、２，２−ジクロロ−Ｎ−［（１Ｒ，２Ｓ）−３−フルオロ−１−ヒドロキシ−１−（４−メチルスルホニルフェニル）プロパン−２−イル］アセトアミド（ＣＡＳ登録番号：７３２３１−３４−２）、チルミコシン（ＣＡＳ登録番号：１０８０５０−５４−０）、エファビレンツ（ＣＡＳ登録番号：１５４５９８−５２−４）、ピラルビシン（ＣＡＳ登録番号：７２４９６−４１−４）、ナテグリニド（ＣＡＳ登録番号：１０５８１６−０４−４）、エピルビシン（ＣＡＳ登録番号：５６４２０−４５−２）、エンテカビル（ＣＡＳ登録番号：１４２２１７−６９−４）、エトリコキシブ（ＣＡＳ登録番号：２０２４０９−３３−４）、シルニジピン（ＣＡＳ登録番号：１３２２０３−７０−４）、塩酸ドキソルビシン（ＣＡＳ登録番号：２５３１６−４０−９）、エスシタロプラム（ＣＡＳ登録番号：１２８１９６−０１−０）、リン酸シタグリプチン一水和物（ＣＡＳ登録番号：６５４６７１−７７−９）、アシトレチン（ＣＡＳ登録番号：５５０７９−８３−９）、安息香酸リザトリプタン（ＣＡＳ登録番号：１４５２０２−６６−０）、ドリペネム（ＣＡＳ登録番号：１４８０１６−８１−３）、アトラクリウムベシラート（ＣＡＳ登録番号：６４２２８−８１−５）、ニルタミド（ＣＡＳ登録番号：６３６１２−５０−０）、３，４−ジヒドロキシフェニルエタノール（ＣＡＳ登録番号：１０５９７−６０−１）、酒石酸ケタンセリン（ＣＡＳ登録番号：８３８４６−８３−７）、オザグレル（ＣＡＳ登録番号：８２５７１−５３−７）、メシル酸エプロサルタン（ＣＡＳ登録番号：１４４１４３−９６−４）、塩酸ラニチジン（ＣＡＳ登録番号：６６３５７−３５−５）、６，７−ジヒドロ−６−メルカプト−５Ｈ−ピラゾロ［１，２−ａ］［１，２，４］トリアゾリウムクロリド（ＣＡＳ登録番号：１５３８５１−７１−９）、スルファピリジン（ＣＡＳ登録番号：１４４−８３−２）、テイコプラニン（ＣＡＳ登録番号：６１０３６−６２−２）、タクロリムス（ＣＡＳ登録番号：１０４９８７−１１−３）、ルミラコキシブ（ＣＡＳ登録番号：２２０９９１−２０−８）、アリルアルコール（ＣＡＳ登録番号：１０７−１８−６）、保護メロペネム（ＣＡＳ登録番号：９６０３６−０２−１）、ネララビン（ＣＡＳ登録番号：１２１０３２−２９−９）、ピメクロリムス（ＣＡＳ登録番号：１３７０７１−３２−０）、４−［６−メトキシ−７−（３−ピペリジン−１−イルプロピル）キナゾリン−４−イル］−Ｎ−（４−プロパン−２−イルオキシフェニル）ピペラジン−１−カルボキサミド（ＣＡＳ登録番号：３８７８６７−１３−２）、リトナビル（ＣＡＳ登録番号：１５５２１３−６７−５）、アダパレン（ＣＡＳ登録番号：１０６６８５−４０−９）、アプレピタント（ＣＡＳ登録番号：１７０７２９−８０−３）、エプレレノン（ＣＡＳ登録番号：１０７７２４−２０−９）、メシル酸ラサギリン（ＣＡＳ登録番号：１６１７３５−７９−１）、ミルテホシン（ＣＡＳ登録番号：５８０６６−８５−６）、ラルテグラビルカリウム（ＣＡＳ登録番号：８７１０３８−７２−１）、ダサチニブ一水和物（ＣＡＳ登録番号：８６３１２７−７７−９）、オキソメマジン（ＣＡＳ登録番号：３６８９−５０−７）、プラミペキソール（ＣＡＳ登録番号：１０４６３２−２６−０）、パレコキシブナトリウム（ＣＡＳ登録番号：１９８４７０−８５−８）、チゲサイクリン（ＣＡＳ登録番号：２２０６２０−０９−７）、トルトラズリル（ＣＡＳ登録番号：６９００４−０３−１）、ビンフルニン（ＣＡＳ登録番号：１６２６５２−９５−１）、ドロスピレノン（ＣＡＳ登録番号：６７３９２−８７−４）、ダプトマイシン（ＣＡＳ登録番号：１０３０６０−５３−３）、モンテルカストナトリウム（ＣＡＳ登録番号：１５１７６７−０２−１）、ブリンゾラミド（ＣＡＳ登録番号：１３８８９０−６２−７）、マラビロク（ＣＡＳ登録番号：３７６３４８−６５−１）、ドキセルカルシフェロール（ＣＡＳ登録番号：５４５７３−７５−０）、オキソリン酸（ＣＡＳ登録番号：１４６９８−２９−４）、塩酸ダウノルビシン（ＣＡＳ登録番号：２３５４１−５０−６）、ニザチジン（ＣＡＳ登録番号：７６９６３−４１−２）、イダルビシン（ＣＡＳ登録番号：５８９５７−９２−９）、塩酸フルオキセチン（ＣＡＳ登録番号：５９３３３−６７−４）、アスコマイシン（ＣＡＳ登録番号：１１０１１−３８−４）、β−メチルビニルホスフェート（ＭＡＰ）（ＣＡＳ登録番号：９０７７６−５９−３）、アモロルフィン（ＣＡＳ登録番号：６７４６７−８３−８）、塩酸フェキソフェナジン（ＣＡＳ登録番号：８３７９９−２４−０）、ケトコナゾール（ＣＡＳ登録番号：６５２７７−４２−１）、９，１０−ジフルオロ−２，３−ジヒドロ−３−メチル−７−オキソ−７Ｈ−ピリド−１（ＣＡＳ登録番号：８２４１９−３５−０）、ケトコナゾール（ＣＡＳ登録番号：６５２７７−４２−１）、塩酸テルビナフィン（ＣＡＳ登録番号：７８６２８−８０−５）、アモロルフィン（ＣＡＳ登録番号：７８６１３−３５−１）、メトキサレン（ＣＡＳ登録番号：２９８−８１−７）、塩酸オロパタジン（ＣＡＳ登録番号：１１３８０６−０５−６）、ジンクピリチオン（ＣＡＳ登録番号：１３４６３−４１−７）、塩酸オロパタジン（ＣＡＳ登録番号：１４０４６２−７６−６）、シクロスポリン（ＣＡＳ登録番号：５９８６５−１３−３）、ならびにボツリヌス毒素およびその類似体およびワクチン成分。
活性物質としてのタンパク質、ポリペプチド、およびペプチド
本開示のデポ製剤において有用なタンパク質には、例えば、分子、例えばサイトカインおよびその受容体、ならびにサイトカインまたはその受容体を含むキメラタンパク質、例えば腫瘍壊死因子アルファおよびベータ、その受容体およびその誘導体；レニン；成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、メチオン−ヒト成長ホルモン、デス−フェニルアラニンヒト成長ホルモン、およびブタ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）；副甲状腺および下垂体ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；ヒト膵臓ホルモン放出因子；リポタンパク質；コルヒチン；プロラクチン；コルチコトロピン；甲状腺刺激ホルモン；オキシトシン；バソプレシン；ソマトスタチン；リプレシン；パンクレオザイミン；ロイプロリド；アルファ−１−アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）；ＬＨＲＨアゴニストおよびアンタゴニスト；グルカゴン；凝固因子、例えばＶＩＩＩＣ因子、ＩＸ因子、組織因子、およびヴォン・ヴィレブランド因子；抗凝固因子、例えばタンパク質Ｃ；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性剤；組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）以外のプラスミノーゲン活性化因子、例えばウロキナーゼ；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌｌｙ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−アルファ）；血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン；ミュラー管抑制物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；絨毛性ゴナドトロピン；ゴナドトロピン放出ホルモン；ウシソマトトロピン；ブタソマトトロピン；微生物タンパク質、例えばベータ−ラクタマーゼ；デオキシリボヌクレアーゼ；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモン受容体または成長因子受容体；インテグリン；タンパク質ＡまたはＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、４、−５、もしくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、もしくはＮＴ−６）、または神経成長因子、例えばＮＧＦ−β；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞成長因子、例えば酸性ＦＧＦおよび塩基性ＦＧＦ；上皮成長因子（ＥＧＦ）；形質転換成長因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータ、例えばＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、またはＴＧＦ−β５；インスリン様成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；デス（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質、例えばＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８、およびＣＤ−１９；エリスロポエチン；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えばインターフェロン−アルファ（例えば、インターフェロンα２Ａ）、−ベータ、−ガンマ、−ラムダ、およびコンセンサスインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；分解促進因子；ウイルス抗原、例えば、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質、ｇｐ１２０、ｇｐ１６０、またはその断片の一部；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；受精抑制剤、例えばプロスタグランジン；受精促進剤；調節タンパク質；抗体（その断片を含む）およびキメラタンパク質、例えばイムノアドヘシン；これらの化合物の前駆体、誘導体、プロドラッグ、および類似体、およびこれらの化合物の薬学的に許容可能な塩、またはその前駆体、誘導体、プロドラッグ、および類似体を含み得る。
好適なタンパク質またはペプチドは、天然または組換えであってもよく、例えば融合タンパク質を含む。
一部の実施形態において、タンパク質は、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、ウシ成長ホルモン、メチオン−ヒト成長ホルモン、デス−フェニルアラニンヒト成長ホルモン、およびブタ成長ホルモン；インスリン、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、およびプロインスリン；または成長因子、例えば血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、ならびにインスリン様成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）である。
本明細書において開示される注射用生分解性送達デポとしての使用に好適なペプチドは、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、ならびにその前駆体、誘導体、プロドラッグ、および類似体を含むが、これらに限定されない。
活性物質としての核酸
核酸活性物質は、核酸、ならびにその前駆体、誘導体、プロドラッグ、および類似体、例えば、治療用ヌクレオチド、ヌクレオシド、およびその類似体；治療用オリゴヌクレオチド；ならびに治療用ポリヌクレオチドを含む。この群から選択される活性物質は、抗癌剤および抗ウイルス剤として特に有用となり得る。好適な核酸活性物質は、例えば、リボザイム、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、アプタマー、およびｓｉＲＮＡを含み得る。好適なヌクレオシド類似体の例には、シタラビン（ａｒａＣＴＰ）、ゲムシタビン（ｄＦｄＣＴＰ）、およびフロクスウリジン（ＦｄＵＴＰ）があるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、好適な核酸活性物質は、干渉ＲＮＡ、例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡである。好適なｓｉＲＮＡには、例えば、ＩＬ−７（インターロイキン−７）ｓｉＲＮＡ、ＩＬ−１０（インターロイキン１０）ｓｉＲＮＡ、ＩＬ−２２（インターロイキン２２）ｓｉＲＮＡ、ＩＬ−２３（インターロイキン２３）ｓｉＲＮＡ、ＣＤ８６ ｓｉＲＮＡ、ＫＲＴ６ａ（ケラチン６Ａ）ｓｉＲＮＡ、Ｋ６ａ Ｎ１７１Ｋ（ケラチン６Ａ Ｎ１７１Ｋ）ｓｉＲＮＡ、ＴＮＦα（腫瘍壊死因子α）ｓｉＲＮＡ、ＴＮＦＲ１（腫瘍壊死因子受容体−１）ｓｉＲＮＡ、ＴＡＣＥ（腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α変換酵素）ｓｉＲＮＡ、ＲＲＭ２（リボヌクレオチドレダクターゼサブユニット−２）ｓｉＲＮＡ、およびＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）ｓｉＲＮＡがある。これらのｓｉＲＮＡのヒト遺伝子標的のｍＲＮＡ配列は、当分野において公知である。ＩＬ−７に関しては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿０００８８０．３、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿００１１９９８８６．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿００１１９９８８７．１、およびＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿００１１９９８８８．１；ＩＬ−１０に関しては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿０００５７２．２；ＩＬ−２２に関しては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿０２０５２５．４；ＩＬ−２３に関しては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿０１６５８４．２、およびＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＦ３０１６２０．１；ＣＤ８６に関しては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿１７５８６２．４、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿００６８８９．４、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿１７６８９２．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿００１２０６９２４．１、およびＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿００１２０６９２５．１；ＫＲＴ６ａに関しては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿００５５５４．３；ＴＮＦαに関しては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿０００５９４．２；ＴＮＦＲ１に関しては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿００１０６５．３；ＴＡＣＥに関しては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿００３１８３．４；ＲＲＭ２に関しては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿００１１６５９３１．１およびＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿００１０３４．３；ＶＥＧＦに関しては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿００１０２５３６６．２、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿００１０２５３６７．２、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿００１０２５３６８．２、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿００１０２５３６９．２、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿００１０２５３７０．２、ＮＭ＿００１０３３７５６．２、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿００１１７１６２２．１、およびＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿００３３７６．５を参照されたい。
さらに、ｓｉＲＮＡ設計時に特定のｍＲＮＡ標的配列を選択するための様々な方法および技術が当分野において公知である。例えば、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｔ ＭＩＴから提供される、公的に入手可能なｓｉＲＮＡ設計ツールを参照されたい。このツールは、インターネット上のウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｊｕｒａ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｂｉｏｃ／ｓｉＲＮＡｅｘｔ／で確認することができる。
さらなる活性物質化合物
様々なさらなる活性物質化合物を本明細書において開示される注射用デポ組成物に使用することができる。好適な化合物は、以下の薬物標的のうちの１つまたは複数を対象とする化合物を含む：クリングルドメイン、カルボキシペプチダーゼ、カルボキシルエステルヒドロラーゼ、グリコシラーゼ、ロドプシン様ドーパミン受容体、ロドプシン様アドレノセプター、ロドプシン様ヒスタミン受容体、ロドプシン様セロトニン受容体、ロドプシン様短鎖ペプチド受容体、ロドプシン様アセチルコリン受容体、ロドプシン様ヌクレオチド様受容体、ロドプシン様脂質様リガンド受容体、ロドプシン様メラトニン受容体、メタロプロテアーゼ、輸送ＡＴＰアーゼ、カルボキシルエステルヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、ＤＯＰＡデカルボキシラーゼ、Ａ／Ｇシクラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、スルホニル尿素受容体、他の輸送体（例えば、ドーパミン輸送体、ＧＡＢＡ輸送体１、ノルエピネフリン輸送体、カリウム輸送ＡＴＰアーゼα−鎖１、ナトリウム−（カリウム）−クロリド共輸送体２、セロトニン輸送体、シナプス小胞アミン輸送体、およびチアシド感受性ナトリウム−クロリド共輸送体）、電気化学ヌクレオシド輸送体、電位依存型イオンチャネル、ＧＡＢＡ受容体（Ｃｙｓループ）、アセチルコリン受容体（Ｃｙｓループ）、ＮＭＤＡ受容体、５−ＨＴ３受容体（Ｃｙｓループ）、リガンド開口型イオンチャネルＧｌｕ：カイナイト、ＡＭＰＡ Ｇｌｕ受容体、酸感受性イオンチャネルアルドステロン、リアノジン受容体、ビタミンＫエポキシドレダクターゼ、ＭｅｔＧｌｕＲ様ＧＡＢＡＢ受容体、内向き整流性Ｋ＋チャネル、ＮＰＣ１Ｌ１、ＭｅｔＧｌｕＲ様カルシウム感受性受容体、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、チロシン３−ヒドロキシラーゼ、アルドースレダクターゼ、キサンチンデヒドロゲナーゼ、リボヌクレオシドレダクターゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ、チオレドキシンレダクターゼ、ジオキシゲナーゼ、イノシトールモノホスファターゼ、ホスホジエステラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、ペプチジルプロリルイソメラーゼ、チミジル酸シンターゼ、アミノトランスフェラーゼ、ファルネシルジホスフェートシンターゼ、タンパク質キナーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、チューブリン、トロポニン、ＩκＢキナーゼ−βの阻害剤、アミンオキシダーゼ、シクロオキシゲナーゼ、シトクロムＰ４５０、チロキシン５−デヨードナーゼ、ステロイドデヒドロゲナーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、ステロイドレダクターゼ、ジヒドロオロト酸オキシダーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、輸送ＡＴＰアーゼ、トランスロケータ、グリコシルトランスフェラーゼ、核内受容体：ＮＲ３受容体、核内受容体：ＮＲ１受容体、およびトポイソメラーゼ。
一部の実施形態において、活性物質は、ロドプシン様ＧＰＣＲ、核内受容体、リガンド開口型イオンチャネル、電位依存型イオンチャネル、ペニシリン結合タンパク質、ミエロペルオキシダーゼ様、ナトリウム：神経伝達物質シンポーターファミリー、ＩＩ型ＤＮＡトポイソメラーゼ、フィブロネクチンＩＩＩ型、およびシトクロムＰ４５０のうちの１つを標的とする化合物である。
一部の実施形態において、活性物質は抗癌剤である。好適な抗癌剤には、アクチノマイシンＤ、アレムツズマブ、アロプリノールナトリウム、アミホスチン、アムサクリン、アナストロゾール、Ａｒａ−ＣＭＰ、アスパラギナーゼ、アザシチジン、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ビカルチミド、ブレオマイシン（例えば、ブレオマイシンＡ２およびＢ２）、ボルテゾミブ、ブスルファン、カンプトテシンナトリウム塩、カペシタビン、カルボプラチン、カルマスティン、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、Ｄアクチノマイシン、ダウノルビシン、ダウノルビシンリポソーム、ダカルバジン、デシタビン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドキソルビシンリポソーム、エピルビシン、エストラムスチン、エトポシド、リン酸エトポシド、エキセメスタン、フロクスウリジン、フルダラビン、リン酸フルダラビン、５−フルオロウラシル、ホテムスチン、フルベストラント、ゲムシタビン、ゴセレリン、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、イリノテカン、イクサベピロン、ラパチニブ、レトロゾール、酢酸ロイプロリド、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、ニムスチン、オファツムマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パニツムマブ、ペグアスパルガーゼ、ペメトレキセド、ペントスタチン、ペルツズマブ、ピコプラチン、ピポブロマン、プレリキサホル、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テモゾロマイド、テニポシド、６−チオグアニン、チオテパ、トポテカン、トラスツズマブ、トレオスルファン、トリエチレンメラミン、トリメトレキサート、ウラシルナイトロジェンマスタード、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ならびにそれらの類似体、前駆体、誘導体、およびプロドラッグがあるが、これらに限定されない。本開示の透過性ペプチド組成物に、上記の化合物のうちの２つ以上を組み合わせて使用してもよいことに留意すべきである。
また、開示される透過性ペプチド組成物中に使用するための当該活性物質は、オピオイドおよびその誘導体、ならびにオピオイド受容体アゴニストおよびアンタゴニスト、例えば、ナルトレキソン、ナロキソン、ナルブフィン、フェンタニル、スフェンタニル、オキシコドン、ならびにそれらの薬学的に許容可能な塩および誘導体も含んでよい。
一部の実施形態において、活性物質は、小分子または低分子量化合物、例えば、分子量約１０００ダルトン以下、例えば、約８００ダルトン以下を有する分子または化合物である。
一部の実施形態において、活性物質は標識である。好適な標識には、例えば、放射性同位体、蛍光体、化学発光体、発色団、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素阻害剤、発色団、染料、金属イオン、磁性粒子、ナノ粒子、および量子ドットがある。
活性物質は、本明細書において開示される組成物中に、任意の好適な濃度で存在してもよい。好適な濃度は、活性物質の効力、活性物質の半減期などに応じて異なってもよい。さらに、本開示による透過性ペプチド組成物は、１つまたは複数の活性物質、例えば、上述の活性物質のうち２つ以上の組み合わせを含んでもよい。
活性物質担体
本明細書においてすでに記載したように、１つまたは複数の活性物質は、透過性ペプチドと共役または会合して、本開示による透過性ペプチド組成物を提供してもよい。あるいは、本開示による透過性ペプチド組成物は、活性物質担体であって、活性物質がそれに結合した、および／またはその中に配置された活性物質担体と共役または会合した、本明細書に開示されるような透過性ペプチドを含んでもよい。
好適な活性物質担体には、例えば、リポソーム、ナノ粒子、ミセル、マイクロバブルなどがある。活性物質をこのような担体に組み込むための手法は、当分野で公知である。例えば、リポソームまたは脂質粒子は、米国特許第５，０７７，０５７号（Ｓｚｏｋａ，Ｊｒ．）に従って調製することができる。脂質二重層を形成する可能性がある非リン脂質成分から形成されるリポソームは、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１９：２２７−２３２（１９８２）に開示されている。リポソームの調製、精製、修飾、および充填に関しては、概して、Ｎｅｗ，Ｒ．Ｃ．Ｃ．，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，（１９９０） Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙを参照されたい。
リポソームの調製のための手法およびリポソームをカプセル化する薬剤の一般的考察は、米国特許第４，２２４，１７９号（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）に記載されている。また、Ｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｌｉｐｉｄｓ，４０：３３３−３４５（１９８６）も参照されたい。また、活性物質乾燥粉末組成物のカプセル化に関して、米国特許第６，０８３，５３９号も参照されたい。活性物質のナノ粒子への組込みに関しては、例えば、Ｍ．Ｍ．ｄｅ Ｖｉｌｌｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，（２００９） Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔｓを参照されたい。活性物質のミセルへの組込みに関しては、例えば、Ｄ．Ｒ．Ｌｕ ａｎｄ Ｓ．Ｏｉｅ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，（２００４） Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｔｏｔｏｗａ,ＮＪを参照されたい。
ペプチドの活性物質および活性物質担体との結合
本明細書に記載されるような透過性ペプチドは、活性物質と共役または会合させてもよい。あるいは、本明細書に記載されるような透過性ペプチドは、活性物質担体と共役または会合させてもよく、この活性物質担体は、それに結合した、および／またはその中に配置された活性物質を含む（この例は上記に記載される）。共役手法は、一般に、透過性ペプチドと活性物質または活性物質担体との間に１つまたは複数の共有結合の形成をもたらし、一方会合手法は、一般に、疎水性相互作用、静電相互作用、またはファン・デル・ワールス相互作用のうちの１つまたは複数を利用する。
様々な手法を用いて、ペプチドを活性物質と共役または会合させることができる。同様に、様々な手法を用いて、ペプチドを活性物質担体、例えば、本明細書に記載するようなリポソーム、ナノ粒子、またはミセルと共役または会合させることができる。
例えば、活性物質がペプチドまたはポリペプチドである場合、透過性ペプチドを含む組成物全体は、標準的アミノ酸合成手法を用いて合成することができる。標準的な分子生物学手法を含む他の方法を用いて、透過性ペプチドを含むポリペプチド配列全体を発現および精製することができる。ペプチドを他のペプチドまたはポリペプチドに共役させるさらなる方法は、Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ ｅｔ ａｌ．（２００２） Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ ４１：２５９６−２５９９、およびＴｏｒｎｏｅ ｅｔ ａｌ．（２００２） Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：３０５７−３０６４によって記載されるような、Ｃｕ触媒アジド／アルキン［３＋２］環化付加「クリックケミストリー」、Ｂａｓｋｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００７） ＰＮＡＳ Ｖｏｌ．１０４，Ｎｏ．４３：１６７３９３−１６７９７によって記載されるような、アジド／ＤＩＦＯ（ジフッ素化シクロオクチン）Ｃｕ不使用クリックケミストリー、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００５） Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２７：２６８６−２６９５によって記載されるような、アジド／ホスフィン「シュタウディンガー反応」、Ｓａｘｏｎ ａｎｄ Ｂｅｒｔｏｚｚｉ（２０００） Ｍａｒ １７ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７（５４６０）：２００７−１０によって記載されるような、アジド／トリアリールホスフィン「修正シュタウディンガー反応」、ならびにＣａｓｅｙ（２００６） Ｊ．ｏｆ Ｃｈｅｍ．Ｅｄｕ．Ｖｏｌ．８３，Ｎｏ．２：１９２−１９５、Ｌｙｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：６６０１−６６０９、およびＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １５：４０１−４０８によって記載されるような、触媒オレフィンクロスメタセシス反応を含む。
活性物質が低分子量化合物または小分子である場合、様々な手法を利用して、低分子量化合物または小分子を本明細書に記載されるような透過性ペプチドと共役させることができ、これには例えば、Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ），２０１０ Ｎｏｖ ２８；４６（４４）：８４０７−９．Ｅｐｕｂ ２０１０ Ｏｃｔ ７に記載されるようなクリックケミストリーがある。また、タンパク質のアミンおよびスルフヒドリル残基に対する小分子カルボキシル、ヒドロキシル、およびアミン残基の共役を記載する、Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．，（２００４）；９４：２５５−６５も参照されたい。
また、リポソームなどの活性物質担体にペプチドを共役するための方法も当分野において利用可能である。例えば、ペプチドをリポソームの表面に結合させるための手法を記載する、Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ（ｅｄｉｔｏｒ），Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌｕｍｅ ＩＩ Ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｉｎｔｏ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，（２００７），Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照されたい。タンパク質のリポソームとの共有結合に関しては、Ｎｅｗ，Ｒ．Ｃ．Ｃ．，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，（１９９０） Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．の第１６３頁〜第１８２頁を参照されたい。
薬学的製剤としての透過性ペプチド組成物の投与
当業者は、必要性のある対象または宿主、例えば患者に、透過性ペプチド組成物を投与する様々な好適な方法が利用可能であり、特定の組成物を投与するために１つ以上の経路を使用することが可能ではあるが、特定の経路は別の経路と比べてより即座により効果的な反応をもたらし得ることを理解するであろう。また、薬学的に許容可能な賦形剤も当業者に周知であり、容易に入手可能である。賦形剤の選択は、個々の化合物、およびその組成物を投与するための個々の方法によってある程度決定されるであろう。したがって、多様な好適な透過性ペプチド組成物の製剤が存在する。以下の方法および賦形剤は例示にすぎず、決して限定するものではない。
経口投与に好適な製剤は、（ａ）液状溶液、例えば、水、食塩水、またはオレンジジュースなどの希釈剤に溶解した有効量の化合物、（ｂ）固体または顆粒として既定量の活性成分をそれぞれ含有する、カプセル、サシェ、または錠剤、（ｃ）適切な液体中の懸濁液、（ｄ）好適な乳剤、および（ｅ）ヒドロゲルからなってもよい。錠剤形態には、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、微結晶性セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、香味剤、ならびに薬学的に適合性の賦形剤のうちの１つまたは複数を含み得る。舐剤形態には、香味料、通常はショ糖およびアカシアまたはトラガカント中の活性成分、ならびに不活性基剤、例えばゼラチンおよびグリセリン、またはショ糖およびアカシアを含むトローチ、活性成分以外に当分野で既知の賦形剤を含有する乳剤やゲルなどを含み得る。
透過性ペプチド製剤は、吸入によって投与されるエアロゾル製剤として製造することもできる。このようなエアロゾル製剤は、加圧された適切な推進剤、例えばジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などに注入することができる。またこれらは、ネブライザまたはアトマイザで使用するためのものなど、非加圧調製物用の医薬品として製剤化してもよい。
非経口投与に好適な製剤には、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬、および製剤を目的のレシピエントの血液と等張にする溶質を含んでもよい水性および非水性の等張滅菌注射液、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および保存剤を含んでもよい水性および非水性の滅菌懸濁液がある。製剤は、アンプルおよびバイアルなどの単位用量または複数用量密封容器中に付与されてもよく、使用直前に注射液用の滅菌液体賦形剤、例えば水の添加のみを必要とする、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。即席注射用溶液および懸濁液は、前述のような性質の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。
局所投与に好適な製剤は、クリーム、ゲル、ペースト、パッチ、スプレー、またはフォームとして与えてもよい。
また、様々な基剤、例えば乳化基剤または水溶性基剤と混合することによって、坐薬製剤も提供される。膣内投与に好適な製剤は、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォームとして与えられる。
経口または直腸内投与用の単位剤形、例えばシロップ剤、エリキシル剤、および懸濁液は、各投与単位、例えば小さじ１杯、大さじ１杯、錠剤、または坐薬が、既定量の組成物を含有するように提供することができる。同様に、注射または静脈内投与用の単位剤形は、滅菌水、生理食塩水、または別の薬学的に許容可能な担体の溶液として、製剤中に透過性ペプチドを含んでもよい。
本明細書において使用する際、用語「単位剤形」は、各単位が、薬学的に許容可能な希釈剤、担体、またはビヒクルと関連して、所望の効果を生じるのに十分な量で算出された既定量の透過性ペプチド組成物を含有する、ヒトおよび動物対象に対する単一投与量として好適な物理的に分離した単位を指す。本透過性ペプチド組成物の新規の単位剤形の規格は、使用する個々の活性物質、および達成すべき効果、および宿主における各化合物に関連する薬力学に依存する。
当業者は、特定の化合物や送達ビヒクルの性質などに応じて用量レベルが異なり得ることを容易に理解するであろう。所定の化合物の好適な投与量は、様々な手段によって、当業者により容易に決定される。
場合によっては、薬学的組成物は、他の薬学的に許容可能な成分、例えば緩衝液、界面活性剤、抗酸化剤、粘度調整剤、保存剤などを含有してもよい。これらの各成分は、当分野において周知である。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９８５，３１０号を参照されたい。
透過性ペプチド製剤での使用に好適な他の成分は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｕｎｅ １９９５）に記載されている。実施形態において、シクロデキストリン水溶液は、デキストロース、例えば約５％のデキストロースをさらに含む。
医療装置の成分としての透過性ペプチド組成物の投与
一部の実施形態において、本開示の透過性ペプチド組成物のうちの１つまたは複数は、当分野で公知の医療装置、例えば、薬剤溶出ステント、カテーテル、織物、セメント、包帯（液体または固体）、生分解性ポリマーデポなどに組み込んでもよい。一部の実施形態において、医療装置は、移植可能または部分的に移植可能な医療装置である。
治療方法
透過性ペプチド組成物の「有効量」（または、療法に関しては、「薬学的有効量」）という用語は、概して、所望の治療効果を達成するのに有効な透過性ペプチド組成物の量、例えば、透過性ペプチド−ｓｉＲＮＡ組成物の場合、標的とされるｍＲＮＡの発現を所望の治療効果を生じるのに有効な量まで減少させるのに有効な量を指す。
透過性ペプチド組成物の有効量、好適な送達ビヒクル、およびプロトコルは、従来の手段によって決定することができる。例えば、治療に関して、医師は、必要性のある対象または患者において、低用量の１つまたは複数の透過性ペプチド組成物で治療を開始し、その後投与量を増加させる、または投与計画を系統的に変更し、患者または対象に対するその効果を監視し、所望の治療効果を最大限にするよう、投与量または治療計画を調整することができる。投与量および治療計画の最適化についてのさらなる考察は、Ｂｅｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｎｉｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９９６），Ｃｈａｐｔｅｒ １，ｐｐ．３−２７、およびＬ．Ａ．Ｂａｕｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ，Ａ Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＤｉＰｉｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｅｄｓ．，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ，（１９９９），Ｃｈａｐｔｅｒ ３，ｐｐ．２１−４３、ならびに読者に紹介されるその中で引用されている文献に記載されている。
投与量レベルおよび投与方法は、様々な因子、例えば使用する透過性ペプチド、活性物質、使用の状況（例えば、治療を受ける患者）などに依存することになる。有効性を評価するための監視システムを含む、投与方法、投与量レベル、およびプロトコルの調整の最適化は、十分に通常の技能の範囲内の日常的事項である。
一実施形態において、本開示は、皮膚科疾患を有する対象を治療する方法であって、本明細書において開示されるような透過性ペプチドを含む薬学的有効量の組成物を対象に投与することを含み、このペプチドが、皮膚科用活性物質、例えば、本明細書において開示されるような皮膚科用活性物質、またはこの活性物質を含む皮膚科用活性物質担体と共役または会合する、方法を提供する。
一実施形態において、本開示は、ｍＲＮＡの発現に少なくとも部分的に起因する障害を有する、有することが疑われる、または発症しやすい対象を治療する方法であって、本明細書において開示されるような透過性ペプチドを含む薬学的有効量の組成物を対象に投与することを含み、この透過性ペプチドが、干渉ＲＮＡまたは干渉ＲＮＡを含む活性物質担体、例えば、前記ｍＲＮＡを標的とするｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、もしくはｓｉＲＮＡ、またはその干渉ＲＮＡを含む担体と共役または会合する、方法を提供する。
一実施形態において、干渉ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、例えば、Ｉl−１０ ｓｉＲＮＡ、ＩＬ−１７ ｓｉＲＮＡ、ＩＬ−２２ ｓｉＲＮＡ、ＩＬ−２３ ｓｉＲＮＡ、ＣＤ８６ ｓｉＲＮＡ、ＫＲＴ６ａ ｓｉＲＮＡ、ＴＮＦＲ１ ｓｉＲＮＡ、ＴＮＦα ｓｉＲＮＡ、およびＴＡＣＥ ｓｉＲＮＡのうちの１つから選択されるｓｉＲＮＡである。
インビトロでの使用
治療方法および他のインビボでの使用に加え、本明細書において開示される透過性ペプチド組成物は、インビトロでの実験において使用することもできる。例えば、本明細書において開示される透過性ペプチドを使用して、本明細書において考察されるような多様な活性物質、および潜在的活性物質のうちのいずれかをインビトロで生細胞中に送達し、その活性物質および潜在的活性物質の潜在的治療効果や有毒性などを決定することができる。この理由で、本開示の透過性ペプチドおよび透過性ペプチド組成物は、薬物試験および／またはスクリーニングにおいて有用となり得る。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるような透過性ペプチド組成物は、例えば、遺伝子標的を対象とする透過性ペプチド−干渉ＲＮＡコンジュゲートを導入し、遺伝子発現に対するその効果を監視することによって、インビトロの遺伝子サイレンシング実験で使用することができる。
さらなるインビトロでの使用には、インビトロで生細胞を標識するために、１つまたは複数の標識化剤（例えば、蛍光剤または放射性標識）または１つまたは複数の標識化剤担体と共役または会合した、本明細書において開示されるような透過性ペプチドの使用を含み得る。
以下の実施例は、当業者に本発明を作製および使用する方法の完全な開示および説明を提供するために示され、本発明者らがその発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではなく、また以下の実験が実施された全てまたは唯一の実験であると示すことを意図するものでもない。使用した数字（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するよう努力したが、ある程度の実験誤差および偏差は考慮すべきである。別段に定めのない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。
実施例１
以下のように、また図１のパネルＡに概括的に図示するように、インビトロファージディスプレイを用いて、ＳＣを透過するペプチドを同定した。
ファージディスプレイ
Ｔｈｅ Ｐｈ．Ｄ．−Ｃ７Ｃ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用した。フランツ型拡散セル（ＦＤＣ、Ｐｅｒｍｅｇｅａｒ）中のブタ皮膚にスクリーニング試験を実施した。２×１０１１ｐｆｕ（１０μＬ）のファージライブラリを１ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）とともに、ＦＤＣのドナー区画に配置した。２４時間後、レシーバ区画の液体を取り出し、一定分量のレシーバ溶液を２００μＬの大腸菌株ＥＲ２７３８（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に添加し、ＩＰＴＧ／Ｘｇａｌプレートに播くことによって滴定した。３７℃で１８時間のインキュベーション後に形成した青色プラークの数を計数し、配列決定のために２０個のプラークを無作為に選択した。その後のスクリーニングラウンド用に、レシーバ溶液１ｍＬを１：１００希釈したＥＲ２７３８の一晩培養物２０ｍＬに添加し、４．５時間成長させてファージを増幅した。このファージをＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿によって精製し、ＰＢＳに再懸濁した。この増幅したファージを次のスクリーニングラウンド用いた。ドナー区画に配置したファージの数２×１０１１ｐｆｕは、全５ラウンドのスクリーニングにわたって一定に保った。
５ラウンドの選択により、図１のパネルＢに示すように、ディスプレイライブラリが絞込まれた。１つの配列、ＡＣ−ＴＧＳＴＱＨＱ−ＣＧ（配列番号１３）は、後期のラウンドで高い頻度で出現し、Ｓｋｉｎ Ｐｅｒｍｅａｔｉｎｇ Ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｅｎｔｅｒｉｎｇ（ＳＰＡＣＥ）ペプチドとして指定した。第２の配列（ＡＣ−ＨＳＡＬＴＫＨ−ＣＧ）（配列番号１４）も高い頻度で出現した。第３の配列（ＡＣ−ＳＴＨＦＩＤＴ−ＣＧ）（配列番号１８）は、ラウンド４および５において、比較的高い頻度で出現した。「ＡＣ−」および「−ＣＧ」は、本明細書においてペプチド配列に関して使用する際、配列のＡＣおよびＣＧ部分がこのファージディスプレイ系に由来することを示すことに留意されたい。
ファージ透過
上述と同じ手順（増幅ステップおよびフォローアップスクリーニングステップを含まない）のあと、レシーバ試料中に検出されたファージコロニーの数と、透過を決定するための標準方程式とを用いて、ペプチドライブラリを含まないファージ、ファージライブラリ全体、ＳＰＡＣＥ−ペプチドを提示するファージ、およびヘプタグリシンファージを含む、種々のファージ試料の透過を決定した。
ファージクローニング
ファージの皮膚を透過する能力を検証するために、Ｐｈ．Ｄ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍ１３ＫＥ ｖｅｃｔｏｒ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、当該の特定のペプチド配列を提示するファージを作成した。当該ペプチド配列をＰｈ．Ｄ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍ１３ＫＥ ｖｅｃｔｏｒ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）内にクローニングした。ペプチド配列をＫｐｎＩ制限部位とＥａｇＩ制限部位との間に挿入した。元のＭ１３ＫＥベクターとペプチドインサートを含有する修飾Ｍ１３ＫＥベクターとを区別するために、逆方向プライマーを操作して、２つの部位突然変異によって、ＥａｇＩ制限部位（５’−ＣＧＧＣＣＧ−３’）（配列番号１９）からＳａｃＩＩ制限部位（５’−ＣＣＧＣＧＧ−３’）（配列番号２０）を修飾した。順方向プライマーおよび逆方向プライマーの両者を用いて、ベクター全体を複製した。順方向プライマーは、５’−ＧＴＴＣＣＧＣＧＧＡＡＡＣＴＧＴＴＧＡＡＡＧＴＴＧＴＴＴＡＧＣＡＡＡＡＴＣＣＣ−３’（配列番号２１）とした。ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）およびＴＨＧＱＴＱＳ（配列番号２２）の逆方向プライマーは、それぞれ５’−ＴＴＴＣＣＧＣＧＧＡＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＣＡＣＴＧＡＴＧＣＴＧＣＴＣＧＡＡＣＣＡＧＴＡＣＡＡＧＣＡＧＡＧＴＧＡＧＡＡＴＡＧＡＡＡＧＧＴＡＣＴＡＣＴＡＡＡＧＧＡＡＴＴＧＣＧＡＡＴＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴＴＣＡＣ−３’（配列番号２３）および５’−ＴＴＴＣＣＧＣＧＧＡＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＣＡ（ＡＧＡＣＴＧＡＧＴＣＴＧＣＣＣＡＴＧＡＧＴ）ＡＣＡＡＧＣＡＧＡＧＴＧＡＧＡＡＴＡＧＡＡＡＧＧＴＡＣＴＡＣＴＡＡＡＧＧＡＡＴＴＧＣＧＡＡＴＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴＴＣＡＣ−３’（配列番号２４）とした。
この複製産物を精製し、次いでＳａｃＩＩで消化して、ベクターのライゲーションに必要とされる平滑末端を生成した。この修飾ベクターをエレクトロコンピテントＥＲ２７３８細胞中に電気穿孔したあと、直ちにＳＯＣ培地（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）１ｍＬ中に配置し、３７℃で４５分間成長させた。得られた培養物を次いで１：１００に希釈した一晩培養物５０ｍＬ中に配置し、４．５時間成長させた。増幅させたファージを上述のプロトコルを用いて精製し、滴定した。１８時間後にプラークを採取し、配列決定してそのファージ表面に提示されるペプチドを検証した。
ペプチド合成
ＳＰＡＣＥペプチドのペプチド配列はＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）であり、対照ペプチド（ＣＰ）のペプチド配列はＡＣＴＨＧＱＴＱＳＣＧ（配列番号２５）であり、システイン間にジスルフィド結合が形成して環状ペプチドを生成した。５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）またはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）共役ペプチドは、ＣｈｉｎａＴｅｃｈ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏ．およびＲＳ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓにより合成された。この染料をペプチドのＮ末端上に配置した。両ペプチドのビオチン化型は、ＣｈｉｎａＴｅｃｈ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏ．により合成され、修飾を有さないペプチドは、ＲＳ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓにより合成された。
実施例２
数学的モデル
ＳＣを超えるファージの透過は、そのサイズを考えると予想外である（Ｐｏｔｔｓ ＲＯ ＆ Ｇｕｙ ＲＨ（１９９２） Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｓｋｉｎ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ．Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ９（５）：６６３−６６９、Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ Ｂ，Ｐｕｇｈ Ｗ，＆ Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｍ（２００４） Ｓｉｍｐｌｅ ｒｕｌｅｓ ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｒ ｔｏｘｉｃｉｔｙ． Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ２１（６）：１０４７−１０５４、Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ Ｓ（２００３） Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｓｋｉｎ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｓｏｌｕｔｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｆｏｕｒ ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ． Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ８６（１）：６９−９２）。大きい溶質（通常はＭＷ＞５００Ｄａ）は不良な皮膚透過を示し、経皮浸透の測定はその検出感度によってしばしば制限される。本研究で使用するＭ１３ファージは、幅およそ８ｎｍ、長さ９００ｎｍの長い繊維状粒子である。高いドナー濃度（約２×１０１１ｐｆｕ／ｍＬ）、低い検出限界（約１ｐｆｕ）、および増幅の可能性は、ファージの真皮透過の評価を容易にした。測定されたブタ皮膚を超えるファージの浸透性は極めて低く、対照ファージ（ペプチドライブラリを含まないファージ）では１０−９ｃｍ／時、ＳＰＡＣＥ−ファージでは１０−７〜１０−６ｃｍ／時であった。ファージの浸透は、低分子量溶質のものよりははるかに小さいが顕著であり、予想外であった。最も重要なことには、ファージの透過は配列特異的であった。
細胞間脂質を通る拡散は、分子の経皮浸透の古典的機序を示す。しかしながら、この機序は、一般に小さい油性分子に限られる。大型の親水性分子の浸透は、比較的研究がなされていない。このような溶質の経皮輸送は、（ｉ）極性または多孔質経路および（ｉｉ）付属器（毛包）の２つの経路による。数学的モデルは、両経路の経皮浸透への寄与を説明するために文献に記載されている（Ｔａｎｇ Ｈ，Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ Ｓ，Ｂｌａｎｋｓｃｈｔｅｉｎ Ｄ，＆ Ｌａｎｇｅｒ Ｒ（２００１） Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｐｅｒｍｅａｎｔｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｌｏｗ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｓｏｎｏｐｈｏｒｅｓｉｓ． Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９０（５）：５４５−５６８、Ｐｅｃｋ ＫＤ，Ｇｈａｎｅｍ ＡＨ，＆ Ｈｉｇｕｃｈｉ ＷＩ（１９９４） Ｈｉｎｄｅｒｅｄ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌａｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｏｒｅ ｒａｄｉｉ ｅｓｔｉｍａｔｅｓ ｏｆ ｉｎｔａｃｔ ａｎｄ ｅｔｈａｎｏｌ ｔｒｅａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ． Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ １１（９）：１３０６−１３１４）。これらのモデルにファージ輸送への適用、およびその実験的観察との比較を以下に提示する。
これらのモデルの基本原則は公開されており（（Ｔａｎｇ Ｈ，Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ Ｓ，Ｂｌａｎｋｓｃｈｔｅｉｎ Ｄ，＆ Ｌａｎｇｅｒ Ｒ（２００１） Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｐｅｒｍｅａｎｔｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｌｏｗ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｓｏｎｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．（Ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｅｎｇ） Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９０（５）：５４５−５６８（ｉｎ ｅｎｇ）、Ｐｅｃｋ ＫＤ，Ｇｈａｎｅｍ ＡＨ，＆ Ｈｉｇｕｃｈｉ ＷＩ（１９９４） Ｈｉｎｄｅｒｅｄ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌａｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｏｒｅ ｒａｄｉｉ ｅｓｔｉｍａｔｅｓ ｏｆ ｉｎｔａｃｔ ａｎｄ ｅｔｈａｎｏｌ ｔｒｅａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ．（Ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｅｎｇ） Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ １１（９）：１３０６−１３１４（ｉｎ ｅｎｇ））、これらのモデルの概要は以下に提示する。これらのモデルは、ファージの半径（約４ｎｍ）よりも小さいが同じ桁である２．６ｎｍの流体力学半径を有するデキストランなど、大きい分子の輸送を説明するために適用された。以下の分析は、これらのモデルの外挿に基づき、皮膚を通るファージ浸透を説明する上で参考になる背景を提供する。
極性経路： 極性（または多孔質）経路は、高分子を含むいくつかの親水性溶質の経皮拡散を説明するために使用されている（Ｔａｎｇ Ｈ，Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ Ｓ，Ｂｌａｎｋｓｃｈｔｅｉｎ Ｄ，＆ Ｌａｎｇｅｒ Ｒ（２００１） Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｐｅｒｍｅａｎｔｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｌｏｗ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｓｏｎｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．（Ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｅｎｇ） Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９０（５）：５４５−５６８（ｉｎ ｅｎｇ）、Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｓｋｉｎ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ：Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ．（Ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｅｎｇ） Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ（ｉｎ Ｅｎｇ）、Ｔｅｚｅｌ Ａ，Ｓｅｎｓ Ａ，＆ Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ Ｓ（２００３） Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｓｏｌｕｔｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｌｏｗ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｓｏｎｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｏｒｏｕｓ ｐａｔｈｗａｙ ｍｏｄｅｌ．（Ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｅｎｇ） Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９２（２）：３８１−３９３（ｉｎ ｅｎｇ）、Ｔｅｚｅｌ Ａ，Ｓｅｎｓ Ａ，＆ Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ Ｓ（２００２） Ａ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌｏｗ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｓｏｎｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｎ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ａｎｄ ｅｎｅｒｇｙ ｄｅｎｓｉｔｙ．（Ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｅｎｇ） Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ １９（１２）：１８４１−１８４６（ｉｎ ｅｎｇ）、Ｔｅｚｅｌ Ａ ＆ Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ Ｓ（２００３） Ｏｎ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｓｉｚｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｏｒｔｕｏｓｉｔｙ ｆｏｒ ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｓｏｌｕｔｅｓ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｕｍ ｃｏｒｎｅｕｍ．（Ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｅｎｇ） Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ８６（１）：１８３−１８６（ｉｎ ｅｎｇ）、Ｐｏｌａｔ ＢＥ，Ｓｅｔｏ ＪＥ，Ｂｌａｎｋｓｃｈｔｅｉｎ Ｄ，＆ Ｌａｎｇｅｒ Ｒ（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｑｕｅｏｕｓ ｐｏｒｏｕｓ ｐａｔｈｗａｙ ｍｏｄｅｌ ｔｏ ｑｕａｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ｌａｕｒｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ ｏｎ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｋｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ．（Ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｅｎｇ） Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ（ｉｎ Ｅｎｇ）、Ｓｅｔｏ ＪＥ，Ｐｏｌａｔ ＢＥ，Ｌｏｐｅｚ ＲＦ，Ｂｌａｎｋｓｃｈｔｅｉｎ Ｄ，＆ Ｌａｎｇｅｒ Ｒ（Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ａｎｄ ｓｏｄｉｕｍ ｌａｕｒｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ ｏｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｐｅｒｍｅａｎｔｓ：Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｔｕｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｆｕｌｌ−ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ａｎｄ ｓｐｌｉｔ−ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ｐｉｇ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ．（Ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｅｎｇ） Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ １４５（１）：２６−３２（ｉｎ ｅｎｇ）、Ｔａｎｇ Ｈ，Ｂｌａｎｋｓｃｈｔｅｉｎ Ｄ，＆ Ｌａｎｇｅｒ Ｒ（２００２） Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｅａｄｙ−ｓｔａｔｅ ｓｋｉｎ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｏｌａｒ ａｎｄ ｎｏｎｐｏｌａｒ ｐｅｒｍｅａｎｔｓ ａｃｒｏｓｓ ｅｘｃｉｓｅｄ ｐｉｇ ｓｋｉｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｓｋｉｎ ｐｏｒｏｕｓ ｐａｔｈｗａｙ．（Ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｅｎｇ） Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９１（８）：１８９１−１９０７（ｉｎ ｅｎｇ）、Ｔａｎｇ Ｈ，Ｂｌａｎｋｓｃｈｔｅｉｎ Ｄ，＆ Ｌａｎｇｅｒ Ｒ（２００２） Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌｏｗ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｏｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｎｎｉｔｏｌ：ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｋｉｎ．（Ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｅｎｇ） Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９１（８）：１７７６−１７９４（ｉｎ ｅｎｇ））。
角質層（ＳＣ）を横断するためには、親水性溶質は、複数の脂質二重層を透過する必要がある。しかしながら、脂質二重層を超える親水性溶質の低い浸透性を考えると、疎水性溶質の場合に重要な役割を果たす古典的な分配−拡散過程によって、親水性分子がＳＣを超えて拡散できる可能性は低いと思われる。このような溶質の経皮透過は、様々な物理的形態で存在する角質層の欠陥、例えば粒界、断層−転位、ナノスケール細孔、または皮膚構造の他の異常を主によって生じることが示されている。角質層の水和作用は、このような欠陥の発生をさらに増加させる。これらの欠陥の正確なサイズは、その欠陥の種類に依存し、１〜１００ｎｍの長さ尺度にわたり得る。
皮膚を通って拡散する親水性浸透物の浸透係数
の一般式は、以下のとおり多孔質経路によって与えられる：
［式中、ε、τ、およびＬは、それぞれ膜の多孔性、ねじれ、および厚さであり、Ｄ∞は、無限希釈における溶質拡散係数であり、Ｈ（λ）は、立体障害因子であり、このときλは浸透物の流体力学半径ｒｈと皮膚の有効細孔半径ｒとの比（すなわち、λ＝ｒｈ／ｒ）である］。Ｈ（λ）とλとの間の関係は、妨げられた輸送の理論であり、文献（１１）に記載されている。γ（ｒ）は、皮膚における細孔径分布であり、以下の関数によってブタ皮膚に関して示される（４）。
方程式［２］を視野に入れるために、媒体、例えば皮膚における細孔（または空隙）形成のエネルギー論を考慮する。細孔形成の確率は、以下の一般方程式によって、細孔形成の自由エネルギーと関連付けることができる。
式中、Ｅは、単位細孔当たり単位面積当たりの細孔形成の自由エネルギーである。方程式［２］および［３］の比較は、ブタ皮膚における半径４ｎｍの細孔のＥの値が、比較的小さい値、＜１ｋＴであることを示す。
ブタ皮膚のεの値は、約２×１０−５でと決定された（４）。同様に、ブタＳＣにおける大きい親水性溶質の拡散の屈曲度τは、約１であることが示された（４）。
は、水中の溶質拡散係数であり、相関、例えば以下のようなＷｉｌｋｅ−ＣｈａｎｇまたはＳｔｏｋｅ−Ｅｉｎｓｔｅｉｎ方程式を用いて算出された。
式中、ｒｈはÅで示され、
は、ｃｍ２／秒で示される。方程式［１］、［２］、および［４］を複合することによって、半径ｒｈの溶質の場合の多孔質経路の寄与を以下のように推定することができる。
式中、
は、ｃｍ／時で示される。ｒｈ＝４０Å（ファージの半径に対応する）を代入することによって、
約１０−８ｃｍ／時を求めることができる。
付属器の寄与： また、大きい溶質は、付属器を通して皮膚を超えて拡散することもできる。毛包の密度は解剖学的位置によって実質的に異なるが、ブタ皮膚における毛包の平均密度は、およそ１０／ｃｍ２と推定される。しかしながら、毛包の大部分は毛によって塞がれ、輸送には利用できない。この短絡路の皮膚浸透性への寄与は、以下によって求められる。
式中、φｓは、輸送に利用可能な毛包が占める皮膚面積の割合である。Ｄｓは、毛包内の内容物中の溶質拡散係数であり、Ｌｓｈｕｎｔは、毛包を通る拡散経路長である。輸送に利用可能な毛包中の皮膚の面積率は、約１０−４ｃｍ２／ｃｍ２である。Ｄｓは、Ｗｉｌｋｅ−Ｃｈａｎｇｅ方程式またはＳｔｏｋｅ−Ｅｉｎｓｔｅｉｎ関係を用いて推定することができる。毛包が粘性液で満たされていると仮定し、大きいサイズのファージを前提とすると、Ｄｓは、近似して約１０−８ｃｍ２／秒であってよい。Ｌｓｈｕｎｔは、約５００μｍである。上記の値をφｓおよびＬｓｈｕｎｔに代入すると、
に対して約１０−７ｃｍ／時の式を得ることができる。
上記の方程式は、したがって、ブタ皮膚を超えるファージ浸透性が１０−７〜１０−８ｃｍ／時の範囲であると推定することができる。
これらの推定値を実験データと比較するために、ブタ皮膚を超えるファージ浸透を本明細書においてすでに記載したように測定した。対照ファージ（いかなるペプチドも提示されないファージ）は、浸透性約１０−９ｃｍ／時を示した。また、ヘプタグリシンを提示するファージも約１０−１０ｃｍ／時の低い浸透性を示した。ファージディスプレイライブラリ全体は、浸透性約１０−８〜１０−７ｃｍ／時を示し、ＳＰＡＣＥ配列を提示するファージの浸透性は、１０−７〜１０−６ｃｍ／時であった。これらの数字は、概して理論予測値と一致する。測定された浸透性は、定常値を表さないかもしれないこと、また浸透性の古典的定義を満たさないかもしれないことに留意しなければならないが、それでもなおこれらの数字は、理論予測値との比較を可能にする適正な値を提供する。
本研究で使用した全てのファージ粒子が同一サイズであるとすれば、ＳＰＡＣＥファージの浸透性が対照ファージ（ペプチドが提示されない）よりも高いことは、ファージ表面に提示されるペプチドによって説明されるであろう。この多孔質経路モデルは、皮膚における溶質の分配が１である、すなわち溶質が皮膚に対して親和性を示さないと仮定する。ＳＰＡＣＥファージが皮膚に対してより高い親和性を示した場合、皮膚を超えるファージのより高い分割および透過をもたらす。実験的観察は、ＳＰＡＣＥが皮膚成分、特にケラチンに対するカーゴの親和性を増加させることを実際に示唆している。いかなる特定の理論に拘束されることも意図しないが、この親和性の増加が、ＳＰＡＣＥファージの透過が対照ファージよりも増加したことの主な理由であることが仮定される。
この過程をさらに裏付けるために実験を行って、ブタ皮膚を超えるＳＰＡＣＥファージの浸透に対する過剰ＳＰＡＣＥペプチドの影響を評価した。具体的には、約１００，０００倍の過剰ＳＰＡＣＥペプチド存在下（ファージ上のＳＰＡＣＥペプチド１個当たり約１０５個遊離ＳＰＡＣＥペプチド）、ＳＰＡＣＥ配列を提示するファージを皮膚上に配置した。過剰ＳＰＡＣＥペプチドは、ＳＰＡＣＥファージの浸透を著しく減少させ、この場合のＳＰＡＣＥ−ファージの浸透性は、ヘプタグリシンファージ（約１０−１０ｃｍ／時）に近かった。
実施例３
真皮スクリーニング
別の実験において、ファージスクリーニングを実施して、真皮に局在するファージを単離した。この真皮スクリーニングのために、ファージディスプレイライブラリもＦＤＣのドナー区画内に配置した。２４時間後、ドナー区画からの液体を除去し、皮膚を６０℃で９０秒間配置した。次に表皮を真皮から除去した。真皮からファージを抽出するために、真皮を小片に切断し、次いで均質化した（ＩＫＡ分散機）。このホモジネートを５，０００ｒｐｍで５分間遠心沈殿させ、次いでＰＢＳに再懸濁させ、室温で５分間インキュベートした。次に試料を再び遠心分離し、さらに２回洗浄した。遠心分離機の最終回転後、ホモジネートを１％ ＮＰ４０（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁させて、残留ファージを真皮から溶出した。次に溶出液を播き、上記に列挙した方法に従って増幅した。これを合計５ラウンド繰り返した。スクリーニングの第５ラウンド終了時に、真皮から約１．９×１０５のファージを回収した。ファージの配列決定を行い、第５ラウンドにおける３つの先導配列は、ＡＣ−ＫＴＧＳＨＮＱ−ＣＧ（配列番号１５）（３０％）、ＡＣ−ＭＧＰＳＳＭＬ−ＣＧ（配列番号１６）（３０％）、およびＡＣ−ＴＤＰＮＱＬＱ−ＣＧ（配列番号１７）（２０％）であった。ＡＣ−ＫＴＧＳＨＮＱ−ＣＧ（配列番号１５）ペプチドと上記で特定されたＳＰＡＣＥペプチドとの類似性を考慮して、ＳＰＡＣＥペプチドをさらなる研究用に選択した。
実施例４
蛍光標識ファージの透過
ＳＰＡＣＥペプチドを提示するファージクローンを蛍光標識し、その皮膚内に透過する能力を試験した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８タンパク質標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ファージ粒子を標識した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８は、ファージの外被タンパク質上の第１級アミン基と反応するＴＦＰエステルを含有する。脱イオン水またはＰＢＳ中の２×１０１２ｐｆｕを脱イオン水に添加して、総体積５００μＬとした。次にこのファージ溶液を５０μＬの１Ｍ重炭酸ナトリウムに添加し、得られた溶液を蛍光染料が入ったバイアルに入れ、室温で１時間置いた。次にファージをＰＥＧ／ＮａＣｌで精製して、過剰の未反応染料を除去し、滴定した。
ヨークシャーブタの側腹部から全層ブタ皮膚を採取した。この皮膚を−８０℃で保管し、使用直前に解凍した。皮膚の導電率を測定して、皮膚バリアの完全性を確認した。抵抗率約５０ｋΩを有する皮膚試料を実験に使用した。ＳＰＡＣＥペプチドまたはスクランブルペプチド配列（ＡＣ−ＴＨＧＱＴＱＳ−ＣＧ）（配列番号２５）を提示する蛍光標識ファージクローンをＦＤＣのドナー区画内に配置した。これらのファージスクリーニング実験が類似するように、２×１０１１ｐｆｕをドナー区画に添加し、２４時間後に皮膚試料を採取した。次に、共焦点顕微鏡法による画像化用に皮膚試料を調製した。
共焦点顕微鏡画像化用の皮膚試料の調製
皮膚試料は、採取して脱イオン水ですすいだ直後に、４％パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に入れて４℃で一晩置いた。次いで皮膚試料をＯ．Ｃ．Ｔ．化合物中で凍結し、クライオトーム（Ｌｅｉｃａ）で厚さ２０μｍに切断した。ガラススライドに組織が接着するように正に荷電したスライド（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に組織を取り付けた。このスライドを脱イオン水で５分間洗浄してから、５μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｅｓｔ ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で５分間染色した。次にこのスライドを再び脱イオン水中で５分間洗浄し、その後暗所にて室温で完全に乾燥させた。１０μＬのＰｅｒｍｏｕｎｔ封入剤（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をカバーガラスとともに皮膚切片上に設置し、次いでスライドを密封した。全ての試料を共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ａｎｄ Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｆｌｕｏｖｉｅｗ ５００）で画像化した。
上記の実験の画像化結果は、図２のパネル（ａ）および（ｂ）に示す。ＳＰＡＣＥペプチドを提示する蛍光標識ファージクローンは、少ないが検出可能な皮膚内への透過を示した（ａ）。対照的に、スクランブル対照ペプチド配列（ＡＣ−ＴＨＧＱＴＱＳ−ＣＧ）（配列番号２５）は、表層のみの透過を示した（ｂ）。
実施例５
ブタ皮膚内へのペプチド透過
ファージから除去したときにブタ皮膚を透過するＳＰＡＣＥペプチドの能力を以下のように試験した。全層ブタ皮膚を採取し、上述のように調製した。蛍光標識したペプチドの１ｍｇ／ｍＬ溶液２００μＬをＦＤＣのドナー区画内に配置した。２４時間後、ドナー区画内の残留溶液を除去し、ＦＤＣを取り外した。皮膚試料を回収し、脱イオン水ですすいで皮膚表面上の過剰のペプチドまたはペプチド複合体を除去した。次いで、上述のように、皮膚試料を共焦点顕微鏡法による画像化用に調製した。
上記の実験の画像化結果は、図１のパネル（ｃ）および（ｄ）に示す。ＳＰＡＣＥペプチドは、ファージから除去したとき、皮膚内に透過した（ｃ）。ファージ全体でなされた観察と一致して、ＳＰＡＣＥペプチドは、真皮に強く局在することが認められた。対照ペプチドの顕著な透過は観察されなかった（ｄ）。
実施例６
ブタ皮膚におけるペプチドおよび高分子透過
ＳＣを超えて高分子カーゴを運搬するＳＰＡＣＥペプチドの能力を以下のように試験した。全層ブタ皮膚を採取し、上述のように調製した。まずペプチドをより詳細に後述するように高分子と共役させ、次いでこのペプチド−高分子複合体をＦＤＣのドナー区画内に配置する。２４時間後、ドナー区画内の残留溶液を除去し、ＦＤＣを取り外した。皮膚試料を回収し、脱イオン水ですすいで皮膚表面上の過剰ペプチド複合体を除去した。次いで、上述のように、皮膚試料を共焦点顕微鏡法による画像化用に調製した。
ペプチドを高分子ストレプトアビジンと共役させるために、１ｍｇ／ｍＬのビオチン化ペプチド溶液８０μＬを２ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）溶液２０μＬとともにインキュベートし、室温で３０分間インキュベートした。次いで得られた溶液をＦＤＣのドナー区画内に配置した。皮膚試料を２４時間後に採取し、上述のように画像化した。
ストレプトアビジンは、ビオチン化ＳＰＡＣＥペプチドと共役したとき、ＳＣを十分に超えて透過し、表皮および真皮において、ストレプトアビジンのある程度の局在化が認められた（図１のパネル（ｅ））。ＳＰＡＣＥペプチドと共役していないストレプトアビジンは、表皮内へのわずかな透過を示した（図１のパネル（ｆ））。
ＳＰＡＣＥペプチドのＳＣを超えて量子ドットを運搬する能力を以下のように試験した。量子ドットの皮膚内への送達のために、１００ｎｇ／ｍＬのビオチン化ペプチド溶液１９８μＬをＱＤｏｔ ５２５ストレプトアビジンコンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２μＬとともに、室温で１時間インキュベートした。次いで、懸濁液２００μＬをＦＤＣのドナー区画内に配置した。皮膚試料を２４時間後に採取し、共焦点顕微鏡画像化を上記のとおり行った。
ＳＰＡＣＥペプチドは、ストレプトアビジンで被覆した量子ドットと共役したとき、検出可能であるが少量の輸送をもたらした。対照ペプチドと共役した量子ドットの顕著な透過は観察されなかった。図２のパネル（ｃ）および（ｄ）をそれぞれ参照されたい。いかなる特定の理論に拘束されることも意図しないが、輸送量の減少は、比較的大きい量子ドットのサイズに起因する可能性がある。
実施例７
ヒト皮膚におけるペプチド透過
ファージから除去して、蛍光タグの形態の例示的小分子と共役させたときに、ＳＰＡＣＥペプチドがヒト皮膚を透過する能力を以下のように試験した。全層ヒト皮膚をＮａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅから入手した。この皮膚を−８０℃で保管し、使用直前に解凍した。皮膚の導電率を測定して、皮膚バリアの完全性を確認した。抵抗率約５０ｋΩを有する皮膚試料を実験に使用した。蛍光標識したペプチドの１ｍｇ／ｍＬ溶液２００μＬをＦＤＣのドナー区画内に配置した。２４時間後、ドナー区画内の残留溶液を除去し、ＦＤＣを取り外した。皮膚試料を回収し、脱イオン水ですすいで皮膚表面上の過剰のペプチドまたはペプチド複合体を除去した。次いで、上述のように、皮膚試料を共焦点顕微鏡法による画像化用に調製した。
ＳＰＡＣＥペプチドは、ヒト皮膚を良好に横断することが示され、ブタ皮膚で認められたものと同様の透過を示した。図２のパネル（ｅ）（ＳＰＡＣＥ）および（ｆ）（対照）を参照されたい。上部から観察した際、角質細胞内にＳＰＡＣＥペプチドの高い局在性が認められたが、対照ペプチドの顕著な透過は観察されなかった。図２のパネル（ｇ）および（ｈ）をそれぞれ参照されたい。
実施例８
インビトロでのマウス皮膚内へのペプチド透過
ＳＰＡＣＥペプチドのインビトロでマウス皮膚を透過する能力を以下のように試験した。２００μＬの蛍光標識したペプチド（１ｍｇ／ｍ）をマウスの皮膚に適用した。皮膚を採取し、それを切断し、顕微鏡下で観察することにより、様々な時点で透過を評価した。
ＳＰＡＣＥペプチドは、対照ペプチドよりも著しく高いレベルで、インビトロでマウス皮膚内に透過した（図３のパネル（ａ）〜（ｆ）、および図４のパネル（ａ）〜（ｆ））。マウス皮膚へのＳＰＡＣＥペプチドの３０分間の適用（図３）により、透過を生じ、２時間の適用（図４）により、皮膚内への顕著な透過および真皮深部における局在化を生じ、これはブタおよびヒトの皮膚で見られたものと一致した。
実施例９
角質層研究
ＳＰＡＣＥペプチドのＳＣを透過する能力をさらに特徴付けるために、以下のような単離ＳＣを用いて実験を実施した。ＳＣを全層皮膚から単離するために、皮膚を６０℃の水浴中に９０秒間配置した。水浴から取り出したあと、表皮を真皮から分離した。次に、表皮側を下にしてＳＣを０．２５％トリプシンが入ったペトリ皿内に配置して、ＳＣから表皮を除去した。このＳＣを脱イオン水で洗浄したあと、室温で完全に乾燥させた。ＳＣを脱脂するために、ＳＣを２：１（ｖ／ｖ）、１：１（ｖ／ｖ）、および１：２（ｖ／ｖ）のクロロホルム：メタノール溶媒混合物中にそれぞれ１５分間配置した。脂質の除去を確認するために、溶媒混合物との接触前後にＳＣ試料にＦＴＩＲを実施した。
ＳＣのフーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）分光
異なるペプチド溶液のＳＣ構造に対する効果を見るために、ＳＣ試料にＦＴＩＲを実施した。ＳＣを１．５×１．５ｃｍ片に切断し、ペプチドとの接触前に各片の対照スペクトルを得た。次いで、２ｍＬのペプチド溶液をＳＣとともに２４時間インキュベートした。次にこのＳＣ試料を脱イオン水ですすぎ、室温で完全に乾燥させた。各ＳＣ試料のスペクトルを再び読み取り、前後のスペクトルを比較して、各ペプチドのＳＣ構造に対する効果を決定した。スペクトルは、Ｎｉｃｏｌｅｔ Ｍａｇｎａ ８５０分光計を用いて分解能２ｃｍ−１で取得し、４００回スキャンの平均値を取った。
単離したヒトＳＣを用いた実験は、ＳＰＡＣＥペプチドが角質細胞タンパク質、大概はケラチンに結合することを明らかにした（図５のパネル（ａ）および（ｂ））。フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）による研究は、ＳＰＡＣＥペプチドのケラチンに対する効果を裏付けた。具体的には、ＳＰＡＣＥペプチドと接触させたＳＣは、ＦＴＩＲスペクトルの変化を示し、ケラチンの構造変化を示唆した（図５のパネル（ｃ））。対照ペプチドは、ペプチド不在下で見られるものと比較して、ＦＴＩＲにおけるタンパク質構造に対して顕著な効果を有さなかった（図５のパネル（ｄ）および図６）。また、ＦＴＩＲは、ＳＰＡＣＥペプチドが、ＳＣ脂質に対する検出可能な効果を有さないことも示した（図５のパネル（ｅ）および（ｆ））。対称ＣＨ２伸縮ピークの面積の変化も中心周波数のシフトも認められず、ＳＰＡＣＥペプチドが、ＳＣ脂質の抽出または流動化を誘発しなかったことを示した。このＦＴＩＲデータと一致して、ＳＰＡＣＥペプチドとの接触は、皮膚の導電率に顕著な変化をもたらさなかった（図７）。具体的には、皮膚の導電率は、ＳＰＡＣＥペプチドとの２４時間のインキュベーション後、約１．７（＋／−０．６）倍に増加した。この向上は、対照ペプチドの場合に観察されたものよりは高いが、比較的軽度であった。同様に、ＳＰＡＣＥペプチドと大型親水性分子であるイヌリンとの共インキュベーションは、その浸透性に軽度な増加をもたらしたにすぎず（図７）、ＳＰＡＣＥペプチドが、同時投与されるカーゴではなく共役したカーゴの浸透の促進に主に有効であることを示している。
いかなる特定の理論に拘束されることも意図しないが、ＳＰＡＣＥペプチドの主な効果は、ＳＣ、主に角質細胞への分配を促進し、続いてＳＰＡＣＥペプチドおよびコンジュゲートの皮膚バリアを横断する能力を強化することであるかもしれない。透過に対するペプチドの付加的効果も、ケラチン構造に影響を与えるその能力により、期待できる可能性がある。
実施例１０
ＳＰＡＣＥペプチドの生細胞内への透過
ＳＰＡＣＥペプチドのＳＣを透過する能力を確認したあと、細胞培養物における、角化細胞、線維芽細胞、および内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を含む生細胞内に浸透するその能力を試験した。
細胞透過研究用に、１．２×１０４細胞をポリ−ｄ−リジンで被覆したガラス底培養皿（ＭａｔＴｅｋ）上に播種した。ＨＵＶＥＣ細胞については、細胞播種前に培養皿を１％ゼラチンで被覆した。３７℃で４時間のインキュベーション後、培地を除去し、１ｍｇ／ｍＬの蛍光ペプチド溶液２μＬを培地１８０μＬに添加し、続いて細胞培養皿に添加した。対照については、ペプチド溶液の代わりに同量のＰＢＳを添加した。ペプチド添加後、細胞培養物を適切な条件で、細胞透過（４℃または３７℃）を研究するためにインキュベートし、６時間または２４時間インキュベートした。細胞を共焦点顕微鏡法による画像化用に調製した。
細胞培養条件
ヒト成人表皮角化細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、Ｈｕｍａｎ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＥｐｉＬｉｆｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養し、ヒト皮膚線維芽細胞（ＡＴＣＣ）は、１０％ウシ胎仔血清を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＡＴＣＣ）中で培養し、プールヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ，Ｌｏｎｚａ）は、１５％ウシ胎仔血清、１５μｇ／ｍＬの内皮細胞成長サプリメント、１００μｇ／ｍＬのヘパリン、および２ｍＭ Ｌ−グルタミンを補充した、１％ゼラチンで被覆したフラスコ上のＭ１９９培地中で培養し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞は、１０％ウシ胎仔血清を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＡＴＣＣ）中で培養した。全ての細胞培養培地に、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充し、培養物は、標準的細胞培養条件下で成長させた（３７℃、５％ ＣＯ２）。
共焦点顕微鏡画像化用の細胞培養物試料の調製
インキュベーション後、細胞をＨａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ，Ｌｏｎｚａ）で洗浄し、１％トリパンブルーとともに５分間インキュベートして、細胞表面上のいかなる蛍光も消光した。次にこれらの細胞を４％パラホルムアルデヒドで３分間固定し、ＨＢＳＳ中で再び洗浄した。次いで、細胞をＨｏｅｃｈｅｓｔ ３３３４２（５μｇ／ｍＬ）とともに５分間インキュベートしたあと、ＨＢＳＳ中で洗浄した。次に細胞培養皿にＨＢＳＳを充填し、共焦点顕微鏡法を用いて画像化した（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｆｌｕｏｖｉｅｗ ５００）。
ＳＰＡＣＥペプチドの顕著な透過が全ての細胞株において示され（図８のパネル（ａ）〜（ｆ）、図８のパネル（ｇ）は、角化細胞におけるＳＰＡＣＥペプチドの内部移行の拡大図を示す）。全ての例において、ＳＰＡＣＥペプチドの内部移行の程度は対照ペプチドのものよりも高く、細胞透過が配列特異的に生じることを示した（図８のパネル（ｈ））。また、ＳＰＡＣＥペプチドは、乳癌細胞における内部移行も示した（ＭＤ−ＭＢ−２３、図９のパネル（ａ）〜（ｃ））。試験した全ての種類の細胞を透過する能力は、ＳＰＡＣＥの細胞内への侵入方式が、研究した全ての細胞株に共通する経路によるものであり、角化細胞に特有の特定の膜タンパク質によるものではないことを示している。
実施例１１
細胞透過機序研究
ＳＰＡＣＥペプチドの細胞透過の潜在的機序を決定するために、４℃でのインキュベーションを含む、いくつかのエンドサイトーシス阻害剤の内部移行に対する効果をヒト角化細胞において試験した（図１０のパネル（ａ）を参照）。
エンドサイトーシス阻害剤
細胞の機序研究のために、細胞を様々なエンドサイトーシス阻害剤とともに、または４℃で１時間インキュベートしたあと、蛍光標識したペプチドを添加した。使用したエンドサイトーシス阻害剤は、ＥＩＰＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ならびにクロルプロマジン、ナイスタチン、およびデオキシ−Ｄ−グルコース（Ｓｉｇｍａ）である。ＥＩＰＡをＤＭＳＯに溶解し、濃度１００μＭで使用した。クロルプロマジン、ナイスタチン、およびデオキシ−Ｄ−グルコースを滅菌水に溶解し、それぞれ濃度１０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、および５ｍＭで使用した。細胞を蛍光標識したペプチドとともに３時間インキュベートし、その後フローサイトメトリを用いた分析のために採取した。
フローサイトメトリ用試料の調製
蛍光標識したペプチドとのインキュベーション後、培地を除去し、細胞をＨＢＳＳ中で５分間ずつ３回洗浄して残留蛍光を除去した。０．２５％トリプシン（ＨｙＣｌｏｎｅ）を用いて、細胞を細胞培養皿から除去した。次にこれらの細胞を５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、細胞をペレットにした。氷上で細胞ペレットをＰＢＳ（ｐＨ７．４）に再懸濁させ、ＦＡＣＳ Ａｒｉａフローサイトメーターと用いて試料を分析した。
４℃でのインキュベーションは、対照ペプチドと同様に、ＳＰＡＣＥペプチドの内部移行を著しく減少させ（３７℃でのものと比較して約５％の取り込み）、これは両者が能動的機序によって細胞に侵入することを示している（図１０のパネル（ａ））。これは、同様に両ペプチドの内部移行の減少（約５２％）をもたらしたデオキシ−Ｄ−グルコースの使用によってさらに裏付けられた（図１０のパネル（ａ））。この能動的取り込みの性質をさらに評価するために、細胞をクラスリン依存性エンドサイトーシス阻害剤のクロルプロマジンおよびカベオラ依存性エンドサイトーシス阻害剤のナイスタチンとともにインキュベートした。これらのはいずれもＳＰＡＣＥペプチドまたは対照ペプチドの細胞内部移行を減少させなかった（図１０のパネル（ａ））。最後に、マクロピノサイトーシス阻害剤の５−（Ｎ−エチル−Ｎ−イソプロピル）アミロリド（ＥＩＰＡ）の効果を試験した。細胞をＥＩＰＡと接触させることにより、ＳＰＡＣＥ内部移行のおよそ５０％の減少がもたらされた（図１０のパネル（ａ））。対照的に、ＥＩＰＡは、対照ペプチドの内部移行に影響を及ぼさない。集合的に、これらの結果は、マクロピノサイトーシスがＳＰＡＣＥペプチドの内部移行において重要な役割を果たすことを示し、これは文献（Ｎａｋａｓｅ Ｉ，ｅｔ ａｌ．（２００４） Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｒｏｌｅｓ ｆｏｒ ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ ａｎｄ ａｃｔｉｎ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １０（６）：１０１１−１０２２．，Ｐａｔｅｌ ＬＮ， Ｚａｒｏ ＪＬ，＆ Ｓｈｅｎ ＷＣ（２００７） Ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐａｔｈｗａｙｓ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ． Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ２４（１１）：１９７７−１９９２）中の他の細胞透過性ペプチドと共通する結果である。研究は、マクロピノサイトーシスによって内部移行したカーゴは、しばしばエンド／リソソームと共局在化しないことを報告し、それらの分解リソソームコンパートメント内への侵入が回避できる可能性があることを示した（Ｔａｍａｒｕ Ｍ，Ａｋｉｔａ Ｈ，Ｆｕｊｉｗａｒａ Ｔ，Ｋａｊｉｍｏｔｏ Ｋ，＆ Ｈａｒａｓｈｉｍａ Ｈ（２０１０） Ｌｅｐｔｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ，ａ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３９４（３）：５８７−５９２．，Ｗａｌｓｈ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２００６） Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｐｅｇｙｌａｔｅｄ ｐｏｌｙ−Ｌ− ｌｙｓｉｎｅ ｃｏｍｐａｃｔｅｄ ＤＮＡ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ ３（６）：６４４−６５３）。角化細胞培養物のＭＴＴアッセイは、ＳＰＡＣＥペプチドが、本明細書において研究した濃度範囲（０．１〜１．０ｍｇ／ｍＬ、図１０のパネル（ｂ））で、細胞毒性がないことを明らかにした。
実施例１２
ＳＰＡＣＥペプチド共役ｓｉＲＮＡを用いたＧＦＰノックダウン
ＳＰＡＣＥペプチドの様々な細胞内に透過する能力により、このペプチドはｓｉＲＮＡ送達の優れた候補となる。この可能性をインビトロでモデル細胞株としての緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現内皮細胞を用いて調査した。
ＧＦＰ発現内皮細胞（ＡＴＣＣ）を１０％ウシ胎仔血清を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍで成長させた。ＧＦＰ ｓｉＲＮＡ、５’−ＧＡＣ ＧＵＡ ＡＡＣ ＧＧＣ ＣＡＣ ＡＡＧ ＵＵＣ Ｎ６−３’（配列番号２６）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を蛍光標識したペプチド（遊離カルボキシル基を含む）とＥＤＣ化学によって共役させた。
１０ｍＭのペプチド溶液を同量のＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ，Ｓｉｇｍａ）の１０ｍＭ溶液およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩（ＮＨＳ，Ｓｉｇｍａ）の９．５ｍＭ溶液ともに、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）中で１５分間インキュベートした。次いで、この混合物にアミンで修飾したｓｉＲＮＡを添加して、ペプチドをｓｉＲＮＡと共役させ、一晩混合させた。
このペプチド−ｓｉＲＮＡ複合体を適切な細胞培養培地に添加して、最終濃度１μＭのｓｉＲＮＡを得た。次いで、この培地をペプチド−ｓｉＲＮＡとともに細胞に添加し、４８時間インキュベートさせた。共焦点顕微鏡法を用いて細胞を画像化し、ＩｍａｇｅＪを用いて画像分析を実施して、各細胞の全体的蛍光強度を決定した。対照例（未処理）の集団で観察された平均強度よりも少なくとも３０％低い強度を有する試験例において、ノックダウンを細胞の割合として決定した。
ＳＰＡＣＥペプチド共役ｓｉＲＮＡは、ＧＦＰの顕著なノックダウンを誘発した（図１１のパネル（ａ））。対照的に、ｓｉＲＮＡ単独、ＳＰＡＣＥ単独、対照ｓｉＲＮＡと共役したＳＰＡＣＥ、またはｓｉＲＮＡと共役した対照ペプチドでは、顕著なノックダウンは観察されなかった。ＳＰＡＣＥペプチドとのｓｉＲＮＡ共役が、ｓｉＲＮＡの有効性に有害効果を与えるかどうかを決定するために、非共役ｓｉＲＮＡおよびＳＰＡＣＥ−ｓｉＲＮＡの両者をＬｉｐｏｆｅｃｔｍｉｎｅ（商標）と複合体化し、ノックダウンを評価した。両例において、対照、すなわちｓｉＲＮＡ処理をしていないものと比較して、ノックダウンは有意であった（図９のパネル（ｄ）〜（ｆ））。
実施例１３
インビボにおけるペプチド共役ＩＬ−１０ ｓｉＲＮＡを用いた真皮透過
ＩＬ−１０ ｓｉＲＮＡの真皮透過を促進するＳＰＡＣＥペプチドの能力を以下のように評価した。このｓｉＲＮＡは、深刻な皮膚科疾患であるアトピー性皮膚炎を治療するその可能性により選択された。対照ペプチドで認められた顕著なノックダウン、およびＳＰＡＣＥペプチドと比較した場合のインビボでの皮膚透過の欠如により、対照ペプチドは、インビボｓｉＲＮＡ研究においては評価しなかった。
このインビボ研究で使用したｓｉＲＮＡ配列は以下のとおりである：ＩＬ−１０：５’−ＧＡＡ ＵＧＡ ＡＵＵ ＵＧＡ ＣＡＵ ＣＵＵ ＣＵＵ Ｎ６−３’（配列番号２７）、およびルシフェラーゼ（対照）：５’−ＵＡＡ ＧＧＣ ＵＡＵ ＧＡＡ ＧＡＧ ＡＵＡ ＣＵＵ Ｎ６−３’（配列番号２８）。ＩＬ−１０の全ての塩基に２−Ｏ−メチル修飾を行った。全てのｓｉＲＮＡｓは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎから購入した。
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認を受けたプロトコルに従って、生後６〜８週間の雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において、ｓｉＲＮＡ送達を実施した。マウスを麻酔し（１〜２％イソフルレン）、その背中を軽く剃毛した。２００μＬの１０μＭペプチド−ｓｉＲＮＡ溶液または対応する対照をこのマウスの背中の３ｃｍ２範囲に局所的に適用した。次いでこの溶液を滅菌ガーゼおよび通気性のある包帯で覆った。２４時間後、ＣＯ２を用いてマウスを安楽死させ、４ｍｍ生検パンチを用いて皮膚試料を直ちに採取した。処置範囲から２つの４ｍｍ生検を任意に採取し、液体窒素中で直ちに凍結させた。次に、この皮膚を０．５％（ｗ／ｖ）３−（デシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホネート（ＤＰＳ）とＢｒｉｊ ３０との混合界面活性剤中に配置し、氷上で１分間均質化して（ＩＫＡ分散機）、皮膚試料からタンパク質を抽出した。このホモジネートを次いで１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みを回収した。総タンパク質濃度は、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて決定し、ＩＬ−１０レベルは、マウスＩＬ−１０ ＥＬＩＳＡ（Ｒａｙｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて決定した。
ペプチドを含まないＩＬ−１０ ｓｉＲＮＡの単独での適用は、未処置のマウス、ＳＰＡＣＥペプチドのみを与えたマウス、またはルシフェラーゼｓｉＲＮＡ（対照ｓｉＲＮＡ）に共役したＳＰＡＣＥを与えたマウスと比較して、ＩＬ−１０レベルに対して顕著な効果を生じなかった。対照的に、ＩＬ−１０ ｓｉＲＮＡと共役したＳＰＡＣＥおよび２−Ｏ−メチル修飾ＩＬ−１０ ｓｉＲＮＡと共役したＳＰＡＣＥで処置したマウスは、ＩＬ−１０レベルの顕著な減少を示した（図１１のパネル（ｂ））。
実施例１４
インビボにおけるペプチド共役ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡを用いた真皮透過
別の例として、ＳＰＡＣＥペプチドをグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｓｉＲＮＡと共役させ、皮膚ＧＡＰＤＨレベルに対するその効果を以下のように評価した。この標的は、ＧＡＰＤＨが一般的なハウスキーピングタンパク質であり、一般的なｓｉＲＮＡ標的の例を示すことから選択された。
このインビボ研究で使用したｓｉＲＮＡ配列は以下のとおりである：ＧＡＰＤＨ：５’−ＧＵＧ ＵＧＡ ＡＣＣ ＡＣＧ ＡＧＡ ＡＡＵ ＡＵＵ Ｎ６−３’（配列番号２９）、およびルシフェラーゼ（対照）：５’−ＵＡＡ ＧＧＣ ＵＡＵ ＧＡＡ ＧＡＧ ＡＵＡ ＣＵＵ Ｎ６−３’（配列番号２８）。全てのｓｉＲＮＡｓは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎから購入した。
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認を受けたプロトコルに従って、生後６〜８週間の雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において、ｓｉＲＮＡ送達を実施した。マウスを麻酔し（１〜２％イソフルレン）、その背中を軽く剃毛した。２００μＬの１０μＭペプチド−ｓｉＲＮＡ溶液または対応する対照をこのマウスの背中の３ｃｍ２範囲に局所的に適用した。次いでこの溶液を滅菌ガーゼおよび通気性のある包帯で覆った。７２時間後、ＣＯ２を用いてマウスを安楽死させ、４ｍｍ生検パンチを用いて皮膚試料を直ちに採取した。処置範囲から２つの４ｍｍ生検を任意に採取し、液体窒素中で直ちに凍結させた。次に、この皮膚を０．５％（ｗ／ｖ）３−（デシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホネート（ＤＰＳ）とＢｒｉｊ ３０との混合界面活性剤中に配置し、氷上で１分間均質化して（ＩＫＡ分散機）、皮膚試料からタンパク質を抽出した。このホモジネートを次いで１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みを回収した。総タンパク質濃度は、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて決定した。ＧＡＰＤＨレベルは、Ｋｄａｌｅｒｔ（商標） ＧＡＰＤＨ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて測定した。
ＳＰＡＣＥ−ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡコンジュゲートで処置したマウスは、対照（未処置、ｓｉＲＮＡ単独、ＳＰＡＣＥペプチド単独、および対照ｓｉＲＮＡと共役したＳＰＡＣＥ、図１１のパネル（ｃ））と比較して、タンパク質レベルの顕著な減少を誘発した。皮膚におけるＧＡＰＤＨのノックダウンは、用量依存的であり、１０μＭでは４３％ノックダウン、５μＭでは２１％ノックダウン、および１μＭでは１０％ノックダウンが観察された（図１１のパネル（ｄ））。また、ノックダウンは適用時間にも依存し、より長い適用時間はより高いノックダウンをもたらした（図１２）。

Claims (138)

  1. アミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、またはＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）を含むペプチドを含む組成物であって、前記ペプチドは、活性物質または前記活性物質を含む活性物質担体と共役し、前記組成物は、角質層（ＳＣ）の層と接触したときに前記層を透過することができる、または細胞と接触したときに前記細胞を透過することができる、組成物。
  2. 前記組成物が、前記ＳＣ層を透過することができ、かつ前記細胞を透過することできる、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記アミノ酸配列が、ＣＴＧＳＴＱＨＱＣ（配列番号７）、ＣＨＳＡＬＴＫＨＣ（配列番号８）、ＣＫＴＧＳＨＮＱＣ（配列番号９）、ＣＭＧＰＳＳＭＬＣ（配列番号１０）、ＣＴＤＰＮＱＬＱＣ（配列番号１１）、またはＣＳＴＨＦＩＤＴＣ（配列番号１２）を含む、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記アミノ酸配列が、ＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、またはＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）を含む、請求項１に記載の組成物。
  5. 前記ペプチドが、Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を含む環状ペプチドである、請求項４に記載の組成物。
  6. 前記組成物が、非ヒト動物生細胞の細胞膜を透過することができる、請求項１に記載の組成物。
  7. 前記組成物が、ヒト生細胞の細胞膜を透過することができる、請求項１に記載の組成物。
  8. 前記組成物が、表皮または真皮の生細胞の細胞膜を透過することができる、請求項１に記載の組成物。
  9. 前記組成物が、生免疫細胞の細胞膜を透過することができる、請求項１に記載の組成物。
  10. 前記活性物質が高分子を含む、請求項１に記載の組成物。
  11. 前記高分子がタンパク質を含む、請求項１０に記載の組成物。
  12. 前記タンパク質が、抗体または少なくとも１つのパラトープを含むその断片を含む、請求項１１に記載の組成物。
  13. 前記高分子が核酸を含む、請求項１０に記載の組成物。
  14. 前記核酸がＤＮＡである、請求項１３に記載の組成物。
  15. 前記核酸がＲＮＡである、請求項１３に記載の組成物。
  16. 前記ＲＮＡが干渉ＲＮＡである、請求項１５に記載の組成物。
  17. 前記干渉ＲＮＡがｓｈＲＮＡである、請求項１６に記載の組成物。
  18. 前記干渉ＲＮＡがｍｉＲＮＡである、請求項１６に記載の組成物。
  19. 前記干渉ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、請求項１６に記載の組成物。
  20. 前記ｓｉＲＮＡがＩＬ−１０ ｓｉＲＮＡである、請求項１９に記載の組成物。
  21. 前記ｓｉＲＮＡがＣＤ８６ ｓｉＲＮＡである、請求項１９に記載の組成物。
  22. 前記ｓｉＲＮＡがＫＲＴ６ａ ｓｉＲＮＡである、請求項１９に記載の組成物。
  23. 前記ｓｉＲＮＡがＴＮＦＲ１ ｓｉＲＮＡである、請求項１９に記載の組成物。
  24. 前記ｓｉＲＮＡがＴＡＣＥ ｓｉＲＮＡである、請求項１９に記載の組成物。
  25. 前記ｓｉＲＮＡが変異特異的ｓｉＲＮＡである、請求項１９に記載の組成物。
  26. 前記活性物質が薬学的化合物である、請求項１に記載の組成物。
  27. 前記活性物質が検出可能な物質を含む、請求項１に記載の組成物。
  28. 前記検出可能な物質が蛍光標識を含む、請求項２７に記載の組成物。
  29. 前記検出可能な物質が放射性標識を含む、請求項２７に記載の組成物。
  30. 前記活性物質がナノ粒子である、請求項１に記載の組成物。
  31. 前記活性物質が低分子量化合物である、請求項１に記載の組成物。
  32. 前記活性物質が、ＩＬ−１０生物活性の阻害剤である、請求項１に記載の組成物。
  33. 前記活性物質が、ＩＬ−１０ ｓｉＲＮＡおよびＩＬ−１０に結合する抗体またはその断片から選択される、請求項３２に記載の組成物。
  34. 前記ペプチドが前記活性物質と共役する、請求項１に記載の組成物。
  35. 前記ペプチドが、前記活性物質を含む活性物質担体と共役する、請求項１に記載の組成物。
  36. 前記活性物質担体がリポソームである、請求項３５に記載の組成物。
  37. 前記活性物質担体がナノ粒子である、請求項３５に記載の組成物。
  38. 前記活性物質担体が高分子ミセルである、請求項３５に記載の組成物。
  39. アミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、またはＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）を含むペプチドを含む組成物であって、前記ペプチドは、活性物質または前記活性物質を含む活性物質担体と会合し、前記会合は、疎水性相互作用、静電相互作用、またはファン・デル・ワールス相互作用によって生じ、前記組成物は、角質層（ＳＣ）の層と接触したときに前記層を透過することができる、または細胞と接触したときに前記細胞を透過することができる、組成物。
  40. 前記組成物が、前記ＳＣ層を透過することができ、かつ前記細胞を透過することできる、請求項３９に記載の組成物。
  41. 前記アミノ酸配列が、ＣＴＧＳＴＱＨＱＣ（配列番号７）、ＣＨＳＡＬＴＫＨＣ（配列番号８）、ＣＫＴＧＳＨＮＱＣ（配列番号９）、ＣＭＧＰＳＳＭＬＣ（配列番号１０）、ＣＴＤＰＮＱＬＱＣ（配列番号１１）、またはＣＳＴＨＦＩＤＴＣ（配列番号１２）を含む、請求項３９に記載の組成物。
  42. 前記アミノ酸配列が、ＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、またはＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）を含む、請求項３９に記載の組成物。
  43. 前記ペプチドが、Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を含む環状ペプチドである、請求項４２に記載の組成物。
  44. ＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、およびＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）の配列のうちの１つから選択されるアミノ酸配列を含む、単離ペプチド。
  45. 前記ペプチドが、ＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、およびＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）のうちの１つまたは複数の繰り返し単位を含む、請求項４４に記載の単離ペプチド。
  46. 前記単位が２〜５０回繰り返される、請求項４５に記載の単離ペプチド。
  47. 各単位が介在ペプチド配列によって分離される、請求項４５に記載の単離ペプチド。
  48. 前記ペプチドが、Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を含む環状ペプチドである、請求項４４に記載の単離ペプチド。
  49. ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、およびＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）のうちの１つまたは複数の繰り返し単位を含む、単離ポリペプチド。
  50. 前記単位が２〜５０回繰り返される、請求項４９に記載の単離ペプチド。
  51. 各単位が介在ペプチド配列によって分離される、請求項４９に記載の単離ペプチド。
  52. ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、およびＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）のうちの１つまたは複数の繰り返し単位から本質的になる、単離ポリペプチド。
  53. 活性物質を対象に送達する方法であって、アミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、またはＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）を含むペプチドを含む組成物を前記対象に投与することを含み、前記ペプチドは、活性物質または前記活性物質を含む活性物質担体と共役し、前記組成物は、前記対象の角質層（ＳＣ）を透過することができる、または前記対象の細胞を透過することができる、前記方法。
  54. 前記組成物が、前記対象の前記ＳＣを透過することができ、かつ前記対象の前記細胞を透過することができる、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記投与が局所投与である、請求項５３に記載の方法。
  56. 前記アミノ酸配列が、ＣＴＧＳＴＱＨＱＣ（配列番号７）、ＣＨＳＡＬＴＫＨＣ（配列番号８）、ＣＫＴＧＳＨＮＱＣ（配列番号９）、ＣＭＧＰＳＳＭＬＣ（配列番号１０）、ＣＴＤＰＮＱＬＱＣ（配列番号１１）、またはＣＳＴＨＦＩＤＴＣ（配列番号１２）を含む、請求項５３に記載の方法。
  57. 前記アミノ酸配列が、ＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、またはＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）を含む、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記ペプチドが、Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を含む環状ペプチドである、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記組成物が、非ヒト動物生細胞の細胞膜を透過することができる、請求項５３に記載の方法。
  60. 前記組成物が、ヒト生細胞の細胞膜を透過することができる、請求項５３に記載の方法。
  61. 前記組成物が、表皮または真皮の生細胞の細胞膜を透過することができる、請求項５３に記載の方法。
  62. 前記組成物が、生免疫細胞の細胞膜を透過することができる、請求項５３に記載の方法。
  63. 前記活性物質が高分子を含む、請求項５３に記載の方法。
  64. 前記高分子がタンパク質を含む、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記タンパク質が、抗体または少なくとも１つのパラトープを含むその断片を含む、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記高分子が核酸を含む、請求項６４に記載の方法。
  67. 前記核酸がＤＮＡである、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記核酸がＲＮＡである、請求項６６に記載の方法。
  69. 前記ＲＮＡが干渉ＲＮＡである、請求項６８に記載の方法。
  70. 前記干渉ＲＮＡがｓｈＲＮＡである、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記干渉ＲＮＡがｍｉＲＮＡである、請求項６９に記載の方法。
  72. 前記干渉ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、請求項６９に記載の方法。
  73. 前記ｓｉＲＮＡがＩＬ−１０ ｓｉＲＮＡである、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記ｓｉＲＮＡがＣＤ８６ ｓｉＲＮＡである、請求項７２に記載の方法。
  75. 前記ｓｉＲＮＡがＫＲＴ６ａ ｓｉＲＮＡである、請求項７２に記載の方法。
  76. 前記ｓｉＲＮＡがＴＮＦＲ１ ｓｉＲＮＡである、請求項７２に記載の方法。
  77. 前記ｓｉＲＮＡがＴＡＣＥ ｓｉＲＮＡである、請求項７２に記載の方法。
  78. 前記ｓｉＲＮＡが変異特異的ｓｉＲＮＡである、請求項７２に記載の方法。
  79. 前記活性物質が薬学的化合物である、請求項５３に記載の方法。
  80. 前記活性物質が検出可能な物質を含む、請求項５３に記載の方法。
  81. 前記検出可能な物質が蛍光標識を含む、請求項５３に記載の方法。
  82. 前記検出可能な物質が放射性標識を含む、請求項５３に記載の方法。
  83. 前記活性物質ナノ粒子である、請求項５３に記載の方法。
  84. 前記活性物質が低分子量化合物である、請求項５３に記載の方法。
  85. 前記活性物質が、ＩＬ−１０生物活性の阻害剤である、請求項１に記載の方法。
  86. 前記活性物質が、ＩＬ−１０ ｓｉＲＮＡおよびＩＬ−１０に結合する抗体またはその断片から選択される、請求項８５に記載の方法。
  87. 前記ペプチドが前記活性物質と共役する、請求項５３に記載の方法。
  88. 前記ペプチドが、前記活性物質を含む活性物質担体と共役する、請求項５３に記載の方法。
  89. 前記活性物質担体がリポソームである、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記活性物質担体がナノ粒子である、請求項８８に記載の方法。
  91. 前記活性物質担体が高分子ミセルである、請求項８８に記載の方法。
  92. 活性物質を対象に送達する方法であって、アミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、またはＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）を含むペプチドを含む組成物を前記対象に投与することを含み、前記ペプチドは、活性物質または前記活性物質を含む活性物質担体と会合し、前記会合は、疎水性相互作用、静電相互作用、またはファン・デル・ワールス相互作用によって生じ、前記組成物は、前記対象の角質層（ＳＣ）を透過することができる、または前記対象の細胞を透過することができる、前記方法。
  93. 前記組成物が、前記対象の前記ＳＣを透過することができ、かつ前記対象の前記細胞を透過することができる、請求項９２に記載の方法。
  94. 前記投与が局所投与である、請求項９２に記載の方法。
  95. 前記アミノ酸配列が、ＣＴＧＳＴＱＨＱＣ（配列番号７）、ＣＨＳＡＬＴＫＨＣ（配列番号８）、ＣＫＴＧＳＨＮＱＣ（配列番号９）、ＣＭＧＰＳＳＭＬＣ（配列番号１０）、ＣＴＤＰＮＱＬＱＣ（配列番号１１）、またはＣＳＴＨＦＩＤＴＣ（配列番号１２）を含む、請求項９２に記載の方法。
  96. 前記アミノ酸配列が、ＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、またはＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）を含む、請求項９５に記載の方法。
  97. 前記ペプチドが、Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を含む環状ペプチドである、請求項９６に記載の方法。
  98. 皮膚科疾患を有する対象を治療する方法であって、アミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、またはＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）を含むペプチドを含む組成物を前記対象に投与することを含み、前記ペプチドは、皮膚科用活性物質または前記活性物質を含む皮膚科用活性物質担体と共役し、前記組成物は、前記対象の角質層（ＳＣ）を透過することができる、または前記対象の細胞を透過することができる、前記方法。
  99. 前記組成物が、前記対象の前記ＳＣを透過することができ、かつ前記対象の前記細胞を透過することができる、請求項９８に記載の方法。
  100. 前記投与が局所投与である、請求項９８に記載の方法。
  101. 前記アミノ酸配列が、ＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、またはＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）を含む、請求項９８に記載の方法。
  102. 前記ペプチドが、Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を含む環状ペプチドである、請求項１０１に記載の方法。
  103. 皮膚科疾患を有する対象を治療する方法であって、アミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、またはＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）を含むペプチドを含む組成物を前記対象に投与することを含み、前記ペプチドは、皮膚科用活性物質または前記活性物質を含む皮膚科用活性物質担体と会合し、前記会合は、疎水性相互作用、静電相互作用、またはファン・デル・ワールス相互作用によって生じ、前記組成物は、前記対象の角質層（ＳＣ）を透過することができる、または前記対象の細胞を透過することができる、前記方法。
  104. 前記組成物が、前記対象の前記ＳＣを透過することができ、かつ前記対象の前記細胞を透過することができる、請求項１０３に記載の方法。
  105. 前記投与が局所投与である、請求項１０３に記載の方法。
  106. 前記アミノ酸配列が、ＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、またはＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）を含む、請求項１０３に記載の方法。
  107. 前記ペプチドが、Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を含む環状ペプチドである、請求項１０６に記載の方法。
  108. ｍＲＮＡの発現に少なくとも部分的に起因する障害を有する、有することが疑われる、または発症しやすい対象を治療する方法であって、アミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、またはＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）を含むペプチドを含む組成物を前記対象に投与することを含み、前記ペプチドは、前記ｍＲＮＡを標的とする干渉ＲＮＡまたは前記干渉ＲＮＡを含む担体と共役し、前記組成物は、前記対象の角質層（ＳＣ）または前記対象の細胞を透過することができ、前記ｍＲＮＡの前記発現がそれによって減弱される、前記方法。
  109. 前記組成物が、前記対象の前記ＳＣを透過することができ、かつ前記対象の前記細胞を透過することができる、請求項１０８に記載の方法。
  110. 前記投与が局所投与である、請求項１０８に記載の方法。
  111. 前記アミノ酸配列が、ＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、またはＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）を含む、請求項１０８に記載の方法。
  112. 前記ペプチドが、Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を含む環状ペプチドである、請求項１１１に記載の方法。
  113. ｍＲＮＡの発現に少なくとも部分的に起因する障害を有する、有することが疑われる、または発症しやすい対象を治療する方法であって、アミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、またはＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）を含むペプチドを含む組成物を前記対象に投与することを含み、前記ペプチドは、前記ｍＲＮＡを標的とする干渉ＲＮＡまたは前記干渉ＲＮＡを含む担体と会合し、前記会合は、疎水性相互作用、静電相互作用、またはファン・デル・ワールス相互作用によって生じ、前記組成物は、前記対象の角質層（ＳＣ）または前記対象の細胞を透過することができ、前記ｍＲＮＡの前記発現がそれによって減弱される、前記方法。
  114. 前記組成物が、前記対象の前記ＳＣを透過することができ、かつ前記対象の前記細胞を透過することができる、請求項１１３に記載の方法。
  115. 前記投与が局所投与である、請求項１１３に記載の方法。
  116. 前記アミノ酸配列が、ＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、またはＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）を含む、請求項１１３に記載の方法。
  117. 前記ペプチドが、Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を含む環状ペプチドである、請求項１１６に記載の方法。
  118. 必要性のある対象のｍＲＮＡ発現を減弱する方法であって、アミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、またはＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）を含むペプチドを含む組成物を前記対象に投与することを含み、前記ペプチドは、前記ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡまたは前記ｍＲＮＡを標的とする前記ｓｉＲＮＡを含む担体と共役し、前記組成物は、前記対象の角質層（ＳＣ）または前記対象の細胞を透過することができ、前記ｍＲＮＡの前記発現がそれによって減弱される、前記方法。
  119. 前記ｍＲＮＡがＩＬ−１０ ｍＲＮＡであり、前記ｓｉＲＮＡがＩＬ−１０ ｓｉＲＮＡである、請求項１１８に記載の方法。
  120. 前記ｍＲＮＡがＣＤ８６ ｍＲＮＡであり、前記ｓｉＲＮＡがＣＤ８６ ｓｉＲＮＡである、請求項１１８に記載の方法。
  121. 前記ｍＲＮＡがＫＲＴ６ａ ｍＲＮＡであり、前記ｓｉＲＮＡがＫＲＴ６ａ ｓｉＲＮＡである、請求項１１８に記載の方法。
  122. 前記ｍＲＮＡがＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡであり、前記ｓｉＲＮＡがＴＮＦＲ１ ｓｉＲＮＡである、請求項１１８に記載の方法。
  123. 前記ｍＲＮＡがＴＡＣＥ ｍＲＮＡであり、前記ｓｉＲＮＡがＴＡＣＥ ｓｉＲＮＡである、請求項１１８に記載の方法。
  124. 前記組成物が、前記対象の前記ＳＣおよび前記細胞を透過することができる、請求項１１８に記載の方法。
  125. 前記投与が局所投与である、請求項１１８に記載の方法。
  126. 前記アミノ酸配列が、ＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、またはＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）を含む、請求項１１８に記載の方法。
  127. 前記ペプチドが、Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を含む環状ペプチドである、請求項１２６に記載の方法。
  128. 必要性のある対象のｍＲＮＡ発現を減弱する方法であって、アミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、またはＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）を含むペプチドを含む組成物を前記対象に投与することを含み、前記ペプチドは、前記ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡまたは前記ｍＲＮＡを標的とする前記ｓｉＲＮＡを含む担体と会合し、前記会合は、疎水性相互作用、静電相互作用、またはファン・デル・ワールス相互作用によって生じ、前記組成物は、前記対象の角質層（ＳＣ）または前記対象の細胞を透過することができ、前記ｍＲＮＡの前記発現がそれによって減弱される、前記方法。
  129. 前記ｍＲＮＡがＩＬ−１０ ｍＲＮＡであり、前記ｓｉＲＮＡがＩＬ−１０ ｓｉＲＮＡである、請求項１２８に記載の方法。
  130. 前記ｍＲＮＡがＣＤ８６ ｍＲＮＡであり、前記ｓｉＲＮＡがＣＤ８６ ｓｉＲＮＡである、請求項１２８に記載の方法。
  131. 前記ｍＲＮＡがＫＲＴ６ａ ｍＲＮＡであり、前記ｓｉＲＮＡがＫＲＴ６ａ ｓｉＲＮＡである、請求項１２８に記載の方法。
  132. 前記ｍＲＮＡがＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡであり、前記ｓｉＲＮＡがＴＮＦＲ１ ｓｉＲＮＡである、請求項１２８に記載の方法。
  133. 前記ｍＲＮＡがＴＡＣＥ ｍＲＮＡであり、前記ｓｉＲＮＡがＴＡＣＥ ｓｉＲＮＡである、請求項１２８に記載の方法。
  134. 前記組成物が、前記対象の前記ＳＣを透過することができ、かつ前記対象の前記細胞を透過することができる、請求項１２８に記載の方法。
  135. 前記投与が局所投与である、請求項１２８に記載の方法。
  136. 前記アミノ酸配列が、ＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ（配列番号１３）、ＡＣＨＳＡＬＴＫＨＣＧ（配列番号１４）、ＡＣＫＴＧＳＨＮＱＣＧ（配列番号１５）、ＡＣＭＧＰＳＳＭＬＣＧ（配列番号１６）、ＡＣＴＤＰＮＱＬＱＣＧ（配列番号１７）、またはＡＣＳＴＨＦＩＤＴＣＧ（配列番号１８）を含む、請求項１２８に記載の方法。
  137. 前記ペプチドが、Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を含む環状ペプチドである、請求項１３６に記載の方法。
  138. アミノ酸配列ＴＧＳＴＱＨＱ（配列番号１）、ＨＳＡＬＴＫＨ（配列番号２）、ＫＴＧＳＨＮＱ（配列番号３）、ＭＧＰＳＳＭＬ（配列番号４）、ＴＤＰＮＱＬＱ（配列番号５）、またはＳＴＨＦＩＤＴ（配列番号６）から本質的になるペプチドを含む組成物であって、前記ペプチドは、活性物質または前記活性物質を含む活性物質担体と共役し、前記組成物は、角質層（ＳＣ）の層と接触したときに前記層を透過することができる、または細胞と接触したときに前記細胞を透過することができる、前記組成物。
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