WO2023237842A1 - Microbulles lipidiques pour la delivrance ciblee d'actifs - Google Patents

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WO2023237842A1
WO2023237842A1 PCT/FR2023/050819 FR2023050819W WO2023237842A1 WO 2023237842 A1 WO2023237842 A1 WO 2023237842A1 FR 2023050819 W FR2023050819 W FR 2023050819W WO 2023237842 A1 WO2023237842 A1 WO 2023237842A1
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microbubbles
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Anthony DELALANDE
Chantal Pichon
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Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Universite D'orleans
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    • A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation

Definitions

  • TITLE LIPID MICROBUBLES FOR TARGETED DELIVERY OF ACTIVE ACTIVE ACTIVES
  • the present invention falls within the field of targeted delivery of active ingredients, for therapy and/or marking, as well as in the field of microbubbles, in particular functionalized microbubbles.
  • the present invention relates in particular to optimized microbubbles, in particular lipid microbubbles, which can be used in the prevention and treatment of diseases or even marking.
  • the invention relates in particular to a lipid microbubble, comprising at least one cationic compound chosen from lipophosphoramidates, histidylated polyethylenimines, and any mixture thereof.
  • the microbubble preferably further comprising at least one agent chosen from a therapeutic agent, a targeting agent, a marking agent, and any combination thereof.
  • the invention further relates to a method for producing this microbubble.
  • the present invention also relates to a composition, in particular a pharmaceutical composition, and a kit, comprising at least one of these microbubbles.
  • the present invention further relates to the use of these microbubbles, composition, kit, as a medicine or as a marking agent.
  • microbubbles can also serve as a vector for therapeutic purposes. Indeed, thanks to the great diversity of molecules that can make up the envelope, it is possible to encapsulate drugs or complex nucleic acids.
  • the MBs used as vectors have a functionalizable lipid envelope, allowing either the therapeutic molecules to be embedded between the lipids, or to dissolve them in a drop of oil inside the envelope.
  • cationic lipids it is possible to complex nucleic acids through electrostatic interactions.
  • Other lipids can also be used to serve as attachments to nanoparticles or antibodies, using streptavidin-biotin interactions or be functionalized in order to carry out click chemistry.
  • microbubbles represent a promising system.
  • Fan et al., 2016, produced MBs composed of folate and complexing nucleic acids with the aim of targeted transfection in the brain.
  • cationic microbubbles are based on the use of DSTAP or DPTAP lipids, using a tri methyl ammonium function as a cationic charge for complexation.
  • the main disadvantage of these formulations is that they are not effective enough to be used in gene therapy protocols. Additionally, it turns out that these formulations are toxic.
  • microbubbles capable of efficiently and targetedly delivering therapeutic agents, such as nucleic acids, to specific organs and even cells.
  • the present invention makes it possible to meet this need, by describing microbubbles based on new cationic formulations whose advantages are as follows:
  • the microbubbles developed by the present inventors have the capacity to transport drugs, in particular nucleic acids, stably in the blood circulation; to actively cross the blood-brain barrier; to deliver drugs in a targeted manner, particularly towards antigens of interest.
  • the technology developed here makes it possible to transiently open the BBB and effectively deliver nucleic acid type active ingredients to through it. It also makes it possible to permeabilize the vessels, in order to deliver molecules of interest.
  • the inventors have developed innovative microbubbles, in particular innovative lipid microbubbles, capable of transporting drugs, in particular nucleic acids, stably in the blood circulation; to actively cross the blood-brain barrier (BBB); and to deliver drugs in a targeted manner, particularly towards antigens of interest.
  • innovative microbubbles in particular innovative lipid microbubbles, capable of transporting drugs, in particular nucleic acids, stably in the blood circulation; to actively cross the blood-brain barrier (BBB); and to deliver drugs in a targeted manner, particularly towards antigens of interest.
  • the inventors have notably shown that, surprisingly, the lipid microbubbles thus developed have significantly improved stability, unlike the microbubbles described in the prior art.
  • the data also reveal that these optimized microbubbles are capable of delivering agents of interest, notably nucleic acids, more efficiently than the microbubbles described in the prior art.
  • These microbubbles are notably capable of crossing the vessels, as well as the BBB, or even the tumor microenvironment, in an active manner.
  • the inventors have also demonstrated that the localized application of ultrasound makes it possible to target these optimized microbubbles very precisely towards the area to be treated, including very difficult to access areas such as the central nervous system, the vessels, and the tumor microenvironment.
  • the present invention therefore provides both powerful and broad-spectrum treatment methods for pathologies, as well as effective and reliable diagnostic methods.
  • the present invention relates in particular to lipid microbubbles, which can be used both in the prevention and treatment of pathologies, and in detection and imaging, particularly medical.
  • the present invention relates in particular to a lipid microbubble, comprising at least one cationic compound chosen from lipophosphoramidates, histidylated polyethylenimines, and any mixture thereof.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one microbubble as defined above, and, optionally, a pharmaceutically acceptable excipient, the concentration of microbubbles in the composition preferably ranging from 10 6 to 10 14 microbubbles/ml, more preferably 10 7 to 10 13 microbubbles/ml, more preferably 10 8 to 10 12 microbubbles/ml, more preferably 10 9 to 10 11 microbubbles/ml, more preferably the microbubble concentration in the composition being approximately 10 10 microbubbles/ml.
  • the present invention also relates to a kit, comprising: a) at least one microbubble as defined above, in a first container; b) at least one therapeutic agent, in a second container; c) optionally, at least one targeting agent in a third container; d) optionally, at least one marking agent in a fourth container; e) optionally, instructions for preparation and/or use; the therapeutic agent and/or the targeting agent and/or the marking agent being preferably chosen from:
  • a chemotherapeutic agent such as a cytotoxic agent and/or a cytostatic agent
  • a nanoparticle preferably comprising at least one agent chosen from a therapeutic agent, a targeting agent, a marking agent, and any combination thereof;
  • the present invention relates to a microbubble, a pharmaceutical composition, or a kit, as defined above, for its use as a medication or as a marking agent.
  • the present invention relates to a method for producing at least one microbubble as defined above, comprising the following steps: a) Mixture, in a container, of cationic compounds chosen from lipophosphoramidates, histidylated polyethylenimines, and any mixtures thereof; ethanol; and optionally at least one agent chosen from a therapeutic agent, a targeting agent, a marking agent, and any combination thereof; b) Evaporation of the mixture obtained in step a) to obtain a lipid film and rehydration of the lipid film to form a liposomal suspension; the entirety of this step can also be carried out by microfluidics; c) Lyophilization of the liposomal suspension obtained in step b); d) Replacement of the air contained in the container containing the lyophilisate obtained in step c), with a biocompatible gas, the gas being preferably chosen from a perfluorobutane (C4F10), a perfluoropropane (C3
  • microbubble designates a bubble whose diameter ranges from approximately one micrometer to several tens of micrometers (up to approximately one hundred micrometers), generally from approximately one micrometer to around ten micrometers.
  • a microbubble includes a shell surrounding a filler material.
  • the envelope may consist of lipids, proteins, sugars, ionic compounds, or mixtures thereof. In the case of an envelope made up of lipids or essentially made up of lipids, we speak of a lipid microbubble.
  • Cationic compounds such as lipophosphoramidates, histidylated polyethylenimines, and any mixtures thereof; and or lipids, in particular chosen from the group consisting of a dimyristoyl-glycero-phosphocholine, a distearoyl-glycero-phosphocholine, a dimyristoyl-glycero-phosphoethanolamine-polyethylene glycol, a distearoyl-glycero-phosphoethanolamine-polyethylene glycol 2000, a distearoyl-glycero- phosphoethanolamine-[biotinyl(polyethylene glycol)], cholesterol, beta-sitosterol, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), 1-oleoyl-2-[6-[(7- nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl]-3-trimethylammonium propane (DOTAP),
  • the microbubble filling material may in particular be a gas of any type.
  • the filling gas is advantageously biocompatible (i.e. it is well tolerated by a living organism).
  • the filling gas can in particular be chosen from a perfluorobutane (C4F10), a perfluoropropane (C3F8), dinitrogen (N2), a sulfur hexafluoride (SF6), a nitrogen oxide (NO), hydrogen, dioxygen , helium, xenon, argon, nitrous oxide (N20), and any mixture thereof.
  • lipid microbubble we mean a microbubble whose envelope is essentially made up of lipids, or is made up of lipids.
  • envelope essentially consisting of lipids here mean an envelope comprising 55% lipids or more, preferably 60% lipids or more, preferably 70% lipids or more, preferably 80% lipids or more, preferably 90% lipid or more, preferably 91% lipid or more, preferably 92% lipid or more, preferably 93% lipid or more, preferably 94% lipid or more, preferably 95% lipid or more more, preferably 96% lipids or more, preferably 97% lipids or more, preferably 98% lipids or more, more preferably 99% lipids or more, the percentage being expressed as mass of lipids relative to the total mass of the envelope.
  • the lipid microbubble comprises at least one cationic compound, in particular a cationic lipid or a lipid coupled to at least one cationic polymer.
  • the envelope of the lipid microbubble may comprise a cationic lipid or a lipid coupled to at least one cationic polymer, or consist essentially of cationic lipids or lipids coupled to at least one cationic polymer, or consist of cationic lipids and/or into lipids coupled to at least one cationic polymer.
  • the envelope comprises cationic lipids and/or lipids coupled to at least one cationic polymer, and fusogenic lipids.
  • the lipid envelope of the microbubble comprises from 2 to 50% of cationic lipids, preferably at least 2% of cationic lipids, preferably at least 10% of cationic lipids, preferably at least 20% of cationic lipids, preferably at least 30% cationic lipids, preferably at least 40% cationic lipids, preferably 50% cationic lipids, the percentage being expressed in moles of cationic lipids relative to the number of moles of total lipids constituting the envelope.
  • cationic compound is meant a compound comprising at least one cation and whose overall charge in solution is positive.
  • cationic lipid we therefore mean a lipid comprising at least one cation and whose overall charge in solution is positive.
  • lipophosphoramidate we mean a bioinspired amphiphilic phospholipid which carries a cationic charge on its polar head.
  • Lipophosphoramidates include in particular dimyristoyl phosphoramidates (such as dimyristoyl bromide phosphoramidates, and dimyristoyl histamine phosphoramidates), dioleyl phosphoramidates (such as dioleyl methylimidazolium phosphoramidates), dipalmitoyl phosphoramidates, and disteraoyl phosphoramidates.
  • dimyristoyl phosphoramidates such as dimyristoyl bromide phosphoramidates, and dimyristoyl histamine phosphoramidates
  • dioleyl phosphoramidates such as dioleyl methylimidazolium phosphoramidates
  • dipalmitoyl phosphoramidates dipalmitoyl phosphoramidates
  • disteraoyl phosphoramidates include in particular dimyristoyl phosphoramidates (such as dimyristoyl bromide
  • polyethylenimine or “polyethyleneimine”, or “PEI”, or “polyaziridine” is meant an organic polymer of chemical formula H[CH2-CH2-NH-] n H.
  • histidylated polyethylenimine is meant a polyethylenimine comprising at least one histidyl group.
  • the histidylated polyethylenimine used to form the microbubble is coupled to a fatty acid.
  • fatty acids which can be coupled to a histidylated polyethylenimine include in particular stearic acid, myristic acid, palmitic acid, oleic acid, and any combination thereof.
  • compound/agent exposed to the surface of the microbubble is meant a compound or an agent conjugated/coupled/bound to the external surface of the microbubble (for example conjugated/coupled/bound to the envelope of the microbubble) and in contact with the environment outside the microbubble.
  • compound/agent embedded in the lipid envelope of the microbubble we mean a compound or an agent partially or totally integrated/incorporated into the layer of compounds (in particular lipids) forming the envelope of the microbubble.
  • a compound or an agent fully integrated/incorporated into the envelope is only in contact with the compounds (in particular lipids) forming the envelope of the microbubble: in this case, the compound or the agent does not is therefore in contact neither with the external environment nor with the internal environment, with the microbubble.
  • a compound or an agent partially integrated/incorporated into the envelope can, however, be either with the environment outside the microbubble, or with the interior environment of the microbubble, or both with the exterior environment and with the interior environment of the microbubble. microbubble (“crossing” compound).
  • compound/agent incorporated inside the microbubble we mean a compound or an agent located in the interior environment of the microbubble (that is to say in the environment/cavity formed by the 'envelope of the microbubble). This compound or agent may be in contact with the internal surface of the microbubble (for example with the internal surface of the microbubble envelope). It can in particular be conjugated/coupled/linked to the internal surface of the microbubble (for example to the internal surface of the envelope of the microbubble).
  • therapeutic agent or “therapeutic compound”, we mean any agent or any compound or any molecule presented as having curative or preventive properties with regard to human or animal pathologies or diseases.
  • a therapeutic agent or therapeutic compound therefore includes any agent or compound that can be used in or administered to humans or animals for the purpose of establishing a medical diagnosis or restoring, correcting or modifying their physiological functions in exerting a pharmacological, immunological and/or metabolic action.
  • the therapeutic agent can therefore be a pharmacological agent.
  • the therapeutic agent or compound can be of any nature or type and does not depend on its origin.
  • the therapeutic agent may be chemically synthesized, naturally occurring, produced recombinantly (and optionally purified), or designed and produced synthetically. It may in particular be a small molecule, a nucleic acid, a peptide (including a post-translationally modified peptide), a polypeptide (including a post-translationally modified polypeptide ), a protein (including a post-translationally modified protein), a chemical compound, an anticancer chemotherapy agent (such as a cytostatic or cytological agent), an antibody, a toxin, an antigen, a hormone, an enzyme, a ligand, a receptor, an antiviral compound, an antibiotic compound, an antifungal compound, a compound antibacterial, a nanoparticle, or any fragment thereof (preferably a functionally active fragment), or any derivative thereof (preferably a functionally active derivative), such as a peptidomimetic, a mimetic
  • the therapeutic agent or compound may for example comprise, or consist essentially of, or consist of, a nucleic acid, a lipid-soluble active ingredient, a chemotherapeutic agent (such as a cytotoxic agent and/or a cytostatic agent), a antibody, an antibody derivative, a functional fragment of an antibody or its derivative, a protein (including a post-translationally modified protein), a protein fragment (such as a peptide, an antigen, an epitope , a functional protein domain, and any combination thereof; including a post-translationally modified protein fragment), a nanoparticle, etc.
  • a chemotherapeutic agent such as a cytotoxic agent and/or a cytostatic agent
  • a antibody an antibody derivative, a functional fragment of an antibody or its derivative
  • a protein including a post-translationally modified protein
  • a protein fragment such as a peptide, an antigen, an epitope , a functional protein domain, and any combination thereof; including a post-translation
  • targeting agent or “targeting compound”
  • binding agent we mean any agent or any compound or any molecule presented as being capable of recognizing and/or binding to another molecule (called “target molecule”), preferably in a specific way. These terms therefore also include “binding agents” or “binding compounds”.
  • binding agents or “binding compounds” designate any agent or any compound or any molecule capable of binding to another molecule (called “target molecule”), said bond preferably being a specific bond.
  • the targeting/binding agent recognizes a site, domain, region, pocket, epitope, spatial pattern, conformation, chemical moiety, or any combination thereof. here, defined of the target molecule.
  • the targeting/binding agent can be of any nature or type and does not depend on its origin.
  • the targeting/binding agent may be chemically synthesized, naturally occurring, recombinantly produced (and optionally purified), or synthetically designed and produced.
  • It may in particular be a small molecule, a nucleic acid, a peptide (including a post-translationally modified peptide), a polypeptide (including a post-translationally modified polypeptide ), a protein (including a post-translationally modified protein), a chemical compound, an antibody, a toxin, an antigen, an epitope, a hormone, of an enzyme, a ligand, a receptor, a nanoparticle, or any fragment thereof (preferably a functionally active fragment), or any derivative thereof (preferably a derivative functionally active), such as a peptidomimetic, a mimetic antibody, a chemical derivative, among others, etc.
  • the targeting/binding agent may for example comprise, or consist essentially of, or consist of, a nucleic acid, a lipid-soluble active ingredient, a chemotherapeutic agent (such as a cytotoxic agent and/or a cytostatic agent), a antibody, an antibody derivative, a functional fragment of an antibody or its derivative, a protein (including a post-translationally modified protein), a protein fragment (such as a peptide, an antigen, an epitope , a functional protein domain, and any combination thereof; including a post-translationally modified protein fragment), a nanoparticle, etc.
  • a chemotherapeutic agent such as a cytotoxic agent and/or a cytostatic agent
  • a chemotherapeutic agent such as a cytotoxic agent and/or a cytostatic agent
  • a chemotherapeutic agent such as a cytotoxic agent and/or a cytostatic agent
  • a chemotherapeutic agent such as a cytotoxic agent and/or
  • the target molecule can be of any nature or type and does not depend on its origin.
  • the target molecule may in particular be a pathogen (such as a virus, a bacteria, a parasite, etc.) or a fragment thereof (for example a nucleic acid, a protein, a polypeptide, a peptide, an epitope , a lipid, a sugar, etc.).
  • marking agent or “marker” is meant any agent or any compound or any molecule presented as being capable of marking another molecule (preferably in a specific manner) and of being detected by any means.
  • the means of detecting the marking agent are well known to those skilled in the art, who is fully capable of selecting the appropriate technique depending on the marking agent used.
  • the means of detecting the marking agent include in particular the following techniques, but are not limited to: optical detection techniques (such as techniques using fluorescence, absorbance, diffraction, light scattering, interferometry, reflectometry, ellipsometry, surface plasmon resonance (SPR), spectroscopy, magnetic particles, etc.), mechanical detection techniques (such as techniques using microbalances, micro beams, etc.). ), electrical detection techniques (such as techniques using electrodes, electrical sensors, etc.).
  • the marking agent can therefore be a contrast agent.
  • the marking agent can be of any nature or type and does not depend on its origin.
  • the targeting/binding agent may be chemically synthesized, naturally occurring, recombinantly produced (and optionally purified), or synthetically designed and produced. It may in particular be a small molecule, a nucleic acid, a peptide (including a peptide modified in a post-translational manner), a polypeptide (including a polypeptide modified by post-translationally), a protein (including a post-translationally modified protein), a chemical compound, an antibody, a toxin, an antigen, an epitope, 'a hormone, an enzyme, a ligand, a receptor, a nanoparticle, or any fragment thereof (preferably a functionally active fragment), or any derivative thereof ( preferably a functionally active derivative), such as a peptidomimetic, an antibody mimetic, a chemical derivative, among others, etc.
  • the marking agent may for example comprise, or consist essentially of, or consist of, a nucleic acid, a lipid-soluble active ingredient, a chemotherapeutic agent (such as a cytotoxic agent and/or a cytostatic agent), an antibody, an antibody derivative, a functional fragment of an antibody or its derivative, a protein (including a post-translationally modified protein), a protein fragment (such as a peptide, an antigen, an epitope, a protein functional domain, and any combination thereof; including a post-translationally modified protein fragment), a nanoparticle, etc.
  • a chemotherapeutic agent such as a cytotoxic agent and/or a cytostatic agent
  • an antibody an antibody derivative, a functional fragment of an antibody or its derivative
  • a protein including a post-translationally modified protein
  • a protein fragment such as a peptide, an antigen, an epitope, a protein functional domain, and any combination thereof; including a post-translationally modified protein fragment
  • the labeling agent may for example comprise, or consist essentially of, or consist of a fluorophore (for example fluorescein or luciferase), a fluorescent protein/polypeptide/peptide (for example GFP and its variants, such as RFP, CFP, YFP, etc.), a radioisotope (in particular suitable for scintigraphy, for example 99m Tc), a label recognizable by an antibody (for example protein c- Myc or a polyhistidine tag), an affinity tag (e.g. biotin, streptavidin, etc.), an enzyme (e.g. horseradish peroxidase), a contrast agent, a peptide tag (“peptide tag” in English), etc.
  • a fluorophore for example fluorescein or luciferase
  • a fluorescent protein/polypeptide/peptide for example GFP and its variants, such as RFP, CFP, YFP, etc.
  • a radioisotope in
  • derivative generally refers to a component or species (protein, antibody, protein fragment, polypeptide, polynucleotide, oligonucleotide, nucleoside, nucleotide, vector, virus, etc.) exhibiting one or more modifications compared to a reference component (e.g. the wild-type component as found in nature as originally identified, i.e. the "original” corresponding component called the original component) .
  • a derivative may in particular be a fragment, a part, a variant, a mutant, a synthetic version (for example manufactured, in particular in vitro), a mimetic, or a combination of these, of the component or of the species of origin.
  • variant can be used interchangeably to generally refer to a component or species (protein, antibody, protein fragment, polypeptide, polynucleotide, oligonucleotide, nucleoside, nucleotide, vector, virus, etc. ) exhibiting one or more modifications relative to a reference component (e.g., the wild-type component as found in nature as originally identified, i.e. the corresponding "original” component called the original component).
  • a nucleotide or nucleoside variant may have a modified base and/or a modified sugar and/or a modified bond.
  • any modification may be contemplated, including substitution, insertion, deletion, and any combination thereof, of one or more nucleotide residues. /amino acids.
  • the variant may be of natural or artificial origin (e.g., mutated and/or manufactured). When several mutations are considered, they may concern consecutive residues and/or non-consecutive residues.
  • variants e.g., respectively, protein variants, peptide variants, antibody variants, virus variants, etc.
  • the reference component e.g., respectively, the corresponding "original” protein, the corresponding "original” protein fragment, the corresponding "original” polynucleotide.
  • “at least 80% identity” means 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99%.
  • an identity of at least 80% also encompasses an identity of 100%.
  • “functional fragment”, or “functionally active fragment”, we mean any fragment of a molecule, of an agent, of a species, of a compound, presenting at least one of the original functions of the molecule, of the agent, of the species, of the compound, from which said fragment comes.
  • the functional fragment performs said function with an efficiency equal to at least 30% of that of said peptide or said protein, preferably at least 40%, preferably at least 45%, preferably at least 50%, preferably at least 55%, preferably at least 60%, preferably at least 65%, preferably at least 70%, preferably at least 75%, preferably at least 80%, preferably at least 85%, preferably at least least 90%, preferably at least 91%, preferably at least 92%, preferably at least 93%, preferably at least 94%, preferably at least 95%, preferably at least 96%, preferably at least 97%, preferably at least 98%, preferably at least 99%, preferably at least 100% of the effectiveness of said molecule, of said agent, of said species, of said compound, from which said fragment is derived.
  • identity or “sequence identity” is meant an exact sequence match between two polypeptides or amino acids, or between two nucleic acid molecules or oligonucleotides.
  • identity percentages to which reference is made in the context of the presentation of the present invention are determined after optimal overall alignment of the sequences to be compared, which may therefore include one or more additions, deletions, truncations and/or substitutions. This identity percentage can be calculated by any sequence analysis method well known to those skilled in the art. The percentage of identity is determined after global alignment of the sequences to be compared taken in their entirety, over their entire length. In addition to manually, it is possible to determine the overall sequence alignment using the Needleman and Wunsch (1970) algorithm.
  • the comparison of the sequences can be carried out using any software well known to those skilled in the art, such as for example the Needle software.
  • the parameters used may in particular be the following: “Gap Open” equal to 10.0, “Gap Extend” equal to 0.5 and the EDNAFULL matrix (EMBOSS version of NCBI NUC4.4).
  • the comparison of the sequences can be carried out using any software well known to those skilled in the art, such as for example the Needle software.
  • the settings used may in particular be the following: “Gap Open” equal to 10.0, “Gap Extend” equal to 0.5 and the BLOSUM62 matrix.
  • sequence identity represents in particular 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% , 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity.
  • nucleotide refers to a polymeric or oligomeric macromolecule consisting of nucleotide monomers (preferably at least 5 nucleotide monomers, also called nucleotide residues). Nucleotide monomers are composed of a nucleobase, a five-carbon sugar (such as, but not limited to, ribose or 2'-deoxyribose), and one to three phosphate groups. Typically, a polynucleotide is formed by phosphodiester bonds between individual nucleotide monomers.
  • Nucleic acid molecules include, but are not limited to, ribonucleic acid (RNA), deoxyribonucleic acid (DNA), and mixtures thereof, such as RNA-DNA hybrids (mixed polyribo-polydeoxyribonucleotides). These terms encompass single or double stranded, linear or circular, natural or synthetic, unmodified or modified versions thereof (e.g., genetically modified polynucleotides; optimized polynucleotides), sense or antisense polynucleotides, chimeric mixture (e.g., hybrids RNA-DNA). Additionally, a polynucleotide may include nucleotides of non-natural origin and may be interrupted by non-nucleotide components.
  • DNA nucleic acids include, without limitation, complementary DNA (cDNA), genomic DNA, plasmid DNA, vector DNA, viral DNA (e.g., viral genomes, viral vectors), oligonucleotides, probes, primers, satellite DNA, microsatellite DNA, coding DNA, non-coding DNA, antisense DNA, and any mixture thereof.
  • cDNA complementary DNA
  • genomic DNA genomic DNA
  • plasmid DNA vector DNA
  • viral DNA e.g., viral genomes, viral vectors
  • oligonucleotides e.g., probes, primers
  • satellite DNA e.g., microsatellite DNA
  • coding DNA e.g., non-coding DNA, antisense DNA, and any mixture thereof.
  • RNA nucleic acids include, but are not limited to, messenger RNA (mRNA), precursor messenger RNA (pre-mRNA), small interfering RNA (siRNA), short hairpin RNA (cRNA), microRNA (miRNA), vector RNA, viral RNA, guide RNA (gRNA), antisense RNA, coding RNA, non-coding RNA, antisense RNA, satellite RNA, cytoplasmic small RNA, nuclear small RNA, etc.
  • mRNA messenger RNA
  • pre-mRNA precursor messenger RNA
  • siRNA small interfering RNA
  • cRNA short hairpin RNA
  • miRNA microRNA
  • vector RNA viral RNA
  • guide RNA guide RNA
  • antisense RNA antisense RNA
  • coding RNA non-coding RNA
  • antisense RNA satellite RNA
  • cytoplasmic small RNA nuclear small RNA, etc.
  • the polynucleotides described herein may be synthesized by standard methods known in the art, for example using an
  • Nucleic acids can for example be synthesized chemically, for example using the phosphotriester method (see, for example, Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543-584).
  • the nucleic acid may comprise at least one modified nucleotide (i.e. a nucleotide which is not a nucleotide of a natural DNA or RNA).
  • modified nucleotides can in particular be used to increase the resistance of the nucleic acid to degradation by nucleases. This is particularly advantageous for RNAs, which are generally more sensitive to nucleases than DNA aptamers.
  • An RNA comprising at least one modified nucleotide is called modified RNA.
  • DNA comprising at least one modified nucleotide is called modified DNA.
  • the nucleic acid may also comprise at least one additional group, in addition to the nucleotides constituting its nucleic acid sequence.
  • the nucleic acid can be linked to at least one additional group.
  • modified DNA we mean DNA comprising at least one modified nucleotide.
  • a modified DNA may in particular be a DNA in which the backbone of the nucleic acid is modified, in whole or in part, in particular to make it resistant to hydrolytic degradation, in particular due to the action of nucleases.
  • DNA can be modified in its entirety (i.e. each nucleotide which constitutes it is modified) or in part (i.e. only part of the nucleotides which constitute it is modified).
  • the DNA is partially modified, we can choose to modify all or part of the purines and/or all or part of the pyrimidines.
  • modified RNA an RNA comprising at least one modified nucleotide.
  • a modified RNA may in particular be an RNA in which the backbone of the nucleic acid is modified, in whole or in part, in particular to make it resistant to hydrolytic degradation, in particular due to the action of nucleases.
  • RNA can be modified in full (i.e. each nucleotide which constitutes it is modified) or in part (i.e. only part of the nucleotides which constitute it is modified). When the RNA is partially modified, we can choose to modify all or part of the purines and/or all or part of the pyrimidines.
  • modifications of a DNA or an RNA are well known to those skilled in the art and can in particular be chosen from: the modification of the OH function on the carbon in the 2' position of the ribose by methylation; the substitution of the OH function on the carbon in the 2' position of the ribose by an O-Methoxyethyl group; the substitution of the OH function on the carbon in the 2' position of the ribose by an amino group; the substitution of the OH function on the carbon in the 2' position of the ribose by a halogen (in particular by fluorine); the replacement of the phosphodiester (PO) by a phosphorothioate (PS) group (we then speak of a phosphorothioate skeleton); the use of a locked nucleic acid (LNA) type structure, i.e.
  • LNA locked nucleic acid
  • PNA peptide nucleic acid
  • vector we mean a vehicle, preferably a nucleic acid molecule or a viral particle, which contains the elements necessary to allow the administration, propagation and/or expression of one or more molecule(s). ) of nucleic acids in a host cell or organism.
  • this term encompasses vectors for maintenance (cloning vectors), vectors for expression in various host cells or organisms (vectors expression), extrachromosomal vectors (e.g. multicopy plasmids) or integration vectors (e.g. designed to integrate into the genome of a host cell and produce additional copies of the nucleic acid molecule that 'it contains when the host cell replicates).
  • This term also encompasses shuttle vectors (e.g., functioning in both prokaryotic and/or eukaryotic hosts) and transfer vectors (e.g. for the transfer of nucleic acid molecule(s) into the genome of a host cell).
  • vectors can be natural, synthetic or artificial genetic sources, or a combination of natural and artificial genetic elements.
  • vector in the context of the invention, must be understood broadly by including plasmid (or plasmid) and viral vectors.
  • Plasmid as used herein means a replicable DNA construct.
  • plasmid vectors contain selection marker genes that allow host cells carrying the plasmid to be identified and/or positively or negatively selected in the presence of the compound corresponding to the selection marker.
  • selection marker genes A variety of positive or negative selection marker genes are known in the art.
  • an antibiotic resistance gene can be used as a positive selection marker gene to select a host cell in the presence of the corresponding antibiotic.
  • viral vector refers to a nucleic acid vector that comprises at least one element of a virus genome and may be packaged into a virus particle or virus particle.
  • Viral vectors may be replication competent or selective (e.g., designed to replicate better or selectively in specific host cells), or may be genetically silenced so as to be replication defective or deficient.
  • polypeptide polymers of amino acid residues which comprise at least nine amino acids linked by peptide bonds.
  • the polymer can be linear, branched or cyclic.
  • the polymer may include natural amino acids and/or amino acid analogues and may be interrupted by non-amino acid residues.
  • the amino acid polymer contains more than 50 amino acid residues, it is preferably called a polypeptide or protein, whereas if the polymer consists of 50 amino acids or less, it is preferably called a "peptide".
  • the reading and writing directions of an amino acid sequence of a polypeptide, a protein and a peptide as used herein are the conventional reading and writing directions.
  • the reading and writing convention for polypeptide, protein, and peptide amino acid sequences places the amine terminus on the left, with the sequence then written and read from the amine terminus (N- terminus) to the carboxyl terminus (C-terminus), from left to right.
  • amino acids constituting polypeptides, proteins and peptides include in particular the so-called “standard” amino acids (also called “natural amino acids”, of which Table 1 below provides a non-exhaustive list), as well as non-standard amino acids. (also called “rare amino acids”, including for example pyrrolysine (symbolized by the letter 0), selenocysteine (symbolized by the letter U), alloisoleucine, allothreonine, ornithine, etc.)
  • peptide or protein fragment or “part of peptide or protein” is meant a portion of a peptide or protein, that is to say a portion of the sequence of consecutive amino acids composing said peptide or said protein (called the peptide or protein from which the fragment is derived).
  • the peptide or protein fragment preferably comprises at least 10 consecutive amino acids of the peptide or protein from which it is derived; more preferably at least 12 consecutive amino acids, more preferably at least 15 consecutive amino acids, more preferably at least 20 consecutive amino acids, more preferably at least 30 consecutive amino acids of the peptide or protein from which it is derived.
  • the peptide or protein fragment preferably has a three-dimensional structure, under non-denaturing conditions (for example conditions usually non-denaturing for proteins, in particular in the absence of denaturing and/or chaotropic agents).
  • post-translational modification refers to a chemical or enzymatic modification occurring naturally or not on a protein or protein fragment, after or concomitantly with the translation of the protein (e.g., biological or biochemical synthesis, using for example cellular machinery), or after or concomitantly with the synthesis of the protein (for example, artificial and/or chemical synthesis).
  • the natural amino acids of the protein or protein fragment is modified by the addition of at least one chemical group and/or modification (including, but not limited to, elimination) of at least one chemical group of the natural amino acid.
  • post-translationally modified protein is meant here a protein having at least one post-translational modification.
  • post-translationally modified protein fragment is meant a protein fragment having at least one post-translational modification.
  • lipid-soluble active ingredient any agent or any compound or any molecule which dissolves in a fatty substance, and having a biological activity, in particular a therapeutic, pharmacological, targeting, or marking activity, as defined above in gaze with therapeutic, targeting, or marking agents.
  • Fat-soluble active ingredients include in particular active ingredients which dissolve in lipids or their derivatives, for example in oils, butters, oily esters, and other ingredients comprising lipids or their derivatives.
  • chemo-therapeutic agent any agent or any compound or any molecule having chemo-therapeutic activity.
  • the chemotherapeutic agent includes in particular agents having anticancer activity (in particular agents capable of eliminating cancer cells and/or tumors, and/or of inducing/stimulating the elimination of cancer cells and/or tumors) as well as than agents with anti-autoimmune disease activity.
  • the chemotherapeutic agent can therefore be a cytotoxic agent and/or a cytostatic agent.
  • examples of chemotherapeutic agents include, but are not limited to, paclitaxel, doxorubicin, gencitabin (e.g. Gemzar), temozolomide, etc.
  • antibody is meant a protein or glycoprotein belonging to the immunoglobulin superfamily; the terms antibody and immunoglobulin are used interchangeably.
  • antibodies are mostly secreted by cells derived from B lymphocytes: plasma cells. They are used in particular by the immune system to detect and neutralize foreign bodies (in particular pathogens, such as bacteria, viruses, parasites, etc.), specifically.
  • Antibodies also include autoantibodies (produced for example in the case of an autoimmune disease). The antibody recognizes a unique part of the foreign target, its antigen.
  • the antibodies have a structure made up of 4 polypeptide chains (150,000 amu or dalton): two identical heavy chains (H for “heavy”, of 50,000 amu each) and two identical light chains (L for “light”, of 25,000 a each) which are linked together by a variable number of disulfide bridges ensuring the cohesion of the molecule. These chains form a Y structure (each light chain constitutes half of one arm of the Y) and are made up of immunoglobulin domains which can comprise approximately 110 amino acids.
  • Each light chain consists of a constant domain (named CL) and a variable domain (called VL); heavy chains are composed of a variable domain (called VH) and, depending on the isotype, of three or four constant domains respectively called CH1, CH2, CH3, (CH4).
  • VH variable domain
  • CH1, CH2, CH3, (CH4) constant domains respectively called CH1, CH2, CH3, (CH4).
  • CH1, CH2, CH3, (CH4) constant domains
  • Constant domains are characterized by an amino acid sequence that is very similar from one antibody to another, characteristic of the species and isotype.
  • the constant domains are generally not involved in antigen recognition, but are involved in the activation of the complement system, as well as in the elimination of immune complexes (antibodies linked to its antigen) by immune cells possessing the receptors. to constant fragments (RFc).
  • An antibody has four variable domains located at the ends of the two “arms”.
  • the association between a variable domain carried by a heavy chain (VH) and the adjacent variable domain carried by a light chain (VL) constitutes the recognition site (or paratope) of the antigen.
  • VH heavy chain
  • VL light chain
  • an immunoglobulin molecule has two antigen-binding sites, one at the end of each arm. These two sites are identical (but intended for different epitopes), hence the possibility of linking two antigen molecules by antibody.
  • the antigen recognition site (or paratope) includes 6 regions called complementarity-determining regions (or CDRs). Each VH has 3 CDRs and each VL also has 3.
  • the Fc fragment (crystallizable fragment). It supports the biological properties of immunoglobulin, in particular its ability to be recognized by immune effectors or to activate complement. It is made up of constant fragments of heavy chains (CH2) beyond the hinge region. It generally does not recognize the antigen; the Fv fragment (Variable Fragment). It is the smallest fragment retaining the properties of the antibody that the immunoglobulin possesses. It consists only of the variable regions VL and VH, it therefore binds the antigen with the same affinity as the complete antibody and is monovalent; the Fab fragment (Fragment antigen-binding). This fragment has the same affinity for the antigen as the full antibody.
  • the Fc fragment crystallizable fragment
  • the Fab fragment is made up of the entire light chain (VL+CL) and part of the heavy chain (VH+CH1). It is monovalent; the fragment F(ab')2. It corresponds to the association of two Fab fragments connected by a small part of the constant parts of the heavy chains, the hinge region (in English: hinge). It has the same affinity as the antibody for the antigen and is divalent.
  • antibody includes native antibodies and their functional derivatives, (e.g., mutated and/or modified antibodies as well as mimetic antibodies), provided that such derivative is capable of binding specifically to an antigen (we speak of “functional antibody derivatives”).
  • antibody derivatives also includes antibody fragments.
  • an “antibody fragment” is capable of specifically binding to an antigen (we speak of a “functional antibody fragment”).
  • Antibodies can be produced by different systems known to those skilled in the art.
  • Antibody production systems include, for example, animal systems (such as rodents, camelids, etc.), hybridoma systems, mammalian cell systems (including in particular CHO cell lines (hamster ovary cells Chinese; e.g. CHO-K1, CHO-DG44, etc.), mouse myeloma cell lines (e.g. NSO), baby hamster kidney cell lines (e.g. BHK), human embryonic kidney cell lines (for example HEK293), etc.), yeast systems (including in particular yeasts improved for glycolization), insect cell systems (including in particular insect cell lines improved for glycolization), plant cell systems (including in particular plant cell lines improved for glycolization), etc.
  • animal systems such as rodents, camelids, etc.
  • hybridoma systems include, for example, animal systems (such as rodents, camelids, etc.), hybridoma systems, mammalian cell systems (including in particular CHO cell lines
  • the antibody is an animal antibody, preferably a mammalian antibody, more preferably a human or humanized antibody.
  • the antibody is humanized.
  • the term "antibodies” includes native antibodies and their derivatives (for example, mutated and/or modified antibodies as well as mimetic antibodies), preferably provided that this derivative is capable of specifically binding to an antigen.
  • functional antibody fragment refers to one or more part(s) or fragment(s) of an antibody, retaining the ability to bind specifically to an antigen.
  • binding fragments encompassed by the term “functional antibody fragments” include, but are not limited to, an antigen-binding fragment (Fab), a Fab' fragment, an F(ab')2 fragment.
  • variable fragment Fv
  • scFv single chain variable fragment
  • scFv single chain variable fragment
  • scFv single chain variable fragment
  • a linking peptide a linking peptide
  • dsFv fragment (“disulfide-bond stabilized Fv”)
  • ds-scFv fragment (“disulfide-bond stabilized scFv”)
  • VH domain a VL domain
  • di-scFv divalent scFv, consisting of the association of two scFvs
  • a “diabody” made up of the covalent or non-covalent association of two scFvs
  • minibody minibody
  • single domain antibody refers to antibody fragments consisting of a single monomeric variable domain of an antibody. These antibodies only include the monomeric variable regions of the heavy chain of heavy chain antibodies produced in particular by camelids or cartilaginous fish. Due to their different origins, they are also called VHH (camelid) or VNAR (variable new antigen receptor; cartilaginous fish) fragments. Single domain antibodies are also called nanobodies. Single domain antibodies can also be obtained by monomerization of the variable domains of conventional mouse or human antibodies through genetic engineering. They have a molecular mass of approximately 12-15 kDa and are therefore the smallest antibody fragments capable of recognizing an antigen.
  • diabody refers to a fusion protein or bivalent antibody that can bind to different antigens.
  • a diabody is composed of two unique protein chains that include fragments of an antibody, namely variable fragments.
  • Diabodies comprise a heavy chain variable domain (VH) linked to a light chain variable domain (VL) on the same polypeptide chain (VH-VL, or VL-VH). Using a short peptide connecting the two variable domains, the domains are forced to pair with the complementary domain of another chain and thus create two antigen binding sites.
  • Diabodies can target the same antigen (monospecific) or different antigens (bispecific).
  • antibody mimetic or “antibody mimetic” as used herein refer to compounds that can bind specifically to antigens, in a manner similar to an antibody, but which are not structurally related to the antibodies.
  • antibody mimetics are artificial peptides or proteins with a molar mass of approximately 3 to 20 kDa that include one, two, or more exposed domains that specifically bind to an antigen.
  • mimetic antibodies include, among others, LACI-D1 (lipoprotein-associated coagulation inhibitor); affilins, for example human ubiquitin or human y B crystalline; cystatin; Sac7D of Sulfolobus acidocaldarius; lipocalins and anticalins derived from lipocalins; DARPins (designed ankyrin repeat proteins); the SH3 domain of Fyn; the Kunit domains of protease inhibitors; monobodies, for example the 10th type III domain of fibronectin; adnectins; knottins (cysteine knot miniproteins); atrimers; evibodies; affibodies, for example the bundle of three helices of the Z domain of Staphylococcus aureus protein A; Trans-bodies, for example human transferrin; tetranectins, for example the monomeric or trimeric domain of human C-type lectin; microbodies (micro-bodies), for example try
  • Nucleic acids and small molecules can also be considered antibody mimetics (e.g. aptamers), but not artificial antibodies, antibody fragments and fusion proteins composed from them. Common advantages over antibodies are better solubility, better tissue penetration, stability against heat and enzymes, and comparatively low production costs.
  • DARPin or "Designed Ankyrin Repeat Protein” herein refer to genetically engineered antibody mimetic proteins which generally exhibit highly specific and high affinity binding to the target protein. They are derived from natural ankyrin repeat proteins, one of the most common classes of binding proteins in nature, which are responsible for diverse functions such as cell signaling, regulation, and structural integrity of the cell. DARPins comprise, or essentially consist of, at least three repeating motifs or modules, of which the most N- and most C-terminal modules are called “caps", because they protect the hydrophobic core of the protein. The number of internal modules is indicated by a number (e.g. N1C, N2C, N3C, ...) while the caps are indicated by “N” or "C”, respectively.
  • antigen we mean a natural or synthetic molecule which, recognized by antibodies or cells of the immune system of an organism, is capable of triggering an immune response in it.
  • any foreign substance, any microbe, introduced into the body can behave as an antigen, that is to say cause the production of special proteins, antibodies which have the property of neutralizing the harmful effects of the foreign substance.
  • Antigens are generally peptides, proteins, sugars (such as polysaccharides or polysaccharides) and their lipid derivatives (lipids). Antigens can also be nucleic acids, or haptens (i.e. fragments of antigens).
  • Antigens, as markers of foreign agents in the body are the basis of the adaptive immune response.
  • antigen-presenting cells APC
  • APC antigen-presenting cells
  • epitopes the part of the antigen recognized by an antibody or lymphocyte receptor.
  • epitopes There are sequential epitopes, corresponding to a sequence of amino acids, and conformational epitopes, linked to the structure of the protein and therefore sensitive to denaturation.
  • Recognition of the antigen by lymphocytes depends on the nature of the epitope. B cells bind directly to epitopes conformational thanks to the immunoglobulins in their membrane.
  • the antigen can be exogenous, that is to say it is foreign to the individual (in this case, it can be allogenic: from an individual of the same species; or xenogenic: from other species), or it can be endogenous, that is to say an antigen specific to the host (autoantigens).
  • the antigen is preferably a microorganism, plant, algae, microalgae, bacteria, virus, parasite, yeast, fungus, insect, animal, or tumor antigen; preferably an antigen of a eukaryotic or prokaryotic pathogen, or of a cancer; preferably a protein antigen, lipid or sugar from bacteria, viruses, parasites, yeast, fungi or tumors.
  • antigen includes native antigens and their derivatives (e.g., mutated and/or modified antigens), preferably provided that this derivative is capable of being the target of an immune response.
  • HLA human leukocyte antigen
  • an "antigen fragment” is any part of an antigen, preferably provided that such fragment/part is capable of being the target of an immune response (e.g., epitopes , immunogenic domains, etc.).
  • the antigenic fragment preferably comprises at least 6 consecutive amino acid residues of the antigen (preferably at least 8 consecutive amino acid residues of the antigen, preferably at least 10 , preferably at least 15, preferably at least 20, preferably at least 30 amino acid residues of the antigen).
  • toxin we mean a substance toxic to one or more living organisms.
  • a toxin is typically synthesized by a living organism (bacteria, poisonous fungus, insect or venomous snake), to which it confers its pathogenic power.
  • Toxins produced by bacteria are called bacteriotoxins, those by fungi are called mycotoxins, those produced by plants are called phytotoxins, those produced by algae are called phycotoxins, those by animals are called animal toxins.
  • the toxin can be a chemical molecule, a peptide, a protein, a glycoprotein, a sugar, an saccharide, a lipid, a nucleic acid, or any combination thereof.
  • biotoxins exotoxins
  • Toxic plants produce toxins via their secondary metabolites: these are molecules which, unlike primary toxins (proteins, lipids, carbohydrates, amino acids, etc.) are produced outside the metabolic pathways necessary to ensure survival ( therefore primary metabolites). Plant toxins can be classified into three groups: phenols, nitrogens and terpenes.
  • the toxin can be a neurotoxin (a toxin acting on the nervous system), a myotoxin (acting on the contraction of muscles, in particular cardiotoxins on the heart and others such as strychnine on the respiratory muscles), a hemotoxin (acting on blood), a cytotoxin (acting on cells), a dermatotoxin (acting on the skin and mucous membranes), a hepatotoxin (acting on the liver), a nephrotoxin (acting on the kidney), an enterotoxin (acting on the tube digestive) etc.
  • a neurotoxin a toxin acting on the nervous system
  • a myotoxin acting on the contraction of muscles, in particular cardiotoxins on the heart and others such as strychnine on the respiratory muscles
  • a hemotoxin acting on blood
  • a cytotoxin acting on cells
  • a dermatotoxin acting on the skin and mucous membranes
  • the toxin may be an toxoid; that is to say a toxin which has been treated in such a way as to retain its antigenic power and lose its toxic power.
  • the toxin is preferably a toxin from a microorganism, plant, algae, microalgae, bacteria, virus, parasite, yeast, fungus, insect, animal, or tumor; preferably a toxin from a eukaryotic or prokaryotic pathogen, or from a cancer.
  • a "toxin fragment” is any part of a toxin, preferably provided that such fragment/part is capable of being toxic to an organism and/or cell.
  • the toxin fragment preferably comprises at least 6 consecutive amino acid residues of the toxin (preferably at least 8 consecutive amino acid residues of the toxin, preferably at least 10, preferably at least 15, preferably at least 20, preferably at least 30 amino acid residues of the toxin).
  • receptor we mean a molecule of the cell membrane or of the cytoplasm or of the cell nucleus which binds specifically to a specific factor (a ligand, such as a neurotransmitter, a hormone, or another substance), inducing a cellular response to this ligand.
  • a ligand such as a neurotransmitter, a hormone, or another substance
  • the modifications in the behavior of the receptor induced by the ligand lead to physiological modifications which constitute the “biological effects” of the ligand.
  • the receptors may include at least: a peptide, a protein, a glycoprotein, a sugar, an saccharide, a lipid, a nucleic acid, or any combination thereof.
  • Receptors are generally proteins or mixed proteins (proteins modified and/or associated with another molecule).
  • the receptor can be a receptor of the external part of the plasma membrane, a transmembrane receptor embedded in the lipid bilayer of cell membranes (generally a transmembrane protein, acting for example as a receptor for hormones and neurotransmitters - These receptors are either coupled to a G protein either carrying an enzymatic activity or an ion channel which allows the activation of metabolic pathways of signal transduction in response to the binding of the ligand), or an intracellular receptor (these receptors can sometimes penetrate into the nucleus of the cell to modulate the expression of specific genes, in response to activation by the ligand).
  • the receptor is preferably a microorganism, plant, algae, microalgae, bacteria, virus, parasite, yeast, fungus, insect, animal, or tumor receptor; preferably a receptor for a eukaryotic or prokaryotic pathogen, or a cancer; preferably a protein or glycoprotein receptor for bacteria, viruses, parasites, yeast, fungi or tumors.
  • the different categories of receptors are well known to those skilled in the art, who can in particular refer to reference works in the field (such as Thomas D. Pollard, William C. Earnshaw, Jennifer Lippincott-Schwartz, Graham Johnson Cell Biology E -Book, Elsevier Health Sciences, Nov.
  • a "receptor fragment” is any portion of a receptor, preferably provided that such fragment/portion is capable of specifically binding to a specific factor (e.g. a ligand, hormone or other substance).
  • the receptor fragment preferably comprises at least 6 consecutive amino acid residues of the receptor (preferably at least 8 consecutive amino acid residues of the receptor, preferably at least 10, preferably at least 15, preferably at least 20, preferably at least 30 amino acid residues of the receptor).
  • enzyme we mean a protein with catalytic properties. Virtually all biomolecules capable of catalyzing chemical reactions in cells are enzymes; However, certain catalytic biomolecules are made up of RNA and are therefore distinct from enzymes: these are ribozymes.
  • An enzyme works by lowering the activation energy of a chemical reaction, which increases the reaction rate.
  • the enzyme is not modified during the reaction.
  • the initial molecules are the substrates of the enzyme, and the molecules formed from these substrates are the products of the reaction.
  • Enzymes are particularly characterized by their very high specificity.
  • an enzyme has the characteristic of being reusable.
  • Enzymes are generally globular proteins that act alone or in complexes of several enzymes or subunits. Like all proteins, enzymes are made up of one or more polypeptide chains folded to form a three-dimensional structure corresponding to their native state.
  • Enzymes are molecules much larger than their substrates. Their size can vary from around fifty-hundred residues to more than 2,000 residues. Only a very small part of the enzyme – between two and four residues most often, sometimes more – is directly involved in catalysis, what is called the catalytic site (or catalytic domain). The latter can be located near one or more binding sites, at which the substrate(s) is(are) bound(s) and oriented(s) in order to allow the catalysis of the chemical reaction. The catalytic site and binding sites form the active site of the enzyme.
  • Enzymes perform a large number of functions within living things. They can, for example, be involved in signal transduction mechanisms and regulation of cellular processes, in the generation of movements, in active transmembrane transport, in digestion, in metabolism, in the immune system, in digestion mechanisms or cleavage of nucleic acids into further production of nucleic acids (here called "enzymes acting on nucleic acids”), in prodrug conversion mechanisms (conversion of prodrug into drug).
  • the enzyme is preferably a prokaryotic, eukaryotic or viral enzyme, preferably an enzyme from an animal, a plant, an alga, a microalga, an insect, a microorganism, a bacteria, a parasite, a yeast, a fungus or a virus, more preferably a mammalian enzyme, such as a human enzyme.
  • a prokaryotic, eukaryotic or viral enzyme preferably an enzyme from an animal, a plant, an alga, a microalga, an insect, a microorganism, a bacteria, a parasite, a yeast, a fungus or a virus, more preferably a mammalian enzyme, such as a human enzyme.
  • the different categories of enzymes are well known to those skilled in the art, who may in particular refer to reference works in the field (such as Schomburg D., Schomburg I., Springer Handbook of Enzymes. 2 edn.
  • Enzyme databases in particular the BRENDA database (available in particular on the site brenda-enzymes.org), as described for example by Chang A, Schomburg I, Placzek S, Jeske L, Ulbrich M, Xiao M, Sensen CW, Schomburg D, Nucleic Acids Res. 2015 Jan; 43. Epub 2014 Nov 5. BRENDA in 2015: exciting developments in its 25th year of existence).
  • an "enzyme fragment” is any portion of an enzyme, preferably provided that such fragment/portion is capable of having enzymatic activity.
  • the enzyme fragment preferably comprises at least 6 consecutive amino acid residues of the enzyme (and is preferably a catalytic site of the enzyme) (preferably at least 8 residues of consecutive amino acid residues of the enzyme, preferably at least 10, preferably at least 15, preferably at least 20, preferably at least 30 amino acid residues of the enzyme).
  • enzyme activity or “catalytic activity” or even “activity” of an enzyme, we mean the efficiency of an enzyme in converting a substrate into a product in a given environment.
  • the efficiency of the enzyme here takes into account the rate of conversion of substrate to product by the enzyme and the rate of conversion of substrate to product by the enzyme.
  • conversion rate of substrate into product by the enzyme we mean here the ratio between the quantity of final product obtained in relation to the initial quantity of substrate for a defined quantity of enzyme.
  • an enzymatic activity within the meaning of the invention can be expressed as the quantity of phloroglucinol produced in a given volume (in g/L).
  • hormone we mean a biologically active chemical substance, generally synthesized by a glandular cell (generally following stimulation) and secreted into the internal environment where it circulates (by blood, by lymph or by sap). It transmits a message in chemical form (generally by acting on specific receptors of a target cell) and therefore plays a role as a messenger in the body. It is capable of acting at very low doses.
  • the hormone is advantageously a plant or animal hormone.
  • Plant hormones are also called phytohormones or growth factors. Their function is often to ensure the growth of the plant or its morphogenesis.
  • Animal hormones are in most cases produced by the endocrine system (an endocrine gland or endocrine tissue).
  • the hormone is a vertebrate hormone, preferably chosen from the following chemical classes:
  • Amine-derived hormones which are made of a single amino acid (tyrosine or tryptophan) but in a derived form.
  • Peptide hormones which are chains of amino acids, therefore proteins, called peptides for the shorter ones.
  • Steroid hormones which are steroids derived from cholesterol.
  • Hormones based on lipids and phospholipids are based on lipids and phospholipids.
  • the hormone is preferably chosen from peptide or protein hormones, amine-derived hormones, steroid hormones and lipid hormones.
  • the hormone is preferably an animal or plant hormone, preferably a mammalian hormone, preferably a human hormone.
  • the different categories of hormones are well known to those skilled in the art, who can in particular refer to reference works in the field (such as Davies PJ (2010) The Plant Hormones: Their Nature, Occurrence, and Functions. In: Davies PJ (eds) Plant Hormones. Springer, Dordrecht; AW Norman, G Litwack, Hormones, Academy Press, 1997; A Kastin, Handbook of biologically active peptides, Academy Press, 2013).
  • a "hormone fragment” is any portion of a hormone, preferably provided that such fragment/portion is capable of stimulating and/or inhibiting a biological process.
  • the hormone fragment preferably comprises at least 6 consecutive amino acid residues of the hormone (preferably at least 8 consecutive amino acid residues of the hormone, preferably at least 10, preferably at least 15, preferably at least 20, preferably at least 30 amino acid residues of the hormone).
  • ligand generally refers to a substance that binds to a receptor on a cell and induces a biological signal.
  • the term ligand includes in particular the terms “addressing or targeting or transport signal”, “signaling molecule”, “signal”, and “cellular signal”.
  • Examples of ligands include peptide and protein targeting sequences, oligosaccharides, molecules allowing cellular transport and/or internalization, neurotransmitters, receptor ligands (receptors being as defined above) , as well as cellular recognition molecules such as Toll Like receptor ligands or C-type lectin receptor ligands.
  • an addressing sequence is a short sequence of amino acids, usually located at the N-terminus protein, used to designate the proteins to be addressed, and indicate their destination.
  • the addressing or targeting or transport signal can be an addressing or targeting or transport signal to/to the core; an addressing or targeting or transport signal to/to the cytoplasm; an addressing or targeting or transport signal to/to the cytosol; an addressing or targeting or transport signal to/to the cell membrane; an addressing or targeting or transport signal to/to the mitochondria; an addressing or targeting or transport signal to/to peroxisomes; an addressing or targeting or transport signal to/to the lysosomes; an addressing or targeting or transport signal to/to the endoplasmic reticulum; a signal for addressing or targeting or transporting secretion pathways; and a ligand of a receptor, preferably a membrane or transmembrane receptor, preferably a membrane or transmembrane receptor of a membrane chosen from a cellular membrane, an extracellular membrane, a cyto
  • the addressing or targeting or transport signal may comprise at least: a peptide, a protein, a glycoprotein, a sugar, an saccharide, a lipid, a nucleic acid, or any combination thereof.
  • the addressing or targeting or transport signal comprises at least one peptide, a protein, a glycoprotein, or a nucleic acid.
  • the signal is preferably a prokaryotic, eukaryotic or viral signal, preferably a signal from an animal, a plant, an algae, a microalgae, a microorganism, a bacteria, a parasite, yeast, fungus, insect, virus, or cancer; more preferably a mammalian signal, such as a human signal.
  • a “ligand fragment” is any portion of a ligand, preferably provided that this fragment/portion is capable of binding to a receptor of a cell and inducing a biological signal.
  • the ligand fragment preferably comprises at least 6 consecutive amino acid residues of the ligand (preferably at least 8 consecutive amino acid residues of the ligand, preferably at least 10, preferably at least 15, preferably at least 20, preferably at least 30 amino acid residues of the ligand).
  • nanoparticle we mean an object whose three dimensions are on the nanometric scale, that is to say a particle whose nominal diameter is less than approximately 100 nm (for example as defined by the ISO TS/ 27687).
  • “functional group” or “functional group” we mean a reactive group, that is to say having the capacity to form at least one chemical, biological, biochemical, enzymatic reaction, or any combination of these, with another molecule.
  • “functional group allowing binding to an agent” is meant a functional group having the capacity to form at least one biological, biochemical, enzymatic chemical reaction, or any combination of these, with an agent (in particular chosen from a therapeutic agent , a targeting agent, a marking agent, and any combination thereof).
  • the functional group may for example comprise, or consist essentially of, or consist of, a peptide tag (“peptide tag” in English), a chemical group (such as a clickable function, a coupling group (“crosslinking group” in English), and any combination thereof), an antibody, an antibody derivative, a functional fragment of an antibody or its derivative, an affinity tag (e.g. biotin, streptavidin, binding protein chitin (CBP), maltose binding protein (MBP), Strep-tag, glutathione-S-transferase (GST), poly(His) tag, etc.), or any combination thereof .
  • a peptide tag in English
  • a chemical group such as a clickable function, a coupling group (“crosslinking group” in English
  • crosslinking group any combination thereof
  • an antibody an antibody derivative, a functional fragment of an antibody or its derivative
  • an affinity tag e.g. biotin, streptavidin, binding protein chitin (CBP), maltose
  • clickable function or “click chemistry” or even “rapid bio-orthogonal chemistry”, we mean a chemical group capable of reacting with another chemical group, in the absence of solvent, at a physiological pH, without formation residue or by-product.
  • clickable functions include, but are not limited to, azide groups, alkyne groups (e.g. acetylene), and any combination thereof.
  • the clickable function can in particular be chosen from an N-hydroxysuccinimide (NHS), dibenzocyclooctyne (DBCO), tetrazine, methyl-tetrazine group, and any combination of these.
  • peptide tag refers to a peptide sequence between 6 and 400 amino acids (preferably between 8 and 300 amino acids, more preferably between 10 and 200 amino acids, more preferably between 12 and 82 amino acids).
  • peptide tags include affinity peptide tags, solubilization peptide tags, chromatography peptide tags, epitope peptide tags, fluorescence peptide tags, etc.
  • Peptide affinity tags are usually added to proteins so that they can be purified from their crude biological source using an affinity technique.
  • CBP chitin-binding protein
  • MBP maltose-binding protein
  • GST glutathione-S-transferase
  • Peptide solubilization tags are particularly used for proteins expressed in chaperone-deficient species, such as E. coli, to assist in the correct folding of proteins and prevent them from precipitating. These include thioredoxin (TRX) and poly(NANP). Some peptide affinity tags have a dual role as solubilizing agent, such as MBP and GST. Chromatographic tags are used to modify the chromatographic properties of the protein to allow different resolution in a particular separation technique. They often consist of polyanionic amino acids, such as the FLAG-tag.
  • Epitope tags are short peptide sequences chosen because high-affinity antibodies can be reliably produced in many different species. They are generally derived from viral genes. Epitope tags include ALFA tag, V5 tag, Myc tag, HA tag, Spot tag, T7 tag, NE tag, etc. Fluorescence tags are particularly used to give a visual readout of a protein. GFP and its variants are the most commonly used fluorescence labels. Tag peptides can enable specific enzymatic modification (such as biotinylation by biotin ligase) or chemical modification (such as reaction with FlAsH-EDT2 for fluorescence imaging). Tag peptides can be combined, in particular to link proteins to several other components. Peptide tags also include covalent peptide tags. Examples of covalent tag peptides include, but are not limited to:
  • Isoeptag covalently binding to the pilin-C protein
  • SpyTag covalently binding to the SpyCatcher protein
  • SnoopTag covalently binding to the SnoopCatcher protein
  • SnoopTagJr covalently binding to SnoopCatcher protein or DogTag protein (mediated by SnoopLigase)
  • DogTag covalently binding to SnoopTagJr protein, mediated by SnoopLigase
  • SdyTag covalently binding to SdyCatcher protein
  • disease or “condition” or “disorder” or “pathology” (these terms are considered here to be synonymous), we mean an alteration of the functions or health of a living organism. It is both illness, referring to all changes in health, and an illness, which then designates a particular entity characterized by its own causes, symptoms, evolution and therapeutic possibilities.
  • prevention or “prevention of a disease” or “prevention of the appearance of a disease” is meant the reduction of the risk of appearance, development or amplification of a disease, of the causes of a illness, symptoms of illness, effects (or consequences, preferably adverse, deleterious effects/consequences) of illness, or any combination thereof; and/or delay the onset, development or amplification of a disease, the causes of a disease, the symptoms of a disease, the effects (or consequences, preferably deleterious effects/consequences) of a disease, or any combination thereof.
  • Prevention includes preventive treatments.
  • treatment or “treatment of a disease” is meant the reduction, inhibition and/or disappearance of a disease, of the causes of a disease, of the symptoms of a disease, of the effects (or consequences, preferably the harmful, deleterious effects/consequences) of a disease, or any combination thereof.
  • the treatment is preferably a curative treatment.
  • a “treatment” or “therapy” includes, but is not limited to, one or more molecules and/or drugs (including any type of molecule or drug, such as chemical or biological compounds, antibodies, antigens, gene therapy, cell therapy, immunotherapy, chemotherapy, any combination thereof, etc.), and/or other treatments (such as radiotherapy, immunotherapy, chemotherapy, surgery, endoscopy, interventional radiology, physical oncology, phototherapy, light therapy, ultrasound therapy, thermotherapy, cryotherapy, electrotherapy, electroconvulsive therapy, oxygen therapy, assisted ventilation, hydrotherapeutic massage, transplantation organs/tissues/fluids, implantation, and any combination thereof, etc.) Therapy can be administered by different modes of administration.
  • drugs including any type of molecule or drug, such as chemical or biological compounds, antibodies, antigens, gene therapy, cell therapy, immunotherapy, chemotherapy, any combination thereof, etc.
  • other treatments such as radiotherapy, immunotherapy, chemotherapy, surgery, endoscopy, interventional radiology, physical oncology, phototherapy, light therapy, ultrasound therapy, thermotherapy
  • methods of administration include, but are not limited to, oral administration, administration by injection into a vein (intravenous, IV), into a muscle (intramuscular, IM), into the space around the spinal cord (intrathecal), under the skin (subcutaneous, sc); sublingual administration; oral administration; rectal administration; vaginal administration; ocular pathway; otic route; nasal administration; by inhalation; by nebulization; cutaneous, topical or systemic administration; transdermal administration.
  • “Medicine” or “drug” means any substance or composition presented as having curative or preventive properties with regard to human or animal diseases.
  • a medicine therefore includes any substance or composition that can be used in or administered to humans or animals for the purpose of establishing a medical diagnosis or restoring, correcting or modifying their physiological functions by exerting a pharmacological, immunological or metabolic action.
  • the term medicine includes in particular vaccines.
  • a “therapeutically effective amount” is the amount of each active entity that is sufficient to produce a beneficial health outcome.
  • An “immunologically effective amount” is the amount of each active entity that is sufficient to produce a detectable immune response.
  • the active entity is for example an active ingredient, a therapeutic agent, a targeting agent, a marking agent, or any combination of these.
  • a "pharmaceutically acceptable excipient” or “pharmaceutically acceptable carrier” is intended to include all carriers, solvents, diluents, excipients, adjuvants, vehicles, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, and retarding agents. absorption, and the like, compatible with administration to a subject particularly to an animal, and particularly to humans.
  • the carriers suitable for use in the present document are well known in the art (see for example l (most recent edition of Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Lippincott, Williams&Wilkins).
  • Non-limiting examples of excipients include water, NaCl, saline solutions, saccharide solutions (e.g.
  • glucose, trehalose, sucrose, dextrose, etc. milk Ringer, alcohols, oils, gelatins, carbohydrates such as lactose, amylose or starch, esters of fatty acids, hydroxymethylcellulose, etc.
  • Mention may in particular be made as adjuvant of swelling agents such as for example a sugar such as lactose, sucrose, trehalose, sorbitol, glucose, raffinose, mannitol, preferably lactose, sucrose, trehalose, glucose, or mannitol, an amino acid such as arginine, glycine, or histidine, preferably glycine, or polymers of the dextran or polyethylene glycol type, or mixtures thereof.
  • swelling agents such as for example a sugar such as lactose, sucrose, trehalose, sorbitol, glucose, raffinose, mannitol, preferably lactose, sucrose, trehalose, glucose, or
  • subject or “patient”, we mean a human individual or an animal other than a human.
  • the subject is for example a human or an animal susceptible to contracting a disease, susceptible to being affected by a disease, or suffering from a disease.
  • the subject is preferably a human being.
  • the subject can be a child (human subject aged 16 or younger) or an adult (human subject aged over 16).
  • healthy subject we mean a subject who does not suffer from the disease in question. In the context of the present invention, a healthy subject is preferably a subject who does not suffer from any disease.
  • reference subject we mean a subject who suffers from a known disease, at a known stage.
  • Bio sample or “sample” from a subject means an entire organ or tissue or part of such an organ or tissue, a fluid or a fraction of such a fluid, cells or cellular components. , obtained from this subject, as well as a homogenate, a lysate or an extract prepared at from these.
  • a "biological sample” or “sample” is preferably any tissue (preferably portions or fractions thereof) that can be used to detect disease, including, but not limited to, plasma, blood, lymph, serum, urine, mucus, saliva, a central nervous system (CNS; such as a brain sample or spinal cord sample, etc.), a respiratory tract sample (such as lung sample, etc.), salivary gland sample, nasopharyngeal sample, oropharyngeal sample, digestive system sample (e.g. colon, intestine, etc.), a skin sample, an organ sample (e.g. liver, kidney, spleen, etc.), etc.
  • CNS central nervous system
  • a respiratory tract sample such as lung sample, etc.
  • salivary gland sample such as lung sample, etc.
  • nasopharyngeal sample such as lung sample, etc.
  • oropharyngeal sample oropharyngeal sample
  • digestive system sample e.g. colon, intestine, etc.
  • the biological sample may have been previously obtained by any technique known in the profession. These techniques include, for example, sampling using a swab, needle or syringe, surgery (such as stereotaxic surgery), puncture, explant, excision, biopsy.
  • excision is meant a surgical procedure consisting of cutting (excising) a more or less wide or deep part of the tissue, preferably an abnormality or growth of the tissue. An excision may be performed to remove and/or analyze a cancerous or suspicious tumor.
  • biopsy here refers to a sample of cells or tissues taken for analysis. Several types of biopsy procedures are known and practiced in the field.
  • the most common types include (1) incisional biopsy, in which only a sample of the tissue is taken; (2) excisional biopsy (or surgical biopsy), which consists of completely removing a tumor mass, thus performing a therapeutic and diagnostic procedure; and (3) needle biopsy, in which a tissue sample is taken using a needle, which can be large or fine.
  • Other types of biopsy exist, such as smears or curettage, and can also be used to obtain the sample. Therefore, the sample can be, for example, an explant, an excision, a biopsy, etc.
  • the sample is preferably obtained by a minimally invasive procedure, such as stereotaxic surgery.
  • the inventors have developed innovative microbubbles, capable of delivering agents of interest into the body in a precise and targeted manner.
  • the inventors have notably shown that, surprisingly, the lipid microbubbles thus developed have significantly improved stability, unlike the microbubbles described in the prior art.
  • the data also reveal that these optimized microbubbles are capable of delivering different types of therapeutic agents, targeting agents and/or labeling agents, including nucleic acids, more efficiently than microbubbles. described in the prior art.
  • These microbubbles are notably capable of actively crossing the vessels, the blood-brain barrier (BBB), or even the tumor microenvironment.
  • BBB blood-brain barrier
  • the inventors have also demonstrated that the localized application of ultrasound makes it possible to target these optimized microbubbles very precisely towards the area to be treated. These data thus reveal the therapeutic potential of these lipid microbubbles to treat numerous pathologies in a targeted manner, including pathologies of the central nervous system, vascular pathologies, tumors and cancers.
  • the data also shows that these optimized microbubbles are tools for labeling, detection and imaging.
  • the present invention therefore relates to a lipid microbubble, comprising, or consisting essentially of, or consisting of, at least one cationic compound chosen from lipophosphoramidates, histidylated polyethylenimines, and any mixture thereof.
  • the envelope of the lipid microbubble comprises, or essentially consists of, or consists of, at least one cationic compound chosen from lipophosphoramidates, histidylated polyethylenimines, and any mixture thereof.
  • the present invention relates to a lipid microbubble having an envelope comprising, or consisting essentially of, or consisting of, at least one cationic compound chosen from lipophosphoramidates, histidylated polyethylenimines, and any mixture of these.
  • the lipid microbubble according to the invention can in particular be an ultrasound contrast agent.
  • the microbubble according to the invention further comprises at least one agent chosen from a therapeutic/pharmacological agent, a targeting agent, a marking agent, and any combination of these.
  • the therapeutic/pharmacological agent, targeting agent, labeling agent, and their combination is (are) preferably: i. exposed to the surface of the microbubble, or ii. embedded in the lipid envelope of the microbubble, or iii. incorporated inside the microbubble, or iv. any combination of i to iii.
  • the therapeutic/pharmacological agent, the targeting agent, and the marking agent are advantageously as defined in the “Definitions” section above.
  • said at least one agent comprises, or essentially consists of, or consists of, or is(are) chosen from:
  • nucleic acid 1) a nucleic acid; 2) a fat-soluble active ingredient;
  • a chemotherapeutic agent such as a cytotoxic agent and/or a cytostatic agent
  • a nanoparticle preferably comprising at least one agent chosen from a therapeutic agent, a targeting agent, a marking agent, and any combination thereof;
  • said at least one agent comprises, or essentially consists of, or consists of, or is(are) chosen from: a) a nucleic acid; b) a fat-soluble active ingredient; c) a chemotherapeutic agent, such as a cytotoxic agent and/or a cytostatic agent; d) an antibody; e) an antibody derivative; f) a functional antibody fragment or its derivative; g) a protein; h) a protein fragment, such as a peptide (eg a cell penetrating peptide (CPP), an antigen, an epitope, a functional protein domain, etc.; i) a nanoparticle, preferably comprising (which may further comprise) at least one agent chosen from a therapeutic agent, a targeting agent, a marking agent, and any combination thereof (in particular a hydrophilic/non-fat-soluble agent) ; and j) any combination of a) to i).
  • a chemotherapeutic agent such as a cytotoxic
  • agents 1) to 16), and a) to i), as listed above, are advantageously as defined in the “Definitions” section above.
  • the nucleic acid 1) and/or a) comprises, consists essentially of, or consists of, a plasmid, a vector, complementary DNA (cDNA), single-stranded DNA, double-stranded DNA, DNA comprising a sequence encoding a gene or a gene fragment, a DNA encoding a gene or a gene fragment (preferably a functional fragment), an RNA, a double-stranded RNA, a messenger RNA, a non-coding RNA, a small RNA, etc.
  • cDNA complementary DNA
  • the chemotherapeutic agent 3) or c) is chosen from cytotoxic agents, cytostatic agents, and cytotoxic and cytostatic agents.
  • the chemotherapeutic agent may in particular be chosen, without being limited, from paclitaxel, doxorubicin, gencitabin (e.g. Gemzar), temozolomide, etc.
  • the targeting agent may in particular comprise, consist essentially of, or consist of, an antibody, an antibody derivative, a functional fragment of an antibody or its derivative, a protein, a protein fragment (such as a peptide, an antigen, an epitope, a functional protein domain, etc.), a nanoparticle (which may further comprise at least one therapeutic agent, in particular a hydrophilic therapeutic agent), and any combination thereof.
  • the microbubble according to the invention further comprises at least one functional group, in particular a functional group allowing binding to at least one agent chosen from a therapeutic agent, a targeting agent, a marking agent, and any combination thereof.
  • Said grouping is preferably: i. exposed to the surface of the microbubble, or ii. embedded in the lipid envelope of the microbubble, or iii. incorporated inside the microbubble, or iv. any combination of i to iii.
  • the functional grouping is advantageously as defined in the “Definitions” section above.
  • the functional group comprises, or consists essentially of, or consists of, or is chosen from: a) a tag peptide; b) a chemical group, preferably chosen from a clickable function, a coupling group, and any combination thereof; c) an antibody; d) an antibody derivative; e) a functional fragment of an antibody or its derivative; f) an affinity tag (e.g. biotin, streptavidin, chitin-binding protein (CBP), maltose-binding protein (MBP), Strep-tag, glutathione-S-transferase (GST ), the poly(His) tag, etc.); and g) any combination of a) to f).
  • an affinity tag e.g. biotin, streptavidin, chitin-binding protein (CBP), maltose-binding protein (MBP), Strep-tag, glutathione-S-transferase (GST ), the poly(His) tag,
  • the lipophosphoramidate comprises, or consists essentially of, or consists of, or is chosen from the group consisting of, a dimyristoyl phosphoramidate (preferably chosen from a dimyristoyl bromide phosphoramidate (preferably 0,0-dimyristoyl-N -[3N-(N methylimidazolium bromide) propylene] phosphoramidate (compound KLN27)), a dimyristoyl histamine phosphoramidate (preferably 0,0-dimyristoyl(-N-(histamine)phosphoramidate (compound MM30)), and any combination thereof ci), a dioleyl phosphoramidate (preferably chosen from the group of dioleyl methylimidazolium phosphoramidates (preferably 0,0-dioleyl-N-(3 N- (N-methylimidazolium iodide) propylene) phosphoramidate (compound KLN25)),
  • the histidylated polyethylenimine is coupled to a fatty acid, preferably chosen from stearic acid, myristic acid, palmitic acid, oleic acid, and any combination of these.
  • the microbubble further comprises (in particular the envelope of the microbubble further comprises) an additional lipid chosen from a dimyristoyl-glycero-phosphocholine (preferably 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC )), a distearoyl-glycero-phosphocholine (preferably 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)), a dimyristoyl-glycero-phosphoethanolamine-(polyethylene glycol) (preferably 1,2- dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DMPE-PEG2000)), a distearoyl-glycero-phosphoethanolamine-(polyethylene glycol) (preferably 1,2-distearoyl-sn - glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000]
  • the microbubble also contains a biocompatible gas.
  • the biocompatible gas is preferably contained by the envelope of the microbubble (it is therefore inside the microbubble, in the medium/cavity formed by the envelope).
  • the biocompatible gas is preferably chosen from a perfluorobutane (C4F10), a perfluoropropane (C3F8), dinitrogen (N2), a sulfur hexafluoride (SF6), a nitrogen oxide (NO), hydrogen, dioxygen, helium, xenon, argon, nitrous oxide (N20), and any mixture thereof; preferably also chosen from a perfluorobutane (C4F10), a perfluoropropane (C3F8), dinitrogen (N2), a sulfur hexafluoride (SF6), dioxygen, nitrous oxide (N20), and any mixture of these .
  • the gas is chosen from the group of perfluorobutanes (C4F10),
  • the data obtained by the Inventors reveal that the microbubbles according to the invention, as defined above, are, remarkably, capable of actively crossing the vessels, the blood-brain barrier (BBB) and/or the tumor microenvironment (in particular during of localized application of ultrasound).
  • BBB blood-brain barrier
  • the localized application of ultrasound makes it possible to target these microbubbles very precisely towards the area to be treated, including difficult to access areas such as the central nervous system, the vessels, and the tumor microenvironment.
  • the data also shows that these optimized microbubbles are capable of efficiently delivering different types of therapeutic agents, targeting agents and/or labeling agents, including nucleic acids, to these hard-to-reach areas. .
  • the microbubble according to the invention is characterized in that it is capable of crossing the blood-brain barrier actively and/or the tumor microenvironment actively (in particular during the localized application of ultrasound).
  • the present invention also relates to a method for producing at least one microbubble according to the invention, as described above, comprising, or essentially consisting of, or consisting of, the following steps: a) Mixing, in a container, of cationic compounds chosen from lipophosphoramidates, histidylated polyethylenimines, and any mixtures thereof; ethanol; and optionally at least one agent chosen from a therapeutic agent, a targeting agent, a marking agent, and any combination thereof; b) Evaporation of the mixture obtained in step a) to obtain a lipid film and rehydration of the lipid film to form a liposomal suspension; the entirety of this step can also be carried out by microfluidics; c) Lyophilization of the liposomal suspension obtained in step b); d) Replacement of the air contained in the container containing the lyophilisate obtained in step c), with a biocompatible gas, the gas being preferably chosen from a perfluorobutane (C4
  • microbubble and its constituents such as lipophosphoramidate, histidylated polyethylenimine, the therapeutic agent, the targeting agent, the marking agent, the biocompatible gas, are advantageously as described in the previous sections (in the section “ Definition” and/or “Lipid microbubble”).
  • the invention further relates to a microbubble capable of being obtained, or obtained, or directly obtained, by the production method described above.
  • the present invention further relates to a kit comprising, or essentially consisting of, at least one microbubble according to the invention, as defined above.
  • the present invention also relates to a composition
  • a composition comprising, or consisting essentially of, or consisting of, at least one microbubble according to the invention, as defined above, and, optionally, an excipient.
  • the present invention relates in particular to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, or consisting essentially of, or consisting of, at least one microbubble according to the invention, as defined above, and, optionally, a pharmaceutically acceptable excipient.
  • the composition in particular the pharmaceutical composition, comprises a therapeutically effective quantity of microbubble.
  • concentration of microbubbles in the composition, in particular the pharmaceutical composition preferably ranges from 10 6 to 10 14 microbubbles/ml, more preferably from 10 7 to 10 13 microbubbles/ml, more preferably from 10 8 to 10 12 microbubbles/ml.
  • ml more preferably from 10 9 to 10 11 microbubbles/ml, more preferably the concentration of microbubbles in the composition being approximately 10 10 microbubbles/ml.
  • the composition in particular the pharmaceutical composition, comprises a quantity of pharmaceutically acceptable excipient in the composition which ranges from 5% to 99% by weight relative to the total weight of the composition, preferably from 10 to 97 % by weight, preferably 20 to 95% by weight, preferably 30 to 90% by weight, preferably 40 to 85% by weight, preferably 50 to 80% by weight, preferably 60 to 70 % by weight, relative to the total weight of the composition.
  • the kit comprises, or essentially consists of, or consists of: a) at least one microbubble according to the invention (as defined above) or a composition as defined above, in particular a pharmaceutical composition as defined above, in a first container; b) at least one therapeutic agent, in a second container; c) optionally, at least one targeting agent in a third container; d) optionally, at least one marking agent in a fourth container; and e) optionally, instructions for preparation and/or use.
  • the kit further comprises means adapted for detecting the presence or absence of the marking agent in a sample and/or in a subject.
  • microbubble and its constituents are advantageously as described in the previous sections (in the section “ Definition”, and/or “Lipid microbubble”, and/or “Methods for producing a lipid microbubble”).
  • the therapeutic agent and/or the targeting agent and/or the marking agent comprises, consists essentially of, or consists of, or is chosen from:
  • a chemotherapeutic agent such as a cytotoxic agent and/or a cytostatic agent
  • a nanoparticle preferably comprising at least one agent chosen from a therapeutic agent, a targeting agent, a marking agent, and any combination thereof;
  • the innovative microbubbles developed here have the capacity to deliver agents of interest into the body in a precise and targeted manner, including in very difficult to access areas such as the central nervous system, the vessels, and the tumor microenvironment.
  • the inventors have notably shown that, surprisingly, lipid microbubbles are significantly more stable than the microbubbles of the prior art. They are notably capable of actively crossing vessels, the blood-brain barrier (BBB), or even the tumor microenvironment.
  • BBB blood-brain barrier
  • the inventors have also demonstrated that the localized application of ultrasound makes it possible to target these optimized microbubbles very precisely towards the area to be treated. These data thus reveal the therapeutic potential of these lipid microbubbles to treat numerous pathologies in a targeted manner, including pathologies of the central nervous system.
  • the data also shows that these optimized microbubbles are tools for labeling, detection and imaging.
  • the present invention therefore provides both powerful and broad-spectrum treatment methods for pathologies, as well as marking methods, particularly for medical imaging.
  • the present invention therefore relates to a microbubble according to the invention (as defined above); or a pharmaceutical composition or a kit comprising, or essentially consisting of, at least one microbubble according to the invention (as defined above); or a pharmaceutical composition as defined above; or a kit as defined above; or any combination thereof; for its use as medicine.
  • the present invention also relates to a microbubble according to the invention (as defined above); or a pharmaceutical composition or a kit comprising, or essentially consisting of, at least one microbubble according to the invention (as defined above); or a pharmaceutical composition as defined above; or a kit as defined above; or any combination thereof; for its use as a marking agent, in particular as a contrast agent.
  • the present invention also relates to the use of a microbubble according to the invention (as defined above); or a pharmaceutical composition or a kit comprising, or essentially consisting of, at least one microbubble according to the invention (as defined above); or a pharmaceutical composition as defined above; or a kit as defined above; or any combination thereof; as medicine.
  • the present invention also relates to the use of a microbubble according to the invention (as defined above); or a pharmaceutical composition or a kit comprising, or essentially consisting of, at least one microbubble according to the invention (as defined above); or a pharmaceutical composition as defined above; or a kit as defined above; or any combination thereof; as a marking agent, in particular as a contrast agent.
  • the present invention also relates to the use of a microbubble according to the invention (as defined above); or a pharmaceutical composition or a kit comprising, or essentially consisting of, at least one microbubble according to the invention (as defined above); or a pharmaceutical composition as defined above; or a kit as defined above; or any combination thereof; for the manufacture of a medicine.
  • the present invention also relates to the use of a microbubble according to the invention (as defined above); or a pharmaceutical composition or a kit comprising, or essentially consisting of, at least one microbubble according to the invention (as defined above); or a pharmaceutical composition as defined above; or a kit as defined above; or any combination thereof; for the manufacture of a marking agent, in particular a contrast agent.
  • the present invention also relates to a treatment method, comprising the administration of a microbubble according to the invention (as defined above); or a pharmaceutical composition or a kit comprising, or essentially consisting of, at least one microbubble according to the invention (as defined above); or a pharmaceutical composition as defined above; or a kit as defined above; or any combination thereof; to a subject (preferably a subject in need).
  • the present invention also relates to a marking method, comprising the administration of a microbubble according to the invention (as defined above); or a pharmaceutical composition or a kit comprising, or essentially consisting of, at least one microbubble according to the invention (as defined above); or a pharmaceutical composition such as defined above; or a kit as defined above; or any combination thereof; to a subject (preferably a subject in need).
  • microbubble and its constituents are advantageously as described in the previous sections (in the section “ Definition”, and/or “Lipid microbubble”, and/or “Methods for producing a lipid microbubble”).
  • compositions and kits are as described above in the “Compositions and kits” section.
  • the microbubble, composition, kit, or any combination thereof is(are) administered to a subject in need thereof, preferably in a therapeutically effective amount.
  • the pathology to be treated by the administration of the microbubble, the composition, the kit, or any combination thereof may be of any type.
  • the pathology may in particular be chosen from vascular pathologies, pathologies of the central nervous system, tumors, cancers, and any combination of these.
  • the area to be marked by administration of the microbubble, composition, kit, or any combination thereof may be of any type.
  • the area to be marked can be any part of the body of the subject to be treated and/or marked.
  • the area to be marked can in particular be chosen from an area of the vessels, an area of the central nervous system, an area of the tumor microenvironment, and any combination of these.
  • the area to be treated and/or the area to be marked can be advantageously located in the vessels, the central nervous system, the tumor microenvironment, and any combination of these (preferably the central nervous system).
  • microbubble, composition, kit, or any combination thereof is (are) preferably formulated to be administered one or more times by the same or different routes. All conventional routes of administration are applicable in the context of the invention, including oral, parenteral and topical routes.
  • Parenteral routes are intended for administration as an injection or infusion and include systemic as well as local routes.
  • the microbubble, composition, kit, or any combination thereof is formulated for one or more parenteral administrations, and preferably intravenously (into a vein), intravascular (in a blood vessel), intra-arterial (in an artery), intradermal (in the dermis), subcutaneous (under the skin), intramuscular (in the muscle), intraperitoneal (in the peritoneum), or intratumoral ( in a tumor).
  • Administration can be done as a single bolus dose or can also be done by a continuous infusion pump.
  • the microbubble, composition, kit, or any combination thereof is formulated to be administered by intravenous infusion.
  • Administrations may use conventional syringes and needles (e.g., Quadrafuse injection needles) or any compound or device available in the art capable of facilitating or enhancing delivery of a microbubble to the subject (e.g. , electroporation to facilitate intramuscular administration).
  • a needle-free injection device for example, the Biojector TM device.
  • Transdermal patches may also be considered.
  • doses within the indicated ranges may be administered to the subject. In case of repeated administrations over several days or more, the treatment will generally be continued until the appearance of an observable clinical benefit. These doses may be administered intermittently, for example every day, every 2 or 3 days, every week, every 2 weeks, every 3 weeks or every month (for example, such that the subject receives from about two to about twenty doses of the composition). Doses may also be tailored to each administration (e.g., higher initial dose(s) followed by lower dose(s).
  • the microbubble, composition, kit, or any combination thereof is administered according to a "prime boost" approach that includes sequential administrations of one or more priming compositions ( “priming”) and one or more reinforcing compositions (“boosting”).
  • the priming and boosting compositions may use the same active agent (i.e., the microbubble, composition, kit, or any combination thereof), or may use a different active agent (i.e. the microbubble, composition, kit, or any combination thereof).
  • the priming and enhancing compositions may be administered to the same area of the body or to a different area, by the same route or by different routes of administration.
  • a preferred priming and boosting approach involves a first injection (e.g.
  • subcutaneous, intramuscular, intradermal, intratumoral or intravenous primary
  • a second injection e.g. subcutaneous, intramuscular, intradermal, intratumoral or intravenously
  • the present invention encompasses one or more administrations of the priming and/or enhancing composition(s), with preference to subcutaneous, intramuscular, intradermal, intratumoral, intranasal and intravenous routes.
  • the time period separating priming and boosting administrations varies from one week to 6 months, with a preference for one week to one month and even more for a period of one to two weeks.
  • the microbubble, composition, kit, or any combination thereof is(are) preferably administered in combination with the application of ultrasound, preferably localized application of ultrasound, preferably l localized application of ultrasound on/towards the area to be treated and/or marked.
  • the ultrasound is preferably administered at a frequency ranging from 1 kHz to 10MHz, preferably from 10kHz to 9MHz, preferably from 50KHz to 8MHz, preferably from 100kHz to 7MHz, preferably from 150kHz to 6MHz, preferably from 200kHz to 5MHz , preferably from 300kHz to 4MHz, preferably from 400kHz to 3MHz, preferably from 500kHz to 2MHz, preferably from 750kHz to 1.5MHz, preferably from 0.8MHz to 1.2MHz, more preferably at a frequency of approximately 1MHz.
  • the ultrasound is preferably pulsed at a frequency ranging from 1 Hz to 10kHz, preferably from 10Hz to 9kHz, preferably from 50Hz to 8kHz, preferably from 100Hz to 7kHz, preferably from 150Hz to 6kHz, preferably from 200Hz to 5kHz , preferably from 300Hz to 4kHz, preferably from 400Hz to 3kHz, preferably from 500Hz to 2kHz, preferably from 750Hz to 1.5kHz, preferably from 0.8kHz to 1.2kHz, more preferably at a frequency of approximately 1 kHz.
  • Ultrasound is preferably administered at an acoustic pressure ranging from 100 to 800 kPa (negative peak), preferably 200 to 700 kPa, preferably 300 to 600 kPa, preferably 400 to 500 kPa.
  • Ultrasound is preferably administered for 30 to 300 seconds, preferably for 40 to 250 seconds, preferably for 50 to 200 seconds, preferably for 60 to 180 seconds, preferably for 80 to 150 seconds, preferably for 90 to 120 seconds. seconds.
  • the area to be treated and/or marked can be any part of the body of the subject to be treated and/or marked.
  • Said zone is preferably chosen from difficult-to-access areas, such as the central nervous system, the vessels, and the tumor microenvironment.
  • the Inventors have notably shown that, surprisingly, the lipid microbubbles according to the invention are capable of actively crossing the vessels, the blood-brain barrier (BBB), or even the tumor microenvironment.
  • BBB blood-brain barrier
  • the inventors have also demonstrated that the localized application of ultrasound makes it possible to target these optimized microbubbles very precisely towards the area to be treated.
  • the microbubble, the composition, the kit, or any combination thereof is(are) administered in combination with the localized application of ultrasound at the level of the area or areas to be treated and/or marked in the central nervous system, vessels, tumor microenvironment, or any combination thereof.
  • the method of administering the microbubble, the composition, the kit, or any combination thereof comprises, or essentially consists of, or consists of, the following steps: a) Administration of the microbubble, the composition, the kit, or any combination thereof, to a subject, by an appropriate method of administration (in particular as described above, preferably parenterally, more preferably intravenously); b) Application of ultrasound to the area to be treated and/or marked (preferably according to the frequency, pulse, acoustic pressure and duration conditions described above).
  • the administration method may further comprise additional steps of preparing the microbubble, the composition, the kit, or any combination thereof, prior to step a) of administration; in particular when the microbubbles, the composition, the kit, or any combination thereof, is in a freeze-dried form; said additional steps being as follows:
  • the microbubbles are activated using a mechanical stirrer; for example with stirring between 2000 and 5000 revolutions per minute (rpm), preferably at 4000 rpm; for a period of between 10 and 120 seconds, preferably for 45 seconds.
  • the method further comprises a step of detecting the presence or absence of the agent marking.
  • microbubble according to the invention can be effectively used as a marking, detection and imaging tool.
  • the present invention therefore provides effective and reliable diagnostic methods. It allows in particular the diagnosis, prognosis, stratification or even the monitoring of diseases, or even the evaluation of the effectiveness of a treatment.
  • the present invention therefore relates to the in vitro use of at least microbubble according to the invention (as defined above); or a composition (in particular pharmaceutical) or a kit comprising, or essentially consisting of, at least one microbubble according to the invention (as defined above); or a composition (in particular pharmaceutical) as defined above; or a kit as defined above; or any combination thereof;
  • a composition in particular pharmaceutical
  • a kit as defined above; or any combination thereof;
  • the stratification of a subject suffering from a disease vi. evaluating the effectiveness of a treatment (in particular curative) administered to a subject suffering from an illness; vii. detect the presence or absence of at least one microbubble in a sample, in particular a biological sample; viii. determine the presence or absence, or even the quantity, of at least one marking agent (in particular a contrast agent) in a sample, in particular a biological sample; ix. screen compounds/molecules having an effect in the prevention, treatment, marking, or any combination thereof, of a disease; or x. any combination of i. to ix.
  • the present invention relates in particular to the in vitro use of at least one microbubble according to the invention (as defined above); or a composition (in particular pharmaceutical) or a kit comprising, or essentially consisting of, at least one microbubble according to the invention (as defined above); or a composition (in particular pharmaceutical) as defined above; or a kit as defined above; or any combination thereof; to deliver an agent inside at least one cell, or a biological sample, preferably by sonoporation; the agent preferably being chosen from a therapeutic agent, a targeting agent, a marking agent, and any combination thereof; the cell preferably being chosen from an animal cell, a plant cell, a microorganism cell, and any combination thereof.
  • microbubble, the composition, the kit, or any combination thereof is(are) preferably placed in contact with the cell or the biological sample (in particular administered to the sample) in combination with the application of ultrasound, preferably localized application of ultrasound, preferably localized application of ultrasound to/towards the area to be treated and/or marked.
  • the ultrasound is preferably applied at a frequency ranging from 1 kHz to 10MHz, preferably from 10kHz to 9MHz, preferably from 50KHz to 8MHz, preferably from 100kHz to 7MHz, preferably from 150kHz to 6MHz, preferably from 200kHz to 5MHz , preferably from 300kHz to 4MHz, preferably from 400kHz to 3MHz, preferably from 500kHz to 2MHz, preferably from 750kHz to 1.5MHz, preferably from 0.8MHz to 1.2MHz, more preferably at a frequency of approximately 1 Hz.
  • the ultrasound is preferably pulsed at a frequency ranging from 1 Hz to 10kHz, preferably from 10Hz to 9kHz, preferably from 50Hz to 8kHz, preferably from 100Hz to 7kHz, preferably from 150Hz to 6kHz, preferably from 200Hz to 5kHz, preferably from 300Hz to 4kHz, preferably from 400Hz to 3kHz, preferably from 500Hz to 2kHz, preferably from 750Hz to 1.5kHz, preferably from 0.8kHz to 1.2kHz, preferably again at a frequency of around 1kHz.
  • Ultrasound is preferably administered at an acoustic pressure ranging from 100 to 800 kPa (negative peak), preferably 200 to 700 kPa, preferably 300 to 600 kPa, preferably 400 to 500 kPa.
  • Ultrasound is preferably administered for 30 to 300 seconds, preferably for 40 to 250 seconds, preferably for 50 to 200 seconds, preferably for 60 to 180 seconds, preferably for 80 to 150 seconds, preferably for 90 to 120 seconds. seconds, preferably for 60 seconds.
  • the method of administering the microbubble, the composition, the kit, or any combination thereof comprises, or essentially consists of, or consists of, the following steps: a) bringing the microbubble into contact , the composition, the kit, or any combination thereof, with a cell or biological sample; or administration of the microbubble, the composition, the kit, or any combination thereof, a biological sample, by an appropriate mode of administration (in particular as described above, in the “Therapeutic Uses and Methods” section) ; b) Application of ultrasound to the area to be treated and/or marked (preferably according to the frequency, pulse, acoustic pressure and duration conditions described above).
  • the administration method may further comprise additional steps of preparing the microbubble, the composition, the kit, or any combination thereof, prior to step a) of administration; in particular when the microbubbles, the composition, the kit, or any combination thereof, is in a freeze-dried form; said additional steps being as follows:
  • the method further comprises a step of detecting the presence or absence of the agent marking in the cell and/or the biological sample.
  • microbubble and its constituents are advantageously as described in the previous sections (in the section “ Definition”, and/or “Lipid microbubble”, and/or “Methods for producing a lipid microbubble”).
  • compositions and kits are as described above in the “Compositions and kits” section.
  • Fig. 1 Summary diagram of the formulations developed.
  • the functionalization of the microbubble can depend on different constituents, such as cationic lipids (capable of electrostatic interactions), and biotinylated lipids (capable of binding antibodies in particular via streptavidin-biotin bonds).
  • Fig. 2 Chemical structure of cationic (LIPID 1) and fusogenic (LIPID 2) lipids used in formulations based on lipophosphoramidates.
  • Fig. 3 Size distribution of the different microbubble formulations developed. Analysis was performed using microscopy image analysis (ImageJ® software).
  • Fig. 4 Measurements of the Zeta potential (mV) of different formulations. Values represent the mean ⁇ SD of 3 measurements.
  • Fig. 5 Size distribution of the microbubble formulations developed, including KLN25.
  • Fig. 6 Complexation gel (0.6% agarose) of different volumes of MBc (cationic MB) with a constant quantity of plasmid DNA (1 pg).
  • Fig. 7 Confocal imaging of MBc-tPTX gas microbubbles complexing CpG oligonucleotides coupled to FITC.
  • Fig. 8 Diagram of the assembly carried out allowing the flow analysis of the targeting of functionalized MBs.
  • Fig. 9 A) Graph representing the binding of MB44 on hCMEC/D3 cells stimulated or not for the production of VEGF receptor. Lanes: dot-dash) MBa on stimulated cells; dotted lines) MBa carrying the anti-VEGFR2 receptor on unstimulated cells; solid line) MBa carrying the anti-VEGFR2 receptor on stimulated cells.
  • B Graph representing the binding of MBc-tPTX on cells stimulated for the production of the receptor for 24 hours. Lanes: dotted) MBc-tPTX without antibody; solid line) MBc-tPTX carrying the antibody.
  • Fig. 10 Diagram representing the experimental in vivo sonoporation device comprising a focused ultrasound probe and a motorized positioning system.
  • the mouse is placed in the cradle after injection of Evan's Blue IV. the left hemisphere is then targeted, the FUS treatment is carried out 10 seconds after injection of the MBs for 60 seconds.
  • the FUS treatment is carried out 10 seconds after injection of the MBs for 60 seconds.
  • FIG. 11 A) Diagram showing the brain partitioning carried out for the luciferase activity assay (blue: area treated with FUS). B) Photograph of the brain of a mouse treated with MBc + FUS at 109 kPa, 24 hours post-transfection, the blue spot corresponds to the extravasation of Evan’s blue. C) Photograph of a brain included for the Cryostat® section.
  • Fig. 12 Graph representing luciferase activity per mg of protein in the different areas of the brain 24 h after sonoporation with a pLuc plasmid complexed with MBc. The area targeted by the ultrasound device is zone 2. Data represents the mean ⁇ SEM. **: p ⁇ 0.01.
  • Fig. 13 Microscopic observation of suspensions of anionic (MB1) and cationic (MBPEI) microbubbles. Objectives 25.
  • A Suspension of MBI after activation of HEPES (10 mM, pH 7.4, filtered at 0.2 nm).
  • B Suspension of MBPEI after activation in HEPES (10 mM, pH 7.4, filtered at 0.2 nm).
  • C Flocculation of MBPEI during the preparation of MB:pDNA complexes for in vivo manipulations.
  • Fig. 14 Fluorescence microscopy 24 hours after transfection of the plasmid encoding eGFP using MBPElhis on a HeLa cell line.
  • A Variation of the MB:DNA ratio over an amplitude of 431 kPa.
  • B Variation of the MB:DNA ratio in the absence of US.
  • C Variation of acoustic pressure/amplitude over a stable MB:DNA ratio (1:2).
  • EXAMPLE Design, development and properties of microbubbles to deliver active ingredients in a targeted manner
  • a new formulation of gas microbubbles has been developed. These microbubbles are particularly advantageous, since they make it possible to both encapsulate different types of active ingredients, such as nucleic acids, and to deliver them in a localized manner after activation by focused ultrasound ( Figure 1).
  • a new device has also been developed, allowing ultrasound to be sent into the mouse brain in a targeted manner. This system is coupled to these original gas microbubbles allowing the encapsulation and delivery of active ingredients.
  • the gas microbubble formulation is activated then using a stirrer, the active ingredient can be present in the formulation or can be added after activation of the formulation.
  • the device is positioned at the coordinates corresponding to the delivery site desired by the user in a motorized manner.
  • the original microbubbles developed here are capable of crossing the BBB.
  • the positioning system developed can be implemented with a brain atlas making it possible to locate the brain structures to be treated.
  • the gas microbubbles are injected systemically then the ultrasound is sent.
  • the device can be implemented with a passive cavitation detection system allowing real-time control of the activation of microbubbles by ultrasound.
  • Gas microbubble formulations make it possible to encapsulate or co-encapsulate different active ingredients:
  • lipid-soluble active ingredients such as chemotherapeutic agents (e.g. paclitaxel), particularly on the surface and/or in the envelope of the microbubble;
  • chemotherapeutic agents e.g. paclitaxel
  • anionic active ingredients such as nucleic acids (plasmid DNA, small RNAs, messenger RNAs, etc.; e.g. for gene therapy), for example using cationic lipids;
  • proteins or peptides such as cell penetrating peptides (CPP)
  • CPP cell penetrating peptides
  • microbubbles have been developed; one based on lipophosphoramidates the other based on histidylated polyethyleneimine coupled to a fatty acid. These microbubbles have already shown their effectiveness in vitro and in vivo as an ultrasound theranostic (therapy and imaging) agent.
  • the blood-brain barrier was transiently permeabilized without danger for the animal, this was validated by MRI imaging and histology. Expression of a luciferase transgene was detected after the sonoporation protocol.
  • Example 1 Microbubbles comprising lipophosphoramidates
  • the first step in MB production involves mixing different lipids depending on the desired microbubble type.
  • Lipids KLN27 and MM30 come from a collaboration with the University of Brest (Berchel). These are phosphoramidate lipids, LIPIDE1 (KLN27) is cationic in nature while LIPIDE2 (MM30) is used as a fusogenic lipid (lipid that can fuse to membranes, notably used to promote endosomal escape). All other lipids used (DMPC, DSPC, DMPE-PEG2000, DSPE-PEG2000, DSPE-PEG2000biot) were from Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA). The different lipids are mixed in a flask in the presence of absolute ethanol (99.96% pure). During this step, PTX solubilized in absolute ethanol (10 mM, Merck, Germany) is added according to the formulation (Table 2).
  • Table 2 List of formulations used. The proportions of the different lipids constituting the envelope are indicated in molar percentage, relative to the total molar quantity of lipids.
  • the mixture is evaporated using a Rotavapor (Büchi, Schwabach, Germany) for 30 min, 20 rpm at 60° C.
  • a lipid film forms in the flask.
  • the lipid film formed is taken up in 2 mL of HEPES (10 mM, pH 7.4) then sonicated for 5 min in order to obtain a homogeneous lipid solution (Figure 11).
  • the solution is then distributed in equal volume in 4 crimp vials (VWR International, Radnor, PA, USA) which will be stored for 1 hour at -80° C. Finally, the vials are placed in a lyophilizer (Bioblock Scientific, Illkirch, France). for one night.
  • the vials are manually crimped and stored at 4°C before being activated.
  • Activation consists of replacing the air in the vial with perfluorobutane (C4F10, F2 Chemical, UK) by overpressure, then rehydrating the lyophilisate with 500 ⁇ l of a 10 mM HEPES solution.
  • the vials are shaken for 45 s using a VIALMIX (Bristol Myers Squibb, USA). This step allows the formation of microbubbles in the bottle; however, it is necessary to wait 5 minutes after shaking before taking a sample. Once a bottle is activated, it can be kept for a few days at 4°C.
  • MBs comprising the phosphoramidate lipid KLN25 are also prepared according to the method described above (paragraph 1.1.1.1).
  • the proportions of the different lipids constituting the envelope in molar percentage, relative to the total molar quantity of lipids, are as follows:
  • MB comprising dipalmitoyl phosphoramidates
  • MBs comprising the dipalmitoyl phosphoramidate lipids are also prepared according to the method described above (paragraph 1.1.1.1).
  • the proportions of the different lipids constituting the envelope in molar percentage, relative to the total molar quantity of lipids, are as follows:
  • MBs comprising the disteraoyl phosphoramidate lipids are also prepared according to the method described above (paragraph 1.1.1.1).
  • the proportions of the different lipids constituting the envelope in molar percentage, relative to the total molar quantity of lipids, are as follows:
  • anionic microbubbles (MBa) is carried out according to the method described in paragraph 2.1.1 below.
  • the microbubbles are observed by an inverted microscope (Nikon Diaphot 300 invert) connected to a computer. This installation allows photography to be taken by a FASTCAM SA7 camera (Photron, USA) and ICcapture® software. The photos are taken with different lenses (x10, x20, x40) then processed by ImageJ®. The processing consists of an 8-bit conversion of the image followed by thresholding allowing the detection of MB contours. Subsequently, a particle analysis allows the counting as well as obtaining the size. In order to carry out this characterization, the microbubbles are diluted 10th or 100th in HEPES (10 mM, pH 7.4) then placed on a Malassez slide.
  • HEPES 10 mM, pH 7.4
  • the potential C corresponds to the overall charge of a particle at the level of its shear plane (surface of the particle). This is measured using the Nano partica SZ-100 (Horiba, Japan). In order to carry out the measurements, 30 pL of MB are diluted in 970 pL of 10 mM HEPES pH 7.4. The analysis is done at 25°C.
  • the size and concentration of the microbubbles prepared according to the present example are evaluated by optical imaging.
  • Figure 3 presents the results obtained for the different formulations in Table 2.
  • the size information collected shows an average diameter of 1.41 pm for MBc and 1.41 pm for MBc-PTX, while it is 1.55 pm For MBc-t.
  • the MBc-tPTX have an average diameter of 1.98 ⁇ m.
  • Concerning the anionic microbubbles, the anionic MB (MBa) have an average size of 1.41 pm.
  • the concentrations of the different formulations are summarized in Table 3. The distribution in size and concentration remains homogeneous between the two main categories of microbubbles (cationic and anionic). Generally speaking, anionic MBs (similar to commercial MBs) are similar in size to cationic MBs, but higher in concentration.
  • MBc-tPTX containing biotinylated lipids as well as PTX are those with the largest size and the lowest concentration. However, the size distribution of MB remains less than 10 ⁇ m, allowing their injection in vivo.
  • Table 3 Summary table of the concentrations and average sizes of the different MB formulations.
  • Figure 4 presents the potential measurements of the developed formulations. These results do not show a significant change in overall charge when MBcs are functionalized with PTX, biotin, or both at the same time. These remain positive (average MBc: +28.8 mV).
  • the MBa formulation does not have KLN27 (cationic lipid) and therefore serves as a control, its charge is -23.4 mV.
  • Figure 5 presents the results obtained for the formulations comprising KLN25 and confirms the possibility of forming MBs comprising KLN25.
  • the size and concentration distribution of MBs comprising KLN25 is comparable to that of MBs comprising KLN27.
  • MB comprising dipalmitoyl phosphoramidates or disteraoyl phosphoramidates
  • Figure 6 presents the complexation capacity of MBc microbubbles (possessing the cationic lipid KLN27) in the presence of 1 pg of plasmid DNA (pLuc plasmid).
  • pLuc plasmid plasmid DNA
  • a culture in Ibidi® of hCMEC/D3 cells stimulated for the production of VEGFR is carried out, then a flow analysis of the MBs by optical microscopy is carried out.
  • 6-channel flow culture plates Ibidi® p-Slide VIO.4, Clinisciences
  • TGFB TGFB
  • microbubbles In order to analyze the fixation of the microbubbles, a field of observation is chosen. Different types of microbubbles are used (described in Table 2 above). Following analyzes carried out by flow cytometry, certain microbubbles are functionalized with the antibody directed against the VEGF receptor (VEGFR2). To do this, 1.23 ⁇ l of streptavidin (15 mM) are incubated in the presence of 0.3465 ⁇ l of anti-VEGFR2-Biot antibody (Anti-mouse CD309, 0.5 mg/mL, eBioscience) in order to obtain a ratio of 2.5 moles of antibodies per mole of streptavidin.
  • VEGFR2 VEGF receptor
  • the rest of the experiment consists of a succession of washing of the cells in culture. First of all, a first wash of 10 min with PBS takes place, at a flow rate of 0.137 mL/min (0.25 dyn/cm 2 ). Then, the injection of the MB contained in 1 mL is carried out for 15 min at the same flow rate, followed by a first rinse for 10 min with PBS, then a second rinse for 10 min at 0.275 mL/min (0.5 dyn/cm 2 ), to finish with a third rinse of 10 min at 0.550 mL/min (1 dyn/cm 2 ), followed by a final rinse at 1.1 mL/min (2 dyn/cm 2 ). Photographs of the canal are taken every minute from the injection. The series of photos is then processed on ImageJ® to obtain a count of the number of MB per minute.
  • the targeting capacity of microbubbles towards the VEGF receptor was evaluated in vitro in real time using a culture chamber allowing the establishment of a flow.
  • the cells used for this analysis are hCMEC/D3 endothelial cells, stimulated or not by TGFB. Different formulations were tested on these cells in order to evaluate the effect of different constituents on the binding capacity of microbubbles (Figure 9).
  • Figure 9A presents the results obtained for the MBa anionic formulation.
  • Figures 9B and 9C present the results obtained for the cationic formulation MBc tPTX (incorporating PTX and biotinylated lipids). This formulation is tested on cells stimulated at 24 h and 48 h. The injection and washing speeds are halved compared to Figure 9A, so as not to stress the cells too quickly.
  • the cationic microbubbles are functionalized with the anti-VEGFR2 antibody, they bind in greater numbers compared to microbubbles not functionalized for the antibody ( Figures 9B, 9C). Without nucleic acid complexation, the number of fixed MBs possessing the antibody is approximately 110% higher than the number of MB fixed without antibodies.
  • the hairs located on the mouse skull must be removed to allow perfect transmission of US between the skin and the ultrasound probe.
  • the mouse is anesthetized using an oxygen/air mixture 1.5% isoflurane (Vetflurane, France) throughout the experiment.
  • a catheter equipped with a 26G needle is placed in the tail vein to allow intravenous injections.
  • An injection of Evan’s blue (5%, saline solution 1 mL/kg) is performed.
  • Evan's blue is a dye that binds to circulating albumin and does not naturally pass the BBB; its extravasation is however visible after opening via MB+FUS, allowing us to obtain information on the location of the area targeted by our protocol once the brain is extracted from the cranium.
  • the mouse is placed in the cradle of the in vivo sonoporation platform ( Figure 10).
  • FUS is applied using a 54 mm diameter single element focused ultrasound transducer (Precision Acoustics, UK).
  • the transducer is placed in a sealed cylinder filled with degassed water and closed by a membrane. The presence of bubbles should be avoided to avoid poor propagation of the US.
  • the transducer is positioned on a motorized control platform connected to a computer, allowing it to be moved using Repetier software. Targeting the transfection zone is done visually using a pointer located at the transducer. The chosen zone corresponds to half the eye-ear distance at the level of the left hemisphere (zone 2).
  • Ultrasound conduction gel is applied to the mouse skull to allow US transmission. After pointing, the transducer positions itself on the pointed area and then descends into contact with the gel.
  • a solution of 30 ⁇ g of pDNA diluted in 60 ⁇ L of 10 mM HEPES pH 7.4 and 20 ⁇ L 20% sucrose is prepared. This solution is incubated for 2 min in the presence of 120 ⁇ L of MBc then injected intravenously into the mouse. Ten seconds after the end of the injection, the US are sent for 60 s (1 MHz, 5% duty cycle, pulse duration 1 sec). Two sound pressures were tested: 109 kPa and 145 kPa. After application of US, the mice are awakened.
  • mice transfected with the plasmid encoding luciferase are euthanized and their brains are removed. This is divided into 6 parts, zones 1, 2, and 3 correspond to the left part of the brain and zones 4, 5, 6 to the right part.
  • the area of transfection targeted by our protocol is located in zone 2 visualized thanks to the extravasation of Evan's blue ( Figure 11).
  • the results presented in Figure 12 show strong luciferase activity (between 5.5x10 3 and 1.05x10 4 RLU/mg proteins) in zones 2 and 3 of the mouse brain, for the two ultrasound powers used.
  • the expression of luciferase is very significantly different between zones 2 and 4 as well as for 2 and 5 for a power of 109 kPa.
  • the results obtained at 145 kPa are not significantly different from those obtained at 109 kPa.
  • Luciferase activity is low in areas 1, 4, 5 and 6 of the brain (less than 10 3 RLU/mg protein). It should be noted that these values are close to those of the background of non-transfected tissues.
  • zones 1 and 3 may present luciferase activity.
  • a strong expression of luciferase is therefore essentially measured in the left hemisphere (targeting location) and not in the right hemisphere, confirming the possibility of using focused ultrasound coupled with cationic microbubbles in order to deliver d. nucleic acids.
  • mice transfected with different plasmids were made in order to study the transfection zone as well as the cell types involved.
  • the transfection zones are determined by observing the extravasation of Evan’s Blue on the cut.
  • Example 2 Microbubbles comprising histidylated polyethylenimines (MBPEI)
  • MBa anionic microbubbles
  • DSPC distearoylphosphatidylcholine
  • DSPE 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy (polyethylene glycol) -2000]
  • Activation of the vials consists of replacing the air contained inside with a high molecular weight gas, perfluorobutane (C4Fio, F2 Chemical, UK), then adding 500 pL of HEPES (10 mM, pH 7, 4, filtered with a 0.2 ⁇ m filter) into the vial using a syringe.
  • HEPES perfluorobutane
  • the vials are then shaken for 45 seconds using a VIALMIX (Bristol Myers Squibb, USA).
  • VIALMIX Billristol Myers Squibb, USA
  • Cationic MBs comprising histidylated polyethylenimines are produced according to a process comprising steps similar to those described in paragraph 2.1.1 above (production of MB1).
  • PEI lipids Polyethyleneimine + Stearic Acid
  • the method of activating these microbubbles is similar to that of MB1.
  • the MBs thus produced are called MBPElhis.
  • the microbubbles are observed by an inverted microscope (Nikon Diaphot 300 invert) connected to a computer. This installation allows photography to be taken by a FASTCAM SA7 camera (Photron, USA) and ICcapture® software. The photos are taken with different lenses (x10, x20, x40) then processed by ImageJ®. The processing consists of an 8-bit conversion of the image followed by thresholding allowing the detection of MB contours. Subsequently, a particle analysis allows the counting as well as obtaining the size. In order to carry out this characterization, the microbubbles are diluted 10th or 100th in HEPES (10 mM, pH 7.4) then placed on a Malassez slide.
  • HEPES 10 mM, pH 7.4
  • the in vitro sonoporation experiments were carried out on the HeLa and HepG2 cell lines, at a rate of 20,000 cells/well (HeLa) and 30,000 cells/well (HepG2), with the DNAs plasmids encoding the GFP protein.
  • each sonoporation condition was carried out in duplicate on 48-well culture plates. Sonoporation transfections were carried out in 190 pL of Opti-MEMTM medium, with 10 pL of an MB/pDNA complexation solution. Each of the transfection conditions in the presence of US was treated for a period of 1 min.
  • the culture plates were incubated at 37°C in a 5% CO2 atmosphere for 30 min in Opti-MEMTM medium, then for 48 hours in conventional culture medium at 37°C with 5% CO2. Analysis of the transfection results by fluorescence microscopy was carried out 24 hours after sonoporation.
  • the size and concentration of the MB prepared according to the present example are evaluated by optical imaging.
  • Figure 13 presents the results obtained for the different formulations.
  • the size information collected shows an average diameter of 1.55 pm for the MBa and 1.31 pm for the MBPElhis.
  • the size distribution of MBPElhis is less than 10 ⁇ m, allowing their injection in vivo.
  • the average concentration is 2.18x1O 10 MB/mL for MBa and 8.51 x10 9 MB/mL 1.31 pm for MBPElhis.
  • the inventors have notably shown that, surprisingly, the lipid microbubbles thus developed have significantly improved stability, unlike the microbubbles described in the prior art.
  • the data also reveals that these optimized microbubbles are capable of delivering different types of agents of interest, including nucleic acids, more efficiently than the microbubbles described in the prior art.
  • these microbubbles are capable of crossing the vessels as well than the BBB.
  • the inventors have also demonstrated that the localized application of ultrasound makes it possible to target these optimized microbubbles very precisely towards the area to be treated. These data thus reveal the therapeutic potential of these lipid microbubbles to treat numerous pathologies in a targeted manner, including pathologies of the central nervous system, vascular pathologies, cancers, and tumors.
  • the data also shows that these optimized microbubbles are detection and imaging tools.
  • the present invention therefore provides both powerful and broad-spectrum treatment methods for pathologies, as well as effective and reliable diagnostic methods.

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Abstract

La présente invention concerne des microbulles optimisées, en particulier des microbulles lipidiques, pouvant être utilisés dans la prévention et le traitement de maladies ou encore le marquage. L'invention concerne en particulier une microbulle lipidique, comprenant au moins un composé cationique choisi parmi les lipophosphoramidates, les polyéthylénimines histidylées, et tout mélange de ceux-ci. La microbulle comprenant de préférence en outre au moins un agent choisi parmi un agent thérapeutique, un agent de ciblage, un agent de marquage, et toute combinaison de ceux-ci. L'invention se rapporte en outre à une méthode de production de cette microbulle. La présente invention concerne également une composition, notamment une composition pharmaceutique, et un kit, comprenant au moins une de ces microbulles. La présente invention porte en outre sur l'utilisation de ces microbulles, composition, kit, comme médicament ou comme agent de marquage.

Description

DESCRIPTION
TITRE : MICROBULLES LIPIDIQUES POUR LA DELIVRANCE CIBLEE D’ACTIFS
DOAAAINE DE L’INVENTION
La présente invention s’inscrit dans le domaine de la délivrance ciblée d’actifs, pour de la thérapie et/ou du marquage, ainsi que dans le domaine des microbulles, notamment des microbulles fonctionnalisées.
La présente invention concerne notamment des microbulles optimisées, en particulier des microbulles lipidiques, pouvant être utilisés dans la prévention et le traitement de maladies ou encore le marquage.
L’invention concerne en particulier une microbulle lipidique, comprenant au moins un composé cationique choisi parmi les lipophosphoramidates, les polyéthylénimines histidylées, et tout mélange de ceux-ci. La microbulle comprenant de préférence en outre au moins un agent choisi parmi un agent thérapeutique, un agent de ciblage, un agent de marquage, et toute combinaison de ceux-ci.
L’invention se rapporte en outre à une méthode de production de cette microbulle.
La présente invention concerne également une composition, notamment une composition pharmaceutique, et un kit, comprenant au moins une de ces microbulles. La présente invention porte en outre sur l’utilisation de ces microbulles, composition, kit, comme médicament ou comme agent de marquage.
ETAT DE LA TECHNIQUE
Initialement développées à des fins de diagnostic, les microbulles (MB) peuvent également servir de vecteur à des fins thérapeutiques. En effet, grâce à la grande diversité de molécules pouvant composer l’enveloppe, il est ainsi possible d’encapsuler des drogues ou bien de complexer des acides nucléiques. Généralement, les MB servant de vecteurs possèdent une enveloppe lipidique fonctionnalisable, permettant soit d’enchâsser les molécules thérapeutiques entre les lipides, soit de les dissoudre dans une goutte d’huile à l’intérieur de l’enveloppe. De plus, en utilisant des lipides cationiques, il est possible de complexer des acides nucléiques par des interactions électrostatiques. D’autres lipides peuvent également être utilisé pour servir d’attaches à des nanoparticules ou des anticorps, à l’aide d’interactions streptavidine-biotine ou bien être fonctionnalisés afin de réaliser de la chimie-click.
Quelques études ont permis la création de MB comme vecteurs de molécules d’intérêts. Ainsi Zhu et al., Scientific Reports, 2016, décrivent des MB chargées en agent chimio-thérapeutique (paclitaxel). Fan et al., Biomaterials, 2013, ont rapporté la mise au point de microbulles chargées avec un agent antinéoplasique (1 ,3-bis(2-chloroéthyl)-1 -nitrosourée ou BCNU). Toutefois, les drogues complexées à ces MB sont limitées à des composés chimiques anticancers. En particulier, la possibilité de délivrer des acides nucléiques avec ces microbulles n’a pas été démontrée. Or, de plus en plus de thérapies émergentes, notamment des thérapies anticancers, utilisent des acides nucléiques. Ces molécules offrent une flexibilité inégalée par les composés chimiques, permettant par exemple des thérapies personnalisées.
Delalande et al., Bioscience Reports, 2017, décrivent des MB cationiques complexées à des ADN plasmidiques. Toutefois, l’efficacité de délivrance des acides nucléique et la spécificité du ciblage par ces MB reste limitée. Ces aspects sont particulièrement critiques dans le cadre du traitement de pathologies cérébrales. En outre, un des obstacles majeurs aux traitements concerne le passage de la barrière-hémato-encéphalique (BHE). Pour ces raisons, les molécules à délivrer dans le système nerveux central étaient jusqu’alors choisies pour leur capacité à traverser la BHE de façon passive. Cela implique une faible efficacité de délivrance des acides nucléique, ainsi qu’une quasi-absence de ciblage, pouvant être la cause de nombreux effets secondaires néfastes.
Il est donc primordial de mettre au point de nouveaux moyens efficaces et spécifiques de délivrance au cerveau d’agents thérapeutiques, notamment d’acides nucléiques, capables de traverser la BHE sans être dégradés.
Dans ce contexte, les microbulles représentent un système prometteur. Ainsi, Fan et al., 2016, ont produit des MB composées de folate et complexant des acides nucléiques dans le but d’une transfection ciblée au niveau cérébral.
Ces microbulles cationiques sont basées sur l’utilisation de lipides DSTAP ou DPTAP, utilisant une fonction tri méthyl ammonium comme charge cationique pour la complexation. Le principal désavantage de ces formulations est qu’elles ne sont pas suffisamment efficaces pour être utilisable dans des protocoles de thérapie génique. De plus, il s’avère que ces formulations sont toxiques.
Il existe donc toujours le besoin de mettre au point des microbulles capables de délivrer efficacement et de manière ciblée des agents thérapeutiques, tels que des acides nucléiques, à des organes voire à des cellules spécifiques.
La présente invention permet de répondre à ce besoin, en décrivant des microbulles à base de nouvelles formulations cationiques dont les avantages sont les suivants :
Meilleure compaction des acides nucléiques,
Plus faible toxicité,
Utilisation du système d’échappement endosomal (« proton sponge effect ») pour augmenter la transfection et éviter la voie du lysosome, Meilleure efficacité de transfection.
Ainsi, les microbulles développées par les présents Inventeurs possèdent la capacité de transporter des drogues, notamment des acides nucléiques, de façon stable dans la circulation sanguine ; de traverser la barrière hémato encéphalique de façon active ; de délivrer des drogues de manière ciblées, notamment envers des antigènes d’intérêt. La technologie ici mise au point permet en effet d’ouvrir transitoirement la BHE et de délivrer efficacement des actifs de type acides nucléiques à travers celle-ci. Elle permet également de perméabiliser les vaisseaux, afin de délivrer des molécules d’intérêts.
EXPOSE DE L’INVENTION
Dans le cadre de la présente invention, les Inventeurs ont mis au point des microbulles innovantes, notamment des microbulles lipidiques innovantes, capables de transporter des drogues, notamment des acides nucléiques, de façon stable dans la circulation sanguine ; de traverser la barrière hémato encéphalique (BHE) de façon active ; et de délivrer des drogues de manière ciblées, notamment envers des antigènes d’intérêt.
Les Inventeurs ont notamment montré que, de manière surprenante, les microbulles lipidiques ainsi mises au point possèdent une stabilité significativement améliorée, à la différence des microbulles décrites dans l’art antérieur. De façon remarquable, les données révèlent également que ces microbulles optimisées sont capables de délivrer des agents d’intérêt, notamment des acides nucléiques, de manière plus efficace que les microbulles décrites dans l’art antérieur. Ces microbulles sont notamment capables de traverser les vaisseaux, ainsi que la BHE, ou encore le microenvironnement tumoral, de façon active. Les Inventeurs ont également démontré que l’application localisée d’ultrasons permet de cibler ces microbulles optimisées de manière très précise vers la zone à traiter, y compris des zones très difficiles d’accès telles que le système nerveux central, les vaisseaux, et le microenvironnement tumoral. Ces données révèlent ainsi le potentiel thérapeutique de ces microbulles lipidiques pour traiter de nombreuses pathologies de manière ciblée, y compris des pathologies du système nerveux central, des pathologies des vaisseaux, des tumeurs, des cancers. Les données montrent également que ces microbulles optimisées sont des outils de détection et d’imagerie.
La présente invention fournit donc à la fois des méthodes de traitement puissant et à spectre large de pathologies, ainsi que des méthodes de diagnostic efficace et fiable.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION
Résumé de l’invention
La présente invention concerne notamment des microbulles lipidiques, pouvant être utilisées à la fois dans la prévention et le traitement de pathologies, et dans la détection et l’imagerie, notamment médicales.
La présente invention concerne en particulier une microbulle lipidique, comprenant au moins un composé cationique choisi parmi les lipophosphoramidates, les polyéthylénimines histidylées, et tout mélange de ceux-ci.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant au moins une microbulle telle que définie ci-dessus, et, optionnellement, un excipient pharmaceutiquement acceptable, la concentration en microbulles dans la composition allant de préférence de 106 à 1014 microbulles/ml, de préférence encore de 107 à 1013 microbulles/ml, de préférence encore de 108 à 1012 microbulles/ml, de préférence encore de 109 à 1011 microbulles/ml, de préférence encore la concentration en microbulles dans la composition étant d’environ 1O10 microbulles/ml.
La présente invention concerne aussi un kit, comprenant : a) au moins une microbulle telle que définie ci-dessus, dans un premier récipient ; b) au moins un agent thérapeutique, dans un second récipient ; c) optionnellement, au moins un agent de ciblage dans un troisième récipient ; d) optionnellement, au moins un agent de marquage dans un quatrième récipient ; e) optionnellement, des instructions de préparation et/ou d’utilisation ; l’agent thérapeutique et/ou l’agent de ciblage et/ou l’agent de marquage étant de préférence choisi(s) parmi :
1 ) un acide nucléique ;
2) un actif liposoluble ;
3) un agent chimio-thérapeutique, tel qu’un agent cytotoxique et/ou un agent cytostatique ;
4) un anticorps ;
5) une protéine ;
6) un antigène ;
7) une toxine ;
8) un récepteur
9) une enzyme ;
10) une hormone ;
11 ) un ligand ;
12) un vecteur viral ;
13) une nanoparticule, comprenant de préférence au moins un agent choisi parmi un agent thérapeutique, un agent de ciblage, un agent de marquage, et toute combinaison de ceux- ci ;
14) tout dérivé de 1 ) à 13), de préférence tout dérivé fonctionnel de ceux-ci ;
15) tout fragment de 1 ) à 14), de préférence tout fragment fonctionnel de ceux-ci ; et
16) toute combinaison de 1 ) à 15) ; de préférence encore parmi un acide nucléique, un actif liposoluble, un agent chimio-thérapeutique, un anticorps, un dérivé d’anticorps, un fragment fonctionnel d’anticorps ou de son dérivé, une protéine, un fragment de protéine, une nanoparticule, et toute combinaison de ceux-ci.
Selon un autre aspect, la présente invention est relative à une microbulle, une composition pharmaceutique, ou un kit, tels que définis ci-dessus, pour son utilisation comme médicament ou comme agent de marquage.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne une méthode de production d’au moins une microbulle telle que définie ci-dessus, comprenant les étapes suivantes : a) Mélange, dans un récipient, de composés cationiques choisis parmi les lipophosphoramidates, les polyéthylénimines histidylées, et les mélanges quelconques de ceux-ci ; d’éthanol; et optionnellement d’au moins un agent choisi parmi un agent thérapeutique, un agent de ciblage, un agent de marquage, et toute combinaison de ceux-ci ; b) Evaporation du mélange obtenu à l’étape a) pour obtenir un film lipidique et réhydratation du film lipidique pour former une suspension liposomale; l’intégralité de cette étape pouvant également être réalisée par microfluidique ; c) Lyophilisation de la suspension liposomale obtenue à l’étape b) ; d) Remplacement de l’air contenu dans le récipient contenant le lyophilisât obtenu à l’étape c), par un gaz biocompatible, le gaz étant de préférence choisi parmi un perfluorobutane (C4F10), un perfluoropropane (C3F8), le diazote (N2), un hexafluorure de soufre (SF6), un oxyde d’azote (NO), l’hydrogène, le dioxygène, l’hélium, le xénon, l’argon, le protoxyde d’azote (N20), et tout mélange de ceux-ci ; e) Réhydratation du lyophilisât de l’étape d) pour obtenir une solution; f) Agitation de la solution obtenue à l’étape d) pour former des microbulles ; g) Optionnellement, fonctionnalisation des microbulles par au moins un agent choisi parmi un agent thérapeutique, un agent de ciblage, un agent de marquage, et toute combinaison de ceux-ci ; et/ou fonctionnalisation des microbulles par l’ajout au moins un groupement fonctionnel permettant la liaison à au moins un agent choisi parmi un agent thérapeutique, un agent de ciblage, un agent de marquage, et toute combinaison de ceux-ci.
Définitions
Les termes « au moins un(e) » sont ici considérés synonymes aux termes « un(e) ou plusieurs », ou encore aux termes « un(e) ou plus ».
Dans le présent document, le terme « microbulle » désigne une bulle dont le diamètre va d’environ un micromètre à plusieurs dizaines de micromètres (jusqu’à une centaine de micromètres environ), en général d’environ un micromètre à une dizaine de micromètres. Une microbulle comprend une enveloppe entourant un matériau de remplissage. L’enveloppe peut être constituée de lipides, de protéines, de sucres, de composés ioniques, ou de mélanges de ceux-ci. Dans le cas d’une enveloppe constituée de lipides ou essentiellement constituée de lipides, on parle de microbulle lipidique.
Parmi les composés pouvant être utilisés pour former une enveloppe de microbulles selon la présente invention, on retrouve notamment :
Les composés cationiques, tels que les lipophosphoramidates, les polyéthylénimines histidylées, et tout mélange de ceux-ci ; et/ou les lipides, notamment choisis dans le groupe constitué par une dimyristoyl-glycéro- phosphocholine, une distéaroyl-glycéro-phosphocholine, une dimyristoyl-glycéro- phosphoéthanolamine-polyéthylène glycol, une distéaroyl-glycéro-phosphoéthanolamine- polyéthylène glycol 2000, une distéaroyl-glycéro-phosphoéthanolamine- [biotinyl(polyéthylène glycol)], un cholestérol, un beta-sitostérol, un 1 ,2-dioleoyl-sn-glycero- 3-phosphoethanolamine (DOPE), un 1 -oleoyl-2-[6-[(7-nitro-2-1 ,3-benzoxadiazol-4- yl)amino]hexanoyl]-3-trimethylammonium propane (DOTAP), un 1 ,2-dimyristoyl-rac-glycero- 3-methoxypolyethylene glycol-2000 (DMG-PEG2000), les lipides clickables DBCO, Tetrazine, Methyl tétrazine, NHS (DSPE-PEG2000-X), et toute combinaison de ceux-ci ; et toute combinaison de ceux-ci.
Le matériau de remplissage de la microbulle peut notamment être un gaz, de tout type. Le gaz de remplissage est avantageusement biocompatible (c’est-à-dire qu’il est bien toléré par un organisme vivant). Le gaz de remplissage peut notamment être choisi parmi un perfluorobutane (C4F10), un perfluoropropane (C3F8), le diazote (N2), un hexafluorure de soufre (SF6), un oxyde d’azote (NO), l’hydrogène, le dioxygène, l’hélium, le xénon, l’argon, le protoxyde d’azote (N20), et tout mélange de ceux-ci.
Par « microbulle lipidique » on entend une microbulle dont l’enveloppe est essentiellement constituée de lipides, ou est constituée de lipides. Les termes « enveloppe essentiellement constituée de lipides » signifient ici une enveloppe comprenant 55% de lipides ou plus, de préférence 60% de lipides ou plus, de préférence 70% de lipides ou plus, de préférence 80% de lipides ou plus, de préférence 90% de lipides ou plus, de préférence 91% de lipides ou plus, de préférence 92% de lipides ou plus, de préférence 93% de lipides ou plus, de préférence 94% de lipides ou plus, de préférence 95% de lipides ou plus, de préférence 96% de lipides ou plus, de préférence 97% de lipides ou plus, de préférence 98% de lipides ou plus, de préférence encore 99% de lipides ou plus, le pourcentage étant exprimé en masse de lipides par rapport à la masse totale de l’enveloppe.
Avantageusement, la microbulle lipidique comprend au moins un composé cationique, en particulier un lipide cationique ou un lipide couplé à au moins un polymère cationique.
L’enveloppe de la microbulle lipidique peut comprendre un lipide cationique ou un lipide couplé à au moins un polymère cationique, ou être essentiellement constituée de lipides cationiques ou de lipides couplés à au moins un polymère cationique, ou consister en des lipides cationiques et/ou en des lipides couplés à au moins un polymère cationique.
Avantageusement, l’enveloppe comprend des lipides cationiques et/ou des lipides couplés à au moins un polymère cationique, et des lipides fusogéniques.
Selon une mise en œuvre, l’enveloppe lipidique de la microbulle comprend de 2 à 50% de lipides cationiques, de préférence au moins 2% de lipides cationiques, de préférence au moins 10% de lipides cationiques, de préférence au moins 20% de lipides cationiques, de préférence au moins 30% de lipides cationiques, de préférence au moins 40% de lipides cationiques, de préférence 50% de lipides cationiques, le pourcentage étant exprimé en moles de lipides cationiques par rapport au nombre de moles de lipides totaux constituant l’enveloppe. Par « composé cationique », on entend un composé comprenant au moins un cation et dont la charge globale en solution est positive. Des exemples de composés cationiques (lipides cationiques) utilisables pour former une enveloppe de microbulle comprennent notamment, sans limitation : les lipophosphoramidates, les polyéthylénimines histidylées, et tout mélange de ceux-ci. Par « lipide cationique », on entend donc un lipide comprenant au moins un cation et dont la charge globale en solution est positive.
Par « lipophosphoramidate » on entend un phospholipide amphiphile bioinspiré qui porte une charge cationique sur sa tête polaire.
Les lipophosphoramidates comprennent notamment les dimyristoyl phosphoramidates (tels que les dimyristoyl bromure phosphoramidates, et les dimyristoyl histamine phosphoramidates), les dioleyl phosphoramidates (tels que les dioleyl methylimidazolium phosphoramidates), les dipalmitoyl phosphoramidates, et les disteraoyl phosphoramidates.
Par « polyéthylénimine », ou « polyéthylèneimine », ou « PEI », ou « polyaziridine », on entend est un polymère organique de formule chimique H[CH2-CH2-NH-]nH. Par « polyéthylénimine histidylée » on entend un polyéthylénimine comprenant au moins un groupement histidyle. Avantageusement, la polyéthylénimine histidylée utilisée pour former la microbulle est couplée à un acide gras. Des exemples d’acides gras pouvant être couplés à une polyéthylénimine histidylée comprennent notamment l’acide stéarique, l’acide myristique, l’acide palmitique, l’acide oléique, et toute combinaison de ceux-ci.
Par « composé/agent exposé à la surface de la microbulle » on entend un composé ou un agent conjugué/couplé/lié à la surface externe de la microbulle (par exemple conjugué/couplé/lié à l’enveloppe de la microbulle) et en contact avec le milieu extérieur à la microbulle.
Par « composé/agent enchâssé dans l’enveloppe lipidique de la microbulle », on entend un composé ou un agent partiellement ou totalement intégré/incorporé dans la couche de composés (notamment des lipides) formant l’enveloppe de la microbulle. Ainsi, un composé ou un agent totalement intégré/incorporé dans l’enveloppe n’est en contact qu’avec les composés (notamment des lipides) formant l’enveloppe de la microbulle : dans ce cas, le composé ou l’agent n’est donc en contact ni avec le milieu extérieur, ni avec le milieu intérieur, à la microbulle. Un composé ou un agent partiellement intégré/incorporé dans l’enveloppe peut en revanche être soit avec le milieu extérieur à la microbulle, soit avec le milieu intérieur de la microbulle, soit à la fois avec le milieu extérieur et avec le milieu intérieur de la microbulle (composé « traversant »).
Par « composé/agent incorporé à l’intérieur de la microbulle », on entend un composé ou un agent situé dans le milieu intérieur de la microbulle (c’est-à-dire dans le milieu/la cavité formé(e) par l’enveloppe de la microbulle). Ce composé ou agent peut être en contact avec la surface interne de la microbulle (par exemple avec la surface interne de l’enveloppe de la microbulle). Il peut notamment être conjugué/couplé/lié à la surface interne de la microbulle (par exemple à la surface interne de l’enveloppe de la microbulle).
Par « agent thérapeutique » ou « composé thérapeutique », on entend tout agent ou tout composé ou toute molécule présenté(e) comme ayant des propriétés curatives ou préventives à l'égard de pathologies ou maladies, humaines ou animales. Un agent thérapeutique ou un composé thérapeutique comprend donc tout agent ou composé pouvant être utilisé chez l'homme ou l'animal ou administré à ceux-ci dans le but d'établir un diagnostic médical ou de restaurer, corriger ou modifier leurs fonctions physiologiques en exerçant une action pharmacologique, immunologique et/ou métabolique. L’agent thérapeutique peut donc être un agent pharmacologique.
L’agent ou le composé thérapeutique peut être de toute nature ou de tout type et ne dépend pas de son origine. L'agent thérapeutique peut être synthétisé chimiquement, d'origine naturelle, produit par recombinaison (et optionnellement purifié), ou encore conçu et produit synthétiquement. Il peut notamment s'agir d’une petite molécule, d’un acide nucléique, d’un peptide (y compris un peptide modifié de manière post-traductionnelle), d’un polypeptide (y compris un polypeptide modifié de manière post-traductionnelle), d’une protéine (y compris une protéine modifiée de manière post- traductionnelle), d’un composé chimique, d'un agent de chimiothérapie anticancéreuse (tel qu'un agent cytostatique ou cytologique), d’un anticorps, d’une toxine, d’un antigène, d’une hormone, d’une enzyme, d’un ligand, d’un récepteur, d’un composé antiviral, d’un composé antibiotique, d’un composé antifongique, d’un composé antibactérien, d’une nanoparticule, ou de tout fragment de ceux-ci (de préférence un fragment fonctionnellement actif), ou de tout dérivé de ceux-ci (de préférence un dérivé fonctionnellement actif), tel qu'un peptidomimétique, un anticorps mimétique, un dérivé chimique, entre autres, etc. L’agent ou le composé thérapeutique peut par exemple comprendre, ou consister essentiellement en, ou consister en, un acide nucléique, un actif liposoluble, un agent chimio-thérapeutique (tel qu’un agent cytotoxique et/ou un agent cytostatique), un anticorps, un dérivé d’anticorps, un fragment fonctionnel d’anticorps ou de son dérivé, une protéine (y compris une protéine modifiée de manière post-traductionnelle), un fragment de protéine (tel qu’un peptide, un antigène, un épitope, un domaine fonctionnel de protéine, et toute combinaison de ceux-ci; y compris un fragment de protéine modifié de manière post-traductionnelle), une nanoparticule, etc.
Par « agent de ciblage » ou « composé de ciblage », on entend tout agent ou tout composé ou toute molécule présenté(e) comme étant capable de reconnaître et/ou de se lier à une autre molécule (dite « molécule cible »), de préférence de manière spécifique. Ces termes incluent donc également les "agents de liaison" ou « composés de liaison ». Les termes "agents de liaison" ou « composés de liaison » désignent tout agent ou tout composé ou toute molécule capable de se lier à une autre molécule (dite « molécule cible »), ladite liaison étant de préférence une liaison spécifique.
L’agent de ciblage/liaison reconnaît un site, un domaine, une région, une poche, un épitope, une configuration spatiale, une conformation, un groupement chimique, ou toute combinaison de ceux- ci, défini(e) de la molécule cible. L'agent de ciblage/liaison peut être de toute nature ou de tout type et ne dépend pas de son origine. L'agent de ciblage/liaison peut être synthétisé chimiquement, d'origine naturelle, produit par recombinaison (et optionnellement purifié), ou encore conçu et produit synthétiquement. Il peut notamment s'agir d’une petite molécule, d’un acide nucléique, d’un peptide (y compris un peptide modifié de manière post-traductionnelle), d’un polypeptide (y compris un polypeptide modifié de manière post-traductionnelle), d’une protéine (y compris une protéine modifiée de manière post-traductionnelle), d’un composé chimique, d’un anticorps, d’une toxine, d’un antigène, d’un épitope, d’une hormone, d’une enzyme, d’un ligand, d’un récepteur, d’une nanoparticule, ou de tout fragment de ceux-ci (de préférence un fragment fonctionnellement actif), ou de tout dérivé de ceux-ci (de préférence un dérivé fonctionnellement actif), tel qu'un peptidomimétique, un anticorps mimétique, un dérivé chimique, entre autres, etc. L’agent de ciblage/liaison peut par exemple comprendre, ou consister essentiellement en, ou consister en, un acide nucléique, un actif liposoluble, un agent chimio-thérapeutique (tel qu’un agent cytotoxique et/ou un agent cytostatique), un anticorps, un dérivé d’anticorps, un fragment fonctionnel d’anticorps ou de son dérivé, une protéine (y compris une protéine modifiée de manière post- traductionnelle), un fragment de protéine (tel qu’un peptide, un antigène, un épitope, un domaine fonctionnel de protéine, et toute combinaison de ceux-ci; y compris un fragment de protéine modifié de manière post-traductionnelle), une nanoparticule, etc.
La molécule cible peut être de toute nature ou de tout type et ne dépend pas de son origine. La molécule cible peut notamment être un agent pathogène (tel qu’un virus, une bactérie, un parasite, etc.) ou un fragment de celui-ci (par exemple un acide nucléique, une protéine, un polypeptide, un peptide, un épitope, un lipide, un sucre, etc.).
Par « agent de marquage » ou « marqueur » on entend tout agent ou tout composé ou toute molécule présenté(e) comme étant capable de marquer une autre molécule (de préférence de manière spécifique) et d’être détecté par tout moyen. Les moyens de détection de l’agent de marquage sont bien connus de la personne du métier, qui est tout à fait à même de sélectionner la technique appropriée en fonction de l’agent de marquage utilisé. Les moyens de détection de l’agent de marquage incluent notamment les techniques suivantes, sans y être limité : les techniques de détection optique (telles que les techniques utilisant la fluorescence, l’absorbance, la diffraction, la diffusion de la lumière, l’interférométrie, la réflectométrie, l’ellipsométrie, la résonance des plasmons de surface (SPR), la spectroscopie, des particules magnétiques, etc.), les techniques de détection mécanique (telles que les techniques utilisant des microbalances, des micro poutres, etc.), les techniques de détection électrique (telles que les techniques utilisant des électrodes, des capteurs électriques, etc.). L’agent de marquage peut donc être un agent de contraste.
L’agent de marquage peut être de toute nature ou de tout type et ne dépend pas de son origine. L'agent de ciblage/liaison peut être synthétisé chimiquement, d'origine naturelle, produit par recombinaison (et optionnellement purifié), ou encore conçu et produit synthétiquement. Il peut notamment s'agir d’une petite molécule, d’un acide nucléique, d’un peptide (y compris un peptide modifié de manière post-traductionnelle), d’un polypeptide (y compris un polypeptide modifié de manière post-traductionnelle), d’une protéine (y compris une protéine modifiée de manière post- traductionnelle), d’un composé chimique, d’un anticorps, d’une toxine, d’un antigène, d’un épitope, d’une hormone, d’une enzyme, d’un ligand, d’un récepteur, d’une nanoparticule, ou de tout fragment de ceux-ci (de préférence un fragment fonctionnellement actif), ou de tout dérivé de ceux-ci (de préférence un dérivé fonctionnellement actif), tel qu'un peptidomimétique, un anticorps mimétique, un dérivé chimique, entre autres, etc. L’agent de marquage peut par exemple comprendre, ou consister essentiellement en, ou consister en, un acide nucléique, un actif liposoluble, un agent chimio-thérapeutique (tel qu’un agent cytotoxique et/ou un agent cytostatique), un anticorps, un dérivé d’anticorps, un fragment fonctionnel d’anticorps ou de son dérivé, une protéine (y compris une protéine modifiée de manière post-traductionnelle), un fragment de protéine (tel qu’un peptide, un antigène, un épitope, un domaine fonctionnel de protéine, et toute combinaison de ceux-ci; y compris un fragment de protéine modifié de manière post-traductionnelle), une nanoparticule, etc.
L’agent de marquage peut par exemple comprendre, ou consister essentiellement en, ou consister en, un fluorophore (par exemple la fluorescéine ou la luciférase), d’un€ protéine/polypeptide/peptide florescent(e) (par exemple la GFP et ses variants, tels que la RFP, la CFP, la YFP, etc.), d'un radioisotope (notamment adapté à la scintigraphie, par exemple 99mTc), d'une étiquette reconnaissable par un anticorps (par exemple la protéine c-Myc ou une étiquette poly- histidine), d'une étiquette d'affinité (par exemple la biotine, la streptavidine, etc.), d'une enzyme (par exemple la peroxydase de raifort), d’un agent de contraste, d’un peptide étiquette (« peptide tag » en anglais), etc.
Le terme "dérivé" désigne généralement un composant ou une espèce (protéine, anticorps, fragment de protéine, polypeptide, polynucléotide, oligonucléotide, nucléoside, nucléotide, vecteur, virus, etc.) présentant une ou plusieurs modifications par rapport à un composant de référence (par exemple, le composant de type sauvage tel qu'on le trouve dans la nature tel qu'il a été identifié à l'origine, c'est-à-dire le composant correspondant "original" appelé le composant d’origine). Un dérivé peut notamment être un fragment, une partie, un variant, un mutant, une version synthétique (par exemple fabriqué, notamment in vitro), un mimétique, ou une combinaison de ceux-ci, du composant ou de l’espèce d’origine. Les termes "variant", ou "mutant", peuvent être utilisés de manière interchangeable pour désigner généralement un composant ou une espèce (protéine, anticorps, fragment de protéine, polypeptide, polynucléotide, oligonucléotide, nucléoside, nucléotide, vecteur, virus, etc.) présentant une ou plusieurs modifications par rapport à un composant de référence (par exemple, le composant de type sauvage tel qu'on le trouve dans la nature tel qu'il a été identifié à l'origine, c'est-à-dire le composant correspondant "original" appelé le composant d’origine). Un variant de nucléotide ou de nucléoside peut avoir une base modifiée et/ou un sucre modifié et/ou une liaison modifiée. En ce qui concerne les variants de polypeptides, de polynucléotides et d’anticorps, toute modification peut être envisagée, y compris la substitution, l'insertion, la suppression, et toute combinaison de celles-ci, d'un ou plusieurs résidus de nucléotides/acides aminés. Le variant peut être d'origine naturelle ou artificielle (par exemple, muté et/ou fabriqué). Lorsque plusieurs mutations sont envisagées, elles peuvent concerner des résidus consécutifs et/ou des résidus non consécutifs. Sont préférés les variants (par exemple, respectivement, les variants de protéine, les variants de peptides, les variants d’anticorps, les variants de virus, etc.) qui conservent un degré d'identité de séquence d'au moins 80 % avec le composant de référence (par exemple, respectivement, la protéine "originale" correspondante, le fragment de protéine "original" correspondant, le polynucléotide "original" correspondant). A titre d'exemple, "au moins 80% d'identité" signifie 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%. Dans certains modes de réalisation, une identité d'au moins 80 % englobe également une identité de 100 %.
Par « fragment fonctionnel», ou« fragment fonctionnellement actif», on entend tout fragment d’une molécule, d’un agent, d’une espèce, d’un composé, présentant au moins une des fonctions originales de la molécule, de l’agent, de l’espèce, du composé, dont ledit fragment est issu. De préférence, le fragment fonctionnel réalise ladite fonction avec une efficacité égale à au moins 30% de celle dudit peptide ou de ladite protéine, de préférence au moins 40%, de préférence au moins 45%, de préférence au moins 50%, de préférence au moins 55%, de préférence au moins 60%, de préférence au moins 65%, de préférence au moins 70%, de préférence au moins 75%, de préférence au moins 80%, de préférence au moins 85%, de préférence au moins 90%, de préférence au moins 91%, de préférence au moins 92%, de préférence au moins 93%, de préférence au moins 94%, de préférence au moins 95%, de préférence au moins 96%, de préférence au moins 97%, de préférence au moins 98%, de préférence au moins 99%, de préférence au moins 100% de l’efficacité de ladite molécule, dudit agent, de ladite espèce, dudit composé, dont ledit fragment est issu.
Par « identité » ou « identité de séquence », on entend une correspondance exacte de séquence entre deux polypeptides ou acides aminés, ou entre deux molécules d’acides nucléiques ou oligonucléotides. Les pourcentages d’identité auxquels il est fait référence dans le cadre de l’exposé de la présente invention sont déterminés après alignement global optimal des séquences à comparer, qui peuvent donc comprendre une ou plusieurs additions, délétions, troncatures et/ou substitutions. Ce pourcentage d’identité peut être calculé par toute méthode d’analyse de séquences bien connue de l’homme du métier. Le pourcentage d’identité est déterminé après alignement global des séquences à comparer prises dans leur intégralité, sur toute leur longueur. Outre manuellement, il est possible de déterminer l’alignement global de séquences au moyen de l’algorithme de Needleman et Wunsch (1970).
Notamment, pour les séquences nucléotidiques, la comparaison des séquences peut être effectuée à l’aide de tout logiciel bien connu de l’homme du métier, comme par exemple le logiciel Needle. Les paramètres utilisés peuvent notamment être les suivants : « Gap Open » égal à 10,0, « Gap Extend » égal à 0,5 et la matrice EDNAFULL (Version EMBOSS du NCBI NUC4.4).
Pour les séquences d’acides aminés, la comparaison des séquences peut être effectuée à l’aide de tout logiciel bien connu de l’homme du métier, comme par exemple le logiciel Needle. Les paramètres utilisés peuvent notamment être les suivants : « Gap Open » égal à 10,0, « Gap Extend » égal à 0,5 et la matrice BLOSUM62.
À titre illustratif, "au moins 80% d'identité de séquence", tel qu'utilisé ici, représente notamment 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% d'identité de séquence.
Les termes "polynucléotide", "molécule d'acide nucléique" et "acide nucléique" sont utilisés de manière interchangeable dans le présent document et désignent une macromolécule polymère ou oligomère constituée de monomères nucléotidiques (de préférence d'au moins 5 monomères nucléotidiques, également appelés résidus nucléotidiques). Les monomères nucléotidiques sont composés d'une nucléobase, d'un sucre à cinq carbones (tel que, mais sans s'y limiter, le ribose ou le 2'-désoxyribose), et d’un à trois groupes phosphates. Typiquement, un polynucléotide est formé par des liaisons phosphodiester entre les monomères nucléotidiques individuels. Les molécules d'acide nucléique comprennent, sans s'y limiter, l'acide ribonucléique (ÀRN), l'acide désoxyribonucléique (ADN) et leurs mélanges, comme par exemple les hybrides ARN-ADN (polyribo- polydésoxyribonucléotides mixtes). Ces termes englobent les versions simples ou double brin, linéaires ou circulaires, naturelles ou synthétiques, non modifiées ou modifiées de celles-ci (par exemple, polynucléotides génétiquement modifiés ; polynucléotides optimisés), polynucléotides sens ou antisens, mélange chimérique (par exemple, hybrides ARN-ADN). En outre, un polynucléotide peut comprendre des nucléotides d'origine non naturelle et peut être interrompu par des composants non nucléotidiques. Les exemples d'acides nucléiques d'ADN comprennent, sans limitation, l'ADN complémentaire (ADNc), l'ADN génomique, l'ADN plasmidique, le vecteur d'ADN, l'ADN viral (par exemple, les génomes viraux, les vecteurs viraux), les oligonucléotides, les sondes, les amorces, l'ADN satellite, l'ADN microsatellite, l'ADN codant, l'ADN non codant, l'ADN antisens, et tout mélange de ceux-ci. Les acides nucléiques ARN exemplaires comprennent, sans limitation, l'ARN messager (ARNm), l'ARN messager précurseur (pré-ARNm), le petit ARN interfèrent (ARNsi), l'ARN en épingle à cheveux courte (ARNc), microARN (miARN), vecteur ARN, ARN viral, ARN guide (gRNA), ARN antisens, ARN codant, ARN non codant, ARN antisens, ARN satellite, petit ARN cytoplasmique, petit ARN nucléaire, etc. Les polynucléotides décrits ici peuvent être synthétisés par des méthodes standard connues dans l'art, par exemple en utilisant un synthétiseur d'ADN automatisé (tel que ceux qui sont disponibles commercialement auprès de Biosearch, Applied Biosystems, etc.) ou obtenus à partir d'une source naturelle (par exemple un génome, un ADNc, etc. ) ou d'une source artificielle (telle qu'une bibliothèque disponible commercialement, un plasmide, etc.) en utilisant des techniques de biologie moléculaire bien connues dans l'art (par exemple le clonage, la PCR, etc.). Les acides nucléiques peuvent par exemple être synthétisés chimiquement, par exemple selon la méthode du phosphotriester (voir, par exemple, Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543- 584).
L’acide nucléique peut comprendre au moins un nucléotide modifié (c’est-à-dire un nucléotide qui n’est pas un nucléotide d’un ADN ou un ARN naturel). Ces nucléotides modifiés peuvent notamment être utilisés afin d’augmenter la résistance de l’acide nucléique à la dégradation par les nucléases. Ceci est particulièrement avantageux pour les ARN, généralement plus sensibles aux nucléases que les aptamères ADN. Un ARN comprenant au moins un nucléotide modifié est appelé ARN modifié. Un ADN comprenant au moins un nucléotide modifié est appelé ADN modifié.
L'acide nucléique peut également comprendre au moins un groupement additionnel, en plus des nucléotides constitutifs de sa séquence d”acide nucléique. Ainsi, l'acide nucléique peut être lié à au moins un groupement additionnel.
Par « ADN modifié » on entend un ADN comportant au moins un nucléotide modifié. Un ADN modifié peut notamment être un ADN dans lequel le squelette de l'acide nucléique est modifié, en totalité ou en partie, en particulier pour le rendre résistant à une dégradation hydrolytique, en particulier du fait de l'action de nucléases. L’ADN peut être modifié en totalité (c'est à dire que chaque nucléotide qui le constitue est modifié) ou en partie (c'est à dire que seule une partie des nucléotides qui le constitue est modifié). Lorsque l’ADN est modifié en partie, on peut choisir de modifier tout ou partie des purines et/ou tout ou partie des pyrimidines.
Par « ARN modifié » on entend un ARN comportant au moins un nucléotide modifié. Un ARN modifié peut notamment être un ARN dans lequel le squelette de l'acide nucléique est modifié, en totalité ou en partie, en particulier pour le rendre résistant à une dégradation hydrolytique, en particulier du fait de l'action de nucléases. L’ARN peut être modifié en totalité (c'est à dire que chaque nucléotide qui le constitue est modifié) ou en partie (c'est à dire que seule une partie des nucléotides qui le constitue est modifié). Lorsque l’ARN est modifié en partie, on peut choisir de modifier tout ou partie des purines et/ou tout ou partie des pyrimidines.
Les modifications d’un ADN ou d’un ARN (et/ou d’un nucléotide) sont bien connues de l'homme du métier et peuvent notamment être choisies parmi : la modification de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par méthylation ; la substitution de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par un groupement O-Méthoxyethyl; la substitution de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par un groupement amino ; la substitution de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par un halogène (notamment par le fluor) ; le remplacement du phosphodiester (PO) par un groupement phosphorothioate (PS) (on parle alors de squelette phosphorothioate) ; le recours à une structure de type acide nucléique bloqué (Locked Nucleic Acid, LNA), c’est-à-dire la formation d’un pont méthylène afin de verrouiller le ribose en conformation C3’-endo (N-type); le recours à une structure de type acide nucléique peptidique (Peptide Nucleic Acid, PNA), c’est-à-dire le remplacement du squelette sucre-phosphate par un squelette de type peptide ; et une combinaison quelconque de ceux-ci.
Par « vecteur », on entend un véhicule, de préférence une molécule d'acide nucléique ou une particule virale, qui contient les éléments nécessaires pour permettre l'administration, la propagation et/ou l'expression d'une ou plusieurs molécule(s) d'acides nucléiques dans une cellule hôte ou un organisme.
D’un point de vue fonctionnel, ce terme englobe des vecteurs pour la maintenance (vecteurs de clonage), des vecteurs pour l'expression dans diverses cellules ou organismes hôtes (vecteurs d'expression), des vecteurs extrachromosomiques (par exemple des plasmides multicopie) ou des vecteurs d'intégration (par exemple conçus pour s'intégrer dans le génome d’une cellule hôte et produire des copies supplémentaires de la molécule d'acides nucléiques qu’il contient lorsque la cellule hôte se réplique). Ce terme englobe également des vecteurs navettes (par exemple, fonctionnant à la fois dans des hôtes procaryotes et/ou eucaryotes) et des vecteurs de transfert (par exemple pour le transfert de molécule(s) d'acides nucléiques dans le génome d’une cellule hôte). D’un point de vue structurel, les vecteurs peuvent être des sources génétiques naturelles, synthétiques ou artificielles, ou une combinaison d'éléments génétiques naturels et artificiels.
Ainsi, dans le contexte de l'invention, le terme "vecteur" doit être compris de manière large en incluant des vecteurs plasmidiques (ou plasmides) et viraux.
Un "plasmide" tel qu'utilisé ici désigne une construction d'ADN réplicable. Habituellement, les vecteurs plasmidiques contiennent des gènes marqueurs de sélection qui permettent aux cellules hôtes portant le plasmide d'être identifiées et/ou sélectionnées de manière positive ou négative en présence du composé correspondant au marqueur de sélection. Une variété de gènes marqueurs de sélection positives ou négatives sont connus dans la technique. À titre d'illustration, un gène de résistance aux antibiotiques peut être utilisé comme un gène marqueur de sélection positive permettant de sélectionner une cellule hôte en présence de l'antibiotique correspondant.
Le terme "vecteur viral" tel qu'utilisé ici se réfère à un vecteur d'acide nucléique qui comprend au moins un élément d'un génome du virus et peut être conditionné dans une particule virale ou une particule virale. Les vecteurs viraux peuvent être compétents pour la réplication ou sélectifs (par exemple, conçus pour se répliquer mieux ou sélectivement dans des cellules hôtes spécifiques), ou peuvent être génétiquement désactivés de manière à être défectueux ou déficients en réplication.
Par « polypeptide », “protéine”, « fragment de protéine » et “peptide”, on entend des polymères de résidus d'acides aminés qui comprennent au moins neuf acides aminés liés par des liaisons peptidiques. Le polymère peut être linéaire, ramifié ou cyclique. Le polymère peut comprendre des acides aminés naturels et/ou analogues d’acides aminés et il peut être interrompu par des résidus non-acides aminés. Comme indication générale et sans y être cependant lié dans le présent document, si le polymère d'acides aminés contient plus de 50 résidus d'acides aminés, il est de préférence appelé un polypeptide ou une protéine, alors que si le polymère est constitué de 50 acides aminés ou moins, il est de préférence appelé "peptide". Les sens de lecture et d’écriture d’une séquence d’acides aminés d’un polypeptide, d’une protéine et d’un peptide tel qu’utilisés ici sont les sens de lecture et d’écriture conventionnels. La convention de lecture et d'écriture pour des séquences d’acides aminés d’un polypeptide, d’une protéine et d’un peptide place la terminaison amine à gauche, la séquence étant alors écrite et lue de la terminaison amine (N-terminus) à la terminaison carboxyle (C-terminus), de gauche à droite.
Les acides aminés constituant les polypeptides, protéines et peptides, comprennent notamment les acides aminés dits « standards » (également appelés « acides aminés naturels », dont le tableau 1 ci- dessous fournit une liste non exhaustive), ainsi que les acides aminés non standards (également appelés « acides aminés rares », comprenant par exemple la pyrrolysine (symbolisée par la lettre 0), la sélénocystéine (symbolisée par la lettre U), l’alloisoleucine, l’allothréonine, l’ornithine, etc.)
Tableau 1 : Acides aminés standards [Table 1]
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Par « fragment de peptide ou de protéine » ou « partie de peptide ou de protéine » ou entend une portion d’un peptide ou d’une protéine, c’est-à-dire une portion de la séquence d’acides aminés consécutifs composant ledit peptide ou ladite protéine (appelés peptide ou protéine dont le fragment est issu). Le fragment de peptide ou de protéine comprend de préférence au moins 10 acides aminés consécutifs du peptide ou de la protéine, dont il est issu ; de préférence encore au moins 12 acides aminés consécutifs, de préférence encore au moins 15 acides aminés consécutifs, de préférence encore au moins 20 acides aminés consécutifs, de préférence encore au moins 30 acides aminés consécutifs du peptide ou de la protéine dont il est issu. Le fragment de peptide ou de protéine présente de préférence une structure tridimensionnelle, dans des conditions non dénaturantes (par exemple des conditions habituellement non dénaturantes pour les protéines, notamment en absence d’agents dénaturants et/ou chaotropiques).
Telle qu'utilisés ici, les termes "modification post-traductionnelle" se réfèrent à une modification chimique ou enzymatique se produisant naturellement ou non sur une protéine ou un fragment de protéine, après ou concomitamment à la traduction de la protéine (par exemple, la synthèse biologique ou biochimique, utilisant par exemple la machinerie cellulaire), ou après ou concomitamment à la synthèse de la protéine (par exemple, la synthèse artificielle et/ou chimique). Cela signifie qu'au moins un des acides aminés naturels de la protéine ou du fragment de protéine est modifié par l'ajout d'au moins un groupe chimique et/ou la modification (y compris, mais sans s'y limiter, l'élimination) d'au moins un groupe chimique de l'acide aminé naturel. Des exemples de telles modifications chimiques ou enzymatiques incluent, sans limitation, la glycosylation, la phosphorylation, l'acylation, la carboxylation, l'acétylation, la biotinylation, l'hydroxylation, la lipoylation, l'amidation, l'ubiquitination, la sumoylation, la désamination, etc. Par "protéine modifiée de façon post-traductionnelle", on entend ici une protéine ayant au moins une modification post- traductionnelle. Par "fragment de protéine modifié de manière post-traductionnelle", on entend un fragment de protéine ayant au moins une modification post-traductionnelle.
Par « actif liposoluble » on entend tout agent ou tout composé ou toute molécule qui se solubilise dans un corps gras, et ayant une activité biologique, notamment une activité thérapeutique, pharmacologique, de ciblage, ou de marquage, telles que définies ci-dessus en regard avec les agents thérapeutiques, de ciblage, ou de marquage. Les actifs liposolubles comprennent notamment les actifs qui se solubilisent dans les lipides ou leurs dérivés, par exemple dans les huiles, beurres, esters huileux, et autres ingrédients comprenant des lipides ou leurs dérivés.
Par « agent chimio-thérapeutique » on entend tout agent ou tout composé ou toute molécule ayant une activité chimio-thérapeutique. L’agent chimio-thérapeutique comprend notamment les agents ayant une activité anticancer (notamment les agents capables d’éliminer des cellules cancéreuses et/ou tumeurs, et/ou d’induire/stimuler l’élimination de cellules cancéreuses et/ou tumeurs) ainsi que les agents ayant une activité anti-maladie auto-immune. L’agent chimio-thérapeutique peut donc être un agent cytotoxique et/ou un agent cytostatique. Des exemples d’agents chimio-thérapeutiques comprennent notamment, sans y être limité, le paclitaxel, la doxorubicine, la gencitabin (e.g. Gemzar), le témozolomide, etc.
Par "anticorps" on entend une protéine ou une glycoprotéine appartenant à la superfamille des immunoglobulines ; les termes anticorps et immunoglobuline sont utilisés indifféremment. Chez les mammifères, les anticorps sont pour la plupart sécrétés par des cellules dérivées des lymphocytes B : les plasmocytes. Ils sont notamment utilisés par le système immunitaire pour détecter et neutraliser les corps étrangers (notamment les agents pathogènes, tels que les bactéries, les virus, les parasites, etc.), de manière spécifique. Les anticorps comprennent également les auto-anticorps (produits par exemple dans le cas d'une maladie auto-immune). L'anticorps reconnaît une partie unique de la cible étrangère, son antigène.
Les anticorps présentent une structure formée de 4 chaînes polypeptidiques (150 000 uma ou dalton) : deux chaînes lourdes identiques (H pour « heavy », de 50 000 uma chacune) et deux chaînes légères identiques (L pour « light », de 25 000 uma chacune) qui sont reliées entre elles par un nombre variable de ponts disulfures assurant la cohésion de la molécule. Ces chaînes forment une structure en Y (chaque chaîne légère constitue pour moitié un bras du Y) et sont constituées de domaines immunoglobulines pouvant comprendre 110 acides aminés environ. Chaque chaîne légère est constituée d'un domaine constant (nommé CL) et d'un domaine variable (appelé VL); les chaînes lourdes sont composées d'un domaine variable (appelé VH) et, selon l'isotype, de trois ou quatre domaines constants respectivement appelés CH1 , CH2, CH3, (CH4). Pour un anticorps donné, les deux chaînes lourdes sont identiques, de même pour les deux chaînes légères. Les domaines constants sont caractérisés par une séquence en acides aminés très proche d'un anticorps à l'autre, caractéristiques de l'espèce et de l'isotype. Les domaines constants ne sont généralement pas impliqués dans la reconnaissance de l'antigène, mais interviennent dans l'activation du système du complément, ainsi que dans l'élimination des complexes immuns (anticorps lié à son antigène) par les cellules immunitaires possédant les récepteurs aux fragments constants (RFc). Un anticorps possède quatre domaines variables situés aux extrémités des deux « bras ». L'association entre un domaine variable porté par une chaîne lourde (VH) et le domaine variable adjacent porté par une chaîne légère (VL) constitue le site de reconnaissance (ou paratope) de l'antigène. Ainsi, une molécule d'immunoglobuline possède deux sites de liaison à l'antigène, un au bout de chaque bras. Ces deux sites sont identiques (mais destiné à différents épitopes), d'où la possibilité de lier deux molécules d'antigène par anticorps. Le site de reconnaissance de l'antigène (ou paratope) comprend 6 régions appelées régions déterminant la complémentarité (ou CDR, pour « Complementarity-determining regions » en anglais). Chaque VH comporte 3 CDR et chaque VL en comporte également 3.
Le clivage enzymatique spécifique permet d'isoler différents fragments : le fragment Fc (Fragment cristallisable). Il est le support des propriétés biologiques de l'immunoglobuline, en particulier sa capacité à être reconnu par des effecteurs de l'immunité ou à activer le complément. Il est constitué des fragments constants des chaînes lourdes (CH2) au-delà de la région charnière (« hinge », en anglais). Il ne reconnaît en général pas l'antigène ; le fragment Fv (Fragment variable). C'est le plus petit fragment gardant les propriétés de l'anticorps que possède l'immunoglobuline. Il est constitué uniquement des régions variables VL et VH, il fixe donc l'antigène avec la même affinité que l'anticorps complet et est monovalent ; le fragment Fab (Fragment antigen-binding). Ce fragment a la même affinité pour l'antigène que l'anticorps complet. Le fragment Fab est formé de la chaîne légère en entier (VL+CL) et d'une partie de la chaîne lourde (VH+CH1 ). Il est monovalent; le fragment F(ab')2. Il correspond à l'association de deux fragments Fab reliés par une petite partie des parties constantes des chaînes lourdes, la région charnière (en anglais : hinge). Il a la même affinité que l'anticorps pour l'antigène et est divalent.
Tel qu'il est utilisé ici, le terme anticorps englobe les anticorps natifs et leurs dérivés fonctionnels, (par exemple, les anticorps mutés et/ou modifiés ainsi que les anticorps mimétiques), à condition qu'un tel dérivé soit capable de se lier spécifiquement à un antigène (on parle de « dérivés fonctionnels d’anticorps »). Tel qu'il est utilisé ici, le terme « dérivés d’anticorps » englobe également les fragments d’anticorps. De préférence, un « fragment d’anticorps » est capable de se lier spécifiquement à un antigène (on parle de « fragment fonctionnel d’anticorps »).
Les anticorps peuvent être produits par différents systèmes connus de l’homme du métier. Les systèmes de production d’anticorps comprennent par exemple les systèmes animaux (tels que des rongeurs, des camélidés, etc.), les systèmes d’hybridomes, les systèmes cellulaires mammifères (incluant notamment les lignées cellulaires CHO (cellules d'ovaire de hamster chinois ; par exemple CHO-K1 , CHO-DG44, etc.), les lignées cellulaires de myélome de souris (par exemple NSO), les lignées cellulaires de rein de bébé hamster (par exemple BHK), les lignées cellulaires de rein embryonnaire humain (par exemple HEK293), etc.), les systèmes levures (incluant notamment les levures améliorées pour la glycolisation), les systèmes cellulaires d’insectes (incluant notamment les lignées cellulaires d’insecte améliorées pour la glycolisation), les systèmes cellulaires de plantes (incluant notamment les lignées cellulaires de plantes améliorées pour la glycolisation), etc.
De préférence, l'anticorps est un anticorps d'un animal, de préférence un anticorps de mammifère, plus préférablement un anticorps humain ou humanisé. Avantageusement, l'anticorps est humanisé. Le terme « anticorps » englobe les anticorps natifs et leurs dérivés (par exemple, les anticorps mutés et/ou modifiés ainsi que les anticorps mimétiques), de préférence à condition que ce dérivé soit capable de se lier spécifiquement à un antigène.
Les différentes catégories d'anticorps et leurs méthodes de production sont bien connues de l'homme du métier, qui pourra notamment se référer aux ouvrages de référence dans le domaine (tels que Thomas D. Pollard, William C. Earnshaw, Jennifer Lippincott-Schwartz, Graham Johnson Cell Biology E-Book, Elsevier Health Sciences, 1 Nov. 2016 ; Mohammed Zourob, Recognition Receptors in Biosensors, DOI 10.1007/978-1 -4419-0919-0, Springer-Verlag New York 2010 ; Abbas, Lichtman, Pillai, Cellular and Molecular Immunology E-Book, Elsevier Health Sciences, 22 août 2014 ; Bayer V. , Un aperçu des anticorps monoclonaux. Semin Oncol Nurs. 2019 Sep 2:150927 ; Wang W, Wang EQ, Balthasar JP. Pharmacocinétique et pharmacodynamique des anticorps monoclonaux. Clin Pharmacol Ther. 2008 Nov;84(5):548-58).
Le terme "fragment fonctionnel d'anticorps", tel qu'il est utilisé ici, désigne une ou plusieurs partie(s) ou fragment(s) d'un anticorps, conservant la capacité de se lier spécifiquement à un antigène. Des exemples de fragments de liaison englobés dans le terme "fragment fonctionnels d'anticorps" comprennent, sans s'y limiter, un fragment de liaison à l'antigène (Fab), un fragment Fab', un fragment F(ab')2, un fragment variable (Fv), un fragment variable à chaîne unique (scFv pour « single chain variable fragment »), correspondant aux régions VH et VL fusionnées à l’aide d’un peptide de liaison), un fragment dsFv (« disulfide-bond stabilised Fv »), un fragment ds-scFv (« disulfide-bond stabilised scFv »), un domaine VH, un domaine VL, un di-scFv (scFv divalent, constitué de l’association de deux scFv), un « diabody » (constitué de l’association covalente ou non de deux scFv), un « diabody » à chaine unique, un triple corps, un minicorps (« minibody », constitué des fragments VL-VH-CH3), un nanocorps (« nanobody »), un anticorps à domaine unique (sdAb), un fragment d'anticorps à chaîne unique (scAb), un anticorps à chaîne lourde (HcAb), un VHH, un VNAR (variable new antigen receptor), un récepteur de nouvel antigène d'immunoglobuline (IgNAR), un engageur de cellules T bispécifique (BITEs), une molécule de reciblage à double affinité (DART), et toute combinaison de ceux-ci (par ex. une protéine de fusion de ceux-ci).
Le terme "anticorps à domaine unique", ou « sdAb », tel qu'il est utilisé ici, désigne les fragments d'anticorps constitués d'un seul domaine variable monomère d'un anticorps. Ces anticorps ne comprennent que les régions variables monomériques de la chaîne lourde des anticorps à chaîne lourde produits notamment par les camélidés ou les poissons cartilagineux. En raison de leurs origines différentes, ils sont également appelés fragments VHH (camélidés) ou VNAR (variable new antigen receptor ; poissons cartilagineux). Les anticorps à domaine unique sont également appelés nanocorps (nanobody en anglais). Les anticorps à domaine unique peuvent également être obtenus par monomérisation des domaines variables d'anticorps conventionnels de souris ou d'humains par le biais du génie génétique. Ils présentent une masse moléculaire d'environ 12-15 kDa et sont donc les plus petits fragments d'anticorps capables de reconnaître un antigène.
Le terme "diabody" tel qu'il est utilisé ici désigne une protéine de fusion ou un anticorps bivalent qui peut se lier à différents antigènes. Un diabody est composé de deux chaînes protéiques uniques qui comprennent des fragments d'un anticorps, à savoir des fragments variables. Les diabodies comprennent un domaine variable de chaîne lourde (VH) relié à un domaine variable de chaîne légère (VL) sur la même chaîne polypeptidique (VH-VL, ou VL-VH). En utilisant un court peptide reliant les deux domaines variables, les domaines sont forcés de s'apparier avec le domaine complémentaire d'une autre chaîne et créent ainsi deux sites de liaison à l'antigène. Les diabodies peuvent cibler le même antigène (monospécifique) ou des antigènes différents (bispécifique).
Les termes " anticorps mimétique" ou "mimétique d'anticorps" tel qu'utilisés ici, font référence à des composés qui peuvent se lier spécifiquement à des antigènes, de manière similaire à un anticorps, mais qui ne sont pas structurellement liés aux anticorps. Habituellement, les mimétiques d'anticorps sont des peptides ou des protéines artificielles ayant une masse molaire d'environ 3 à 20 kDa qui comprennent un, deux ou plusieurs domaines exposés se liant spécifiquement à un antigène. Des exemples d’anticorps mimétiques comprennent, entre autres, le LACI-D1 (inhibiteur de la coagulation associé aux lipoprotéines) ; les affilines, par exemple l'ubiquitine humaine ou l’y B cristalline humaine ; la cystatine ; Sac7D de Sulfolobus acidocaldarius ; les lipocalines et les anticalines dérivées des lipocalines ; les DARPins (domaines répétés d'ankyrine conçus ou « Designed Ankyrin Repeat Proteins » en anglais) ; le domaine SH3 de Fyn ; les domaines Kunits des inhibiteurs de protéase ; les monobodies, par exemple le 10ème domaine de type III de la fibronectine ; les adnectines ; les knottines (miniprotéines à nœud de cystéine) ; les atrimères ; les evibodies ; les affibodies, par exemple le faisceau de trois hélices du domaine Z de la protéine A de Staphylococcus aureus ; les Trans-bodies, par exemple la transferrine humaine ; les tétranectines, par exemple le domaine monomérique ou trimérique de la lectine de type C humaine ; les microbodies (micro-corps), par exemple l'inhibiteur de trypsine-ll ; les protéines répétées de type armadillo ; etc. Les acides nucléiques et les petites molécules peuvent également être considérés comme des mimétiques d'anticorps (par exemple les aptamères), mais pas les anticorps artificiels, les fragments d'anticorps et les protéines de fusion composées à partir de ceux-ci. Les avantages communs par rapport aux anticorps sont une meilleure solubilité, une meilleure pénétration dans les tissus, une stabilité vis-à-vis de la chaleur et des enzymes, et des coûts de production comparativement faibles.
Les termes "DARPin" ou "Designed Ankyrin Repeat Protein" désignent ici des protéines mimétiques d'anticorps obtenues par génie génétique qui présentent généralement une liaison hautement spécifique et de haute affinité avec la protéine cible. Elles sont dérivées de protéines naturelles à répétition ankyrine, l'une des classes de protéines de liaison les plus courantes dans la nature, qui sont responsables de diverses fonctions telles que la signalisation cellulaire, la régulation et l'intégrité structurelle de la cellule. Les DARPins comprennent, ou consistent essentiellement en, ou consistent en, au moins trois motifs ou modules répétés, dont les modules les plus N- et les plus C-terminaux sont appelés "caps", car ils protègent le noyau hydrophobe de la protéine. Le nombre de modules internes est indiqué par un nombre (par exemple N1C, N2C, N3C, ...) tandis que les capuchons sont indiqués par "N" ou "C", respectivement.
Par « antigène » on entend une molécule naturelle ou synthétique qui, reconnue par des anticorps ou des cellules du système immunitaire d’un organisme, est capable de déclencher chez celui-ci une réponse immunitaire. Ainsi toute substance étrangère, tout microbe, introduit dans le corps, peut se comporter en antigène, c’est-à-dire y provoquer la fabrication de protéines spéciales, les anticorps qui ont la propriété de neutraliser les effets nocifs de la substance étrangère. Les antigènes sont généralement des peptides, des protéines, des sucres (tels que polysaccharides ou polyosides) et leurs dérivés lipidiques (lipides). Les antigènes peuvent également être des acides nucléiques, ou des haptènes (soit des fragments d'antigènes). Les antigènes, en tant que marqueurs des agents étrangers à l'organisme, sont à la base de la réponse immunitaire adaptative. C'est la reconnaissance de l'antigène par les cellules immunocompétentes, directement ou via les cellules présentatrices d'antigène (CPA), qui active l'immunité spécifique. Dans le cas d'antigènes protéiques, on nomme « épitope » ou « déterminant antigènique » la partie de l'antigène reconnue par un anticorps ou un récepteur lymphocytaire. Un même antigène peut comporter plusieurs épitopes (identiques ou différents) et ainsi induire une réponse immunitaire variée. Il existe des épitopes séquentiels, correspondant à une séquence d'acides aminés, et des épitopes conformationnels, liés à la structure de la protéine et donc sensibles à la dénaturation. La reconnaissance de l'antigène par les lymphocytes dépend de la nature de l'épitope. Les lymphocytes B se lient directement aux épitopes conformationnels grâce aux immunoglobulines de leur membrane. Les lymphocytes T reconnaissent les épitopes séquentiels présentés par les cellules présentatrices d'antigènes. L’antigène peut être exogène, c’est-à-dire qu’il est étranger à l’individu (dans ce cas, il peut être allogénique : issu d’un individu de la même espèce ; ou xénogénique : issu d’autres espèces), ou il peut être endogène, c’est-à-dire un antigène propre à l’hôte (auto-antigènes). L’antigène est de préférence un antigène de microorganisme, de plante, d’algue, de microalgue, de bactérie, de virus, de parasite, de levure, de champignon, d’insecte, d’animal, ou de tumeur ; de préférence un antigène d’un pathogène eucaryote ou procaryote, ou d’un cancer ; de préférence un antigène protéique, un lipide ou un sucre de bactérie, de virus, de parasite, de levure, de champignon ou de tumeur.
Le terme antigène englobe les antigènes natifs et leurs dérivés (par exemple, les antigènes mutés et/ou modifiés), de préférence à condition que ce dérivé soit capable d'être la cible d'une réponse immunitaire.
Les différentes catégories d’antigènes sont bien connues de l’homme du métier, qui pourra notamment se référer aux ouvrages de référence dans le domaine (tels que G. J. V. Nossal, G L Ada, Antigens, Lymphoid Cells and the Immune Response, Academic Press, 1971 ; Marc H. V. Van Regenmortel, Structure of Antigens, Volume 3 CRC Press, 20 déc. 1995 ; Edouard Drouhet, Garry T. Cole, Louis De Repentigny, Jean Latge, Fungal Antigens: Isolation, Purification, and Detection, Springer Science & Business Media, 11 nov. 2013 ; Graziano D.F., Finn O.J. (2005) Tumor Antigens and Tumor Antigen Discovery. In: Khleif S.N. (eds) Tumor Immunology and Cancer Vaccines. Cancer Treatment and Research, vol 123. Springer, Boston, MA; Wang M, Claesson MH, Methods Mol Biol. 2014;1184:309-17. Classification of human leukocyte antigen (HLA) supertypes ; ainsi que les bases de données spécialisées telles que décrites dans Galperin, Fernândez-Suârez, Rigden, The 24th annual Nucleic Acids Research database issue: a look back and upcoming changes, NAR, Volume 45, Issue D1 , January 2017, Pages D1 -D11 ; en particulier la base de données PAAAPP, une base de données des autoantigènes humains (disponible notamment sur le site aagatlas.ncpsb.org)).
Tel qu'il est utilisé ici, un "fragment d'antigène" est toute partie d'un antigène, de préférence à condition que ce fragment/cette partie soit capable d'être la cible d'une réponse immunitaire (par exemple, épitopes, domaines immunogènes, etc. ). Dans le cas d'un antigène protéique, le fragment antigènique comprend de préférence au moins 6 résidus d'acides aminés consécutifs de l'antigène (de préférence au moins 8 résidus d'acides aminés consécutifs de l'antigène, de préférence au moins 10, de préférence au moins 15, de préférence au moins 20, de préférence au moins 30 résidus d'acides aminés de l'antigène).
Par « toxine » on entend une substance toxique pour un ou plusieurs organismes vivants. Une toxine est typiquement synthétisée par un organisme vivant (bactérie, champignon vénéneux, insecte ou serpent venimeux), auquel elle confère son pouvoir pathogène. Les toxines produites par des bactéries sont appelées bactériotoxines, celles par les champignons sont dénommées mycotoxines, celles produites par les plantes sont appelées phytotoxines, celles produites par les algues sont appelées phycotoxines, celles par les animaux sont dénommées toxines animales. La toxine peut être une molécule chimique, un peptide, une protéine, une glycoprotéine, un sucre, un oside, un lipide, un acide nucléique, ou une combinaison quelconque de ceux-ci Plusieurs familles de bactéries sécrètent des biotoxines (exotoxines) dans les tissus qu'elles colonisent. D'autres bactéries (Gram négatif) conservent en elles-mêmes la plus grande partie des composés toxiques, qui ne sont libérés que lors de la lyse cellulaire, sous l'action de moyens chimiques, physiques ou mécaniques (les endotoxines). Les végétaux toxiques produisent des toxines via leurs métabolites secondaires : ce sont des molécules qui, à l'inverse des toxines primaires (protéines, lipides, glucides, acides aminés...) sont produites en dehors des voies métaboliques nécessaires à assurer la survie (donc des métabolites primaires). On peut classer les toxines végétales en trois groupes : les phénols, les azotés et les terpènes. La toxine peut être une neurotoxine (une toxine agissant sur le système nerveux), une myotoxine (agissant sur la contraction des muscles, notamment les cardiotoxines sur le cœur et d'autres comme la strychnine sur les muscles respiratoires), une hémotoxine (agissant sur le sang), une cytotoxine (agissant sur les cellules), une dermatotoxine (agissant sur la peau et les muqueuses), une hépatotoxine (agissant sur le foie), une néphrotoxine (agissant sur le rein), une entérotoxine (agissant sur le tube digestif) etc. La toxine peut être une anatoxine ; c’est-à-dire une toxine qui a été traitée de manière à conserver son pouvoir antigènique et perdre son pouvoir toxique. La toxine est de préférence une toxine de microorganisme, de plante, d’algue, de microalgue, de bactérie, de virus, de parasite, de levure, de champignon, d’insecte, d’animal, ou de tumeur ; de préférence une toxine d’un pathogène eucaryote ou procaryote, ou d’un cancer.
Les différentes catégories de toxines sont bien connues de l’homme du métier, qui pourra notamment se référer aux ouvrages de référence dans le domaine (tels que Michael W. Parker, Protein Toxin Structure, Springer Science & Business Media, 29 juin 2013 ; Michael R. Dobbs, Clinical Neurotoxicology E-Book: Syndromes, Substances, Environments, Elsevier Health Sciences, 22 juil. 2009 ; Walker AA, Robinson SD, Yeates DK, Jin J, Baumann K, Dobson J, Fry BG, King GF. Entomo- venomics: The evolution, biology and biochemistry of insect venoms. Toxicon. 2018 Nov; 154: 15-27; Vilariho N, Louzao MC, Abai P, Cagide E, Carrera C, Vieytes MR, Botana LM. Human Poisoning from Marine Toxins: Unknowns for Optimal Consumer Protection. Toxins (Basel). 2018 Aug 9; 10(8) ; ainsi que les bases de données spécialisées telles que décrites dans Galperin, Fernândez-Suârez, Rigden, The 24th annual Nucleic Acids Research database issue: a look back and upcoming changes, NAR, Volume 45, Issue D1 , January 2017, Pages D1 -D11 ; en particulier la base de données Comparative Toxicogenomics Database, telle que décrite dans Davis, Grondin Murphy, Johnson, Lay, Lennon- Hopkins, Saraceni-Richards, Sciaky, King, Rosenstein, Wiegers, Mattingly, The Comparative Toxicogenomics Database: update 2013, NAR, Volume 41 , Issue D1 , 1 January 2013, Pages D1104- D1114 (disponible notamment sur le site ctdbase.org)).
Tel qu'utilisé ici, un "fragment de toxine" est toute partie d'une toxine, de préférence à condition que ce fragment/cette partie soit capable d'être toxique pour un organisme et/ou une cellule. Dans le cas d'une toxine protéique, le fragment de toxine comprend de préférence au moins 6 résidus d'acides aminés consécutifs de la toxine (de préférence au moins 8 résidus d'acides aminés consécutifs de la toxine, de préférence au moins 10, de préférence au moins 15, de préférence au moins 20, de préférence au moins 30 résidus d'acides aminés de la toxine). Par « récepteur » on entend une molécule de la membrane cellulaire ou du cytoplasme ou du noyau cellulaire qui se lie spécifiquement à un facteur spécifique (un ligand, tels un neurotransmetteur, une hormone, ou une autre substance), induisant une réponse cellulaire à ce ligand. Les modifications du comportement du récepteur induites par le ligand conduisent à des modifications physiologiques qui constituent les « effets biologiques » du ligand. Les récepteurs peuvent comprendre au moins : un peptide, une protéine, une glycoprotéine, un sucre, un oside, un lipide, un acide nucléique, ou une combinaison quelconque de ceux-ci. Les récepteurs sont en général des protéines ou des protéines mixtes (protéines modifiées et/ou associées à une autre molécule). Le récepteur peut être un récepteur de la partie externe de la membrane plasmique, un récepteur transmembranaire enchâssé dans la bicouche lipidique des membranes cellulaires (en général une protéine transmembranaire, agissant par exemple comme récepteur aux hormones et aux neurotransmetteurs - Ces récepteurs sont soit couplés à une protéine G soit porteurs d'une activité enzymatique ou de canal ionique qui permettent l'activation des voies métaboliques de la transduction du signal en réponse à la fixation du ligand), ou un récepteur intracellulaire (ces récepteurs peuvent parfois pénétrer dans le noyau de la cellule pour y moduler l'expression de gènes spécifiques, en réponse à l'activation par le ligand). Le récepteur est de préférence un récepteur de microorganisme, de plante, d’algue, de microalgue, de bactérie, de virus, de parasite, de levure, de champignon, d’insecte, d’animal, ou de tumeur ; de préférence un récepteur d’un pathogène eucaryote ou procaryote, ou d’un cancer ; de préférence un récepteur protéique ou glycoprotéique de bactérie, de virus, de parasite, de levure, de champignon ou de tumeur. Les différentes catégories de récepteurs sont bien connues de l’homme du métier, qui pourra notamment se référer aux ouvrages de référence dans le domaine (tels que Thomas D. Pollard, William C. Earnshaw, Jennifer Lippincott-Schwartz, Graham Johnson Cell Biology E-Book, Elsevier Health Sciences, 1 nov. 2016 ; Mohammed Zourob, Recognition Receptors in Biosensors, DOI 10.1007/978-1 -4419-0919-0, Springer-Verlag New York 2010 ; Abbas, Lichtman, Pillai, Cellular and Molecular Immunology E-Book, Elsevier Health Sciences, 22 août 2014 ; ainsi que les bases de données spécialisées telles que décrites dans Galperin, Fernândez-Suârez, Rigden, The 24th annual Nucleic Acids Research database issue: a look back and upcoming changes, NAR, Volume 45, Issue D1 , January 2017, Pages D1 -D11 ; en particulier la base de données GPCRdb, , telle que décrite dans Isberg V. , Mordalski S., Munk C., Rataj K., Harpsoe K., Hauser A.S., Vroling B., Bojarski A.J., Vriend G., Gloriam D.E.. GPCRdb: an information system for G protein -cou pled receptors. Nucleic Acids Res. 2016 ; 44:D356-D364 (disponible notamment sur le site gpcrdb.org)).
Tel qu'utilisé ici, un "fragment de récepteur" est toute portion d'un récepteur, de préférence à condition que ce fragment/ portion soit capable de se lier spécifiquement à un facteur spécifique (par exemple un ligand, une hormone ou une autre substance). Dans le cas d'un récepteur protéique, le fragment de récepteur comprend de préférence au moins 6 résidus d'acides aminés consécutifs du récepteur (de préférence au moins 8 résidus d'acides aminés consécutifs du récepteur, de préférence au moins 10, de préférence au moins 15, de préférence au moins 20, de préférence au moins 30 résidus d'acides aminés du récepteur). Par « enzyme » on entend une protéine dotée de propriétés catalytiques. Pratiquement toutes les biomolécules capables de catalyser des réactions chimiques dans les cellules sont des enzymes ; certaines biomolécules catalytiques sont cependant constituées d'ARN et sont donc distinctes des enzymes : ce sont les ribozymes. Une enzyme agit en abaissant l'énergie d'activation d'une réaction chimique, ce qui accroît la vitesse de réaction. L'enzyme n'est pas modifiée au cours de la réaction. Les molécules initiales sont les substrats de l'enzyme, et les molécules formées à partir de ces substrats sont les produits de la réaction. Les enzymes sont notamment caractérisées par leur très grande spécificité. De plus, une enzyme a la caractéristique d'être réutilisable.
Les enzymes sont généralement des protéines globulaires qui agissent seules ou en complexes de plusieurs enzymes ou sous-unités. Comme toutes les protéines, les enzymes sont constituées d'une ou plusieurs chaînes polypeptidiques repliées pour former une structure tridimensionnelle correspondant à leur état natif.
Les enzymes sont des molécules bien plus grandes que leurs substrats. Leur taille peut varier d’une cinquantaine-centaine de résidus à plus de 2 000 résidus. Seule une toute petite partie de l'enzyme — entre deux et quatre résidus le plus souvent, parfois plus — est directement impliquée dans la catalyse, ce qu'on appelle le site catalytique (ou domaine catalytique). Ce dernier peut être situé à proximité d'un ou plusieurs sites de liaison, au niveau desquels le(s) substrat(s) est(sont) lié(s) et orienté(s) afin de permettre la catalyse de la réaction chimique. Le site catalytique et les sites de liaison forment le site actif de l'enzyme.
Les enzymes remplissent un grand nombre de fonctions au sein des êtres vivants. Elles peuvent par exemple intervenir dans des mécanismes de transduction de signal et de régulation des processus cellulaires, dans la génération de mouvements, dans le transport actif transmembranaire, dans la digestion, dans le métabolisme, dans le système immunitaire, dans des mécanismes de digestion ou coupure d’acides nucléiques en encore de production d’acides nucléiques (appelées ici « enzymes agissant sur les acides nucléiques »), dans des mécanismes de conversion de prodrogue (conversion de prodrogue en drogue). L’enzyme est de préférence une enzyme procaryote, eucaryote ou virale, de préférence une enzyme d’un animal, d’un végétal, d’une algue, d’une microalgue, d’un insecte, d’un microorganisme, d’une bactérie, d’un parasite, d’une levure, d’un champignon ou d’un virus, de préférence encore une enzyme de mammifère, telle qu’une enzyme humaine. Les différentes catégories d’enzymes sont bien connues de l’homme du métier, qui pourra notamment se référer aux ouvrages de référence dans le domaine (tels que Schomburg D. , Schomburg I., Springer Handbook of Enzymes. 2 edn. Heidelberg: Springer; 2001 -2009 ; Liébecq C., IUPAC-IUBMB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN) and Nomenclature Committee of IUBMB (NC-IUBMB) Biochem. Mol. Biol. Int. 1997;43:1151 -1156; IUBMB (1992), Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego; ainsi que les bases de données spécialisées telles que décrites dans Schomburg D, Schomburg I. Methods Mol Biol. 2010;609:113-28. Enzyme databases ; en particulier la base de données BRENDA (disponible notamment sur le site brenda-enzymes.org), telle que décrite par exemple par Chang A, Schomburg I, Placzek S, Jeske L, Ulbrich M, Xiao M, Sensen CW, Schomburg D, Nucleic Acids Res. 2015 Jan;43. Epub 2014 Nov 5. BRENDA in 2015: exciting developments in its 25th year of existence). Tel qu'utilisé ici, un "fragment d'enzyme" est toute portion d'une enzyme, de préférence à condition que ce fragment/portion soit capable d'avoir une activité enzymatique. Dans le cas d'une enzyme protéique, le fragment enzymatique comprend de préférence au moins 6 résidus d'acides aminés consécutifs de l'enzyme (et est de préférence un site catalytique de l'enzyme) (de préférence au moins 8 résidus d'acides aminés consécutifs de l'enzyme, de préférence au moins 10, de préférence au moins 15, de préférence au moins 20, de préférence au moins 30 résidus d'acides aminés de l'enzyme).
Par « activité enzymatique » ou « activité catalytique » ou encore « activité » d’une enzyme, on entend l’efficacité d’une enzyme à convertir un substrat en produit dans un environnement donné. L’efficacité de l’enzyme prend en compte ici la vitesse de conversion du substrat en produit par l’enzyme et le taux de conversion du substrat en produit par l’enzyme. Par « taux de conversion du substrat en produit par l’enzyme » on entend ici le ratio entre la quantité de produit final obtenu par rapport à la quantité initiale de substrat pour une quantité définie d’enzyme. Par exemple, une activité enzymatique au sens de l’invention peut être exprimée en quantité de phloroglucinol produit dans un volume donné (en g/L).
Par « hormone » on entend une substance chimique biologiquement active, en général synthétisée par une cellule glandulaire (généralement suite à une stimulation) et sécrétée dans le milieu intérieur où elle circule (par voie sanguine, par la lymphe ou par la sève). Elle transmet un message sous forme chimique (en général en agissant sur des récepteurs spécifiques d'une cellule cible) et joue donc un rôle de messager dans l'organisme. Elle est capable d'agir à très faible dose.
L’hormone est avantageusement une hormone végétale ou animale. Les hormones végétales sont également appelées phytohormones ou facteurs de croissance. Elles ont souvent comme fonction d'assurer la croissance de la plante ou sa morphogenèse. Les hormones animales sont dans la plupart des cas produites par le système endocrinien (une glande endocrine ou un tissu endocrinien).
Avantageusement, l’hormone est une hormone de vertébrés, de préférence choisie parmi les classes chimiques suivantes :
Les hormones dérivées d'amines, qui sont constituées d'un seul acide aminé (la tyrosine ou le tryptophane) mais sous une forme dérivée.
Les hormones peptidiques, qui sont des chaînes d'acides aminés, donc des protéines, appelées peptides pour les plus courtes.
Les hormones stéroïdes, qui sont des stéroïdes dérivés du cholestérol.
Les hormones à base de lipides et de phospholipides.
L’hormone est de préférence choisie parmi les hormones peptidiques ou protéiques, les hormones dérivées d’amines, les hormones stéroïdes et les hormones lipidiques. L’hormone est de préférence une hormone d’un animal ou d’un végétal, de préférence une hormone de mammifère, de préférence une hormone humaine. Les différentes catégories d’hormones sont bien connues de l’homme du métier, qui pourra notamment se référer aux ouvrages de référence dans le domaine (tels que Davies P. J. (2010) The Plant Hormones: Their Nature, Occurrence, and Functions. In: Davies P. J. (eds) Plant Hormones. Springer, Dordrecht ; AW Norman, G Litwack, Hormones, Academie Press, 1997; A Kastin, Handbook of biologically active peptides, Academie Press, 2013).
Tel qu'utilisé ici, un "fragment d'hormone" est toute portion d'une hormone, de préférence à condition que ce fragment/portion soit capable de stimuler et/ou d'inhiber un processus biologique. Dans le cas d'une hormone protéique, le fragment d'hormone comprend de préférence au moins 6 résidus d'acides aminés consécutifs de l'hormone (de préférence au moins 8 résidus d'acides aminés consécutifs de l'hormone, de préférence au moins 10, de préférence au moins 15, de préférence au moins 20, de préférence au moins 30 résidus d'acides aminés de l'hormone).
Le terme "ligand" désigne généralement une substance qui se lie à un récepteur d'une cellule et induit un signal biologique. Le terme ligand englobe notamment les termes « signal d’adressage ou de ciblage ou de transport », « molécule de signalisation », « signal », et « signal cellulaire ». Des exemples de ligands comprennent les séquences d’adressage de peptide et de protéine, les oligosaccharides, les molécules permettant le transport et/ou l’internalisation cellulaire, les neurotransmetteurs, les ligands de récepteurs (les récepteurs étant tels que définis ci-dessus), ainsi que les molécules de reconnaissance cellulaire telles que les ligands des récepteurs Toll Like ou les ligands des récepteurs des lectines de type C. Une séquence d'adressage est une courte séquence d'acide aminés, généralement situé à l'extrémité N-terminale de la protéine, servant à désigner les protéines devant être adressées, et indiquer leur destination. Ainsi, le signal d’adressage ou de ciblage ou de transport peut être un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport au/vers le noyau ; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport au/vers le cytoplasme ; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport au/vers le cytosol ; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport à/vers la membrane cellulaire ; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport aux/vers les mitochondries ; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport aux/vers les péroxysomes; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport aux/vers les lysosomes ; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport au/vers le réticulum endoplasmique ; un signal d’adressage ou de ciblage ou de transport des voies de sécrétion ; et un ligand d’un récepteur, de préférence un récepteur membranaire ou transmembranaire, de préférence un récepteur membranaire ou transmembranaire d’une membrane choisie parmi une membrane cellulaire, une membrane extracellulaire, une membrane cytoplasmique ou une membrane nucléaire. Le signal d’adressage ou de ciblage ou de transport peut comprendre au moins : un peptide, une protéine, une glycoprotéine, un sucre, un oside, un lipide, un acide nucléique, ou une combinaison quelconque de ceux-ci. De préférence, le signal d’adressage ou de ciblage ou de transport comprend au moins un peptide, une protéine, une glycoprotéine, ou un acide nucléique. Le signal est de préférence un signal procaryote, eucaryote ou viral, de préférence un signal d’un animal, d’un végétal, d’une algue, d’une microalgue, d’un microorganisme, d’une bactérie, d’un parasite, d’une levure, d’un champignon, d’un insecte, d’un virus, ou d’un cancer ; de préférence encore un signal de mammifère, tel qu’un signal humain. Les différentes catégories de signaux sont bien connues de l’homme du métier, qui pourra notamment se référer aux ouvrages de référence dans le domaine (tels que Thomas D. Pollard, William C. Earnshaw, Jennifer Lippincott-Schwartz, Graham Johnson Cell Biology E-Book, Elsevier Health Sciences, 1 nov. 2016 ; Mohammed Zourob, Recognition Receptors in Biosensors, DOI 10.1007/978-1 -4419-0919-0, Springer-Verlag New York 2010 ; Abbas, Lichtman, Pillai, Cellular and Molecular Immunology E-Book, Elsevier Health Sciences, 22 août 2014).
Un "fragment de ligand" est toute portion d'un ligand, de préférence à condition que ce fragment/ portion soit capable de se lier à un récepteur d'une cellule et d'induire un signal biologique. Dans le cas d'un ligand protéique, le fragment de ligand comprend de préférence au moins 6 résidus d'acides aminés consécutifs du ligand (de préférence au moins 8 résidus d'acides aminés consécutifs du ligand, de préférence au moins 10, de préférence au moins 15, de préférence au moins 20, de préférence au moins 30 résidus d'acides aminés du ligand).
Par « nanoparticule » on entend un objet dont les trois dimensions sont à l'échelle nanométrique, c'est-à-dire une particule dont le diamètre nominal est inférieur à 100 nm environ (par exemple tel que défini par la norme ISO TS/27687).
Par « groupement fonctionnel » ou « groupe fonctionnel » on entend un groupement réactif, c’est à dire possédant la capacité de former au moins une réaction chimique, biologique, biochimique, enzymatique, ou toute combinaison de celles-ci, avec une autre molécule. Par « groupement fonctionnel permettant la liaison à un agent » on entend un groupement fonctionnel possédant la capacité de former au moins une réaction chimique biologique, biochimique, enzymatique, ou toute combinaison de celles-ci, avec un agent (notamment choisi parmi un agent thérapeutique, un agent de ciblage, un agent de marquage, et toute combinaison de ceux-ci).
Le groupement fonctionnel peut par exemple comprendre, ou consister essentiellement en, ou consister en, un peptide étiquette (« peptide tag » en anglais), un groupement chimique (tel qu’une fonction cliquable, un groupement de couplage (« crosslinking group » en anglais), et toute combinaison de ceux-ci), un anticorps, un dérivé d’anticorps, un fragment fonctionnel d’anticorps ou de son dérivé, une étiquette d'affinité (par exemple la biotine, la streptavidine, la protéine de liaison à la chitine (CBP), la protéine de liaison au maltose (MBP), le Strep-tag, la glutathione-S-transférase (GST), le poly(His) tag, etc.), ou toute combinaison de ceux-ci.
Par « fonction cliquable », ou « chimie-click » ou encore « chimie bio-orthogonale rapide », on entend un groupement chimique capable de réagir avec un autre groupement chimique, en l’absence de solvant, à un pH physiologique, sans formation de résidu ou de sous-produit. Des exemples de fonctions cliquables incluent notamment, sans y être limités, les groupements azoture, les groupements alcyne (e.g. acétylène), et toute combinaison de ceux-ci. La fonction cliquable peut notamment être choisie parmi un groupement N-hydroxysuccinimide (NHS), dibenzocyclooctyne (DBCO), tétrazine, méthyl-tétrazine, et toute combinaison de ceux-ci.
Tel qu'utilisé ici, les termes « peptide étiquette », ou "étiquette peptidique", ou « peptide tag », se réfèrent à une séquence peptidique comprise entre 6 et 400 acides aminés (de préférence entre 8 et 300 acides aminés, plus préférablement entre 10 et 200 acides aminés, plus préférablement entre 12 et 82 acides aminés). Parmi les exemples d'étiquettes peptidiques, on peut citer les étiquettes peptidiques d'affinité, les étiquettes peptidiques de solubilisation, les étiquettes peptidiques de chromatographie, les étiquettes peptidiques d'épitope, les étiquettes peptidiques de fluorescence, etc. Les étiquettes peptidiques d'affinité sont généralement ajoutées aux protéines afin qu'elles puissent être purifiées à partir de leur source biologique brute à l'aide d'une technique d'affinité. Il s'agit notamment de la protéine de liaison à la chitine (CBP), de la protéine de liaison au maltose (MBP), du Strep-tag, de la glutathione-S-transférase (GST), du poly(His) tag, etc. Les étiquettes peptidiques de solubilisation sont particulièrement utilisées pour les protéines exprimées dans des espèces déficientes en chaperons, comme E. coli, pour aider au repliement correct des protéines et les empêcher de précipiter. Il s'agit notamment de la thiorédoxine (TRX) et du poly(NANP). Certaines étiquettes peptidiques d'affinité ont un double rôle d'agent de solubilisation, comme la MBP et la GST. Les étiquettes chromatographiques sont utilisées pour modifier les propriétés chromatographiques de la protéine afin de permettre une résolution différente dans une technique de séparation particulière. Elles consistent souvent en des acides aminés polyanioniques, comme le FLAG-tag. Les étiquettes épitopes sont de courtes séquences peptidiques choisies parce que des anticorps de haute affinité peuvent être produits de manière fiable dans de nombreuses espèces différentes. Elles sont généralement dérivées de gènes viraux. Les étiquettes épitopes comprennent l'étiquette ALFA, l'étiquette V5, l'étiquette Myc, l'étiquette HA, l'étiquette Spot, l'étiquette T7, l'étiquette NE, etc. Les étiquettes de fluorescence sont notamment utilisées pour donner une lecture visuelle d'une protéine. La GFP et ses variantes sont les étiquettes de fluorescence les plus couramment utilisés. Les peptides étiquettes peuvent permettre une modification enzymatique spécifique (comme la biotinylation par la biotine ligase) ou une modification chimique (comme la réaction avec FlAsH-EDT2 pour l'imagerie par fluorescence). Les peptides étiquettes peuvent être combinés, notamment afin de relier les protéines à plusieurs autres composants. Les étiquettes peptidiques comprennent également les étiquettes peptidiques covalentes. Des exemples de peptides étiquettes covalents incluent, mais ne sont pas limités à :
Isopeptag (se liant de manière covalente à la protéine pilin-C); SpyTag (se liant de manière covalente à la protéine SpyCatcher) ; SnoopTag (se liant de manière covalente à la protéine SnoopCatcher) ;
SnoopTagJr (se liant de manière covalente à la protéine SnoopCatcher ou à la protéine DogTag (medié par la SnoopLigase)) ;
DogTag (se liant de manière covalente à la protéine SnoopTagJr, médié par la SnoopLigase), SdyTag (se liant de manière covalente à la protéine SdyCatcher) ;
Tout variant de ceux-ci.
Les variants des peptides étiquettes sont bien décrits dans la littérature, sont disponibles pour la personne de métier et n'ont pas besoin d'être décrits en détail dans le présent document.
Par "maladie" ou « affection » ou "trouble" ou "pathologie" (ces termes sont ici considérés comme étant synonymes), on entend une altération des fonctions ou de la santé d'un organisme vivant. Il s'agit aussi bien de la maladie, se référant à l'ensemble des altérations de santé, que d'une maladie, qui désigne alors une entité particulière caractérisée par des causes, des symptômes, une évolution et des possibilités thérapeutiques propres.
Par "prévention" ou "prévention d'une maladie" ou "prévention de l'apparition d'une maladie" on entend la réduction du risque d'apparition, de développement ou d'amplification d'une maladie, des causes d'une maladie, des symptômes d'une maladie, des effets (ou conséquences, de préférence les effets/conséquences néfastes, délétères) d'une maladie, ou toute combinaison de ceux-ci ; et/ou retarder l'apparition, le développement ou l'amplification d'une maladie, les causes d'une maladie, les symptômes d'une maladie, les effets (ou les conséquences, de préférence les effets/conséquences délétères) d'une maladie, ou toute combinaison de ceux-ci. La prévention comprend notamment les traitements préventifs.
Par "traitement" ou "traitement d'une maladie" on entend la réduction, l'inhibition et/ou la disparition d'une maladie, des causes d'une maladie, des symptômes d'une maladie, des effets (ou conséquences, de préférence les effets/conséquences nocifs, délétères) d'une maladie, ou toute combinaison de ceux-ci. Le traitement est de préférence un traitement curatif.
Un "traitement" ou une "thérapie" comprend, sans s'y limiter, une ou plusieurs molécules et/ou des médicaments (y compris tout type de molécule ou de médicament, comme les composés chimiques ou biologiques, les anticorps, les antigènes, la thérapie génique, la thérapie cellulaire, l'immunothérapie, la chimiothérapie, toute combinaison de ceux-ci, etc.), et/ou d'autres traitements (tels que la radiothérapie, l'immunothérapie, la chimiothérapie, la chirurgie, l'endoscopie, la radiologie interventionnelle, l'oncologie physique, la photothérapie, la luminothérapie, l'ultrasonothérapie, la thermothérapie, la cryothérapie, l'électrothérapie, l'électroconvulsivothérapie, l'oxygénothérapie, la ventilation assistée, le massage hydrothérapeutique, la transplantation d'organes/de tissus/de fluides, l'implantation, et toute combinaison de ceux-ci, etc.) Une thérapie peut être administrée par différents modes d'administration. L'homme du métier sait comment sélectionner le ou les modes d'administration les plus appropriés en fonction de la thérapie, de la maladie et du sujet à traiter. Par exemple, les modes d'administration comprennent, sans s'y limiter, l'administration orale, l'administration par injection dans une veine (intraveineuse, IV), dans un muscle (intramusculaire, IM), dans l'espace autour de la moelle épinière (intrathécale), sous la peau (sous-cutanée, sc) ; administration sublinguale ; administration buccale ; administration rectale ; administration vaginale ; voie oculaire ; voie otique ; administration nasale ; par inhalation ; par nébulisation ; administration cutanée, topique ou systémique ; administration transdermique.
"Médicament" ou "drogue" désigne toute substance ou composition présentée comme ayant des propriétés curatives ou préventives à l'égard des maladies humaines ou animales. Un médicament comprend donc toute substance ou composition pouvant être utilisée chez l'homme ou l'animal ou administrée à ceux-ci dans le but d'établir un diagnostic médical ou de restaurer, corriger ou modifier leurs fonctions physiologiques en exerçant une action pharmacologique, immunologique ou métabolique. Le terme médicament inclut notamment les vaccins.
Les termes "thérapeutique" ou "utilisations thérapeutiques" dans le contexte de la présente invention couvrent les utilisations "prévention", "traitement" et "vaccin".
Une "quantité thérapeutiquement efficace" correspond à la quantité de chaque entité active qui est suffisante pour produire un résultat bénéfique pour la santé. Une "quantité immunologiquement efficace" correspond à la quantité de chaque entité active qui est suffisante pour produire une réponse immunitaire détectable. L’entité active est par exemple un principe actif, un agent thérapeutique, un agent de ciblage, un agent de marquage, ou toute combinaison de ceux-ci.
Tel qu'utilisé ici, un "excipient pharmaceutiquement acceptable" ou « support pharmaceutiquement acceptable" est destiné à inclure tous les supports, solvants, diluants, excipients, adjuvants, véhicules, milieux de dispersion, enrobages, agents antibactériens et antifongiques, et agents retardateurs d'absorption, et autres, compatibles avec l'administration chez un sujet notamment chez un animal, et en particulier chez l'homme. Les supports appropriés pour une utilisation dans le présent document sont bien connus de l'art (voir par exemple l'édition la plus récente de Remington : The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Lippincott, Williams&Wilkins). Des exemples non limitatifs d’excipients comprennent l'eau, le NaCl, les solutions salines, les solutions de saccharides (par exemple le glucose, le tréhalose, le saccharose, le dextrose, etc.), le Ringer lacté, les alcools, les huiles, les gélatines, les hydrates de carbone tels que le lactose, l'amylose ou l'amidon, les esters d'acides gras, l'hydroxyméthycellulose, etc. On peut notamment citer comme adjuvant les agents de gonflement comme par exemple un sucre tel que le lactose, le saccharose, le tréhalose, le sorbitol, le glucose, le raffinose, le mannitol, de préférence le lactose, le saccharose, le tréhalose, le glucose, ou le mannitol, un acide aminé tel que l’arginine, la glycine, ou I’ histidine, de préférence la glycine, ou des polymères de type dextrane ou polyéthylène glycol, ou leurs mélanges.
Par « sujet » ou « patient », on entend un individu humain ou un animal différent d’un humain. Le sujet est par exemple un humain ou un animal susceptible de contracter une maladie, susceptible d’être atteint d’une maladie, ou souffrant d’une maladie. Le sujet est de préférence un être humain. Le sujet peut être un enfant (sujet humain âgé de 16 ans ou moins) ou un adulte (sujet humain âgé de plus de 16 ans). Par « sujet sain » on entend un sujet qui ne souffre pas de la maladie considérée. Dans le cadre de la présente invention, un sujet sain est de préférence un sujet qui ne souffre d’aucune maladie. Par « sujet de référence » on entend un sujet qui souffre d’une maladie connue, à un stade connu.
Par "échantillon biologique" ou "prélèvement" d’un sujet, on entend un organe entier ou un tissu ou une partie d’un tel organe ou tissu, un fluide ou une fraction d’un tel fluide, des cellules ou des composants cellulaires, obtenus de ce sujet, ainsi qu’un homogénat, un lysat ou un extrait préparé à partir de ceux-ci. En particulier, un "échantillon biologique" ou "prélèvement" est de préférence tout tissu (de préférence des portions ou fractions de celui-ci) qui peut servir à détecter une maladie, y compris, mais sans s'y limiter, du plasma, du sang, de la lymphe, du sérum, de l’urine, du mucus, de la salive, un échantillon du système nerveux central (SNC ; tel qu'un échantillon de cerveau ou un échantillon de moelle épinière, etc.), un échantillon de voie respiratoire (tel qu’un échantillon de poumon, etc.), un échantillon de glandes salivaires, un échantillon nasopharyngé, un échantillon oropharyngé, un échantillon du système digestif (par exemple de colon, d’intestin, etc.), un échantillon de peau, un échantillon d’organe (par exemple de foie, de rein, de rate, etc.), etc.
L'échantillon biologique peut avoir été préalablement obtenu par toute technique connue dans la profession. Ces techniques comprennent, par exemple, le prélèvement à l’aide d’un écouvillon, d’une aiguille ou d’une seringue, la chirurgie (telle que la chirurgie stéréotaxique), la ponction, l'explant, l'excision, la biopsie. Par "excision", on entend une procédure chirurgicale consistant à couper (exciser) une partie plus ou moins large ou profonde du tissu, de préférence une anomalie ou une croissance du tissu. Une excision peut être pratiquée pour enlever et/ou analyser une tumeur cancéreuse ou suspecte. Le terme "biopsie" désigne ici un échantillon de cellules ou de tissus prélevé pour analyse. Plusieurs types de procédures de biopsie sont connus et pratiqués sur le terrain. Les types les plus courants comprennent (1 ) la biopsie incisionnelle, dans laquelle seul un échantillon du tissu est prélevé ; (2) la biopsie excisionnelle (ou biopsie chirurgicale), qui consiste à retirer totalement une masse tumorale, réalisant ainsi une procédure thérapeutique et diagnostique ; et (3) la biopsie à l'aiguille, dans laquelle un échantillon de tissu est prélevé à l'aide d'une aiguille, qui peut être grosse ou fine. D'autres types de biopsie existent, comme les frottis ou le curetage, et peuvent également être utilisés pour obtenir l'échantillon. Par conséquent, l'échantillon peut être, par exemple, un expiant, une excision, une biopsie, etc. L'échantillon est de préférence obtenu par une procédure peu invasive, telle que la chirurgie stéréotaxique.
Dans la description détaillée qui suit, les modes de réalisation peuvent être pris seuls ou dans toute combinaison appropriée par l'homme du métier, et les définitions ci-dessus s'appliquent à tous les modes de réalisation décrits ci-dessous ainsi qu’à leurs combinaisons.
Microbulle lipidique
Dans le cadre de la présente invention, les Inventeurs ont mis au point des microbulles innovantes, capables de délivrer dans l’organisme des agents d’intérêt de manière précise et ciblée.
Les Inventeurs ont notamment montré que, de manière surprenante, les microbulles lipidiques ainsi mises au point possèdent une stabilité significativement améliorée, à la différence des microbulles décrites dans l’art antérieur. De façon remarquable, les données révèlent également que ces microbulles optimisées sont capables de délivrer différents types d’agent thérapeutiques, d’agents de ciblage et/ou d’agents de marquage, y compris des acides nucléiques, de manière plus efficace que les microbulles décrites dans l’art antérieur. Ces microbulles sont notamment capables de traverser de façon active les vaisseaux, la barrière hématoencéphalique (BHE), ou encore le microenvironnement tumoral. Les Inventeurs ont également démontré que l’application localisée d’ultrasons permet de cibler ces microbulles optimisées de manière très précise vers la zone à traiter. Ces données révèlent ainsi le potentiel thérapeutique de ces microbulles lipidiques pour traiter de nombreuses pathologies de manière ciblée, y compris des pathologies du système nerveux central, des pathologies des vaisseaux, des tumeurs, des cancers.
Les données montrent également que ces microbulles optimisées sont des outils de marquage, de détection et d’imagerie.
Cette grande flexibilité est notamment liée à la formulation originale des microbulles qui consiste en l'utilisation d'un mélange de molécules cationiques telles que des lipophosphoramidates et/ou de la polyethyleimine histidylée.
La présente invention concerne donc une microbulle lipidique, comprenant, ou consistant essentiellement en, ou consistant en, au moins un composé cationique choisi parmi les lipophosphoramidates, les polyéthylénimines histidylées, et tout mélange de ceux-ci. Avantageusement, l’enveloppe de la microbulle lipidique comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en, au moins un composé cationique choisi parmi les lipophosphoramidates, les polyéthylénimines histidylées, et tout mélange de ceux-ci. Ainsi, selon un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne une microbulle lipidique ayant une enveloppe comprenant, ou consistant essentiellement en, ou consistant en, au moins un composé cationique choisi parmi les lipophosphoramidates, les polyéthylénimines histidylées, et tout mélange de ceux-ci. La microbulle lipidique selon l’invention peut notamment être un agent de contraste ultrasonore.
Selon un mode de réalisation préféré, la microbulle selon l’invention comprend en outre au moins un agent choisi parmi un agent thérapeutique/pharmacologique, un agent de ciblage, un agent de marquage, et toute combinaison de ceux-ci.
L’agent thérapeutique/pharmacologique, l’agent de ciblage, l’agent de marquage, et leur combinaison est (sont) de préférence : i. exposé à la surface de la microbulle, ou ii. enchâssé dans l’enveloppe lipidique de la microbulle, ou iii. incorporé à l’intérieur de la microbulle, ou iv. toute combinaison de i à iii.
L’agent thérapeutique/pharmacologique, l’agent de ciblage, et l’agent de marquage, sont avantageusement tels que définis dans la section « Définitions » ci-dessus.
Selon un mode de réalisation, ledit au moins un agent comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en, ou est(sont) choisi(s) parmi :
1 ) un acide nucléique ; 2) un actif liposoluble ;
3) un agent chimio-thérapeutique, tel qu’un agent cytotoxique et/ou un agent cytostatique ;
4) un anticorps ;
5) une protéine ;
6) un antigène ;
7) une toxine ;
8) un récepteur
9) une enzyme ;
10) une hormone ;
11 ) un ligand ;
12) un vecteur viral ;
13) une nanoparticule, comprenant de préférence au moins un agent choisi parmi un agent thérapeutique, un agent de ciblage, un agent de marquage, et toute combinaison de ceux- ci ;
14) tout dérivé de 1 ) à 13), de préférence tout dérivé fonctionnel de ceux-ci ;
15) tout fragment de 1 ) à 14), de préférence tout fragment fonctionnel de ceux-ci ; et
16) toute combinaison de 1 ) à 15).
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, ledit au moins un agent comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en, ou est(sont) choisi(s) parmi : a) un acide nucléique ; b) un actif liposoluble ; c) un agent chimio-thérapeutique, tel qu’un agent cytotoxique et/ou un agent cytostatique ; d) un anticorps ; e) un dérivé d’anticorps ; f) un fragment fonctionnel d’anticorps ou de son dérivé ; g) une protéine ; h) un fragment de protéine, tel qu’un peptide (e.g. un peptide de pénétration cellulaire (CPP pour « Cell penetrating peptide »), un antigène, un épitope, un domaine fonctionnel de protéine, etc ; i) une nanoparticule, comprenant de préférence (pouvant en outre comprendre) au moins un agent choisi parmi un agent thérapeutique, un agent de ciblage, un agent de marquage, et toute combinaison de ceux-ci (notamment un agent hydrophile/non liposoluble); et j) toute combinaison de a) à i).
Les différents types d’agents 1 ) à 16), et a) à i), tels que listés ci-dessus, sont avantageusement tels que définis dans la section « Définitions » ci-dessus.
De préférence, l’acide nucléique 1 ) et/ou a) comprend, consiste essentiellement en, ou consiste en, un plasmide, un vecteur, un ADN complémentaire (ADNc), un ADN simple brin, un ADN double brin, un ADN comprenant une séquence codant un gène ou un fragment de gène, un ADN codant un gène ou un fragment de gène (de préférence un fragment fonctionnel), un ARN, un ARN double brin, un ARN messager, un ARN non codant, un petit ARN, etc.
De préférence, l’agent chimio-thérapeutique 3) ou c) est choisi parmi les agents cytotoxiques, les agents cytostatiques, et les agents cytotoxiques et cytostatiques. L’agent chimio-thérapeutique peut notamment être choisi, sans y être limité, parmi le paclitaxel, la doxorubicine, la gencitabin (e.g. Gemzar), le témozolomide, etc.
L’agent de ciblage peut en particulier comprendre, consister essentiellement en, ou consister en, un anticorps, un dérivé d’anticorps, un fragment fonctionnel d’anticorps ou de son dérivé, une protéine, un fragment de protéine (tel qu’un peptide, un antigène, un épitope, un domaine fonctionnel de protéine, etc.), une nanoparticule (pouvant en outre comprendre au moins un agent thérapeutique, notamment un agent thérapeutique hydrophile), et toute combinaison de ceux-ci.
Selon un mode de réalisation avantageux, la microbulle selon l’invention comprend en outre au moins un groupement fonctionnel, notamment un groupement fonctionnel permettant la liaison à au moins un agent choisi parmi un agent thérapeutique, un agent de ciblage, un agent de marquage, et toute combinaison de ceux-ci. Ledit groupement est de préférence : i. exposé à la surface de la microbulle, ou ii. enchâssé dans l’enveloppe lipidique de la microbulle, ou iii. incorporé à l’intérieur de la microbulle, ou iv. toute combinaison quelconque de i à iii.
Le groupement fonctionnel est avantageusement tel que défini dans la section « Définitions » ci- dessus.
Avantageusement, le groupement fonctionnel comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en, ou est choisi parmi : a) un peptide étiquette ; b) un groupement chimique, de préférence choisi parmi une fonction cliquable, un groupement de couplage, et toute combinaison de ceux-ci ; c) un anticorps ; d) un dérivé d’anticorps ; e) un fragment fonctionnel d’anticorps ou de son dérivé ; f) une étiquette d'affinité (par exemple la biotine, la streptavidine, la protéine de liaison à la chitine (CBP), la protéine de liaison au maltose (MBP), le Strep-tag, la glutathione-S- transférase (GST), le poly(His) tag, etc.) ; et g) toute combinaison de a) à f).
Selon un mode de réalisation, le lipophosphoramidate comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en, ou est choisi dans le groupe constitué par, un dimyristoyl phosphoramidate (choisi de préférence parmi un dimyristoyl bromure phosphoramidate (de préférence 0,0-dimyristoyl-N-[3N-(N méthylimidazolium bromure) propylene] phosphoramidate (composé KLN27)), un dimyristoyl histamine phosphoramidate (de préférence 0,0-dimyristoyl(-N-(histamine)phosphoramidate (composé MM30)), et toute combinaison de ceux-ci), un dioleyl phosphoramidate (choisi de préférence dans le groupe des dioleyl méthylimidazolium phosphoramidates (de préférence 0,0-dioleyl-N-(3 N- (N-methylimidazolium iodide) propylene) phosphoramidate (composé KLN25)), un dipalmitoyl phosphoramidate, un disteraoyl phosphoramidate, et tout mélange de ceux-ci.
Selon un mode de réalisation, la polyéthylénimine histidylée est couplée à un acide gras, choisi de préférence parmi l’acide stéarique, l’acide myristique, l’acide palmitique, l’acide oléique, et toute combinaison de ceux-ci.
Avantageusement, la microbulle comprend en outre (en particulier l’enveloppe de la microbulle comprend en outre) un lipide additionnel choisi parmi une dimyristoyl-glycéro-phosphocholine (de préférence la 1 ,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DMPC)), une distéaroyl-glycéro- phosphocholine (de préférence la 1 ,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)), une dimyristoyl-glycéro-phosphoéthanolamine-(polyéthylène glycol) (de préférence la 1 ,2-dimyristoyl-sn- glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[methoxy(polyéthylène glycol)-2000] (DMPE-PEG2000)), une distéaroyl-glycéro-phosphoéthanolamine-(polyéthylène glycol) (de préférence la 1 ,2-distearoyl-sn- glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000)), et une distéaroyl-glycéro-phosphoéthanolamine-[biotinyl(polyéthylène glycol)] (de préférence la 1 ,2- distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[biotinyl(polyéthylène glycol)-2000] (DSPE-PEG2000- biotin)), un cholestérol, un beta-sitostérol, un 1 ,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), un 1 -oleoyl-2-[6-[(7-nitro-2-1 ,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl]-3-trimethylammonium propane (DOTAP), un 1 ,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (DMG- PEG2000), et toute combinaison de ceux-ci. Selon un mode de réalisation préféré, la microbulle contient en outre un gaz biocompatible. Le gaz biocompatible est de préférence contenu par l’enveloppe de la microbulle (il est donc à l’intérieur de la microbulle, dans le milieu/la cavité formé(e) par l’enveloppe). Le gaz biocompatible est de préférence choisi parmi un perfluorobutane (C4F10), un perfluoropropane (C3F8), le diazote (N2), un hexafluorure de soufre (SF6), un oxyde d’azote (NO), l’hydrogène, le dioxygène, l’hélium, le xénon, l’argon, le protoxyde d’azote (N20), et tout mélange de ceux-ci ; de préférence encore choisi parmi un perfluorobutane (C4F10), un perfluoropropane (C3F8), le diazote (N2), un hexafluorure de soufre (SF6), le dioxygène, le protoxyde d’azote (N20), et tout mélange de ceux-ci. De manière particulièrement préférée, le gaz est choisi dans le groupe des perfluorobutanes (C4F10).
Les données obtenues par les Inventeurs révèlent que les microbulles selon l’invention, telles que définies ci-dessus, sont, de façon remarquable, capables de traverser activement les vaisseaux, la barrière hématoencéphalique (BHE) et/ou le microenvironnement tumoral (notamment lors de l’application localisée d’ultrasons). Les Inventeurs ont également démontré que l’application localisée d’ultrasons permet de cibler ces microbulles de manière très précise vers la zone à traiter, y compris des zones difficiles d’accès telles que le système nerveux central, les vaisseaux, et le microenvironnement tumoral. De plus, les données montrent également que ces microbulles optimisées sont capables de délivrer efficacement différents types d’agent thérapeutiques, d’agents de ciblage et/ou d’agents de marquage, y compris des acides nucléiques, dans ces zones difficiles d’accès.
Ainsi, selon un mode de réalisation avantageux, la microbulle selon l’invention est caractérisée en ce qu’elle est capable de franchir la barrière hématoencéphalique de façon active et/ou le microenvironnement tumoral de façon active (notamment lors de l’application localisée d’ultrasons).
Méthodes de production d’une microbulle lipidique
La présente invention se rapporte également à une méthode de production d’au moins une microbulle selon l’invention, telle que décrite ci-dessus, comprenant, ou consistant essentiellement en, ou consistant en, les étapes suivantes : a) Mélange, dans un récipient, de composés cationiques choisis parmi les lipophosphoramidates, les polyéthylénimines histidylées, et les mélanges quelconques de ceux-ci ; d’éthanol; et optionnellement d’au moins un agent choisi parmi un agent thérapeutique, un agent de ciblage, un agent de marquage, et toute combinaison de ceux-ci ; b) Evaporation du mélange obtenu à l’étape a) pour obtenir un film lipidique et réhydratation du film lipidique pour former une suspension liposomale ; l’intégralité de cette étape pouvant également être réalisée par microfluidique ; c) Lyophilisation de la suspension liposomale obtenue à l’étape b) ; d) Remplacement de l’air contenu dans le récipient contenant le lyophilisât obtenu à l’étape c), par un gaz biocompatible, le gaz étant de préférence choisi parmi un perfluorobutane (C4F10), un perfluoropropane (C3F8), le diazote (N2), un hexafluorure de soufre (SF6), un oxyde d’azote (NO), l’hydrogène, le dioxygène, l’hélium, le xénon, l’argon, le protoxyde d’azote (N20), et tout mélange de ceux-ci; e) Réhydratation du lyophilisât de l’étape d) pour obtenir une solution; f) Agitation de la solution obtenue à l’étape d) pour former des microbulles ; g) Optionnellement, fonctionnalisation des microbulles par au moins un agent choisi parmi un agent thérapeutique, un agent de ciblage, un agent de marquage, et toute combinaison de ceux-ci; et/ou fonctionnalisation des microbulles par l’ajout au moins un groupement fonctionnel permettant la liaison à au moins un agent choisi parmi un agent thérapeutique, un agent de ciblage, un agent de marquage, et toute combinaison de ceux-ci.
La microbulle et ses constituants, tels que le lipophosphoramidate, la polyéthylénimine histidylée, l’agent thérapeutique, l’agent de ciblage, l’agent de marquage, le gaz biocompatible, sont avantageusement tels que décrits dans les sections précédentes (dans la section « Définition » et/ou « Microbulle lipidique »).
L’invention concerne en outre une microbulle susceptible d’être obtenue, ou obtenue, ou directement obtenue, par la méthode de production décrite ci-dessus.
Compositions et kits
La présente invention concerne en outre un kit comprenant, ou consistant essentiellement en, au moins une microbulle selon l’invention, telle que définie ci-dessus.
La présente invention concerne également une composition comprenant, ou consistant essentiellement en, ou consistant en, au moins une microbulle selon l’invention, telle que définie ci- dessus, et, optionnellement, un excipient.
La présente invention concerne notamment une composition pharmaceutique comprenant, ou consistant essentiellement en, ou consistant en, au moins une microbulle selon l’invention, telle que définie ci-dessus, et, optionnellement, un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Avantageusement, la composition, notamment la composition pharmaceutique, comprend une quantité thérapeutiquement efficace de microbulle. La concentration en microbulles dans la composition, notamment la composition pharmaceutique, va de préférence de 106 à 1014 microbulles/ml, de préférence encore de 107 à 1013 microbulles/ml, de préférence encore de 108 à 1012 microbulles/ml, de préférence encore de 109 à 1011 microbulles/ml, de préférence encore la concentration en microbulles dans la composition étant d’environ 1O10 microbulles/ml. Selon un mode de réalisation, la composition, notamment la composition pharmaceutique, comprend une quantité d’excipient pharmaceutiquement acceptable dans la composition qui va de 5% à 99% en poids par rapport au poids total de la composition, de préférence de 10 à 97% en poids, de préférence de 20 à 95% en poids, de préférence de 30 à 90% en poids, de préférence de 40 à 85% en poids, de préférence de 50 à 80% en poids, de préférence de 60 à 70 % en poids, par rapport au poids total de la composition.
Selon un mode de réalisation, le kit, comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en : a) au moins une microbulle selon l’invention (telle que définie ci-dessus) ou une composition telle que définie ci-dessus, notamment une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans un premier récipient ; b) au moins un agent thérapeutique, dans un second récipient ; c) optionnellement, au moins un agent de ciblage dans un troisième récipient ; d) optionnellement, au moins un agent de marquage dans un quatrième récipient ; et e) optionnellement, des instructions de préparation et/ou d’utilisation.
Avantageusement, le kit comprend en outre des moyens adaptés pour la détection de la présence ou de l’absence de l’agent de marquage dans un échantillon et/ou dans un sujet.
La microbulle et ses constituants, tels que le lipophosphoramidate, la polyéthylénimine histidylée, l’agent thérapeutique, l’agent de ciblage, l’agent de marquage, le gaz biocompatible, sont avantageusement tels que décrits dans les sections précédentes (dans la section « Définition », et/ou « Microbulle lipidique », et/ ou « Méthodes de production d’une microbulle lipidique »).
Ainsi, de préférence, l’agent thérapeutique et/ou l’agent de ciblage et/ou l’agent de marquage comprend, consiste essentiellement en, ou consiste en, ou est choisi parmi :
1 ) un acide nucléique ;
2) un actif liposoluble ;
3) un agent chimio-thérapeutique, tel qu’un agent cytotoxique et/ou un agent cytostatique ;
4) un anticorps ;
5) une protéine ;
6) un antigène ;
7) une toxine ;
8) un récepteur 9) une enzyme ;
10) une hormone ;
11 ) un ligand ;
12) Un vecteur viral ;
13) une nanoparticule, comprenant de préférence au moins un agent choisi parmi un agent thérapeutique, un agent de ciblage, un agent de marquage, et toute combinaison de ceux- ci ;
14) tout dérivé de 1 ) à 13), de préférence tout dérivé fonctionnel de ceux-ci ;
15) tout fragment de 1 ) à 14), de préférence tout fragment fonctionnel de ceux-ci ; et
16) toute combinaison de 1 ) à 15) ; de préférence encore parmi un acide nucléique, un actif liposoluble, un agent chimio-thérapeutique, un anticorps, un dérivé d’anticorps, un fragment fonctionnel d’anticorps ou de son dérivé, une protéine, un fragment de protéine, une nanoparticule, et toute combinaison de ceux-ci.
Utilisations et Méthodes thérapeutiques
Les Inventeurs ont notamment montré que, de manière surprenante, les microbulles innovantes ici mises au point possèdent la capacité de délivrer dans l’organisme des agents d’intérêt de manière précise et ciblée, y compris dans des zones très difficiles d’accès telles que le système nerveux central, les vaisseaux, et le microenvironnement tumoral. En effet, les Inventeurs ont notamment montré que, de manière surprenante, les microbulles lipidiques sont significativement plus stables que les microbulles de l’art antérieur. Elles sont notamment capables de traverser de façon active les vaisseaux, la barrière hématoencéphalique (BHE), ou encore le microenvironnement tumoral. Les Inventeurs ont également démontré que l’application localisée d’ultrasons permet de cibler ces microbulles optimisées de manière très précise vers la zone à traiter. Ces données révèlent ainsi le potentiel thérapeutique de ces microbulles lipidiques pour traiter de nombreuses pathologies de manière ciblée, y compris des pathologies du système nerveux central.
Les données montrent également que ces microbulles optimisées sont des outils de marquage, de détection et d’imagerie.
La présente invention fournit donc à la fois des méthodes de traitement puissant et à spectre large de pathologies, ainsi que des méthodes de marquage, pour l’imagerie médicale notamment.
La présente invention concerne donc une microbulle selon l’invention (telle que définie ci-dessus) ; ou une composition pharmaceutique ou un kit comprenant, ou consistant essentiellement en, au moins une microbulle selon l’invention (telle que définie ci-dessus) ; ou une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus ; ou un kit tel que défini ci-dessus ; ou toute combinaison de ceux-ci ; pour son utilisation comme médicament. La présente invention porte également sur une microbulle selon l’invention (telle que définie ci- dessus) ; ou une composition pharmaceutique ou un kit comprenant, ou consistant essentiellement en, au moins une microbulle selon l’invention (telle que définie ci-dessus) ; ou une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus ; ou un kit tel que défini ci-dessus ; ou toute combinaison de ceux-ci ; pour son utilisation comme agent de marquage, notamment comme agent de contraste.
La présente invention concerne également l’utilisation d’une microbulle selon l’invention (telle que définie ci-dessus) ; ou d’une composition pharmaceutique ou d’un kit comprenant, ou consistant essentiellement en, au moins une microbulle selon l’invention (telle que définie ci-dessus) ; ou une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus ; ou un kit tel que défini ci-dessus ; ou toute combinaison de ceux-ci ; comme médicament.
La présente invention porte également sur l’utilisation d’une microbulle selon l’invention (telle que définie ci-dessus) ; ou d’une composition pharmaceutique ou d’un kit comprenant, ou consistant essentiellement en, au moins une microbulle selon l’invention (telle que définie ci-dessus) ; ou une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus ; ou un kit tel que défini ci-dessus ; ou toute combinaison de ceux-ci ; comme agent de marquage, notamment comme agent de contraste.
La présente invention concerne également l’utilisation d’une microbulle selon l’invention (telle que définie ci-dessus) ; ou d’une composition pharmaceutique ou d’un kit comprenant, ou consistant essentiellement en, au moins une microbulle selon l’invention (telle que définie ci-dessus) ; ou une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus ; ou un kit tel que défini ci-dessus ; ou toute combinaison de ceux-ci ; pour la fabrication d’un médicament.
La présente invention se rapporte également à l’utilisation d’une microbulle selon l’invention (telle que définie ci-dessus) ; ou d’une composition pharmaceutique ou d’un kit comprenant, ou consistant essentiellement en, au moins une microbulle selon l’invention (telle que définie ci-dessus) ; ou une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus ; ou un kit tel que défini ci-dessus ; ou toute combinaison de ceux-ci ; pour la fabrication d’un agent de marquage, notamment un agent de contraste.
La présente invention concerne également une méthode de traitement, comprenant l’administration d’une microbulle selon l’invention (telle que définie ci-dessus) ; ou d’une composition pharmaceutique ou d’un kit comprenant, ou consistant essentiellement en, au moins une microbulle selon l’invention (telle que définie ci-dessus) ; ou une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus ; ou un kit tel que défini ci-dessus ; ou toute combinaison de ceux-ci ; à un sujet (de préférence un sujet en ayant besoin).
La présente invention se rapporte également à une méthode de marquage, comprenant l’administration d’une microbulle selon l’invention (telle que définie ci-dessus) ; ou d’une composition pharmaceutique ou d’un kit comprenant, ou consistant essentiellement en, au moins une microbulle selon l’invention (telle que définie ci-dessus) ; ou une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus ; ou un kit tel que défini ci-dessus ; ou toute combinaison de ceux-ci ; à un sujet (de préférence un sujet en ayant besoin).
La microbulle et ses constituants, tels que le lipophosphoramidate, la polyéthylénimine histidylée, l’agent thérapeutique, l’agent de ciblage, l’agent de marquage, le gaz biocompatible, sont avantageusement tels que décrits dans les sections précédentes (dans la section « Définition », et/ou « Microbulle lipidique », et/ ou « Méthodes de production d’une microbulle lipidique »).
Avantageusement, la composition pharmaceutique et/ou le kit sont tels que décrits ci-dessus dans la section « Compositions et kits ».
Selon un mode de réalisation préféré, la microbulle, la composition, le kit, ou toute combinaison de ceux-ci, est(sont) administré(s) à un sujet en ayant besoin, de préférence en une quantité thérapeutiquement efficace.
La pathologie à traiter par l’administration de la microbulle, la composition, le kit, ou toute combinaison de ceux-ci (dans le cadre des utilisations et des méthodes de traitement susmentionnées) peut être de tout type. La pathologie peut notamment être choisie parmi les pathologies des vaisseaux, les pathologies du système nerveux central, les tumeurs, les cancers, et toute combinaison de ceux-ci.
La zone à marquer par l’administration de la microbulle, la composition, le kit, ou toute combinaison de ceux-ci (dans le cadre des utilisations et des méthodes de traitement susmentionnées) peut être de tout type. La zone à marquer peut être n’importe quelle partie du corps du sujet à traiter et/ou marquer. La zone à marquer peut notamment être choisie parmi une zone des vaisseaux, une zone du système nerveux central, une zone du microenvironnement tumoral, et toute combinaison de ceux- ci.
Ainsi, la zone à traiter et/ou la zone à marquer peut être avantageusement localisée dans les vaisseaux, le système nerveux central, le microenvironnement tumoral, et toute combinaison de ceux-ci (de préférence le système nerveux central).
La microbulle, la composition, le kit, ou toute combinaison de ceux-ci, est (sont) de préférence formulée pour être administrée une ou plusieurs fois par la même voie ou par des voies différentes. Toutes les voies d'administration classiques sont applicables dans le contexte de l'invention, y compris les voies orale, parentérale et topique.
Les voies parentérales sont destinées à l'administration sous forme d'injection ou de perfusion et englobent les voies systémiques ainsi que les voies locales. De préférence, la microbulle, la composition, le kit, ou toute combinaison de ceux-ci, est formulé(e) pour une ou plusieurs administrations parentérales, et de préférence par voie intraveineuse (dans une veine), intravasculaire (dans un vaisseau sanguin), intra-artérielle (dans une artère), intradermique (dans le derme), sous-cutanée (sous la peau), intramusculaire (dans le muscle), intrapéritonéale (dans le péritoine), ou intratumorale (dans une tumeur). L'administration peut se faire sous la forme d'une dose unique en bolus ou peut également se faire par une pompe à perfusion en continu.
De préférence, la microbulle, la composition, le kit, ou toute combinaison de ceux-ci, est formulé(e) pour être administrée par perfusion intraveineuse.
Les administrations peuvent utiliser des seringues et des aiguilles classiques (par exemple, des aiguilles d'injection Quadrafuse) ou tout composé ou dispositif disponible dans l'art capable de faciliter ou d'améliorer la délivrance d'une microbulle chez le sujet (par exemple, l'électroporation pour faciliter l'administration intramusculaire). Une alternative est l'utilisation d'un dispositif d'injection sans aiguille (par exemple, le dispositif Biojector TM). Des patchs transdermiques peuvent également être envisagés.
Plusieurs doses comprises dans les fourchettes indiquées peuvent être administrées au sujet. En cas d'administrations répétées sur plusieurs jours ou plus, le traitement sera généralement maintenu jusqu'à l'apparition d'un bénéfice clinique observable. Ces doses peuvent être administrées de manière intermittente, par exemple tous les jours, tous les 2 ou 3 jours, toutes les semaines, toutes les 2 semaines, toutes les 3 semaines ou tous les mois (par exemple, de telle sorte que le sujet reçoive d'environ deux à environ vingt doses de la composition). Les doses peuvent également être adaptées à chaque administration (par exemple, une ou plusieurs doses initiales plus élevées suivies d'une ou plusieurs doses plus faibles).
Dans un mode de réalisation, la microbulle, la composition, le kit, ou toute combinaison de ceux-ci, est administré(e) selon une approche "prime boost" qui comprend des administrations séquentielles d'une ou plusieurs compositions d'amorçage (« priming ») et d'une ou plusieurs compositions de renforcement (« boosting »). Typiquement, les compositions d'amorçage et de renforcement peuvent utiliser le même agent actif (c'est-à-dire la microbulle, la composition, le kit, ou toute combinaison de ceux-ci), ou peuvent utiliser un agent actif différent (c'est-à-dire la microbulle, la composition, le kit, ou toute combinaison de ceux-ci). En outre, les compositions d'amorçage et de renforcement peuvent être administrées au niveau de la même zone de l’organisme ou à une zone différente, par la même voie ou par des voies d'administration différentes. Une approche préférée d'amorçage et de renforcement implique une première injection (par exemple sous-cutanée, intramusculaire, intradermique, intratumorale ou intraveineuse) (amorçage) suivie d'une seconde injection (par exemple sous-cutanée, intramusculaire, intradermique, intratumorale ou intraveineuse) après une période de temps optimale. La présente invention englobe une ou plusieurs administrations de la ou des compositions d'amorçage et/ou de renforcement, avec une préférence pour les voies sous- cutanée, intramusculaire, intradermique, intratumorale, intranasale et intraveineuse. La période de temps séparant les administrations du priming et du boosting varie d'une semaine à 6 mois, avec une préférence pour une semaine à un mois et encore plus pour une période d'une à deux semaines. La microbulle, la composition, le kit, ou toute combinaison de ceux-ci, est(sont) de préférence administré(es) en combinaison avec l’application d’ultrasons, de préférence l’application localisée d’ultrasons, de préférence l’application d’ultrasons localisée sur/vers la zone à traiter et/ou marquer. Les ultrasons sont de préférence administrés à une fréquence allant de 1 kHz à 10MHz, de préférence de 10kHz à 9MHz, de préférence de 50KHz à 8MHz, de préférence de 100kHz à 7MHz, de préférence de 150kHz à 6MHz, de préférence de 200kHz à 5MHz, de préférence de 300kHz à 4MHz, de préférence de 400kHz à 3MHz, de préférence de 500kHz à 2MHz, de préférence de 750kHz à 1 ,5MHz, de préférence de 0,8MHz à 1 ,2MHz, de préférence encore à une fréquence d’environ 1MHz. Les ultrasons sont de préférence pulsés à une fréquence allant de 1 Hz à 10kHz, de préférence de 10Hz à 9kHz, de préférence de 50Hz à 8kHz, de préférence de 100Hz à 7kHz, de préférence de 150Hz à 6kHz, de préférence de 200Hz à 5kHz, de préférence de 300Hz à 4kHz, de préférence de 400Hz à 3kHz, de préférence de 500Hz à 2kHz, de préférence de 750Hz à 1 ,5kHz, de préférence de 0,8kHz à 1 ,2kHz, de préférence encore à une fréquence d’environ 1 kHz.
Les ultrasons sont de préférence administrés à une pression acoustique allant de 100 à 800 kPa (pic négatif), de préférence de 200 à 700 kPa, de préférence de 300 à 600 kPa, de préférence de 400 à 500 kPa.
Les ultrasons sont de préférence administrés pendant 30 à 300 secondes, de préférence pendant 40 à 250 secondes, de préférence pendant 50 à 200 secondes, de préférence pendant 60 à 180 secondes, de préférence pendant 80 à 150 secondes, de préférence pendant 90 à 120 secondes.
La zone à traiter et/ou marquer peut être n’importe quelle partie du corps du sujet à traiter et/ou marquer. Ladite zone est de préférence choisie parmi les zones difficiles d’accès, telles que le système nerveux central, les vaisseaux, et le microenvironnement tumoral. En effet, les Inventeurs ont notamment montré que, de manière surprenante, les microbulles lipidiques selon l’invention sont capables de traverser de façon active les vaisseaux, la barrière hématoencéphalique (BHE), ou encore le microenvironnement tumoral. Les Inventeurs ont également démontré que l’application localisée d’ultrasons permet de cibler ces microbulles optimisées de manière très précise vers la zone à traiter. Ainsi, selon un mode de réalisation avantageux, la microbulle, la composition, le kit, ou toute combinaison de ceux-ci, est(sont) administré(es) en combinaison avec l’application localisée d’ultrasons au niveau de la zone ou des zones à traiter et/ou marquer du système nerveux central, des vaisseaux, du microenvironnement tumoral, ou toute combinaison de ceux-ci.
Avantageusement, la méthode d’administration de la microbulle, de la composition, du kit, ou de toute combinaison de ceux-ci, comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en, les étapes suivantes : a) Administration de la microbulle, la composition, le kit, ou toute combinaison de ceux-ci, à un sujet, par un mode d’administration approprié (notamment tel que décrit ci-dessus, de préférence par voie parentérale, de préférence encore par voie intraveineuse) ; b) Application des ultrasons sur la zone à traiter et/ou marquer (de préférence selon les conditions de fréquences, de puise, de pression acoustique et de durée décrites ci-dessus).
La méthode d’administration peut en outre comprendre des étapes additionnelles de préparation de la microbulle, de la composition, du kit, ou de toute combinaison de ceux-ci, préalable à l’étape a) d’administration ; notamment lorsque les microbulles, la composition, le kit, ou toute combinaison de ceux-ci, se présente sous une forme lyophilisée ; lesdites étapes additionnelles étant comme suit :
(i) Optionnellement, mise en suspension du lyophilisât ;
(ii) Optionnellement, activation des microbulles;
(iii) Optionnellement, mélange des microbulles à un excipient (notamment un diluant) et incubation pendant 0,5 à 15 minutes, de préférence 1 à 10 minutes, de préférence 1 ,5 à 8 minutes, de préférence 2 à 6 minutes, de préférence 1 à 5 minutes, de préférence 1 à 3 minutes ;
(iv) Optionnellement mise en présence des microbulles à un agent thérapeutique, un agent de ciblage, un agent de marquage, ou toute combinaison de ceux-ci ; l’agent thérapeutique, l’agent de ciblage, l’agent de marquage, ou toute combinaison de ceux-ci ; pouvant être préalablement mélangé(s) à un excipient (notamment un diluant).
Selon un mode de réalisation, les microbulles sont activées à l’aide d’un agitateur mécanique ; par exemple avec une agitation comprise entre 2000 et 5000 tours par minute (tpm), de préférence à 4000 tpm ; pour une période comprise entre 10 et 120 secondes, de préférence pendant 45 secondes. Selon un mode de réalisation, lorsque la microbulle, la composition, le kit, ou toute combinaison de ceux-ci, est utilisée dans un but de marquage, la méthode comprend en outre une étape de détection de la présence ou non de l’agent de marquage.
Utilisations et Méthodes in vitro
Les données révèlent que la microbulle selon l’invention peut être efficacement utilisée comme outil de marquage, de détection et d’imagerie.
La présente invention fournit donc des méthodes de diagnostic efficace et fiable. Elle permet notamment le diagnostic, le pronostic, la stratification ou encore le suivi de maladies, ou encore d’évaluation de l'efficacité d’un traitement.
La présente invention se rapporte donc à l’utilisation in vitro d’au moins microbulle selon l’invention (telle que définie ci-dessus) ; ou d’une composition (notamment pharmaceutique) ou d’un kit comprenant, ou consistant essentiellement en, au moins une microbulle selon l’invention (telle que définie ci-dessus) ; ou une composition(notamment pharmaceutique) telle que définie ci-dessus ; ou d’un kit tel que défini ci-dessus ; ou de toute combinaison de ceux-ci ; pour : i. la délivrance d’un agent (thérapeutique, de ciblage, de marquage, ou toute combinaison de ceux-ci) à l’intérieur d’une cellule, ou d’un échantillon biologique ; ii. le marquage d’une cellule ou d’un échantillon biologique; iii. le diagnostic d’une maladie, chez un sujet susceptible de souffrir d’une maladie ; iv. le suivi chez un sujet souffrant d’une maladie; v. la stratification d’un sujet souffrant d’une maladie; vi. l’évaluation de l’efficacité d’un traitement (notamment curatif) administré à un sujet souffrant d’une maladie; vii. détecter la présence ou l’absence d’au moins une microbulle dans un échantillon, notamment un échantillon biologique ; viii. déterminer la présence ou l’absence, ou encore la quantité, d’au moins un agent de marquage (notamment un agent de contraste) dans un échantillon, notamment un échantillon biologique ; ix. cribler des composés/molécules ayant un effet dans la prévention, le traitement, le marquage, ou toute combinaison de ceux-ci, d’une maladie; ou x. une combinaison quelconque de i. à ix.
La présente invention concerne notamment l’utilisation in vitro d’au moins une microbulle selon l’invention (telle que définie ci-dessus) ; ou d’une composition (notamment pharmaceutique) ou d’un kit comprenant, ou consistant essentiellement en, au moins une microbulle selon l’invention (telle que définie ci-dessus) ; ou une composition(notamment pharmaceutique) telle que définie ci-dessus ; ou d’un kit tel que défini ci-dessus ; ou de toute combinaison de ceux-ci ; pour délivrer un agent à l’intérieur d’au moins une cellule, ou d’un échantillon biologique, de préférence par sonoporation ; l’agent étant de préférence choisi parmi un agent thérapeutique, un agent de ciblage, un agent de marquage, et toute combinaison de ceux-ci ; la cellule étant de préférence choisie parmi une cellule animale, une cellule végétale, une cellule de microorganisme, et toute combinaison de ceux-ci.
La microbulle, la composition, le kit, ou toute combinaison de ceux-ci, est(sont) de préférence mis(es) en contact avec la cellule ou l’échantillon biologique (notamment administré à l’échantillon) en combinaison avec l’application d’ultrasons, de préférence l’application localisée d’ultrasons, de préférence l’application d’ultrasons localisée sur/vers la zone à traiter et/ou marquer. Les ultrasons sont de préférence appliqués à une fréquence allant de 1 kHz à 10MHz, de préférence de 10kHz à 9MHz, de préférence de 50KHz à 8MHz, de préférence de 100kHz à 7MHz, de préférence de 150kHz à 6MHz, de préférence de 200kHz à 5MHz, de préférence de 300kHz à 4MHz, de préférence de 400kHz à 3MHz, de préférence de 500kHz à 2MHz, de préférence de 750kHz à 1 ,5MHz, de préférence de 0,8MHz à 1 ,2MHz, de préférence encore à une fréquence d’environ 1 Hz.
Les ultrasons sont de préférence pulsés à une fréquence allant de 1 Hz à 10kHz, de préférence de 10Hz à 9kHz, de préférence de 50Hz à 8kHz, de préférence de 100Hz à 7kHz, de préférence de 150Hz à 6kHz, de préférence de 200Hz à 5kHz, de préférence de 300Hz à 4kHz, de préférence de 400Hz à 3kHz, de préférence de 500Hz à 2kHz, de préférence de 750Hz à 1 ,5kHz, de préférence de 0,8kHz à 1 ,2kHz, de préférence encore à une fréquence d’environ 1kHz.
Les ultrasons sont de préférence administrés à une pression acoustique allant de 100 à 800 kPa (pic négatif), de préférence de 200 à 700 kPa, de préférence de 300 à 600 kPa, de préférence de 400 à 500 kPa.
Les ultrasons sont de préférence administrés pendant 30 à 300 secondes, de préférence pendant 40 à 250 secondes, de préférence pendant 50 à 200 secondes, de préférence pendant 60 à 180 secondes, de préférence pendant 80 à 150 secondes, de préférence pendant 90 à 120 secondes, de préférence pendant 60 secondes.
Avantageusement, la méthode d’administration de la microbulle, de la composition, du kit, ou de toute combinaison de ceux-ci, comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en, les étapes suivantes : a) mise en contact de la microbulle, la composition, le kit, ou toute combinaison de ceux-ci, avec une cellule ou un échantillon biologique ; ou administration de la microbulle, la composition, le kit, ou toute combinaison de ceux-ci, un échantillon biologique, par un mode d’administration approprié (notamment tel que décrit ci-dessus, dans la section « Utilisations et Méthodes thérapeutiques ») ; b) Application des ultrasons sur la zone à traiter et/ou marquer (de préférence selon les conditions de fréquences, de puise, de pression acoustique et de durée décrites ci-dessus).
La méthode d’administration peut en outre comprendre des étapes additionnelles de préparation de la microbulle, de la composition, du kit, ou de toute combinaison de ceux-ci, préalable à l’étape a) d’administration ; notamment lorsque les microbulles, la composition, le kit, ou toute combinaison de ceux-ci, se présente sous une forme lyophilisée ; lesdites étapes additionnelles étant comme suit :
(i) Optionnellement, mise en suspension du lyophilisât ;
(ii) Optionnellement, activation des microbulles;
(iii) Optionnellement, mélange des microbulles à un excipient (notamment un diluant) et incubation pendant 0,5 à 15 minutes, de préférence 1 à 10 minutes, de préférence 1 ,5 à 8 minutes, de préférence 2 à 6 minutes, de préférence 1 à 5 minutes, de préférence 1 à 3 minutes ;
(iv) Optionnellement mise en présence des microbulles à un agent thérapeutique, un agent de ciblage, un agent de marquage, ou toute combinaison de ceux-ci ; l’agent thérapeutique, l’agent de ciblage, l’agent de marquage, ou toute combinaison de ceux-ci ; pouvant être préalablement mélangé(s) à un excipient (notamment un diluant). Selon un mode de réalisation, lorsque la microbulle, la composition, le kit, ou toute combinaison de ceux-ci, est utilisée dans un but de marquage, la méthode comprend en outre une étape de détection de la présence ou non de l’agent de marquage dans la cellule et/ou l’échantillon biologique.
La microbulle et ses constituants, tels que le lipophosphoramidate, la polyéthylénimine histidylée, l’agent thérapeutique, l’agent de ciblage, l’agent de marquage, le gaz biocompatible, sont avantageusement tels que décrits dans les sections précédentes (dans la section « Définition », et/ou « Microbulle lipidique », et/ ou « Méthodes de production d’une microbulle lipidique »).
Avantageusement, la composition et/ou le kit sont tels que décrits ci-dessus dans la section « Compositions et kits ».
Les exemples qui suivent visent à illustrer la présente invention, et ne sauraient être considérés comme limitatifs.
DESCRIPTION DES FIGURES
Fig. 1 : Schéma récapitulatif des formulations développées. La fonctionnalisation de la microbulle peut dépendre de différents constituants, tels que des lipides cationiques (capables d’interactions électrostatiques), et des lipides biotinylés (capable de lier notamment des anticorps par des liaisons streptavidine-biotine).
Fig. 2 : Structure chimique des lipides cationiques (LIPIDE 1 ) et fusogéniques (LIPIDE 2) utilisés dans les formulations à base de lipophosphoramidates.
Fig. 3 : Distribution en taille des différentes formulations de microbulles développées. L’analyse a été réalisée à l’aide d’analyse d’image de microscopie (logiciel ImageJ®).
Fig. 4 : Mesures du potentiel Zeta (mV) de différentes formulations. Les valeurs représentent la moyenne ± SD de 3 mesures.
Fig. 5 : Distribution en taille des formulations de microbulles développées, comprenant du KLN25.
Fig. 6 : Gel de complexation (0,6% agarose) de différents volumes de MBc (MB cationique) avec une quantité constante d’ADN plasmidique (1 pg).
Fig. 7 : Imagerie confocale de microbulles de gaz MBc-tPTX complexant des oligonucléotides CpG couplé à la FITC.
Fig. 8 : Schéma du montage réalisé permettant l’analyse en flux du ciblage des MBs fonctionnalisées. Fig. 9 A) Graphique représentant la fixation de MB44 sur des cellules hCMEC/D3 stimulées ou non pour la production de récepteur au VEGF. Pistes : point-tiret) MBa sur cellules stimulées ; pointillés) MBa portant le récepteur anti-VEGFR2 sur cellules non stimulées ; trait plein) MBa portant le récepteur anti-VEGFR2 sur cellules stimulées. B) Graphique représentant la fixation de MBc-tPTX sur des cellules stimulées pour la production du récepteur pendant 24h. Pistes : pointillés) MBc-tPTX sans anticorps ; trait plein) MBc-tPTX portant l’anticorps. C) Graphique représentant la fixation de MBc-tPTX complexant des ODN CpG sur des cellules stimulées pour la production du récepteur pendant 48 h. Pistes : pointillés) MBc-tPTX sans anticorps ; trait plein) MBc-tPTX avec anticorps. Barre verticale : fin de l’injection, début des rinçages.
Fig. 10 : Schéma représentant le dispositif expérimental de sonoporation in vivo comprenant une sonde ultrasonore focalisée et un système de positionnement de la motorisé. La souris est placée dans le berceau après injection du Bleu Evan’s par voie I.V. l’hémisphère gauche est ensuite ciblé, le traitement FUS est réalisé 10s après injection des MBs pendant 60s. Adapté de Celia Si Ahmed, M2 2018, Orléans.
Fig. 11 A) Schéma montrant le partage du cerveau réalisé pour le dosage de l’activité luciférase (bleu : zone traitée par les FUS). B) Photographie du cerveau d’une souris traitée par MBc + FUS à 109 kPa, 24H post-transfection, la tache bleue correspond à l’extravasation du bleu Evan’s. C) Photographie d’un cerveau inclus pour la réalisation de coupe au Cryostat®.
Fig. 12 : Graphique représentant l’activité de la luciférase par mg de protéines dans les différentes zones du cerveau 24 h après sonoporation avec un plasmide pLuc complexé par des MBc. La zone ciblée par l’appareil à ultrasons est la zone 2. Les données représentent la moyenne ± SEM. ** : p<0.01 .
Fig. 13 : Observation au microscope de suspensions de microbulles anioniques (MB1 ) et cationiques (MBPEI). Objectifs 25. (A) Suspension de MBI après activation dons de l’HEPES (10 mM, pH 7,4, Filtrée a 0,2 nm). (B) Suspension de MBPEI apres activation dans de l’HEPES (10 mM, pH 7,4, Filtrée à 0,2 nm). (C) Floculation des MBPEI lors de la preparation des complexes MB:ADNp pour les manipulations in vivo. MBI — Taille & concentration (n = 6) ; MBPEI —Taille & concentration (n = 8).
Fig. 14 : Microscopie fluorescence 24h après transfection du plasmide codant l’eGFP utilisant les MBPElhis sur une lignée cellulaire HeLa. (A) Variation du ratio MB:ADN sur une amplitude de 431 kPa. (B) Variation du ratio MB:ADN en absence d'US. (C) Variation de la pression acoustique /amplitude sur un ratio MB:ADN stable (1 :2). EXEMPLES
EXEMPLE : Conception, mises au point et propriétés de microbulles pour délivrer des actifs de manière ciblée
Introduction
Dans le cadre de la présente invention, une nouvelle formulation de microbulles de gaz a été développée. Ces microbulles sont particulièrement avantageuses, puisqu’elles permettent à la fois d'encapsuler différents types d’actifs, tels que des acides nucléiques, et de les délivrer de façon localisée après activation par ultrasons focalisés (Figure 1 ). Un nouveau dispositif a également été développé, permettant d'envoyer des ultrasons dans le cerveau de la souris de façon ciblée. Ce système est couplé à ces microbulles de gaz originales permettant l'encapsulation et la délivrance d'actifs. La formulation de microbulles de gaz est activée puis à l'aide d'un agitateur, l'actif peut être présent dans la formulation ou peut être ajouté après activation de la formulation. Le dispositif se positionne aux coordonnées correspondant au site de délivrance souhaité par l'utilisateur de façon motorisée. Les microbulles originales ici développées sont capables de traverser la BHE. Ainsi, le système de positionnement mis au point peut être implémenté avec un atlas du cerveau permettant de localiser les structures cérébrales à traiter. Les microbulles de gaz sont injectées par voie systémique puis les ultrasons sont envoyés. Le dispositif peut être implémenté d'un système de détection de cavitation passive permettant de contrôler en temps réel l'activation des microbulles par les ultrasons.
Les formulations de microbulles de gaz permettent d'encapsuler ou de co-encapsuler différents d'actifs :
(i) des actifs liposolubles, tels que des agents chimio-thérapeutiques (e.g. le paclitaxel), notamment à la surface et/ou dans l’enveloppe de la microbulle;
(il) des actifs anioniques tels que des acides nucléiques (ADN plasmidiques, petits ARN, ARN messagers, etc. ; e.g. pour la thérapie génique), par exemple à l'aide de lipides cationiques;
(iii) des anticorps, par exemple à l'aide du couple streptavidine-biotine, ou de la chimie-click, ou encore de lipides couplés à groupements methyl tetrazine ;
(iv) des protéines ou des peptides (tels que des peptides pénétrants dans les cellules (CPP)), par exemple à l'aide du couple streptavidine-biotine, ou de la chimie-click, ou encore de lipides couplés à groupements methyl tetrazine.
Cette grande flexibilité est notamment liée à la formulation originale des microbulles qui consiste en l'utilisation d'un mélange de molécules cationiques telles que des lipophosphoramidates et/ou de la polyethylèneimine histidylée.
En effet, deux types de microbulles cationiques ont été développées ; un à base de lipophosphoramidates l'autre à base de Polyéthylèneimine histidylée couplée à un acide gras. Ces microbulles ont déjà montré leur efficacité in vitro et in vivo en tant qu’agent théranostique (thérapie et imagerie) ultrasonore. La barrière hémato encéphalique a été perméabilisée de façon transitoire sans danger pour l’animal, ceci a été validé par imagerie IRM et en histologie. Une expression d’un transgène luciférase a été détecté après le protocole de sonoporation.
Exemple 1 : Microbulles comprenant des lipophosphoramidates
1.1. Matériels et méthodes
1. 1. 1. Production de microbulles (MB) selon l’invention
La première étape de la production de MB consiste à mélanger différents lipides en fonction du type de microbulle souhaité.
1 .1 .1 .1 . MB comprenant du KLN27
Les lipides KLN27 et MM30 (Figure 2) proviennent d’une collaboration avec l’Université de Brest (Berchel). Il s’agit de lipides phosphoramidate, le LIPIDE1 (KLN27) est de nature cationique tandis que le LIPIDE2 (MM30) est utilisé comme lipide fusogénique (lipide pouvant fusionner aux membranes, notamment utilisé pour favoriser l’échappement endosomal). Tous les autres lipides utilisés (DMPC, DSPC, DMPE-PEG2000, DSPE-PEG2000, DSPE-PEG2000biot) proviennent d’Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA). Le mélange des différents lipides est réalisé dans un ballon en présence d’éthanol absolu (99,96% pur). Durant cette étape, le PTX solubilisé dans de l’éthanol absolu (10 mM, Merck, Allemagne) est ajouté selon la formulation (Table 2).
Table 2 : Liste des formulations utilisées. Les proportions des différents lipides constituants l’enveloppe sont indiquées en pourcentage molaire, par rapport à la quantité totale molaire de lipides.
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Par la suite, le mélange est évaporé à l’aide d’un Rotavapor (Büchi, Schwabach, Allemagne) durant 30 min, 20 rpm à 60° C. Passé cette étape, un film lipidique se forme dans le ballon. Le film lipidique formé est repris dans 2 mL d’HEPES (10 mM, pH 7,4) puis soniqué pendant 5 min afin d’obtenir une solution lipidique homogène (Figure 11 ). La solution est ensuite répartie en volume égal dans 4 flacons à sertir (VWR International, Radnor, PA, USA) qui seront stockés 1 h à -80° C. Enfin, les flacons sont placés au lyophilisateur (Bioblock Scientific, lllkirch, France) pendant une nuit. Une fois le lyophilisât récupéré, les flacons sont sertis manuellement et stockés à 4°C avant d’être activés. L’activation consiste à remplacer l’air du flacon par du perfluorobutane (C4F10, F2 Chemical, UK) par surpression, puis à réhydrater le lyophilisât avec 500 pl d’une solution d’HEPES 10 mM. Les flacons sont agités 45 s à l’aide d’un VIALMIX (Bristol Myers Squibb, USA). Cette étape permet la formation de microbulles dans le flacon, il est cependant nécessaire d’attendre 5 min post-agitation avant d’effectuer un prélèvement. Une fois un flacon activé, celui-ci peut être gardé quelques jours à 4°C.
1 .1 .1 .2. MB comprenant du KLN25
Des MB comprenant le lipide phosphoramidate KLN25 sont également préparées selon la méthode décrite ci-dessus (paragraphe 1.1.1.1 ).
Les proportions des différents lipides constituants l’enveloppe en pourcentage molaire, par rapport à la quantité totale molaire de lipides, sont comme suit :
- 47,5% KLN25 ;
- 47,5% MM27 ; et
- 5% DSPE-PEG(5000).
1 .1 .1 .3. MB comprenant des dipalmitoyl phosphoramidates
Des MB comprenant les lipides dipalmitoyl phosphoramidates sont également préparées selon la méthode décrite ci-dessus (paragraphe 1.1.1.1 ).
Les proportions des différents lipides constituants l’enveloppe en pourcentage molaire, par rapport à la quantité totale molaire de lipides, sont comme suit :
47,5% dipalmitoyl phosphoramidate ;
- 47,5% MM27 ; et
- 5% DSPE-PEG(5000).
1 .1 .1 .4. MB comprenant des disteraoyl phosphoramidates
Des MB comprenant les lipides disteraoyl phosphoramidates sont également préparées selon la méthode décrite ci-dessus (paragraphe 1.1.1.1 ). Les proportions des différents lipides constituants l’enveloppe en pourcentage molaire, par rapport à la quantité totale molaire de lipides, sont comme suit :
47,5% disteraoyl phosphoramidate ;
- 47,5% MM27 ; et
- 5% DSPE-PEG(5000).
1. 1.2. MB anioniques (exemple comparatif)
La production de microbulles anioniques (MBa) est réalisée selon la méthode décrite au paragraphe 2.1.1 plus bas.
1. 1.3. Caractérisation des microbulles
1 .1 .3.1 . Concentration et taille
Les microbulles sont observées par un microscope inversé (Nikon Diaphot 300 invert) relié à un ordinateur. Cette installation permet la prise de photographie par une caméra FASTCAM SA7 (Photron, USA) et le logiciel ICcapture®. Les photos sont prises avec différents objectifs (x10, x20, x40) puis traitées par ImageJ®. Le traitement consiste en une conversion 8 bit de l’image suivie d’un seuillage permettant la détection des contours des MB. Par la suite, une analyse de particules permet le dénombrement ainsi que l’obtention de la taille. Afin de réaliser cette caractérisation, les microbulles sont diluées au 10ème ou 100ème dans de l’HEPES (10 mM, pH 7,4) puis déposées sur lame de Malassez.
1.1..3.2. Mesure du potentiel Zêta (£)
Le potentiel C, correspond à la charge globale d’une particule au niveau de son plan de cisaillement (surface de la particule). Celle-ci est mesurée à l’aide du Nano partica SZ-100 (Horiba, Japon). Afin de réaliser les mesures, 30 pL de MB sont dilués dans 970 pL d’HEPES 10 mM pH 7,4. L’analyse se fait à 25°C.
1.2. Résultats
1.2. 1. Caractérisation des microbulles selon l’invention et comparaison avec les microbulles anioniques
La taille et la concentration des microbulles préparées selon le présent exemple (MB selon la présente invention, préparées comme décrit au paragraphe 1.1.1 ci-dessus) sont évaluées par imagerie optique.
1 .2.1 .1 . MB comprenant du KLN27
La Figure 3 présente les résultats obtenus pour les différentes formulations de la Table 2. Les informations de taille recueillies montrent un diamètre moyen de 1 ,41 pm pour les MBc et 1 ,41 pm pour les MBc-PTX, tandis qu’il est de 1 ,55 pm Pour les MBc-t. Les MBc-tPTX possèdent un diamètre moyen de 1 ,98 pm. Concernant les microbulles anioniques, les MB anioniques (MBa) présentent une taille moyenne de 1 ,41 pm. Les concentrations des différentes formulations sont réunies dans la Table 3. La distribution en taille et en concentration reste homogène entre les deux grandes catégories de microbulles (cationique et anionique). De manière générale, les MB anioniques (semblables aux MB commerciales) présentent une taille similaire aux MB cationiques, mais une concentration plus élevée. Les MBc fonctionnalisées avec le PTX apparaissent légèrement plus petites et en plus grande concentration que la formulation de base (MBc). Les MBc-tPTX possédant des lipides biotinylés ainsi que du PTX sont celles possédant la plus grande taille ainsi que la plus faible concentration. Cependant, la distribution en taille des MB reste inférieure à 10 pm, permettant leur injection in vivo.
Table 3 : Tableau récapitulatif des concentrations et tailles moyennes des différentes formulations de MB.
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La Figure 4 présente les mesures de potentiel des formulations développées. Ces résultats ne montrent pas de changement significatif de la charge globale lorsque les MBc sont fonctionnalisées avec le PTX, la biotine, ou les deux en même temps. Celles-ci restent positives (moyenne des MBc : +28,8 mV). La formulation MBa ne possède pas de KLN27 (lipide cationique) et sert donc de contrôle, sa charge est de -23,4 mV.
1.2.1.2. MB comprenant du KLN25
La Figure 5 présente les résultats obtenus pour les formulations comprenant du KLN25 et confirme la possibilité de former des MB comprenant du KLN25. La distribution en taille et en concentration des MB comprenant du KLN25 est comparable à celle des MB comprenant du KLN27.
1.2.1.3. MB comprenant des dipalmitoyl phosphoramidates ou des disteraoyl phosphoramidates
Les résultats obtenus pour les formulations comprenant des dipalmitoyl phosphoramidates ou des disteraoyl phosphoramidates sont comparables à ceux obtenus avec les formulations comprenant du KLN27 ou du KLN25. La distribution en taille et en concentration des MB comprenant des dipalmitoyl phosphoramidates ou des disteraoyl phosphoramidates est comparable à celle des MB comprenant du KLN27 ou du KLN25. Ces données confirment la possibilité de former des MB à partir de dipalmitoyl phosphoramidates ou de disteraoyl phosphoramidates.
1.2.2. Complexation d’acides nucléiques
La capacité des microbulles à vectoriser les acides nucléiques est évaluée par gel retard. La Figure 6 présente la capacité de complexation des microbulles MBc (possédant le lipide cationique KLN27) en présence d’1 pg d’ADN plasmidique (plasmide pLuc). Lorsqu’il n’y a pas de microbulles, une bande migrant à 3 kilobases environ apparait après révélation aux UV. Cette bande correspond à l’ADN plasmidique non complexé. Plus la concentration en MB est grande, plus l’intensité de la bande à 3 kb diminue, correspondant à une complexation de l’ADNp avec les microbulles. Lorsque l’ADNp est complexé, celui-ci ne migre plus et reste dans les puits de dépôts. En utilisant 10 pL de MB la totalité de l’ADNp est complexé, la bande à 3kb n’est plus visible au profit d’un marquage dans les puits.
Cette capacité de complexation a également été confirmée par microscopie confocale de fluorescence (Figure 7). Les MBc-tPTX sont complexées 2 min avec des oligonucléotides CpG couplés à la FITC au ratio 1 pg d’acide nucléique pour 10 pL de microbulles. La fluorescence observée sur le contour des microbulles permet de confirmer la complexation des acides nucléiques. Des débris fluorescent sont visibles autour des microbulles montrant probablement la formation de lipoplexes à partir de fragments de microbulles détruites ou de lipides libres en solution.
1.2.3. Evaluation du ciblage des MB fonctionnalisées
Afin d’évaluer la capacité de ciblage des MB contre le récepteur au VEGF, une culture en Ibidi® de cellules hCMEC/D3 stimulées pour la production du VEGFR est réalisée, puis une analyse en flux des MB par microscopie optique est faite. Pour ce faire, des plaques de culture en flux 6 canaux (Ibidi® p-Slide VIO.4, Clinisciences) sont ensemencés à raison de 18 000 cellules/canal. Une fois les cellules fixées au fond des canaux, les puits sont remplis de milieu de culture complémentés (ou non) de TGFB à 5 ng/ml et les cellules sont mises à incuber 24 h ou 48 h à 37° C sous atmosphère à 5% CO2. La concentration en TGFB optimal permettant une augmentation du nombre de récepteurs VEGFR2 à la surface des cellules endothéliales est déterminée par cytométrie en flux.
Par la suite, la plaque Ibidi® est positionnée sur le microscope inversé doté d’une caméra et relié à l’ordinateur. Le montage utilisé tout au long de l’expérimentation est présenté sur la Figure 8.
Afin d’analyser la fixation des microbulles, un champ d’observation est choisi. Différents types de microbulles sont utilisés (décrits dans la Table 2 ci-dessus). À la suite des analyses réalisées en cytométrie en flux, certaines microbulles sont fonctionnalisées avec l’anticorps dirigé contre le récepteur au VEGF (VEGFR2). Pour ce faire, 1 ,23 pl de streptavidine (15 mM) sont mis à incuber en présence de 0,3465 pL d’anticorps anti-VEGFR2-Biot (Anti-mouse CD309, 0,5 mg/mL, eBioscience) afin d’obtenir un ratio de 2,5 moles d’anticorps par mole de streptavidine. Puis, 20 pL de la solution de MB sont mis à incuber 10 min de manière à fonctionnaliser les MB, en empêchant la formation d’agrégats de microbulles par des liaisons streptavidine-biotine. A la fin des 10 min, une solution d’HEPES 10 mM pH 7,4 est ajoutée afin d’atteindre un volume final de 1 mL.
La suite de l’expérience consiste en une succession de lavage des cellules en culture. Tout d’abord, un premier lavage de 10min au PBS à lieu, à un débit de 0,137 mL/min (0,25 dyn/cm2). Ensuite, l’injection des MB contenues dans 1 mL est réalisée durant 15 min au même débit, suivie d’un premier rinçage pendant 10 min au PBS, puis d’un deuxième rinçage de 10 min à 0,275 mL/min (0,5 dyn/cm2), pour finir avec troisième rinçage de 10 min à 0,550 mL/min (1 dyn/cm2), suivi d’un dernier rinçage à 1 ,1 mL/min (2 dyn/cm2). Des photographies du canal sont réalisées toutes les minutes à partir de l’injection. La série de photos est ensuite traitée sur ImageJ® pour obtenir un comptage du nombre de MB par minute.
La capacité de ciblage des microbulles envers le récepteur au VEGF (VEGFR-2) a été évalué in vitro en temps réel à l’aide d’une chambre de culture permettant la mise en place d’un flux. Les cellules utilisées pour cette analyse sont les cellules endothéliales hCMEC/D3, stimulées ou non par le TGFB. Différentes formulations ont été testées sur ces cellules afin d’évaluer l’effet de différents constituants sur la capacité de fixation des microbulles (Figure 9).
La figure 9A présente les résultats obtenus pour la formulation anionique MBa. Le volume de MB injecté est le même pour chaque condition testée. Cette formulation est testée sans anticorps sur des cellules stimulées 24 h (point-tiret), avec anticorps sur des cellules non stimulées (pointillés) et avec anticorps sur des cellules stimulées 24 h (trait plein). A t=15min, le 1er rinçage débute. Les résultats montrent un très faible nombre de MB fixées concernant la courbe avec tirets, correspondant aux interactions non spécifiques de ces MB sur les cellules, avec 42 MBa fixées à t=15min. Ce nombre diminue à 27 à la fin des lavages. Concernant la courbe en pointillés, correspondant aux liaisons spécifiques des MB sur les cellules, le nombre de MB fixée est de 112 à t=15min. Ce nombre diminue à 33 à la fin des lavages. La courbe en trait plein, correspondant aux cellules stimulées pour la production du VEGFR2 en présence de MB ciblées, présente un nombre de MB fixées à t=15min de 102. Ce nombre diminue à 52 à la fin des lavages. Cette courbe enregistre donc le plus grand nombre de fixation dans le temps.
Les Figures 9B et 9C présentent les résultats obtenus pour la formulation cationique MBc tPTX (incorporant du PTX et des lipides biotinylés). Cette formulation est testée sur des cellules stimulées à 24 h et 48 h. Les vitesses d’injection et de lavages sont diminuées de moitié par rapport à la Figure 9A, afin de ne pas stresser trop rapidement les cellules. Lorsque les microbulles cationiques sont fonctionnalisées avec l’anticorps anti-VEGFR2, celles-ci se lient en plus grand nombre par rapport aux microbulles non fonctionnalisées pour l’anticorps (Figures 9B, 9C). Sans complexation d’acide nucléique, le nombre de MB fixées possédant l’anticorps est environs 110% plus élevée que le nombre de MB fixé sans anticorps. La complexation d’oligonucléotides CpG (Figure 9C) par les microbulles diminue la capacité de liaison au récepteur. Lorsque la microbulle possède l’anticorps et l’acide nucléique, le nombre de MB fixée est environs 60% plus élevé par rapport au contrôle sans anticorps.
1.2.4. Expérimentation in vivo
1.2.4.1. Sonoporation in vivo
Afin de réaliser de la transfection par MB et FUS, les poils situés sur le crâne de la souris doivent être retirés pour permettre une transmission parfaite des US entre la peau et la sonde ultrasonore. Une fois la souris préparée, celle-ci est anesthésiée à l’aide d’un mélange oxygène/air 1 ,5% isoflurane (Vetflurane, France) tout au long de l’expérience. Un cathéter équipé d’une aiguille de 26G est placé dans la veine caudale afin de permettre les injections intra veineuses. Une injection de bleu Evan’s (5%, solution saline 1 mL/kg) est réalisée. Le bleu Evan’s est un colorant se liant à l’albumine circulant et ne passant pas naturellement la BHE, son extravasation est cependant visible après une ouverture via MB+FUS, nous permettant d’obtenir des informations sur la localisation de la zone ciblée par notre protocole une fois le cerveau extrait de la boite crânienne.
Ensuite, la souris est placée dans le berceau de la plateforme de sonoporation in vivo (Figure 10). Les FUS sont appliqués à l’aide d’un transducteur ultrasonore focalisé mono élément de 54 mm de diamètre (Precision Acoustics, UK). Le transducteur est placé dans un cylindre étanche rempli d’eau dégazée et fermé par une membrane. La présence de bulles est à proscrire pour éviter une mauvaise propagation des US. Le transducteur est positionné sur une plateforme de pilotage motorisée reliée à un ordinateur, permettant son déplacement à l’aide du logiciel Repetier. Le ciblage de la zone de transfection se fait visuellement à l’aide d’un pointeur situé au niveau du transducteur. La zone choisie correspond à la moitié de la distance œil-oreille au niveau de l’hémisphère gauche (zone 2). Du gel de conduction ultrasonore est appliqué sur le crâne de la souris afin de permettre la transmission des US. Après pointage, le transducteur se positionne sur la zone pointée et il descend ensuite au contact du gel.
Par la suite, une solution de 30 pg d’ADNp dilué dans 60 pL d’HEPES 10 mM pH 7,4 et 20 pL sucrose 20% est préparée. Cette solution est mise à incuber 2 min en présence de 120 pL de MBc puis injectée par voie intraveineuse à la souris. Dix secondes après la fin de l’injection, les US sont envoyés pendant 60 s (1 MHz, 5% duty cycle, durée du puise 1 sec). Deux pressions acoustiques ont été testées : 109 kPa et 145 kPa. Après application des US, les souris sont réveillées.
1.2.4.2. Mesure de l’activité luciférase (dosage RLU)
24H après sonoporation, les souris transfectées avec le plasmide codant la luciférase sont euthanasiées et leurs cerveaux sont prélevés. Celui-ci est sectionné en 6 parties, les zones 1 , 2, et 3 correspondent à la partie gauche du cerveau et les zones 4, 5, 6 à la partie droite. La zone de transfection ciblée par notre protocole se situe dans la zone 2 visualisée grâce l’extravasation du bleu Evan’s (Figure 11 ).
Chaque partie est ensuite mise dans des tubes Eppendorf® puis plongées dans de l’azote liquide. Par la suite, les sections sont broyées manuellement dans un mortier en présence d’azote liquide, puis les broyats sont solubilisés dans 500 pL de tampon de lyse CCLR pendant 1 h30. Une centrifugation est réalisée (5 min, 12 000 RPM, 4°C), et 150 pL de surnageant est récupéré afin d’effectuer une lecture à l’aide du luminomètre Lumat LB9507 (Berthold, Allemagne). L’appareil est ainsi chargé d’une solution de LAR (Luciferase Assay Reagent) permettant la mesure de l’activité luciférase. Le reste du lysat est ensuite utilisé afin de déterminer la concentration en protéine contenue dans chaque zone. Cette quantification est réalisée par un dosage BCA. Les valeurs obtenues sont ensuite normalisées avec les valeurs d’activité luciférase en RLU/mg de protéines.
L’efficacité de la délivrance d’acide nucléique a été testé via la mesure d’activité d’un gène rapporteur codant pour la luciférase. Ce gène a été transfecté dans le cerveau à l’aide de microbulles cationique (MBc) ainsi que par des ultrasons focalisés. Deux pressions acoustiques différentes sont testées, 109 kPa (n=8) et 145 kPa (n=5).
Les résultats présentés sur la Figure 12 montrent une forte activité luciférase (entre 5,5x103 et 1.05x104 RLU/mg protéines) dans les zones 2 et 3 du cerveau des souris, pour les deux puissances ultrasonores utilisées. L’expression de la luciférase est très significativement différente entre les zones 2 et 4 ainsi que pour 2 et 5 pour une puissance de 109 kPa. Les résultats obtenus à 145 kPa ne sont pas significativement différents de ceux obtenus à 109 kPa. L’activité de la luciférase est faible dans les zones 1 , 4, 5 et 6 du cerveau (inférieure à 103 RLU/mg de protéines). Il est à noter que ces valeurs sont proches de celles du bruit de fond de tissus non transfectés. Le ciblage n’étant pas stéréotaxique et la découpe des zones imprécise, les zones 1 et 3 peuvent présenter de l’activité luciférase. Une forte expression de la luciférase est donc essentiellement mesurée dans l’hémisphère gauche (lieu du ciblage) et non dans l’hémisphère droit, confirmant la possibilité d’utiliser des ultrasons focalisés couplées à des microbulles cationiques afin d’effectuer de la délivrance d’acides nucléiques.
1.2.4.3. Immunohistochimie
Des coupes de cerveaux de souris transfectées avec différents plasmides ont été réalisés afin d’étudier la zone de transfection ainsi que les types cellulaires impliqués. Les zones de transfections sont déterminées par observation de l’extravasation du Bleu Evan’s sur la coupe.
Exemple 2 : Microbulles comprenant des polyéthylénimines histidylées (MBPEI)
2.1 . Matériels et méthodes
2.1.1. Production de microbulles anioniques (exemple comparatif) La production de microbulles anioniques (MBa) se réalise en plusieurs étapes. La première consiste à mélanger des phospholipides dans un ballon de 50 mL. Pour cette formulation de MBs, du distearoylphosphatidylcholine (DSPC) est mélange a du 1 ,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N- [methoxy (polyethylene glycol) -2000] (DSPE) a un ratio de 90 % -10 % a 87 % - 13 % (rapport molaire) selon les lots de MBs, dans un volume final de 2 mL d' ethanol 99.9 %. La solution est ensuite chauffée a 60°C à vide dans un Rotavapor (Büchi, Schwabach, Allemagne), jusqu'à l'obtention d'un film lipidique dans le ballon. Ce film est ensuite resuspendu dans 2 mL d'HEPES (10 mM, pH 7,4, filtrée avec un filtre de 0,2 pm), et soniqué pendant 5 min dans un bain à sonication (35 kHz). Cette solution est ensuite distribuée dans quatre flacons en verre, puis conservée pendant 1 h à -80° C. Enfin, les flacons sont mis a lyophiliser (Bioblock Scientific, lllkirch, France) pendant au moins 12 h. Les flacons sont ensuite sertis afin de les rendre hermétiques, et conservés à 4°C jusqu’à activation.
L’activation des flacons consiste à remplacer l'air contenu à l'interieur par un gaz de haut poids moléculaire, le perfluorobutane (C4Fio, F2 Chemical, UK), puis à ajouter 500 pL d'HEPES (10 mM, pH 7,4, filtré avec un filtre de 0,2 pm) dans le flacon a l'aide d'une seringue. Les flacons sont ensuite agités pendant 45 secondes a l'aide d'un VIALMIX (Bristol Myers Squibb, USA). Les MBs ainsi produites sont appelées MB1 .
2. 1.2. Production de microbulles (MB) MBPEI selon l’invention
Les MBs cationiques comprenant des polyéthylénimines histidylées sont produites selon un procédé comprenant des étapes similaires à celles décrites au paragraphe 2.1.1 ci-dessus (production des MB1 ). Toutefois, ici, des lipides PEI (Polyethyleneimine + Acide stéarique) couplés à de l'histidine sont utilisés afin d'obtenir une coque chargée positivement. La méthode d'activation de ces microbulles est similaire à celle des MB1 . Les MBs ainsi produites sont appelées MBPElhis.
2. 1.3. Caractérisation des microbulles
2.1.3.1. Concentration et taille
Les microbulles sont observées par un microscope inversé (Nikon Diaphot 300 invert) relié à un ordinateur. Cette installation permet la prise de photographie par une caméra FASTCAM SA7 (Photron, USA) et le logiciel ICcapture®. Les photos sont prises avec différents objectifs (x10, x20, x40) puis traitées par ImageJ®. Le traitement consiste en une conversion 8 bit de l’image suivie d’un seuillage permettant la détection des contours des MB. Par la suite, une analyse de particules permet le dénombrement ainsi que l’obtention de la taille. Afin de réaliser cette caractérisation, les microbulles sont diluées au 10ème ou 100ème dans de l’HEPES (10 mM, pH 7,4) puis déposées sur lame de Malassez.
2.1.3.2. Evaluation de la déliyrance d’acide nucléique in vitro
Les expérimentations de sonoporation in vitro ont été réalisées sur les lignées cellulaires HeLa et HepG2, à raison de 20 000 cellules/puits (HeLa) et 30 000 cellules/puits (HepG2), avec les ADN plasmidiques codant la protéine GFP. Afin d’évaluer la capacité de transfection des MBs en présence ou non d’US, chaque condition de sonoporation ont été réalisée en duplicat sur des plaques de culture 48 puits. Les transfections par sonoporation ont été réalisé dans 190 pL de milieu Opti-MEMTM, avec 10 pL d’une solution de complexation MB/ADNp. Chacune des conditions de transfections en présence d’US a été traitée pendant une durée de 1 min. Après transfection, les plaques de culture ont été incubées à 37 °C sous atmosphère 5% CO2 pendant 30 min dans le milieu Opti-MEMTM, puis pendant 48h dans du milieu de culture classique à 37 °C à 5 % CO2. L’analyse des résultats de transfection par microscopie fluorescence a été effectuée 24h après sonoporation.
2.2. Résultats
2.2. 1. Caractérisation des MB selon l’invention et comparaison avec les MBa
La taille et la concentration des MB préparées selon le présent exemple (MBPElhis selon la présente invention, préparées comme décrit au paragraphe 2.1.2 ci-dessus) sont évaluées par imagerie optique. La Figure 13 présente les résultats obtenus pour les différentes formulations. Les informations de taille recueillies montrent un diamètre moyen de 1 ,55 pm pour les MBa et 1 ,31 pm pour les MBPElhis. Ainsi, la distribution en taille des MBPElhis est inférieure à 10 pm, permettant leur injection in vivo.
La concentration moyenne est de 2,18x1O10 MB/mL pour les MBa et de 8, 51 x109 MB/mL 1 ,31 pm pour les MBPElhis.
2.2.2. Evaluation de la délivrance d’acide nucléique in vitro
L’efficacité de la délivrance d’acide nucléique in vitro a été mesurée à partir du gène rapporteur qui code pour l’eGFP. Ce gène a été transfecté sur la lignée cellulaire HeLa, à l’aide de MBPEIs ou MB1 en présence ou non d’US. Différents ratios MB:ADNp et pression acoustiques ont été testées. Les résultats de cette transfection ont ensuite été analysés par microscopie de fluorescence et montrent une efficacité de transfection par sonoporation des microbulles MBPEIs (Figure 14).
Discussion
L’ensemble de ces données montre que les microbulles innovantes mises au point par les présents Inventeurs sont capables de transporter différents types de drogues, notamment des acides nucléiques, de façon stable dans la circulation sanguine ; de traverser la barrière hémato encéphalique (BHE) ; et de délivrer des drogues de manière ciblées, notamment envers des antigènes d’intérêt.
Les Inventeurs ont notamment montré que, de manière surprenante, les microbulles lipidiques ainsi mises au point possèdent une stabilité significativement améliorée, à la différence des microbulles décrites dans l’art antérieur. De façon remarquable, les données révèlent également que ces microbulles optimisées sont capables de délivrer différents types d’agents d’intérêt, y compris des acides nucléiques, de manière plus efficace que les microbulles décrites dans l’art antérieur. De manière particulièrement intéressante, ces microbulles sont capables de traverser les vaisseaux ainsi que la BHE. Les Inventeurs ont également démontré que l’application localisée d’ultrasons permet de cibler ces microbulles optimisées de manière très précise vers la zone à traiter. Ces données révèlent ainsi le potentiel thérapeutique de ces microbulles lipidiques pour traiter de nombreuses pathologies de manière ciblée, y compris des pathologies du système nerveux central, des pathologies de vaisseaux, des cancers, et des tumeurs.
Les données montrent également que ces microbulles optimisées sont des outils de détection et d’imagerie.
La présente invention fournit donc à la fois des méthodes de traitement puissant et à spectre large de pathologies, ainsi que des méthodes de diagnostic efficace et fiable.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Microbulle lipidique, comprenant au moins un composé cationique choisi parmi les lipophosphoramidates, les polyéthylénimines histidylées, et tout mélange de ceux-ci.
2. Microbulle selon la revendication 1 , comprenant en outre au moins un agent choisi parmi un agent thérapeutique, un agent de ciblage, un agent de marquage, et toute combinaison de ceux-ci ; ledit au moins un agent étant de préférence : i. exposé à la surface de la microbulle, ou ii. enchâssé dans l’enveloppe lipidique de la microbulle, ou iii. incorporé à l’intérieur de la microbulle, ou iv. toute combinaison de i à iii.
3. Microbulle selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit au moins un agent est choisi parmi :
1 ) un acide nucléique ;
2) un actif liposoluble ;
3) un agent chimio-thérapeutique, tel qu’un agent cytotoxique et/ou un agent cytostatique ;
4) un anticorps ;
5) une protéine ;
6) un antigène ;
7) une toxine ;
8) un récepteur
9) une enzyme ;
10) une hormone ;
11 ) un ligand ;
12) Un vecteur viral ;
13) une nanoparticule, comprenant de préférence au moins un agent choisi parmi un agent thérapeutique, un agent de ciblage, un agent de marquage, et toute combinaison de ceux- ci ;
14) tout dérivé de 1 ) à 13), de préférence tout dérivé fonctionnel de ceux-ci ;
15) tout fragment de 1 ) à 14), de préférence tout fragment fonctionnel de ceux-ci ; et
16) toute combinaison de 1 ) à 15).
4. Microbulle selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre au moins un groupement fonctionnel permettant la liaison à au moins un agent choisi parmi un agent thérapeutique, un agent de ciblage, un agent de marquage, et toute combinaison de ceux-ci ; ledit groupement étant de préférence : i. exposé à la surface de la microbulle, ou ii. enchâssé dans l’enveloppe lipidique de la microbulle, ou iii. incorporé à l’intérieur de la microbulle, ou iv. toute combinaison de i à iii.
5. Microbulle selon la revendication 4, le groupement fonctionnel étant choisi parmi : un peptide étiquette ; un groupement chimique, de préférence choisi parmi une fonction cliquable, un groupement de couplage, et toute combinaison de ceux-ci ; un anticorps ; un dérivé d’anticorps ; un fragment fonctionnel d’anticorps ou de son dérivé ; une étiquette d'affinité; et toute combinaison de ceux-ci.
6. Microbulle selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le lipophosphoramidate est choisi dans le groupe constitué par un dimyristoyl phosphoramidate, choisi de préférence parmi un dimyristoyl bromure phosphoramidate, un dimyristoyl histamine phosphoramidate, et toute combinaison de ceux-ci ; un dioleyl phosphoramidate, choisi de préférence parmi un dioleyl methylimidazolium phosphoramidate, et toute combinaison de ceux-ci ; un dipalmitoyl phosphoramidate ; un disteraoyl phosphoramidate ; et tout mélange de ceux-ci.
7. Microbulle selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la polyéthylénimine histidylée est couplée à un acide gras, l’acide gras étant de préférence choisi parmi l’acide stéarique, l’acide myristique, l’acide palmitique, l’acide oléique, et toute combinaison de ceux-ci.
8. Microbulle selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre un lipide additionnel choisi dans le groupe constitué par une dimyristoyl-glycéro-phosphocholine, une distéaroyl-glycéro-phosphocholine, une dimyristoyl-glycéro-phosphoéthanolamine-polyéthylène glycol, une distéaroyl-glycéro-phosphoéthanolamine-polyéthylène glycol, et une distéaroyl-glycéro- phosphoéthanolamine-[biotinyl(polyéthylène glycol)], un cholestérol, un beta-sitostérol, un 1 ,2- dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), un 1 -oleoyl-2-[6-[(7-nitro-2-1 ,3-benzoxadiazol-4- yl)amino]hexanoyl]-3-trimethylammonium propane (DOTAP), un 1 ,2-dimyristoyl-rac-glycero-3- methoxypolyethylene glycol-2000 (DAAG-PEG2000), et toute combinaison de ceux-ci.
9. Microbulle selon l’une quelconque des revendications précédentes, contenant un gaz biocompatible, le gaz étant de préférence choisi parmi un perfluorobutane (C4F10), un perfluoropropane (C3F8), le diazote (N2), un hexafluorure de soufre (SF6), un oxyde d’azote (NO), l’hydrogène, le dioxygène, l’hélium, le xénon, l’argon, le protoxyde d’azote (N20), et tout mélange de ceux-ci.
10. Composition pharmaceutique comprenant au moins une microbulle selon l’une quelconque des revendications précédentes, et, optionnellement, un excipient pharmaceutiquement acceptable, la concentration en microbulles dans la composition allant de préférence de 106 à 1014 microbulles/ml, de préférence encore de 107 à 1013 microbulles/ml, de préférence encore de 108 à 1012 microbulles/ml, de préférence encore de 109 à 1011 microbulles/ml, de préférence encore la concentration en microbulles dans la composition étant d’environ 1010 microbulles/ml.
11 . Kit, comprenant : a) au moins une microbulle selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, dans un premier récipient ; b) au moins un agent thérapeutique, dans un second récipient ; c) optionnellement, au moins un agent de ciblage dans un troisième récipient ; d) optionnellement, au moins un agent de marquage dans un quatrième récipient ; e) optionnellement, des instructions de préparation et/ou d’utilisation ; l’agent thérapeutique et/ou l’agent de ciblage et/ou l’agent de marquage étant de préférence choisi(s) parmi :
1 ) un acide nucléique ;
2) un actif liposoluble ;
3) un agent chimio-thérapeutique, tel qu’un agent cytotoxique et/ou un agent cytostatique ;
4) un anticorps ;
5) une protéine ;
6) un antigène ;
7) une toxine ;
8) un récepteur
9) une enzyme ;
10) une hormone ;
11 ) un ligand ;
12) Un vecteur viral ; 13) une nanoparticule, comprenant de préférence au moins un agent choisi parmi un agent thérapeutique, un agent de ciblage, un agent de marquage, et toute combinaison de ceux- ci ;
14) tout dérivé de 1 ) à 13), de préférence tout dérivé fonctionnel de ceux-ci ;
15) tout fragment de 1 ) à 14), de préférence tout fragment fonctionnel de ceux-ci ; et
16) toute combinaison de 1 ) à 15) ; de préférence encore parmi un acide nucléique, un actif liposoluble, un agent chimio-thérapeutique, un anticorps, un dérivé d’anticorps, un fragment fonctionnel d’anticorps ou de son dérivé, une protéine, un fragment de protéine, une nanoparticule, et toute combinaison de ceux-ci.
12. Microbulle selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, composition pharmaceutique selon la revendication 10, ou kit selon la revendication 11 , pour son utilisation comme médicament ou comme agent de marquage.
13. Méthode de production d’au moins une microbulle selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, comprenant les étapes suivantes : a) Mélange, dans un récipient, de composés cationiques choisis parmi les lipophosphoramidates, les polyéthylénimines histidylées, et les mélanges quelconques de ceux-ci ; d’éthanol; et optionnellement d’au moins un agent choisi parmi un agent thérapeutique, un agent de ciblage, un agent de marquage, et toute combinaison de ceux-ci ; b) Evaporation du mélange obtenu à l’étape a) pour obtenir un film lipidique et réhydratation du film lipidique pour former une suspension liposomale; c) Lyophilisation de la suspension liposomale obtenue à l’étape b) ; d) Remplacement de l’air contenu dans le récipient contenant le lyophilisât obtenu à l’étape c), par un gaz biocompatible, le gaz étant de préférence choisi parmi un perfluorobutane (C4F10), un perfluoropropane (C3F8), le diazote (N2), un hexafluorure de soufre (SF6), un oxyde d’azote (NO), l’hydrogène, le dioxygène, l’hélium, le xénon, l’argon, le protoxyde d’azote (N2O), et tout mélange de ceux-ci ; e) Réhydratation du lyophilisât de l’étape d) pour obtenir une solution; f) Agitation de la solution obtenue à l’étape d) pour former des microbulles ; g) Optionnellement, fonctionnalisation des microbulles par au moins un agent choisi parmi un agent thérapeutique, un agent de ciblage, un agent de marquage, et toute combinaison de ceux-ci ; et/ou fonctionnalisation des microbulles par l’ajout au moins un groupement fonctionnel permettant la liaison à au moins un agent choisi parmi un agent thérapeutique, un agent de ciblage, un agent de marquage, et toute combinaison de ceux-ci.
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