JP2014211448A - 多光源顕微鏡 - Google Patents
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Abstract
Description
実施の形態1.
図1は、本実施の形態に係る多光源顕微鏡の構成の一例を示す模式図である。
多光源顕微鏡は、ホストコンピュータ1からなるシステム制御部1と、SEM部2と、光学顕微鏡部20とから構成されている。SEM部2においては、電子線発生部3から発生し加速された電子線が、電子線走査部4により2次元的に走査され、真空チャンバ6内に配置された鏡筒部5を通って試料9に照射される。なお、鏡筒内5には、光学顕微鏡用の反射ミラー13が配置されているが、電子線は反射ミラー13内の通過孔(不図示)を通って試料10に至る。また、11は試料10をXY方向に移動させる試料ステージであり、試料ステージ制御部9により駆動される。また、試料10への電子線照射により発生する二次電子は検出器7により検出され、増幅器8により増幅される。
a)免疫染色およびレクチン染色用の蛍光色素には、電子線耐性が高い、上記国際公開パンフレットに記載された蛍光色素又はAlexa系を用いることができる。
b)脱水剤にはアセトンを用い、上昇系脱水法による(50-75-85-95-100%×2(各7分))。
<A:灌流固定>
1)固定液は、2.8%パラフォルムアルデヒド+0.2%ピクリン酸+0.06%グルタルアルデヒドのリン酸緩衝液を用いる。後固定として4%パラフォルムアルデヒドのリン酸緩衝液を用いる。
<B:凍結割断(DMSO法)>
2)4%パラフォルムによる後固定後、PBSで十分な洗浄を行い、試料を30%DMSO→50%DMSOへ置換し、凍結割断装置(液体窒素)を用い50%DMSOに封じ込めた試料を割断・洗浄する。
<C:蛍光標識>
3)PBS洗浄後、免疫蛍光法およびレクチン染色により試料を蛍光色素で標識する。
<D:試料処理−1>
4)蛍光標識された試料を、アセトン脱水系に回した後、上昇系Tert-ブチルアルコール(50-100%×2(各5分))に置換する。凍結乾燥機(エイコー製RD−1)にて乾燥しバルク試料とする。
<E:コーティング>
5)試料をSEM用試料台にカーボン製両面テープ等で接着後、オスミウムコータ(真空デバイス社製ID−2)を用い、約2nmの厚さにオスミウムをコートする。
試料処理に以下の方法を用いた以外は、バルク観察用試料作製法と同様の方法で行うことができる。
<D:試料処理−2>
5)標識・脱水後の試料を親水性プラスチック(テクノビット8100)にて包埋後、光顕用ダイヤモンドナイフとウルトラミクロトームを用い約5μm厚の切片を作製する。蛍光輝度を確保するため、切片の厚さを10μmとすることもできる。
6)試料搭載用の板には、ウェハ用Si基板を8mm角程度に割ったものを用い、試料を載せる。
7)基板試料にイオンエッチングを行い切片試料とする。イオンエッチングは、真空デバイス社製PIB−10を用い、13mA/8分で行う。
図5は、本実施の形態に係る多光源顕微鏡の構成の一例を示す模式図である。
多光源顕微鏡は、ホストコンピュータからなるシステム制御部51と、分光器52と、顕微鏡部50とから構成されている。顕微鏡部50は、複数の光源54,55,56と、それら光源を移動可能に保持する光源保持手段57とを有する光源部53と、鏡筒58内に配置され、光源からの電子線を加速し試料に照射する複数の電磁レンズ60aからなる光学系60と、試料68を保持し、XY方向へ移動可能でかつ回転可能な試料筒69と、試料の透過電子を検出する検出部70と、鏡筒58外に配置された観察部64を有する。検出部70は、試料68を透過した電子が到達する蛍光板71と、蛍光板71が取着されたファイバーテーパー72と、レンズユニット74と、CCD/CMOS検出器75と、ファイバーテーパー72とレンズユニット74との間に取り付けられたフィルター73とから構成されている。また、観察部64は、外部CCDカメラ65と蛍光選択フィルター67が取着された三眼鏡筒66から構成されている。また、59は仕切り板であり、鏡筒と光源部を遮断するのに用いる。すなわち、光源部内の光源を切り換える場合、光源部だけでなく真空状態にある鏡筒全体をリークすると、リークと再度真空状態に戻すのに時間を要する。そこで、仕切り弁で光源部と鏡筒を遮断し、光源部のリークと再真空引きの時間を短縮する。また、61は、試料からの反射電子を検出する反射電子検出器である。また、62は、試料からの二次電子を検出する二次電子検出器である。また、63は、エネルギー分散型X線分光法(EDX)検出器である。また、76は、可動型小反射蛍光板であり、試料68からの透過電子を観察部64に導くものである。
光源に電子銃を用いることにより電子顕微鏡として使用することができる。
すなわち、光源部53内の電子銃より照射された電子線は、仕切弁59を通り鏡筒58内の光学系60により加速され、試料筒69に固定された試料68に照射される。試料68からの反射電子は反射電子検出器61で検出される。また、試料68を透過した電子は、蛍光板71、ファイバーテーパー72、レンズユニット74を通過し、CCD/CMOS検出器75で検出され、システム制御部51のモニタに画像化されて表示される。すなわち、透過型電子顕微鏡として使用することができる。ここで、観察倍率は、レンズユニット74を操作することで変化させることができる。また、可動型小反射蛍光76を光路上に移動させることで、試料68からの透過電子像を三眼鏡筒66で目視観察することができる。また、試料より発生したX線をEDX検出器63を用いて検出することで元素分析が可能となる。
光源にレーザ光源を用いることにより、レーザ顕微鏡(光学顕微鏡)として使用することができる。ただし、電顕鏡筒内に光学系が組み込まれていないのでケーラー照明としてある面積に対してのみレーザが照射される。
光源部53内のレーザ光源より照射されたレーザ光は、仕切り弁59を通り鏡筒58内の光学系60を通り、試料筒69内に固定された試料68に照射される。可動型小反射蛍光板76を光路上に移動させることで、試料68からの光を三眼鏡筒66で目視観察することができる。すなわち、光学顕微鏡として使用することができる。また、試料が蛍光色素で標識されている場合は、三眼鏡筒66に搭載されている蛍光選択フィルタ67を光軸上に挿入することで、レーザ光(励起光)をカットして蛍光像を観察することが可能となる。また、試料からの光を三眼鏡筒66経由で分光器52に光ファイバ等で導くことで、ラマン測定が可能となる。また、試料筒69のXY方向への走査、ならびに回転走査(θ方向)により、3D光学像又は3D蛍光像の観察が可能となる。
光源にX線源を用いることによりX線顕微鏡として使用することができる。
すなわち、光源部53内のX線源より照射されたX線は、仕切弁59を通り鏡筒58内の光学系60により加速され、試料筒69に固定された試料68に照射される。試料68を透過したX線は、蛍光板71、ファイバーテーパー72、レンズユニット74を通過し、CCD/CMOS検出器75で検出され、システム制御部51のモニタに画像化されて表示される。すなわち、X線電子顕微鏡として使用することができる。ここで、観察倍率は、レンズユニット74を操作することで変化させることができる。また、可動型小反射蛍光76を光路上に移動させることで、試料68からの透過X線像を三眼鏡筒66で目視観察することができる。また、試料筒69のXY方向への走査、ならびに回転走査(θ方向)により、3D透視X線像の観察が可能となる。
1. "Evaluation of properties of YAG (Ce) poly-crystal scintillator with APD" Takayuki Yanagida, Hiromitsu Takahashi, Daisuke Kasama, Takeshi Ito, Hisako Niko, Motohide Kokubun, Kazuo Makishima, Takagimi Yanagitani, Hideki Yagi,Takashi Shigeta, and Takashi Ito Proceedings of Scintillating Crystals and their Applications at KEK, p111-116.
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その方法によれば、チョクラルスキー法(Cz法)、又は、フローティングゾーン法(FZ法)によって単結晶のインゴットが作製可能である。また、セリウムのドープ量は、0.005〜0.5mol%である。
例えば、透過電子顕微鏡画像とレーザ顕微鏡画像の場合は以下の通りである。
試料からの透過電子は検出部70で検出されて光電変換され、システム制御部51でA・D変換されて、透過電子顕微鏡画像が得られる。また、レーザ顕微鏡は、蛍光選択フィルタ67と外部CCDカメラ65を有しており、蛍光選択フィルタでの波長選択により目的の波長で表示された蛍光画像をCCDカメラで検出し、システム制御部1へデジタル信号として送る。送られた透過電子顕微鏡画像と蛍光画像は、システム制御部1により、画像合成システムソフトウェアを用いて合成(重ね合わせ)が実行される。
試料からの透過電子は検出部70で検出されて光電変換され、システム制御部51でA・D変換されて、透過電子顕微鏡画像が得られる。また、試料からの透過X線は検出部70で検出されて光電変換され、システム制御部51でA・D変換されて、透過X線顕微鏡画像が得られる。送られた透過電子顕微鏡画像と透過X線顕微鏡画像は、システム制御部1により、画像合成システムソフトウェアを用いて合成(重ね合わせ)が実行される。
(試料作製)
ラットの神経組織であるアストロサイトに対し、以下の手順により免疫染色を行った。
1)4%パラフォルムアルデヒドを含む0.1M PB(Phosphate Buffer)で還流固定後、浸漬固定した(3時間)。
2)20%シュークロースを含む0.1M PBで洗浄した(4℃、一晩)。
3)a.カミソリによる切断、b.SEM用凍結割断、c.10μm凍結切片作製などの、各用途に応じた技法により神経(脊髄)組織を小さな試料に分けた。図2(a)にはc、図2(b)にはaの方法を用いた。
4)0.1M PB洗浄(5分×3回)
5)0.8% fish gelatin、1% 牛血清アルブミン, 0.2%Triton X-100を含む0.1M PBS(PBSTBF)でブロッキングした(室温、1時間)。
6)抗グリア線維性酸性蛋白Glial fibrillary acidic protein (GFAP)マウスモノクローナル抗体(1: 20,000; Sigma) in PBSTBF(4℃、14時間)。コントロールはPBSTBFのみでインキュベートした。
7)0.1M PB洗浄(5分×3回)
8)ビオチン標識抗マウス抗体(1: 400; Jackson Lab) in PBSTBF(室温、90分)
9)0.1M PB洗浄(5分×3回)
10)Fluolid-labeled streptavidin in 10m M HEPES, 0.15M NaCl (pH7.3), 室温, 90分AMCA(7-amino-4-methylcoumarine-3-acetic acid)標識ストレプトアビジン(1: 200; Jackson Lab) in PBSTBF, 室温,90分。
但し、希釈倍率はFluolidの製作過程により変動する。
11)0.1M PB洗浄(5分×3回)
なお、本実施例及び以下の実施例中、Fluolidとは、前記国際公開に記載された蛍光色素を指す。
SEM部と光学顕微鏡部を備えた日本電子(株)製の波長分散型元素分析装置JXA−8600の光学顕微鏡部の光学系を改造したものを用いた。
図2(a)に蛍光顕微鏡画像を、そして(b)に本発明の蛍光SEMシステムを用いて得られた蛍光SEM画像を示す。本発明の蛍光SEMシステムを用いることにより、アストロサイトのみが染色された鮮明な画像が得られた。
(試料作製)
ラットの腎(尿細管)に対し、以下の手順により免疫染色を行った。
1)2.8%パラホルムアルデヒド−0.2%ピクリン酸−0.06%グルタールアルデヒド−0.1MPBで還流固定後、4%パラホルムアルデヒドin PBにて後固定を行い、4℃で保存した。
2)ビブラトームで1mmの試料を作製し、PBS (0.01M)で洗浄した(4℃、1日)。
3) Biotinylated Peanut Agglutinin(PNA)(Vector)in PBS (4℃、4日)(1:100)
4)PBS洗浄(4℃、20分×3)
5)蛍光色素付加(4℃、1日)
Streptavidin-Fluolid-W-Orange in PBS(1:10)
6)PBS洗浄(4℃,20分×3)
7)アセトン脱水 (50-75-85-95-100 %上昇系脱水)
8)標識・脱水後の試料を親水性プラスチック(テクノビット8100)にて包埋後、光顕用ダイヤモンドナイフとウルトラミクロトームを用い約5μm厚の切片を作製した。
9)試料搭載用の板に、ウェハ用Si基板を8mm角程度に割ったものを用い、その上に試料を載せた。
10)基板試料にイオンエッチングを行い切片試料とした。イオンエッチングは、真空デバイス社製PIB−10を用い、13mA/8分で行った。
図3(a)にSEM画像、(b)に蛍光画像、そして(c)に本発明の蛍光SEMシステムを用いて得られた蛍光SEM画像を示す。蛍光SEM画像により、尿細管断面のブラッシュボーダーが選択的に染色されていることを確認できた。また、蛍光顕微鏡では観察不可能な尿細管内壁の絨毛を詳細に観察することができた。
(試料作製)
1)2.8%パラホルムアルデヒド−0.2%ピクリン酸−0.06%グルタールアルデヒド−0.1MPBで還流固定後、4%パラホルムアルデヒドPBにて後固定を行い、4℃で保存した。
2)ビブラトームで1mmの試料を作製し、PBS (0.01M)で洗浄した(4℃、1日)。
3)Biotinylated Peanut Agglutinin(PNA)(Vector)in PBS (4℃、4日)(1:100)
4)PBS洗浄(4℃、20分×3)
5)蛍光色素付加(4℃、1日)
Streptavidin-Fluolid-W-Orange(IST)in PBS(1:10)
6)PBS洗浄(4℃,20分×3)
7)アセトン脱水 (50-75-85-95-100 %上昇系脱水)
8)標識・脱水後の試料を親水性プラスチック(テクノビット8100)にて包埋後、光顕用ダイヤモンドナイフとウルトラミクロトームを用い約5μm厚の切片を作製した。
9)試料搭載用の板に、ウェハ用Si基板を8mm角程度に割ったものを用い、その上に試料を載せた。
10)基板試料にイオンエッチングを行い切片試料とした。イオンエッチングは、真空デバイス社製PIB−10を用い、13mA/8分で行った。
図4(a)にSEM画像、(b)に蛍光画像、そして(c)に本発明の蛍光SEMシステムを用いて得られた蛍光SEM画像を示す。試料は、マクロファージを含むラットのリンパ節である。リンパ節組織中にあるマクロファージ(貪食細胞)は、生体内の様々な老廃物を取り込んでいるため、自家蛍光を有すると考えられている。そこで、無染色のまま、本装置にてリンパ節を蛍光観察した結果が(b)であり、この黄色に光る蛍光部と一致してマクロファージの存在を同定することができた。SEM像と重ね合わせることにより(c)マクロファージ細胞を他の細胞と区別してSEMにて観察することができた。
2 SEM部
3 電子発生部
4 電子線走査部
5 真空チャンバ
6 鏡筒
7 検出器
8 増幅器
9 試料ステージ制御部
10 試料
11 試料ステージ
12 カセグレン鏡
12a 大鏡
12b 小鏡
13 反射ミラー
20 光学顕微鏡部
21 光源
22 照明部
23 観察カメラ
24 光ファイバー部
25 分光器
50 顕微鏡部
51 システム制御部
52 分光器
53 光源部
54,55,56 光源
57 光源保持手段
58 鏡筒
59 仕切板
60 光学系
60a 電磁レンズ
61 反射電子検出器
62 二次電子検出器
63 EDX検出器
64 観察部
65 外部CCDカメラ
66 三眼鏡筒
67 蛍光選択フィルター
68 試料
69 試料筒
70 検出部
71 蛍光板
72 ファイバーテーパー
73 フィルター
74 レンズユニット
75 CCD/CMOS検出器
76 可動型小反射蛍光板
図5は、本参考形態に係る多光源顕微鏡の構成の一例を示す模式図である。
多光源顕微鏡は、ホストコンピュータからなるシステム制御部51と、分光器52と、顕微鏡部50とから構成されている。顕微鏡部50は、複数の光源54,55,56と、それら光源を移動可能に保持する光源保持手段57とを有する光源部53と、鏡筒58内に配置され、光源からの電子線を加速し試料に照射する複数の電磁レンズ60aからなる光学系60と、試料68を保持し、XY方向へ移動可能でかつ回転可能な試料筒69と、試料の透過電子を検出する検出部70と、鏡筒58外に配置された観察部64を有する。検出部70は、試料68を透過した電子が到達する蛍光板71と、蛍光板71が取着されたファイバーテーパー72と、レンズユニット74と、CCD/CMOS検出器75と、ファイバーテーパー72とレンズユニット74との間に取り付けられたフィルター73とから構成されている。また、観察部64は、外部CCDカメラ65と蛍光選択フィルター67が取着された三眼鏡筒66から構成されている。また、59は仕切り板であり、鏡筒と光源部を遮断するのに用いる。すなわち、光源部内の光源を切り換える場合、光源部だけでなく真空状態にある鏡筒全体をリークすると、リークと再度真空状態に戻すのに時間を要する。そこで、仕切り弁で光源部と鏡筒を遮断し、光源部のリークと再真空引きの時間を短縮する。また、61は、試料からの反射電子を検出する反射電子検出器である。また、62は、試料からの二次電子を検出する二次電子検出器である。また、63は、エネルギー分散型X線分光法(EDX)検出器である。また、76は、可動型小反射蛍光板であり、試料68からの透過電子を観察部64に導くものである。
Claims (3)
- 試料を同一位置で観察可能な多光源顕微鏡であって、
蛍光を観察するための光学顕微鏡部と走査型電子顕微鏡部とからなり、該走査型電子顕微鏡部の電子ビームの光軸と同軸となるように該光学顕微鏡のカセグレン鏡が該走査型顕微鏡部の鏡筒内に配置されてなり、反射面が非球面型であるカセグレン鏡を用いる多光源顕微鏡。 - 上記カセグレン鏡が、中央に開口を有する大鏡と、該開口の下方に該大鏡に対向するように配置された小鏡とからなり、大鏡と小鏡の反射面が非球面型である請求項1記載の多光源顕微鏡。
- 上記光学顕微鏡部の光源にレーザ光源を用いる請求項1記載の多光源顕微鏡。
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