KR101672336B1 - 광학현미경과 전자현미경의 연계형 이미징 검출을 위해 초저온 전자현미경 시편장착 홀더를 포함하는 워크 스테이션 또는 이를 포함한 연계형 이미징 검출장치를 이용한 연계형 현미경 관찰 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 연계형 이미징 검출장치를 이용한 광학현미경과 전자현미경의 연계형 이미징 관찰 방법에 관한 것으로, 구체적으로, 연계형 이미징 검출장치를 이용한 광학현미경과 전자현미경 초저온 전자현미경 관찰방법은 시료 그리드를 냉각제에 담그어 냉각시키는 전처리 과정과 전처리된 시료 그리드를 운반하여 광학현미경에 장착하고 관찰하는 일련의 과정이 단일의 시편준비장치 내에서 연속적으로 수행될 수 있도록 구성되는 새로운 구조의 전자현미경의 연계형 초저온 시편준비장치를 이용하여, 초저온 전자현미경 관찰에 앞서 광학현미경 관찰을 통해 대략적으로 표적의 위치를 파악할 수 있게 하고, 또한 광학현미경을 통한 관찰 후 시료 그리드를 ?ケ穗? 동안 시료 그리드의 동결 상태를 지속적으로 유지시켜 전자현미경을 통한 측정의 정확성을 보다 향상시키므로 생체 내 바이러스, 미세소포, 세포소기관 등 나노입자(nanoparticle)의 관찰, 추적, 검출 등에 유용하게 이용 될 수 있다.

Description

광학현미경과 전자현미경의 연계형 이미징 검출을 위해 초저온 전자현미경 시편장착 홀더를 포함하는 워크 스테이션 또는 이를 포함한 연계형 이미징 검출장치를 이용한 연계형 현미경 관찰 방법 {Correlative microscopy of light microscope and electron microscope using a work station comprising sample holder for cryogenic electron microscopy for correlative imaging detection apparatus in combination of optical microscopy and electron microscopy or correlative imaging detection including said work station}

본 발명은 광학현미경(light Microscope)과 전자현미경(Electron Microscope)의 연계 측정을 위한 워크 스테이션 또는 이를 포함하는 연계 측정 장치 를 이용한 연계형 현미경 관찰 방법에 관한 것이다.

일반적으로 의료, 생명 기술분야에서 생체 시료를 관찰하기 위한 장치로서, 광학현미경(light Microscope)과 전자현미경(Electron Microscope)이 널리 사용되고 있다.

광학현미경(fluorescent microscope, 螢光顯微鏡)은, 형광체가 특정 파장의 빛을 흡수하면 형광을 발하는 원리를 이용한 것으로, 시료에 형광 물질(형광색소)을 처리한 후, 상기 시료에 상기 형광 물질의 흡수 파장의 광을 조사하여, 상기 빛을 발하는 형광 물질을 통해 상기 시료를 관찰하는 장치를 말한다. 광학현미경은 생물학적 물질의 검사에 많이 이용되는데, 박테리아나 단백질과 같은 시료 자체가 형광성을 가지거나, 형광물질을 흡착할 수 있는 시료에 유효하게 사용될 수 있으며, 개개의 시료에 따라서 적합한 형광색소를 선택한다. 또한 이러한 형광 현미경 중 하나의 형태로 공초점 레이저 주사 현미경이 있다. 일반적인 현미경과는 달리 대물 렌즈 뒤편에 바늘 구멍을 두어 시료의 한 점에서 출발한 빛만이 통과하게 하여 명암비와 분해능을 높인 현미경이며, 한 번에 한 점만을 보기 때문에 시간 간격을 두어 이웃한 점들을 연속적으로 측정하여 이를 컴퓨터를 이용해 시각화하면 기존의 광학 현미경보다 현저히 높은 분해능을 가진 2차원 혹은 3차원 영상을 얻을 수 있다. 다만 공초점 현미경 역시 분해능의 한계가 있어 나노미터 단위의 세포 미소기관 등의 관찰을 할 수 없는 문제가 있다.

1920년대에 기존 현미경의 분해능 한계를 극복할 수 있는 새로운 미세 관찰 기술이 요구되어 전자현미경(electron microscope)이 발명되었다. 전자현미경(Electron Microscope)은 광학현미경(Light Microscope)에서 사용하는 가시광선(visible rays) 대신 전자선(electron beam)을, 또한 유리렌즈(glass lens) 대신에 전자렌즈(electron lens)를 사용하여 물체의 확대상을 만드는 장치를 말한다. 다만 전자현미경으로 세포 등을 관찰시에는 전자가 투과 될 수 있을만큼 시료가 얇아야 하기 때문에, 시료 준비과정에서 상온건조, 절편화 등을 거치며, 이로 인하여 완전한 세포, 살아있는 상태의 관찰이 불가능 한 단점이 있었다. 특히 기존의 면역금 표지(immunogold labeling) 방법을 사용하면 세포 밖으로 분비되는 표적의 위치파악은 용이하나, 이 세포소기관의 자세한 구조를 보고자 하면 표지된 금입자에 가려 정확한 정보를 얻을 수 없는 단점이 있었다.

이러한 점을 해결하기 위해, 초저온 전자현미경 관찰기법(cryo-electromicroscopy, cryo-EM) 이 개발되었고, cryo-EM은 수분을 포함하는 세포샘플을 액체질소 등의 냉각제로 급속동결로 얼려 동결-수화(frozen-hydrated)된 샘플을 이미징 하므로 그 자연적(native) 상태를 유지하며, 기존의 면역금 표지 방식도 사용하지 않고 미세소포(microvesicle) 본연의 모습을 그대로 유지한채 가림없이 나노미터 범위로 세포 소기관까지 이미징 할 수 있게 되었다.

다만, 초저온 전자현미경으로 시료 관찰시, 상대적으로 굉장히 넓은 범위(~50nm)의 세포 내에서 관찰자가 관심있어 하는 나노미터 단위의 매우 작은 입자부분들을 발견해 내는 것이 가장 큰 문제이며, 특히 전자현미경 관찰시에는 전자선량에 따른 샘플의 손상이 매우 심각하므로 저선량만을 유지해야 하는 환경이므로, 현미경분석법의 연계를 통해 원하는 위치를 쉽게 찾을 수 있는 방법이 요구되었다.

따라서 최근 들어서는 생체 세포를 관찰함에 있어서, 광학현미경과 전자현미경을 연계시킴으로써, 광학현미경을 통해 필요한 시그널을 추출해낸 후 추출된 부위를 전자현미경을 통해 집중적으로 관찰하는 방법이 이용되고 있는 추세이다.

종래에 있어서, 광학현미경과 전자현미경을 연계시켜 생체시료를 관찰하기 위해서는 예컨데, 생체 시료를 액체에 혼탁시킨 후 피펫으로 소정의 처리가 된 지지막에 올리고 여과지 등으로 물기를 제거한 다음, 액체 질소를 공급하여 얼음 결정이 생기지 않도록 급속 냉각시키는 전처리 공정 수행하고, 그 후, 급속 냉각된 생체 시료 그리드를 광학현미경으로 운반하여 관찰한 후 다시 한번 전자현미경으로 운반하여 관찰하는 과정이 필요하다

따라서, 종래에는 별도의 장치를 통해 생체 시료를 급속 냉각 처리한 후 광학현미경으로 운반하는 과정과, 광학현미경으로 관찰된 생체 시료를 전자현미경으로 운반하는 과정에서 핀셋 등의 공구를 통한 수작업이 수반될 수 밖에 없다. 따라서 종래에는 전처리 공정 및 광학현미경에 의해 시그널이 추출된 시료 그리드를 운반하는 각 과정에서 시료 그리드의 파손이나 손상 등이 발생하는 경우가 발생되었다. 또한, 급속 냉각에 의해 전처리된 시료 그리드는 전자현미경으로 최종 운반되는 동안 온도를 일정하게 유지해야 하므로, 시료 운반작업이 매우 까다롭고 번거로우며, 많은 시간이 소요되는 문제점이 있었다.

이러한 문제점을 해결하기 위한 기술로서, 본 발명의 출원인에 의해 선 출원 등록된 국내등록 제10-1396420호는 시료 그리드를 액체질소에 담그어 냉각시키는 전처리 과정과 전처리된 시료 그리드를 운반하여 광학현미경에 장착하고 관찰하는 일련의 과정이 단일의 시편 준비장치 내에서 연속적으로 수행될 수 있도록 구성되는 전자현미경의 연계형 초저온 시편준비장치에 관한 기술이 기재되어 있다. 이를 위해 상기 국내등록 제10-1396420호는 도 7에 도시된 바와 같이, 시편준비장치(A)의 본체(1)에 형성된 주입구(2)를 통해 액체질소를 주입하고, 본체(1) 내에 형성된 시료장착부의 시료보관부(5)에 거치되는 시료 그리드 운반용기로부터 시료 그리드를 꺼내어 상기 시료장착부(4)에 장착한 후 시료 그리드가 장착된 상기 시편준비장치(A)를 광학현미경에 장착하여 관찰할 수 있도록 한 기술이 기재되어 있다.

그러나, 상기 국내등록 제10-1396420호는 시료 그리드를 전처리 후 광학현미경으로는 바로 장착할 수 있지만, 전자현미경으로의 투입은 여전히 그리드를 수동으로 운반하여 이루어질 수 밖에 없다. 따라서, 시료 그리드를 전자현미경으로 투입하는 과정에서 손상이 발생될 수 밖에 없으며, 특히, 이러한 전자현미경은 복잡한 측정 환경과, 시료 그리드의 장착 환경을 가짐으로써, 시료 그리드의 운반이 매우 까다롭고 많은 시간을 소요시키는 문제점이 있다.

이에, 상기한 종래기술의 문제점을 해결하여, 시료 그리드의 전처리와 광학현미경 뿐 아니라 전자현미경으로의 투입이 연속적으로 수행될 수 있도록 하는 기술의 도입이 시급히 요구되고 있는 시점에서, 본 발명자들은 시료 그리드의 전처리 과정과, 광학현미경을 통한 측정 및 전자현미경을 통한 측정이 하나의 장치를 통해 진행될 수 있도록 하며, 시료 그리드를 광학현미경에서 전자현미경으로 투입하기 위해 이동시킬 필요 없고, 냉각상태가 지속적으로 유지될 수 있도록 하여 광학현미경과 전자현미경의 연계 측정을 위한 연계 측정 장치 및 이를 이용한 측정방법을 완성하였다.

국내등록 제10-1396420호

본 발명의 목적은, 연계형 이미징 검출장치를 이용하여

1) 시료 그리드를 광학현미경으로 이미징하는 단계;

2) 상기 단계 1)에서 얻은 광학현미경 이미지로부터 시료 그리드 상의 전자현미경 관찰을 위한 표적 위치를 선별하는 단계;

3) 상기 단계 2)에서 선별된 시료 그리드 상의 표적 위치를 초저온 전자현미경 관찰법으로 이미징하는 단계를 포함하는 시료 관찰 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 연계형 이미징 검출장치를 이용하여

1) 시료 그리드를 광학현미경으로 이미징하는 단계;

2) 상기 단계 1)에서 얻은 광학현미경 이미지로부터 시료 그리드 상의 전자현미경 관찰을 위한 표적 위치를 선별하는 단계;

3) 상기 단계 2)에서 선별된 시료 그리드 상의 표적 위치를 초저온 전자현미경 관찰법으로 이미징하는 단계를 포함하는 시료 관찰 방법을 제공한다.

본 발명의 연계형 초저온 워크 스테이션 또는 이를 포함한 연계형 이미징 검출장치를 이용한 광학현미경과 전자현미경의 연계형 현미경 관찰 방법은 시료 그리드를 냉각시키는 전처리 과정과, 광학현미경을 통한 측정하는 과정이 단일의 연계 측정 장치 내에서 이루어지고, 광학현미경을 통한 측정 후 전자현미경으로 투입하기 위해 시료 그리드를 옮길 필요 없이 그대로 투입할 수 있도록 함으로써, 시료 그리드를 옮기는데 소요되는 시간을 줄이고, 시료 그리드의 파손을 방지할 수 있다.

또한 본 발명에 따르면, 광학현미경을 통한 관찰 후 시료 그리드를 ?ケ穗? 동안 시료 그리드의 동결 상태를 지속적으로 유지시킬 수 있으며, 이를 통해 전자현미경을 통한 측정의 정확성을 보다 향상시키므로 생체 시료, 생체 내 바이러스, 미세소포, 세포소기관, 나노입자(nanoparticle) 등의 관찰, 추적, 검출 등에 유용하게 이용 될 수 있다.

도 1은 본 발명의 워크 스테이션과 이를 포함한 연계 측정 장치의 제 1실시예를 나타내는 사시도이다.
도 2는 도 1에 도시된 워크 스테이션과 이를 포함한 연계 측정 장치의 측면도이다.
도 3은 도 1에 도시된 워크 스테이션의 그리드 수용부를 확대한 사시도이다.
도 4는 도 3에 도시된 그리드 수용부의 평면도와 측면도이다.
도 5는 본 발명의 워크 스테이션과 이를 포함한 연계 측정 장치의 제 2실시예를 나타내는 사시도이다.
도 6은 도 5에 도시된 워크 스테이션과 이를 포함한 연계 측정 장치의 측면도이다.
도 7은 도 5에 도시된 워크 스테이션의 그리드 수용부를 확대한 사시도이다.
도 8은 도 7에 도시된 그리드 수용부의 평면도와 측면도이다.
도 9는 본 발명의 실시예에 따른 측정렌즈 홀더를 확대한 사시도이다.
도 10은 본 발명의 실시예에 따른 시편 장착 홀더의 측면도이다.
도 11은 본 발명의 워크 스테이션과 이를 포함한 연계 측정 장치의 제 1 실시예를 나타내는 사시도이다.
도 12는 종래기술을 나타낸 사시도이다.
도 13은 HeLa 세포의 HIV-1 입자의 연속적 공초점 이미지를 나타내는 도면이다.
도 14는, a는 광학현미경 이미지에서 나타난 금 비드의 위치를 나타내는 도이고, b는 전자현미경 이미지에서 a와 동일한 위치의 금 비드의 위치를 나타내는 도이다.
도 15는, a는 HeLa 세포 HIV 바이러스 입자의 초저온 DIC 이미지를 나타내는 도이고, b는 a 이미지 위에 초저온 형광 이미지를 겹친것을 나타내는 도이며, c, d는 바이러스 입자의 초저온 EM 이미지를 나타내는 도이고, e, f, g는 d 우측하단에 표시된 바이러스 입자(하얀색 화살표)의 4nm 두께의 단층 슬라이스 이미지를 나타내는 도이다.
도 16은, a는 1일동안 세포를 배양한 그리드를 나타내는 도이고, b는 a를 확대한 도(스케일바 : 200㎛)이며, c는 b를 확대한 도(스케일바 : 50㎛)이다.
도 17은, a, b, c, d, e는 GRS-관련 미세소포(microvesicle)들의 광학현미경 이미지를 나타낸 도이며, f는 e에서 사각형으로 표시된 부분을 전자현미경으로 이미징 한것을 나타낸 도이다

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명을 첨부된 예시도면을 참조로 상세히 설명하며, 이러한 설명은 일례로서 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 여러 가지 상이한 형태로 구현할 수 있으므로, 본 발명은 이에 한정되지 않는다.

본 발명은,

1) 시료 그리드를 광학현미경으로 이미징하는 단계;

2) 상기 단계 1)에서 얻은 광학현미경 이미지로부터 시료 그리드 상의 전자현미경 관찰을 위한 표적 위치를 선별하는 단계;

3) 상기 단계 2)에서 선별된 시료 그리드 상의 표적 위치를 초저온 전자현미경 관찰법으로 이미징하는 단계를 포함하는 시료 관찰 방법을 제공한다.

상기 단계 1)의 시료 그리드는 냉각되지 않은 것일 수 있으나, 급속 냉각된 것이 바람직하다.

상기 시료 관찰 방법에 있어서, 광학현미경 이미지와 전자현미경 이미지 사이의 위치관계 비교를 위해 시료에 화면지표로 사용될 물질을 시료에 가할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 화면지표로 사용될 물질은 금 비드일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 광학현미경 및 전자현미경 상에서 관찰될 수 있는 표지된 DNA, 단백질, 탄수화물, 무기물질, 유기물질 등의 모든 물질을 포함한다.

상기 시료 관찰 방법은 생체 시료, 바이러스 입자, 미세소포, 또는 나노입자 관찰을 위한 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 시료는 세포, 세포소기관, 지질, 탄수화물, 단백질, RNA, DNA, 바이러스, 미세소포(microvesicle), 나노입자 등 현미경으로 관찰될 수 있는 모든 물질을 포함한다.

상기 나노입자는 일반적으로 적어도 한 차원이 100nm 이하인 입자를 말하며, 원자의 개수가 수개 내지는 수백개의 복합체, 지질, 탄수화물, DNA, ,RNA, 세포소기관, 미세소포, 바이러스 입자 등 모든 생체 물질을 포함하나, 이에 한정되지는 않으며, 광학현미경 또는 전자현미경으로 관찰될 수 있는 모든 작은 입자들도 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 각 1) 단계, 2) 단계, 3) 단계에 있어서, 상기 시료 그리드는 연계 측정을 위한 워크 스테이션, 시편 장착 홀더, 또는 이들을 포함한 연계형 이미징 검출장치를 이용하여 관찰 할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

이하 상기 연계 측정을 위한 워크 스테이션, 시편 장착 홀더, 및 이들을 포함한 연계형 이미징 검출장치의 실시예를 첨부된 예시도면을 참조로 상세히 설명하며, 이러한 실시예는 일례로서 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으므로, 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 워크 스테이션과 이를 포함하는 연계 측정 장치의 사시도를 나타내고, 도 2는 도 1에 도시된 워크 스테이션과 이를 포함하는 연계 측정 장치의 측면도를 나타낸다.

도 1 및 도 2를 함께 참조하면, 본 실시예에 따른 연계 측정 장치는 시료 그리드를 냉각시키는 전처리 과정을 수행하기 위한 워크 스테이션(10)과, 전처리 과정 중에는 상기 워크 스테이션(10)에 연결되고 전처리 과정이 수행된 후에 상기 워크 스테이션(10)으로부터 분리되어 연계 측정을 위한 전자 현미경의 측정부에 삽입되도록 하는 시편 장착 홀더(14)가 포함된다.

워크 스테이션(10)은 그리드 수용부(150)가 형성되는 박스부(120)와, 박스부(120)의 하부에 구비되어서 외부의 계측장비 또는 제어장치와 연결하기 위한 외부기기 연결단자인 외부 단자부(122)와, 박스부(120)의 상부를 덮어 상기 그리드 수용부(150)를 상부로 노출시키는 개구부가 형성된 상부 플레이트(110)와, 상부플레이트(110)를 수직하게 지지하여 하부로 이어지는 수직 지지부(123)와, 수직 지지부(123)의 하단을 지지하는 베이스 플레이트(140)와, 베이스 플레이트(140)에 일측면에 형성되어 워크 스테이션(10)을 수평으로 지지하는 수평 지지부(142)를 포함하여 형성될 수 있다.

여기서, 박스부(120)의 상부 및 베이스 플레이트(140)에는 각각 제1 손잡이(121) 및 제2 손잡이(141)가 구비된다. 상기 제2 손잡이(141)는 수직방향과 수평방향으로 회동 가능한 구조로 형성된다. 예를 들면, 제2 손잡이(141)는 손잡이에 경첩이 형성되어 수직 및 수평방향으로 회전 가능하다. 이를 통해, 전자현미경에 시편 장착 홀더를 삽입하기 위해 워크 스테이션(10)으로부터 분리할 때, 용이하게 분리할 수 있도록 한다.

또한 박스부(120)는 내측이 구리를 포함하는 열전도성 재질로 형성되고, 외측이 수지종류 중 가장 단단한 아세탈 재질로 형성된다. 특히, 내측과 외측의 사이에는 스티로폼을 포함하는 단열성 재질로 형성된 단열층이 복층구조로 형성된다.

상기 그리드 수용부(150)는 측정될 시료 그리드가 수용될 수 있도록 형성된다.

그리드 수용부(150)는 워크 스테이션(10)의 외부에 구비된 액체질소 탱크(미도시함)로부터 내부로 시편 그리드를 냉각시키기 위한 액체질소를 공급하는 유입관(124)이 삽입되는 유입공(324)과, 내부에 공급된 액체질소를 외부로 배출할 수 있도록 하는 배출관(125)가 삽입되는 배출공(325)이 각각 형성된다.

여기서, 유입관(124) 및 배출관(125)에 밸브(미도시)를 각각 구비하여 액체질소의 유입과 배출을 제어할 수 있다. 이를 통해 워크 스테이션(10)이 전자현미경으로 움직이기 용이하게 할 수 있다.

그리드 수용부(150)는 상부를 덮거나 열수 있도록 하는 수용부 커버(152)가 포함되고, 수용부 커버(152)의 상부에는 손잡이(154)가 형성되어, 손으로 잡고 쉽게 덮고 열 수 있도록 형성된다.

참고로, 수용부 커버(152)는 아크릴이나, 유리, 합성 수지 등의 투명한 재질로 형성될 수 있으며, 이에 한정되지 않고 다양한 소재로 형성될 수 있다. 바람직하게는 수용부 커버(152)가 아크릴이 포함된 재질로 형성되어 관찰이 용이하게 할 수 있다.

또한, 수용부 커버(152)는 그리드 수용부(150)의 상부를 덮은 상태에서 그리드 수용부(150)의 내부로 작업 공구가 삽입될 수 있도록 하는 장공 형태의 개방부(155)가 형성될 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, 시료 그리드를 냉각시키는 전처리 과정을 수행하기 위한 워크 스테이션(10)과, 액체질소가 저장되는 냉각기(170)와, 상기 냉각기(170)의 일측으로 연장되어 형성되는 연장관(180)을 포함하며, 전처리 과정 중에는 상기 워크 스테이션(10)에 연결되고, 전처리 과정이 수행된 후에 상기 워크 스테이션(10)으로부터 분리되어 연계 측정을 위한 전자 현미경의 측정부에 삽입되도록 하는 시편 장착 홀더(14)를 포함하는 광학현미경과 전자현미경의 연계 측정을 위한 연계 측정 장치가 제공된다.

본 실시예에서 워크 스테이션은 전술한 워크 스테이션이 적용될 수 있으므로, 이에 관한 설명은 이하에서 생략하기로 한다.

시편 장착 홀더(14)는 워크 스테이션(10)의 일측에 구비되어 탈부착 가능하게 결합되며, 일측으로 길게 연장된 연장관(180)의 선단이 워크 스테이션(10)의 측부로 삽입되어 그리드 수용부(150)의 그리드 수용홈(340)에 위치되도록 결합된다.

이때, 다양한 길이의 시편 장착 홀더(14)는 냉각기(170)를 상기한 베이스 플레이트(140)에 안착시키되, 냉각기(170)의 하부를 지지하여 그리드 수용부(150)로부터 분리되는 방향으로 슬라이딩시키고, 그리드 수용부(150)로 삽입되는 방향으로는 삽입을 제한하는 스토퍼가 형성된 슬라이딩 가이드(190)를 통해 지지될 수 있다. 또한 슬라이딩 가이드(190)는 앞뒤로 슬라이딩이 되어 시편 장착 홀더(14)가 용이하게 이동시킬 수 있다.

도 3은 도 1에 도시된 연계 측정 장치의 그리드 수용부를 확대한 사시도이고, 도 4는 도3에 도시된 연계 측정 장치의 평면도와 측면도를 나타낸다.

도 3 및 도 4를 함께 참조하면, 그리드 수용부(150)는 워크 스테이션(10)의 상부를 향해 개방된 내부 공간을 형성하고, 상기한 박스부(120)에 형성되어 상부 플레이트(110)의 개구부를 통해 상부로 노출된다.

그리드 수용부(150)의 내부 공간에는 내부로 공급된 액체질소를 수용하는 냉각제 수용부(310)와, 냉각제 수용부(310)와 분리되어 시료 그리드가 위치되는 공간을 형성하는 그리드 수용홈(340)이 형성되고, 내부의 일측부에 워크 스테이션(10)의 외부로 관통되는 관통공(156)이 형성된다.

그리드 수용부(150)는 내부의 타측부에 유입공(324)과 배출공(325)를 더 형성한다. 유입공(324)는 액체질소가 유입되며, 배출공(325)는 액체질소가 배출된다. 특히, 배출공(325)는 유입공(324)보다 높은 위치에 형성되어 액체질소의 수위가 일정하게 유지되면서 배출될 수 있도록 한다.

또한 상기 그리드 수용부(150)의 내측에 상기 유입공(324)으로부터 유입되는 액체질소의 튀는현상을 방지하는 'ㄱ'자 형상의 유입격벽(312)이 형성된다.

냉각제 수용부(310)와 그리드 수용홈(340)은 수용부 격벽(323)에 의해 서로 분리되어 냉각제 수용부(310)에 수용된 액체질소가 그리드 수용홈(340)으로 유입되지 않도록 형성된다.

여기서, 수용부 격벽(323)은 구리를 포함하고, 전체 박스부의 높이보다 조금 낮게 설계된다. 이러한 설계는 이미지 관찰하는 동안 수용부 커버(152)를 닫고 액체질소의 차가운 공기가 그리드 수용부(150)에서 얼려진 시편 그리드가 위치하는 그리드 수용홈(340) 방향으로 넘어와 시편 그리드가 액체질소없이도 녹지 않도록 한다.

그리드 수용홈(340)은 그 내부에 시료 그리드를 수용할 수 있도록 형성되고, 그리드 수용홈(340)의 하부에는 광학현미경을 통해 시료 그리드를 측정 할 수 있도록 하는 측정 렌즈가 삽입될 수 있는 렌즈홈(342)이 하부에 형성된다.

본 발명에 따른 워크 스테이션은 시료 그리드를 광학현미경과 전자현미경을 연계하여 시료 그리드를 측정하기 위한 것으로서, 예컨데 생체 세포 시편을 관찰할 경우, 광학현미경을 통해 관찰된 시그널의 위치가 변동되는 것을 방지하기 위해 시료 그리드를 급속 동결시키는데 액체 질소를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 그리드 수용부(150)는 상기 시료 그리드를 다수 저장하는 그리드 홀더(미도시함)를 냉각제 수용부(310) 일측의 하부로 삽입하여 액체질소에 잠긴 상태를 유지시키는 냉각부홈(320)이 형성된다.

그리고, 냉각부홈(320)로부터 상기한 그리드 홀더를 건져내서 상기 그리드 수용홈(340)의 일측에 안착시키는 홀더 안착홈(330)이 더 형성된다.

참고로, 그리드 홀더는 원형으로 형성될 수 있고, 냉각부홈(320)과 홀더 안착홈(330)은 그리드 홀더를 끼워서 삽입할 수 있도록 하는 원형으로 형성될 수 있다.

이때, 냉각부홈(320)과 홀더 안착홈(330)은 일측부에 그리드 홀더와 각각 요철 구조를 이루는 돌출구(321, 331)를 각각 형성하여, 그리드 홀더가 움직이는 것이 방지되도록 형성될 수 있다. 특히, 홀더 안착홈(330)은 그리드 홀더에서 시편 그리드를 안정적으로 꺼낼 수 있게 할 수 있다.

또한, 상기 그리드 수용홀의 내부에는 온도를 측정할 수 있도록 하는 온도센서(343)가 형성되어, 냉각재에 의해 냉각된 내부 온도를 감지하여 사용자가 온도를 조절할 수 있도록 형성될 수 있다.

자세하게, 온도센서(343)에서 측정된 온도는 외부 단자부(122)를 통하여 연결된 외부 제어장치를 제어하는 기초가 되며, 상기 외부 제어장치는 액체질소의 유입과 배출을 제어하여 시료 그리드의 온도를 일정하게 유지시킨다.

도 5는 본 발명의 워크 스테이션과 이를 포함한 연계 측정 장치의 제 2실시예를 나타내는 사시도이고, 도 6은 도 5에 도시된 워크 스테이션과 이를 포함한 연계 측정 장치의 측면도를 나타낸다.

도 5 및 도 6를 함께 참조하면, 제2 실시예에 따른 워크 스테이션은 제1 실시예에 따른 워크 스테이션과 기본적인 구성 및 동작은 동일하나 제2 실시예에 따른 워크 스테이션이 보다 휴대하기 용이하다.

워크 스테이션(10)은 전자현미경으로 움직이기 용이하도록 외부로부터 액체질소가 공급되는 유입관(124) 및 유입공(324)이 제거되지만 배출구(125) 및 배출공(325)은 액체질소의 오버 플로우(overflow)를 방지하기 위해 유지된다.

또한 수용부 커버(152)는 제1 유입공(156) 및 제2 유입공(157)이 형성되며, 제1 유입공(156)는 제1 유입관(360)이 삽입되고, 제2 유입공(157)은 제2 유입관(370)이 삽입된다. 상기 제1 유입관(360) 및 제2 유입관(370)의 상세한 설명은 후술된다.

상기 전술된 구성 이외의 구성들은 제1 실시예에 따른 워크 스테이션과 동일하다.

도 7은 도 5에 도시된 워크 스테이션의 그리드 수용부를 확대한 사시도이고, 도 8은 도 7에 도시된 그리드 수용부의 평면도와 측면도를 나타낸다.

도 7 및 도 8을 함께 참조하면, 제2 실시예에 따른 그리드 수용부(150)는 유입공(324)이 제거되며, 배출공(325)만 유지된다.

그리드 수용부(150)는 휴대용 냉각부(350)에 담긴 액체질소가 제1 유입관(360) 및 제2 유입관(370)을 통하여 유입된다. 휴대용 냉각부(350)는 깔대기 또는 용기 형상으로 형성될 수 있다. 또한 제1 유입관(360)는 그리드 수용홈(340)으로 액체질소를 유입시키고, 제2 유입관(370)는 냉각제 수용부(310)로 액체질소를 유입시킨다.

여기서, 제1 유입관(360)은 제1 유입공(156)에 삽입되어 그리드 수용홈(340)에 액체질소를 유입시킬 수 있고, 제2 유입관(370)은 제2 유입공(157)에 삽입되어 냉각제 수용부(310)에 액체질소를 유입시킬 수 있다.

또는 제1 유입관(360) 및 제2 유입관(370)은 제1 실시예에 도시된 수용부 커버(152)의 개방부(155)를 통과하여 액체질소를 유입시킬 수 있다.

이 때, 휴대용 냉각부(350)에 연결된 제1 유입관(360)은 기본적으로 제2 유입관(370)보다 높은 위치에 형성된다. 이로 인해 제1 유입관(360)은 제2 유입관(370)보다 액체질소를 유입 중단이 빠를 수 있으며, 이는 냉각제 수용부(310)에 액체질소가 유입되며 온도 유지를 하는 동시에 그리드 수용홈(340)은 액체질소의 유입이 중단되어 이미지 측정을 용이하게 할 수 있다.

또한 제1 유입관(360) 및 제2 유입관(370)에 밸브를 더 구비하여 액체질소의 유입량을 조절할 수 있다.

상기 전술된 구성 이외의 구성들은 제1 실시예에 따른 그리드 수용부(150)와 동일하다.

도 9는 본 발명의 제1 및 제2 실시예에 따른 측정렌즈 홀더를 확대한 사시도를 나타낸다.

도 9를 참조하면, 측정렌즈 홀더(400)는 측정렌즈의 결빙을 방지하기 위하여 구비된다. 측정렌즈 홀더(400)는 홀더 본체(410), 가스 주입부(420) 및 완충제(430)을 포함한다.

홀더 본체(410)는 측정렌즈가 삽입되고, 가스 주입부(420)는 질소가스와 같은 불활성가스를 주입하여 측정렌즈의 결빙이나 성에 발생을 방지하기 위해 홀더 본체(410)의 일측에 형성이 된다. 또한 완충제(430)는 홀더 본체(410) 내부에 삽입된 측정렌즈의 충격흡수 및 진동방지를 위해 설치된다. 즉, 완충제(430)는 측정렌즈가 외부충격으로부터 보호를 해준다.

따라서, 측정렌즈 홀더(400)는 액체질소로 냉각된 시료와 측정렌즈가 근접하게 되면, 온도 차이로 인해 측정렌즈가 결빙되거나 성에가 생성되어 정확한 이미지를 얻을 수 없게 되는 문제를 보안한다.

도 10은 본 발명의 워크 스테이션과 이를 포함한 연계 측정 장치의 제1 및 제2 실시예에 따른 시편 장착 홀더의 측면도를 나타낸다.

도 5를 참조하면, 시편 장착 홀더(14)는 내부에 액체질소를 저장할 수 있는 냉각기(170)와, 냉각기(170)로부터 일측으로 연장되어 액체질소를 공급하는 연장관(180)과, 연장관(180)의 연장된 선단에 형성되어 시료 그리드를 안착시킬 수 있도록 그리드 안착홈(382)이 구비된 안착 헤드(380)가 포함된다.

냉각기(170)는 손으로 잡고 쉽게 휴대 및 이동시킬 수 있는 소형으로 형성되는 것이 바람직하다.

냉각기(170)에 저장된 액체 질소는 연장관(180)을 통해 안착 헤드(380)로 공급됨으로써, 안착 헤드(380)에 안착된 시료 그리드에 액체질소를 공급한다.

상기 액체 질소는 액체 산소, 액체 헬륨 등의 당업계에서 통상적으로 사용하는 다른 냉각제로 대체될 수 있다.

시편 장착 홀더(14)는 연장관(180)의 선단에 형성된 안착 헤드(380)가 기존의 일반적인 전자현미경의 측정부로 삽입되어 시료 그리드를 위치시킬 수 있도록 제작된다.

이때, 시편 장착 홀더(14)의 연장관(180)은 선단 측에서 직경이 작아지는 단차를 다수 개소에 형성하여, 연장관(180)을 끝까지 삽입된 위치에서 정확히 정지될 수 있도록 함으로써, 전자현미경 또는 워크 스테이션(10)의 내부에 시료 그리드를 정확하게 위치시킬 수 있도록 형성될 수 있다.

여기서, 연장관(180)은 냉각제가 저장되는 박스부(120)의 일측으로 연장되어 형성되며, 내측은 스티로폼 같은 단열성 재질로 형성되고, 외측은 수지종류 중 가장 단단한 아세탈 재질로 형성된다.

또한 연장관(180)은 다양한 두께와 길이를 가진 시편 장착 홀더(14)에 따라 두께와 길이를 조절할 수 있도록 내부에 톱니바퀴를 구비하거나, 시편 장착 홀더(14)의 사이즈에 따라 연장관(180)을 구비하여 상기 사이즈에 맞게 착탈식 구조로 형성될 수 있다.

이하, 상기한 구성에 따른 본 발명의 워크 스테이션 및 이를 포함한 연계 측정 장치의 작동을 상세하게 설명한다.

본 발명에 따르면, 광학현미경과, 전자현미경의 측정을 연계시키는데 있어서, 광학현미경의 측정을 위한 워크 스테이션(10)의 그리드 수용부(150)와, 전자현미경의 측정부에 각각 탈부착 가능한 시편 장착 홀더(14)의 끝부분인 그리드 안착홈 (382)에 초저온 시료 그리드를 장착하고 측정이 이루어지도록 한다.

본 발명에 따르면, 광학현미경상에서 시료 그리드를 측정하기 전에, 워크 스테이션(10)에 시편 장착 홀더(14)의 안착 헤드(380)를 그리드 수용부(150)의 그리드 수용홈(340)에 위치시킨다. 그리드 수용부 (150)에 액체질소를 채운 후 초저온 시편이 저장된 그리드 홀더를 수용부(320)에 우선 위치시키고, 그리드 수용홈(340)의 온도가 -185도 이하로 안정화되면, 그리드 홀더를 냉각수 수용부(320)로부터 건져 올려 그리드 수용부(150)의 홀더 안착홈(330)에 안착시키고, 핀셋 등의 기구를 이용하여 시료 그리드를 인접하게 위치되는 시편 장착 홀더(14)의 안착 헤드(380)의 시료 삽입부인 그리드 안착홈(382)에 장착하여, 광학현미경의 하부에 위치한 렌즈(미도시함)로 측정을 진행한다

광학현미경을 통해 시그널이 측정되면, 시편 장착 홀더(14)를 워크 스테이션(10)으로부터 분리하여 시료 그리드가 안착된 안착 헤드(380)를 그리드 수용부(150)로부터 분리시킨 후 전자현미경의 내부로 삽입하여 광학현미경의 시그널에 기반한 이미징 측정을 진행한다.

이때, 광학현미경을 통해 측정된 시료 그리드를 워크 스테이션(10)로부터 분리하는 시점부터 전자현미경으로 투입하여 측정이 완료될 때까지는 시편 장착 홀더(14)의 냉각기(170)에 의한 액체질소가 지속적으로 공급됨으로써, 광학현미경을 통해 측정한 시그널에 따른 시료 그리드의 상태가 초저온상에서 정확하게 유지될 수 있도록 한다.

따라서, 본 발명에 따른 연계 측정 장치에 의하면, 시료 그리드를 냉각시키는 전처리 과정과, 광학현미경을 통한 측정하는 과정이 단일의 연계 측정 장치 내에서 이루어지고, 광학현미경을 통한 측정 후 시료 그리드를 옮길 필요 없이 그대로 전자현미경의 측정부에 투입할 수 있다.

따라서, 전자현미경 측정을 위해 시료 그리드를 수작업으로 옮겨야 하는 불편함을 해소할 수 있고, 전자현미경으로 ?ケ穗? 동안 시료 그리드의 동결이 지속적으로 유지되도록 함으로써, 전자현미경을 통한 측정의 정확성을 향상시킬 수 있다.

뿐만 아니라, 수작업을 통해 시료 그리드를 옮기는 과정에서 손상 및 파손이 발생하는 것을 방지할 수 있다.

도 11은 본 발명의 워크 스테이션과 이를 포함한 연계 측정장치의 제 1실시예를 나타내는 사시도이다.

도 11을 참조하면, 앞선 실시예에 따른 연계 측정 장치의 베이스 플레이트(140)의 하부면을 받쳐 상기 연계 측정 장치의 상하 높이를 조절하는 높이조절장치(510)가 더 포함된다.

높이조절장치(510)는 지면의 바닥을 받치는 지면 플레이트(520)와, 지면플레이트(520)와 상기 베이스 플레이트(140) 사이에서 다수의 링크에 의해 상하 구동 스트로크를 형성하는 절첩부재(540) 및 절첩부재(540)에 나사산이 형성된 작동축(530)을 삽입하여, 상기 절첩부재(540)를 상하 구동시키는 구동레버(550)를 포함하여 형성될 수 있다.

이러한 구성에 따르면, 광학현미경에 위치되는 워크 스테이션(10)에 시편 장착 홀더(14)를 삽입한 상태에서 일체로 상하로 이동시킬 수 있어, 광학현미경을 통한 측정의 정확도를 높일 수 있으며, 전자현미경과 연계한 측정을 보다 효율적이고 용이하게 할 수 있도록 한다.

이하에서는 본 발명의 다른 일측면에 따른 광학현미경과 전자현미경을 연계한 측정방법에 대해 설명한다.

참고로, 본 실시예에 따른 측정방법은 앞서 설명한 워크 스테이션 및 이를 포함한 연계 측정 장치를 사용하여 실행될 수 있다.

또한, 이하에서 연계 측정 장치의 구성을 언급할 경우, 전술한 도면부호의 구성과 동일한 기능을 하는 구성에 대해서는 동일한 도면부호를 붙여 설명하기로 하며, 전술한 연계 측정 장치의 설명과 중복되는 설명을 피하기 위해 간략하게 설명하기로 한다.

본 실시예에 따르면, 광학현미경에 시료 그리드를 위치시키는 그리드 수용부(150)의 일 측부로 시편 장착 홀더(14)를 삽입하여, 상기 그리드 수용부(150)의 그리드 수용홈(340)에 시료 그리드가 장착된 상기 시편 장착 홀더(14)의 안착 헤드(380)를 위치시키는 제1단계와, 그리드 수용부 (150)에 액체질소를 채운 후 초저온 시편이 저장된 그리드 홀더를 수용부(320)에 우선 위치시키고, 그리드 수용홈(340)의 온도가 -185도 이하로 안정화되기를 기다린 후 그리드 홀더를 냉각수 수용부(320)로부터 건져 올려 그리드 수용부(150)의 홀더 안착홈(330)에 안착시키는 제2단계와, 그리드 홀더에 보관한 초저온 그리드를 상기 그리드 수용부(150)의 상기 안착 헤드(380)의 시료 삽입부인 그리드 안착홈(382)에 장착하여 상기 광학현미경을 통해 시그널을 측정하는 제3단계 및 상기 시편 장착 홀더(14)를 상기 그리드 수용부로부터 분리시켜 상기 안착 헤드(380)를 전자현미경으로 투입하고 측정하는 제4단계로 이루어질 수 있다.

그리고, 제3단계는 그리드 홀더에서 냉각된 시료 그리드를 핀셋으로 집어서 상기 안착 헤드(380)로 옮기는 방법을 이용한다.

이때, 그리드 홀더는 냉각수 수용부(310)로부터 건져 올려져 그리드 수용부(150)의 홀더 안착홈(330)에 안착된 상태에서 인접하게 위치되는 그리드 수용홈(340)으로 쉽게 이동시킬 수가 있다.

그리고, 그리드 홀더가 냉각수 수용부(310)로부터 건져 올려진 후에도 그리드 수용부(150) 내부에서 액체질소의 영향을 계속 받게 되므로, 동결된 상태가 지속적으로 유지될 수 있다.

또한, 제4단계는 시편 장착 홀더(14)를 그리드 수용부(150)로부터 분리시킨 후 전자현미경에 의한 측정이 완료될 때까지 상기 시편 장착 홀더(14)에 구비된 냉각기(170)에 의한 액체질소를 상기 시료 그리드에 공급하여 냉각을 유지시키는 것을 포함한다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 광학현미경과 전자현미경을 연계한 측정방법에 의하면, 광학현미경을 통해 시료 그리드를 측정하기 전 전처리시키는 과정에서 냉각 후 신속하게 광학현미경으로 투입할 수 있도록 함으로써, 시료 그리드의 파손을 방지하는 것은 물론, 시료 그리드의 동결 상태를 지속적으로 유지할 수 있다.

뿐만 아니라, 광학현미경을 통한 측정 후 시료 그리드를 전자현미경에 투입하기 위해 별도의 스테이지로 옮길 필요가 없이 하나의 장치에 의해 간편하고, 용이하게 시료 그리드를 옮길 수 있어, 시료 그리드의 이동 중 발생될 수 있는 파손이 방지될 수 있고, 냉각기에 의한 액체질소의 지속적인 공급이 가능하다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 초저온 워크 스테이션 및 이를 포함한 연계형 이미징 검출장치는 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술사상과 아래에 기재될 특허청구범위의 균등범위 내에서 다양한 수정 및 변형 가능함은 물론이다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 연계형 현미경 관찰을 위해 시료 그리드를 냉각제에 담그어 냉각시키는 전처리 과정과 전처리된 시료 그리드를 광학현미경으로 관찰한 뒤 시료의 직접적인 운반 없이 전자현미경에 장착하고 관찰하는 일련의 과정이 연속적으로 수행될 수 있도록 구성된 연계형 이미징 검출장치를 이용하였다.

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 HIV 바이러스 입자를 관찰하기 위해 전자현미경 그리드를 피브로넥틴으로 코팅하고 자외선으로 소독한 후, HeLa 세포를 그 그리드 위에 직접 배양하고 형광단백질로 표지된 HIV 바이러스를 감염시켰다. 시료에 전자선이 직접 닿는 것을 방지하기 위해 피브로넥틴 으로 코팅한 뒤 자외선으로 소독하였다. 이 후 형광 세포 트래커를 상기 세포에 처리한 후, 세포로 이동하는 HIV 입자들을 광학현미경으로 관찰하고, 화면지표로 이용될 물질을 첨가한 후 시료를 동결하였다. 그 후 초저온 광학현미경법과 초저온 전자현미경법으로 관찰하여, 원하는 바이러스 입자 이미지를 획득하였으며, 본 과정에서 상기 연계형 이미징 검출장치가 사용되어 쉽게 전자현미경 관찰을 위한 표적위치를 선별하였고, 시료의 손상 등을 최소화 할 수 있었다.

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 미세소포(microvesicle)를 관찰하기 위해, 전자현미경 그리드를 콜라겐으로 코팅하고 자외선으로 소독한 후, 그리드 위에 세포를 배양하였다. 이 후 글라이신 tRNA 합성효소(GRS)를 표적물질로 이용하기 위해, 글루코스 결핍 조건을 만든 후, GRS를 형광 표지하여 광학현미경으로 관찰하고, 시료를 초저온 동결 시킨뒤 광학현미경 이미징 자료 분석을 토대로 초저온 전자현미경 관찰을 시행하여 미세소포(microvesicle)의 전자현미경 이미지를 획득하였으며, 본 과정에서 상기 연계형 이미징 검출장치가 사용되어 쉽게 전자현미경 관찰을 위한 표적위치를 선별하였고, 시료의 손상 등을 최소화 할 수 있었다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 연계형 이미징 검출장치를 이용한 광학현미경과 전자현미경의 연계형 현미경 관찰 방법에 의한 살아있는 세포 내 바이러스 입자 관찰

<1-1> 헬라(HeLa) 세포의 배양

200 메쉬 R2/2 Quantifoil 금 EM 파인더 그리드의 탄소면을 25mA 이하로 25초동안 글로 방전하였다. 이 후 피브로넥틴(fibronectin, 40㎕, 50㎍/ml)으로 부동하여 EM 그리드를 코팅하고, 클린벤치에서 2시간동안 자외선 소독하였다.

헬라 세포를 그리드에 2x10⁴cells/ml(total 2ml)로 유리 바닥(glass-bottom) 디쉬에 분주하여, 37도℃, 5% CO₂ 조건에서 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)배지에 4.5g/L-글루타민, 글루코스, 10% FCS(fetal calf serum), 100units/ml 페니실린, 100mg/ml 스트렙토마이신을 첨가하여 약 18시간동안 배양하였다.

<1-2> HIV-1의 헬라세포에 대한 감염 및 살아있는 세포 이미징

형광 세포 트래커(Red CMTPX, 1ul/2ml)을 상기 배지에 처리하고 상기 트래커의 흡수를 위해 37℃에서 10분간 배양하고, PBS(phosphate-buffered saline)로 세포를 세척하였다.

이후에 연계될 초저온 전자현미경 관찰은 상대적으로 얇은 샘플 영역을 필요로 하기 때문에, 넓게 퍼진 세포를 포함한 여러 위치(10-15)를 선택하였고, 상기 세포 샘플들은 VSV-G pseudo-typed HIV-1 바이러스 입자 (GFP-Vpr(40㎕, 40ng/ml of p24)로 표지) 들을 이용하여 감염되었다.

상기 바이러스 감염이 완료된 시료는 상기 초저온 워크 스테이션 및 이를 포함한 연계형 이미징 검출장치에 준비되었고, 이 후, 상기 선택된 위치(10-15)에서 40분동안 연속적 고속 3차원 공초점 이미지(time-lapse high-speed 3D confocal image)들을 얻었다 (Nikon Tie 현미경, Prairie Technologies Swept Field Confocal(SFC) scanner). 데이터 분석은 MetaMorph(Molecular Devices, 미국) 또는 Imaris(Bitplane, 스위스) 소프트웨어를 이용했다 (도 13).

<1-3> 동결-수화 (frozen-hydrated) EM 샘플 준비

상기 시료 그리드의 공초점 이미지를 모은 후, 즉시 0.2㎛ 형광 마이크로스피어를 섞은 15nm 금 비드 용액 4㎕ 를 그리드에 뿌리고, 유입관(324) 및 냉각기(170)에 액체 질소를 주입하여 그리드를 급속동결 시킨다. 이 때 시료 그리드를 상기 그리드 홀더에 옮긴 후 다시 그리드 홀더를 냉각부홈(320)에 넣어서 냉각시킬 수 있다. 이 후 냉각된 그리드 홀더를 홀더 안착홈(330)으로 옮기고, 핀셋 등으로 시료를 그리드 수용홈(340)에 안착시켜 현미경 관찰할 수 있다. 상기 금 비드는 광학현미경 이미지와 전자현미경 이미지의 비교시의 화면지표로 이용된다 (도 14).

<1-4> 초저온 광학현미경 관찰법

본 발명자들은, 상기 실시예 <1-3>의 그리드 수용홈(340)에 안착되어 있는 시료를 측정렌즈(342)를 통해 올림푸스 IX 71 현미경으로 이미징 하였다.

상기의 이미징을 통해 초저온 차등간섭위상차(differential-interference contrast, DIC) 이미지와 초저온-GFP 이미지를 얻었으며, 상기 DIC와 GFP 이미지를 오버랩하면(도 15a, 15b), 상기 실시예 <1-2>의 살아있는 세포의 광학현미경 이미지들과 초저온 광학현미경 이미지들의 GFP 신호의 위치 연관성을 알 수 있다. 따라서 이 후 전자현미경 이미징시, 바이러스 입자들의 위치를 완전하게 특정할 수 있게된다.

<1-5> 초저온 전자 현미경 이미징 및 토모그래피

상기 초저온 광학현미경 관찰이 종료된 후, 전자현미경으로 연계되어진 부분의 이미징을 시작하였다.

구체적으로, 전계 방출 전자총과 post-GIF 2K x 2K CCD 카메라가 장착된 Gatan GIF2000 에너지 필터가 있는 FEI polara G3 전자 현미경을 사용하였고, 170 X 배율로 저선량(low-dose) 검색 모드에서 상기 실시예<1-4>에서 확인된 그리드 구역을 확인하고 저장한다. 상기 FEI polara G3 전자 현미경은 자동화된 데이터 수집을 위하여 Batch tomography 프로그램이 설치되어진 것이 사용될 수 있다.

이 후 EFTEM 이미징 모드로 전환하고, 3500 X 배율로 저선량(low-dose) 검색 모드에서, 100㎛ 대물렌즈 조리개를 넣고, 상기 실시예<2-4>에서 확인된 GFP 신호와 상관관계가 있는 모든 그리드 구역을 검색하고 저장한다.

이 후 저선량 노출 모드로 전환하고, 상관관계가 관찰되지 않아 필요 없는 부분은 무시하고, 빔 강도를 1 또는 2e^-/ Ų로 조절하고 기울기 축을 다시 설정한다.

이 후 저선량 포커스 모드로 전환 하고, 초점 거리를 ~3um 로 조정하고 초점방향을 기울기축과 평행하도록 각도를 조정한다.

이 후 저선량 검색 모드에서, 상기 EFTEM 이미징 모드에서 저장된 위치를 불러와서 표본 유센트릭 높이를 조정하고, 조사하고자 하는 영역의 기울기 범위를 확인한다. 상기 저선량 노출모드의 매우 낮은 전자선량(~1e^-/Å^2, 8~10 ㎛ 디포커스)에서 얻은 투영(projection) 이미지는, 초저온 전자 토모그래피에서 형광이미지와의 상관관계가 확인되는 바이러스 입자를 확인하기 위한 것이다.

이 후, 저용량 초점 모드로 전환하고, 무손실 에너지 필터(zero loss energy filter)의 슬릿을 중심으로 설정하고 TEM 자동 기능 메뉴에서 초점영역에서의 자동 유센트릭 높이와 초점 맞춤 기능을 진행한 후, tilt-series를 얻기 위한 파라미터를 설정하여, 상기 EFTEM 이미징 모드에서 저장된 모든 위치에서 본 단계를 진행하였다. (기울기 각도의 범위는 ±70˚, 이며 45˚상하로 2~3˚간격, 6㎛ defocus, 약 70e^-/Ų 선량(dose)).

상기의 방법으로 얻어진 데이타들은 IMOD를 이용하여 3차원으로 재복원 하였다 (Kremer, J.R., Mastronarde, D.N. & McIntosh, J.R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Struct Biol 116, 71-76 (1996).).

그 결과, 도 15c. 15d, 15e, 15f, 15g와 같이 연계형 이미징 검출장치를 이용한 광학현미경과 전자현미경의 연계형 현미경 관찰 방법을 통해 초저온 전자현미경 이미지에서 HIV-1 바이러스 입자의 위치를 특정할 수 있었다.

<실시예 2> 연계형 이미징 검출장치를 이용한 광학현미경과 전자현미경의 연계형 현미경 관찰 방법에 의한 생체 내 미세소포 확인

본 발명자들은 세포 내 미세소포(microvesicle)의 관찰을 위하여, 상기 <실시예 1>와 동일한 연계형 이미징 검출장치를 이용한 광학현미경과 전자현미경의 연계형 현미경 관찰 방법을 이용하여 세포 내에서 미세소포(microvesicle)의 위치 및 구조를 확인하였다.

구체적으로, 1 일동안 Raw 264.7 세포를 배양한 후, 콜라겐을 이용해 quantifiol EM finder 그리드를 코팅하고, 이후 상기 그리드를 자외선으로 2시간 동안 소독하고, 유리바닥 실험디쉬에 상기 세포를 분주하여 다시 1일간 배양하였다 (도 16a).

이 때 특히 알파벳과 숫자로 구성되어진 파인더 그리드(도 16b. 16c)를 사용하면, 형광시그널이 표지된 위치를 더욱 더 쉽게 파악할 수 있게 된다.

GRS(glycin tRNA synthetase)는 글루코즈 결핍 조건(glucose deprived condition)에서 세포질 특정 부위에 집중되고(localization), GRS는 미세소포(microvesicle) 표면에 붙어 세포질에서 세포 밖으로 분비되는 것이 관찰되었으므로, 미세소포(microvesicle)의 추적을 위한 바람직한 표적이 될 수 있다.

따라서 상기 세포를 배양한 실험디쉬에 글루코즈 결핍 조건을 2시간동안 만들어 주고, 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 화학적 고정시켰다. CAS를 이용해 염색 전 블로킹 하고, Triton x -100으로 세포막투과성을 높였다. 이 후 글라이신 tRNA 합성효소(glycin tRNA synthetase, GRS)를 토끼 유래 1차 항체로 2시간 내지 하루동안 표지하고(labeling), 상기 토끼유래 1차 항체는 다시 alexa488 형광염료로 염색된 2차 항체로 표지되었다. 그리고 상기 준비된 시료를 공초점 광학현미경으로 이미징하고, 급속 냉각 시킨 후, 광학현미경 관찰 결과 데이터 분석 후, 동결 전자현미경으로 관찰하였다 (Technai G2 Spirit Twin TEM at 120kV).

그 결과, GRS가 글루코즈 결핍 조건에서 세포질 특정부위에 집중되고, GRS가 세포에서 미세소포(microvesicle)를 통해 분비된다는 것을 확인하여, 미세소포(microvesicle)의 위치를 특정할 수 있었고 (도 17a, 17b, 17c, 17d, 17e), 연계된 동결전자현미경 이미징을 통해 GRS-연관 미세소포 (GRS-associated microvesicle)의 본연의 이미지를 확실하게 관찰할 수 있었다 (도 17f).

10: 워크 스테이션
14: 시편 장착 홀더
110: 상부 플레이트
120: 박스부
121: 제1 손잡이
122: 외부 단자부
123: 수직 지지부
124: 유입관
125: 배출관
140: 베이스 플레이트
141: 제2 손잡이
142: 수평 지지부
150: 그리드 수용부
152: 수용부 커버
154: 커버 손잡이
155: 개방부
156: 제1 유입공
157: 제2 유입공
158: 관통공
170: 냉각기
180: 연장관
190: 슬라이딩 가이드
310: 냉각수 수용부
312: 유입격벽
320: 냉각부홈
323: 수용부 격벽
324: 유입공
325: 배출공
330: 홀더 안착홈
340: 그리드 수용홈
342: 렌즈홈
343: 온도센서
350: 휴대용 냉각부
360: 제1 유입관
370: 제2 유입관
380: 안착 헤드
382: 그리드 안착홈
400: 측정렌즈 홀더
410: 홀더 본체
420: 가스 주입부
430: 완충제
510: 높이조절장치
520: 지면 플레이트
530: 작동축
540: 절첩부재
550: 구동레버

Claims (14)

1. 측정될 시료 그리드가 수용되며, 외부에 구비된 액체질소 탱크로부터 내부로 시편 그리드를 냉각시키기 위한 액체질소가 공급되는 유입공과, 공급된 액체질소가 외부로 배출되는 배출공이 형성된 그리드 수용부; 및
   내부에 액체질소를 저장할 수 있는 냉각기와, 상기 냉각기로부터 일측으로 연장되어 액체질소를 공급하는 연장관과, 상기 연장관의 연장된 선단에 형성되어 시료 그리드를 안착시킬 수 있도록 그리드 안착홈이 구비된 안착 헤드를 구비하여, 상기 그리드 수용부로 슬라이딩 가능하게 결합되는 시편 장착 홀더를 포함하는 워크 스테이션을 이용하여,
   1) 상기 시료 그리드를 광학현미경으로 이미징하는 단계;
   2) 상기 단계 1)에서 얻은 광학현미경 이미지로부터 상기 시료 그리드 상의 전자 현미경 관찰을 위한 표적 위치를 선별하는 단계;
   3) 상기 단계 2)에서 선별된 시료 그리드 상의 표적 위치를 초저온 전자현미경 관찰법으로 이미징하는 단계를 포함하고,
   상기 워크 스테이션의 상기 유입공을 통해 냉각제를 주입하면서 상기 시료 그리드를 광학현미경으로 관찰하며, 관찰 후 상기 시편 장착 홀더를 슬라이딩 이동시켜 상기 그리드 수용부로부터 분리하고, 전자현미경으로 투입하여 측정이 완료될 때까지 상기 시편 장착 홀더는 상기 냉각기에 의해 액체질소가 지속적으로 공급되어 상기 시료 그리드의 상태를 초저온상으로 유지시키는 것을 특징으로 하는 시료 관찰 방법.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 시료 그리드는 급속 냉각된 것인 시료 관찰 방법.
   
3. 제 1항에 있어서, 상기 시료 그리드는 화면지표로 사용되는 물질이 가해진 것인 시료 관찰 방법.
   
4. 제 1항에 있어서, 상기 시료 관찰 방법은 생체 시료, 바이러스 입자, 미세소포, 또는 나노입자 관찰을 위한 것인 시료 관찰 방법.
   
5. 외부에 구비된 액체질소 탱크로부터 내부로 시편 그리드를 냉각시키기 위한 액체질소가 공급되는 유입공과, 공급된 액체질소가 외부로 배출되는 배출공과, 공급된 냉각제가 수용되는 냉각제 수용부와, 상기 냉각제 수용부와 분리되어 형성되고 측정될 시료 그리드가 위치될 수 있는 그리드 수용홈, 및 상기 그리드 수용홈의 하부에 삽입되어 상기 시편 그리드를 측정할 수 있는 측정 렌즈가 삽입되는 렌즈홈이 구비된 그리드 수용부;
   내부에 액체질소를 저장할 수 있는 냉각기와, 상기 냉각기로부터 일측으로 연장되어 액체질소를 공급하는 연장관과, 상기 연장관의 연장된 선단에 형성되어 시료 그리드를 안착시킬 수 있도록 그리드 안착홈이 구비된 안착 헤드를 포함하는 시편 장착 홀더; 및
   베이스 플레이트에 마련되어 상기 시편 장착 홀더를 지지하며 상기 시편 장착 홀더를 상기 그리드 수용부로부터 탈착 시킬 수 있도록 슬라이딩시키는 슬라이딩 가이드를 포함하여,
   상기 연장관이 상기 그리드 수용부에 연결되어 시료 그리드의 전처리가 수행된 후에 상기 연장관이 분리되어 상기 시편 장착 홀더가 연계 측정을 위한 전자 현미경의 측정부에 삽입되는 것을 특징으로 하는 워크 스테이션.
   
6. 제 5항에 있어서,
   상기 그리드 수용부는,
   상기 시편 그리드를 다수 고정하는 그리드 홀더를 삽입하여 냉각제에 잠겨진 상태를 유지시키는 냉각부홈; 및
   상기 냉각부홈으로부터 상기 그리드 홀더를 건져내서 상기 그리드 수용홈의 일측에 안착시키는 홀더 안착홈을 포함하는 것을 특징으로 하는 워크 스테이션.
   
7. 제 5항에 있어서,
   상기 그리드 수용부가 형성되는 박스부;
   상기 박스부의 상부를 덮되, 상기 그리드 수용부의 일부를 노출시키는 개구부가 형성된 상부 플레이트;
   상기 상부 플레이트를 수직 방향으로 지지하는 지지부; 및
   상기 지지부의 하단을 지지하는 베이스 플레이트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 워크 스테이션.
   
8. 삭제
9. 제 5항에 있어서, 상기 그리드 수용홈의 내부에 온도를 측정할 수 있도록 하는 온도감지 센서가 더 포함된 것을 특징으로 하는 워크 스테이션.
   
10. 제 5항에 있어서, 상기 시편 장착 홀더의 연장관의 선단에는 직경이 점차 작아지는 적어도 하나의 단차가 형성된 것을 특징으로 하는 워크 스테이션.
    
11. 제 5항에 있어서,
    상기 슬라이딩 가이드는,
    상기 시편 장착 홀더를 상기 그리드 수용부로부터 분리되는 방향으로 슬라이딩시, 상기 시편 장착 홀더가 상기 그리드 수용부로 삽입되는 깊이를 제한하는 스토퍼가 구비된 것을 특징으로 하는 워크 스테이션.
    
12. 제 7항에 있어서,
    상기 베이스 플레이트의 하부면을 받쳐 상기 워크 스테이션의 상하 높이를 조절하는 높이조절장치를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 워크 스테이션.
13. 삭제
14. 삭제

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