JP2014501906A - 電子顕微鏡及び蛍光顕微鏡で検査のための生体試料の調製方法 - Google Patents
電子顕微鏡及び蛍光顕微鏡で検査のための生体試料の調製方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
−生体試料を準備し、
−高圧凍結で試料を凍結固定し、
−凍結切片により切片を形成し、
−切片を電気顕微鏡グリッド上に配置し、
−室温で免疫ラベル化し、及び
−前記切片を、電子顕微鏡及び蛍光顕微鏡で検査することを含む。
循環(血液)細胞は、ヒト及び動物の体の他の組織の全てのタイプの細胞と遭遇する。これらの遭遇の際には、前記循環細胞と「身体」細胞の間に「情報」の交換が生じる。この情報交換は、身体細胞により送られる分子シグナルにより促進され、分子は循環細胞でレセプタータンパク質として認識され、又は身体細胞で生成された分子又はエキソソームが前記循環細胞により捕捉される。両方のプロセスは、循環細胞でのシグナル処理において変化を生じる結果となり、これらのシグナル処理プロセスはこれらのシグナルプロセスにより制御される遺伝子転写物のアップ及びダウンレギュレーションを生じる結果となる。しばしばこれらのプロセスは、循環細胞のタンパク質プロフィールに変化を与える結果となる。さらに、(シグナル)分子は、前記循環細胞に補足され内部化され(Hofman E、Thesis、Chapter 1、2008、ISBN 978−90−393−4905)、これはまた循環細胞のタンパク質プロフィールを変化させる。これらのタンパク質プロフィールの変化はしばしば、循環細胞及び細胞表面抗原の形態に影響を与える。また、細胞表面のタンパク質複合体の、二量化などの変化が起こり、その結果細胞外レセプターの活性化又は不活性化が生じ得る。タンパク質プロフィールの変化は、プロテオミック技術でモニターされ得る一方、形態変化は、例えば細胞中で新たな複合体の形成や分解などのようなタンパク質プロフィールの明らかな違いを示さずに生じる。
高圧凍結、切片化及びAFSへのグリッド移動
白血病細胞株からのTHP−1ヒト単球細胞はATCC(LGC Standards GmbH、Wesel、ドイツ)から入手し、供給者の指示書に従い培養した。高圧凍結のために、前記細胞を遠心(5分、1200rpm)し、得られたペレットをデキストラン(最終濃度15%)中に再懸濁した。銅試料管をデキストラン中の前記懸濁液で満たし、LeicaEMPACTを用いて約2000バールで高圧凍結した。凍結管は切片化に先立ち液体窒素中で保存した。前記管をトリムし、LeicaCRION静電防止装置を放電に設定して、−150℃でLEIcaEMUC6/FC6ウルトラムミクロトーム内でダイヤモンドナイフを用いて切片化した。切片化の再、60から80ナノメートルの厚さで、長い光沢のあるように見える切片のリボンをTEMグリッド上に整列させた。formvar膜を持ち、カーボンコーティングされグロー放電される前記グリッドは前記Leicaミクロ操作装置のナイフエッジの近くに保持された。前記リボンが十分に長い場合、LeicaCRION静電防止装置で前記グリッドへ静的に接着された。ここで、非常に重要なことは、前記接着が良好かどうかを、前記切片をグリッドから持ち上げられるかどうかでチェックされることであるが、持ち上げ可能であってはならない。VIS2FIXFS方法を用いる場合、前記切片は、有効な固定化を達成するには少なくとも80nmの厚さを必要とする、ということが見出された。
Leica試薬浴(最小高さを±1cmに最小化するために切断)内に、Leicaフロースルーリング(最小高さを±6mmに最小化するために切断)を設けた。前記フロースルーリングを含む試薬浴は、前記AFS2内の−90℃での缶(Leicaユニバーサル容器)内の3つの冷却リング(Leica底板)上に設けられた。この温度で、−90℃の固定化剤を含む乾燥アセトン(Sigma−Aldrich、St Louis、Missouri、アメリカ)3mLを前記フロースルーリングにピペットで入れて、Aclarホイル(直径3.5cm)でカバーした。アセトンは、前記試料中のリン脂質の保持がメタノールよりも高いことから、FS(媒体として選択された。使用された固定化剤は、アセトン中の0.1%酢酸ウラニウム、0.1から0.5%グルタルアルデヒド及び0.2から0.5%の四酸化オスミウムであった。切片化に続いて、前記SDホルダー内のグリッドは前記の通り前記FSチャンバへ移動した。予冷却された曲げられた微細先端ピンセット(カバースリップピンセットと類似)を用いて、それぞれのグリッドは注意深く、前記リングの1つのフロースルー区画内の固定化剤の表面に切片を浮遊させた。1つのフロースルーリングは最大10のグリッドを保持するが、前記の通り、固定化剤と共に3つまでのフロースルーリングが前記AFS2に配置され得る。前記アセトンの低表面張力により、前記グリッドは最終的には前記フロースルー区画の底部に溶液中に沈む。前記最後のグリッドを配置すると直ぐに、前記凍結置換プログラムを開始した。望ましい場合、前記固定化剤組成は前記凍結置換の際いつでも変更され得る。これを達成するため、固定化剤の大部分を前記フロースルーリングの中心から除去するが、いくらかの洗浄ステップを続けてもよい。ここで重要なことは前記グリッドを乾燥させないことである。続いて前記新たな固定化剤を前記グリッドと共にフロースルーリングへ添加され得る。前記固定化剤が、−90℃から−60℃で、アセトン中0.1%酢酸ウラニウムと0.2%の四酸化オスミウムから、続いてアセトン中0.1%酢酸ウラニウムと0.2%の四酸化オスミウム及び0.2%グルタルアルデヒドと交換する場合に、良好な形態が達成された。温度が0℃に到達して凍結置換プログラムが終了した時点で、前記グリッドを5回以上、乾燥アセトン中の0.2%グルタルアルデヒドで前記の通り洗浄する。続く再水和ステップは、0℃でAFS2内で実施され、1から2分の7連続ステップ:水中で95%アセトン中0.2%GA、90%アセトン中0.2%GA、80%アセトン中0.2%GA、70%アセトン中0.2%GA、50%アセトン中0.2%GA、30%アセトン中0.2%GA、及び最後に10%アセトン中0.2%GA、で行われた。再水和の後前記フロースルーリング内のグリッドは3回水で洗浄された。前記グリッドは、前記フロースルーリングから、微細先端ピンセットを用いて除去し、前記グリッドの背側をやや湿らせた濾紙で乾燥させた。最後に前記グリッドは、パラフィン片上に置かれた水滴上に浮遊させて1分で7回洗浄した。この点で前記グリッドは、免疫ラベル化又は後の使用のための保存の準備が整った。これらの切片はTokuyasu切片と同様に保存され得る。保存のために、前記グリッドは、氷上の0.1MPHEM緩衝液(60mMPEPES、25mMPEPES、10mMEGRA及び2mMMgCl2、pH6.9へ調節)中のメチルセルロース及び2.3Mスクロースの1:1混合物の一滴上で短時間インキュベートされた。前記グリッドは次にゆっくりと前記粘性滴から引き上げパラフィンでカバーされた前記切片を含むガラススライド上に前記滴を下向きにして置かれた。前記グリッドを含むガラススライドは、ガラスペトリ皿に入れてパラフィンで密閉し4℃で保存された。
0.05から0.5%の四酸化オスミウム、0.2%酢酸ウラニウム及び0.2%のグルタルアルデヒドを含む固定化剤の2mLが、氷状で0.1MPHEM緩衝液中で調製された。800μmlの最終容積を、前記浴の底をカバーする試薬浴(最小高さ1cmに切断)内に配置された。前記試薬浴は、次にAFS2(−90℃に設定)へ移動され、Aclarホイル(直径3.5cm)でカバーされた缶内の3つの冷却リングの上部に配置された。固定化剤は直ぐに凍結された。前記グリッドは前記の通りAFS2へ移動され、予冷却された微細先端ピンセットで、静かに切片を前記凍結固定化剤表面に上に下向きに置いた。前記グリッドを含む試薬浴は次に、空気から保護するために冷却されたペトリ皿内に移された。その後AFS2から取り出されてガラスペトリ皿に(直径9cm)でカバーされた40℃のホットプレート上に置かれた。前記ホットプレート上のペトリ皿を静かに回しながら前記固定化剤を溶融させた。約4から5分間で前記固定化剤の表面が液化するとすぐに前記グリッドは浮遊を始めた。前記固定化剤及びグリッドを含むペトリ皿は次に迅速に氷上に移して、光から保護し、さらに10分間固定化させた。最後に、前記グリッドを固定化剤から除去して10回1分間水滴上で洗浄され、免疫ラベル化又は保存(前記のような)のために整った。
免疫TEMのために、VIS2FIX固定化切片での遊離アルデヒド基は、0.1MPHEM緩衝液中0.02Mグリシンで、2分間5回洗浄することで失活させた。前記切片は、前記抗体の非特異的結合から、15分間、0.1MPHEM緩衝液中で1%(体積/重量)BSA(ウシ血清アルブミン)を含むブロック緩衝液でインキュベートすることでブロックし、続いて、ブロック緩衝液で希釈した第1の抗体(マウスモノクローナル抗PDI、1:199、Stressgen Biotechnologies Corp.、British Columbia、カナダ)で1時間インキュベートした。0.1MPHEM緩衝液中0.1%(体積/重量)BSAで5回洗浄後、切片を、20分間、ブリッジング抗体ウサギ抗マウスIg(ブロック緩衝液中1:200、Dako、Glostrup、デンマーク)でインキュベートした。前記切片を、PHEM緩衝液中0.1%BSAで2分間で5回洗浄し、続いてタンパク質A金(ブロック緩衝液中で20分間インキュベート、Cell Microscopy Centre、University Medical Centre Utrecht)でラベル化した。0.1MPHEM緩衝液で15分間10回洗浄後、前記ラベル化は5分間1%グルタルアルデヒドインキュベートで安定化された。前記緩衝液及びグルタルアルデヒドを除去するために、前記切片は、水滴上で1分間10回洗浄され、水中(pH7)2%シュウ酸ウラニウムで5分間染色した。その後切片は水上で短時間2回洗浄された。最後に、切片は、氷上で1.8%メチルセルロース内に0.4%酢酸ウラニウム中に埋め込まれた。
第1抗体としてマウスモノクローナル抗LAMP2が使用された(1:150、BD Biosciences Pharmingen、San Diego、California、アメリカ)。タンパク質A金インキュベートステップに続いて、前記グリッドを0.1MPHEM緩衝液中0.1%BSAで2分間5回線上し、続いてAlexa488蛍光共役ヤギ抗ウサギ抗体(1:200、Invitrogen、Carlsbad、California、アメイカ)で45分間インキュベートした。前記切片を0.1MPHEM緩衝液で2分間5回洗浄し、4%ホルムアルデヒド(固定化剤としてグルタルアルデヒドの使用は、前記切片の自動蛍光が増加し得る)で15分間固定化された。これは続いて、水で1分間10回洗浄され、2%シュウ酸ウラニウム及び続いて2%酢酸ウラニウムで染色された。前記切片は、前記染色ステップの間に短く水で2回洗浄された。最後に前記切片は洗浄されて、氷上で1.8%メチルセルロース内に埋め込まれた。
前記切片は、統合化レーザー及び電子顕微鏡(iLEM);Tecnai 12 120kV透過電子顕微鏡(FEI company、Eindhoven、オランダ)を用いて画像化された。前記ILEMは、カスタム設計の、前記試料ステージに直接面する側の1つに設けられるレーザー走査蛍光顕微鏡を持つ。TEM操作の際に、蛍光顕微鏡は前記TEMカラムからやや傾けられてTEM画像化や操作を妨げない。前記TEM画像は、底部に設けられるTEMCam−F214(Tietzビデオ及び画像処理システム、Gauting、ドイツ)CCDカメラで80keVで記録された。前記レーザー走査顕微鏡は、400nm青色光子シングルモードレーザー(Omicron Laserage Laserprodukte GmbH、Rodgau−Dudenhofen、ドイツ)及びアバランチ光ダイオード(APD)検出装置を備えている。前記iLEMの蛍光顕微鏡は、LabView8.0に基づきA.V.Agronskaia博士が独自に設計したソフトウェアを用いて操作された。
図3は、VIS2FIX方法及び免疫金ラベル化PDIの超構造的側面を示す。
(a)は、脂質液滴(LD)の中性脂質コアが、VIS2FIXFS固定化後で失われていることを示す。
(b)は、VIS2FIXH後に、脂質コアが、液滴内部に存在する密度して観察される。
(c)は、VIS2FIXFSでER残留タンパク質PDIの免疫金(15nm)ラベル化を示す。
(d)はVIS2FIXH切片上でのPDIの免疫金(15nm)ラベル化を示す。
ここで留意すべきは、(c)及び(d)での全細胞質及び核内に保存されたヘテロクロマチンである。
ここで、Ly:リソソーム;G:ゴルジ体;M:ミトコンドリア;Mv:多胞体を示す。
倍率を示す線は、(a)と(b)では300nm、及び(c)と(d)では500nmである。
(a)は、免疫金及び免疫蛍光(オンライン方法参照)でのLAMP2のための切片ラベル化の50μm2領域の蛍光画像を示す。
(b)は、(a)で示された領域の蛍光シグナルを、前記同じ領域のTEM画像と重ねたものである。
(c)(b)で示された領域のより高倍率のTEM画像である。
前記リソソームの過剰ラベル化に留意すること。
倍率を表す線は、(a)では10μm、(b)では1μm及び(c)では500nmである。
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Claims (16)
- 電子顕微鏡及び蛍光顕微鏡で検査するために生体試料を調製する方法であり、前記方法は:
−生体試料を準備し、
−試料を高圧凍結で凍結固定化し、
−凍結切片化で切片を作成し、
−切片を電子顕微鏡グリッド上に配置し、
−室温で免疫ラベル化し、及び
−前記切片を電子顕微鏡及び蛍光顕微鏡で検査することを含み、
−固定化及び/又は染色を前記電子顕微鏡上に設けられる前記切片で実施することを特徴とする、方法。 - 請求項に記載の方法であり、前記固定化及び/又は染色が、凍結温度で実施される、方法。
- 請求項2に記載の方法であり、さらに、前記切片の凍結置換、続いて前記切片を凍結状態から室温へ戻し、続いて再水和させることを含む、方法。
- 請求項2に記載の方法であり、前記凍結置換が、水と、固定化剤を含む有機溶媒の混合物とを置換すること、より具体的には水と、アセトン及び固定化剤との混合物とを置換することを含む、方法。
- 請求項3に記載の方法であり、前記置換が、凍結温度で、より具体的には−90℃未満の温度で、最も具体的には−90℃で実施される、方法。
- 請求項1に記載の方法であり、前記方法がさらに、前記凍結断片を凍結水系固定化剤上に設け、続いて融解させて前記切片を前記凍結水系固定化剤を融解させることで固定化し、及び前記切片を氷の融解温度で固定化することを含む、方法。
- 請求項1乃至6のいずれか一項に記載の方法であり、前記ラベル化が蛍光ラベル化剤でラベル化することを含む、方法。
- 請求項1乃至7のいずれか一項に記載の方法であり、前記ラベル化が、電子緻密ラベル化剤、より具体的には、金、銀、パラジウム、白金からの重金属でラベル化することを含む、方法
- 請求項1乃至5のいずれか一項に記載の方法であり、前記ラベル化が、量子ドットでラベル化することを含む、方法。
- 請求項1乃至9のいずれか一項に記載の方法であり、前記電子顕微鏡及び蛍光顕微鏡が1つの装置に組み合わされている、方法。
- 請求項1乃至3のいずれか一項に記載の方法であり、オスミウム含有物が、固定化剤及び/又は電子緻密染色として使用され、及びオスミウムが、−60℃未満で前記凍結置換媒体から除去されそれにより抗原性を防止することを含む、方法。
- 請求項1乃至11のいずれか一項に記載の方法を実施するための取り扱い装置であり、前記装置は:
−凍結固定化剤及び/又は凍結置換媒体及び/又はラベル化用流体を保持するための容器、
−蓋を含み、前記蓋は前記容器の上部に位置され、前記蓋は、脱着可能に許容するグリッドのためのロク機構を含む、取り扱い装置。 - 請求項12に記載の取り扱い装置であり、グリッドを取り扱うための強化周縁部を設け、前記グリッドが自動的取り扱いのために好適である、取り扱い装置。
- 請求項2乃至5のいずれか一項に記載の方法であり、前記固定化及び/又は染色が、請求項12又は13のいずれか一項に記載の取り扱い装置で実施される、方法。
- 請求項6に記載の方法であり、前記凍結水系固定化剤上に設けられ、及び融解されることが、請求項12又は13のいずれか一項に記載の取り扱い装置で生じる、方法。
- 請求項14又は15のいずれか一項に記載の方法であり、前記ラベル化が請求項12又は13のいずれか一項に記載の取り扱い装置で生じる、方法。
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2011
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