CN111929436A

CN111929436A - 一种用于冷冻电镜的免疫金标记蛋白质方法

Info

Publication number: CN111929436A
Application number: CN202011068573.XA
Authority: CN
Inventors: 匡栩源; 陈若蝉; 彭争荣; 祖映翔; 吴峰静; 柏素芬
Original assignee: Xiangya Hospital of Central South University
Current assignee: Xiangya Hospital of Central South University
Priority date: 2020-10-09
Filing date: 2020-10-09
Publication date: 2020-11-13

Abstract

本发明提供一种用于冷冻电镜的免疫金标记蛋白质方法，包括如下步骤：1）利用多聚‑L‑赖氨酸溶液和PBS分别对冷冻电镜的格栅进行预处理；2）将格栅正面朝上放置在培养皿中，滴取样品到格栅上，静置孵育后用PBS洗脱；3）在培养皿中加入封闭剂，静置孵育后用PBS洗脱；4）在培养皿中加入一抗，即目标蛋白质的特异性抗体，静置孵育后用PBS洗脱；5）在培养皿中加入二抗，即根据一抗种属选取的免疫金抗体，静置孵育后用PBS洗脱；6）取出格栅并用冷冻电镜成像，分析图像数据得到目标蛋白质结构。本发明结合免疫标记蛋白质技术和冷冻电镜断层扫描技术的优点，实现在冷冻电镜成像中观察到目标蛋白质的同时进行结构解析。

Description

一种用于冷冻电镜的免疫金标记蛋白质方法

技术领域

本发明涉及免疫标记技术领域，特别地，涉及一种用于冷冻电镜的免疫金标记蛋白质方法。

背景技术

免疫标记蛋白质技术被广泛应用于临床及科学研究中，例如在室温下对病理切片进行分析等。该技术通过使蛋白质抗体与蛋白质孵育后特异性结合起到标记蛋白质的作用，但常规的免疫标记方法只能用于实现对蛋白质的区分和示踪，即证明样品中含有该蛋白质，而不可见蛋白质的具体结构。

目前常采用的分析蛋白质结构的手段为冷冻电镜断层扫描技术，它是一种在低温下使用透射电子显微镜来观察样品结构的显微技术，可通过获取同一区域多个角度的投影图来反向重构研究对象的三维结构，因此适合于在纳米级尺度上研究不具有结构均一性的蛋白、病毒、细胞器以及它们之间组成的复合体的三维结构。具体过程为：首先将样品冻起来并保持低温状态放入显微镜内，接着用高度相干的电子作为光源从样品上方照射，电子透过样品及附近的冰层时会发生散射，然后利用探测器和透镜系统把散射信号成像记录下来，最后对信号进行处理分析以得到目标样品结构。但冷冻电镜的缺点在于只能显示蛋白质的三维结构而不能对蛋白质进行标记。

综上所述，需要本领域技术人员开发一种新的免疫标记蛋白质技术，在鉴定蛋白质的同时可对蛋白质的结构进行研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可在鉴定蛋白质的同时对蛋白质结构进行研究的免疫标记蛋白质技术，以解决背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供一种用于冷冻电镜的免疫金标记蛋白质方法，包括如下步骤：

步骤1）利用多聚-L-赖氨酸溶液和PBS（即磷酸缓冲盐溶液）分别对冷冻电镜的格栅进行预处理；

步骤2）将格栅正面朝上放置在培养皿中，滴取样品到格栅上，静置孵育后用PBS洗脱；

步骤3）在培养皿中加入封闭剂对蛋白质进行封闭，静置孵育后用PBS洗脱；

步骤4）在培养皿中加入一抗，即目标蛋白质的特异性抗体，静置孵育后用PBS洗脱；

步骤5）在培养皿中加入二抗，即根据一抗种属选取的免疫金抗体，静置孵育后用PBS洗脱；

步骤6）取出格栅并进行冷冻处理，然后利用透射电子显微镜成像，最后对图像数据进行分析处理以得到目标蛋白质的结构。

优选地，在所述步骤2）~步骤5）中，装有格栅的培养皿被放置在尺寸更大且装有PBS的培养皿中，以确保培养皿周边环境潮湿。

优选地，在所述所述步骤2）~步骤5）中，所述PBS洗脱的具体过程为：用移液枪吸取PBS至格栅上，确保格栅的表面完全被PBS覆盖，洗脱完成后用移液枪移去多余的液体。

优选地，在所述步骤4）和步骤5）中，加入一抗和二抗的方式均为将抗体用PBS稀释后加入培养皿中。

优选地，在所述步骤2）中，所述培养皿中间设有用于容置格栅的凹槽结构。所述凹槽结构通常能容纳2-3个格栅，确保在操作过程中格栅不会随意移动。

优选地，所述步骤1）中预处理格栅的具体过程为：首先用多聚-L-赖氨酸溶液覆盖格栅，然后移除多聚-L-赖氨酸溶液，接着用1x PBS浸泡格栅，最后用镊子将格栅夹取至滤纸上干燥备用。

优选地，所述多聚-L-赖氨酸溶液的质量浓度为0.01~0.1%。利用该浓度范围的多聚-L-赖氨酸溶液对格栅进行预处理效果最好，若浓度太高，从4℃冰箱中转移至室温环境下，溶液本身会很快凝固成固体状，无法使用，若浓度太低，则溶液本身很难形成足够的表面张力覆盖到格栅上。

优选地，在所述步骤1）之前，用纯丙酮清洗格栅，并用辉光放电仪对格栅进行预处理。

优选地，在所述步骤6）中，采用Leica EMGP冷冻仪，冷冻格栅的具体过程为：用镊子夹取格栅，设置冷冻仪使格栅的正面朝向冷冻仪的加样侧，用滤纸从加样侧的背面吸取格栅上多余的液体，样品随着液体扩散形成的液膜均匀分布并通过冻仪制冷形成薄冰层。

Leica EMGP冷冻仪的结构特殊，Leica EMGP冷冻仪从样本后方吸附液体，可保证样本的完整性，而其他品牌的冷冻仪均采用从两面吸附的方式，将同时吸附走大部分样本，不能达到本发明中这么好的效果。

优选地，所述格栅为表面覆盖连续碳膜的200目的铜网。

应用本发明提供的技术方案，至少具有如下有益效果：

1、本发明结合了免疫标记蛋白质技术和冷冻电镜断层扫描技术的优点，首先通过一抗蛋白质抗体与目标蛋白质特异性结合且二抗免疫金颗粒抗体又与一抗蛋白质抗体结合，使得目标蛋白质因带有金颗粒而被标记，进而可在冷冻电镜成像中被观察到；然后通过冷冻电镜本身的扫描功能对冷冻样品的中蛋白质进行结构解析，实现在鉴定蛋白质的同时对蛋白质的结构进行研究，尤其是在分辨率不理想或无法找到生物已知结构作为参照的情况下，例如对破碎生物膜的膜蛋白的鉴定等，从而为发现全新的高分辨率的蛋白质结构提供技术支持。

2、本发明为了实现将目标蛋白质牢牢固定在格栅上，首先使用了多聚-L-赖氨酸溶液对格栅进行预处理，且当多聚-L-赖氨酸溶液的质量浓度为0.01~0.1%时效果最好；然后对每次孵育后的洗脱过程进行改进：用移液枪吸取PBS至格栅上，确保格栅的表面完全被PBS覆盖，洗脱完成后再用移液枪移去多余的液体，确保洗脱完全且不会将蛋白质冲走。

3、本发明选用了冷冻电镜而非普通的扫描电镜，避免发生因普通电镜在固化蛋白质时需要使用酒精而导致蛋白质结构发生变化的问题；且为了防止在蛋白质孵育过程中出现溶液干涸的情况，本发明还通过将装有格栅的较小尺寸的培养皿放置在装有PBS的较大尺寸的培养皿中，以确保试验全程孵育环境潮湿。

4、本发明还对培养皿容器进行改进，通过选取特定型号的培养皿以便于在格栅上进行操作，且在培养皿的中部位置设置凹槽以减少操作过程中格栅的移动，避免样品脱落和碳膜破损。

5、本发明通过对各步骤处理时间的优化，确保实验结果表现最佳，在抗体孵育过程中，时间太长会导致蛋白质降解，时间太短则不能保证抗体完全结合，在PBS漂洗过程中，时间太长会导致蛋白质降解，时间太短则能增加非特异性的结合。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：

图1是本发明实施例1中对褐藻类囊体膜蛋白进行免疫金标记后采用冷冻电镜断层扫描成像的截面图，可见6nm的金吸附于蛋白质上。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

一种用于冷冻电镜的免疫金标记蛋白质方法，目标蛋白质为褐藻类囊体膜蛋白，具体标记过程如下：

1）格栅的预处理

冷冻电镜的格栅为表面覆盖连续碳膜的200目的铜网，首先用纯丙酮清洗格栅，然后用辉光放电仪对格栅进行处理，接着用质量分数为0.01%的多聚-L-赖氨酸溶液覆盖格栅2小时，移除多聚-L-赖氨酸溶液，然后用1x PBS浸泡格栅2小时，最后用镊子将格栅夹取至滤纸上干燥备用。

2）样品孵育

首先按要求制备好样品，取直径4cm且中间带凹槽的培养皿，在每个培养皿内放置若干个格栅且保证每个格栅的正面朝上，然后滴取样品到格栅上，最后将装有格栅的小培养皿放置在直径10cm且装有PBS的大培养皿中，静置孵育1小时；

孵育完成后，轻轻用量程为10ul的移液枪吸取PBS约100ul-150ul，滴在每个格栅上洗脱10分钟，用移液枪移去多余的液体。

3）封闭

在培养皿中加入120ul含4% BSA的PBS，静置孵育30分钟以减少抗体的非特异性结合；

4）一抗孵育

在培养皿中加入一抗膜蛋白抗体（按照1:125的比例稀释于PBS）8ul，室温孵育1小时；

5）二抗孵育

在培养皿中加入二抗免疫金抗体（按照1:5的比例稀释于PBS）100ul，室温孵育30分钟，所述免疫金抗体根据一抗的种属选取EMS 25104羊抗兔IgG抗体（H&L）且抗体中孵育金颗粒大小为6nm；

孵育完成后，轻轻用量程为10ul的移液枪吸取PBS约100ul-150ul，滴在每个格栅上洗脱30分钟备用。

6）冷冻电镜成像及数据处理

用镊子夹出浸泡在PBS中的格栅并置于Leica EMGP冷冻仪中，使格栅的正面朝向冷冻仪的加样侧，用滤纸从加样侧的背面吸取格栅上多余的液体，样品随着液体扩散形成的液膜均匀分布并通过冻仪制冷形成薄冰层。

将冷冻好的格栅放入透射电子显微镜内行断层扫描成像，对得到的图像数据进行分析处理：参见图1，通过移动二维图像的纵轴可见免疫金附着在蛋白质上，因此可确定样品中含有目标膜蛋白，再通过对二维图像的三维重构得到该蛋白质的具体结构。

为了证明本发明技术的效果优势，申请人还进行了多组对照实验：除了不使用多聚-L-赖氨酸对格栅进行处理或不使用带凹槽的培养皿之外，对比实施例的其他步骤均与实施例1相同。对比发现，在不使用多聚-L-赖氨酸的对比实施例中，铜网上的样本大量脱落；在不使用带凹槽的培养皿的对比实施例中，经多次PBS漂洗后的铜网的破损率高达70%以上；而本发明实施例中通过带凹槽培养皿和多聚-L-赖氨酸的配合使用，确保铜网破损率控制在50%以内，附着样本保存较完好。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。在本发明的精神和原则之内，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的任何改进或等同替换，直接或间接运用在其它相关的技术领域，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种用于冷冻电镜的免疫金标记蛋白质方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1）利用多聚-L-赖氨酸溶液和PBS分别对冷冻电镜的格栅进行预处理；

2.根据权利要求1所述用于冷冻电镜的免疫金标记蛋白质方法，其特征在于，在所述步骤2）~步骤5）中，装有格栅的培养皿被放置在尺寸更大且装有PBS的培养皿中，以确保培养皿周边环境潮湿。

3.根据权利要求2所述用于冷冻电镜的免疫金标记蛋白质方法，其特征在于，在所述所述步骤2）~步骤5）中，所述PBS洗脱的具体过程为：用移液枪吸取PBS至格栅上，确保格栅的表面完全被PBS覆盖，洗脱完成后用移液枪移去多余的液体。

4.根据权利要求3所述用于冷冻电镜的免疫金标记蛋白质方法，其特征在于，在所述步骤4）和步骤5）中，加入一抗和二抗的方式均为将抗体用PBS稀释后加入培养皿中。

5.根据权利要求4所述用于冷冻电镜的免疫金标记蛋白质方法，其特征在于，在所述步骤2）中，所述培养皿中间设有用于容置格栅的凹槽结构。

6.根据权利要求1~5中任意一项所述用于冷冻电镜的免疫金标记蛋白质方法，其特征在于，所述步骤1）中预处理格栅的具体过程为：首先用多聚-L-赖氨酸溶液覆盖格栅，然后移除多聚-L-赖氨酸溶液，接着用1x PBS浸泡格栅，最后用镊子将格栅夹取至滤纸上干燥备用。

7.根据权利要求6所述用于冷冻电镜的免疫金标记蛋白质方法，其特征在于，所述多聚-L-赖氨酸溶液的质量浓度为0.01~0.1%。

8.根据权利要求7所述用于冷冻电镜的免疫金标记蛋白质方法，其特征在于，在所述步骤1）之前，用纯丙酮清洗格栅，并用辉光放电仪对格栅进行预处理。

9.根据权利要求8所述用于冷冻电镜的免疫金标记蛋白质方法，其特征在于，在所述步骤6）中，采用Leica EMGP冷冻仪，冷冻格栅的具体过程为：用镊子夹取格栅，设置冷冻仪使格栅的正面朝向冷冻仪的加样侧，用滤纸从加样侧的背面吸取格栅上多余的液体，样品随着液体扩散形成的液膜均匀分布并通过冻仪制冷形成薄冰层。

10.根据权利要求9所述用于冷冻电镜的免疫金标记蛋白质方法，其特征在于，所述格栅为表面覆盖连续碳膜的200目的铜网。