JPH085529A - 電子顕微鏡用グリッドホルダーおよびこれを用いたガス圧式染色装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 超薄切片積載グリッドを保持するホルダーと
染色槽を兼用し、この染色槽を組合せた極めて簡単な装
置により、試料汚染や染色液の劣化を防止し、染色から
乾燥まで自動的に短時間で処理し、しかも染色液の使用
量をグリッド数に応じて調節し、コントラストが鮮明で
汚染のない試料を作成できる。 【構成】 貯水槽31および染色液貯留槽32、33を夫々開
閉バルブ37、38、39を介して窒素ガスボンベ30に連通す
ると共に、これら貯水槽31と染色液貯留槽32、33および
不活性ガスボンベ30を夫々六方向分配バルブ40に連結
し、この分配バルブ40の排出口に流出管を接続し、この
流出管に、グリッド保持室19を設けたグリッドホルダー
15を複数個直列に連結した染色槽27を連通して連続した
流路20を形成し、この流路20の上部に流出管を接続し
て、この流出管を流量計55を介して廃液槽58に接続した
ことを特徴とするガス圧式染色装置。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、生体の細胞微細構造、
小器官、膜系、巨大分子を透過型電子顕微鏡で観察しよ
うとする際、グリッドに積載した生体超薄切片の電子染
色に使用する電子顕微鏡用グリッドホルダーおよびこれ
を用いたガス圧式染色装置に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】一般に、超微形態観察を目的とする医
学、生物学の分野では生体超薄切片を電子顕微鏡で観察
することが行なわれている。この生体超薄切片は直接、
電子顕微鏡で観察することができないため、生体超薄切
片を染色液で染色してから観察していた。従来この染色
作業は一般に熟練した技術者により手作業で行なわれて
いる。

【０００３】この作業の詳細は、各検査機関の技術者に
より異なるが、一般的な方法を例示すれば、先ず図７に
示すように円形メッシュで形成した直径３mm程度のグリ
ッド１の上に生体超薄切片２を接着して超薄切片積載グ
リッド３を作成しておく。次にシャーレの中に固形水酸
化ナトリウムを入れて、内部気相の二酸化炭素を吸収除
去しておく。この後、前記超薄切片積載グリッド３をピ
ンセットで挟んで蒸留水の中に約５分間浸漬した後、図
８に示すようにアクリル板の上面に凹部４を形成した染
色容器５に、冷蔵庫で保存していた染色液となる４％の
酢酸ウラニル染色液６を盛り、蒸留水に浸漬しておいた
超薄切片積載グリッド３をピンセット７で挟んで酢酸ウ
ラニル染色液６の液表面に垂直に挿入して、凹部４の縁
に立てかけて保持し、この染色容器５を図示しない二酸
化炭素を除去したシャーレ内に移して約15分間放置して
ウラン染色を行なう。

【０００４】次に染色容器５から超薄切片積載グリッド
３をピンセットで取り出して水洗した後、別の容器に満
たした蒸留水中に再び浸漬して放置しておく。この後、
別の染色容器５に染色液となる0.5 ％クエン酸鉛溶液を
満たし、ここに超薄切片積載グリッド３を浸漬して、こ
れを二酸化炭素を除去したシャーレ内に移して15分間放
置して鉛染色を行なう。次に染色容器５から、超薄切片
積載グリッド３を取り出し、蒸留水で洗浄した後、付着
している水分をろ紙で除去してから乾燥させる。

【０００５】この後、染色を完了した超薄切片積載グリ
ッド３を、図９に示すようにプラスチック平板８の上面
に、中空菱形状の保持部９…を形成したグリッドホルダ
ー10の保持部９に立てた状態で挿入して保持しておく。
電子顕微鏡で観察する時には、保持部９から１枚ずつ超
薄切片積載グリッド３を取り出して、電子顕微鏡にセッ
トして観察していた。

【０００６】このように染色作業は、酢酸ウラニル染色
液で核酸やタンパク質を染色し、クエン酸鉛染色液でリ
ポ核タンパク質、炭水化物や還元オスミウムを染色し
て、生体試料の微細構造全体を識別できるように、通常
は２種類の染色液で染色している。これらの染色液に
は、空気中の二酸化炭素と反応して金属塩微細粒子を析
出し、あるいは酸素や光と反応して染色液を劣化させる
成分が含まれていることが多いが、特に鉛塩試薬が二酸
化炭素と反応して生成した微細粒子が生体超薄切片２に
付着して汚染すると、電子顕微鏡像に黒い斑点となって
現れ、これが生体組織の微細構造と識別できず、正確な
検査ができないという問題があった。また空気成分と染
色液が反応して劣化すると、染色ムラが生じて電子顕微
鏡像コントラストが不鮮明になり、正確な検査ができな
い問題もあった。

【０００７】このため従来の手作業による染色作業で
は、染色液の開封、濾過、保存や、蒸留水による十分な
洗浄、染色中のシャーレ内の二酸化炭素の除去など、そ
の過程はできる限り速やかに行う必要があり、熟練を要
すると共に、熟練した技術者でも、10枚の超薄切片積載
グリッド３を染色するのに１時間以上もかかり、50枚染
色するには７〜８時間もかかって作業性が悪い上、この
間に試料が空気に晒されて汚染される危険性があった。
また超薄切片積載グリッド３を頻繁にピンセット７でつ
かんで移動させるため超薄切片を損傷する危険性も高か
った。

【０００８】このような手作業による染色作業に代わ
り、近年では多数の超薄切片積載グリッドを同時に染色
できる自動染色装置が開発されている。このうち水圧式
電子染色装置は、装置の内部に酢酸ウラニル染色液やク
エン酸鉛染色液などの染色液貯留槽と蒸留水槽と染色チ
ャンバーが設けられている。先ず図９に示すようなグリ
ッドホルダー10の保持部９…に超薄切片積載グリッド３
…を立てて挟持させ、このグリッドホルダー10ごと装置
内の染色チャンバーにセットしてから、染色チャンバー
内に蒸留水槽から水圧で蒸留水を満たして超薄切片積載
グリッド３を水浸漬してから排水する。

【０００９】次に酢酸ウラニル染色液を染色チャンバー
に満たしてウラン染色を行なった後、これを排出して蒸
留水を満たす。この後、染色チャンバーにクエン酸鉛溶
液を水圧で満たして鉛染色を行なった後、排出して蒸留
水を満たして水洗いする。この後、グリッドホルダー10
ごと装置から取出して空気を当てて風乾させてから、デ
シケーター内に保存する。

【００１０】しかしながら、この水圧式電子染色装置
は、同時に数十枚の超薄切片積載グリッド３を染色でき
るが、染色チャンバー内に染色液や蒸留水を供給したり
排出したりする間に空気との接触が原因で試料が汚染さ
れ、また染色チャンバーから取り出して大気中で風乾す
る過程も長時間かかるので、空気中微粒子などが超薄切
片に付着して汚染する危険性が高かった。

【００１１】また染色液や蒸留水を染色チャンバーに供
給、排出する作用をポンプを使って自動的に行なうポン
プ式電子染色装置もあるが、これも染色液や蒸留水を供
給したり排出したりする間に空気との接触が原因で試料
が汚染され、また染色チャンバーから取り出して大気中
で風乾する過程でも塵埃などが付着する恐れがあった。
しかもポンプ式は装置が複雑で高価である。

【００１２】またこれらの自動染色装置は同時に数十枚
の超薄切片積載グリッドを染色できるので作業性は良い
が、グリッドホルダー10に同時にセットするため、染色
チャンバー内における超薄切片積載グリッドのセット位
置がそれぞれ違うので、染色液や蒸留水が各超薄切片積
載グリッドに同一条件で作用し難く、染色に差が生じて
染色ムラが出来やすい欠点がある。また超薄切片積載グ
リッド３はグリッドホルダー10にセットされているの
で、染色チャンバー内にセットして染色液を充填しても
気泡が残留し易く、また染色チャンバーは大型で装置に
固定されているので、染色反応の温度コントロールが難
しく、これが染色ムラの原因ともなっていた。

【００１３】しかもこれら自動染色装置はバッチ式に処
理するので、１枚の超薄切片積載グリッド３を染色する
場合でも、数十枚同時に染色する場合でも、使用する染
色液の量は同じであり、高価な染色液が無駄になり検査
費用が高くなるなどの問題があった。また従来の方法で
は、空気中で固体酢酸ウラニルやクエン酸鉛を水に溶解
して染色液を調製し、これを冷蔵庫に保存して、使用す
る度に冷蔵庫から取り出しているが、頻繁に空気と接触
するため、劣化が早く１か月程度で廃棄しなければなら
なかった。

【００１４】また染色処理の終了した超薄切片積載グリ
ッド３は、複数の保持部９…を設けたグリッドホルダー
10内に挿着して、デシケーター内に保存すが、保持部９
への挿入間違いを起こす恐れもあり、また他のグリッド
ホルダー10を取り出す時にその都度に、空気に触れて塵
埃によって試料が汚染される恐れもあった。

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】本発明はかかる手動式
の染色方法や、自動染色装置における問題点に鑑み種々
研究を行なった結果、超薄切片積載グリッドを１個ずつ
保持できるホルダーとなると共に、これを複数個直列に
連結して染色槽も兼用できる電子顕微鏡用グリッドホル
ダーを提供すものである。更に本発明は、この染色槽も
兼用できる直列に連結した電子顕微鏡用グリッドホルダ
ーを組合せた極めて簡単な装置により、試料汚染や染色
液の劣化を防止して、染色から乾燥までを大気に触れる
ことなく自動的に短時間で処理でき、しかも染色する超
薄切片積載グリッドの数に合わせて染色液の使用量を調
節でき、怖めて経済的で熟練を必要とせずに、コントラ
ストが鮮明で汚染のない試料を作成できるガス圧式染色
装置を提供するものである。

【００１６】

【課題を解決するための手段】以下本発明の電子顕微鏡
用グリッドホルダーを図面を参照して説明する。このグ
リッドホルダー15は図１に示すように、上部が太く下部
が細い硬質プラスチックで形成された中空円筒体16の中
間の外周側面に、板状の把持部17が一体に突設されてい
る。前記中空円筒体16の上部内側には小室18が形成さ
れ、、この小室18の下部に図２に示すように水平断面が
菱形状のグリッド保持室19が形成されている。またこの
菱形状のグリッド保持室19の下部には図３に示すよう
に、ここに連通して中空円筒体16の下部内側に前記小室
18より内径の小さい通路20が形成されている。

【００１７】この通路20を形成した中空円筒体16の下部
外周に下方に向かって外径が縮小したテーパー面21を形
成した連結突出部22が形成されている。また中空円筒体
16の上部内側に形成した小室18の内面にも前記連結突出
部22が着脱自在に嵌合する、下方に向かって外径が縮小
したテーパー面23を形成した連結溝部24が形成されてい
る。

【００１８】このグリッドホルダー15は、グリッド保持
室19に１枚ずつ超薄切片積載グリッド３を挿着して、図
４に示すようにグリッドホルダー15の連結溝部24に、上
方に隣接する別のグリッドホルダー15の連結突出部22を
嵌合して連結し、以下同様に複数のグリッドホルダー15
の連結溝部24に連結突出部22を順次嵌合して直列に連結
し、連続した通路20を形成できるようになっている。

【００１９】またグリッドホルダー15には図５に示すよ
うに、連結溝部24に着脱自在に嵌合する円柱状のプラグ
25と、連結突出部22の下部に着脱自在に嵌合するカップ
状のプラグ26とが設けられ、グリッド保持室19を密閉し
て超薄切片積載グリッド３を保持するようになってい
る。

【００２０】また上記グリッドホルダー15を染色槽27と
して用いたガス圧式染色装置の構造は図６に示すように
形成されている。図において30が窒素ガスボンベ、31は
貯水槽、32は第１の染色液貯留槽、33は第２の染色液貯
留槽である。窒素ガスボンベ30の出口には圧力計34と減
圧弁35とが取付けられ、ここから開閉バルブ37、38、39
を介して配管を通して貯水槽31と、第１の染色液貯留槽
32および第２の染色液貯留槽33に接続されている。この
第１の染色液貯留槽32には酢酸ウラニル染色液６が入れ
られ、また第２の染色液貯留槽33にはクエン酸鉛染色液
12が入れられている。

【００２１】更に貯水槽31と、第１の染色液貯留槽32お
よび第２の染色液貯留槽33は、夫々フィルター39を設け
た配管を通して六方向分配バルブ40に接続されている。
また貯水槽31から引き出された配管は、開閉バルブ42、
43を介して第１の染色液貯留槽32および第２の染色液貯
留槽33に接続されていると共に、開閉バルブ44、45、46
を介して六方向分配バルブ40に接続されている。また貯
水槽31からの配管と窒素ガスボンベ30からの配管とは二
方向分配バルブ47を介して六方向分配バルブ40に接続さ
れている。

【００２２】また貯水槽31と、第１の染色液貯留槽32お
よび第２の染色液貯留槽33には夫々蓋31ａ，32ａ，33ａ
が被せられ、ここに開閉バルブ50、51、52を設けた排気
管が取付けられている。また第１の染色液貯留槽32と第
２の染色液貯留槽33には夫々マグネチックスターラーの
攪拌子53が浸漬されている。

【００２３】また六方向分配バルブ40の流出管には、図
４に示すように複数個のグリッドホルダー15を直列に接
続した染色槽27が接続され、更にこの排出側の流出管に
は流量計55が接続されている。染色槽27は恒温槽56に縦
方向に浸漬されている。また前記流量計55の排出口には
開閉バルブ57が取付けられ、この下方に廃液槽58が設け
られている。

【００２４】

【作用】貯水槽31に沸騰水を入れ、蓋31ａを閉じた後、
開閉バルブ39、50を開き、窒素ガスボンベ30から窒素ガ
スを水中に緩く通じながら室温まで冷却してから、開閉
バルブ39、50を閉じて貯水槽31内の空気が窒素ガスで置
換され、二酸化炭素や酸素が除去された蒸留水28を得
た。

【００２５】次に第１の染色液貯留槽32内の空気を、開
閉バルブ38、51を開いて、窒素ガスボンベ30から窒素ガ
スを供給して置換した後、開閉バルブ38、51を閉じ、開
閉バルブ39、42を開いて貯水槽31内の蒸留水28をガス圧
により第１の染色液貯留槽32へ空気遮断下で所定量供給
してから、開閉バルブ42を閉じた。この後、開閉バルブ
38、51を開き、窒素ガスを第１の染色液貯留槽32に流し
ながら蓋32ａを半開し、酢酸ウラニルを投入して蓋32ａ
と開閉バルブ51を閉じ、マグネチックスターラーで攪拌
子53を回して完全に溶解し、得られた酢酸ウラニル染色
液６をそのまま静置・保存した。

【００２６】次に開閉バルブ37、52を開き、開閉バルブ
43を閉じた状態で、窒素ガスを第２の染色液貯留槽33に
供給して内部を窒素ガスで置換した後、窒素ガスを流し
ながら蓋33ａを半開した状態で約90℃程度の熱水を注入
し、マグネチックスターラーの攪拌子53を回転させて水
温が70℃付近まで下がったら、クエン酸鉛を投入して攪
拌を続け、得られた乳白濁の液に固形水酸化ナトリウム
を加えて蓋33ａを閉じ、クエン酸鉛を溶解させた。室温
まで放冷後、窒素ガスを流し続けながら蓋33ａを半開
し、ｐＨ電極を液に漬けてｐＨを測定し、必要な場合は
塩酸水溶液または水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを約12
に調整してから蓋33ａを閉じ、開閉バルブ39、43を開い
て貯水槽31内の水を第２の染色液貯留槽33に給水して所
定量に薄め、この後、開閉バルブ39、43、52を閉じ、得
られたクエン酸鉛染色液12をそのまま静置・保存した。

【００２７】このように、窒素ガス気相により空気を遮
断した状態で、酢酸ウラニル染色液６とクエン酸鉛染色
液12を製造して保存した状態で染色処理を行なう。先ず
生体超薄切片２を積載した超薄切片積載グリッド３を
図３に示すように、グリッドホルダー15のグリッド保持
室19に縦方向に挿着し、これを図４に示すように 複数
個を直列に連結して連続した染色槽27を形成し、この下
段の連結突出部22を六方向分配バルブ40から引き出され
た排出管に接続し、上段の連結溝部24に流量計55に連通
する排出管を接続して、染色槽27を恒温槽56に浸漬す
る。

【００２８】この状態で、開閉バルブ37、38、39、44、
45、46、57を開いて、減圧弁35で窒素ガス圧を調整し、
六方向分配バルブ40の切替バルブを最高位の流入口40ａ
に合わせ、グリッドホルダー15を連結した染色槽27に窒
素ガス圧を利用して貯水槽31内の蒸留水28を供給して、
超薄切片積載グリッド３の水浸漬を確認し、気泡があれ
ば直列連結グリッドホルダー15に振動を与えて気泡を除
いた後、六方向分配バルブ40の切替バルブを時計方向へ
30度回して（時計短針１時の位置）通水を止めた。

【００２９】次に流量計55が空になった状態でこの開閉
バルブ57を閉じてから、六方向分配バルブ40の切替バル
ブを時計方向へ30度回して流入口40ｂに合わせて、窒素
ガス圧を利用して第１の染色液貯留槽32内の黄色い酢酸
ウラニル染色液６を直列連結グリッドホルダー15の染色
槽27へ送る。ここを通過して流量計55へ黄色い酢酸ウラ
ニル染色液６が流出したら六方向分配バルブ40の切替バ
ルブを時計方向へ30度回して（時計短針３時の位置）流
出を止め、流出量（ｖミリリットル）を流量計55で読み
とって記録しておく。

【００３０】この後、約１５分間、酢酸ウラニル染色を
行ない、この後、六方向分配バルブ40の切替えバルブを
時計方向へ30度回して流入口40ｃに合わせ、貯水槽31内
の蒸留水28を窒素ガス圧で流して、染色槽27内の超薄切
片積載グリッド３を水洗いする。この後、六方向分配バ
ルブ40の切替えバルブを時計方向へ30度回して（時計短
針５時の位置）通水を止めた。次いで開閉バルブ57を開
いて流量計55内の液を廃液槽58へ捨てた後、開閉バルブ
57を閉じた。

【００３１】この後、六方向分配バルブ40の切替バルブ
を時計方向へ30度回して流入口40ｄに合わせて、窒素ガ
ス圧を利用して第２の染色液貯留槽33のクエン酸鉛染色
液12を直列連結したグリッドホルダー15の染色槽27に、
流量計55に溜った蒸留水28の量を見ながら、酢酸ウラニ
ル染色液６の使用量と等量（ｖミリリットル）を流した
後、切替えバルブを時計方向へ30度回して（時計短針７
時の位置）通液を止めた。この後、１５分間、クエン酸
鉛染色を行なった後、六方向分配バルブ40の切替バルブ
を時計方向へ30度回して流入口40ｅに合わせて、窒素ガ
ス圧を利用して、貯水槽31内の蒸留水28を流して水洗い
した後、更に切替バルブを時計方向へ60度回して流入口
40ｆに合わせて通水を止めた。

【００３２】直列連結グリッドホルダー15を恒温槽56か
ら取り出し、その外壁に着いている水を拭い、二方向分
配バルブ47を窒素ガスに対して開き、直列連結グリッド
ホルダー15の染色槽27内を窒素ガスで乾燥させる。この
後、二方向分配バルブ47を閉じてから、直列連結グリッ
ドホルダー15…を把持部17をつまんで分離し、図５に示
すように分離したそれぞれのグリッドホルダー15の連結
溝部24に円柱状のプラグ25を嵌合し、連結突出部22にカ
ップ状のプラグ26を嵌合して、グリッド保持室19内を密
閉して、電子顕微鏡観察に供するまで保存した。

【００３３】なお上記説明では、窒素ガスを用いた場合
について示したがアルゴンガスやネオンガスなどの不活
性ガスを用いても良い。また染色液貯留槽は２個に限ら
ず１個または３個以上設けても良い。また廃液槽は染色
液の種類に応じてそれぞれ別個に設けて、使用済み染色
液の処理を容易にしても良い。

【００３４】

【実施例】

（実施例１） 図６に示すガス圧式染色装置において、
容積 100ミリリットルの褐色ガラス瓶から成る第１の染
色液貯留槽32内の空気を、大気圧下において窒素ガスで
置換した後、貯水槽31から 100ミリリットルの蒸留水28
を第１の染色液貯水槽32に送水し、蓋32ａを半開して酢
酸ウラニル64．0 グラムを投入し、マグネチックスター
ラーで攪拌子53を回して完全に溶解し、得られた酢酸ウ
ラニル染色液６をそのまま静置・保存した。

【００３５】また容積 100ミリリットルの無色ガラス瓶
から成る第２の染色液貯留槽33内を窒素ガスで置換した
後、約90℃の熱水60ミリリットルを注入し、マグネチッ
クスターラーで攪拌子53を回して、水温が70℃付近まで
下がったら、クエン酸鉛を0.5 グラムを投入して攪拌を
続け、得られた乳白濁の液に固形水酸化ナトリウム0.2
グラムを加え、ｐＨを約12に調整してから、貯水槽31内
の水を送って 100ミリリットルとし、得られたクエン酸
鉛染色液12をそのまま静置・保存した。

【００３６】ラットおよびマウスの肝臓、腎臓、心臓、
小腸および脳の超薄切片２を積載した直径３ミリメート
ルの超薄切片積載グリッド３をグリッド保持室19に入れ
た10個のグリッドホルダー15…を直列連結して染色槽27
を形成し、これを六方向分配バルブ40に連結すると共
に、25℃の恒温槽56に浸漬した。

【００３７】この後、窒素ガスボンベ30の減圧弁35を0.
3 気圧に調整し、蒸留水28を直列連結したグリッドホル
ダー15…の染色槽27に送って、内部の残留空気を排除し
た後、酢酸ウラニル染色液６を1.2 ミリリットル供給し
て15分間ウラン染色を行なった。この後、蒸留水28を30
ミリリットル送って水洗いした後、クエン酸鉛染色液12
を1.2 ミリリットル供給して15分間鉛染色を行ない、こ
の後、再び30ミリリットルの蒸留水28で洗浄してから窒
素ガスを供給して超薄切片積載グリッド３の乾燥を行な
った。次に直列連結グリッドホルダー15…を分離してか
ら、図５に示すように円柱状のプラグ25とカップ状のプ
ラグ26を嵌合して、グリッド保持室19内を密閉して、電
子顕微鏡観察に供するまで保存した。直列連結したグリ
ッドホルダー15…をガス圧式染色装置にセットしてか
ら、ここまでの処理時間は約41分であった。

【００３８】このように染色処理した超薄切片積載グリ
ッド３を電子顕微鏡で観察したところ、酢酸ウラニル染
色液６やクエン酸鉛染色液12の調製から、染色工程まで
全て空気を遮断した窒素ガス気相下で行っているので、
観察した電子顕微鏡像は、染色ムラがなくコントラスト
も鮮明で、二酸化炭素と反応した鉛塩微細粒子の斑点や
空気中微粒子による汚染が全くなく正確な検査を行なう
ことができた。また図６に示す装置の第１の染色液貯留
槽32に保存した酢酸ウラニル染色液６は、室温状態のま
ま３カ月間、第２の染色液貯留槽33に保存したクエン酸
鉛染色液12は６カ月間に亘って染色能は変化せず使用す
ることができた。

【００３９】（実施例２） 図６に示すガス圧式染色装
置において、容積 100ミリリットルの第１の染色液貯留
槽32内の空気を窒素ガスで置換した後、貯水槽31から 1
00ミリリットルの蒸留水28を第１の染色液貯留槽32に送
り、窒素ガスを第１の染色液貯留槽32の気相へ送りなが
ら、蓋32ａを半開してタンニン酸1.0 グラム、ｐ−ニト
ロフェノール1.7 グラム、酢酸ウラニル67ミリグラムを
投入して蓋32ａを閉じ、約60℃に加熱しながらマグネチ
ックスターラーで攪拌子53を回転させて完全に溶解し、
得られた淡褐色のタンニン酸・酢酸ウラニル染色液を室
温に放冷し、そのまま静置・保存した。

【００４０】ラットおよびマウスの組織の超薄切片２を
積載した直径３ミリメートルの超薄切片積載グリッド３
をグリッド保持室19に入れた20個のグリッドホルダー15
…を直列連結して染色槽27を形成し、これを六方向分配
バルブ40に連結すると共に、35℃の恒温槽56に浸漬し、
上記実施例１にならい、タンニン酸・酢酸ウラニル染色
液の1.6 ミリリットルを染色槽27に供給して15分間染色
を行なって水洗いした後、クエン酸鉛染色液12を1.6 ミ
リリットル供給して10分間染色を行なった。この後、再
び水洗いしてから窒素ガスを送って超薄切片積載グリッ
ド３を乾燥した。次に各グリッドホルダー15を分離して
から、図５に示すように円柱状のプラグ25とカップ状の
プラグ26で密栓した。ここまでの処理時間は約43分であ
った。

【００４１】このようにタンニン酸・酢酸ウラニル染色
液およびクエン酸鉛染色液12で染色した超薄切片積載グ
リッド３を電子顕微鏡で観察したところ、全ての処理を
窒素ガス気相下で行っているので、染色ムラがなくコン
トラストも鮮明で、金属塩微粒子の斑点や空気中塵埃微
粒子による汚染が全く認められず、正確な検査を行なう
ことができた。また図６に示す装置の第１の染色液貯留
槽32に室温状態で保存したタンニン酸・酢酸ウラニル染
色液は、３カ月間に亘って酸素による着色の進行や劣化
は認められなかった。

【００４２】

【発明の効果】以上説明したごとく、本発明による電子
顕微鏡用グリッドホルダーは、直列に連結して染色槽と
してそのまま使用できるので、超薄切片積載グリッドの
浸漬や、取出しなど頻繁にピンセットで移動させる必要
がなく、また染色処理の終了した超薄切片積載グリッド
をそのままグリッド保持室内に密閉して、電子顕微鏡観
察に供するまで保存できるので、挿入間違いを起こす恐
れも少なく、室内空気に含まれる塵埃などの微粒子によ
って試料が汚染されるのを防止することもできる。

【００４３】また本発明の電子顕微鏡用グリッドホルダ
ーを直列に連結して染色槽とし、これを組込んだガス圧
式染色装置においては、染色槽内の液の通路が連通した
１本の細い通路であり、従来のバッチ式の自動染色装置
の場合とは異なり、各グリッドホルダー内の染色液や蒸
留水の作用条件が空気遮断下で均一に保たれ、染色槽内
の液の流速を高めて、気泡の残留も防止できるので染色
ムラを防止することができ、熟練を必要とせずに染色作
業を行なうことができる。

【００４４】またグリッドホルダーの１個当たりの内容
積は約40マイクロリットルであり、装置のデッドボリュ
ームを含めて必要な染色液量は、超薄切片積載グリット
10枚の染色で1.2 ミリリットル、20枚で1.6 ミリリット
ル、50枚で2.8 ミリリットルで十分である。このため従
来のバッチ式の自動染色装置に比べて、使用液量が極め
て少なく経済的であり、また使用済み染色液の処理量も
少なくなるので環境汚染削減の面からも望ましい結果が
得られる。更に染色液は空気遮断下で調製し、そのまま
装置の染色液貯留槽に常温で保存でき、使用の都度これ
をフィルターで濾過しながら染色槽へガス圧で供給でき
るので、室温状態のまま長期間に亘って染色能を保持す
ることができる。

【００４５】また染色液の供給に従来のように電動ポン
プを使わず、ガス圧を利用した簡単な構造であるので、
装置は構造が簡単で、小型であり安価に製造することが
できる。また直列連結グリッドホルダーは、通常、実験
・検査室に常備されている恒温槽に浸漬することができ
るので、生体超薄切片の細胞化学的反応などの厳密な温
度条件を要求される処理も効果的に行うことができると
共に、温度変化による染色ムラがなく鮮明な映像を得る
ことができるなど種々の効果を有するものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例によるグリッドホルダーを示
す斜視図である。

【図２】図１に示すグリッドホルダーの平面図である。

【図３】図１に示すグリッドホルダーの断面図である。

【図４】図１に示すグリッドホルダーを直列に複数個連
結して形成した染色槽の断面図である。

【図５】図３に示すグリッドホルダーにプラグを取付け
て密閉した状態を示す断面図である。

【図６】本発明のガス圧式染色装置を示す構成図であ
る。

【図７】グリッドに生体超薄切片を取付けた超薄切片積
載グリッドの平面図である。

【図８】従来の染色容器に入れた染色液に超薄切片積載
グリッドを手作業により浸漬している状態を示す断面図
である。

【図９】従来の保持部を形成したグリッドホルダーに超
薄切片積載グリッドを保持している状態を示す斜視図で
ある。

【符合の説明】

１ グリッド ２ 生体超薄切片 ３ 超薄切片積載グリッド ４ 凹部 ５ 染色容器 ６ 酢酸ウラニル染色液 ７ ピンセット ８ プラスチック平板 ９ 保持部 10 グリッドホルダー 12 クエン酸鉛染色液 15 グリッドホルダー 16 中空円筒体 17 把持部 18 小室 19 グリッド保持室 20 通路 22 連結突出部 24 連結溝部 25 円柱状のプラグ 26 カップ状のプラグ 27 染色槽 28 蒸留水 30 窒素ガスボンベ 31 貯水槽 32 第１の染色液貯留槽 33 第２の染色液貯留槽 34 圧力計 36 フィルター 37 開閉バルブ 40 六方向分配バルブ 42 開閉バルブ 47 二方向分配バルブ 50 開閉バルブ 53 攪拌子 55 流量計 56 恒温槽 58 廃液槽

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【手続補正書】

【提出日】平成６年８月１２日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１４

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１４】また染色処理の終了した超薄切片積載グリ
ッド３は、複数の保持部９…を設けたグリッドホルダー
10内に挿着して、デシケーター内に保存すが、保持部９
への挿入間違いを起こす恐れもあり、また他のグリッド
ホルダー10を取り出す時にその都度、空気に触れて塵埃
によって試料が汚染される恐れもあった。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】本発明はかかる手動式
の染色方法や、自動染色装置における問題点に鑑み種々
研究を行なった結果、超薄切片積載グリッドを１個ずつ
保持できるホルダーとなると共に、これを複数個直列に
連結して染色槽も兼用できる電子顕微鏡用グリッドホル
ダーを提供すものである。更に本発明は、この染色槽も
兼用できる直列に連結した電子顕微鏡用グリッドホルダ
ーを組合せた極めて簡単な装置により、試料汚染や染色
液の劣化を防止して、染色から乾燥までを大気に触れる
ことなく自動的に短時間で処理でき、しかも染色する超
薄切片積載グリッドの数に合わせて染色液の使用量を調
節でき、極めて経済的で熟練を必要とせずに、コントラ
ストが鮮明で汚染のない試料を作成できるガス圧式染色
装置を提供するものである。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１６】

【課題を解決するための手段】以下本発明の電子顕微鏡
用グリッドホルダーを図面を参照して説明する。このグ
リッドホルダー15は図１に示すように、上部が太く下部
が細い硬質プラスチックで形成された中空円筒体16の中
間の外周側面に、板状の把持部17が一体に突設されてい
る。前記中空円筒体16の上部内側には小室18が形成さ
れ、この小室18の下部に図２に示すように水平断面が菱
形状のグリッド保持室19が形成されている。またこの菱
形状のグリッド保持室19の下部には図３に示すように、
ここに連通して中空円筒体16の下部内側に前記小室18よ
り内径の小さい通路20が形成されている。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１７】この通路20を形成した中空円筒体16の下部
外周に下方に向かって外径が縮小したテーパー面21を形
成した連結突出部22が形成されている。また中空円筒体
16の上部内側に形成した小室18の内面にも前記連結突出
部22が着脱自在に嵌合する、下方に向かって内径が縮小
したテーパー面23を形成した連結溝部24が形成されてい
る。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２１】更に貯水槽31と、第１の染色液貯留槽32お
よび第２の染色液貯留槽33は、夫々フィルター36を設け
た配管を通して六方向分配バルブ40に接続されている。
また貯水槽31から引き出された配管は、開閉バルブ42、
43を介して第１の染色液貯留槽32および第２の染色液貯
留槽33に接続されていると共に、開閉バルブ44、45、46
を介して六方向分配バルブ40に接続されている。また貯
水槽31からの配管と窒素ガスボンベ30からの配管とは二
方向分配バルブ47を介して六方向分配バルブ40に接続さ
れている。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３４

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３４】

【実施例】 （実施例１） 図６に示すガス圧式染色装置において、
容積 100ミリリットルの褐色ガラス瓶から成る第１の染
色液貯留槽32内の空気を、大気圧下において窒素ガスで
置換した後、貯水槽31から 100ミリリットルの蒸留水28
を第１の染色液貯水槽32に送水し、蓋32ａを半開して酢
酸ウラニル 4．0 グラムを投入し、マグネチックスター
ラーで攪拌子53を回して完全に溶解し、得られた酢酸ウ
ラニル染色液６をそのまま静置・保存した。

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３５】また容積 100ミリリットルの無色ガラス瓶
から成る第２の染色液貯留槽33内を窒素ガスで置換した
後、約90℃の熱水60ミリリットルを注入し、マグネチッ
クスターラーで攪拌子53を回して、水温が70℃付近まで
下がったら、クエン酸鉛0.5グラムを投入して攪拌を続
け、得られた乳白濁の液に固形水酸化ナトリウム0.2グ
ラムを加え、ｐＨを約12に調整してから、貯水槽31内の
水を送って 100ミリリットルとし、得られたクエン酸鉛
染色液12をそのまま静置・保存した。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 プラスチックで形成された円筒体の上部
   内側に中空円筒状の小室を形成し、この小室の下部に水
   平断面が中空角形状のグリッド保持室を設けると共に、
   これに連通して円筒体の下部内側に前記溝部より内径の
   小さい通路を形成し、この通路を形成した円筒体の下部
   外周に下方に向かって外径が縮小したテーパー面を形成
   した連結突出部とすると共に、前記円筒体の上部内側に
   形成した小室に、前記連結突出部が着脱自在に嵌入する
   下方に向かって内径が縮小したテーパー面を形成した連
   結溝部としたことを特徴とする電子顕微鏡用グリッドホ
   ルダー。
2. 【請求項２】 円筒体の外周側面に把持部を一体に突設
   したことを特徴とする請求項１記載の電子顕微鏡用グリ
   ッドホルダー。
3. 【請求項３】 連結溝部と連結突出部に夫々着脱自在に
   嵌合して、グリッド保持室を密閉するプラグを設けたこ
   とを特徴とする請求項１記載の電子顕微鏡用グリッドホ
   ルダー。
4. 【請求項４】 貯水槽および染色液貯留槽を夫々開閉バ
   ルブを介して不活性ガスボンベに連通すると共に、これ
   ら貯水槽と染色液貯留槽および不活性ガスボンベを夫々
   分配バルブに連結し、この分配バルブの排出口に流出管
   を接続し、この流出管に、プラスチックで形成された円
   筒体の上部内側に中空円筒状の小室を形成し、この小室
   の下部に水平断面が中空角形状のグリッド保持室を設け
   ると共に、これに連通して円筒体の下部内側に前記溝部
   より内径の小さい通路を形成し、この通路を形成した円
   筒体の下部外周に下方に向かって外径が縮小したテーパ
   ー面を形成した連結突出部とすると共に、前記円筒体の
   上部内側に形成した小室に、前記連結突出部が着脱自在
   に嵌入する下方に向かって内径が縮小したテーパー面を
   形成した連結溝部とした電子顕微鏡用グリッドホルダー
   の、前記連結突出部を接続すると共に、この上部の連結
   溝部に、隣接する電子顕微鏡用グリッドホルダーの連結
   突出部を順次嵌合し、複数の電子顕微鏡用グリッドホル
   ダーを直列に連結して連続した流路を形成し、この流路
   の上部に流出管を接続して、この流出管を流量計を介し
   て廃液槽に接続したことを特徴とするガス圧式染色装
   置。
5. 【請求項５】 染色液貯留槽を複数個並列に設けて、夫
   々不活性ガスボンベと分配バルブに接続したことを特徴
   とする請求項４記載のガス圧式染色装置。