CN106872500B - 用于带电粒子显微镜的低温样本的制备 - Google Patents

用于带电粒子显微镜的低温样本的制备 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于带电粒子显微镜的低温样本的制备。一种为带电粒子显微镜中的研究制备样本的方法，由此该样本经受使用致冷剂的快速冷却，包括下面的步骤：‑提供用于输送低温流体的两个导管，这些导管中的每一个都打开进入管口，这些管口被布置成跨介于中间的间隙而面对彼此；‑将样本放置在所述间隙中；‑通过所述导管泵送低温流体以便从所述管口同时冲刷，由此从两个相对面将样本突然浸入在低温流体中。

Description

用于带电粒子显微镜的低温样本的制备
技术领域
本发明涉及为带电粒子显微镜中的研究制备样本的方法，借此使用致冷剂使该样本经受快速冷却。本发明另外涉及用于执行这样的方法的装置。
本发明还涉及这样的样本在带电粒子显微镜中的使用，包括：
- 样本保持器，用于容纳样本；
- 冷却设备，用于至少在样本在所述样本保持器上时将所述样本维持在低温温度；
- 源，用于产生带电粒子射束；
- 照明器，用于引导所述射束以便照射样本；
- 检测器，用于响应于所述照射来检测从样本发出的辐射通量。
术语“致冷剂”应该被解释为指的是处于低温温度（即处于或低于-150℃）的液体。这样的致冷剂的示例包括液态乙烷、液态丙烷、液态氧以及其混合物。
背景技术
带电粒子显微镜是公知的并且对于对微观物体成像（特别地以电子显微学的形式）而言是越来越重要的技术。从历史来看，电子显微镜的基本种类已经经历到许多公知装置种类（诸如透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）、和扫描透射电子显微镜（STEM））的演化，并且还经历到各种子种类（诸如所谓的“双射束”工具（例如FIB-SEM）的演化，其另外采用“机器加工的”聚焦离子束（FIB），从而例如允许诸如离子束铣削或离子束诱导沉积（IBID）的支持活动。更具体地：
-在SEM中，通过扫描电子束来照射样本使来自样本的“辅助”辐射的发射物沉淀，例如以二次电子、背散射电子、X射线和光致发光（红外、可见和/或紫外光子）的形式；发出的辐射的该通量的一个或多个分量然后被检测并被用于图像累积目的。
-在TEM中，将被用来照射样本的电子束选取为穿透样本的足够高的能量（为此样本通常将比SEM样本情况下的更薄）；从样本发出的透射电子的通量然后可以被用来创建图像。当以扫描模式操作这样的TEM时（因此变成STEM），讨论中的图像将在照射电子束的扫描运动期间被累积。
关于这里阐明的一些主题的更多信息可以例如从下面的维基百科链接收集：
http://en.wikipedia.org/wiki/Electron_microscope
http://en.wikipedia.org/wiki/Scanning_electron_microscope
http://en.wikipedia.org/wiki/Transmission_electron_microscopy
http://en.wikipedia.org/wiki/Scanning_transmission_electron_microscopy
作为对将电子用作照射射束的替代，还可以使用其他种类的带电粒子来执行带电粒子显微镜。在这方面，短语“带电粒子”应该被广义地解释为包括例如电子、正离子（例如Ga或He离子）、负离子、质子和正电子。关于基于非电子的带电粒子显微镜，可以例如从诸如下面的来源收集一些其他信息：
https://en.wikipedia.org/wiki/Focused_ion_beam
http://en.wikipedia.org/wiki/Scanning_Helium_Ion_Microscope
- W.H. Escovitz, T.R. Fox and R. Levi-Setti, Scanning Transmission Ion Microscope with a Field Ion Source, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72(5),1826-1828 页(1975).
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22472444
应该指出，除了成像和执行（局部化的）表面改性（例如铣削、蚀刻、沉积等等）之外，带电粒子显微镜还可以具有其他功能，诸如执行光谱学、检查衍射图等等。
在所有情况下，带电粒子显微镜（CPM）将包括至少下面的部件：
-辐射源，诸如肖特基电子源或离子枪。
-照明器，其用来操控来自源的“原始”辐射射束并且对其执行某些操作（诸如聚焦、畸变减轻、（利用孔径）裁切、滤波等等）。其通常包括一个或多个（带电粒子）透镜，并且还可以包括其他类型的（粒子）光学部件。如果需要，照明器可以被提供有偏转器系统，其可以被调用来促使其输出射束跨过被研究中的样本执行扫描运动。
-样本保持器，可以在其上容纳和定位（例如倾斜、旋转）研究中的样本。如果需要，该保持器可以被移动以便影响射束关于样本的期望扫描运动。一般来讲，这样的样本保持器将被连接到诸如机械台的定位系统。保持器可以包括将样本维持在给定（热或冷）温度范围的装置，在当前发明的特定环境中，其通常将包括用于将样本维持在低温温度的装置。
-检测器（用于检测从被照射的样本发出的辐射），其本质上可以是单一的或复合的/分布式的，并且其可以根据被检测中的辐射而采用许多不同形式。示例包括光电二极管、CMOS检测器、CCD检测器、光伏电池、X射线检测器（诸如硅漂移检测器或Si（Li）检测器）等等。一般来说，CPM可以包括若干种不同类型的检测器，可以在不同情况下调用它们的选择。
在扫描类型装置（例如诸如SEM或STEM）的特定情况下，CPM将包括：
-扫描装置，其用于产生辐射射束和样本的相对扫描运动，由此促使该射束描绘出样本（的呈现表面）上的预定（二维）扫描图案。然后，基于扫描图案上每个采样点的检测器输出来构造图像，由此构造所述样本（表面）的（二维）图。如上文提到的，这样的扫描装置可以例如基于射束（扫描）偏斜或保持器（扫描）运动。
在透射型显微镜（诸如例如（S）TEM）的情况下，CPM还将包括：
-成像系统，其实质上采用透射通过样本（平面）的带电粒子并且将它们引导（聚焦）在分析装置（诸如检测/成像设备、分光镜装置（诸如EELS模块）等等）上。就上文提到的照明器而言，成像系统还可以执行其他功能（诸如畸变减轻、裁切、滤波等等），并且它通常将包括一个或多个带电粒子透镜和/或其他类型的粒子光学部件。
在下文中，通常在电子显微镜的具体环境中（通过示例的方式）阐述本发明。然而，这样的简化仅仅意图用于清楚/说明性目的，并且不应该被解释为限制。
需要被存储在含水液体（诸如水、电解液、细胞液、血浆等等）主体中并在其中进行研究的生物样品（诸如细胞、细胞成分、单细胞生物体等等）可以呈现对于它们在CPM中的检查的重大挑战，因为：
-被引入到CPM的（准）真空环境中的含水液体将开始除气/沸腾，因此易于降低样品的质量；
-为了防止这个情况，样本（样品+含水液体）可以在被引入到所述真空之前首先被冷冻；
-然而，为了防止由（锋利）冰晶体的形成引起的对样品的损坏，这样的冷冻通常必须被非常快速地执行，目的是在没有显著冰结晶的情况下实现样本玻璃化（凝固为非结晶、玻璃状的相）。
为了促进这样的玻璃化（但还允许在透射型CPM（诸如TEM）中研究样本），样本应该是相对薄的（薄片状的），但是一个样本应仍能够通过其边缘支持自己（使得所采用的支撑装置对射束穿透没有显著影响）。为此，如果通常使用网格状保持器（诸如所谓的TEM自动网格®），则使带孔膜（诸如所谓的“多洞碳薄膜”）跨越该网格状保持器，在那些孔中（通过表面张力效应）可以容纳少量的样本。
在S. Kasas等人的文章Vitrification of cryoelectron microscopy specimens revealed by high-speed photographic imaging（J. Microscopy 211(1),2003年7月, 48-53页）中解释上文的开始段落中阐述的方法。该文章基本上对网格状样本保持器（3mm直径的铜网格、碳膜、通常70-200μm的孔径尺寸、~2μm的孔尺寸、各孔之间~1-5μm的典型间距）以及被插入其中的低温浴液（bath）之间研究频闪分析的、时间分辨的热接触轮廓感兴趣。就这点来说，它讨论了将样本保持器“垂直投入”到致冷剂（由此样本保持器的平面垂直于致冷剂的暴露表面）和“水平投入”（由此样本保持器的平面平行于致冷剂的暴露表面）之间的差异，并且它在后面提出一种实现比之前更均匀的玻璃化结果（就从样本到致冷剂的更均质热量传递而言）的方式。然而，该文章（基本上）没有使其自己涉及样本制备的其他重要方面，并且特别地未能解决样本污染的主题。
在本发明之前的研究中，发明人注意到，上文提及的“水平投入”方法一致地倾向于产生受到显著污染的样本。例如参见图2A，其示出使用现有技术获得的玻璃化样本的1μm×1μm方形部分。在所采用的放大率（~30k）的情况下，该方形应该大部分是准均匀的灰色，然而如可以从附图清楚看到的，样本反而被深色、点状特征分布覆盖。这些污染特征的存在可以大大的阻碍CPM中样本的后续分析，因为它们充当针对带电粒子的CPM的成像射束的散射地点。如果特定研究样品恰好沿着与这样的污染特性共享的视线来定位或与该视线接近，则通常使用CPM不能满意地观察到该样品。
在解决该问题的尝试中，发明人（以及合作者）首先检查上面提到的污染现象，并且发现它归因于将样本内部的水滤取出以及滤取到其背面上，因为其正面被投入到致冷剂浴液中。作为补救，发明人以及团队引入美国专利US 9,116,091[FNL1320]（通过参考合并于此）中的新颖技术，在其中：
-样本被水平投入到致冷剂浴液中，首先是正面；
-就在样本的正面接触致冷剂之前，一股（气相）低温流体被（从喷嘴）给予到样本的背面。
该技术目的是实现样本的正面和背面的同时玻璃化，尝试（通过在可以通过背面发生滤取出之前“密封”该背面）阻止上面提到的污染物的“滤取”。
尽管先前的段落中提及的技术相比显著改进之前的现有技术产生更显著的改进，但是发明人仍寻求进一步改进它。该努力的结果是本发明的主题。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种通过玻璃化来制备低温样本的改进方法。特别地，本发明的一个目的是这一方法应该产生比现有技术更均匀的结果。具体来说，本发明的一个目的是新方法应该进一步降低玻璃化工艺中不需要的污染效应的流行程度。
在上面开始段落中阐述的方法中实现这些和其他目的，通过下面的步骤来表征该方法：
-提供用于输送低温流体的两个导管，这些导管中的每一个打开进入管口，这些管口被布置成跨介于中间的间隙而面对彼此；
-将样本放置在所述间隙中；
-通过所述导管泵送低温流体以便从所述管口同时冲刷，由此从两个相对面将样本突然浸入（浸泡、使其湿透、将其弄湿）在低温流体中。
该新颖技术与现有技术在许多重要方面不同，包括以下各项：
（i）样本不再被投入液体致冷剂主体中；作为代替，通过所述导管将致冷剂带到样本；
（ii）这样的组织允许关于样本的背面和正面的冷却的完全对称：就致冷剂类型、相、温度、流动横断面和流速来说来自两个发明性管口的致冷剂的冲刷可以相同。这与现有技术中的水平投入技术形成强烈对比，在现有技术中在针对样本的正面和背面的冷却条件之间存在内在差异；例如，在上面提到的US 9,116,091中，样本正面经历致冷剂浴液，而样本背面经历致冷剂喷雾，这导致在热容量/热传导、暴露几何形状/图案/范围、流体压力、相等方面的正面/背面差异；
（iii）当导管给予它们的低温流体冲刷时，样本相对于导管可以是静态的。这是重要的，因为用于样本安装的网格/膜通常是非常易碎/脆的，并且突然将它们移动/投入到液体的不流动的主体中可以损坏它们。在本发明中，可以通过同时将致冷剂的冲刷给予静态样本的相对面来缓和该问题，这易于在其网格/膜上产生更多对称力。结果，常常可以使用相对薄的网格/膜，而无需切换到更结实的网格/膜。
应该注意，从管口冲刷的低温流体可以是液体或（干的）气体/水蒸气，只要对于每个管口而言它是相同的。液体倾向于比气相流体更优选，尤其因为液体更大的热容量以及在液体情况下可以相对容易存储和泵送。还应该注意，如果需要，管口可以包含网孔/筛或其他形式的流动路径细分，例如以便实现层状流动和/或特定流动模式。
在根据本发明的组织中，可以例如使用一个或多个电子泵通过所采用的导管来泵送低温流体；可以按照需要接通/断开这些电子泵，并且/或者阀系统可以被用来任意打开/关闭导管中的流量。然而，在可替代实施例中，使用“人工泵”组织，在其中：
-所述导管被布置在柱塞中，由此每个导管具有在柱塞底面上的入口孔径，并且所述间隙被提供为柱塞顶面中的狭槽；
-在所述柱塞下面提供低温流体浴液；
-使用将向下压力施加在所述柱塞上的工具来将所述样本插入到所述狭槽中，由此至少部分淹没柱塞并引起所述浴液中的低温流体流入所述入口孔径中并通过所述管口出现。
例如在图3A-3C中图示这样的组织，并且它有效地使用与活塞中使用的机制相类似的流体位移机制（由此柱塞充当了[具有过流的导管的]活塞头的角色，并且低温浴液被包含在活塞管中）。在这样的一个实施例中，应该注意：
-讨论中的“工具”例如可以是钳子或镊子，其可以被用来通过样品的边缘来抓住样品。这样的工具可以例如包含诸如与柱塞的顶部（或其上的某些结构）啮合的突起、布结或局部放大物的特征以便将工具（在狭槽中）的插入运动转换成柱塞的（向下）共同运动，
-柱塞可以最初（浅浅地）漂浮在致冷剂浴液中，或者可以可替代地悬浮（hang）在该浴液上。
-尽管图3A-3C中的图示描绘了样本平面被垂直定向并且致冷剂流体从管口水平冲刷的场景，但不一定必须是这样的情况。反而，可以例如构造一种组织，在其中样本平面被水平定向，管口被布置在其上面和下面，并且致冷剂流体从管口垂直冲刷。在这两个场景中，期望使两个导管的（累积）长度基本上相等，以便确保当柱塞被适当浸没时基本上同步从两个管口流出低温流体，
-柱塞可以由各种材料制成，只要它们与低温温度下的使用兼容（例如就脆性而言）。示例包括例如不锈钢、钛和（某些）陶瓷。
尽管这不是本发明的约束性/必要的方面，但是就样本的许多常见类型而言，将应用以下各项：
-样本是基本上平面的，具有相对定位的主表面；
-样本可以被布置在所述间隙中以使得所述主表面面向所述管口。
这样的布置基本上规定以下内容：
-可以将末端/极值/圆周周界与各管口中的每一个相关联。这通常将是圆形的，尽管不一定必须是这样的情况。
-这些周界理想地将以公共轴线为中心。
-该公共轴线以（大约）法向角/垂直角横切（平面）样本的平面。
公共轴线理想地还将经过样本的几何中心/图心/质心。
理想地，样本将被定位成使得它与各管口等距（或者在样本包括跨过网格的膜的情况下使得该膜与各管口等距）。如果与第二管口相比样本/膜更靠近第一管口，则仍可以通过例如以下各项来确保同时冲刷样本的正面和背面：
-稍稍推迟致冷剂到与第一管口相连接的导管中的泵送；或者/以及
-体现比连接到第二管口的导管稍稍更长的与第一管口相连接的导管。
关于样本要被投入其中的致冷剂浴液，存在关于所使用的致冷剂的各种可能选择。例如，各个从业人员报告使用液态乙烷/丙烷混合物。在本发明的特定实施例中，在-160℃到-183℃的温度范围的浴液中的致冷剂包括液态乙烷（没有大量的其他成分）。当通过投入-冷却样本来将该样本玻璃化时，可以倾向于坚持“越冷越好”的规则。然而，在低于-183℃左右的温度，发明人已经观察到液态乙烷倾向于变得如此有粘性以至于开始妨碍投入过程，例如通过附着到样本保持器。因此高于该等级（例如-175℃）的温度通常更可取。
为了实现样本的令人满意的玻璃化，样本从本发明的管口到低温流体的暴露应该是相对突然的（因为术语“冲刷”）。如果从管口到低温流体的暴露是更逐步/延伸的，则存在样本将（至少部分）被冻结成结晶形状而不是无定形的凝固的风险，这在本发明的环境中是不合意的。本发明的冲刷的时序和持续时间可以根据各个因素而被调整/优化，该各个因素诸如样本（的网格/膜）的厚度、所采用的低温流体的温度、管口所产生的压力/流动模式等等。作为不具约束力的示例，冲刷可以具有100毫秒或更多的持续时间；在样本包括网格上的多洞膜的情况下，较长的持续时间通常将帮助确保除了产生多洞膜中的含水薄膜的玻璃化之外，来自网格的剩余热量被（以及任何相关联的支撑构件）移除到令人满意的程度，以便防止通过来自网格的热泄露的不需要的膜的“再加热”。在玻璃化发生之后，含水薄膜温度将优选保持低于-145℃，以防止不需要的结晶冰形成。技术人员将能够选择冲刷持续时间，调整以适应关于本发明的给定实施例的组织和参数。
附图说明
现在将基于示例性实施例和所附示意性附图来更详细地阐明本发明，在附图中：
图1A-1C描绘用于将样本玻璃化的各种现有技术方法。
图1D图示玻璃化过程中所使用的普通样本结构（的特定示例）。
图2A和2B是使用根据现有技术（图2A）和本发明（图2B）的方法在网格上制备并玻璃化的含水液体样本的相对低放大率的TEM图像。
图3A-3C呈递了根据本发明的装置的实施例的方面的纵向横截面视图（用于表现本发明的方法）。
图4呈递了适用于与本发明的一起使用的带电粒子显微镜的纵横截面视图。
在这些图中，在相关的情况下使用相对应的参考符号来指示对应部件。应该注意，一般来说，附图并不是按比例的。
具体实施方式
可比较的示例（现有技术）
图1A呈递了用于将样本S投入冷却到低温温度（更具体地使用上文提到的“水平投入”技术）的现有技术装置1的方面的示意性正视图（elevational view）。样本S将通常（但不一定）具有诸如图1D中更详细示出的类型的组合结构。要注意，将在下面的描述中使用笛卡尔坐标系XYZ。所描绘的装置1包括：
-臂3，其可以用来将样本S夹紧在其边缘处/附近，并且将样本S保持为基本水平取向（平行于XY平面）。该臂3包括使用例如镊子活动夹紧样本S的夹具3a。如果需要，样本S可以具有允许它更容易被夹具3a夹紧的小突出凸耳（未描绘）。
-容器5（诸如杜瓦瓶），其可以至少部分填充有致冷剂7的浴液，以使得所述致冷剂7具有暴露的上表面9（除了相对较小的新月效应（meniscus effect）之外它将基本水平）。
-下投机构11a、11b可以被（至少部分）用来将臂3移动到容器5中，从而允许（夹具3a的）臂3中/上的样本S被投入致冷剂表面9的下面，其中样本S的正面Sf指向下方（平行于Z方向）。如这里所描绘的，下投机构11a、11b包括可以沿着平行Z方向的棒（rod）11b向上和向下移动（如箭头11c所指示的）的滑块11a。滑块11a在投入期间的向下运动可以例如是自由下降、被弹射或被机动化。作为所描绘的机构的替代/补充，也可以仅手动地把样本S浸入致冷剂表面9下面。
图1D（未按照比例）呈递了可以结合图1A的装置1（并且也在本发明中）使用的样本S的特定实施例的方面的更详细的（示意性）视图。该特定类型的样本S包括常常被称为“网格”或“自动网格”G的对象。它包括Cu导线的圆形环21a，该环的直径典型地达到约3mm的程度并且导线的直径典型地达到约50-100μm的程度。在环21内附接的是直的导线部分21b，它们（在这种情况下）被布置成形成正交网格图案，由此限定（基本上方形）孔径（开口/洞/窗口）23的矩阵状阵列。图1D的中间部分示出（沿着直径B-B'获得的）图的上部的横剖面图。它示出网格G具有基本上平面的（板状）形式，具有基本上彼此平行的相对的第一（S1）和第二（S2）“面”。如这里所描绘的，膜25已跨在第一面S1上（并且可选地，例如使用黏合剂或通过熔融粘结贴在导线21b）。该膜25可以例如包括含碳材料（诸如尼龙或石墨烯），并且通常将具有范围从约0.3nm到几百nm的厚度（在Z方向上）。膜25包含多个孔27的分布，在图底部的详细视图中可清楚看到它们。这些孔27典型地具有达到约2μm量级的程度的直径（平行于XY平面）。本质上，网格G充当膜25的支架，并且膜25进而充当用于孔27的支撑结构（以致有时它被称为“多洞的碳支撑”）。在孔27内要提供和支撑最终的“样品”，这以横跨每个给定孔27的含水液体的薄膜29（包括悬在其中的一个或多个研究样品）的形式，（尤其）凭借表面张力效应停留在适当位置。应该注意，如图1D（网格G+穿孔膜25、27）中描绘的以及如上文描述的结构在商业上可买到，例如从诸如美国加利福尼亚的雷丁的Ted Pella有限公司之类的厂商购买。还有可能购买（各种各样的）预先制造的多洞的碳薄膜（与穿孔膜25、27相对应），例如从诸如德国耶拿的Quantifoil Micro Tools股份有限公司之类的厂商购买。
可以使用技术文献中详细描述的且技术人员已知的方法在膜25的各个孔27中提供含水液体的薄膜29。在一个这样的公知的方法中，靠着膜25的外/下表面按压一张吸水纸（没有描绘），然后利用讨论中的含水液体使其潮湿，并且随后移除（例如剥离）膜25以引起（大多数）孔径27被赋予含水液体的（小型）薄膜29，其通过表面张力效应在各孔径之内跨越。例如在Marc Adrian等人的文章Cryo-negative Staining，Micron 29 (2-3),Elsevier Science有限公司，1998，145-160页中描述了这种类型的方法，并且在这里将不会受到进一步的注意。还引用了在欧洲专利申请EP 15156546.2[FNL1504]（其通过引用合并于本文）中阐述的替代方法。
现在返回到图1A，如上文所述一旦样本S已被提供有其（多个）含水液体薄膜29，它就可以以膜25向下面向致冷剂表面9的这种方式被安装在臂3的夹具3a上，由此形成样本S的正面Sf（与背面Sb相对）。在容器5中提供致冷剂7（例如液态乙烷）的适当浴液，并且下投机构11a、11b然后被用来将样本S突然地投入致冷剂7中（例如以大约2ms-1的速度）。这样的过程是例如在上文提到的Kasas等人的文章中描述。在以这种方式已将样本S投入冷却之后，将其从致冷剂7移出并放置在低温保持器（未描绘）上/中，该低温保持器可以将其保持在低温温度直到它经历CPM中的研究为止。
如上文已经阐述的，发明人已发现该现有技术方法产生就样本质量而言令人不满意的结果。更特别地，以这种方式冷却的样本易于展示严重污染。该影响在图2A中示出，图2A描绘已经使用如图1A中图示且上文阐述的现有技术装置/技术投入冷却的含水液体薄膜29的1μm×1μm方形部分（贴片），并且在这里以相对低的放大率使用低温TEM对其成像。大的均质/无特征的图像被带有深色斑点、点状特征代替应该会怎样。如上文所解释的，发明人已经确立，这些特征实际上是已形成在在投入期间面朝上/ 远离致冷剂表面9的薄膜29的侧面上的表面冰岛。这些特征的存在使共享普通光线的研究样品模糊不清，并且在用来研究薄膜29的带电粒子束中引起不需要的散射效应。
为了整齐有序，还要注意图1A中示出以及上文描述的情况的下述变化：
-在图1B中，使用“垂直投入”技术而不是“水平投入”方法来玻璃化样本S。在上面提到的Kasas参考文献中讨论这样的方法，并且该方法被视为产生不满意的结果，因为样本S被“线性”（在垂直方向上）而不是“面上（face on）”冷却，
-在图1C中，示意性地图示上文提到的US 9,116,091中阐述的方法。这再一次是“水平投入”技术，但是修改为当样本S的正面Sf撞击致冷剂表面9时喷嘴13将“一阵”低温蒸汽15应用于样本S的背面Sb，尝试实现正面Sf和背面Sb的同时玻璃化，这与图1A的情况不同，在图1A中这样的玻璃化不是同时的。
实施例1
图3A-3C示出根据本发明的方法和装置的实施例的各方面。以图3A开始，图3A示出用于输送低温流体的一对导管31a、31b。这些导管31a、31b中的每一个都具有两个极值孔口，这些孔口（分别）是：
-（下面的）进入孔口37a、37b，低温流体可以通过它们进入导管31a、31b；
-（上面的）管口（离开孔口）33a、33b，低温流体可以通过它们从导管31a、31b露出。这些管口33a、33b跨介于中间的间隙35而面对彼此。
应该注意：
- 为了方便起见，各个部件31a、31b、33a、33b、35、37a、37b在这里被描绘为驻留在主体P中，该主体P可以充当将它们保持在适当位置的基质/结构；例如，主体P可能是金属或陶瓷插头/块，在其中已经通过例如铸造、成形、机械加工或3D打印来创建这些各个部件。然而，不一定必须是这样的情况，并且代替地各个部件可以是（准）独立的结构，
- 孔口37a、37b；33a、33b在这里被描绘为向外展开的，但是不一定必须是这样的情况，
- 间隙35被描绘为均匀的宽度，但是例如可替代地它可以是锥形的。
图3A中还描绘的是可以被用来抓住并操控样本S（例如通过沿着其边缘夹紧它）的工具T（诸如镊子、钳子、钳类工具、夹子、机器臂等等）。该工具T可以被用来将样本S定位在间隙35中并且在管口33a、33b之间。
如上文已经阐述的，将低温流体供应给入口孔口37a、37b的一种方式是使用适当的管道/管线将它们简单地连接到（电气）致冷剂泵（以及相关联的致冷剂储罐）；然后可以通过导管31a、31b泵送致冷剂并且到管口33a、33b之外以便用低温流体冲刷/弄湿间隙35（位于间隙53中的样本S）。然而，在当前实施例中，作为代替使用（手动）活塞作用来使低温流体移动通过导管31a、31b。为此，主体P被具体化为柱塞，它具有底面Pu（入口孔口37a、37b位于底面Pu中）和顶面Pt（有可能通过顶面Pt来跨过间隙35）。该柱塞P然后可以例如被（部分）插入/浸入致冷剂7的容器5（管道、器皿）中；当柱塞的底面Pu移动到表面9下面时，将对致冷剂7（逐步）用力以通过入口孔口37a、37b、通过导管31a、31b以及到管口33a、33b之外（参见从图3A到3B到3C的进展，这图示该运动的部分）。应该注意，某种程度的毛细管作用通常将引起一定量的致冷剂7缓慢移动上来到导管31a、31b中，这种缓慢移动的程度尤其取决于导管31a、31b的直径、致冷剂7的密度/黏度等等；为了简单起见，尚未在图3A-3C中图示该效应。
为了产生这种柱塞运动，所描绘的组织使用工具T来将向下的力应用于柱塞P（但不一定必须是这种情况），已经作为代替可以通过其他手段向下推动柱塞P。如图3B和3C中所示，工具T具有与柱塞P的顶面Pt的对等区/部分P'啮合的突出物/凸耳T'，从而允许在工具T上的向下的力将向下动量传递给柱塞P：参见图3B、3C中说明性的向下箭头T''。此外，突出物T'可以（如果这样期望的话）被利用来确保样本S被插入间隙35中的最佳深度（理想地在管口33a、33b之间基本对称）并且还可以被用来提供间隙35中的样本S的正确横向定位（再一次，理想地利用与管口33a、33b等距的样本（的玻璃状薄膜））。
在诸如这里描绘的组织的非限制示例中，可以应用下面的说明性（以及近似）值：
- 样本S包括直径为3mm且厚度为0.4mm的平面网格。
- 管口33a、33b的直径：3-4mm。
- 导管31a、31b的直径：2.5mm。
- 管口31a、31b的间隔/间隙35的宽度：1mm。
- 从管口31a、31b的流速：~5-15m/s。
技术人员将能够使其自己的价值适合于给定情况的需求。
当前发明相对于现有技术改进的结果从图2B很明显，在图2B中图2A的污染物点状特征完全没有了。在图2B的中心以及左下方处管状“浮动实体”是Keyhole Limpet Hemocynanin蛋白质复合物，其在图2A中不可见。沿着图2B的底部的深色区是所采用的多洞碳薄膜（中的2μm宽孔径）的边缘。
实施例2
图4是可以被用来检查根据本发明制备的样本的CPM的实施例的高度示意性描绘；更具体地，其示出透射型显微镜M的实施例，在这种情况下该透射型的显微镜M是TEM/STEM（尽管在当前发明的环境中，例如可能有效的仅仅是基于离子的显微镜）。在图中，在真空罩V内，电子源2（诸如例如肖特基发射器）产生穿过电子光学照明器4的电子束（C），电子光学照明器4用于将它们引导/聚焦到样本S的所选部分上（其可以例如（局部）变薄/平面化）。该照明器4具有电子-光学轴C'，并且通常将包括各种各样的静电/磁透镜、（多个）（扫描）偏转器D、校正器（诸如消象散器）等等；典型地它还可以包括冷凝器系统（整个条目4有时被称为“冷凝器系统”）。
样品S被保持在样品保持器H上，样品保持器H可以通过定位系统/平台A以多个自由度定位；例如样品保持器H（尤其）可以包括在XY平面中移动的手指（参见所描绘的笛卡尔坐标系；典型地，平行于Z且（至少）关于X/Y倾斜的运动也将是可能的）。这样的移动允许样本S的不同部分被沿着轴C'（在Z方向上）行进的电子束辐射/成像/检查（以及/或者允许执行扫描运动，作为对射束扫描的替代）。冷却设备H'与样品保持器H亲密热接触，并且能够将后者保持在冷却温度，例如通过使用一大桶低温致冷剂来实现和保持期望的低温。
沿着轴C'行进的（经过聚焦的）电子束C将以引起各种类型的“受激”辐射从样品S发出的这种方式与样品S交互，包括（例如）二次电子、散射电子、X射线和光学辐射（阴极射线发光）。如果需要，可以在分析设备6的帮助下检测这些辐射类型中的一个或多个，例如该分析设备6可能是组合的闪烁物/光电倍增管或EDX（能量色散X射线光谱学）模块；在这种情况下可以使用与SEM中基本相同的原理来构造图像。然而，可替代地或作为补充，可以研究穿过（通过）样品S、从样本出现（发出）并沿着轴C'继续传播(大体上，尽管一般具有一些偏斜/散射）的电子。这样的透射电子通量进入成像系统（组合的物镜/投影透镜）8，其一般将包括各种各样的静电/磁透镜、偏转器、校正器（诸如消象散器）等等。在正常（非扫描）TEM模式中，该成像系统8可以将所透射的电子通量聚焦到荧光屏10上，如果需要的话该荧光屏10可以被缩回/收回（如由箭头10'示意性指示的）以便将它带到轴C'的路径之外。将通过成像系统8在屏幕10上形成样品S的（一部分的）图像（或衍射图），并且可以通过位于罩V的壁的适当部分中的观察口12来观察该图像。屏幕10的缩回机构可以例如本质上是机械的或/或电的，并且在这里不描绘。
作为对观察屏幕10上的图像的可替代方式，可以作为代替利用从成像系统8发出的电子通量的焦深通常非常大（例如大约1米）的事实。因此，在屏幕10的下游可以使用各种其他类型的分析装置，诸如：
- TEM相机14。在相机14处，电子通量可以例如形成可被控制器E处理且显示在诸如平板显示器之类的显示设备（没有绘制）上的静态图像（或衍射图）。当不需要时，相机14可以被缩回/收回（如由箭头14'示意性指示的）以便将它带到轴C'的路径之外。
- STEM成像器（相机）16。可以根据射束C在样品S上的（X，Y）扫描位置来记录来自成像器16的输出，并且可以将图像构造为作为X、Y的函数的来自成像器16的输出的“图”。成像器16可以例如包括直径为例如20mm的单个像素，与相机14中有特征地存在的像素矩阵形成对照。此外，成像器16通常将具有比相机14（例如每秒102幅图像）高得多的采集速率（例如每秒106个点）。再次地，例如当不需要时，成像器16可以被缩回/收回（如由箭头16'示意性指示的）以便将它带到轴C'的路径之外（尽管这样的缩回在炸面圈形状的环形暗场成像器16的情况下不一定是必须的；在这样的成像器中，当不使用成像器时中央的洞将允许射束通过），
- 作为对使用相机14或成像器16进行成像的替代，还可以调用光谱装置18，其可以是例如EELS模块（EELS=电子能量损失光谱学）。
应该注意，条目14、16和18的顺序/位置不是严格的，并且许多可能变化是可想到的。例如，光谱装置18也可以被集成到成像系统8之内。
所注意的是控制器（计算机处理器）E被经由控制线（总线）E'连接到各种说明性部件。该控制器E可以提供各种各样的功能，诸如同步行动、提供组织点、处理信号、执行计算以及在显示设备（未描绘出）上显示消息/信息。不用说，（示意性描绘的）控制器E可以（部分）在罩V之内或之外，并且根据需要可以具有单一或复合结构。技术人员将会理解罩V的内部不一定要被保持在严格真空中；例如在所谓的“环境TEM/STEM”中，给定气体的背景大气被故意引入/保持在罩V之内。技术人员还将理解，实际上限制罩V的体积是有利的以使得有可能的话它实质上拥抱轴C'，其采用所采用的电子束通过的（例如直径大约1cm的）小管的形式，但是将其加宽以容纳诸如源2、样品保持器H、屏幕10、相机14、成像器16、光谱装置18等等之类的结构。
图4中示出的样品S可以例如是已经历根据本发明的玻璃化工序的样品。这样的样品可以在其处于CPM M中时（以及在其被输送/存储时）由于冷却设备H'被保持在低温温度。为此，可以例如采用诸如以下各项的实施例：
-冷却设备H'包括杜瓦瓶/烧瓶，其被紧密热连接（例如经由铜棒和/或交错编织（braid））到保持器H，并且可以被填充有致冷剂，
-组合结构H+H'可以被插入到CPM M中/从CPM M移除，由此它可以位于定位系统A的接收器部分中/被定位系统A的接收器部分夹住。
参考例如美国专利申请US 2012/0112064A1中讨论的组织，以及类似的这种组织。

Claims (16)

1.一种为带电粒子显微镜中的研究制备样本的方法，由此该样本经受使用致冷剂的快速冷却，该方法包括：
-提供用于输送低温流体的两个导管，这些导管中的每一个都打开进入管口，这些管口被布置成跨介于中间的间隙而面对彼此；
-将样本放置在所述间隙中；以及
-通过所述导管泵送低温流体以便从所述管口同时冲刷，由此从两个相对面将样本突然浸入在低温流体中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中：
-所述导管被布置在柱塞中，由此每个导管具有在柱塞底面上的入口孔径，并且所述间隙被提供为柱塞顶面中的狭槽；
-在所述柱塞下面提供低温流体浴液；以及
-使用将向下压力施加在所述柱塞上的工具来将所述样本插入到所述狭槽中，由此至少部分淹没柱塞并引起所述浴液中的低温流体流入所述入口孔径中并通过所述管口出现。
3.根据权利要求1所述的方法，其中：
-所述样本是基本上平面的，具有相对定位的主表面；以及
-该样本被布置在所述间隙中以使得所述主表面面向所述管口。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述样本包括平面网格。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述低温流体包括温度在范围-160℃到-183℃中的液态乙烷。
6.一种用于为带电粒子显微镜中的研究制备样本的装置，由此该样本经受使用致冷剂的快速冷却，该装置包括：
-用于输送低温流体的一对导管，这些导管中的每一个都打开进入管口，这些管口被布置成跨样本被布置在其中的介于中间的间隙而面对彼此；以及
-泵送机构，其用于通过所述导管泵送低温流体以便从所述管口同时冲刷并且从两个相对面将样本突然浸入在低温流体中。
7.根据权利要求6所述的装置，其中：
-所述导管被布置在柱塞中，由此每个导管具有在柱塞底面上的入口孔径，并且所述间隙被提供为柱塞顶面中的狭槽。
8.使用如权利要求1所要求保护的方法制备的样本在带电粒子显微镜中的使用包括：
- 样本保持器，其用于容纳样本；
- 冷却设备，其用于至少在样本在所述样本保持器上时将所述样本维持在低温温度；
-源，其用于产生带电粒子射束；
-照明器，其用于引导所述射束以便照射样本；以及
-检测器，其用于响应于所述照射检测从样本发出的辐射通量。
9.根据权利要求2所述的方法，其中：
-所述样本是基本上平面的，具有相对定位的主表面；以及
-该样本被布置在所述间隙中以使得所述主表面面向所述管口。
10.根据权利要求2所述的方法，其中所述低温流体包括温度在范围-160℃到-183℃中的液态乙烷。
11.根据权利要求3所述的方法，其中所述低温流体包括温度在范围-160℃到-183℃中的液态乙烷。
12.根据权利要求4所述的方法，其中所述低温流体包括温度在范围-160℃到-183℃中的液态乙烷。
13.根据权利要求2所述的方法，进一步包括：
在带电粒子显微镜内，在样本保持器中提供样本；
至少在样本在所述样本保持器上时使用冷却设备将所述样本维持在低温温度；
从源产生带电粒子射束；
使用照明器引导所述射束以便照射样本；以及
使用检测器响应于所述照射检测从样本发出的辐射的辐射通量。
14.根据权利要求3所述的方法，进一步包括：
在带电粒子显微镜内，在样本保持器中提供样本；
至少在样本在所述样本保持器上时使用冷却设备将所述样本维持在低温温度；
从源产生带电粒子射束；
使用照明器引导所述射束以便照射样本；以及
使用检测器响应于所述照射检测从样本发出的辐射的辐射通量。
15.根据权利要求4所述的方法，进一步包括：
在带电粒子显微镜内，在样本保持器中提供样本；
至少在样本在所述样本保持器上时使用冷却设备将所述样本维持在低温温度；
从源产生带电粒子射束；
使用照明器引导所述射束以便照射样本；以及
使用检测器响应于所述照射检测从样本发出的辐射的辐射通量。
16.根据权利要求5所述的方法，进一步包括：
在带电粒子显微镜内，在样本保持器中提供样本；
至少在样本在所述样本保持器上时使用冷却设备将所述样本维持在低温温度；
从源产生带电粒子射束；
使用照明器引导所述射束以便照射样本；以及
使用检测器响应于所述照射检测从样本发出的辐射的辐射通量。
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