JP2017106895A - 荷電粒子顕微鏡用の極低温サンプルの調製 - Google Patents

Abstract

【課題】荷電粒子顕微鏡における評価のため、ガラス化により極低温サンプルを調製する改善された方法を提供する。
【解決手段】極低温流体を輸送する２つの導管３１ａ，３１ｂを提供するステップであって，導管３１ａ，３１ｂの各々は，マウスピース３３ａ，３３ｂまで開通しており，マウスピース３３ａ，３３ｂは，介在ギャップ３５を介して相互に対面するように配置されるステップと，サンプルＳをギャップ３５に設置するステップと，導管３１ａ，３１ｂを介して極低温流体７をくみ上げ，マウスピース３３ａ，３３ｂから一斉に流出させ，これにより，２つの対向する側からサンプルＳを極低温流体７に急速浸漬させるステップと，を有する方法。
【選択図】図３Ａ

Description

本発明は、荷電粒子顕微鏡における評価のためサンプルを調製する方法であって、当該方法により、前記サンプルは、凍結剤を用いて急冷される、方法に関する。また、本発明は、そのような方法を実施する機器に関する。

また、本発明は、荷電粒子顕微鏡における、そのようなサンプルの使用に関し、前記荷電粒子顕微は、
前記サンプルを保持するサンプルホルダと、
少なくとも前記サンプルホルダにある間、前記サンプルを極低温に維持する冷却装置と、
荷電粒子のビームを形成するソース源と、
前記ビームが前記サンプルに照射されるように前記ビームを誘導する照明器と、
前記照射に応じて前記サンプルから放射される放射線の流束を検出する検出器と、
を有する。

「凍結剤」と言う用語は、極低温の液体、すなわち−150℃以下の液体を表すものとして理解される。そのような凍結剤の例は、液体エタン、液体プロパン、液体酸素、およびこれらの混合物を含む。

荷電粒子顕微鏡は、良く知られており、特に電子顕微鏡の形態においては、顕微鏡対象物の結像のための重要な技術になってきている。歴史的に、電子顕微鏡の基本種類は、透過型電子顕微鏡（TEM）、走査型電子顕微鏡（SEM）、走査透過型電子顕微鏡（STEM）など、多くの既知の機器に進化するとともに、いわゆる「ジュアルビーム」ツール（例えばFIB-SEM）など様々なサブ種に進化しており、後者は、追加で「機械加工」集束イオンビーム（FIB）を用いることで、例えばイオンビームミリングまたはイオンビーム誘導成膜（IBID）のような、支援動作が可能になる。より具体的には：
−SEMでは、走査電子ビームによるサンプルの照射により、サンプルから、例えば、二次電子、後方散乱電子、X線、およびフォトルミネッセンス（赤外光子、可視光、および／または紫外光子）の形態の「予備」放射線の放出が促進される。次に、この放出放射線の流束の1または2以上の成分が検出され、画像蓄積用に使用される。
−TEMでは、サンプルに照射される電子ビームにおいて、十分に高いエネルギーが選定され、これがサンプルに進入する（このため、通常、サンプルは、SEMのサンプルに比べて薄くされる）。次に、サンプルから放出される透過電子の流束を用いて、画像が形成される。そのようなTEMが走査モードで作動される（すなわちSTEMとなる）と、照射電子ビームの走査の動きの間、対象の画像が蓄積される。

このトピックスに関するさらなる情報は、例えば、以下のWikipediaのリンクから収集される：
http://en.wikipedia.org/wiki/Electron_microscope
http://en.wikipedia.org/wiki/Scanning_electron_microscope
http://en.wikipedia.org/wiki/Transmission_electron_microscopy
http://en.wikipedia.org/wiki/Scanning_transmission_electron_microscopy
照射ビームとして電子を使用する代わりに、荷電粒子顕微鏡では、荷電粒子の他の種類が使用される。この態様において、「荷電粒子」という用語は、例えば、電子、正イオン（例えばGaまたはHeイオン）、負イオン、プロトンおよびポジトロンを含むように、広く解する必要がある。非電子系の荷電粒子顕微鏡に関しては、以下のような情報源からのいくつかの別の情報が参照される：
https://en.wikipedia.org/wiki/Focused_ion_beam
http://en.wikipedia.org/wiki/Scanning_Helium_Ion_Microscope
- W.H. Escovitz, T.R. Fox and R. Levi-Setti, Scanning Transmission Ion Microscope with a Field Ion Source, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72(5), pp 1826-1828 (1975).
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22472444
結像および（局部的）表面改質（例えばミリング、エッチング、成膜等）の実施に加えて、荷電粒子顕微鏡は、分光分析の実施、回折像の評価等、他の機能も有することに留意する必要がある。

いずれの場合も、荷電粒子顕微鏡（CPM）は、少なくとも以下の部材を有する：
−例えばショットキー電子源またはイオン銃のような放射線源。
−ソース源からの「生の」放射線ビームを操作し、焦点化、収差軽減、クロッピング（アパーチャとともに）、フィルタ処理などの動作を実施するように機能する照明器（illuminator）。通常、これは、1または2以上の（荷電粒子）レンズを有し、さらに他の種類の（粒子）光学部材を有しても良い。必要な場合、照明器には、偏向器システムが提供され、これにより、出力ビームは、被評価サンプルにわたる走査の動きを実施できるようになる。
−サンプルホルダ。被評価サンプルは、この上に保持され、（例えば傾斜、回転して）配置される。必要な場合、このホルダを動かし、サンプルに対するビームの所望の走査の動きを実施しても良い。通常、そのようなサンプルホルダは、機械式ステージのような配置システムに接続される。ホルダは、サンプルを所与の温度範囲（高温または低温）に維持する手段を有しても良い。本発明の特定の例では、これは、通常、サンプルを極低温に維持する手段を有する。
−（被照射サンプルから放出される放射線を検出する）検出器。これは、事実上、一体型であっても、複合／分散式であっても良く、検出される放射線に応じて、多くの異なる態様を取り得る。一例には、CMOS検出器、CCD検出器、光電セル、X線検出器（シリコンドリフト検出器およびSi(Li)検出器）等が含まれる。通常、CPMは、いくつかの異なる種類の検出器を有し、これらの選択には、異なる状況が想定される。

走査式の機器（例えばSEMまたはSTEM）の特定の場合、CPMは、以下を有する：
−放射線ビームおよびサンプルの相対的な走査の動きを生成する走査手段。これにより、ビームは、サンプル（の表面）上で所定の（2次元）走査パターンでトレースされる。次に、走査パターンのサンプリング点あたりの検出器の出力に基づいて画像が形成され、前記サンプル（表面）の（2次元）マップが構築される。前述のように、そのような走査手段は、例えば、ビーム（走査）偏向またはホルダ（走査）の動きに基づいても良い。

また、透過式の顕微鏡（例えば（S）TEM）の場合、CPMは、以下を有する：
−結像システム。これは、実質的にサンプル（面）を通過する荷電粒子を取り込み、これらを、検出／結像装置、分光分析機器（EELSモジュール）等のような解析機器に誘導（集束）する。前述の照明器で参照したように、結像システムは、収差軽減、クロッピング、フィルタ処理などのような、他の機能を実施しても良く、通常、これは、1または2以上の荷電粒子レンズおよび／または他の種類の粒子−光学部材を有する。

以下、本発明では、一例として、しばしば、電子顕微鏡の特定の例について説明する。しかしながら、そのような単純化は、単に明確化／一例の表示を意図するものであり、限定的なものと解してはならない。

水溶液（水、電解質、細胞流体、血漿等）の本体に保管され調査される必要がある生物学的試料（細胞セル、細胞成分、単細胞有機体など）は、以下の理由により、CPMにおける評価に対する重要な課題である：
−CPMの（準）真空環境に導入された水溶液は、脱ガス／沸騰を開始し、試料が劣化する傾向にある；
−これを防ぐため、サンプル（資料＋水溶液）は、まず、前記真空に導入する前に凍結される；
−しかしながら、（鋭い）氷の結晶の形成により生じる試料の損傷を防ぐには、そのような凍結は、通常、極めて急速に実施され、顕著な氷の結晶化を生じさせずに、サンプルのガラス化（アモルファス、ガラス状相への固化）を得る必要がある。

サンプルは、例えばTEMのような透過式のCPMにおいても評価されるが、そのようなガラス化（vitrification）を容易にするため、サンプルは、比較的薄く（シート状に）する必要がある。ただし、その場合でも、（使用サポート手段が、ビームの進入に対して大きな影響を示さないように）端部でこれを支持する必要がある。このため、通常、グリッド状のホルダ（いわゆるTEM Autogrid（登録商標））が使用されると、これにわたって、孔空き膜（いわゆる「孔空き炭素膜」）が橋渡しされ、（表面張力効果により）孔に少量のサンプルが保持される。

前述の方法は、S．Kasasらの文献「高速写真結像法により明確化される低温電子顕微鏡試料のガラス化」，J．Microscopy 211(1)，July 2003，pp．48-53に詳しい。この文献は、基本的に、グリッド状のサンプルホルダ（直径3mmの銅グリッド、炭素膜、通常70〜200μmの開口サイズ、〜2μmの孔サイズ、通常孔間〜1.5μmのピッチ）と、それが急落下される凍結剤浴との間の、ストロボ的に解析された時間分解熱接触プロファイルの研究に関するものである。この点、これは、サンプルホルダの凍結剤への「垂直急落下」（これによりサンプルホルダの面は、凍結剤の露出面に対して垂直になる）と、「水平急落下」（これにより、サンプルホルダの面は、凍結剤の露出表面に平行になる）との間の差を検討し、前者よりも均一なガラス化が得られる結果として、後者を提案している（サンプルから凍結剤へのより均一な熱輸送の点で）。しかしながら、文献では、（実質的に）サンプル調製の他の重要な態様について検討しておらず、特に、サンプルのコンタミネーションの課題について対処していない。

本発明の前の研究において、本願発明者らは、「水平急落下」法では、前述の顕著なコンタミネーションが生じるサンプルが生成される傾向があることに気付いた。例えば、図2Aを参照すると、図には、従来技術を用いて得られるガラス化サンプルの1μm×1μmの正方形部分が示されている。使用倍率（〜30k）では、この四角形は、準均一な灰色であるはずである。しかしながら、図から明らかなように、サンプルは、暗いドット状の特徴物の分布で覆われている。これらの汚染特徴物の存在は、CPMにおける後続のサンプルの分析を大きく妨げる。これらは、CPMの荷電粒子の結像ビームを散乱させるサイトとして機能するためである。特定の評価試料がそのような汚染特徴物を有する共有視線に沿って、またはその近傍に配置されると、通常、CPMを用いた満足な視認ができなくなる。

この問題に対処するため、本願発明者（および共同研究者）は、前述のコンタミネーション現象を最初に評価し、これは、サンプルの前側が凍結剤浴に急落下された際の、サンプルの内部およびその前側からの水の染み出しによるものであることを見出した。対策として、本願発明者およびチームは、米国特許第US 9,116,091号［FNL1320］（本願の参照として取り入れられている）において、新たな技術を導入した。すなわち：
−サンプルは、前側が先に、水平に凍結剤浴に急落下され、
−サンプルの前側が凍結剤と接触する直前に、サンプルの後側に、極低温流体の一吹き（気相）を（ノズルから）提供する。

この技術の目的は、サンプルの前側および後側で同時にガラス化を行うことであり、（染み出しが起こる前に後側を「シールする」ことにより）前述の汚染物質の「染み出し」を抑制することである。

前の段落に記載した技術では、それ以前の従来技術に比べて大きな改善が得られるが、本願発明者は、これに対しては未だ改善の余地があることを見出した。この発見の結果は、本発明の主題である。

本発明の目的は、ガラス化により極低温サンプルを調製する改善された方法を提供することである。特に、本発明の目的は、そのような方法で、従来技術に比べて、より均一な結果を得ることである。特に、本発明の目的は、新たな方法で、ガラス化プロセスにおける好ましくないコンタミネーションの影響を抑制することである。

これらのおよび他の目的は、最初の段落に記載の方法により達成される。当該方法は、
−極低温流体を輸送する2つの導管を提供するステップであって、前記導管の各々は、マウスピースまで開通しており、該マウスピースは、介在ギャップを介して相互に対面するように配置される、ステップと、
−前記サンプルを前記ギャップに設置するステップと、
−前記導管を介して極低温流体をくみ上げ、前記マウスピースから一斉に流出させ、これにより、2つの対向する側から前記サンプルを、極低温流体に急速浸漬（濡らし、湿らせ、シャワー）させるステップと、
を有する。

この新たな技術は、以下を含む多くの点で従来技術とは異なる：
（i）サンプルは、液体凍結剤中に急落下させる必要はなく、代わりに、凍結剤は、前記導管を介してサンプルにもたらされる。
（ii）そのような構成では、サンプルの後側と前側の冷却の点で、完全な対称性が得られる。両マウスピースからの凍結剤の一斉流出は、凍結剤種、相、温度、流束断面、および流速の点で、同じである。これは、例えば、サンプルの前側と後側とで、冷却条件の間に固有の差異が存在する、従来の水平急落下技術とは対照的である。前述のUS 9,116,091号では、サンプルの前側は、極低温の浴に晒されるのに対して、サンプルの後側は、凍結剤のスプレーに晒される。熱容量／熱伝導度、露出形状／パターン／範囲、流体圧力、相などの結果、前側／後側において差異が生じる。
（iii）導管が極低温流体を一斉流出させる際、サンプルは、導管に対して静止している。これは、重要である。なぜなら、サンプルの取り付けに使用されるグリッド／膜は、通常、極めて脆く／壊れやすく、これらを液体の停滞する本体に、突然、移動／急落下させると、これらが損傷する。本発明では、この問題は、静止サンプルの対向する両面に、凍結剤を同時に一斉流出させることにより、軽減される。これは、グリッド／膜に、より対称な力を形成する傾向にある。その結果、しばしば、頑丈なものに切り換えなくても、比較的薄いグリッド／膜が使用できる。

マウスピースから一斉流出される極低温流体は、これが各マウスピースで同じである限り、液体または（乾燥）気体／蒸気であっても良いことに留意する必要がある。液体は、気相流体よりも好ましい傾向がある。液体は大きな熱容量を有し、比較的保管およびくみ上げが容易であるからである。また、必要な場合、マウスピースは、メッシュ／シーブ，または例えば層流および／または特定の流れパターンが得られるような、他の流路サブ分割形態を含んでも良いことに留意する必要がある。

本発明による構成では、極低温流体は、例えば、1または2以上の電気ポンプを用いて、使用導管を介してくみ上げられる：これらは、必要に応じて、オン／オフが切り換えられ、および／またはバルブシステムを用いて、導管内の流体の開／閉が任意に行われても良い。しかしながら、別の実施例では、「手動くみ上げ」構成が使用される。この場合：
前記導管は、プランジャ内に配置され、各導管は、前記プランジャの下側に入口開口を有し、前記ギャップは、前記プランジャの上側にスロットとして提供され、
前記プランジャの下には極低温流体の浴が提供され、
前記サンプルは、前記プランジャに下向きの圧力を印加するツールを用いて、前記スロットに挿入され、これにより、プランジャの少なくとも一部が沈み、前記浴中の極低温流体は、前記入口開口に流れ、前記マウスピースを介して放出される。

そのような構成は、例えば、図3A乃至3Cに示されている。これは、ピストンに使用されるものと同様の、流体移動機構を有効に使用する（これにより、プランジャは、（オーバーフロー導管の）ピストンヘッドとして機能し、極低温浴に、ピストン管が収容される）。そのような実施例では、以下のことに留意する必要がある：
−関心対象の「ツール」は、例えば、ピンセットまたはピラーであり、これを用いて、試料がその端部で把持される。そのようなツールは、（スロットの）ツールの（下側の）プランジャへの挿入の動きを変換するため、例えば、プランジャの上部に係合する、突起、バール、または局部的な拡大部のような特徴部を有する。
−プランジャは、最初、凍結剤浴に（浅く）浮遊しても良く、あるいは浴に漂っていても良い。
−図3A乃至3Cに示した例では、サンプル面は垂直に配向され、極低温流体は、マウスピースから水平に一斉流出されるが、これは、必ずしも必要ではない。代わりに、例えば、サンプル面が水平に配向され、マウスピースがその上下に配置され、極低温流体がマウスピースから鉛直方向に一斉流出されるように、構成されても良い。いずれの場合も、両方の導管の（累積）長さは、実質的に等しいことが望ましい。この場合、プランジャが好適に潜水した際に、両方のマウスピースからの極低温流体の噴出を、実質的に同時に生じさせることができる。
−プランジャは、極低温での使用と互換性を有する限り（例えば脆性の点で）、各種材料で構成されても良い。一例には、例えばステンレス鋼、チタン、および（ある）セラミックが含まれる。

これは、本発明の必須の／限定的な態様ではないが、多くの一般的なサンプルの場合、以下のことが適用される：
−サンプルは、実質的に平坦であり、相互に対向する主表面を有する；
−サンプルは、前記ギャップ内に、前記主表面が前記マウスピースと対面するように配置される。

そのような配置には、基本的に以下のことが要求される：
−各マウスピースの終端／極値／円周の周囲が考慮される。これは、通常、円形であるが、これは必ずしも必要ではない。
−これらの周囲は、理想的には、共通軸上に中心化される。
−この共通軸は、（平坦な）サンプルの面と（ほぼ）直角／垂直な角度で交差する。

また、共通軸は、理想的には、サンプルの形状の中心／重心／共通重心を通る。

理想的には、サンプルは、これが両マウスピースから等距離となるように配置される（または、サンプルがグリッド上に橋渡しされた膜を有する場合、膜がマウスピースから等距離となるように配置される）。サンプル／膜が第2のマウスピースよりも第1のマウスピースにより接近する場合でも、例えば以下により、サンプルの前側および後側に、同時にフラッシュさせることが可能になる：
−第1のマウスピースに接続された導管への凍結剤のくみ上げを僅かに遅らせる、および／または
−第1のマウスピースに接続される導管の長さを、第2のマウスピースに接続される長さよりも僅かに長くする。

サンプルが急落下される凍結剤浴に関しては、使用凍結剤に対応した各種可能な選択がある。例えば、各種専門家は、液体エタン／プロパン混合物を使用することを報告している。本発明の特定の実施例では、浴内の凍結剤は、液体エタン（他の成分は、実質的な含有量では含まれていない）を有し、温度は、−160℃から−183℃の範囲である。急落下冷却法によりサンプルをガラス化する際、「低いほど良い」というルールに固執される傾向にある。しかしながら、本願発明者らは、約−183℃未満の温度では、液体エタンが高粘性となり、例えば、サンプルホルダへの付着により、急落下プロセスが妨害され始めることを観測している。従って、このレベルよりも高い温度（例えば−175℃）が通常好ましい。

サンプルを十分にガラス化するため、本発明において、マウスピースからの極低温流体に対するサンプルの暴露は、比較的急速に生じさせる必要がある。従って、「（一斉）流出（flush：フラッシュ）」と言う用語が使用される。マウスピースからの極低温流体に対する暴露がより段階的で長時間化された場合、サンプルがアモルファス的な固化ではなく、（少なくとも部分的に）結晶形態で凍結されるリスクがある。これは、本発明では望ましくない。本発明における一斉流出（フラッシュ）のタイミングおよび期間は、サンプルの（グリッド／膜の）厚さ、使用極低温流体の温度、マウスピースにより生成される圧力／流れパターンなどのような各種因子に応じて、調整／最適化される。非拘束的な例では、一斉流出（フラッシュ）は、100ミリ秒以上の期間で行われる。サンプルがグリッド上の孔空き膜を有する場合、通常、より長い期間が使用され、孔空き膜内の水溶液膜のガラス化を確実に生じさせるとともに、グリッド（および任意の関連の支持膜）から、残留熱が十分な量、除去される。これにより、グリッドからの熱リークによる、膜の好ましくない「再加熱」が回避される。ガラス化が生じた後、水溶液膜の温度は、約−145℃未満に維持されることが好ましい。これにより好ましくない結晶質氷の形成が回避される。当業者は、本発明の所与の実施例に関する構成およびパラメータを調節し、一斉流出（フラッシュ）の期間を選定することができる。

以下、実施例および添付の概略的な図面に基づいて、本発明について詳しく説明する。

サンプルをガラス化（vitrified）する各種従来技術の方法を示した図である。 サンプルをガラス化する各種従来技術の方法を示した図である。 サンプルをガラス化する各種従来技術の方法を示した図である。 ガラス化プロセスにおいて使用される一般的なサンプル構造（特定の実施例）を示した図である。 従来技術による方法を用いてグリッド上に調製されガラス化された、水溶液サンプルの比較的低倍率のTEM像である。 本発明による方法を用いてグリッド上に調製されガラス化された、水溶液サンプルの比較的低倍率のTEM像である。 本発明による（本発明の方法を実施する）機器の実施例の態様における長手方向の断面図である。 本発明による（本発明の方法を実施する）機器の実施例の態様における長手方向の断面図である。 本発明による（本発明の方法を実施する）機器の実施例の態様における長手方向の断面図である。 本発明の使用に適した荷電粒子顕微鏡の長手方向の断面図である。

図において、関連し対応する部材には、同様の参照符号が使用されている。通常、図面には、スケールは示されていないことに留意する必要がある。

比較例（従来技術）
図1Aには、サンプルSを極低温に急落下冷却する、より具体的には、前述の「水平急落下」技術と称される技術を用いる、従来の機器1の態様の概略的な正面図を示す。サンプルSは、通常（これに限られるものではないが）、図1Dに詳細を示すようなタイプの複合構造を有する。以下の記載では、デカルト座標系XYZが使用されることに留意する必要がある。示された機器1は、以下を有する：
−端部またはその近傍で、サンプルSを把持するために使用されるアーム3であって、サンプルSを実質的に水平な配向（XY平面と平行）に保持するアーム3。このアーム3は、グリッパ3aを有し、これは、例えば、ピンセット動作を用いて、サンプルSを把持する。必要な場合、サンプルSは、小さな突出ラグ（図示されていない）を有し、これがグリッパ3aによってより容易に把持されても良い。
−凍結剤の浴7で少なくとも部分的に充填された、（デュワーのような）容器5。前記凍結剤7は、露出上表面9を有する（これは、比較的小さなメニスカス効果を与えるが、実質的に水平である）。
−落下機構11a、11b。これらを用いて、（少なくとも部分的に）アーム3が容器5内に移動し、アーム3の（グリッパ3aの）サンプルSは、サンプルSの前側Sfが下向き（Z方向に平行）な状態で、凍結剤表面9の下まで急落下する。本願において、落下機構11a、11bは、スライダ11aを有し、これは、ロッド11bに沿って、Z方向に平行に、上下に移動する（矢印11cで示されている）。落下中のスライダ11aの下向きの動きは、例えば、自由落下、カタパルト式、または電動式であっても良い。示された機構の代替／補完として、サンプルSを凍結剤表面9の下まで手動で浸漬させても良い。

図1D（スケール化されていない）には、サンプルSの特定の実施例の態様のより詳細な（概略）図を示す。これは、図1Aの機器1（または本発明）とともに使用される。この特定のタイプのサンプルSは、しばしば、「グリッド」または「オートグリッド」Gと呼ばれる特徴物を有する。これは、Cuワイヤの円形リング21aを有し、リングの直径は、通常、約3mmのオーダであり、ワイヤの直径は、通常、約50〜100μmのオーダである。リング21a内には、直線ワイヤ部21bが取り付けられ、（この場合）これらは、直交グリッドパターンを形成するように配置される。従って、マトリクス状の（実質的に四角形状の）開口（穴／孔／窓）23のアレイが定められる。図1Dの中央部には、図の上部の直径B-B’に沿った横断面図が示されている。図において、グリッドGは、実質的に平坦な（板状の）形態を有し、対向する第1（S1）および第2の（S2）「面」は、相互に実質的に平行である。図に示すように、第1の面S1には、膜25が設置される（必要な場合、例えば、溶融結合により、または接着剤を用いて、ワイヤ21bに固定される）。この膜25は、例えば、ナイロンまたはグラフェンのような炭素質材料を有しても良く、通常、厚さ（Z方向）は、約0.3nmから数百nmの範囲である。膜25は、孔27の分布を有し、これらの孔は、図の底部の詳細図において、明確に視認される。これらの孔27は、通常、約2μmのオーダの直径（XY平面に平行）を有する。本質的に、グリッドGは、膜25の足場として機能し、膜25は、孔27の支持構造として機能する（その結果、これは時折、「孔空き炭素サポート」と称される）。孔27の内部には、水溶液（1または2以上の分散された評価試料を有する）の薄膜29の形態で、最終的な「試料」が提供され、これが支持される。これは、それぞれの所与の孔27にわたって橋渡しされ、表面張力効果により、所定の場所に留められる。図1D（グリッドG＋孔空き膜25、27）に示した構造、および前述の構造は、例えば、Ted Pella，Inc．，Redding，California，USAのような会社から、市販されていることに留意する必要がある。また、例えば、Quantifoil Micro Tools GmbH，Jena，Germanyから、予備製造された（各種）（孔空き膜25、27に対応する）孔空き炭素膜を購入することも可能である。

技術文献に記載の当業者には知られた方法を用いて、膜25の各種孔27に、水溶液の膜29が提供されても良い。あるそのような既知の方法では、膜25の外側／下側表面に、吸い取り紙のシート（図示されていない）が押し付けられ、次に、対象となる水溶液で湿らされ、その後、膜25が除去され（例えば剥離され）、開口27（の大部分）に水溶液の（ミニ）膜29が付与され、この水溶液は、表面張力効果により、これらの内部に広げられる。このタイプの方法は、例えば、Marc Adrianらの「Cryo-negative Staining」 Micron 29 (2-3)，Elsevier Science Limited，1998，pp．145-160に記載されている。ここでは、これ以上記載しない。また、欧州特許出願公開第EP15156546.2［FNL1504］（本願の参照として取り入れられている）に記載の代替方法も参照される。

再度図1Aを参照すると、いったんサンプルSに前述の水溶液の膜29が提供されると、これは、膜25が凍結剤表面9に向かって下向きに面するように、アーム3のグリッパ3aに取り付けられ、これにより、サンプルSの（後側Sbに対向する）前側Sfが形成される。凍結材7（例えば液体エタン）の好適な浴が容器5に提供され、次に、落下機構11a、11bを用いて、突然サンプルSが、例えば2ms^-1の速度で凍結剤7中に急落下される。そのような手順は、例えば、前述のKasasらの文献に記載されている。サンプルSがこのように急落下冷却された後、サンプルは凍結剤7から取り出され、クリオホルダ（図示されていない）に配置され、CPMにおいて評価が行われるまで、極低温が維持される。

前述のように、本願発明者らは、この従来の方法では、サンプルの品質の点で、あまり良好ではない結果が生じることを見出した。より具体的には、この方法で冷却されたサンプルは、一連の汚染（コンタミネーション）を示す傾向にある。この影響は、図2Aに示されている。図2Aには、水溶液の膜29の1μm×1μmの正方形部分（タイル）が示されており、これは、前述の図1Aに示したような従来の機器／技術を用いて急落下冷却されたものであり、クリオ（cryo）TEMを使用して比較的低倍率で撮影されたものである。均一で／特徴のない画像であるはずが、暗いドット上の特徴物を有する、明るい画像となっている。前述のように、本願発明者らは、これらの特徴物は、実際の急落下の際に、膜の凍結剤表面9の上方／遠い側に面する側に形成された氷の表面島であることを見出した。これらの特徴物の存在は、共通の視野方向を共有する試料の評価を妨害し、膜29の評価に使用される荷電粒子ビームに好ましくない散乱の影響を生じさせる。

図1Aに示した以下の状況の多様性が注目される：
−図1Bでは、サンプルSは、「水平急落下」法の代わりに、「垂直急落下」技術を用いてガラス化される。そのような方法は、前述のKasasの文献に記載されているが、好ましくない結果が生じることが予想される。サンプルSは、「うつぶせ」ではなく、「直線的に」（垂直方向に）冷却されるためである。
−図1Cには、前述の米国特許第US9,116,091号に記載の方法が概略的に示されている。これは、「水平急落下」技術ではあるが、サンプルSの後側Sbに向かって、ノズル13が極低温蒸気の「一吹き」15を加え、その前側Sfが凍結剤表面9に当たるように修正されている。前側Sfおよび後側Sbの同時のガラス化が達成される。これは、ガラス化が同時に生じない図1Aの状態とは異なる。

実施例1
図3A乃至3Cには、本発明による方法および機器の実施例の態様を示す。最初に図3Aについて検討すると、この図には、極低温流体を輸送する導管31a、31bの組が示されている。これらの導管31a、31bの各々は、2つの外部オリフィスを有し、これらは（それぞれ）：
−（下側）入口オリフィス37a、37bであって、これを介して、極低温流体は、導管31a、31bに導入される、入口オリフィス37a、37b；
−（上側）マウスピース（出口オリフィス）33a、33bであって、これを介して、極低温流体は、導管31a、31bから排出される、マウスピース33a、33b；
である。これらのマウスピース33a、33bは、介在ギャップ35を介して相互に対面する。

以下のことに留意する必要がある：
−利便性のため、ここでは、各部材31a、31b、33a、33b、35、37a、37bは、本体Pに配置されるものとして描かれており、この本体Pは、これらの部材を所定の位置に維持するマトリクス／構造として機能する。例えば、本体Pは、金属またはセラミックの栓（plug）／ブロックであっても良く、これらの各種部材は、例えば、鋳造、成型、機械加工、または3Dプリンタにより形成される。しかしながら、これは必ずしも必須ではなく、各種部材は、（準）自立構造であっても良い。
−ここでは、オリフィス37a、37b、33a、33bは、フレア状に描かれているが、これは必ずしも必要ではない。
−ギャップ35は、均一な幅を有するものとして描かれているが、代わりに、これは例えば、テーパ状であっても良い。
また、図3Aに示されているツールT（ピンセット、挟み、プライヤ、クランプ、ロボットアームなど）は、例えば、サンプルSをその端部に沿って把持することにより、サンプルSを把持し操作するように使用されても良い。このツールTを使用して、マウスピース33a、33bの間のギャップ35に、サンプルSを配置しても良い。

前述のように、入口オリフィス37a、37bに極低温流体を供給する一つの方法は、適当な管／パイプを用いて、これらを（電気的）凍結剤ポンプ（および関連の極低温リザーバ）に単に接続することである。次に、導管31a、31bを介して、凍結剤がくみ上げられ、マウスピース33a、33bから、ギャップ35（に配置されたサンプルS）に、極低温流体がフラッシュ／シャワーされる。ただし、本実施例では、代わりに、（手動の）ピストン動作が使用され、極低温流体は、導管31a、31bを介して移動する。このため、本体Pは、プランジャとして構成され、これは、下側Pu（入口オリフィス37a、37bが配置される）および上側Pt（これを介してギャップ35にアクセスすることが可能になる）を有する。次に、このプランジャPは、例えば、（部分的に）凍結剤7の容器（管、入れ物）5に急落下／浸漬される。プランジャの下側Puが表面9の下側に動くと、凍結剤7は、入口オリフィス37ａ、37bを通り、導管31a、31bを通りマウスピース33a、33ｂに至るように（徐々に）力を受ける（図3Aから図3Cの変化参照。これらには、この動きの一部が示されている）。キャピラリ動作のある度合いでは、通常、ある量の凍結剤7が導管31a、31bに染み出すことに留意する必要がある。そのような染み出しの程度は、特に導管31a、31bの直径、凍結剤7の密度／粘度等に依存する。単純化のため、この効果は、図3A乃至3Cには示されていない。

そのような急落下的な動きのため、示された構成では、ツールTが使用され、プランジャPに下向きの力が印加される。ただし、これは必ずしも必要ではなく、代わりに、他の手段によりプランジャPを下方に押し出しても良い。図3Bおよび3Cに示すように、ツールTは、突起／ラグT’を有し、これは、プランジャPの上側Ptの逆領域／部分P’と係合する。これにより、ツールTに対する下向きの力が、プランジャPに下向きのモーメントとして伝達する。図3B、3Cの下向きの矢印T”参照。また、（必要な場合）突起T’が使用され、サンプルSは、最適な深さでギャップ35に挿入される（理想的には、マウスピース33a、33ｂの間で実質的に対称となるように挿入される）。また、これを用いて、サンプルSのギャップ35内での正確な横方向の配置が提供される（ここでも、理想的には、サンプル（のガラス膜）は、マウスピース33a、33bから等距離に配置される）。

本願で示したような構成の非限定的な例では、一例として以下の値が適用されても良い：
−サンプルSは、直径3mm、厚さ0.4mmの平坦グリッドを有する。
−マウスピース33a、33bの直径は、3〜4mmである。
−導管31a、31bの直径は、2.5mmである。
−マウスピース31a、31bの分離／ギャップ35の幅は、1mmである。
−マウスピース31a、31bからの流速は、〜5乃至15m／sである。
当業者は、所与の状況における要求に対して、これらの値を調整することができる。

従来技術に対する本発明の改善された結果は、図2Bから明らかである。図2Aの汚染ドット状特徴物は、完全に消失している。図2Bの左下および中央における管状「浮遊物」は、キーホールリンペットヘモシナニン（Hemocynanin）プロテイン複合物であり、これは、図2Aでは視認できない。図2Bのベースに沿った暗い領域は、使用した孔空き炭素膜の（2μm幅のアパチャーの）端部である。

実施例2
図4には、CPWの実施例を概略的に示す。これは、本発明により調製されたサンプルの評価に使用される。より具体的には、これは、透過型の顕微鏡Mの実施例を示す。この場合、これは、TEM／STEMである（ただし、本発明では、これは、例えば、イオン系の顕微鏡であっても良い）。図において、真空覆いV内では、電子源2（ショットキーエミッタ等）により、電子のビーム（C）が形成され、これは、光電子照明器4を通り、試料S（これは、例えば、（局部的に）薄肉化／平坦化されても良い）の選択部分に誘導／焦点化される。この照明器4は、光電子軸C’を有し、通常、各種静電／磁気レンズ、（走査）偏光器D、補正器（スティグメータ）等を有する。通常、これは、凝集システムを有しても良い（部材4全体は、しばしば、「凝集システム」と称される）。

試料Sは、試料ホルダHに保持され、これは、配置システム／ステージAにより、ある程度の自由度で配置される。例えば、試料ホルダHは、XY面内を移動するフィンガーを有しても良い（示されたデカルト座標系参照。通常、Zに平行な動き、および（少なくとも）X/Yに対して傾斜した動きが可能である）。そのような動きにより、軸C’に沿って（Z方向に）移動する電子ビームを用いて、試料Sの異なる部分を照射／結像／検査することができる（および／またはビーム走査の代わりに、走査の動きを実施することが可能となる）。冷却装置H’は、試料ホルダHと熱的に接触し、試料ホルダHを極低温に維持することができる。例えば、極低温クーラントのタンクを使用することにより、所望の低温まで温度を下げ、この温度に維持することができる。

軸C’に沿って移動する（収束）電子ビームCは、試料Sと相互作用し、試料Sから、（例えば）二次電子、後方散乱電子、X線、および光放射線（カソードルミネッセンス）を含む、各種「刺激」放射線が放出される。必要な場合、解析装置6により、これらの放射線種の1または2以上が検出され、これは、例えば、シンチレータ／光電子増倍管、またはEDX（エネルギー分散X線分光分析）モジュールと組み合わされる。この場合、画像は、基本的に、SEMと同じ原理を用いて構成される。ただし、その代わりにまたは補完的に、試料Sを通り（貫通し）、そこから放射され、軸C’に沿って（通常、実質的にある程度の偏向／散乱を介して）伝播し続ける電子を評価しても良い。そのような透過電子の流束は、（対物／投影レンズと組み合わされた）結像システム8に導入される。これは、通常、各種静電／磁気レンズ、偏向器、補正器（スティグメータ）等を有する。通常の（非走査式）TEMモードでは、この結像システム8は、蛍光スクリーン10に透過電子流束を焦点化し、必要な場合、撤収／回収され（矢印10で概略的に示されている）、軸C’から除去される。試料S（の一部の）の画像（または回折像）は、結像システム8により、スクリーン10に形成され、これは、覆いVの壁の適当な位置に配置されたビューポート12を介して視認される。スクリーン10の撤収機構は、図には示されていないが、例えば、機械的および／または電気的なものであっても良い。

スクリーン10上の画像を視認する代わりに、結像システム8から放射される電子流束の焦点の深さが、通常極めて大きい（例えば1mのオーダ）ことを利用しても良い。その結果、スクリーン10の下流に、例えば以下のような、各種他の解析機器が使用される：
−TEMカメラ14。カメラ14の位置では、電子流束は、静止画像（または回折像）を形成し、これが制御器Eで処理され、例えばフラットパネルディスプレイのような表示装置（図示されていない）に表示される。不要な場合、カメラ14は、撤収／回収され（矢印14’で概略的に示されている）、軸C’から除かれる。
−STEMイメージャ（カメラ）16。イメージャ16からの出力は、ビームCの試料S上の（X，Y）走査位置の関数として記録され、X、Yの関数として、イメージャ16からの出力の「マップ」にあたる画像が構築される。イメージャ16は、カメラ14に存在する画素のマトリクスとは対照的に、例えば、直径が20mmの単一の画素を有しても良い。また、イメージャ16は、通常、カメラ14（例えば10²画像／秒）よりも大きな取得速度（例えば10⁶点／秒）を有する。また、不要な場合、イメージャ16は、撤収／回収されても良く（矢印16’で概略的に示されている）、軸C’から除かれる（ただし、例えばドーナツ状環状暗視野イメージャ16の場合、そのような撤収は、必要ではない。そのようなイメージャでは、イメージャが使用されない場合、中央孔により、ビームは通過することができる）。
−カメラ14またはイメージャ16を使用する結像法の代替法として、例えばEELSモジュール（EELS＝電子エネルギー損失分光法）のような、分光機器18の使用が想定される。
部材14、16、18の順番／配置は、厳密なものではなく、多くの変更が可能であることに留意する必要がある。例えば、分光機器18は、結像システム8に一体化されても良い。

制御器（コンピュータプロセッサ）Eは、制御ライン（バス）E’を介して、各種示された部材に接続されることに留意する必要がある。この制御器Eは、同期動作、設定点の提供、信号処理、計算の実施、および表示装置（図示されていない）へのメッセージ／情報の表示など、各種機能を提供する。言うまでもないことであるが、必要な場合、（概略的に示されている）制御器Eは、（一部が）覆いVの内部または外部にあり、単一構造または複合構造を有しても良い。当業者には、例えば、いわゆる「環境TEM／SEM」において、覆いVの内部が厳密に真空に維持される必要はないことが理解できる。覆いV内では、意図的に所与のガスのバックグラウンド雰囲気が導入／維持される。また、当業者には、実際に、覆いVの容積を限定することが有意であることが理解できる。可能な場合、覆いVは、実質的に軸C’に沿った、小さな管の形態を取り（例えば直径が1cmのオーダ）、これを介して使用電子ビームが進行するが、ソース源2、試料ホルダH、スクリーン10、カメラ14、イメージャ16、分光機器18等のような構造が収容されるように広げられても良い。

図4に示した試料Sは、例えば、本発明によるガラス化が行われた試料であっても良い。そのような試料は、CPMMの場合（および輸送／保管される場合）、冷却装置H’により、極低温に維持される。このため、例えば、以下の実施例が使用されても良い：
−冷却装置H’は、（例えば銅ロッドおよび／またはひもを介して）熱的に強固に接続されたデュワー／フラスコを有し、これには凍結剤が充填される。
−複合構造H＋H’は、CPMMに挿入／CPMMから除去され、これにより、配置システムAの受容部によって、これが設置されクランプ留めされる。

例えば、米国特許出願第US2010／0112064A1号に示された構成、および同様の構成が参照される。

３１ａ、３１ｂ 導管
３３ａ、３３ｂ マウスピース
３５ 介在ギャップ
３７ａ、３７ｂ 入口オリフィス
Ｃ 電子ビーム
Ｃ’ 軸
Ｓ サンプル
Ｖ 覆い

Claims (8)

1. 荷電粒子顕微鏡における評価のためサンプルを調製する方法であって、
   当該方法により、前記サンプルは、凍結剤を用いて急冷され、
   当該方法は、
   −極低温流体を輸送する2つの導管を提供するステップであって、前記導管の各々は、マウスピースまで開通しており、該マウスピースは、介在ギャップを介して相互に対面するように配置される、ステップと、
   −前記サンプルを前記ギャップに設置するステップと、
   −前記導管を介して極低温流体をくみ上げ、前記マウスピースから一斉に流出させ、これにより、2つの対向する側から前記サンプルを極低温流体に急速浸漬させるステップと、
   を有する方法。
2. 前記導管は、プランジャ内に配置され、各導管は、前記プランジャの下側に入口開口を有し、前記ギャップは、前記プランジャの上側にスロットとして提供され、
   前記プランジャの下には極低温流体の浴が提供され、
   前記サンプルは、前記プランジャに下向きの圧力を印加するツールを用いて、前記スロットに挿入され、これにより、プランジャの少なくとも一部が沈み、前記浴中の極低温流体は、前記入口開口に流れ、前記マウスピースを介して放出される、請求項1に記載の方法。
3. 前記サンプルは、実質的に平坦であり、相互に対向配置された主表面を有し、
   前記サンプルは、前記主表面が前記マウスピースと対面するように、前記ギャップに配置される、請求項1または2に記載の方法。
4. 前記サンプルは、平坦グリッドを有する、請求項3に記載の方法。
5. 前記極低温流体は、−160℃から−183℃の温度範囲の液体エタンを有する、請求項1乃至4のいずれか一つに記載の方法。
6. 荷電粒子顕微鏡における評価のためのサンプルを調製するための機器であって、
   前記サンプルは、凍結剤を用いて急冷され、
   −極低温流体を輸送する一組の導管であって、各々は、マウスピースまで開通しており、該マウスピースは、前記サンプルが配置される介在ギャップを介して相互に対面するように配置される、一組の導管と、
   −前記導管を介して極低温流体をくみ上げ、前記マウスピースから一斉に流出させ、2つの対向する側から前記サンプルを極低温流体に急速浸漬させる、ポンプ機構と、
   を有する機器。
7. 前記導管は、プランジャ内に配置され、各導管は、前記プランジャの下側に入口開口を有し、前記ギャップは、前記プランジャの上側にスロットとして提供される、請求項6に記載の機器。
8. 荷電粒子顕微鏡における、請求項1乃至5のいずれか一つに記載の方法を用いて調製されたサンプルの使用であって、前記荷電粒子顕微鏡は、
   前記サンプルを保持するサンプルホルダと、
   少なくとも前記サンプルホルダにある間、前記サンプルを極低温に維持する冷却装置と、
   荷電粒子のビームを形成するソース源と、
   前記ビームが前記サンプルに照射されるように前記ビームを誘導する照明器と、
   前記照射に応じて前記サンプルから放射される放射線の流束を検出する検出器と、
   を有する、使用。

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