WO2012093474A1 - 多光源顕微鏡 - Google Patents

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WO2012093474A1
WO2012093474A1 PCT/JP2011/050044 JP2011050044W WO2012093474A1 WO 2012093474 A1 WO2012093474 A1 WO 2012093474A1 JP 2011050044 W JP2011050044 W JP 2011050044W WO 2012093474 A1 WO2012093474 A1 WO 2012093474A1
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light
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信一郎 礒部
孝昭 金丸
信一 高洲
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Isobe Shinichiro
Kanemaru Takaaki
Takasu Shin-Ichi
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    • H01J2237/2808—Cathodoluminescence

Definitions

  • the present invention relates to a multi-light source microscope having a plurality of light sources and capable of observing a sample at the same position.
  • the analysis point of a sample consisting of a biological tissue labeled with a fluorescent dye can be immediately observed with the SEM, and the object can be identified in a short time from the morphological characteristics of the analysis point. Can be expected.
  • a practical level analyzer that combines an SEM and an optical microscope, which has insufficient resolution and can be used for observation of living tissue.
  • an SEM and an optical microscope not only a combination of an SEM and an optical microscope but also a combination of an SEM and an X-ray microscope or an SEM, an optical microscope and an X-ray microscope is required.
  • the present invention provides a multi-light source microscope equipped with a plurality of observation light sources capable of performing not only electronic image observation but also fluorescence image observation and fluoroscopic image observation on the same biological tissue sample. Aimed at that.
  • a multi-light source microscope of the present invention is a multi-light source microscope capable of observing a sample at the same position, and includes an optical microscope unit for observing fluorescence with a light source unit, and a scanning electron microscope unit
  • the optical microscope has a Cassegrain mirror whose reflecting surface is an aspheric type, and the Cassegrain mirror is coaxial with the optical axis of the electron beam of the scanning electron microscope section in the barrel of the scanning microscope section. It is arrange
  • Another multi-light source microscope of the present invention is a multi-light source microscope capable of observing a sample at the same position, and is arranged so as to be movable to the optical axis position, one or more laser light sources, and X
  • a light source unit including a radiation source, an optical system that irradiates the sample with an electron beam or an electromagnetic wave from the light source unit, and a detection unit that has a fluorescent plate made of cerium-doped YAG and detects the electron beam or the electromagnetic wave transmitted through the sample It is characterized by having at least.
  • the multi-light source microscope of the present invention is configured so that the optical axes of a plurality of light sources are coaxial, and without moving a sample, fluorescence observation and electron image observation, or fluorescence observation and electron observation can be performed with a single device.
  • Image observation and fluoroscopic X-ray image observation are possible. Accordingly, it is possible to observe and analyze the sample at the same position without being affected by the positional deviation caused by storing and taking out the sample and physical and chemical changes, and the foot space is reduced.
  • an electron gun is used as a light source
  • secondary electron image observation, reflected electron image observation, transmission electron image observation, EDX observation, and STEM observation are possible.
  • observation object of the present invention is not limited to living tissue, and includes various materials such as metals, semiconductors, ceramics, and plastics as long as they are intended for conventional electron microscopes, X-ray microscopes, and optical microscopes. It is.
  • FIG. 2 is a schematic diagram illustrating an example of a configuration of a multi-light source microscope according to Embodiment 1.
  • FIG. 4 is a schematic diagram illustrating an example of a configuration of an optical microscope unit according to Embodiment 1.
  • FIG. 6 is a schematic diagram illustrating another example of the configuration of the optical microscope unit according to the first embodiment.
  • FIG. 6 is a schematic diagram illustrating another example of the configuration of the light source unit of the optical microscope unit according to the first embodiment.
  • 6 is a schematic diagram illustrating an example of a configuration of a multi-light source microscope according to Embodiment 2.
  • FIG. FIG. 10 is a schematic diagram illustrating another example of the configuration of the light source unit in the second embodiment.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of the configuration of the multi-light source microscope according to the present embodiment.
  • the multi-light source microscope includes a system control unit 1 including a host computer 1, an SEM unit 2, and an optical microscope unit 20.
  • the SEM unit 2 the electron beam generated and accelerated from the electron beam generation unit 3 is two-dimensionally scanned by the electron beam scanning unit 4 and passes through the lens barrel unit 5 disposed in the vacuum chamber 6. 9 is irradiated.
  • a reflecting mirror 13 for an optical microscope is disposed in the lens barrel 5, but the electron beam reaches the sample 10 through a passage hole (not shown) in the reflecting mirror 13.
  • Reference numeral 11 denotes a sample stage that moves the sample 10 in the XY directions, and is driven by the sample stage control unit 9. Further, secondary electrons generated by electron beam irradiation on the sample 10 are detected by the detector 7 and amplified by the amplifier 8.
  • the optical microscope unit 20 is an optical fiber that collects fluorescence from the light source unit 21 for illumination, the illumination unit 22, the observation camera 23, and the sample 9 disposed at a position away from the optical axis of the SEM unit. And a spectroscope 25 for measuring the fluorescence intensity from the optical fiber unit 24.
  • the light from the light source unit 21 of the optical microscope unit 20 is irradiated from the illumination unit 22 toward the reflection mirror 13 by an optical system (not shown) such as a lens or a half mirror.
  • the light reflected by the reflection mirror 13 reaches the Cassegrain mirror 12 disposed in the lens barrel 5 along the optical axis of the electron beam in the SEM part.
  • the Cassegrain mirror 12 is composed of one large mirror 12a having an opening at the center and disposed above, and a small mirror 12b disposed below the opening.
  • the large mirror 12a and the small mirror 12b are opposed to each other. Are arranged to be.
  • the light from the reflection mirror 13 passes through the opening of the large mirror 12a, is reflected by the small mirror 12b, and the reflected light is reflected and focused by the large mirror 12a and irradiated onto the sample 10.
  • the light from the sample 10 is reflected by the large mirror 12a, reflected by the small mirror 12b, and travels toward the reflecting mirror 13.
  • the light reflected by the reflection mirror 13 travels to the observation camera 23 and the optical fiber unit 24 by an optical system (not shown) such as a lens or a half mirror.
  • FIG. 2 is an enlarged view of the optical path of the return light, and shows an example in which the return light is introduced into the observation camera and the optical fiber section using a half mirror. That is, the light from the light source unit 21 of the optical microscope unit 20 is irradiated from the illumination unit 22 toward the reflection mirror 13 by the half mirrors 26 and 27. On the other hand, the return light from the sample is reflected by the reflection mirror 13 and travels to the observation camera 23 and the optical fiber unit 24 by the half mirrors 26 and 27.
  • the fluorescently labeled sample is observed with an optical microscope at an observation magnification of about several hundred times, and the desired sample region is further observed with an SEM at a higher magnification.
  • the SEM unit detects secondary electrons or the like obtained by scanning control of the electron beam with the host computer 1 with the detection unit 7 and converts it into an electrical signal with an IV amplifier (not shown).
  • a SEM image is acquired by conversion with an A / D converter (not shown).
  • the optical microscope section also has a fluorescence selection filter (not shown) and an observation camera (for example, a CCD camera), and the fluorescence image displayed at the target wavelength by the wavelength selection by the fluorescence selection filter is displayed on the CCD camera.
  • the sent SEM image and fluorescent image are synthesized (superposed) by the host computer 1 using image synthesis system software.
  • an aspherical Cassegrain mirror is used. That is, the Cassegrain mirror is composed of a large mirror having an opening in the center and a small mirror disposed below the opening so as to face the large mirror, and the reflecting surfaces of the large mirror and the small mirror are aspherical. Some can be used.
  • a Cassegrain mirror constituting an optical microscope is composed of one concave mirror having an opening in the center and one convex mirror smaller than the concave mirror, and the shape of the reflecting surface is a parabolic surface, an elliptical surface. It was a spherical type such as a hyperboloid.
  • the reflecting surface is a spherical type
  • the peripheral portion is distorted when the optical image is observed, so that it cannot be superimposed on the electron microscope image.
  • the aspherical Cassegrain mirror with the aspherical reflecting surfaces of the large mirror and the small mirror is used, there is no distortion around the optical image, and the superposition with the electron microscope image is performed. Is easy. As a result, the resolution can be further improved, and fluorescence observation at a high magnification becomes possible.
  • the aspheric type means that the reflecting surface is not a spherical type such as the above-mentioned paraboloid, ellipsoid or hyperboloid, specifically a flat surface.
  • the phenomenon of creating asymmetric blur with a tail like a comet that does not gather at a point) is improved, and chromatic aberration (on the axis, magnification) that is an optical problem (glass used in the optical system is
  • the refractive index varies depending on each wavelength, which results in different focal lengths for each wavelength, and the phenomenon that the image formation position shifts is improved. Fluorescence image observed with an optical microscope within the field of view It does not occur.
  • the amount of the return light reflected and returned from the sample is in the range of 60 to 90% with respect to the irradiation light amount of the light source. More preferably, it is 70 to 90%, and still more preferably 70%.
  • the amount of return light reflected back from the sample is improved, and observation can be performed with an observation camera without using an expensive high-sensitivity observation camera.
  • the observation camera can be replaced with monoculars or binoculars and can be observed visually.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing a structure of an optical microscope unit having an optical path switching mechanism.
  • the half mirror 28 serves to irradiate the light from the light source unit 21 of the optical microscope unit 20 toward the illumination unit 22 reflection mirror 13 and to pass return light from the sample to the observation camera 23 side.
  • 29 is a switching mirror which is an optical path switching mechanism.
  • a half mirror 27 is provided instead of the switching mirror 29. The switching mirror 29 switches the optical path of the return light from the sample to either the observation camera 23 side or the optical fiber unit 24 side.
  • the switching mirror 29 is arranged in parallel to the optical path of the return light so as not to block the optical path of the return light.
  • it is arranged so as to block the optical path of the return light, and the return light is reflected and introduced into the optical fiber unit 24. At this time, it is preferable that 95% or more of the return light is reflected.
  • the switching mirror 29 by switching the switching mirror 29 and arranging it so as to block the optical path, a part of the return light from the sample passes through the observation camera 23 side, so that the light irradiated from the illumination unit 21 is the purpose of the sample. It can be confirmed whether the measurement position is irradiated. Further, the return light reflected by the switching mirror 29 is guided to the spectroscope 25 through the optical fiber unit 24, whereby fluorescence spectrum analysis, Raman light measurement, and cathodoluminescence light measurement can be performed at the measurement position of the sample. . In the case where there is no optical path switching mechanism as shown in FIG. 1, it is difficult to perform fluorescence spectrum analysis, Raman light measurement, and cathodoluminescence light measurement.
  • Monochromatic light such as laser light, white light, and combinations thereof can be used for the light source of the optical microscope unit.
  • Koehler illumination or spot illumination is possible for an illumination part.
  • a fluorescence microscope can be configured by using a laser light source as a light source and using Koehler illumination as an illumination unit.
  • a laser light source is used as the light source
  • spot illumination is used as the illumination unit
  • the sample stage is scanned in the XY direction
  • the return light is I / V converted by the detector
  • synchronized with the scanning signal of the sample stage as an XY map By displaying, a scanning laser microscope can be configured, and further, a confocal scanning laser microscope can be formed by adjusting the position of the detector.
  • a laser light source may be used as a light source
  • spot illumination may be used as an illumination unit
  • return light may be guided to a spectroscope so that fluorescence measurement and Raman measurement can be performed.
  • a laser light source is used as the light source
  • spot illumination is used as the illumination unit
  • the sample stage is scanned in the X and Y directions
  • the return light is guided to the spectrometer
  • the sample stage is scanned while performing spectroscopic analysis for each scanning position.
  • a plurality of single-color light sources (for example, laser light sources) are arranged in the light source unit 21, and each of the fluorescent dyes emits light at each excitation wavelength while switching the single-color light source.
  • a plurality of fluorescent images can be synthesized by image processing to observe the fluorescent image of the sample.
  • FIG. 4 is a schematic diagram illustrating an example of the light source unit 21 having a plurality of monochromatic light sources.
  • the light source unit 21 is a light combining unit that combines a plurality of single color light sources 31-1, 31-2, 31-3,..., 31-n (n is an integer of 2 or more) and light from the plurality of single color light sources.
  • a photosynthesis module 32 is provided.
  • the sample light labeled with a plurality of fluorescent reagents can be irradiated with synthesized light of monochromatic light at a time, the measurement procedure can be simplified as compared with the method of switching the monochromatic light source.
  • it is not necessary to perform image synthesis of a plurality of fluorescent images it is not necessary to align the plurality of fluorescent images associated with image synthesis.
  • the photosynthesis module can irradiate light of a color close to white light by simultaneously irradiating monochromatic light of red, blue, and green, and irradiates the sample with light as white illumination in a form different from that of a white laser.
  • a sample can be observed as a stereoscopic optical microscope.
  • a projection image is formed from a one-dimensional light modulation element in which a plurality of elements that respectively modulate red, blue, and green light are arranged in one direction, a combining mirror that combines the modulated light, and the modulated light. What comprises a projection optical system etc. can be used.
  • the preparation method of the observation sample used in the present embodiment is not particularly limited, and any preparation method conventionally used for microscope observation can be used. For example, an embedding method using a thin section of a specimen And freezing method. In addition, a method of fixing the specimen piece itself on the support base material for entity observation is also included. In addition, it is preferable to use the fluorescent dye described in (International Publication No. 2008/013260 pamphlet) as the fluorescent dye. By using the fluorescent dye (oxadiazolopyridine derivative) described in the international publication pamphlet, it is possible to provide a permanent specimen in which the fluorescence from the fluorescent dye does not disappear even when stored for a period of time.
  • a biological specimen using a conventional fluorescent dye fades in about one week, whereas a biological specimen using the fluorescent dye can be stored semipermanently as long as it can be stored refrigerated. Moreover, it is cheaper than conventional fluorescent dyes. In addition, since a biological specimen that is substantially in a dry state gives high fluorescence intensity, a more reliable pathological diagnosis is possible.
  • sample preparation method in the case of performing bulk observation and etching slice observation is shown.
  • the following reagents can be commonly used for sample preparation.
  • the fluorescent dye for immunostaining and lectin staining the fluorescent dye described in the above international pamphlet or the Alexa system having high electron beam resistance can be used.
  • Acetone was used as the dehydrating agent, and the ascending system dehydration method was used (50-75-85-95-100% ⁇ 2 (each 7 minutes)).
  • ⁇ A Perfusion fixation> 1
  • a phosphate buffer solution of 2.8% paraformaldehyde + 0.2% picric acid + 0.06% glutaraldehyde is used as a fixing solution.
  • 4% paraformaldehyde phosphate buffer is used for post-fixation.
  • DMSO method Freezing cleaving (DMSO method)> 2) After post-fixation with 4% paraformaldehyde, thoroughly wash with PBS, replace the sample with 30% DMSO ⁇ 50% DMSO, and cleave the sample sealed in 50% DMSO using a freeze crusher (liquid nitrogen) ⁇ Wash.
  • ⁇ C Fluorescent label> 3
  • ⁇ D Sample treatment-1> 4
  • the fluorescently labeled sample is transferred to an acetone dehydration system and then replaced with ascending system Tert-butyl alcohol (50-100% ⁇ 2 (each 5 minutes)). Dry with a freeze dryer (RD-1 manufactured by Eiko) to make a bulk sample.
  • RD-1 Refrigerated system
  • ⁇ E Coating> 5
  • osmium is coated to a thickness of about 2 nm using an osmium coater (ID-2 manufactured by Vacuum Device Inc.).
  • sample preparation for etching observation Except for using the following method for sample processing, it can be performed in the same manner as the sample preparation method for bulk observation.
  • ⁇ D Sample treatment-2> 5
  • a slice of about 5 ⁇ m thickness is prepared using a diamond knife for light microscopy and an ultramicrotome. In order to ensure the fluorescence luminance, the thickness of the slice can be set to 10 ⁇ m.
  • a wafer Si substrate divided into about 8 mm square is used, and the sample is placed thereon.
  • the Cassegrain mirror of the optical microscope is arranged in the SEM column so as to be coaxial with the optical axis of the electron beam of the SEM system, so that one sample can be moved without moving the sample. Fluorescence observation and SEM observation are possible with this device. Accordingly, it is possible to observe and analyze the sample at the same position without being affected by the positional deviation caused by storing and taking out the sample and physical and chemical changes, and the foot space is reduced.
  • the reflection surface of the Cassegrain mirror constituting the optical microscope is a spherical type, and when the optical image is observed, the peripheral portion is distorted and cannot be superimposed on the electron microscope image.
  • the present invention uses a Cassegrain mirror having an aspherical reflecting surface, so that there is no distortion around the optical image, it is easy to superimpose with an electron microscope image, and the resolution can be improved. it can. As a result, the fluorescently labeled site in the sample can be immediately enlarged and observed at a high magnification. Thereby, identification confirmation of a labeled part can be performed rapidly.
  • FIG. FIG. 5 is a schematic diagram showing an example of the configuration of the multi-light source microscope according to the present embodiment.
  • the multi-light source microscope includes a system control unit 51 including a host computer, a spectroscope 52, and a microscope unit 50.
  • the microscope unit 50 is disposed in a light source unit 53 having a plurality of light sources 54, 55, and 56 and a light source holding unit 57 that holds the light sources so as to be movable to the optical axis position.
  • An optical system 60 comprising a plurality of electromagnetic lenses 60a for accelerating an electron beam and irradiating the sample, a sample cylinder 69 that holds the sample 68, is movable in the XY directions and is rotatable, and detection for detecting transmitted electrons of the sample Part 70 and an observation part 64 arranged outside the lens barrel 58.
  • the detection unit 70 includes a fluorescent plate 71 to which electrons transmitted through the sample 68 arrive, a fiber taper 72 to which the fluorescent plate 71 is attached, a lens unit 74, a CCD / CMOS detector 75, a fiber taper 72, and a lens unit 74. And a filter 73 attached between the two.
  • the observation unit 64 is composed of a trinocular tube 66 to which an external CCD camera 65 and a fluorescence selection filter 67 are attached.
  • Reference numeral 59 denotes a partition plate, which is used to block the lens barrel and the light source unit. That is, when switching the light source in the light source unit, if not only the light source unit but also the entire lens barrel in a vacuum state leaks, it takes time to return to the vacuum state again. Therefore, the light source unit and the lens barrel are shut off by the gate valve, and the leak time and re-evacuation time of the light source unit are shortened.
  • Reference numeral 61 denotes a backscattered electron detector that detects backscattered electrons from the sample.
  • Reference numeral 62 denotes a secondary electron detector that detects secondary electrons from the sample.
  • Reference numeral 63 denotes an energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) detector.
  • Reference numeral 76 denotes a movable small reflection fluorescent plate that guides transmitted electrons from the sample 68 to the observation unit 64.
  • the light source of the light source unit 53 three types of light sources, that is, an electron gun 54, a laser light source 55, and an X-ray source 56 can be used. In the multi-light source microscope according to the present embodiment, these three types of light sources are switched appropriately for use.
  • an electron gun By using an electron gun as a light source, it can be used as an electron microscope. That is, the electron beam irradiated from the electron gun in the light source unit 53 passes through the gate valve 59, is accelerated by the optical system 60 in the lens barrel 58, and is irradiated on the sample 68 fixed to the sample cylinder 69. The reflected electrons from the sample 68 are detected by the reflected electron detector 61. The electrons that have passed through the sample 68 pass through the fluorescent plate 71, the fiber taper 72, and the lens unit 74, are detected by the CCD / CMOS detector 75, are imaged and displayed on the monitor of the system control unit 51. That is, it can be used as a transmission electron microscope.
  • observation magnification can be changed by operating the lens unit 74. Further, by moving the movable small reflection fluorescence 76 on the optical path, the transmitted electron image from the sample 68 can be visually observed with the trinocular tube 66. Further, elemental analysis can be performed by detecting the X-rays generated from the sample using the EDX detector 63.
  • the sample tube 69 is scanned in the X and Y directions and rotated ( ⁇ direction), and the secondary electrons from the sample 68 are detected by using the secondary electron detector 62, so that it can be used as a scanning electron microscope. Can do. Further, by using the CCD / CMOS detector 75, an STEM image (scanning transmission electron microscope image) can be observed. In addition, by using the EDX detector 63, it is possible to observe a two-dimensional element map image in the XY directions.
  • cathodoluminescence measurement can be performed by guiding light emitted from the sample 68 to the spectroscope 52 via the trinocular tube 66 by an optical fiber or the like. Then, the two-dimensional cathodoluminescence map image can be observed by scanning the sample cylinder 69 in the XY directions.
  • laser microscope By using a laser light source as the light source, it can be used as a laser microscope (optical microscope). However, since an optical system is not incorporated in the electron microscope column, the laser is irradiated only to a certain area as Koehler illumination.
  • the laser light emitted from the laser light source in the light source unit 53 passes through the gate valve 59, passes through the optical system 60 in the lens barrel 58, and is applied to the sample 68 fixed in the sample cylinder 69.
  • the movable small reflection fluorescent plate 76 By moving the movable small reflection fluorescent plate 76 on the optical path, the light from the sample 68 can be visually observed with the trinocular tube 66. That is, it can be used as an optical microscope.
  • a fluorescence selection filter 67 mounted on the trinocular tube 66 is inserted on the optical axis, so that the laser light (excitation light) is cut and a fluorescent image is obtained. It becomes possible to observe. Further, the Raman measurement can be performed by guiding the light from the sample to the spectroscope 52 via the trinocular tube 66 with an optical fiber or the like. Further, a 3D optical image or a 3D fluorescent image can be observed by scanning the sample tube 69 in the X and Y directions and rotating and scanning (the ⁇ direction).
  • the CCD / CMOS detector 75 when photographing with transmitted light, the CCD / CMOS detector 75 is used, but the sensitivity of the fluorescent agent may be lowered due to sample preparation. Then, when photographing with only the detector 75, there is a possibility that exposure for a long time may be forced, and brightness can be secured by using the fluorescent plate 71 as means for assisting the exposure. Further, the taper 72 can secure a wide field of view and guide the image to the detector 75.
  • a white laser can be used as the laser light source.
  • a plurality of laser light sources having different wavelengths can be switched and used as necessary.
  • X-ray microscope By using an X-ray source as a light source, it can be used as an X-ray microscope. That is, the X-rays irradiated from the X-ray source in the light source unit 53 pass through the gate valve 59 and are accelerated by the optical system 60 in the lens barrel 58 and are irradiated on the sample 68 fixed to the sample tube 69. The X-ray that has passed through the sample 68 passes through the fluorescent plate 71, the fiber taper 72, and the lens unit 74, is detected by the CCD / CMOS detector 75, and is displayed as an image on the monitor of the system control unit 51. That is, it can be used as an X-ray electron microscope.
  • the observation magnification can be changed by operating the lens unit 74.
  • the transmitted X-ray image from the sample 68 can be visually observed with the trinocular tube 66 by moving the movable small reflection fluorescence 76 on the optical path.
  • a 3D fluoroscopic X-ray image can be observed by scanning the sample tube 69 in the X and Y directions and rotating and scanning (the ⁇ direction).
  • a X-ray source although a well-known X-ray source can be used, it is preferable to use what was chipped.
  • the fluorescent plate used in this embodiment absorbs the energy of an electron beam or electromagnetic wave that has passed through a sample and generates fluorescence.
  • An enlarged image of the sample transmission part is formed on the fluorescent plate, and the enlarged image is taken by a CCD / CMOS detector.
  • a fluorescent plate made of a P22 powder phosphor has been used for an electron microscope, and a fluorescent plate such as zinc sulfide containing a small amount of silver has been used for an X-ray microscope.
  • the detection wavelength range of fluorescent plates for electron microscopes is 0.0037 nm to 0.0025 nm, whereas the detection wavelength range of fluorescent plates for X-ray microscopes is 0.07 nm to 0.15 nm. There wasn't.
  • cerium-doped YAG is used for the fluorescent plate. Since this cerium-doped YAG has a detection wavelength range of 0.002 to 700 nm, it is possible to perform electron microscope observation and X-ray microscope observation with one kind of fluorescent plate.
  • cerium-doped YAG for example, a single crystal produced by a method described in the following document is used.
  • YAG (Ce) poly-crystal scintillator with APD Takayuki Yanagida, Hiromitsu Takahashi, Daisuke Kasama, Takeshi Ito, Hisako Niko, Motohide Kokubun, Kazuo Makishima, Takagimi Yanagitani, Hideki Yagi, Takashi Shigeta, and Takashi Ito Proceedings of Scintillating Crystals and their Applications at KEK, p111-116.
  • a single crystal ingot can be produced by the Czochralski method (Cz method) or the floating zone method (FZ method).
  • the doping amount of cerium is 0.005 to 0.5 mol%.
  • the case of a transmission electron microscope image and a laser microscope image is as follows. Transmitted electrons from the sample are detected by the detection unit 70, photoelectrically converted, and A / D converted by the system control unit 51 to obtain a transmission electron microscope image. Further, the laser microscope has a fluorescence selection filter 67 and an external CCD camera 65. The fluorescence image displayed at the target wavelength is detected by the CCD camera by the wavelength selection by the fluorescence selection filter, and the system control unit 1 is detected. Send as a digital signal. The transmitted transmission electron microscope image and fluorescent image are synthesized (superposed) by the system control unit 1 using image synthesis system software.
  • a transmission electron microscope image and an X-ray microscope image it is as follows. Transmitted electrons from the sample are detected by the detection unit 70, photoelectrically converted, and A / D converted by the system control unit 51 to obtain a transmission electron microscope image. Further, transmitted X-rays from the sample are detected and photoelectrically converted by the detection unit 70 and A / D converted by the system control unit 51 to obtain a transmission X-ray microscope image. The transmitted transmission electron microscope image and transmission X-ray microscope image are synthesized (superposed) by the system control unit 1 using image synthesis system software.
  • the transmission electron microscope image, the laser microscope image, and the X-ray microscope image are superimposed, the transmitted transmission electron microscope image, the fluorescence image, and the transmission X-ray microscope image are imaged by the system control unit 1. Synthesis (superposition) is executed using the synthesis system software.
  • a laser light source unit including a plurality of laser light sources having different wavelengths is provided instead of the laser light source 55, and the plurality of laser light sources are switched and used as necessary.
  • Each fluorescent dye is caused to emit light at each excitation wavelength to obtain a plurality of fluorescent images, and then a plurality of fluorescent images can be synthesized by image processing to observe a fluorescent image of the sample.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing a configuration of a laser light source unit used in place of the laser light source 55 of FIG.
  • the laser light source unit 80 includes a plurality of laser light sources 81-1, 81-2, 81-3,...
  • the photosynthesis module 82 is provided.
  • cerium-doped YAG is used for the fluorescent plate of the detection unit, electron microscope observation, X-ray microscope observation, and laser microscope observation can be performed with one apparatus without moving the sample. It is. Accordingly, it is possible to observe and analyze the sample at the same position without being affected by the positional deviation caused by storing and taking out the sample and physical and chemical changes, and the foot space is reduced. Thereby, identification confirmation of a labeled part can be performed rapidly.
  • Example 1 Immunostaining was performed on astrocytes, which are rat nerve tissue, by the following procedure. 1) The solution was fixed under reflux with 0.1M PB (Phosphate Buffer) containing 4% paraformaldehyde, and then fixed by immersion (3 hours). 2) Washed with 0.1M PB containing 20% sucrose (4 ° C., overnight). 3) a. Cutting with a razor, b. Freezing cleaving for SEM, c. Nerve (spinal cord) tissue was divided into small samples by a technique suitable for each application, such as preparation of 10 ⁇ m frozen sections. A sample was prepared using the method c in FIG. 7A and the method a in FIG. 7B.
  • PB Phosphate Buffer
  • PBSTBF Phosphate Buffered Salts
  • FIG. 7A shows a fluorescence microscope image containing astrocytes of rat neural tissue
  • FIG. 7B shows a fluorescence SEM image of rat spinal cord astrocytes obtained using the multi-light source microscope of the present invention.
  • Example 2 Immunostaining was performed on rat kidneys (tubules) according to the following procedure. 1) 2.8% paraformaldehyde-0.2% picric acid-0.06% glutaraldehyde-reflux fixed with 0.1M PB, postfixed with 4% paraformaldehyde in PB, and stored at 4 ° C did. 2) A 1 mm sample was prepared with a vibratome and washed with PBS (0.01 M) (4 ° C., 1 day). 3) Biotinylated Peant Agglutinin (PNA) (Vector) was incubated in PBS (4 ° C., 4 days) (1: 100).
  • PNA Biotinylated Peant Agglutinin
  • FIG. 8A shows an SEM image
  • FIG. 8B shows a fluorescent image
  • FIG. 8C shows a fluorescent SEM image obtained using the multi-light source microscope of the present invention
  • FIG. 8D shows a partially enlarged image of FIG. From the fluorescence SEM image, it was confirmed that the brush border of the tubular section was selectively stained. Moreover, the villi on the inner wall of the tubule, which could not be observed with a fluorescence microscope, could be observed in detail.
  • Example 3 (Sample preparation) 1) 2.8% paraformaldehyde-0.2% picric acid-0.06% glutaraldehyde-reflux fixed with 0.1M PB, postfixed with 4% paraformaldehyde PB and stored at 4 ° C . 2) A 1 mm sample was prepared with a vibratome and washed with PBS (0.01 M) (4 ° C., 1 day). 3) Biotinylated Peant Agglutinin (PNA) (Vector) was incubated in PBS (4 ° C., 4 days) (1: 100).
  • PNA Biotinylated Peant Agglutinin
  • FIG. 9A shows an SEM image
  • FIG. 9B shows a fluorescent image
  • FIG. 9C shows a fluorescent SEM image obtained using the multi-light source microscope of the present invention.
  • the sample is a rat lymph node containing macrophages. Macrophages (phagocytic cells) in lymph node tissue are considered to have autofluorescence because they take in various waste products in the living body.
  • FIG. 9B shows the result of fluorescence observation of the lymph nodes with this apparatus without staining, and the presence of macrophages could be identified in agreement with this yellow fluorescent part.
  • FIG. 9C By superimposing with the SEM image (FIG. 9C), macrophage cells were distinguished from other cells and could be observed with SEM.
  • Example 4 The rat eyeball was immunostained by the following procedure. 1) After enucleation, the specimen was immersed in 1% PFA for 10 minutes, and then the retina was removed. 2) Immerse in 4% PFA for 1 hour. 3) PBS washing (10 minutes x 3 times) 4) Degreasing-acetone dipping (5 minutes) 5) PBS washing (10 minutes x 3 times) 6) Blocking (Nacalai Tesque's Blocking One) (60 minutes) 7) As a primary antibody of CNV (choroidal neovascularization), rat anti-CD31 antibody (BD pharmamigen) diluted 10-fold was incubated (4 ° C., 3 days).
  • CNV choroidal neovascularization
  • rat anti-CD31 antibody BD pharmamigen
  • Example 1 The multi-light source microscope used in Example 1 was used for microscopic observation.
  • 10A shows an SEM image
  • FIG. 10B shows a fluorescent image
  • FIG. 10C shows a fluorescent SEM image obtained using the multi-light source microscope of the present invention.
  • Macrophages are thought to release vascular endothelial growth factor that grows CNV.
  • a multi-light source microscope it was possible to observe stereoscopically that macrophages exist in the inflammatory cell tissue in and around CNV and that CNV is distributed in a range affected by surrounding macrophages. Images suggesting the possibility that macrophages located at the tip of the retina and present in the immediate vicinity of CNV are promoting CNV formation were obtained.

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Abstract

　同一の生体組織試料について、電子像観察だけでなく、蛍光像観察、および透視像観察等を行うことも可能な、複数の観察用光源を備えた多光源顕微鏡を提供する。　本発明の多光源顕微鏡は、光源部を備え蛍光を観察するための光学顕微鏡部と、走査型電子顕微鏡部とからなり、該光学顕微鏡は反射面が非球面型であるカセグレン鏡を有し、該カセグレン鏡が該走査型顕微鏡部の鏡筒内に該走査型電子顕微鏡部の電子ビームの光軸と同軸となるように配置されている。

Description

多光源顕微鏡
　本発明は、複数の光源を有し、試料を同一位置で観察可能な多光源顕微鏡に関する。
　疾病診断方法の開発等の医療バイオ分野では、生体組織を蛍光色素で免疫染色を行った後、蛍光顕微鏡を用いて観察している。しかし、この方法では１０００倍程度の解像度が限界である。それに対し、蛍光色素で標識された生体組織からなる試料の分析点を高倍率で観察する方法として、走査型電子顕微鏡（以下、ＳＥＭという。）の電子線を試料に照射して蛍光を発生させ（カソードルミネッセンス）、その蛍光を観察する方法が提案されている（例えば、特許文献１）。また、半導体ウェハ等の分析に関するものではあるが、荷電粒子による試料励起と光による試料励起を一つの装置で行うようＳＥＭと光学顕微鏡とを組み合わせて、試料の分析点のＸ線分光スペクトルと蛍光スペクトルとを測定する表面分析装置も提案されている（例えば、特許文献２）。
特開平１１－２６０３０３号公報 特開平５－１１３４１８号公報
　ＳＥＭと光学顕微鏡とを組み合わせることにより、蛍光色素で標識された生体組織からなる試料の分析点を即座にＳＥＭで観察することにより、その分析点の形態的特徴から対象物を短時間で同定できることが期待できる。しかしながら、分解能が不十分であり、生体組織の観察に使用可能な、ＳＥＭと光学顕微鏡とを組み合わせた実用レベルの分析装置は報告されていない。
　また、ＳＥＭと光学顕微鏡との組み合わせだけでなく、ＳＥＭとＸ線顕微鏡、あるいはＳＥＭと光学顕微鏡とＸ線顕微鏡との組み合わせも必要とされている。
　そこで、本発明は、同一の生体組織試料について、電子像観察だけでなく、蛍光像観察、そして透視像観察等を行うことも可能な、複数の観察用光源を備えた多光源顕微鏡を提供することを目的とした。
　上記課題を解決するため、本発明の多光源顕微鏡は、試料を同一位置で観察可能な多光源顕微鏡であって、光源部を備え蛍光を観察するための光学顕微鏡部と、走査型電子顕微鏡部とからなり、該光学顕微鏡は反射面が非球面型であるカセグレン鏡を有し、該カセグレン鏡が該走査型顕微鏡部の鏡筒内に該走査型電子顕微鏡部の電子ビームの光軸と同軸となるように配置されていることを特徴とする。
　また、本発明の別の多光源顕微鏡は、試料を同一位置で観察可能な多光源顕微鏡であって、光軸位置に移動可能に配置された、電子銃と、１以上のレーザ光源と、Ｘ線源とを備えた光源部と、該光源部からの電子線又は電磁波を試料に照射する光学系と、セリウムドープＹＡＧからなる蛍光板を有し試料を透過した電子線又は電磁波を検出する検出部を少なくとも有することを特徴とするものである。
　本発明の多光源顕微鏡は、複数の光源の光軸が同軸となるように構成されており、試料を移動させることなく、１台の装置で、蛍光観察と電子像観察、あるいは蛍光観察と電子像観察と透視Ｘ線像観察が可能である。それにより、試料の収納、取り出しによる位置ズレ並びに物理的、化学的変化の影響を受けることなく、同一位置で試料の観察並びに分析が可能であり、フットスペースも軽減される。本発明によれば、光源に電子銃を用いた場合、二次電子像観察、反射電子像観察、透過電子像観察、ＥＤＸ観察、そしてＳＴＥＭ観察が可能であり、光源にレーザを用いた場合、ケーラー照明による像観察やケーラー照明による蛍光像観察、光源にＸ線を用いた場合、透視Ｘ線像観察や３Ｄ透視Ｘ線像観察、そして電子線照射によるカソードルミネッセンス観察や、レーザ照射によるラマン／蛍光測定等が可能である。なお、本発明の観察対象は生体組織に限定されず、従来の電子顕微鏡、Ｘ線顕微鏡、そして光学顕微鏡が対象とするものであれば、金属、半導体、セラミックス、プラスチック等の種々の材料も含まれる。
実施の形態１に係る多光源顕微鏡の構成の一例を示す模式図である。 実施の形態１における光学顕微鏡部の構成の一例を示す模式図である。 実施の形態１における光学顕微鏡部の構成の別の例を示す模式図である。 実施の形態１における光学顕微鏡部の光源部の構成の別の例を示す模式図である。 実施の形態２に係る多光源顕微鏡の構成の一例を示す模式図である。 実施の形態２における光源部の構成の別の例を示す模式図である。 実施例１におけるラット神経組織のアストロサイトを含む顕微鏡写真であり、蛍光画像を示す。 実施例１におけるラット脊髄の顕微鏡写真であり、アストロサイトの蛍光ＳＥＭ画像を示す。 実施例２におけるラットの腎(尿細管)の顕微鏡写真であり、（ａ）はＳＥＭ画像、（ｂ）は蛍光画像、（ｃ）は蛍光ＳＥＭ画像、（ｄ）は（ａ）の部分拡大画像である。 実施例３におけるマクロファージを含むリンパ節組織の顕微鏡写真であり、ＳＥＭ画像を示す。 実施例３におけるマクロファージを含むリンパ節組織の顕微鏡写真であり、蛍光画像を示す。 実施例３におけるマクロファージを含むリンパ節組織の顕微鏡写真であり、蛍光ＳＥＭ画像を示す。 実施例４における新生血管とマクロファージを標識したマウス眼底の顕微鏡写真であり、（ａ）はＳＥＭ画像、（ｂ）は蛍光画像、（ｃ）は蛍光ＳＥＭ画像である。
　１　システム制御部
　２　ＳＥＭ部
　３　電子線発生部
　４　電子線走査部
　５　真空チャンバ
　６　鏡筒
　７　検出器
　８　増幅器
　９　試料ステージ制御部
　１０　試料
　１１　試料ステージ
　１２　カセグレン鏡
　１２ａ　大鏡
　１２ｂ　小鏡
　１３　反射ミラー
　２０　光学顕微鏡部
　２１，３０　光源部
　２２　照明部
　２３　観察カメラ
　２４　光ファイバー部
　２５　分光器
　２６，２７，２８　ハーフミラー
　２９　切換ミラー
　３１－１、…、３１－ｎ　単色光源
　３２　光合成モジュール
　５０　顕微鏡部
　５１　システム制御部
　５２　分光器
　５３　光源部
　５４，５５，５６　光源
　５７　光源保持手段
　５８　鏡筒
　５９　仕切板
　６０　光学系
　６０ａ　電磁レンズ
　６１　反射電子検出器
　６２　二次電子検出器
　６３　ＥＤＸ検出器
　６４　観察部
　６５　外部ＣＣＤカメラ
　６６　三眼鏡筒
　６７　蛍光選択フィルター
　６８　試料
　６９　試料筒
　７０　検出部
　７１　蛍光板
　７２　ファイバーテーパー
　７３　フィルター
　７４　レンズユニット
　７５　ＣＣＤ／ＣＭＯＳ検出器
　７６　可動型小反射蛍光板
　８０　レーザ光源部
　８１－１、…、８１－ｎ　レーザ光源
　８２　光合成モジュール
　以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。
実施の形態１．
　図１は、本実施の形態に係る多光源顕微鏡の構成の一例を示す模式図である。
　多光源顕微鏡は、ホストコンピュータ１からなるシステム制御部１と、ＳＥＭ部２と、光学顕微鏡部２０とから構成されている。ＳＥＭ部２においては、電子線発生部３から発生し加速された電子線が、電子線走査部４により２次元的に走査され、真空チャンバ６内に配置された鏡筒部５を通って試料９に照射される。なお、鏡筒内５には、光学顕微鏡用の反射ミラー１３が配置されているが、電子線は反射ミラー１３内の通過孔（不図示）を通って試料１０に至る。また、１１は試料１０をＸＹ方向に移動させる試料ステージであり、試料ステージ制御部９により駆動される。また、試料１０への電子線照射により発生する二次電子は検出器７により検出され、増幅器８により増幅される。
　一方、光学顕微鏡部２０は、ＳＥＭ部の光軸から離れた位置に配置された、照明用の光源部２１と、照明部２２と、観察カメラ２３と、試料９からの蛍光を集光する光ファイバー部２４と、その光ファイバー部２４からの蛍光強度を測定する分光器２５とを有している。
　例えば、試料１０の光学像を観察する場合、光学顕微鏡部２０の光源部２１の光を、照明部２２からレンズやハーフミラー等の光学系（不図示）により反射ミラー１３に向けて照射する。反射ミラー１３で反射された光は、ＳＥＭ部に電子線の光軸に沿って、鏡筒内５に配置されたカセグレン鏡１２に至る。カセグレン鏡１２は、中央に開口を有し上方に配置された１個の大鏡１２ａと、その開口の下方に配置された小鏡１２ｂとからなり、その大鏡１２ａと小鏡１２ｂとが対向するように配置されている。反射ミラー１３からの光は、大鏡１２ａの開口を通過し、小鏡１２ｂによって反射され、その反射光は大鏡１２ａによって反射集束されて試料１０に照射される。
　そして、試料１０からの光は、大鏡１２ａによって反射され、小鏡１２ｂによって反射され、反射ミラー１３へ向かう。反射ミラー１３で反射された光は、レンズやハーフミラー等の光学系（不図示）によって観察カメラ２３と光ファイバー部２４へと向かう。
　図２は、戻り光の光路を拡大した図であり、ハーフミラーを用いて観察カメラと光ファイバー部に戻り光を導入する例を示している。すなわち、光学顕微鏡部２０の光源部２１の光は、照明部２２からハーフミラー２６，２７により反射ミラー１３に向けて照射される。一方、試料からの戻り光は反射ミラー１３で反射され、ハーフミラー２６，２７によって観察カメラ２３と光ファイバー部２４へと向かう。
　蛍光標識された試料について光学顕微鏡で数百倍程度の観察倍率で観察を行い、さらに所望の試料領域についてＳＥＭを用いてさらに高倍率の観察を行う。
　ここで、ＳＥＭ部は、ホストコンピュータ１で電子線を走査制御して得られた二次電子等を検出部７で検出してＩ－Ｖアンプ（不図示）にて電気信号に変え、ホストコンピュータ１のＡ・Ｄコンバータ（不図示）で変換してＳＥＭ画像を取得する。また、光学顕微鏡部は、蛍光選択フィルタ（不図示）と観察用カメラ（例えば、ＣＣＤカメラ）を有しており、蛍光選択フィルタでの波長選択により目的の波長で表示された蛍光画像をＣＣＤカメラで検出し、ホストコンピュータ１へデジタル信号として送る。送られたＳＥＭ画像と蛍光画像は、ホストコンピュータ１により、画像合成システムソフトウェアを用いて合成（重ね合わせ）が実行される。
　本実施の形態では、非球面型のカセグレン鏡を用いている。すなわち、カセグレン鏡が、中央に開口を有する大鏡と、該開口の下方に該大鏡に対向するように配置された小鏡とからなり、大鏡と小鏡の反射面が非球面型であるものを用いることができる。従来、光学顕微鏡を構成するカセグレン鏡は、中央に開口を有する１個の凹面鏡と、その凹面鏡よりは小さい１個の凸面鏡とから構成されており、その反射面の形状が放物面、楕円面、双曲面等の球面型であった。しかしながら、反射面が球面型であると、光学像を観察した際に周辺部が歪むため、電子顕微鏡像と重ね合わせることはできない。これに対し本実施の形態では、大鏡と小鏡の反射面が非球面である非球面型のカセグレン鏡を用いているので、光学像の周囲に歪みがなく、電子顕微鏡像との重ね合わせが容易である。これにより分解能をさらに向上させることができるので、高倍率での蛍光観察が可能となる。ここで、非球面型とは、反射面が上記の放物面、楕円面、双曲面等の球面型でないもの、具体的には平坦面を意味する。効果についてさらに詳しく説明すると、カセグレン鏡を非球面化することで、ザイデル収差の一つ歪曲収差(物体平面上の形状と像面での形状が相似形とはならない現象)が改善され、球面収差(軸上光線で開口数Ｎ．Ａ．の差によって結像位置が異なる現象)、コマ収差(球面収差が十分小さく補正されていても、軸外物点から出た光線は像面上の1点に集まらず、彗星のように尾を引いた非対称なボケを作る現象)等も同時に改善され、尚且つ、光学的な問題(軸上、倍率)である色収差(光学系に使用するガラスは、各波長により屈折率が異なる特性を有している。それにより各波長毎で焦点距離が異なることとなり、結像位置のズレが発生する現象)も改善され、電子顕微鏡像と重ね合わせても光学顕微鏡で観察している蛍光像の視野範囲内でのズレが生じなくなる。
　また、本実施の形態においては、試料から反射して戻って来た戻り光の光量が光源の照射光量に対し６０～９０％の範囲にあることが好ましい。より好ましくは、７０～９０％、さらに好ましくは７０％である。戻り光の光量低下を抑制することにより、試料から反射して戻って来た戻り光の光量が向上し、高価な高感度観察カメラを使用すること無く、観察カメラで観察できる。また、観察カメラを単眼鏡または双眼鏡に置き換えて目視でも観察可能となる。
　また、本実施の形態においては、光学顕微鏡部に、試料からの戻り光の光路を観察カメラ側または光ファイバー部側のいずれか一方に切り換える光路切換機構を設けることもできる。図３は、光路切換機構を有する光学顕微鏡部の構造を示す模式図である。ハーフミラー２８は、光学顕微鏡部２０の光源部２１の光を、照明部２２反射ミラー１３に向けて照射するとともに、試料からの戻り光を観察カメラ２３側に通す働きをする。一方、２９は光路切換機構である切換ミラーである。なお、図２ではこの切換ミラー２９の代わりにハーフミラー２７が設けられている。切換ミラー２９は、試料からの戻り光の光路を観察カメラ２３側または光ファイバー部２４側のいずれか一方に切り換える。具体的には、試料からの蛍光検出を行わない場合には、切換ミラー２９は、戻り光の光路を遮らないように戻り光の光路に平行に配置される。一方、蛍光検出時には、戻り光の光路を遮るように配置され、戻り光は反射され、光ファイバー部２４に導入される。この時、戻り光の９５％以上が反射されることが好ましい。切換ミラー２９を光路に平行にすることで、試料からの戻り光を１００％観察カメラ２３側に通すことができ、暗い蛍光像等の像を観察することか可能となる。また、切換ミラー２９を切換え、光路を遮るように配置することで、試料からの戻り光の一部の光を観察カメラ２３側に通すことで、照明部２１から照射された光が試料の目的とする測定位置に照射されているかの確認ができる。さらに、切換ミラー２９で反射した戻り光を光ファイバー部２４を経て、分光器２５に導くことで、上記の試料の測定位置についての、蛍光スペクトル分析、ラマン光測定、カソードルミネッセンス光測定が可能となる。なお、図１のように光路切換機構がない場合には、蛍光スペクトル分析、ラマン光測定、カソードルミネッセンス光測定は困難である。
　光学顕微鏡部の光源には、レーザ光等の単色光、白色光及びそれらの組み合わせを用いることができる。また、照明部はケーラー照明又はスポット照明が可能であることが好ましい。例えば、光源にレーザ光源を用い、照明部にケーラー照明を用いることにより、蛍光顕微鏡を構成することができる。また、光源にレーザ光源を用い、照明部にスポット照明を用い、試料ステージをＸＹ方向に走査して、戻り光を検出器でＩ／Ｖ変換させ、試料ステージの走査信号に同期させＸＹマップとして表示することで、走査型レーザ顕微鏡を構成することもでき、さらに、検出器の位置調整を行うことで共焦点型走査レーザ顕微鏡とすることもできる。また、光源にレーザ光源を用い、照明部にスポット照明を用い、戻り光を分光器に導くことにより、蛍光測定及びラマン測定が可能な構成とすることもできる。また、光源にレーザ光源を用い、照明部にスポット照明を用い、試料ステージをＸＹ方向に走査して、戻り光を分光器に導き、走査位置毎の分光分析を実施しながら、試料ステージの走査信号に同期させＸＹマップとして表示することで、３次元での蛍光測定及びラマン測定が可能な構成とすることもできる。ここで、ＸＹ軸は共に試料面上の位置情報となり、Ｚ軸方向は分光分析による波長軸となる。
　また、励起波長の異なる複数の蛍光色素を用いる場合、光源部２１内に複数の単色光源（例えば、レーザ光源）を配置し、単色光源を切換ながら各励起波長で各蛍光色素を発光させて複数の蛍光画像を取得した後、画像処理により複数の蛍光画像を合成して試料の蛍光像観察を行うことができる。
　あるいは、光学顕微鏡の光源部として、複数の単色光源と、該複数の単色光源からの光を混合して合成光となす光合成手段とを有するものを用いることもできる。図４は、複数の単色光源を有する光源部２１の一例を示す模式図である。光源部２１は、複数の単色光源３１－１，３１－２、３１－３、…、３１－ｎ（ｎは２以上の整数）と、該複数の単色光源からの光を合成する光合成手段である、光合成モジュール３２とを備えている。これにより、複数の蛍光試薬で標識した試料に対し単色光の合成光を一度に照射できるので、上記の単色光源を切り換える方法に比べ、測定手順が簡略化できる。
また、複数の蛍光像の画像合成を行う必要がないので、画像合成時に伴う複数の蛍光像の位置合せが不要となる。単色光源を切り換えて複数の蛍光像を取得し、蛍光ＳＥＭ画像を作製する場合には、各蛍光像の重心位置を算出し、その各蛍光像の重心位置をＳＥＭ像の重心位置と一致させるように、各蛍光像の位置調整および観察倍率補正を行う必要がある。これに対し、上記の光合成手段を用いる態様では、各蛍光像の位置調整および観察倍率補正を行う必要はなく、任意の１種以上の蛍光像の位置調整および観察倍率補正を行うだけでよい。これにより、複数の蛍光像を観察することに伴う装置側の設置環境による光軸のドリフト補正/試料ステージのドリフト問題を低減できるので、ＳＥＭ像ならびに蛍光像の輪郭がハッキリとした画像の取得が可能となり、分解能が向上してより鮮明な画像が得られる。ならびに試料測定に対しての時間短縮ならびに後処理作業の簡素化が期待できるという利点がある。
　光合成モジュールは、赤、青、緑の単色光を同時照射することで白色光に近い色の光を照射することができ、白色レーザと違った形での白色照明としての光を試料に照射し実体光学顕微鏡として試料を観察することができるようにするものである。例えば、赤、青、緑の光を、それぞれ変調する複数の素子を一方向に配列した１次元の光変調素子、変調された光を合成する合成ミラー、変調された光から投影像を形成する投影光学系等から構成されたものを用いることができる。
　本実施の形態に用いる観察用試料の作製方法は、特に限定されず、従来、顕微鏡観察用に用いられているいずれの作製方法も用いることができ、例えば、検体の薄切片を用いる包埋法や凍結法を挙げることができる。また、実体観察のため、検体片自身を支持基材上に固定する方法も含まれる。なお、蛍光色素には、（国際公開第２００８／０１３２６０号パンフレット）に記載された蛍光色素を用いることが好ましい。その国際公開パンフレットに記載された蛍光色素（オキサジアゾロピリジン誘導体）を用いることにより、期間保存しても蛍光色素からの蛍光が消失することがない永久標本を提供することができる。すなわち、従来の蛍光色素を用いた生体標本では、１週間程度で褪色するのに対し、その蛍光色素を用いた生体標本は、冷蔵保存可能である限り半永久的に保存することが可能となる。また、従来の蛍光色素に比べ安価である。また、実質的に乾燥状態である生体標本でも高い蛍光強度を与えるため、さらに信頼性の高い病理診断が可能である。
　以下に、バルク観察とエッチング切片観察を行う場合の試料作製方法の一例を示す。なお、試料作製には、以下の試薬を共通して用いることができる。
　ａ）免疫染色およびレクチン染色用の蛍光色素には、電子線耐性が高い、上記国際公開パンフレットに記載された蛍光色素又はＡｌｅｘａ系を用いることができる。
　ｂ）脱水剤にはアセトンを用い、上昇系脱水法による（５０－７５－８５－９５－１００％×２(各７分)）。
（バルク観察用試料作製法）
＜Ａ：灌流固定＞
　１)固定液は、２．８％パラホルムアルデヒド＋０．２％ピクリン酸＋０．０６％グルタルアルデヒドのリン酸緩衝液を用いる。後固定として４％パラホルムアルデヒドのリン酸緩衝液を用いる。
＜Ｂ：凍結割断（ＤＭＳＯ法）＞
　２)４％パラホルムアルデヒドによる後固定後、ＰＢＳで十分な洗浄を行い、試料を３０％ＤＭＳＯ→５０％ＤＭＳＯへ置換し、凍結割断装置（液体窒素）を用い５０％ＤＭＳＯに封じ込めた試料を割断・洗浄する。
＜Ｃ：蛍光標識＞
　３）ＰＢＳ洗浄後、免疫蛍光法およびレクチン染色により試料を蛍光色素で標識する。
＜Ｄ：試料処理－１＞
　４）蛍光標識された試料を、アセトン脱水系に回した後、上昇系Ｔｅｒｔ-ブチルアルコール（５０－１００％×２(各５分)）に置換する。凍結乾燥機（エイコー製ＲＤ－１）にて乾燥しバルク試料とする。
＜Ｅ：コーティング＞
　５）試料をＳＥＭ用試料台にカーボン製両面テープ等で接着後、オスミウムコータ（真空デバイス社製ＩＤ－２）を用い、約２ｎｍの厚さにオスミウムをコートする。
（エッチング観察用試料作製法）
　試料処理に以下の方法を用いた以外は、バルク観察用試料作製法と同様の方法で行うことができる。
＜Ｄ：試料処理－２＞
　５）標識・脱水後の試料を親水性プラスチック（テクノビット８１００）にて包埋後、光顕用ダイヤモンドナイフとウルトラミクロトームを用い約５μｍ厚の切片を作製する。蛍光輝度を確保するため、切片の厚さを１０μｍとすることもできる。
　６）試料搭載用の板には、ウェハ用Ｓｉ基板を８ｍｍ角程度に割ったものを用い、試料を載せる。
　７）基板試料にイオンエッチングを行い切片試料とする。イオンエッチングは、真空デバイス社製ＰＩＢ－１０を用い、１３ｍＡ／８分で行う。
　本実施の形態によれば、ＳＥＭシステムの電子ビームの光軸と同軸となるように光学顕微鏡のカセグレン鏡がＳＥＭの鏡筒内に配置されていることで、試料を移動させることなく、１台の装置で蛍光観察とＳＥＭ観察が可能である。それにより、試料の収納、取り出しによる位置ズレ並びに物理的、化学的変化の影響を受けることなく、同一位置で試料の観察並びに分析が可能であり、フットスペースも軽減される。また、従来、光学顕微鏡を構成するカセグレン鏡の反射面は球面型であり、光学像を観察した際に周辺部が歪んでおり、電子顕微鏡像と重ね合わせることはできなかった。これに対し本発明では、反射面が非球面型であるカセグレン鏡を用いているので、光学像の周囲に歪みがなく、電子顕微鏡像との重ね合わせが容易であり、分解能を向上させることができる。それにより、試料中の蛍光標識した部位を即座に拡大して高倍率で観察することが可能となる。それにより標識部位の同定確認を迅速に行うことができる。
実施の形態２．
　図５は、本実施の形態に係る多光源顕微鏡の構成の一例を示す模式図である。
　多光源顕微鏡は、ホストコンピュータからなるシステム制御部５１と、分光器５２と、顕微鏡部５０とから構成されている。顕微鏡部５０は、複数の光源５４，５５，５６と、それら光源を光軸位置に移動可能に保持する光源保持手段５７とを有する光源部５３と、鏡筒５８内に配置され、光源からの電子線を加速し試料に照射する複数の電磁レンズ６０ａからなる光学系６０と、試料６８を保持し、ＸＹ方向へ移動可能でかつ回転可能な試料筒６９と、試料の透過電子を検出する検出部７０と、鏡筒５８外に配置された観察部６４を有する。検出部７０は、試料６８を透過した電子が到達する蛍光板７１と、蛍光板７１が取着されたファイバーテーパー７２と、レンズユニット７４と、ＣＣＤ／ＣＭＯＳ検出器７５と、ファイバーテーパー７２とレンズユニット７４との間に取り付けられたフィルタ７３とから構成されている。また、観察部６４は、外部ＣＣＤカメラ６５と蛍光選択フィルタ６７が取着された三眼鏡筒６６から構成されている。また、５９は仕切り板であり、鏡筒と光源部を遮断するのに用いる。すなわち、光源部内の光源を切り換える場合、光源部だけでなく真空状態にある鏡筒全体をリークすると、リークと再度真空状態に戻すのに時間を要する。そこで、仕切り弁で光源部と鏡筒を遮断し、光源部のリークと再真空引きの時間を短縮する。また、６１は、試料からの反射電子を検出する反射電子検出器である。また、６２は、試料からの二次電子を検出する二次電子検出器である。また、６３は、エネルギー分散型Ｘ線分光法（ＥＤＸ）検出器である。また、７６は、可動型小反射蛍光板であり、試料６８からの透過電子を観察部６４に導くものである。
　光源部５３の光源としては、電子銃５４、レーザ光源５５、そしてＸ線源５６の３種の光源を用いることができる。本実施の形態に係る多光源顕微鏡では、この３種の光源を適宜切り換えて使用する。
（電子顕微鏡）
　光源に電子銃を用いることにより電子顕微鏡として使用することができる。
　すなわち、光源部５３内の電子銃より照射された電子線は、仕切弁５９を通り鏡筒５８内の光学系６０により加速され、試料筒６９に固定された試料６８に照射される。試料６８からの反射電子は反射電子検出器６１で検出される。また、試料６８を透過した電子は、蛍光板７１、ファイバーテーパー７２、レンズユニット７４を通過し、ＣＣＤ／ＣＭＯＳ検出器７５で検出され、システム制御部５１のモニタに画像化されて表示される。すなわち、透過型電子顕微鏡として使用することができる。ここで、観察倍率は、レンズユニット７４を操作することで変化させることができる。また、可動型小反射蛍光７６を光路上に移動させることで、試料６８からの透過電子像を三眼鏡筒６６で目視観察することができる。また、試料より発生したＸ線をＥＤＸ検出器６３を用いて検出することで元素分析が可能となる。
　また、試料筒６９をＸＹ方向へ走査、そして回転走査(θ方向)し、二次電子検出器６２を用いて試料６８からの二次電子を検出することにより、走査型電子顕微鏡として使用することができる。また、ＣＣＤ／ＣＭＯＳ検出器７５を用いることによりＳＴＥＭ像（走査透過電子顕微鏡像）の観察が可能となる。また、ＥＤＸ検出器６３を用いることで、ＸＹ方向の２次元元素マップ像の観察が可能となる。
　また、試料６８からの発光を三眼鏡筒６６を経由して分光器５２に光ファイバ等で導くことで、カソードルミネッセンス測定が可能となる。そして、試料筒６９をＸＹ方向へ走査することで２次元カソードルミネッセンスマップ像の観察が可能となる。
（レーザ顕微鏡）
　光源にレーザ光源を用いることにより、レーザ顕微鏡（光学顕微鏡）として使用することができる。ただし、電顕鏡筒内に光学系が組み込まれていないのでケーラー照明としてある面積に対してのみレーザが照射される。
　光源部５３内のレーザ光源より照射されたレーザ光は、仕切り弁５９を通り鏡筒５８内の光学系６０を通り、試料筒６９内に固定された試料６８に照射される。可動型小反射蛍光板７６を光路上に移動させることで、試料６８からの光を三眼鏡筒６６で目視観察することができる。すなわち、光学顕微鏡として使用することができる。また、試料が蛍光色素で標識されている場合は、三眼鏡筒６６に搭載されている蛍光選択フィルタ６７を光軸上に挿入することで、レーザ光(励起光)をカットして蛍光像を観察することが可能となる。また、試料からの光を三眼鏡筒６６経由で分光器５２に光ファイバ等で導くことで、ラマン測定が可能となる。また、試料筒６９のＸＹ方向への走査、ならびに回転走査(θ方向)により、３Ｄ光学像又は３Ｄ蛍光像の観察が可能となる。
　また、透過光で撮影する場合、ＣＣＤ／ＣＭＯＳ検出器７５を用いるが、試料作製により蛍光剤感度に低下が起こる場合がある。すると検出器７５のみでの撮影では、長時間の露出を強いられる可能性があり、それを補助する手段として蛍光板７１を用いることで輝度を確保できる。また、テーパー７２で広い視野を確保し検出器７５に画像を導く事ができる。
　なお、レーザ光源としては、白色レーザを用いることができる。あるいは、波長が異なる複数のレーザ光源を必要に応じて切り換えて使用することもできる。
（Ｘ線顕微鏡）
　光源にＸ線源を用いることによりＸ線顕微鏡として使用することができる。
　すなわち、光源部５３内のＸ線源より照射されたＸ線は、仕切弁５９を通り鏡筒５８内の光学系６０により加速され、試料筒６９に固定された試料６８に照射される。試料６８を透過したＸ線は、蛍光板７１、ファイバーテーパー７２、レンズユニット７４を通過し、ＣＣＤ／ＣＭＯＳ検出器７５で検出され、システム制御部５１のモニタに画像化されて表示される。すなわち、Ｘ線電子顕微鏡として使用することができる。ここで、観察倍率は、レンズユニット７４を操作することで変化させることができる。また、可動型小反射蛍光７６を光路上に移動させることで、試料６８からの透過Ｘ線像を三眼鏡筒６６で目視観察することができる。また、試料筒６９のＸＹ方向への走査、ならびに回転走査(θ方向)により、３Ｄ透視Ｘ線像の観察が可能となる。
　なお、Ｘ線源としては、公知のＸ線源を用いることができるが、チップ化されたものを用いることが好ましい。
　本実施の形態で用いる蛍光板は、試料を透過した電子線や電磁波のエネルギーを吸収して蛍光を発生させるものである。蛍光板には試料透過部の拡大像が形成され、その拡大像はＣＣＤ／ＣＭＯＳ検出器により撮影される。従来、電子顕微鏡にはＰ２２粉末蛍光体からなる蛍光板が使用され、Ｘ線顕微鏡には微量の銀の入った硫化亜鉛等の蛍光板が使用されていた。電子顕微鏡用の蛍光板の検出波長域は、０．００３７ｎｍ～０．００２５ｎｍであるのに対し、Ｘ線顕微鏡の蛍光板の検出波長域は０．０７ｎｍ～０．１５ｎｍであり、共通に使用できるものではなかった。これに対し、本実施の形態では、蛍光板にセリウムドープＹＡＧを用いている。このセリウムドープＹＡＧは、０．００２～７００ｎｍの検出波長域を有しているため、１種の蛍光板で電子顕微鏡観察とＸ線顕微鏡観察を行うことが可能である。
　セリウムドープＹＡＧは、例えば、以下の文献に記載された方法で作製された単結晶を用いる。
1. "Evaluation of properties of YAG (Ce) poly-crystal scintillator with APD" Takayuki Yanagida, Hiromitsu Takahashi, Daisuke Kasama, Takeshi Ito, Hisako Niko, Motohide Kokubun, Kazuo Makishima, Takagimi Yanagitani, Hideki Yagi,Takashi Shigeta, and Takashi Ito Proceedings of Scintillating Crystals and their Applications at KEK, p111-116.
2. Tadayuki Takahashi: Future Prospects on X-ray and Gamma-ray Mission: 17th Annual October Astrophysics Conference in Maryland, Radiation Backgrounds from the First Stars, Galaxies and Black Holes: (2006)).
　その方法によれば、チョクラルスキー法（Cz法）、又は、フローティングゾーン法（FZ法）によって単結晶のインゴットが作製可能である。また、セリウムのドープ量は、０．００５～０．５ｍｏｌ％である。
　ここで、電子顕微鏡画像と、レーザ顕微鏡画像及び／又はＸ線顕微鏡画像との重ね合わせについて説明する。
　透過電子顕微鏡画像とレーザ顕微鏡画像の場合は以下の通りである。
　試料からの透過電子は検出部７０で検出されて光電変換され、システム制御部５１でＡ・Ｄ変換されて、透過電子顕微鏡画像が得られる。また、レーザ顕微鏡は、蛍光選択フィルタ６７と外部ＣＣＤカメラ６５を有しており、蛍光選択フィルタでの波長選択により目的の波長で表示された蛍光画像をＣＣＤカメラで検出し、システム制御部１へデジタル信号として送る。送られた透過電子顕微鏡画像と蛍光画像は、システム制御部１により、画像合成システムソフトウェアを用いて合成（重ね合わせ）が実行される。
　また、透過電子顕微鏡画像とＸ線顕微鏡画像の場合は以下の通りである。
　試料からの透過電子は検出部７０で検出されて光電変換され、システム制御部５１でＡ・Ｄ変換されて、透過電子顕微鏡画像が得られる。また、試料からの透過Ｘ線は検出部７０で検出されて光電変換され、システム制御部５１でＡ・Ｄ変換されて、透過Ｘ線顕微鏡画像が得られる。送られた透過電子顕微鏡画像と透過Ｘ線顕微鏡画像は、システム制御部１により、画像合成システムソフトウェアを用いて合成（重ね合わせ）が実行される。
　また、透過電子顕微鏡画像と、レーザ顕微鏡画像と、Ｘ線顕微鏡画像とを重ね合わせる場合、送られた透過電子顕微鏡画像と、蛍光画像と、透過Ｘ線顕微鏡画像は、システム制御部１により、画像合成システムソフトウェアを用いて合成（重ね合わせ）が実行される。
　なお、本実施の形態に用いる観察用試料の作製方法は、実施の形態１で用いたと同様の作製方法を用いることができる。
　励起波長の異なる複数の蛍光色素を用いる場合、レーザ光源５５に代えて、波長が異なる複数のレーザ光源を備えたレーザ光源部を設け、該複数のレーザ光源を必要に応じて切り換えて使用し、各励起波長で各蛍光色素を発光させて複数の蛍光画像を取得した後、画像処理により複数の蛍光画像を合成して試料の蛍光像観察を行うことができる。
　あるいは、レーザ光源部として、複数のレーザ光源と、該複数のレーザ光源からの光を混合して合成光となす合成手段とを有するものを用いることもできる。図６は、図５のレーザ光源５５に代えて用いるレーザ光源部の構成を示す模式図である。レーザ光源部８０は、複数のレーザ光源８１－１，８１－２、８１－３、…、８１－ｎ（ｎは２以上の整数）と、該複数のレーザ光源からの光を合成する光合成手段である、光合成モジュール８２とを備えている。これにより、複数の蛍光試薬で標識した試料に対し単色光の合成光を一度に照射できるので、上記の単色光源を切り換える方法に比べ、測定手順が簡略化できる。また、複数の蛍光像の画像合成を行う必要がないので、画像合成時に伴う複数の蛍光像の位置合せが不要となる。単色光源を切り換えて複数の蛍光像を取得し、蛍光ＳＥＭ画像を作製する場合には、各蛍光像の重心位置を算出し、その各蛍光像の重心位置をＳＥＭ像の重心位置と一致させるように、各蛍光像の位置調整および観察倍率補正を行う必要がある。これに対し、上記の光合成手段を用いる態様では、各蛍光像の位置調整および観察倍率補正を行う必要はなく、任意の１種以上の蛍光像の位置調整および観察倍率補正を行うだけでよい。これにより、複数の蛍光像を観察することに伴う装置側の設置環境による光軸のドリフト補正/試料ステージのドリフトを低減できるので、ＳＥＭ像ならびに蛍光像の輪郭がハッキリとした画像の取得が可能となり、分解能が向上してより鮮明な画像が得られる。ならびに試料測定に対しての時間短縮ならびに後処理作業の簡素化が期待できるという利点がある。
　本実施の形態によれば、検出部の蛍光板にセリウムドープＹＡＧを用いるようにしたので、試料を移動させることなく、１台の装置で電子顕微鏡観察とＸ線顕微鏡観察、そしてレーザ顕微鏡観察が可能である。それにより、試料の収納、取り出しによる位置ズレ並びに物理的、化学的変化の影響を受けることなく、同一位置で試料の観察並びに分析が可能であり、フットスペースも軽減される。それにより標識部位の同定確認を迅速に行うことができる。
　以下、実施例を用いて本発明についてさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１．
（試料作製）
　ラットの神経組織であるアストロサイトに対し、以下の手順により免疫染色を行った。
１）４％パラホルムアルデヒドを含む０．１Ｍ　ＰＢ(Phosphate Buffer)で還流固定後、浸漬固定した（３時間）。
２）２０％シュークロースを含む０．１Ｍ　ＰＢで洗浄した（４℃、一晩）。
３）ａ．カミソリによる切断、ｂ．ＳＥＭ用凍結割断、ｃ．１０μｍ凍結切片作製などの、各用途に応じた技法により神経(脊髄)組織を小さな試料に分けた。図７Ａにはｃ、図７Ｂにはａの方法を用いて試料を作製した。
４）０．１Ｍ　ＰＢ洗浄（５分×３回）
５）０．８％Ｆｉｓｈ　Ｇｅｌａｔｉｎ、１％ 牛血清アルブミン、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を含む０．１Ｍ　ＰＢＳ（Phosphate Buffered Ｓalts，ＰＢＳＴＢＦ）でブロッキングした（室温、１時間）。
６）抗グリア線維性酸性蛋白Ｇｌｉａｌ　ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ　ａｃｉｄｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＡＰ）マウスモノクローナル抗体(１：２０，０００；Ｓｉｇｍａ1)をＰＢＳＴＢＦ中でインキュベートした（４℃、１４時間）。コントロールはＰＢＳＴＢＦのみでインキュベートした。
７）０．１Ｍ　ＰＢ洗浄（５分×３回）
８）ビオチン標識抗マウス抗体(１：４００；Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂ．)をＰＢＳＴＢＦ中でインキュベートした（室温、９０分）。
９）０．１Ｍ　ＰＢ洗浄（５分×３回）
１０）Ｆｌｕｏｌｉｄ標識ストレプトアビジンを１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ（ｐＨ７．３）中で、室温、９０分、インキュベートした。ＡＭＣＡ（７－ａｍｉｎｏ－４－ｍｅｔｈｌｙｃｏｕｍａｒｉｎｅ－３－ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ）標識ストレプトアビジン(１：２００；Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂ．)をＰＢＳＴＢＦ中、室温、９０分、インキュベートした。
　但し、希釈倍率はＦｌｕｏｌｉｄの作製過程により変動する。
１１)０．１Ｍ　ＰＢ洗浄（５分×３回）
　なお、本実施例及び以下の実施例中、Ｆｌｕｏｌｉｄとは、前記国際公開に記載された蛍光色素を指す。
（顕微鏡観察方法）
　多光源顕微鏡として、ＳＥＭ部と光学顕微鏡部を備えた日本電子（株）製の波長分散型元素分析装置ＪＸＡ－８６００の光学顕微鏡部の光学系を改造したものを用いた。
（結果）
　図７Ａにラット神経組織のアストロサイトを含む蛍光顕微鏡画像を、そして図７Ｂに本発明の多光源顕微鏡を用いて得られたラット脊髄のアストロサイトの蛍光ＳＥＭ画像を示す。本発明の多光源顕微鏡を用いることにより、アストロサイトのみが染色された鮮明な画像が得られた。
実施例２．
（試料作製）
　ラットの腎(尿細管)に対し、以下の手順により免疫染色を行った。
１）２．８％パラホルムアルデヒド－０．２％ピクリン酸－０．０６％グルタールアルデヒド－０．１Ｍ　ＰＢで還流固定後、４％パラホルムアルデヒドｉｎ　ＰＢにて後固定を行い、４℃で保存した。
２）ビブラトームで１ｍｍの試料を作製し、ＰＢＳ（０．０１Ｍ）で洗浄した（４℃、１日）。
３)　Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ　Ｐｅａｎｕｔ　Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＰＮＡ）（Ｖｅｃｔｏｒ）をＰＢＳ中でインキュベートした（４℃、４日）（１：１００）。
４）ＰＢＳ洗浄（４℃、２０分×３）
５）蛍光色素付加（４℃、１日）
　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－Ｆｌｕｏｌｉｄ－Ｗ－ＯｒａｎｇｅをＰＢＡ中でインキュベートした（１：１０）。
６）ＰＢＳ洗浄（４℃、２０分×３）
７）アセトン脱水　（５０－７５－８５－９５－１００％上昇系脱水）
８）標識・脱水後の試料を親水性プラスチック（テクノビット８１００）にて包埋後、光顕用ダイヤモンドナイフとウルトラミクロトームを用い約５μｍ厚の切片を作製した。
９）試料搭載用の板に、ウェハ用Ｓｉ基板を８ｍｍ角程度に割ったものを用い、その上に試料を載せた。
１０）基板試料にイオンエッチングを行い切片試料とした。イオンエッチングは、真空デバイス社製ＰＩＢ－１０を用い、１３ｍＡ／８分で行った。
（結果）
　顕微鏡観察には、実施例１で用いた多光源顕微鏡を用いた。図８（ａ）にＳＥＭ画像、（ｂ）に蛍光画像、（ｃ）に本発明の多光源顕微鏡を用いて得られた蛍光ＳＥＭ画像、（ｄ）に（ｃ）の部分拡大画像を示す。蛍光ＳＥＭ画像により、尿細管断面のブラッシュボーダーが選択的に染色されていることを確認できた。また、蛍光顕微鏡では観察不可能な尿細管内壁の絨毛を詳細に観察することができた。
実施例３．
（試料作製）
１）２．８％パラホルムアルデヒド－０．２％ピクリン酸－０．０６％グルタールアルデヒド－０．１Ｍ　ＰＢで還流固定後、４％パラホルムアルデヒドＰＢにて後固定を行い、４℃で保存した。
２）ビブラトームで１ｍｍの試料を作製し、ＰＢＳ（０．０１Ｍ）で洗浄した（４℃、１日）。
３)Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ　Ｐｅａｎｕｔ　Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＰＮＡ）（Ｖｅｃｔｏｒ）をＰＢＳ中でインキュベートした（４℃、４日）（１：１００）。
４）ＰＢＳ洗浄（４℃、２０分×３）
５）蛍光色素付加（４℃、１日）
　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－Ｆｌｕｏｌｉｄ－Ｗ－ＯｒａｎｇｅをＰＢＳ中でインキュベートした（１：１０）。
６）ＰＢＳ洗浄（４℃,２０分×３）
７）アセトン脱水（５０－７５－８５－９５－１００％上昇系脱水）
８）標識・脱水後の試料を親水性プラスチック（テクノビット８１００）にて包埋後、光顕用ダイヤモンドナイフとウルトラミクロトームを用い約５μｍ厚の切片を作製した。
９）試料搭載用の板に、ウェハ用Ｓｉ基板を８ｍｍ角程度に割ったものを用い、その上に試料を載せた。
１０）基板試料にイオンエッチングを行い切片試料とした。イオンエッチングは、真空デバイス社製ＰＩＢ－１０を用い、１３ｍＡ／８分で行った。
（結果）
　顕微鏡観察には、実施例１で用いた多光源顕微鏡を用いた。図９ＡにＳＥＭ画像、図９Ｂに蛍光画像、そして図９Ｃに本発明の多光源顕微鏡を用いて得られた蛍光ＳＥＭ画像を示す。試料は、マクロファージを含むラットのリンパ節である。リンパ節組織中にあるマクロファージ(貪食細胞)は、生体内の様々な老廃物を取り込んでいるため、自家蛍光を有すると考えられている。そこで、無染色のまま、本装置にてリンパ節を蛍光観察した結果が図９Ｂであり、この黄色に光る蛍光部と一致してマクロファージの存在を同定することができた。ＳＥＭ像と重ね合わせることにより（図９Ｃ）、マクロファージ細胞を他の細胞と区別してＳＥＭにて観察することができた。
実施例４．
　ラットの眼球に対し、以下の手順により免疫染色を行った。
１）眼球摘出後、１％ＰＦＡに１０分間浸漬し、その後網膜を除去した。
２）４％ＰＦＡに１時間浸漬した。
３）ＰＢＳ洗浄（１０分×３回）
４）脱脂-アセトン浸漬（５分）
５）ＰＢＳ洗浄（１０分×３回）
６）ブロッキング（ナカライテスク社のブロッキングワン）（６０分）
７）ＣＮＶ（脈絡膜血管新生）の一次抗体として、１０倍希釈したｒａｔ　ａｎｔｉ－ＣＤ３１抗体（ＢＤ　ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）をインキュベートした（４℃、３日間）。
８）ＰＢＳ洗浄（１０分×３回）
９）ＣＮＶの二次抗体として、Ａｌｅｘａ　ｆｌｕｒ　５４６（ｒｅｄ）で標識し、２００倍希釈したｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｒａｔ　ＩｎＧをインキュベートした（４℃、３０時間）。
１０）マクロファージ用にＰＢＳ洗浄（１０分×３回）
１１）一次抗体として、５００倍希釈したｒａｂｂｉｔ　Ｉｂａ－１抗体 (ｗａｋｏ)をインキュベートした（４℃、一晩）。
１２）ＰＢＳ洗浄（１０分×３回）
１３）マクロファージの二次抗体として、Ａｌｅｘａ　ｆｌｕｒ　４８８（ｇｒｅｅｎ）で標識し、１０００倍希釈したｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ　ＩｎＧをインキュベートした（４℃、３～４時間）。
１４）ＰＢＳ洗浄（１０分×３回）
１５）アセトン脱水（５０－７５－８５－１００％上昇系脱水、１００％×２回（各５分））
１６）ｔｅｒｔ－ブチルアルコール１００％液で置換（５分×２回）
１７）凍結乾燥装置（エイコーエンジニアリング社製　ＩＤ－２）を用いて約１．５時間乾燥した。
１８）試料搭載用のアルミ台（高さ５ｍｍ／１２．５ｍｍφ）にカーボン製両面テープで乾燥試料を搭載した。
１９）Os（オスミウム）プラズマコーター（真空デバイス社製　ＨＰＣ－１Ｃ）を用いコーティングした（コーティング膜厚２．５ｎｍ）。
（結果）
　顕微鏡観察には、実施例１で用いた多光源顕微鏡を用いた。図１０の（ａ）にＳＥＭ画像、（ｂ）に蛍光画像、そして（ｃ）に本発明の多光源顕微鏡を用いて得られた蛍光ＳＥＭ画像を示す。マクロファージからは、ＣＮＶを成長させる血管内皮細胞増殖因子が放出されると考えられている。多光源顕微鏡観察により、ＣＮＶおよびその周辺における炎症細胞組織にマクロファージが存在しＣＮＶが周囲のマクロファージから影響を受ける範囲に分布している様子を立体的に観察できた。網膜内先端部に位置しＣＮＶ直近に存在するマクロファージが、ＣＮＶ形成を促進している可能性を示唆する画像が得られた。
　これら実施例１から４で説明した蛍光ＳＥＭ画像は、従来全く報告がなく、本発明により初めて観察することが可能となったものである。以上の通り、本発明によれば、迅速に蛍光ＳＥＭ画像を観察することができるので、ＳＥＭと光学顕微鏡とを組み合わせた実用レベルの生体組織分析装置を提供することが可能となる。

Claims (6)

  1. 　試料を同一位置で観察可能な多光源顕微鏡であって、
    　光源部を備え蛍光を観察するための光学顕微鏡部と、走査型電子顕微鏡部とからなり、
    　該光学顕微鏡は反射面が非球面型であるカセグレン鏡を有し、該カセグレン鏡が該走査型顕微鏡部の鏡筒内に該走査型電子顕微鏡部の電子ビームの光軸と同軸となるように配置されている多光源顕微鏡。
  2. 　上記カセグレン鏡が、中央に開口を有する大鏡と、該開口の下方に該大鏡に対向するように配置された小鏡とからなり、大鏡と小鏡の反射面が非球面型である請求項１記載の多光源顕微鏡。
  3. 　上記光学顕微鏡の光源部が、複数の単色光源と、該複数の単色光源からの光を混合して合成光となす光合成手段とを有する請求項１記載の多光源顕微鏡。
  4. 　上記光学顕微鏡が、光源部からの光を試料に照射する照明部と、試料からの戻り光を観察する観察カメラと、試料からの蛍光を集光する光ファイバー部と、試料からの戻り光の光路を観察カメラ側または光ファイバー側のいずれか一方に切り換える光路切換機構とを有する請求項１記載の多光源顕微鏡。
  5. 　試料を同一位置で観察可能な多光源顕微鏡であって、
    　光軸位置に移動可能に配置された、電子銃と、１以上のレーザ光源と、Ｘ線源とを備えた光源部と、
    　該光源部からの電子線又は電磁波を試料に照射する光学系と、
    　セリウムドープＹＡＧからなる蛍光板を有し試料を透過した電子線又は電磁波を検出する検出部を少なくとも有する、多光源顕微鏡。
  6. 　上記光源部が、複数のレーザ光源と、該複数のレーザ光源からの光を混合して合成光となす光合成手段とを有する請求項５記載の多光源顕微鏡。
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5963453B2 (ja) * 2011-03-15 2016-08-03 株式会社荏原製作所 検査装置
NL1039512C2 (en) * 2012-04-02 2013-10-03 Univ Delft Tech Integrated optical and charged particle inspection apparatus.
US9885804B2 (en) * 2013-10-22 2018-02-06 Cgg Services Sas Desktop hyperspectral spectra collection of geological material
WO2017216941A1 (ja) * 2016-06-17 2017-12-21 株式会社 日立ハイテクノロジーズ 荷電粒子線装置
CN107941831B (zh) * 2016-10-13 2019-08-13 北京大学 一种电子束激发荧光成像和荧光光谱测量装置及其方法
DE102017201706A1 (de) * 2017-02-02 2018-08-02 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Abbildungseinrichtung zur Abbildung eines Objekts und zur Abbildung einer Baueinheit in einem Teilchenstrahlgerät
CN206848286U (zh) * 2017-05-09 2018-01-05 深圳博大博聚科技有限公司 一种全自动荧光显微分析仪
US10748737B2 (en) * 2017-10-10 2020-08-18 Kla-Tencor Corporation Electron beam generation and measurement
KR20210021369A (ko) * 2018-07-13 2021-02-25 에이에스엠엘 네델란즈 비.브이. Sem 이미지 향상 방법들 및 시스템들
US11598732B2 (en) * 2018-07-26 2023-03-07 Focus-Ebeam Technology (Beijing) Co., Ltd. Imaging system and method for specimen detection
KR102116889B1 (ko) * 2018-10-30 2020-05-29 (주)자비스 유도 특성 개선 구조의 투과 엑스선 현미경 장치
US20220216028A1 (en) 2019-05-09 2022-07-07 Attolight AG Cathodoluminescence electron microscope
WO2021021656A1 (en) * 2019-07-26 2021-02-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Sub-wavelength raman imaging with combined optical and electron excitation
US11227743B2 (en) 2019-08-20 2022-01-18 Attolight AG Accurate wavelength calibration in cathodoluminescence SEM
US20220137380A1 (en) * 2020-10-30 2022-05-05 Kla Corporation Reflective compact lens for magneto-optic kerr effect metrology system
TWI808554B (zh) 2020-12-04 2023-07-11 亞光股份有限公司 使用陰極發光測量判別半導體材料中的位錯類型和密度的裝置與方法
US11782001B2 (en) 2020-12-04 2023-10-10 Attolight AG Dislocation type and density discrimination in semiconductor materials using cathodoluminescence measurements
JP2024504682A (ja) 2021-01-19 2024-02-01 アットライト エージー μＬＥＤの大量生産における費用対効果が高いプロービング
WO2023205466A1 (en) * 2022-04-21 2023-10-26 University Of Kansas Electron microscope imaging stages and systems

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60247141A (ja) * 1984-05-22 1985-12-06 Shimadzu Corp カソ−ドルミネツセンス装置
JPS6361938A (ja) * 1986-09-02 1988-03-18 Shimadzu Corp カソ−ドルミネツセンス装置
JPS6356556U (ja) * 1986-09-30 1988-04-15
JPS63149058U (ja) * 1987-03-20 1988-09-30
JPH05113418A (ja) * 1990-12-25 1993-05-07 Shimadzu Corp 表面分析装置
JP2001330563A (ja) * 2000-05-23 2001-11-30 Jeol Ltd 検査装置
JP2006010585A (ja) * 2004-06-28 2006-01-12 National Institute For Materials Science カソードルミネッセンス専用測定装置
WO2009069675A1 (ja) * 2007-11-27 2009-06-04 Nikon Corporation 蛍光顕微鏡
JP2010008406A (ja) * 2008-05-30 2010-01-14 Shinichiro Isobe 多光源顕微鏡

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2596863B1 (fr) * 1986-04-07 1988-06-17 Centre Nat Rech Scient Dispositif de microscopie analytique, propre a former a la fois une sonde raman et une sonde electronique
DE4243146C1 (de) * 1992-12-19 1994-04-07 Bruker Analytische Messtechnik Spiegeloptik mit streifender Reflexion
US6885445B2 (en) * 1998-05-09 2005-04-26 Renishaw Plc Electron microscope and spectroscopy system
US8144312B2 (en) * 2009-08-25 2012-03-27 Sigma Space Corporation Telescope with a wide field of view internal optical scanner

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60247141A (ja) * 1984-05-22 1985-12-06 Shimadzu Corp カソ−ドルミネツセンス装置
JPS6361938A (ja) * 1986-09-02 1988-03-18 Shimadzu Corp カソ−ドルミネツセンス装置
JPS6356556U (ja) * 1986-09-30 1988-04-15
JPS63149058U (ja) * 1987-03-20 1988-09-30
JPH05113418A (ja) * 1990-12-25 1993-05-07 Shimadzu Corp 表面分析装置
JP2001330563A (ja) * 2000-05-23 2001-11-30 Jeol Ltd 検査装置
JP2006010585A (ja) * 2004-06-28 2006-01-12 National Institute For Materials Science カソードルミネッセンス専用測定装置
WO2009069675A1 (ja) * 2007-11-27 2009-06-04 Nikon Corporation 蛍光顕微鏡
JP2010008406A (ja) * 2008-05-30 2010-01-14 Shinichiro Isobe 多光源顕微鏡

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