JP2014209912A - 非ウイルスアプローチを用いたiPS細胞の産生のための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2008年6月4日に出願された米国出願第61/058,858号および2009年3月16日に出願された米国出願第61/160,584号に対する優先権を主張する。これらの出願の開示全体は、権利放棄なしでその全体が本明細書中に参考として具体的に援用される。
本発明は、全体として、分子生物学、幹細胞、および分化細胞の分野に関する。詳細には、本発明は、体細胞および未分化細胞の分化プログラミングまたはリプログラミングに関する。
一般に、幹細胞は、一連の成熟機能細胞を生じさせることができる未分化細胞である。例えば、造血幹細胞は、様々な種類の最終分化血液細胞のいずれも生じさせることができる。胚性幹(ES)細胞は、胚に由来し、多能性であるため、あらゆる器官または組織型、または少なくとも潜在的に完全な胚に発達する能力を有する。
本発明は、分化プログラミングによって、外因性ベクター要素を本質的に含まない誘導多能性幹細胞および他の望ましい細胞型の提供における当技術分野の主な欠点を解消する。第1の実施形態では、誘導多能性幹(iPS)細胞集団を産生する方法であって、(a)リプログラミングベクター得るステップであって、このベクターの要素が、複製起点、およびiPSリプログラミング因子をコードする1つまたはそれより多い発現カセットを含む、ステップと、(b)リプログラミングベクターを体細胞の集団の細胞内に導入するステップと、(c)これらの細胞を培養して細胞集団を成長させるステップと、(d)前記成長した集団の子孫細胞を選択するステップであって、前記子孫細胞が、胚性幹細胞の1つまたはそれより多い特質を有する、ステップと、(e)選択した子孫細胞を培養してiPS細胞集団を提供するステップであって、1つまたはそれより多い前記発現カセットが、複製起点に結合して染色体外の鋳型を複製するトランス作用因子をコードするヌクレオチド配列を含み、かつ/または体細胞が、このようなトランス作用因子を発現する、ステップと、を含む、方法を提供する。さらなる態様では、ステップcまたはステップeは、細胞がベクター要素を本質的に含まなくなるまでさらに培養することを含む、またはベクターを含まないiPS細胞の産生を促進するように、後述する追加の選択ステップを含む。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
外因性レトロウイルス要素を本質的に含まない、選択されたヒト個人のゲノムを含むiPS細胞集団。
(項目2)
ゲノムが最終分化したヒト細胞に由来し、かつ外因性レトロウイルス要素を本質的に含まない細胞を含むiPS細胞集団。
(項目3)
前記iPS細胞集団が、外因性ウイルスベクター要素を本質的に含まない、項目1または2に記載のiPS細胞集団。
(項目4)
出発細胞集団と比較して変更された分化状態を有し、かつプログラミングベクター遺伝子要素を本質的に含まない細胞を有する細胞集団を提供する方法であって、
(a)第1の分化状態を有する細胞の出発集団を得るステップと、
(b)1つまたはそれより多い分化プログラミングベクターを得るステップであって、各ベクターが、複製起点、および組み合わせられると該出発細胞集団の分化状態を第2の分化状態に変更することができる1つまたはそれより多い分化プログラミング因子をコードする1つまたはそれより多い発現カセットを含み、該発現カセットのうちの1つまたはそれより多くが、該複製起点に結合して染色体外の鋳型を複製するトランス作用因子をコードするヌクレオチド配列を含み、かつ/または該出発集団の細胞が、このようなトランス作用因子を発現する、ステップと、
(c)該分化プログラミングベクターを該出発集団の細胞内に導入するステップと、
(d)該細胞を培養して、該第2の分化状態に対応する形質が、該培養された細胞の少なくとも一部の細胞で生じるように1つまたはそれより多いリプログラミング因子を発現させるステップと、
(e)該形質を有する細胞を十分な世代数に渡ってさらに培養して、該第2の分化状態を有するが、プログラミングベクター遺伝子要素を本質的に含まない細胞を含む目的の細胞集団を提供するステップと、を含む、方法。
(項目5)
前記分化状態を変更することがリプログラミングである、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記分化状態を変更することが分化である、項目4に記載の方法。
(項目7)
前記分化状態を変更することが分化転換である、項目4に記載の方法。
(項目8)
前記出発細胞が体細胞であり、前記形質が、胚性幹細胞の1つまたはそれより多い特質と定義される、項目5に記載の方法。
(項目9)
前記出発細胞が、線維芽細胞、ケラチノサイト、造血細胞、間葉細胞、肝細胞、胃細胞、またはβ細胞である、項目5に記載の方法。
(項目10)
前記分化プログラミング因子が、Sox−2およびOct−4を含むリプログラミング因子とさらに定義される、項目5に記載の方法。
(項目11)
前記リプログラミング因子は、Nanog、Lin28、Klf4、またはc−Mycをさらに含む、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記出発細胞が、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、間葉幹細胞、造血前駆細胞、内胚葉前駆細胞、膵臓前駆細胞、または内皮前駆細胞である、項目6に記載の方法。
(項目13)
前記第1の分化状態および前記第2の分化状態が最終分化である、項目7に記載の方法。
(項目14)
前記複製起点が、リンパ球向性ヘルペスウイルス、アデノウイルス、SV40、ウシパピローマウイルス、または酵母の複製起点である、項目4に記載の方法。
(項目15)
前記複製起点が、リンパ球向性ヘルペスウイルスの複製起点であり、EBVのoriPに対応する、項目14に記載の方法。
(項目16)
前記リンパ球向性ヘルペスウイルスが、エプスタインバーウイルス(EBV)、カポジ肉腫ヘルペスウイルス(KSHV)、リスザルヘルペスウイルス(HS)、またはマレク病ウイルス(MDV)である、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記トランス作用因子がEBVのEBNA−1に対応する、項目1に記載の方法。
(項目18)
前記トランス作用因子が、EBVのEBNA−1に対応する野生型タンパク質の誘導体であり、該誘導体は、野生型EBNA−1と比較して低い、組み込まれた鋳型からの転写活性化能力を有する、項目1に記載の方法。
(項目19)
前記トランス作用因子が、EBVのEBNA−1に対応する野生型タンパク質の誘導体であり、該誘導体は、前記複製起点に結合すると、該対応する野生型タンパク質による転写活性化の少なくとも5%のレベルで染色体外の鋳型からの転写を活性化する、項目1に記載の方法。
(項目20)
前記トランス作用因子が、EBVのEBNA−1に対応する野生型タンパク質の誘導体であり、該誘導体は、EBNA−1の残基約65〜約89に対応する残基の欠失および/またはEBNA−1の残基約90〜約328に対応する残基の欠失を有する、項目1に記載の方法。
(項目21)
前記誘導体が、EBNA−1の残基1〜約40および残基約328〜641に対して少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質をコードする、項目18に記載の方法。
(項目22)
前記ステップ(d)または(e)において前記培養細胞の細胞を選択する追加のステップをさらに含み、該細胞は、分化プログラミングベクター遺伝子要素を本質的に含まない、項目4に記載の方法。
(項目23)
前記ステップ(d)または(e)において前記培養細胞の細胞を選択する追加のステップをさらに含み、該細胞は、前記分化プログラミングベクターに含まれる選択マーカーを本質的に含まない、項目4に記載の方法。
(項目24)
前記選択マーカーが、単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ、抗生物質耐性因子、または蛍光タンパク質である、項目23に記載の方法。
(項目25)
前記目的の細胞集団を分化させるステップをさらに含む、項目8に記載の方法。
(項目26)
分化プログラミングベクターであって、複製起点、および該複製起点に結合して該ベクターを染色体外で複製するトランス作用因子をコードする1つまたはそれより多い発現カセット;および1つまたはそれより多い分化プログラミング因子を含む分化プログラミングベクター。
(項目27)
前記分化プログラミング因子が、Sox−2、Sox−7、Sox−17、Oct−4、Nanog、Lin−28、c−Myc、Klf4、Esrrb、EBF1、C/EBPα、C/EBPβ、Ngn3、Pdx、およびMafaからなる群から選択される、項目26に記載の分化プログラミングベクター。
(項目28)
SoxファミリーメンバーおよびOctファミリーメンバーを含むリプログラミングベクターとしてさらに定義される、項目26に記載の分化プログラミングベクター。
(項目29)
前記分化プログラミング因子が、Nanog、Lin−28、Klf4、およびc−Mycからなる群から選択される1つまたは複数をさらに含む、項目28に記載の分化プログラミングベクター。
(項目30)
前記分化プログラミングベクターが、宿主細胞ゲノム内に組み込まれる能力を有していない、項目26に記載の分化プログラミングベクター。
(項目31)
前記複製起点が、リンパ球向性ヘルペスウイルス、アデノウイルス、SV40、ウシパピローマウイルス、または酵母の複製起点である、項目26に記載の分化プログラミングベクター。
(項目32)
前記複製起点が、リンパ球向性ヘルペスウイルスの複製起点であり、EBVのoriPに対応する、項目31に記載の分化プログラミングベクター。
(項目33)
前記リンパ球向性ヘルペスウイルスが、エプスタインバーウイルス(EBV)、カポジ肉腫ヘルペスウイルス(KSHV)、リスザルヘルペスウイルス(HS)、またはマレク病ウイルス(MDV)である、項目32に記載の分化プログラミングベクター。
(項目34)
前記トランス作用因子がEBVのEBNA−1に対応する、項目26に記載の分化プログラミングベクター。
(項目35)
前記トランス作用因子が、EBVのEBNA−1に対応する野生型タンパク質の誘導体であり、該誘導体は、前記複製起点に結合すると、前記対応する野生型タンパク質による転写活性化の少なくとも5%で染色体外の鋳型からの転写を活性化し、かつ野生型EBNA−1と比較して低い、組み込まれた鋳型からの転写活性化能力を有する、項目26に記載の分化プログラミングベクター。
(項目36)
前記誘導体が、組み込まれた鋳型からの転写を活性化する、前記野生型EBNA−1タンパク質に存在する配列を有していない、項目35に記載の分化プログラミングベクター。
(項目37)
前記誘導体が、EBNA−1の残基約65〜約89に対応する残基の欠失および/またはEBNA−1の残基約90〜約328に対応する残基の欠失を有する、項目35に記載の分化プログラミングベクター。
(項目38)
前記誘導体が、EBNA−1の残基1〜約40および残基約328〜641に対して少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する誘導体をコードする、項目35に記載の分化プログラミングベクター。
(項目39)
前記誘導体が、前記対応する野生型EBNA−1の残基1〜約40をコードする第1のヌクレオチド配列、および前記対応する野生型EBNA−1の残基約328〜641をコードする第2のヌクレオチド配列を含む、項目35に記載の分化プログラミングベクター。
I.本発明
本発明は、ウイルスベクターや外因性要素を本質的に含まない誘導多能性幹細胞の作製などの、細胞の様々な発生段階の現行のリプログラミング技術または分化プログラミングでいくつかの重要な問題を解決する。組み込み型ウイルスベクターを使用する従来の方法とは対照的に、これらの方法は、例えば、EBV要素をベースとしたプラスミドなどの染色体外リプログラミングまたは分化プログラミングベクターを使用して、リプログラミングまたは分化プログラミング因子を体細胞または幹細胞に形質導入し、これらの細胞を培養し、1つまたはそれより多い胚性幹細胞の特質について子孫細胞を選択する、または望ましい変更された分化状態に対応する形質について細胞を選択する。EBV要素をベースとしたベクターのような染色体外複製ベクターは、宿主細胞ゲノム内に組み込まれず、多能性または望ましい細胞状態に細胞を誘導するのに十分な期間が経過すると消失する。これらの方法の固有の特徴は、外因性遺伝子要素を本質的に含まない子孫細胞を作製し、負の選択がプロセスを促進し得る。これらの方法は、分化状態を変更することによってベクター要素を本質的に含まないiPS細胞または任意の望ましい細胞型を単離することを可能にする。したがって、新規な組成物および方法は、細胞におけるウイルス要素のランダムな挿入または持続的な発現によって引き起こされる変異誘発のリスクのない、治療用のベクターを含まないiPS細胞または他の望ましい細胞型の生産を可能にする。本発明のさらなる実施形態および利点は後述する。
「リプログラミング」は、リプログラミングなしの同じ条件下でよりも、培養下またはin vivoで少なくとも1つの新規な細胞型の子孫を形成する、計測可能に増大した能力を細胞に与えるプロセスである。より具体的には、リプログラミングは、体細胞に多能性潜在能力を与えるプロセスである。これは、新規な細胞型の表現型の特質を有する子孫がリプログラミングの前に本質的に形成できなくても、十分な増殖後には、このような子孫が計測可能な割合で形成されることを意味し、別の方法では、新規な細胞型の特質を有する子孫の割合が、リプログラミングの前よりも計測可能に多いことを意味する。特定の条件下で、新規な細胞型の特質を持つ子孫の割合は、優先度が増加する順に、少なくとも約1%、5%、25%、またはそれ以上であり得る。
本発明の特定の実施形態では、染色体外ベクターをベースとした系を用いてリプログラミング因子を体細胞内に導入することによって体細胞をリプログラミングする方法が開示される。これらの細胞の子孫は、後述する様々な態様で胚性幹細胞と同一であり得るが、外因性遺伝子要素を本質的に含んでいない。胚性幹細胞の特質を理解することが、誘導多能性幹細胞の選択に役立ち得る。幹細胞のリプログラミングの研究から既知のリプログラミング因子は、これらの新規な方法に使用され得る。胚性幹細胞の使用に際する倫理的ハードルために、これらの誘導多能性幹細胞が、治療および研究用途として胚性幹細胞の代わりに潜在的に使用され得ることがさらに企図されている。
幹細胞は、すべてではないにしても殆どが多細胞生物で見られる細胞である。幹細胞は、有糸細胞分裂によって自身を再生する能力、および様々な特殊化した細胞型への分化によって特徴付けられる。広範な2種類の哺乳動物幹細胞:胚盤胞で見られる胚性幹細胞、および成体の組織で見られる成体幹細胞がある。発達中の胚では、幹細胞は、特殊化した胚組織のすべてに分化することができる。成体生物では、幹細胞および前駆細胞は、体の修復系として機能して特殊化した細胞を補充するだけではなく、血液、皮膚、または腸組織などの再生器官の正常の代謝回転を維持する。
胚性幹細胞系(ES細胞系)は、胚盤胞または初期桑実期胚の内細胞塊(ICM)の胚盤葉上層組織由来の細胞の培養物である。胚盤胞は、ヒトでは約4〜5日齢の初期胚であり、50〜150の細胞からなっている。ES細胞は、多能性であり、発達中に3つの主要な胚葉:外胚葉、内胚葉、および中胚葉のすべての誘導体を発生させる。言い換えれば、ES細胞は、特定の細胞型にとって十分かつ必要な刺激が与えられると、成体の体の200を超える細胞型のそれぞれに発達できる。ES細胞は、胚外膜または胎盤に寄与しない。
iPS細胞の作製は、誘導のために使用される遺伝子にとって極めて重要である。以下の因子またはそれらの組合せは、本発明に開示されるベクター系に使用され得る。特定の態様では、SoxおよびOct(好ましくはOct3/4)をコードする核酸が、リプログラミングベクターに含まれる。例えば、リプログラミングベクターは、Sox−2、Oct−4、Nanog、および任意選択のLin−28をコードする発現カセット、またはSox−2、Oct−4、Klf4、および任意選択のc−mycをコードする発現カセット、またはSox−2、Oct−4、および任意選択のEsrrbをコードする発現カセットを含み得る。これらのリプログラミング因子をコードする核酸は、同じ発現カセット、異なる発現カセット、同じリプログラミングベクター、または異なるリプログラミングベクターの中に含められ得る。
iPS細胞は、典型的には、成体の線維芽細胞などの非多能性細胞内への特定の幹細胞関連遺伝子のトランスフェクションによって誘導される。トランスフェクションは、典型的には、レトロウイルスなどの現行方式の組み込み型ウイルスベクターによって達成される。移入遺伝子は、他の遺伝子が誘導の効率を高めることが示唆されているが、マスター転写調節因子Oct−3/4(Pouf51)およびSox−2を含む。臨界期後、トランスフェクト細胞の少数が、多能性幹細胞に形態学的および生化学的に似るようになり始め、典型的には、形態学的選択、倍加時間、またはレポーター遺伝子および抗生物質の感染によって単離される。
上記のように、ヒト体細胞からの多能性幹細胞の誘導は、リプログラミング遺伝子の異所性発現のためのレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを用いて達成された。モロニーマウス白血病ウイルスなどの組換えレトロウイルスは、宿主ゲノムに安定して組み込む能力を有する。組換えレトロウイルスは、宿主ゲノム内への組込みを可能にする逆転写酵素を含む。レンチウイルスは、レトロウイルスのサブクラスである。レンチウイルスは、分裂細胞はもちろん非分裂細胞のゲノム内に組み込む能力のために、ベクターとして広く採用されている。また、これらのウイルスベクターは、広い文脈:脱分化、分化、および分化転換を含む細胞の分化プログラミングで広く使用されてきた。RNAの形態のウイルスゲノムは、ウイルスが細胞に侵入すると逆転写されてDNAを生成し、次いで、このDNAがウイルスインテグラーゼ酵素によってランダムな位置でゲノム内に挿入される。したがって、成功しているリプログラミングの現行技術は、組込みをベースとするウイルス法に依存している。
ヒトヘルペスウイルス4(HHV−4)とも呼ばれるエプスタインバーウイルス(EBV)は、ヘルペスファミリー(単純ヘルペスウイルスおよびサイトメガロウイルスを含む)のウイルスであり、ヒトにおける最も一般的なウイルスの1つである。EBVは、そのゲノムを染色体外に維持し、効率的な複製と維持のために宿主細胞機構と協働し(LindnerおよびSugden、2007)、細胞分裂中の細胞内でのその複製および維持の2つの必須の特徴にのみ依存する(Yatesら、1985;Yatesら、1984)。一般にoriPと呼ばれる1つの要素が、シスに存在し、複製の起点として機能する。もう1つの因子EBNA1が、oriP内の配列に結合してプラスミドDNAの複製および維持を促進することによってトランスで機能する。限定目的ではない例として、発明者らは、これらの2つの特徴を取り出し、これらを、従来のプラスミドに対してこれらの遺伝子の複製および発現を促進する体細胞のリプログラミングに必要な遺伝子を運ぶためにプラスミドの文脈に使用する。
oriPは、DNAの複製を開始する部位またはその近傍であり、反復ファミリー(FR)と二分子対称(DS)として知られる約1キロ塩基対離れた2つのシス作用性配列から構成されている。
エプスタインバー核抗原1(EBNA1)は、oriPまたはRep*のFRおよびDSに結合して、各細胞分裂中の細胞染色体と協調するが独立した娘細胞へのEBVプラスミドの複製および忠実な分配を促進するDNA結合タンパク質である。
(1)疎水性:ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile;
(2)中性親水性:cys、ser、thr;
(3)酸性:asp、glu;
(4)塩基性:asn、gln、his、lys、arg;
(5)側鎖の向きに影響を与える残基:gly、pro;および
(6)芳香族:trp、tyr、pheに基づいて各群に分けられる。
重要なことは、oriPをベースとしたプラスミドの複製および維持が、不完全であり、細胞内に導入されてから初めの2週間以内に細胞から急激に減少する(1回の細胞分裂で25%);しかし、プラスミドを維持する細胞は、その減少が少ない(1回の細胞分裂で3%)(LeightおよびSugden、2001;NanboおよびSugden、2007)。プラスミドを含む細胞の選択が除去されると、プラスミドは、各細胞分裂の際に失われ、時間が経つとすべてのプラスミドが除去され、得られる娘細胞内にプラスミドが以前に存在していたという痕跡が残らない。この痕跡のない特徴は、分化プログラミングを用いてiPS細胞および他の望ましい細胞を作製するために遺伝子を送達する現行のウイルス関連方法の代替としてのoriPをベースとした系のアピールの根拠である。また、他の染色体外ベクターも、宿主細胞の複製および増殖の際に失われ、本発明にも用いられ得る。
特定の実施形態では、リプログラミングまたは分化プログラミングベクターは、上記したリプログラミング因子または分化プログラミング因子を細胞内で発現させるために、これらのリプログラミング因子をコードする核酸配列に加えて追加の要素を含むように構築され得る。これらの方法の新規な特徴は、染色体外複製ベクターの使用であり、染色体外複製ベクターは、宿主細胞のゲノム内に組み込まれず、複製の生成の際に失われ得る。これらのベクター成分および送達方法の詳細は以下に開示される。
プラスミドまたはリポソームをベースとした染色体外ベクター、例えば、oriPをベースとしたベクターおよび/またはEBNA−1の誘導体をコードするベクターの使用により、DNAの大きい断片を細胞内に導入して染色体外に維持すること、1回の細胞周期に1回複製すること、娘細胞に効率的に分配すること、および実質的に免疫応答を誘発しないことが可能になる。特に、oriPをベースとした発現ベクターの複製に必要な唯一のウイルスタンパク質であるEBNA−1は、その抗原をMHCクラスI分子に提示するために必要なプロセシングをバイパスする効率的な機構を発達させたため、細胞免疫応答を誘発しない(Levitskayaら、1997)。さらに、EBNA−1は、トランスで作用してクローン化遺伝子の発現を促進することができ、一部の細胞系において最大100倍のクローン化遺伝子の発現を誘導する(Langle−Rouaultら、1998;Evansら、1997)。最後に、このようなoriPをベースとした発現ベクターの製造は安価である。
ベクター内に含められる真核生物発現カセットは、好ましくは、タンパク質コード配列、介在配列を含むスプライスシグナル、および転写停止/ポリアデニル化配列に機能的に連結された真核生物転写プロモーターを含む(5’から3’方向に)。
「プロモーター」は、転写の開始および速度が制御される核酸配列の領域である制御配列である。プロモーターは、調節タンパク質および分子がRNAポリメラーゼおよび他の転写因子などに結合して核酸配列の特異的な転写を開始し得る遺伝子要素を含み得る。句「機能的に配置された」、「機能的に連結された」、「制御下」、および「転写制御下」は、プロモーターが、核酸配列の転写開始および/または発現を制御するべく、その配列に対して正確な機能位置および/または向きにあることを意味する。
特定の開始シグナルも、コード配列の効率的な翻訳に必要であり得る。これらのシグナルは、ATG開始コドンまたは隣接配列を含む。ATG開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルは、提供される必要があり得る。当業者であれば、容易にこれを決定し、必要なシグナルを提供できるであろう。望ましいコード配列のリーディングフレームが全インサートを確実に翻訳するためには、開始コドンが「インフレーム」でなければならないことは周知である。外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然または合成のいずれかであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素を含めることによって促進され得る。
ベクターは、マルチクローニング部位(MCS)を含み得、このMCSは、複数の制限酵素部位を含む核酸領域であり、どの制限酵素部位も、ベクターを消化するために標準的な組換え技術とともに使用され得る(例えば、参照により本明細書に組み入れられるCarbonelliら、1999、Levensonら、1998、およびCocea、1997を参照)。「制限酵素消化」は、核酸分子の特定の位置でのみ機能する酵素を用いた核酸分子の触媒的切断を指す。これらの制限酵素の多くは市販されている。このような酵素の使用は、当業者によって広く理解されている。しばしば、ベクターは、MCS内で切断して外因性配列のベクターへのライゲーションを可能にする制限酵素を使用して線状化または断片化される。「ライゲーション」とは、2つの核酸断片間にホスホジエステル結合を形成するプロセスを指し、これらの断片は互いに連続していてもよいし、連続していなくてもよい。制限酵素およびライゲーション反応を伴う技術は、組換え技術の分野の技術者には周知である。
殆どの転写された真核生物RNA分子は、一次転写物からイントロンを除去するためのRNAスプライシングを受ける。真核生物ゲノム配列を含むベクターは、タンパク質発現のための転写の適切なプロセシングを確実にするためにドナーおよび/またはアクセプタースプライシング部位を必要とし得る(例えば、参照により本明細書に組み入れられるChandlerら、1997を参照)。
本発明のベクターまたは構築物は、一般的に、少なくとも1つの終結シグナルを含む。「終結シグナル」または「ターミネーター」は、RNAポリメラーゼによるRNA転写物の特定の終結に関与するDNA配列から構成されている。したがって、特定の実施形態では、RNA転写物の産生を終了させる終結シグナルが企図される。ターミネーターは、望ましいメッセージのレベルを達成するためにin vivoで必要であり得る。
発現、特に真核生物発現では、典型的には、転写物の適切なポリアデニル化をもたらすためのポリアデニル化シグナルが含まれる。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の実施の成功にとって重要であるとは考えられていないが、任意のこのような配列が利用され得る。好ましい実施形態は、様々な標的細胞で十分に機能することが知られている便利なSV40ポリアデニル化シグナルまたはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含む。ポリアデニル化は、転写物の安定性を向上させ得る、または細胞質輸送を容易にし得る。
宿主細胞中でベクターを増殖させるために、ベクターは、複製部位の1つまたはそれより多い起点(しばしば「ori」と呼ばれる)、例えば、上記のEBVのoriPまたは遺伝子組換えoriPに対応する核酸配列を含み得、遺伝子組換えoriPは、分化プログラミングにおける機能が同様または上昇した、複製が開始される特定の核酸配列である。あるいは、上記の他の染色体外複製ウイルスの複製起点または自律複製配列(ARS)が利用され得る。
本発明の特定の実施形態では、本発明の核酸構築物を含む細胞は、発現ベクター内にマーカーを含めることによって、in vitroまたはin vivoで同定され得る。このようなマーカーは、同定可能な変化を細胞に付与して、発現ベクターを含む細胞の容易な同定を可能にし得る。一般的に、選択マーカーは、選択を可能にする特性を付与するものである。正の選択マーカーは、そのマーカーの存在がその選択を可能にするものであるのに対して、負の選択マーカーは、そのマーカーの存在がその選択を阻止するものである。正の選択マーカーの例は、薬剤耐性マーカーである。
本発明を用いたリプログラミングまたは分化プログラミングベクターの体細胞内への導入は、本明細書に記載された、または当業者に公知であろう細胞の形質転換のための核酸送達の任意の適切な方法を使用し得る。このような方法には、限定されるものではないが、ex vivoトランスフェクション(Wilsonら、1989、Nabelら、1989)、微量注入(HarlanおよびWeintraub、1985;参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,789,215号)を含む注入(それぞれ参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,994,624号、同第5,981,274号、同第5,945,100号、同第5,780,448号、同第5,736,524号、同第5,702,932号、同第5,656,610号、同第5,589,466号、および同第5,580,859号);エレクトロポレーション(参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,384,253号;Tur−Kaspaら、1986;Potterら、1984);リン酸カルシウム沈殿(GrahamおよびVan Der Eb、1973;ChenおよびOkayama、1987;Rippeら、1990);DEAE−デキストラン、続くポリエチレングリコールの使用(Gopal、1985);直接超音波負荷(Fechheimerら、1987);リポソーム媒介トランスフェクション(NicolauおよびSene、1982;Fraleyら、1979;Nicolauら、1987;Wongら、1980;Kanedaら、1989;Katoら、1991)、および受容体媒介トランスフェクション(WuおよびWu、1987;WuおよびWu、1988);微粒子銃(それぞれ参照により本明細書に組み入れられる国際出願第94/09699号および同第95/06128号;米国特許第5,610,042号、同第5,322,783号、同第5,563,055号、同第5,550,318号、同第5,538,877号、および同第5,538,880号);炭化ケイ素繊維を用いた攪拌(Kaepplerら、1990;それぞれ参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,302,523号および同第5,464,765号);Agrobacterium媒介形質転換(それぞれ参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,591,616号および同第5,563,055号);プロトプラストのPEG媒介形質転換(Omirullehら、1993;それぞれ参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,684,611および同第4,952,500号);乾燥/阻害媒介DNA取り込み(Potrykusら、1985)、およびこのような方法の任意の組み合わせなどによるDNAの直接送達が含まれる。これらのような技術の適用によって、細胞小器官(複数可)、細胞(複数可)、組織(複数可)、または生物(複数可)が安定的または一過性に形質転換され得る。
本発明の特定の実施形態では、核酸は、例えば、リポソームなどの脂質複合体の中に閉じ込められ得る。リポソームは、リン脂質二分子膜および内部の水性媒体によって特徴付けられる小胞構造物である。多重膜リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。これらは、リン脂質が過剰の水溶液中で懸濁される際に自然に生じる。脂質成分は、密閉構造物が形成される前に自己再構成され、脂質二分子膜間に水および溶解した溶質を閉じ込める(GhoshおよびBachhawat、1991)。また、Lipofectamine(Gibco BRL)またはSuperfect(Qiagen)と複合体を形成した核酸も企図される。使用されるリポソームの量は、使用される細胞はもちろん、リポソームの性質によって様々であり得、例えば、細胞1,000,000〜10,000,000に対してベクターDNA約5〜約20μgが企図され得る。
本発明の特定の実施形態では、核酸は、エレクトロポレーションによって細胞小器官、細胞、組織、または生物内に導入される。エレクトロポレーションは、細胞およびDNAの懸濁液の高電圧放電への曝露を含む。レシピエント細胞は、機械的創傷によって形質転換しやすくすることができる。また、使用されるベクターの量は、使用される細胞の性質によって様々であり得、例えば、細胞1,000,000〜10,000,000に対してベクターDNA約5〜約20μgが企図され得る。
本発明の他の実施形態では、核酸が、リン酸カルシウム沈殿を用いて細胞に導入される。ヒトKB細胞が、この技術を用いてアデノウイルス5DNAをトランスフェクトされた(GrahamおよびVan Der Eb、1973)。同様に、この方法で、マウスL(A9)、マウスC127、CHO、CV−1、BHK、NIH3T3、およびHeLa細胞が、ネオマイシンマーカー遺伝子をトランスフェクトされ(ChenおよびOkayama、1987)、そしてラット肝細胞が、様々なマーカー遺伝子をトランスフェクトされた(Rippeら、1990)。
別の実施形態では、核酸は、DEAE−デキストラン、次いでポリエチレングリコールを用いて細胞内に送達される。この方法で、レポータープラスミドが、マウス骨髄腫細胞および赤白血病細胞内に導入された(Gopal、1985)。
本発明のさらなる実施形態は、直接超音波負荷による核酸の導入を含む。LTK線維芽細胞は、超音波負荷によってチミジンキナーゼ遺伝子をトランスフェクトされた(Fechheimerら、1987)。
なおさらに、核酸は、受容体媒介送達ビヒクルによって標的細胞に送達され得る。これらは、標的細胞中で起こる受容体媒介エンドサイトーシスによる高分子の選択的な取り込みを利用している。様々な受容体の細胞型特異的分布から見て、この送達方法は、本発明にさらにある程度の特異性を付け加える。
微粒子銃技術は、少なくとも1つの細胞小器官、細胞、組織、または生物内に核酸を導入するために使用され得る(それぞれ参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,550,318号;同第5,538,880号;同第5,610,042号;および国際出願第94/09699号)。この方法は、細胞を殺傷することなくDNA被覆微粒子発射体(DNA−coated microprojectile)を細胞膜に突き通して細胞に侵入することを可能にする高速度までDNA被覆微粒子発射体を加速させる能力に依存する(Kleinら、1987)。当技術分野で公知の様々な微粒子銃技術が存在し、その多くが本発明に適用可能である。
本発明の特定の態様では、リプログラミングベクターが体細胞内に導入された後、細胞が、増殖のために培養され(任意選択で、トランスフェクト細胞を濃縮するために正の選択またはスクリーニングマーカーのようなベクター要素の存在について選択され)、リプログラミングベクターが、これらの細胞内でリプログラミング因子を発現し、細胞分裂と共に複製および分配する。これらの発現されたリプログラミング因子は、体細胞ゲノムをリプログラミングして、自立多能性状態を確立し、この最中またはベクターの存在の正の選択の除去後に、外因性遺伝子要素が徐々に消失する。これらの誘導多能性幹細胞は、多能性胚性幹細胞と実質的に同一であることが期待されているため、胚性幹細胞の特質に基づいてこれらの体細胞に由来する子孫から選択され得る。追加の負の選択ステップも、リプログラミングベクターDNAの非存在の検査または選択マーカーの使用によって、外因性遺伝子要素を本質的に含まないiPS細胞の選択を促進または助けるために利用され得る。
以前の研究で作製に成功したiPSCは、以下に示す点で天然単離多能性幹細胞(マウス胚性幹細胞mESCおよびヒト胚性幹細胞hESCなど)に著しく類似しているため、天然単離多能性幹細胞に対するiPSCの同一性、真正性、および多能性が裏付けられた。したがって、本発明に開示された方法で作製された誘導多能性幹細胞は、1つまたはそれより多い以下の胚性幹細胞の特質に基づいて選択され得る。
形態:iPSCは、ESCに形態学的に類似している。各細胞は、丸い形状、大きい核小体、および少ない細胞質を有し得る。iPSCのコロニーも同様に、ESCのコロニーに類似し得る。ヒトiPSCは、hESCに類似した縁が鋭く平坦な密集したコロニーを形成し、マウスiPSCは、mESCに類似し、hESCよりも平坦ではなく、より塊状のコロニーを形成する。
プロモーターの脱メチル化:メチル化は、メチル基のDNA塩基への転移、典型的には、CpG部位(シトシン/グアニン配列の近傍)のシトシン分子へのメチル基の転移である。遺伝子の広範なメチル化は、発現タンパク質の活性の抑制または発現を阻害する酵素の動員によって発現を阻害する。したがって、遺伝子のメチル化は、転写の抑制によって効率的に遺伝子を沈黙させる。Oct−3/4、Rex1、およびNanogを含む多能性関連遺伝子のプロモーターは、iPSC内で脱メチル化され、それらのプロモーター活性ならびにiPSC内の多能性関連遺伝子の活発な促進および発現を示し得る。
本発明のoriPをベースとしたプラスミドなどのリプログラミングベクターは、染色体外で複製し、何世代か後にはその存在が宿主細胞から消失する。しかし、外因性ベクター要素を本質的に含まない子孫細胞の追加の選択ステップは、このプロセスを促進し得る。例えば、子孫細胞のサンプルが、当技術分野で公知の外因性ベクター要素の存在または消失を検査するために抽出され得る(LeightおよびSugden、Molecular and Cellular Biology、2001)。
開示された方法を用いてリプログラミングベクターが体細胞に導入されてから、これらの細胞が、多能性を維持するのに十分な培地で培養され得る。本発明で作製された誘導多能性幹(iPS)細胞の培養は、霊長類多能性幹細胞、特に、米国特許出願第20070238170号および同第20030211603号に記載されている胚性幹細胞を培養するために開発された様々な培地および技術を用いることができる。
Press、207−246、1987)の抗体を使用して、免疫組織化学またはフローサイトメトリーによって同定され得る特徴的な抗原を有する。胚性幹細胞の多能性は、約0.5〜10×106の細胞を8〜12週齢の雄SCIDマウスの後肢筋肉内に注入することによって確認され得る。3つの胚葉のそれぞれの少なくとも1つの細胞型を示す奇形腫が発生する。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示される技術が、本発明者によって見出された、本発明の実施において十分に機能する技術を代表し、したがって、本発明の実施のための好ましい方法を構成すると見なされ得ることを、当業者であれば理解できよう。しかし、多くの変更が、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく開示された特定の実施形態で可能であり、なお同様または類似の結果が得られることを当業者であれば本開示から理解できよう。
本発明者らは、EBV(LindnerおよびSugden、2007を参照)に由来する約1,000塩基対離隔したDSおよびFRを含むoriP配列ならびにδUR1として知られている野生型EBNA1の短縮型(Kennedyら、2003では、DomNeg2と呼ばれている)を含むレシピエント骨格プラスミドを構築する(図3)。プラスミドは、現在は、δUR1の発現を最大にするイントロン配列も含む延長因子1a(EF1a)プロモーターによって駆動されるδUR1を発現させるために構築される。骨格プラスミドは、現在は、ハイグロマイシン耐性をコードする哺乳動物細胞の選択マーカーを含むように構築される:しかし、耐性マーカーの選択は、プラスミドが導入される細胞系の感受性に対応するように柔軟性を保つ。同様に、プラスミドは、原核細胞選択の薬剤耐性をコードし、この場合、プラスミドは、アンピシリン耐性をコードする。
リプログラミングの成功は、この大きい(15〜20キロ塩基)のプラスミドの哺乳動物細胞内への効率的な導入に左右される。本発明者らは、現在は、親油性(lypophyllic)をベーとした方法を利用してDNAをヒト線維芽細胞に導入している;しかし、この方法は、トランスフェクトされる細胞型によって変更される可能性が高い。例えば、本発明者らは、DNAプラスミドの造血細胞内への導入のためにエレクトロポレーションを選択する可能性が高いであろう。細胞が適切にトランスフェクトされたら、本発明者らは、これらの細胞を、トランスフェクト細胞に適した培地を用いて、放射線照射マウス胚線維芽細胞(MEF)のベッドまたは10cmの培養皿のマトリゲルに載せる。トランスフェクトの約6日後に、培地を、リプログラミング細胞専用の培地に換え、毎日または1日置きに交換する(Yuら、2007)。
以下に示す参照文献は、本明細書の記載を補足する例示的な手順または他の詳細を提供する程度まで、参照により本明細書に明確に組み入れられる。
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