JP2014195433A

JP2014195433A - Ｄ−アミノ酸の製造方法

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Publication number: JP2014195433A
Application number: JP2013073131A
Authority: JP
Inventors: 俊孝小田巻; Toshitaka Odamaki; 淳一南; Junichi Minami; 金忠清水; Kinchu Shimizu
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date: 2013-03-29
Filing date: 2013-03-29
Publication date: 2014-10-16
Anticipated expiration: 2033-03-29
Also published as: JP6139217B2

Abstract

【課題】本発明は、これまでＤ−アミノ酸を分泌することが知られていなかった細菌を用いてＤ−アミノ酸を製造するという新規な技術を提供することを課題とする。また、高効率でＤ−アミノ酸を製造する方法を提供することを課題とする。
【解決手段】Ｄ−アミノ酸の製造に、ビフィドバクテリウム属に属する細菌を用いる。特に、Ｌ体よりもＤ体の分泌量が極めて高い種を使用することにより、高効率にＤ−アミノ酸を製造することが可能となる。
【選択図】なし

Description

本発明は、Ｄ−アミノ酸の製造方法に関する。当該方法により製造されるＤ−アミノ酸は、医薬、医薬部外品、化粧料、食品、及び飼料等の組成物に配合して利用することができる。

アミノ酸にはＤ体、Ｌ体が存在するが、人間の体内に存在するアミノ酸はＬ体がほとんどであると考えられてきた。しかし測定技術の進歩により、いくつかのＤ−アミノ酸が人間の体内に存在すること、及び、Ｄ−アミノ酸の生理作用は、Ｌ−アミノ酸とは異なること等が明らかとなってきた。

Ｄ−アミノ酸に関する研究は、神経伝達やホルモン調節との関連といった生理学的、医学的な観点からのアプローチが主流であった。たとえば、Ｄ−セリンは、中枢神経系に偏在しており、ＮＭＤＡ受容体チャネルの分布と強い正の相関を示すことから、その作用が注目されていた。ＮＭＤＡ受容体は、その機能が高まると記憶、学習能力も高まることが知られている。そして、Ｄ−セリンまたはＤ−アラニンは、ＮＭＤＡ受容体活性を増強することが明らかとなっている（非特許文献１）。

Ｄ−アラニンは、血糖値の制御に関与すること（非特許文献２）、及び、コラーゲン産生促進作用を有することが知られている（特許文献１）。また、Ｄ−プロリンは紫外線傷害を軽減することから、紫外線が関与するシワを抑制するのみならず、医薬として白内障等への適用も期待されている（特許文献２）。

また、Ｄ−アミノ酸はヒトの皮膚（角層）に存在し、加齢とともにＤ−アスパラギン酸が減少すること、及びＤ−アスパラギン酸がＬ−アスパラギン酸より優れた美肌効果を有することが明らかとなっている（非特許文献３）。上記効果から、現在は、Ｄ−アスパラギン酸を豊富に含む製品が市販されている。

また、Ｄ−アスパラギン酸は、松果体実質細胞に存在し、精巣ライディッヒ細胞のテストステロン産生の亢進などに関与することから、生殖機能の改善に関与する可能性が示唆されている（非特許文献４）。

Ｄ−ヒスチジンは、食欲抑制による抗肥満作用を有することから、メタボリックコントロール等の体重コントロールに使用することが期待されている（非特許文献５）。

一方、近年は、Ｄ−アミノ酸に関して、食品分野からのアプローチも始まっている。遊離のアミノ酸の味は、Ｌ体とＤ体とでは大きく異なることが知られているが、Ｌ体と同様にＤ体も風味改良剤として使用し得る（特許文献３）。そして、チーズ、ヨーグルト、黒酢又は日本酒等の発酵食品には、Ｄ−アミノ酸が豊富に含まれており、発酵食品の旨みの一役を担っていると考えられている。

非特許文献６は、生措造りの日本酒は、含有されるＤ−アミノ酸濃度が高い傾向があり、それらＤ−アミノ酸は日本酒の旨味や総合評価を高めること、及び、それらＤ−アミノ酸は生措由来の乳酸菌が生産していることを、明らかにしている。

上記のように、Ｄ−アミノ酸は、生理・生化学、食品学などに関係する研究から、さまざまな用途が期待されており、食品、医薬品などの分野における新しい機能成分として使
用されると考えられている。しかし、Ｄ−アミノ酸は光学活性を有するアミノ酸であり、光学的に純度の高いＤ−アミノ酸の製造は困難であることが知られている。

これまでに、ビフィズス菌や乳酸菌を含む細菌の細胞内には、多くのＤ−アミノ酸が存在することが報告されている（非特許文献７）。そこで、当該細菌または当該細菌が産生する酵素を用いて、Ｄ−アミノ酸を製造する方法が知られているが（特許文献４、５）、細菌細胞内に存在することが報告されているＤ体の種類は限られており、また、Ｌ体に対するＤ体の比率も高くないため、効率がいいとはいえない。さらに、Ｄ−アミノ酸は、医薬、医薬部外品、化粧料、食品、及び飼料等の材料として使用され得ることから、高純度のものが求められているところ、上記の方法では、細菌由来の不純物が少なからず混入する可能性があった。

国際公開第２０１１／０４０３６３号国際公開第２０１０／１１３９２５号国際公開第２０１２／０５７０８４号特開２０１０−１５４７７４号公報特開平１１−１１３５９２号公報特開２００５−００３５５８号公報

松井隆明，近畿大医誌, １９９６年，第２１巻，第１号，ｐ．１１５−１２４ Morikawa A, et al., Biochem Biophys Res Commun, 2007, 355(4):872-6 ヘルスｐｒｏニュースｆｒｏｍ日経ヘルス、"Ｄ−アミノ酸に美肌効果、資生堂が発表角層と真皮内部で働き、水分量向上"、［online］、2010年6月25日、［平成25年2月28 日検索］、インターネット〈URL：http://nhpro.nikkeibp.co.jp/nh/pro/〉 Macchia G, et al., "DL-Aspartic acid administration improves semen quality in rabbit bucks.", Animal Reproduction Science, 2010, 118(2-4):337-343 山本祐司，「Ｄ型アミノ酸の生体内における生理機能の解析」，浦上財団研究報告書，２００７年，Ｖｏｌ．１５，ｐ．３３−４２郷上佳孝ら，Trace Nutrients Research 29, 2012, 1-6 HANS BRUCKNER, et al., CHIRALITY, 1993, 5:385-392 Kenji Hamase, et al., Journal of Chromatography A, 2010, Vol.1217, 1056-1062 浜瀬健司ら，「哺乳類体内微量Ｄ−アミノ酸の選択的分析法の開発」，分析化学，２００４年，Ｖｏｌ．５３，Ｎｏ．７，ｐ．６７７−６９０

本発明は、これまでＤ−アミノ酸を分泌することが知られていなかった細菌を用いてＤ−アミノ酸を製造するという新規な技術を提供することを課題とする。また、高効率でＤ−アミノ酸を製造する方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、ビフィドバクテリウム
属に属する細菌がＤ−アミノ酸を分泌すること、及び、ビフィドバクテリウム属に属する細菌の中には、Ｌ体よりもＤ体の分泌量が極めて高い種が存在することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下の事項に関する。
［１］ビフィドバクテリウム属に属する細菌を培地で培養する工程、及び、
前記培養後の培地中に分泌されたＤ−アミノ酸と細菌とを分離し、かつ、Ｄ−アミノ酸を含む画分を培地から回収する工程、
を含む、Ｄ−アミノ酸の製造方法。
［２］前記Ｄ−アミノ酸を含む画分の培地からの回収を、培地から細菌を除去した後に行う、前記［１］に記載の製造方法。
［３］前記Ｄ−アミノ酸を含む画分が、以下の（１）の関係式を満たすものである前記［１］または［２］に記載の製造方法。
［Ｄ−アミノ酸分泌量］／（［Ｄ−アミノ酸分泌量］＋［Ｌ−アミノ酸分泌量］）≧０．５・・・・・・（１）
［４］前記Ｄ−アミノ酸が、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−セリン、およびＤ−アラニンからなる群より選択される一または複数のＤ−アミノ酸である前記［１］〜［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］前記ビフィドバクテリウム属に属する細菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガム種、ビフィドバクテリウム・ブレーベ種、およびビフィドバクテリウム・ビフィダム種からなる群より選択される一または複数の細菌である、前記［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］前記［１］〜［５］のいずれかに記載の製造方法により製造されるＤ−アミノ酸を含む画分からなる組成物。

本発明によれば、これまでＤ−アミノ酸を分泌することが知られていなかったビフィドバクテリウム属に属する細菌を用いて、Ｄ−アミノ酸を製造することができる。
また、好ましい態様では、［Ｄ−アミノ酸分泌量］／（［Ｄ−アミノ酸分泌量］＋［Ｌ−アミノ酸分泌量］）の比率が高いビフィドバクテリウム属細菌を使用することにより、高効率でＤ−アミノ酸を製造する方法が提供される。
さらに、本発明において使用される細菌は、長い食経験のあるビフィドバクテリウム属細菌、所謂ビフィズス菌であるため、本発明により製造されるＤ−アミノ酸は、安全性が高く、医薬、医薬部外品、化粧料、飲食品、飼料等の組成物に好適に用いることができる。

一次元目の逆相カラムにより分離されたセリン（Ｌ体とＤ体が混合した状態）のピークを含むクロマトグラムである。縦軸は蛍光の検出強度を表しており、横軸は経過時間を表している。二次元目の光学異性体分離カラムにより分離された、Ｄ−セリンとＬ−セリンのピークを含むクロマトグラムである。縦軸は蛍光の検出強度を表しており、横軸は経過時間を表している。

以下、本発明の好ましい実施態様について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施態様に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。

ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属細菌（以下、「ビフィズス菌（bifidobac
teria）」ともいう。）は、ヒトの腸管内で形成される腸内菌叢の優勢菌種の一つである
。健常な正常者においてはビフィズス菌が腸内細菌の５〜２０％存在している。
ビフィズス菌は、乳酸と酢酸を２：３の割合で産生し、それらの酸によって大腸の蠕動運動を促進させ、大腸菌やウエルッシュ菌などの有害菌を抑制させ、さらに腐敗産物を抑制するなど便性を適正に保っているものと考えられている。ビフィズス菌は、上記整腸作用の他に、免疫増強作用、発ガン抑制作用等を有することが知られている。このため、近年、生活者の健康志向の高まりと共に、ビフィズス菌入り発酵乳等の、生きているビフィズス菌を含む食品への需要が高まっている。

ビフィズス菌の菌体内には、Ｄ−アミノ酸が存在することは知られているが（非特許文献７）、ビフィズス菌が培地中へとＤ−アミノ酸を分泌すること、さらに、特定の種において、Ｌ体よりもＤ体の分泌量が極めて高いことは、これまで知られていなかった。

本発明において使用されるビフィドバクテリウム属細菌としては、特に制限されないが、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）種、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）種、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）種、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）種、及び、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスに再分類されている）種が挙げられる。
これらの細菌は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110, United States of America）から購入
することができる。

上記ビフィドバクテリウム属細菌の中でも、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ１５７０７（基準株）、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣＢＡＡ−９９９、ビフィドバクテリウム・ブレーベＦＥＲＭＢＰ−１１１７５、ビフィドバクテリウム・ブレーベＮＩＴＥＢＰ−１２５３、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＮＩＴＥＢＰ−１２５２、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＣＣ１０９２を使用することが好ましい。

ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ１５７０７、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣＢＡＡ−９９９は、前記アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手することができる。

ビフィドバクテリウム・ブレーベＦＥＲＭＢＰ−１１１７５は、２００９年８月２５日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（現独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター：〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、ブダペスト条約に基づき国際寄託されている（受託番号：ＦＥＲＭ
ＢＰ−１１１７５）。

ビフィドバクテリウム・ブレーベＮＩＴＥＢＰ−１２５３は、２０１２年２月２３日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、ブダペスト条約に基づき国際寄託されている（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−１２５３）。

ビフィドバクテリウム・ビフィダムＮＩＴＥＢＰ−１２５２は、２０１２年２月２３日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、ブダペスト条約に基づき国際寄託されている（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−１２５２）。

使用するビフィドバクテリウム属細菌は、製造するＤ−アミノ酸の種類によって選択す
ることが可能である。たとえば、Ｌ−アミノ酸の混入量を問わず、Ｄ−アミノ酸を大量に得ることを目的とする場合には、ビフィドバクテリウム属細菌の中でも、分泌するＤ−アミノ酸量が特に多い種を選択することが好ましい。

一方、Ｌ−アミノ酸の混入を極力抑えて、Ｄ−アミノ酸のみを得ることを目的とする場合には、Ｌ体よりもＤ体の分泌量が高い種を使用することが好ましい。
たとえば、［Ｄ−アミノ酸分泌量］／（［Ｄ−アミノ酸分泌量］＋［Ｌ−アミノ酸分泌量］）の式により算出される値が、０．５以上、好ましくは０．８以上、より好ましくは１．０となるビフィドバクテリウム属細菌を使用することにより、高効率にＤ−アミノ酸を製造することが可能となる。上記式に適用するアミノ酸分泌量は、式中の分母における分泌量の単位と、式中の分子における分泌量の単位とが同じであれば、どのような単位で表される値であってもよい。

Ｄ−アミノ酸の分泌量及び分泌比率の観点から、ビフィドバクテリウム・ロンガム種、ビフィドバクテリウム・ブレーベ種、ビフィドバクテリウム・ビフィダム種を使用することが好ましい。

本発明において使用される培地としては、ビフィドバクテリウム属細菌を培養可能なものであればよく、公知の培地のなかから適宜選択できる。具体的には、ＭＲＳ（de Man, Rogosa Sharpe）培地、ＡＢＣＭ（anaerobic bacterial culture medium）培地、ＲＣＡ
（Reinforced clostridial agar）培地、ＢＬ（Blood Liver）培地、ＴＯＳプロピオン酸培地、ＧＡＭ（Gifu Anaerobic Medium）培地、ＥＧ（Eggerth-Gagnon）培地等が挙げら
れる。

本発明における培養工程としては、ビフィドバクテリウム属細菌を培養可能な公知の培養条件を採用することができる。たとえば、２５〜４５℃で嫌気的に培養することが可能であるが、３０〜４２℃で、特に３７〜４２℃で培養することにより、ビフィドバクテリウム属細菌が良好に増殖するので好ましい。培養時間は、１２〜７２時間の間で増殖速度を観察しながら適宜調節可能であるが、１６〜４８時間、特に１６〜２４時間であるとき、ビフィドバクテリウム属細菌の増殖が定常期に達し、Ｄ−アミノ酸の産生量が最大に達するので好ましい。

上記のような培養工程により培養した培養液から、培地中に分泌されたＤ−アミノ酸と細菌とを分離し、かつ、Ｄ−アミノ酸を含む画分を培地から回収する。Ｄ−アミノ酸と細菌との分離、及び培地からのＤ−アミノ酸を含む画分の回収は、同時に行ってもよく、また、培地から細菌を除去した後に、培地からＤ−アミノ酸を含む画分を回収してもよい。

培地から細菌を分離する工程としては、例えば、膜によるろ過、遠心分離等が挙げられる。膜は、平膜及び中空糸膜（ホローファイバー）のいずれでもよい。中空糸膜（ホローファイバー）を使用してろ過を行った場合、Ｄ−アミノ酸と細菌との分離、及びＤ−アミノ酸を含む画分の培地からの回収を、同時に行うことができる。

また、細菌を除去した培地からＤ−アミノ酸を含む画分を回収する工程としては、Ｌ−アミノ酸について知られている方法を採用することができ、たとえば、イオン交換、ゲルろ過、逆相等の各種クロマトグラフィー、塩析、晶析、溶媒沈殿などの方法が挙げられる。これらの方法は、目的物であるＤ−アミノ酸の種類によって、適宜選択することができる。クロマトグラフィーは、低圧であっても高圧（HPLC）であってもよい。

Ｄ−アミノ酸を含む画分は、Ｄ−アミノ酸の効果を損なわず、かつ、菌体を含まない限り特に制限されず、培地成分を含んでいてもよく、完全に又は部分的に精製したものであ
ってもよい。Ｄ−アミノ酸の精製は、上記のＤ−アミノ酸を含む画分を回収する方法を適宜組み合わせることによって行うことができる。
Ｄ−アミノ酸を含む画分の性状は特に制限されず、液体であってもよく、凍結乾燥等によって得られる粉体であってもよい。

Ｄ−アミノ酸を含む画分は、Ｄ−アミノ酸の効果を損なわない限り、Ｌ−アミノ酸を含んでいてもよいが、公知の分離精製方法を使用して、Ｄ−アミノ酸のみを分離精製してもよい。Ｄ−アミノ酸とＬ−アミノ酸の分離は、例えば、ジアステレオマー法、酵素法、またはクロマトグラフィー等を適宜選択することによって、またはそれらの方法を組み合わせることによって、行うことができる（特許文献６、非特許文献８、非特許文献９）。
当該クロマトグラフィーとしては、光学異性体を分離するための方法として知られているものを適宜選択すればよく、たとえば、固定相に結合させた光学活性なコンポーネントとジアステレオメリック複合体を形成させることにより、目的とするエナンチオマーを分取するキラル固定相法、移動相溶媒に適当な光学活性化合物を添加することにより行うキラル移動相法、エナンチオマーに対し適当な光学活性誘導体化試薬を反応させてジアステレオマーに変換してから通常の分離系に供するキラル誘導体化法等を適宜組み合わせることによって、Ｄ−アミノ酸の分離精製を行うことができる。

本発明により製造されるＤ−アミノ酸は、Ｄ−アミノ酸が有する生理作用を期待するのみならず、矯味等の様々な目的で、医薬、医薬部外品、化粧料、飲食品、飼料等の組成物に配合することができる。

本発明により製造されるＤ−アミノ酸は、一態様として、医薬、医薬部外品又はそれらの有効成分として利用することができ、Ｄ−アミノ酸をそのまま、又はＤ−アミノ酸を製剤学的に許容される製剤担体と組み合わせて、経口的にまたは経皮的にヒトを含む哺乳動物に投与することができる。

医薬又は医薬部外品の製剤形態は特に限定されず、錠剤（糖衣錠、腸溶性コーティング錠、バッカル錠を含む）、散剤、カプセル剤（腸溶性カプセル、ソフトカプセルを含む。）、顆粒剤（コーティングしたものを含む。）、丸剤、トローチ剤、封入リポソーム剤、液剤、軟膏剤、又はこれらの製剤学的に許容され得る徐放製剤等を例示することができる。

製剤化にあたっては、製剤成分として通常の製剤に汎用される担体、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤、溶剤等の添加剤を使用できる。また、Ｄ−アミノ酸は、他の医薬又は医薬部外品と併用されてもよい。
併用する医薬又は医薬部外品は、Ｄ−アミノ酸を含む製剤中に有効成分の一つとして含有させてもよいし、製剤中には含有させずに別個の製剤として組み合わせて商品化してもよい。

上記の医薬又は医薬部外品に用いる担体及び賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、白糖、マンニトール、馬鈴薯澱粉、トウモロコシ澱粉、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、結晶セルロース、カンゾウ末、ゲンチアナ末等を、結合剤としては例えば澱粉、ゼラチン、シロップ、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等を、それぞれ例示することができる。

また、崩壊剤としては、澱粉、寒天、ゼラチン末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、及びアルギン酸ナトリウム等を例示することができる。

更に、滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、水素添加植物油、及びマクロゴール等、着色剤としては医薬品に添加することが許容されている赤色２号、黄色４号、及び青色１号等を例示することができる。

錠剤及び顆粒剤は、必要に応じ、白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、精製セラック、ゼラチン、ソルビトール、グリセリン、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、フタル酸セルロースアセテート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルメタクリレート、及びメタアクリル酸重合体等により被膜することもできる。

化粧料に配合する場合は、Ｄ−アミノ酸の効果を損なわない範囲において、通常の化粧料に使用され得る添加剤等を配合し、各種の形態で調製することができる。例えば、化粧水、クリ−ム、ファンデ−ション、乳液等の皮膚に適用される化粧品として、または、入浴剤等の皮膚に適用する形態とすることが可能である。

飲食品に配合する場合は、Ｄ−アミノ酸の効果を損なわず、経口摂取できるものであれば形態や性状は特に制限されず、通常飲食品に用いられる原料を用いて通常の方法によって製造することができる。また、本発明において使用されるビフィドバクテリウム属に属する細菌は、長い食経験のある所謂ビフィズス菌であるため、細菌を含んだままの画分をそのまま配合することも可能である。

上記のような食品としては、液状、ペースト状、ゲル状固体、粉末等の形態を問わず、錠菓、流動食等のほか、例えば、パン、マカロニ、スパゲッティ、めん類、ケーキミックス、から揚げ粉、パン粉等の小麦粉製品；即席めん、カップめん、レトルト・調理食品、調理缶詰め、電子レンジ食品、即席スープ・シチュー、即席みそ汁・吸い物、スープ缶詰め、フリーズ・ドライ食品、その他の即席食品等の即席食品類；農産缶詰め、果実缶詰め、ジャム・マーマレード類、漬物、煮豆類、農産乾物類、シリアル（穀物加工品）等の農産加工品；水産缶詰め、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品、水産珍味類、つくだ煮類等の水産加工品；畜産缶詰め・ペースト類、畜肉ハム・ソーセージ等の畜産加工品；加工乳、乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料類、チーズ、アイスクリーム類、調製粉乳類、クリーム、その他の乳製品等の乳・乳製品；バター、マーガリン類、植物油等の油脂類；しょうゆ、みそ、ソース類、トマト加工調味料、みりん類、食酢類等の基礎調味料；調理ミックス、カレーの素類、たれ類、ドレッシング類、めんつゆ類、スパイス類、その他の複合調味料等の複合調味料・食品類；素材冷凍食品、半調理冷凍食品、調理済冷凍食品等の冷凍食品；キャラメル、キャンディー、チューインガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、米菓子、豆菓子、デザート菓子、ゼリー、その他の菓子などの菓子類；炭酸飲料、天然果汁、果汁飲料、果汁入り清涼飲料、果肉飲料、果粒入り果実飲料、野菜系飲料、豆乳、豆乳飲料、コーヒー飲料、お茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、スポーツ飲料、栄養飲料、アルコール飲料、その他の嗜好飲料等の嗜好飲料類、ベビーフード、ふりかけ、お茶潰けのり等のその他の市販食品等；育児用調製粉乳；経腸栄養食；機能性食品（特定保健用食品、栄養機能食品）等が挙げられる。

さらに、Ｄ−アミノ酸は、飼料中に含有させることも可能である。
飼料の形態としては特に制限されず、例えば、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦、マイロ等の穀類；大豆油粕、ナタネ油粕、ヤシ油粕、アマニ油粕等の植物性油粕類；フスマ、麦糠、米糠、脱脂米糠等の糠類；コーングルテンミール、コーンジャムミール等の製造粕類；魚粉、脱脂粉乳、ホエイ、イエローグリース、タロー等の動物性飼料類；トルラ酵母、ビール酵母等の酵母類；第三リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の鉱物質飼料；油
脂類；単体アミノ酸；糖類等を配合することにより製造できる。飼料の形態としては、例えば、ペットフード、家畜飼料、養魚飼料等が挙げられる。

以下に、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

〔実施例１〕
ビフィドバクテリウム属に属する細菌として、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣＢＡＡ−９９９、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ１５７０７（以上、ＡＴＣＣより入手）、ビフィドバクテリウム・ブレーベＦＥＲＭＢＰ−１１１７５、ビフィドバクテリウム・ブレーベＮＩＴＥＢＰ−１２５３、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＮＩＴＥＢＰ−１２５２、及びビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＣＣ１０９２を、それぞれＭＲＳ（de Man Rogasa Sharpe）培地（Ｄｉｆｃｏ（登録商標）製品、ベクトン・ディッキンソン社製）3 mL で、嫌気的に37℃で一晩（16時間）培養した。培地は0.22μmフィルターにてろ過して菌体を除去し、得られた培養上清を冷蔵にて保存した。
なお、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＣＣ１０９２は、出願人によりヒト乳児の糞便中から単離された株を、本実施例に使用した。

上記培養上清中のアミノ酸は、4-Fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiaxole(NBD-F)を用いて蛍光誘導体とし、これをHPLCにて分析した。具体的には、培養上清 1 mLを減圧下にお
いて風乾させ、得られた固形分をホウ酸ナトリウム緩衝液（pH8.2）20μLに溶解した。次いで、5μLの40 mM NBD-F/アセトニトリル溶液を加え、60℃にて2分間インキュベートし
、2%トリフルオロ酢酸水溶液75μLに溶解した反応液2μLを、HPLCに供した。

HPLCは、主に、逆相マイクロカラムを用いる一次元目と、光学異性体分離カラムを用いる二次元目とにより構成されるHPLCシステムにより行われた。
使用したＨＰＬＣシステム（NANOSPACE SI-2 シリーズ, 資生堂, 日本）の構成を以下
に示す。
３０１０型脱気装置、
３２０１型ポンプ２台、
３０３３型オートサンプラー、
３００４型カラムオーブン、
３０１３型蛍光検出器２台、
３０１２型カラム選択ユニット、マルチループユニット（9ループ、1ループは長さ 750
mm x 内径 0.5 mm、ループ当たり150μL容量）、1入力-10出力バルブ（C5-2340 EMTD, Valco Instruments、米国）。
データ処理プログラムのEzChrom Elite Clientは、検出器の反応をモニタリングするのに使用し、カラム選択ユニットとマルチループユニットは、KSAAバルブ制御システム（資生堂）を用いて制御した。

一次元目においては、microbore-monolithic ODSカラム（長さ 1000 mm x 内径 0.53 mm、シリカゲル充填、資生堂製）を、45℃に維持して使用した。移動相には、6%アセトニ
トリル、0.06%トリフルオロ酢酸を含む水溶液を、25μL毎分の流速で用いた。

二次元目においては、narrowbore-Sumichiral OA-2500S 光学異性体分離カラム（長さ 250 mm x 内径 1.5 mm、住化分析化学、日本）を、25℃に維持して使用した。
Asn、Serの移動相には、5 mMクエン酸加・メタノール／アセトニトリル混合液（25：75混合液）を、流速200μL毎分で使用した。
Glu、Aspの移動相には、2.5 mM クエン酸加・メタノール／アセトニトリル混合液（25
：75混合液）を、流速200μL毎分で使用した。
Hisの移動相には、0.5 mM クエン酸加・メタノールを、流速200μL毎分で使用した。
また、Proには5 mMクエン酸加・メタノールを流速200μL毎分で、Alaには5 mMクエン酸加・メタノール／アセトニトリル混合液（50：50混合液）を流速200μL毎分で使用した。

上記誘導体化したアミノ酸を含む反応液を、一次元目における逆相マイクロカラムに供した。
そして、一次元目に設置した蛍光検出器によって、４７０ｎｍの励起波長によるＮＢＤ誘導体化アミノ酸の蛍光を５３０ｎｍにて検出し、検出したアミノ酸を含む画分（Ｄ体とＬ体の混合物の状態：図１）を、カラムスイッチングにより二次元目における光学異性体分離カラムへ導入して分離し、二次元目に設置した蛍光検出器によってＤ体とＬ体を定量した（図２）。
Ｄ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸の定量結果をそれぞれ表１に示す。

表１は、各々の細菌培養後における培地中のアミノ酸含有量から、培養前のＭＲＳ培地に含まれるアミノ酸含有量を差し引くことにより算出した、アミノ酸分泌量を示す。
分泌量がマイナスの場合は、培養中に細菌が分泌したアミノ酸量よりも、培地中のアミノ酸が細菌により消費された量の方が多かったことを示し、プラスの場合は、培地中のアミノ酸が細菌により消費された量よりも、培養中に細菌が分泌したアミノ酸量が多かったことを示す。

表１は、ビフィドバクテリウム属細菌が、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−セリン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−アラニンを分泌したことを示している。

以下の表２は、表１の結果から、各々の細菌におけるＤ−アミノ酸の分泌比率を、［Ｄ
−アミノ酸分泌量］／（［Ｄ−アミノ酸分泌量］＋［Ｌ−アミノ酸分泌量］）の式で計算した結果である。但し、Ｄ−アミノ酸分泌量またはＬ−アミノ酸分泌量がマイナスの値である場合には、分泌量は０として計算を行った。

ビフィドバクテリウム・ロンガムでは、Ｄ−アスパラギン及びＤ−プロリンの分泌比率が０．５以上であり、Ｄ−アミノ酸が高効率に分泌されていることが判明した。
ビフィドバクテリウム・ブレーベでは、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−アスパラギン及びＤ−アラニンの分泌比率が０．５以上であり、Ｄ−アミノ酸が高効率に分泌されていることが判明した。
ビフィドバクテリウム・ビフィダムでは、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−アスパラギン及びＤ−セリンの分泌比率が０．５以上であり、Ｄ−アミノ酸が高効率に分泌されていることが判明した。

本発明において製造されるＤ−アミノ酸は、Ｄ−アミノ酸の生理作用を期待して、又は、矯味等の目的で、医薬、医薬部外品、化粧料、食品、又は飼料等に幅広く使用可能である。
また、本発明の製造方法において、特定の種を採用することにより、高効率でＤ−アミノ酸を製造することが可能である。

１Ｄ体とＬ体が混合した状態のセリンのピークを示す。
２Ｄ−セリンのピークを示す。
３Ｌ−セリンのピークを示す。

Claims

ビフィドバクテリウム属に属する細菌を培地で培養する工程、及び、
前記培養後の培地中に分泌されたＤ−アミノ酸と細菌とを分離し、かつ、Ｄ−アミノ酸を含む画分を培地から回収する工程、
を含む、Ｄ−アミノ酸の製造方法。
前記Ｄ−アミノ酸を含む画分の培地からの回収を、培地から細菌を除去した後に行う、請求項１に記載の製造方法。
前記Ｄ−アミノ酸を含む画分が、以下の（１）の関係式を満たすものである請求項１または２に記載の製造方法。
［Ｄ−アミノ酸分泌量］／（［Ｄ−アミノ酸分泌量］＋［Ｌ−アミノ酸分泌量］）≧０．５・・・・・・（１）
前記Ｄ−アミノ酸が、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−セリン、およびＤ−アラニンからなる群より選択される一または複数のＤ−アミノ酸である請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
前記ビフィドバクテリウム属に属する細菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガム種、ビフィドバクテリウム・ブレーベ種、およびビフィドバクテリウム・ビフィダム種からなる群より選択される一または複数の細菌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法により製造されるＤ−アミノ酸を含む画分からなる組成物。