JP2011087486A - カテキン代謝物の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】微生物変換による簡便な５−フェニル―４―ハイドロキシ吉草酸および／または５−フェニルγ−バレロラクトンの新規な製造方法の提供。
【解決手段】出発原料であるカテキン類あるいはカテキン誘導体を、選択的に５−フェニル―４―ハイドロキシ吉草酸および／または５−フェニルγ−バレロラクトンに変換できる微生物の培養菌体またはその培養菌体の調製物の存在下、出発原料を嫌気的にインキュベーション処理し、目的の化合物を極めて簡便に製造する方法。尚、出発原料としてカテキン誘導体を使用する場合は微生物としてはユウバクテリウム属あるいはクロストリジウム属のいずれかに属するものを挙げることが出来る。出発原料としてカテキン類を使用する場合はこれらの微生物に加え、さらにエガーテラ属あるいはアドラークルーツィア属に属する微生物を使用する必要がある。
【選択図】なし

Description

本発明は、抗炎症作用やがん抑制作用が期待されるカテキン類の代謝産物であるフェニル−４−ハイドロキシ吉草酸およびフェニルγ−バレロラクトンの生物学的変換による製造方法、該製造方法で得られる組成物、該組成物を含有する口腔適用対象物及び上記化合物に変換する微生物に関する。

式(II)及び式(III)で表される化合物は、カテキン類を経口摂取したときに尿から検出されるカテキン類の代謝産物として知られている。最近、茶カテキン類の代謝産物である式(III)に示される化合物の一つである５−（３’，４’，５’−トリハイドロキシフェニル）γ−バレロラクトンに抗炎症作用やがん抑制作用が期待できるという報告がなされている（非特許文献１）。このようなことから、主要なカテキン類の代謝物である式(II)及び式(III)に示される化合物の生理活性機能が注目されている。

従来、式(II)及び式(III)に示される化合物は、カテキン類の代謝産物として同定されているだけであったため、その製造方法に関する知見はほとんどなく、先に示した非特許文献１に、式(III)に示される化合物である５−（３’，４’，５’−トリハイドロキシフェニル）γ−バレロラクトンおよび５−（３’，４’−ジハイドロキシフェニル）γ−バレロラクトンの化学合成法が開示されているに過ぎない。しかし、この化学合成法では合成のステップが多く煩雑であるばかりでなく、合成した化合物がラセミ体であるという欠点を有していた。

Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１５， ８７３−８７６，２００５．

そこで、本発明は、下記式(I)に示すカテキン誘導体を選択的に下記式(II)および／または式（III）の化合物に変換できる微生物を見出すとともに、該微生物を用いて極めて簡便に式(II)及び式(III)の化合物を製造する方法を見出し、本発明を完成した。

すなわち、請求項１記載の本発明は、
式（I）
（式中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ独立に水酸基（ＯＨ）または水素（Ｈ）を表す）
に示すカテキン誘導体を資化して
式（II）
（式中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ独立に水酸基（ＯＨ）または水素（Ｈ）を表す）
に示す５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸および／または
式（III）
（式中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ独立に水酸基（ＯＨ）または水素（Ｈ）を表す）で表される５−フェニルγーバレロラクトンを生成する微生物を、式（I）に示すカテキン誘導体含有物に作用させることを特徴とする式（II）で表される５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸および／または式（III）で表される５−フェニルγ−バレロラクトン含有物の製造方法を提供するものである。なお本発明においては式（II）で示される５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸は、その塩をも包含し、例えば式（II）化合物のナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などを挙げることが出来る。

また、請求項２記載の本発明は、式（I）に示す化合物を資化して、式(II)に示す５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸および／または式(III)で表される５−フェニルγ−バレロラクトンを生成する微生物を、式(I)に示すカテキン誘導体含有物の存在下嫌気性条件で培養することを特徴とする式(II)で表される５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸および／または式(III)で表される５−フェニルγ−バレロラクトン含有物の製造方法である。

請求項３記載の本願発明は、式（I）に示す化合物を資化して、式（II）に示す５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸および／または式（III）で表される５−フェニルγ−バレロラクトンを生成する微生物が、ユウバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ） 属あるいはクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌から選ばれる少なくとも1種である請求項１乃至２記載の製造方法である。

請求項４記載の本発明は、式（I）に示す化合物を資化して式(II)に示す５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸および／または式（III）で表される５−フェニルγ−バレロラクトンを生成する微生物が、ユウバクテリウム・プラウティＡＴＣＣ２９８６３（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｌａｕｔｉｉ ＡＴＣＣ２９８６３）、ユウバクテリウム・プラウティＭＴ４２（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｌａｕｔｉｉ ＭＴ４２，ＦＥＲＭ Ｐ−２１７６５）あるいはクロストリジウム・オルビシンデンスＡＴＣＣ４９５３１（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｏｒｂｉｓｃｉｎｄｅｎｓ ＡＴＣＣ４９５３１）から選ばれる少なくとも1種である請求項１乃至３記載の製造方法である。

請求項５記載の本発明は、
式（IV）
（式中、Ｒは水酸基（ＯＨ）または水素（Ｈ）を表す）に示すカテキン類を資化して、式（I)に示すカテキン誘導体を生成する能力を有するエガーテラ（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ）属および／またはアドラークルーツィア（Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ）属の微生物を、式（IV）に示すカテキン類に作用させて、式（I)に示すカテキン誘導体を生成させることを特徴とする請求項１乃至４記載の式（II）で表される５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸および／または式（III）で表される５−フェニルγ−バレロラクトン含有物の製造方法である。

請求項６記載の本発明は、式（IV）に示すカテキン類を資化して、式（I)に示すカテキン誘導体を生成する能力を有する微生物が、エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ ｌｅｎｔａ ＪＣＭ９９７９）およびアドラークルーツィア・エクオーリファシエンスＭＴ４ｓ―５（Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ ｅｑｕｏｌｉｆａｃｉｅｎｓ ＭＴ４ｓ−５，ＦＥＲＭ Ｐ−２１７３８）である請求項１乃至５記載の式（II）で表される５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸および／または式（III）で表される５−フェニルγ−バレロラクトン含有物の製造方法である。
尚、アドラークルーツィア・エクオーリファシエンス（Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ ｅｑｕｏｌｉｆａｃｉｅｎｓ）は新規微生物であり、現在、ＭＴ４ｓ−５株と１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の相同性が９９．９％あるアドラークルーツィア・エクオーリファシエンス（Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ ｅｑｕｏｌｉｆａｃｉｅｎｓ）と同様に、ＭＴ４ｓ−５と１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の相同性が９９．９％あるアサッカロバクター・セラタス（Ａｓａｃｃｈａｒｏｂａｃｔｏｒｅ ｃｅｌａｔｕｓ）が別々に新種提案されている。従って、アドラークルーツィア・エクオーリファシエンス（Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ ｅｑｕｏｌｉｆａｃｉｅｎｓ）とアサッカロバクター・セラタス（Ａｓａｃｃｈａｒｏｂａｃｔｏｒｅ ｃｅｌａｔｕｓ）を同一菌種とみなす。

請求項７記載の本発明は、請求項１乃至６記載の製造方法によって得られる式(II)で表される５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸含有物のｐＨを３以下に調整することによって、式(II)の化合物を式（III）に示す５−フェニルγ−バレロラクトンに変換することを特徴とする式（III）で表される５−フェニルγ−バレロラクトン含有物の製造方法である。

請求項８記載の本発明は、請求項１乃至６記載の製造方法によって得られる式(III)で表される５−フェニルγ−バレロラクトン含有物のｐＨを８以上に調整することあるいは式(III)の化合物のラクトン環を開環する微生物によって、式(III)の化合物を式（II）に示す５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸に変換することを特徴とする式（II）で表される５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸含有物の製造方法である。

請求項９記載の本発明は、請求項1乃至８記載の製造方法で得られる式(II)に示す５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸あるいは式（III）で表される５−フェニルγ−バレロラクトンの少なくとも一つを必須成分として含有することを特徴とする組成物を提供するものである。

請求項１０記載の本発明は、請求項９記載の組成物を含有してなる口腔適用対象物を提供するものである。

請求項11記載の本発明は、式(I)に示すカテキン誘導体を資化して式(II)に示す５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸および／または式（III）で表される５−フェニルγ−バレロラクトンを生成するユウバクテリウム・プラウティＭＴ４２（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｌａｕｔｉｉ ＭＴ４２，ＦＥＲＭ Ｐ−２１７６５）を提供するものである。

本発明によれば、式(I)で示されるカテキン誘導体を、微生物の作用により簡単に式(II)で表される５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸および／または式（III）で表される５−フェニルγ−バレロラクトンに変換できる。また、式(IV)で示されるカテキン類を式(I)のカテキン誘導体に変換する微生物を併用することで、該カテキン類から容易に上記に示した５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸および／または５−フェニルγ−バレロラクトンを得ることができる。これらの化合物は、抗炎症作用やがん抑制作用のほか、他の生理活性作用も期待できるものである。

本発明の生物学的変換方法では、前記式(I)で示されるカテキン誘導体を前記式(II)で示される５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸および／または前記式（III）で表される５−フェニルγ−バレロラクトンへ変換する能力を有する微生物であれば、微生物の種類を問うことなく使用することができる。そのような微生物の好ましい例としては、ユウバクテリウム属細菌およびクロスリジウム属細菌を上げることができ、さらに好ましくは、ユウバクテリウム・プラウティＡＴＣＣ２９８６３（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｌａｕｔｉｉ ＡＴＣＣ２９８６３）、ユウバクテリウム・プラウティＭＴ４２（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｌａｕｔｉｉ ＭＴ４２，ＦＥＲＭ Ｐ−２１７６５）およびクロストリジウム・オルビシンデンスＡＴＣＣ４９５３１（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｏｒｂｉｓｃｉｎｄｅｎｓ ＡＴＣＣ４９５３１）を挙げることができる。このうち、ユウバクテリウム・プラウティＭＴ４２（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｌａｕｔｉｉ ＭＴ４２）株は、特許生物寄託センターに、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１７６５として寄託されているラットの糞中から分離された微生物である。

上記ＭＴ４２株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の全塩基配列（１４８４ｂｐ）は、配列番号１の通りである。得られたＭＴ４２株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を国際塩基配列データベース（ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＢａｎｋ）の配列データと比較し相同性を調べた。その結果、ＭＴ４２菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列はＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｌａｕｔｉｉ
ＣＣＵＧ２８０９３Ｔと９９．７％、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｏｒｂｉｓｃｉｎｄｅｎｓ ＤＳＭ６７と９９．５％の相同性を示した。以上の結果から本発明者らはＭＴ４２菌株がユウバクテリウム・プラウティ(Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｌａｕｔｉｉ)であると同定した。

なお、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の全塩基配列（１４８４ｂｐ）の解析は以下の通りに行った。
ＧＡＭ寒天培地（日水製薬（株）社製）により３７℃の嫌気条件下で２日間培養したＭＴ４２株ＰｒｅｐＭａｎ Ｕｌｔｒａ Ｒｅａｇｅｎｔ (Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)を用いてＤＮＡ抽出を行った。得られたＤＮＡ溶液をＰＣＲ反応用ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅとして用い、ＭｉｃｒｏＳｅｑ Ｆｕｌｌ Ｇｅｎｅ １６ＳｒＤＮＡＢａｃｔｅｒｉａｌ ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＰＣＲ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域１４８４ｐをＰＣＲ反応で増幅させた。得られたＰＣＲ反応産物はＱｕｉｃｋＳｔｅｐ^TM２ＰＣＲ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ(ＥｄｇｅＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社製)を用いて精製した。精製したＰＣＲ反応産物をＢｉｇ−Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ反応用ｔｅｍｐｌａｔｅとして用い、ＭｉｃｒｏＳｅｑ Ｆｕｌｌ Ｇｅｎｅ １６ＳｒＤＮＡ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によりシークエンス反応（サイクルシークエンス）を行った。サーマサイクラーには、ＧｅｎｅＡｍｐ
ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００(Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)を使用した。得られた反応液はＡｕｔｏＳｅｑ^TMＧ-５０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製)を用いて精製し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１００Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列の解読を行った。得られた本菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子(１４８４ｂｐ)の塩基配列は配列番号１のとおりである。

また、本発明の生物学的変換方法では、式(IV)で示されるカテキン類を式(I)のカテキン誘導体に変換する微生物を併用することで、該カテキン類含有物から容易に上記に示した５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸および／または５−フェニルγ−バレロラクトン含有物を得ることができる。本発明の方法では、エガーテラ（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ）属およびアドラークルーツィア（Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ）属に属し、式(IV)で示されるカテキン類を式(I)のカテキン誘導体に変換する能力を有する微生物であれば、種および株の種類を問うことなく使用することができる。

そのような微生物の好ましい例として、エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ ｌｅｎｔａ ＪＣＭ９９７９）およびアドラークルーツィア・エクオーリファシエンスＭＴ４ｓ−５（Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ ｅｑｕｏｌｉｆａｃｉｅｎｓ ＭＴ４ｓ−５）を挙げることができる。このうち、アドラークルーツィア・エクオーリファシエンスＭＴ４ｓ−５（Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ ｅｑｕｏｌｉｆａｃｉｅｎｓ ＭＴ４ｓ−５）株は、特許生物寄託センターに、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１７３８として寄託されているラットの糞中から分離された微生物である。

上記ＭＴ４ｓ−５株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の全塩基配列（１４６０ｂｐ）は、配列番号２の通りである。得られたＭＴ４ｓ−５株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を国際塩基配列データベース（ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＢａｎｋ）の配列データと比較し相同性を調べた。その結果、ＭＴ４ｓ―５菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ ｅｑｕｏｌｉｆａｃｉｅｎｓ
ＦＪＣ−Ｂ９Ｔと９９．９％、Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ ｅｑｕｏｌｉｆａｃｉｅｎｓ ＦＪＣ−Ｄ５３およびＡｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ ｅｑｕｏｌｉｆａｃｉｅｎｓ
ＦＪＣ−Ａ１０と９９．８％、Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ ｅｑｕｏｌｉｆａｃｉｅｎｓ ＦＪＣ−Ｂ２０と９９．５％の相同性を示した。以上の結果から、ＭＴ４ｓ−５菌株はアドラークルーツィア・エクオーリファシエンス(Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ ｅｑｕｏｌｉｆａｃｉｅｎｓ)またはアサッカロバクター・セラタス（Ａｓａｃｃｈａｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｌａｔｕｓ）であると同定した。

なお、ＭＴ４ｓ−５菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の全塩基配列（１４６０ｂｐ）の解析は以下の通りに行った。ＧＡＭ寒天培地（日水製薬（株）製）により３７℃の嫌気条件下で２日間培養したＭＴ４ｓ−５株ＰｒｅｐＭａｎ
Ｕｌｔｒａ Ｒｅａｇｅｎｔ (Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)を用いてＤＮＡ抽出を行った。得られたＤＮＡ溶液をＰＣＲ反応用ＤＮＡ
ｔｅｍｐｌａｔｅとして用い、ＭｉｃｒｏＳｅｑ Ｆｕｌｌ Ｇｅｎｅ １６ＳｒＤＮＡＢａｃｔｅｒｉａｌ ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＰＣＲ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域１４６０ｐをＰＣＲ反応で増幅させた。得られたＰＣＲ反応産物はＱｕｉｃｋＳｔｅｐ^TM２ＰＣＲ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ(ＥｄｇｅＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社製)を用いて精製した。精製したＰＣＲ反応産物をＢｉｇ−Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ反応用ｔｅｍｐｌａｔｅとして用い、ＭｉｃｒｏＳｅｑ Ｆｕｌｌ Ｇｅｎｅ １６ＳｒＤＮＡ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によりシークエンス反応（サイクルシークエンス）を行った。サーマサイクラーには、ＧｅｎｅＡｍｐ
ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００(Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)を使用した。得られた反応液はＡｕｔｏＳｅｑ^TMＧ-５０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製)を用いて精製し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１００Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列の解読を行った。得られたＭＴ４ｓ−５菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子(１４６０ｂｐ)の塩基配列は配列番号２のとおりである。

本発明によれば、前記式(I)で示されるカテキン誘導体を前記式(II)で示される５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸および／または前記式（III）で表される５−フェニルγ−バレロラクトンへ変換する能力を有する微生物の培養菌体の存在下または当該微生物が生育する培養液中に、出発原料（基質）である式（I）で示されるカテキン誘導体含有物を添加してインキュベーション処理することにより式（II）で示される５―フェニル―４−ハイドロキシ吉草酸および／または式（III）で示される５−フェニルγ−バレロラクトン含有物を得ることができる。このインキュベーション処理は、前記微生物を培養後、培養菌体を集菌し、この菌体を緩衝液、生理食塩水、水などに懸濁させた後に基質を添加するか、前記微生物を培養する際あるいは培養開始後一定期間経過した培養液に基質を添加して行うことができる。培養開始後、基質を添加する時期は特に限定されないが、好ましくは培養２〜１２０時間の間に、より好ましくは４〜７２時間、さらに好ましくは６〜４８時間の間に添加すると効果的である。

さらに、本発明では、式(IV)で示されるカテキン類を式(I)のカテキン誘導体に変換する微生物を、式（I）で示されるカテキン誘導体含有物を式（II）で示される５―フェニル―４−ハイドロキシ吉草酸および／または式（III）で示される５−フェニルγ−バレロラクトンに変換する能力を有する微生物の培養菌体懸濁液または培養液に共存させ、式（IV）で示されるカテキン類含有物を基質として添加し、インキュベーション処理することにより、容易に上記に示した５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸および／または５−フェニルγ−バレロラクトン含有物を得ることができる。このインキュベーション処理は、前記微生物を培養後、培養菌体を集菌し、この菌体を緩衝液、生理食塩水、水などに懸濁させた後に基質を添加するか、前記微生物を培養する際あるいは培養開始後一定期間経過した培養液に基質を添加して行うことができる。培養開始後、基質を添加する時期は特に限定されないが、好ましくは培養２〜１２０時間の間に、より好ましくは４〜７２時間、さらに好ましくは６〜４８時間の間に添加すると効果的である。

また、式(IV)で示されるカテキン類を式(I)のカテキン誘導体に変換する微生物の培養菌体の存在下または当該微生物が生育する培養液中に、出発原料（基質）である式（IV）で示されるカテキン類含有物を添加してインキュベーション処理することにより、式（I）で示されるカテキン誘導体を生成させた後、式（I）で示されるカテキン誘導体含有物を式（II）で示される５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸および／または式（III）で示される５−フェニルγーバレロラクトンに変換する能力を有する微生物の培養菌体懸濁液または培養液を添加してインキュベーション処理することで目的とする式（II）および／または式（III）の化合物を得ることも可能である。さらに、式（IV）で示されるカテキン類含有物から微生物変換で得られる式（I）のカテキン誘導体を単離して、これを式（II）で示される５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸および／または式（III）で示される５−フェニルγ−バレロラクトンに変換する能力を有する微生物の出発材料（基質）として用いることも可能である。

上記の方法で生成した式（I）で示されるカテキン誘導体を単離するには、種々の既知精製手段を選択し、組み合わせて行うことができる。例えば、酢酸エチル、ブタノール、エーテルなどを用いた溶媒抽出、合成樹脂吸着剤の脱吸着を利用する方法、シリカゲルなどのカラムクロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィーを単独あるいは適宜組み合わせて分離・精製することができる。

前記に示した微生物を培養する場合には、該微生物が生育できる栄養源含有培地に接種し、嫌気的条件下で培養する。培養菌体を得るための微生物の培養および基質存在下での微生物の培養は、一般的な嫌気性微生物の培養方法を採用することができる。また、培養菌体を集菌した後、前記基質の存在下でインキュベーション処理する場合にも、嫌気条件下で行うことが望ましい。

培養に用いられる培地としては、前記微生物が生育できる培地であれば特に限定されないが、例を挙げればＧＡＭブイヨン（日水製薬（株）製）などが利用可能である。なお、式（IV）のうちＲが水素であるカテキン類を式（I）のＲ１およびＲ２が水素であるカテキン誘導体に微生物変換するためには、培地中に水素及び蟻酸を添加することが望ましい。また、式（IV）のうちＲが水酸基であるカテキン類を式（I）のＲ１が水酸基、Ｒ２が水素であるカテキン誘導体に微生物変換するためには、培地中に水素を添加する必要がある。さらに、水素や蟻酸を培地中に添加しない場合には、式（IV）および式（I）の化合物には作用しない水素および／または蟻酸生成微生物を共存させることも可能である。このような微生物の例として、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）を挙げることができる。

培養条件は、前記微生物が生育しうる範囲内で適宜選択することができる。通常、ｐＨ６．０〜７．５、３５〜４０℃であり、好ましくはｐＨ６．５〜７．３、３７〜３９℃である。培養時間は通常２４〜１２０時間、好ましくは４８〜７２時間である。上述した各種の培養条件は、使用する微生物の種類や特性、外部条件などに応じて適宜変更でき、最適条件を選択することができる。

基質となる式（I）で示されるカテキン誘導体あるいは式（IV）で示されるカテキン類は、水、食塩水、緩衝液などのほか、水溶性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどに溶解後、微生物の生育を阻害しない濃度範囲で培養液あるいは培養菌体の懸濁液に添加することができる。該基質の添加量は、微生物による変換が可能な濃度あるいは量の範囲内で適宜選択することができる。通常、培養液の場合には、培養液１リットル当たり０．３〜５ｇであり、好ましくは０．５〜２ｇ、より好ましくは０．６〜１ｇである。また、培養後の菌体の懸濁液を用いる場合には、懸濁液１リットル当たり５０〜５００ｍｇ、好ましくは１００〜２５０ｍｇである。

本発明の生物学的変換方法で生成した目的の式（II）で示される５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸および／または式（III）で示される５−フェニルγーバレロラクトン含有物から該目的化合物を単離するには、種々の既知精製手段を選択し、組合わせて行うことができる。例えば、酢酸エチル、ブタノールなどを用いた溶媒抽出、合成樹脂吸着剤の脱吸着を利用する方法、シリカゲルなどのカラムクロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィーを単独あるいは適宜組み合わせて分離・精製することができる。

本発明によれば、生物学的変換方法によって得られる式（II）の５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸を式（III）で示される５−フェニルγ−バレロラクトンに変換することも可能である。この変換は、式（II）の化合物や式（II）および式（III）の化合物の混合物のｐＨを酸性とすることにより達成できる。例を挙げれば、生物学的変換方法によって得られる式（II）の５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸および／または式（III）で示される５−フェニルγ−バレロラクトン含有物に酸（塩酸、蟻酸、酢酸、トリフルオロ酢酸など）を添加して、ｐＨ３以下、好ましくはｐＨ２以下において、０〜５０℃、好ましくは４〜４０℃で１〜７２時間、好ましくは２〜４８時間インキュベーション処理することにより、式（II）に示される５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸を式（III）の５−フェニルγ−バレロラクトンに変換することが可能である。このような方法を用いることにより、式（II）の５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸および式（III）で示される５−フェニルγ−バレロラクトン含有物から、式（III）の化合物を式（II）および式（III）の化合物総量の少なくとも９０％以上含有する組成物を得ることができる。

また、本発明によれば、生物学的変換方法によって得られる（III）で示される５−フェニルγ−バレロラクトンを式（II）の５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸に変換することも可能である。この場合には、式（III）の化合物や式（II）および式（III）の化合物の混合物のｐＨをアルカリ性とすることにより達成できる。例を挙げれば、生物学的変換方法によって得られる式（II）の５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸および／または式（III）で示される５−フェニルγ−バレロラクトン含有物にアルカリ（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウムなど）を添加して、ｐＨ８以上、好ましくはｐＨ９以上、さらに好ましくはｐＨ１０以上とし、０〜５０℃、好ましくは４〜４０℃で１〜７２時間、好ましくは２〜４８時間インキュベーション処理することにより、式（III）の５−フェニルγ−バレロラクトンを式（II）に示される５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸に変換することが可能である。このような方法を用いることにより、式（II）の５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸および式（III）で示される５−フェニルγ−バレロラクトン含有物から、式（II）の化合物を少なくとも式（II）および式（III）の化合物総量の９０％以上含有する組成物を得ることができる。

上記の、式（III）で示される化合物を式（II）の化合物に変換する方法としては、微生物学的変換方法も利用できる。例えば、ラットの糞あるいは盲腸内容物から嫌気培養によって得られる腸内細菌の培養菌体を式（III）で示される５−フェニルγ−バレロラクトン含有物に作用させるか、あるいは上記の腸内細菌を式（III）で示される化合物の存在下で培養する。培養菌体との反応や培養条件は、前記の生物学的変換方法による（III）で示される５−フェニルγ−バレロラクトンを式（II）の５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸の生成条件や式(IV)で示されるカテキン類を式(I)のカテキン誘導体に変換するための条件等を適用することができる。

本発明の式（II）に示される５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸あるいは（III）で示される５−フェニルγ−バレロラクトンの少なくとも一つを必須成分として含有する組成物は、上記成分の粗製品でも精製品でもよく、また液状であっても乾燥品等であってもよい。また、組成物の必須成分の含量も特に限定されるものではないが、通常０．１以上、好ましくは１〜１０％、より好ましくは１５〜３０％、さらに好ましくは４０％以上含有する。

本発明の前記組成物は、どのような形態であってもよく、例えば、粉末状であってもよいし液状であってもよい。また、本発明の組成物は、必要に応じて、抗酸化剤、着色剤、香料、矯味剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、甘味料などと併用して用いてもよい。抗酸化剤としては、例えば、クエン酸トコフェロール（三栄源・エイ・エフ・アイ社製）などが挙げられる。界面活性剤としては、例えば、ショ糖脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステル、レシチン、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン系非界面活性剤などが挙げられる。甘味料としては、砂糖、ブドウ糖、果糖、異性化液糖、グリチルリチン、ステビア、アスパラテーム、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、その他のオリゴ糖としてシクロデキストリンが挙げられる。シクロデキストリンとしては、α−、β−、γ−シクロデキストリンおよび分岐α−、β−、γ−シクロデキストリンが使用できる。また、人工甘味料も使用できる。酸味料としては、天然成分から抽出した果汁類のほか、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、リン酸が挙げられる。

本発明の飲食品は、式（II）に示される５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸あるいは（III）で示される５−フェニルγ−バレロラクトンの少なくとも一つを必須成分として含有する組成物を配合することができるものであればどのような形態であってもよく、例えば、水溶液や混濁物や乳化物などの液状形態であっても、ゲル状やペースト状の半固形状形態であっても、粉末や顆粒やカプセルやタブレットなどの固形状形態であってもよい。

本発明における飲食品としては、例えば、即席食品類（即席めん、カップめん、レトルト・調理食品、調理缶詰め、電子レンジ食品、即席味噌汁・吸い物、スープ缶詰め、フリーズドライ食品など）、炭酸飲料、柑橘類（グレープフルーツ、オレンジ、レモンなど）の果汁や果汁飲料や果汁入り清涼飲料、柑橘類の果肉飲料や果粒入り果実飲料、トマト、ピーマン、セロリ、ウリ、ニンジン、ジャガイモ、アスパラガスなどの野菜を含む野菜系飲料、豆乳・豆乳飲料、コーヒー飲料、お茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、スポーツ飲料、栄養飲料、アルコール飲料やタバコなどの嗜好飲料・嗜好品類、マカロニ・スパゲッティ、麺類、ケーキミックス、唐揚げ粉、パン粉、ギョーザの皮などの小麦粉製品、キャラメル・キャンディー、チューイングガム、チョコレート、クッキー・ビスケット、ケーキ・パイ、スナック・クラッカー、和菓子・米菓子・豆菓子、デザート菓子などの菓子類、しょうゆ、みそ、ソース類、トマト加工調味料、みりん類、食酢類、甘味料などの基礎調味料、風味調味料、調理ミックス、カレーの素類、たれ類、ドレッシング類、めんつゆ類、スパイス類などの複合調味料・食品類、バター、マーガリン類、マヨネーズ類、植物油などの油脂類、牛乳・加工乳、乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料、チーズ、アイスクリーム類、調製粉乳類、クリームなどの乳・乳製品、素材冷凍食品、半調理冷凍食品、調理済み冷凍食品などの冷凍食品、水産缶詰め、果実缶詰め・ペースト類、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品、水産珍味類、水産乾物類、佃煮類などの水産加工品、畜産缶詰め・ペースト類、畜肉缶詰め、果実缶詰め、ジャム・マーマレード類、漬物・煮豆類、農産乾物類、シリアル（穀物加工品）などの農産加工品、ベビーフード、ふりかけ・お茶漬けのりなどの市販食品などが挙げられる。

また、本発明の飲食品は口に含むことのできる医薬品、医薬部外品、化粧品なども含むことができる。医薬品としては日本薬局方に収められている医薬品で口に含むことができれば特に限定されるものではなく、その製剤形態としては、例えば、エアゾール剤、液剤、エキス剤、エリキシル剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、散剤、酒精剤、錠剤、シロップ剤、浸剤・煎剤、トローチ剤、芳香水剤、リモナーゼ剤などが挙げられる。医薬部外品としては厚生労働大臣が指定した医薬部外品で口に含むことができれば特に限定されるものではなく、例えば、内服液剤、健康飲料、消毒剤、消毒保護剤、ビタミン含有保健剤などが挙げられる。

飲食品への本発明の組成物の配合方法は特に制限されるものではない。例えば、飲食品の形態が液状形態や半固形状形態である場合には、その調製段階において本発明の組成物をそのまま、あるいは水に溶解させた水溶液などとして添加し、均一化することにより行えばよい。また、本発明の組成物をアルコール水などの含水有機溶媒やエタノールなどの有機溶媒などに分散させた分散液として添加し、十分に攪拌してこれを分散させることも可能である。なお、このようにして得られた調製物を、噴霧乾燥機や凍結乾燥機などを用いて乾燥することで、粉末などの固形状形態としてもよい。また、飲食品の形態が固形状形態である場合には、その調製段階において本発明の組成物をそのまま、あるいは水に溶解させた水溶液などとして添加し、均一化することにより行えばよい。また、本発明の組成物をアルコール水などの含水有機溶媒やエタノールなどの有機溶媒などに分散あるいは溶解させた液として添加し、十分に混合させることも可能である。水難溶性の飲食品に本発明の組成物を配合する場合、必要に応じて飲食品にアルコール水などの含水有機溶媒やエタノールなどの有機溶媒などを添加してこれを溶解あるいは希釈し、ここに本発明の組成物を添加し、十分に攪拌して組成物を混合させるようにしてもよい。

飲食品に対する本発明の組成物の配合量は、特に制限されないが、対象となる飲食品により配合量を適宜設定する。一般的には、最終製品中で０.０１〜２０重量％であることが好ましく、０．０５〜１０重量％であることがより好ましく、０．１〜５重量％であることがさらに好ましい。

以下、本発明について具体的な例を挙げてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

式（I）で示されるカテキン誘導体を式（II）の５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸および／または式（III）で示される５−フェニルγ−バレロラクトンに変換する微生物のスクリーニング
細菌の分離源としてＷｉｓｔａｒ系のラット（日本チャールスリバー（株））を使用した。ラットから新鮮な糞便約２ｇを採取し、ＧＡＭブイヨン（組成（１Ｌ中）：ペプトン１０ｇ、ダイズペプトン３ｇ、プロテオーゼペプトン１０ｇ、消化血清末１３．５ｇ、酵母エキス５ｇ、肉エキス２．２ｇ、肝臓エキス１．２ｇ、ブドウ糖３ｇ、リン酸二水素カリウム２．５ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、溶性デンプン５ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩０．３ｇ、チオグリコール酸ナトリウム０．３ｇ、ｐＨ７．１、日水製薬（株）社製）３ｍｌに懸濁して糞溶液を調製した。糞溶液０．１ｍｌをマイクロチューブに入れＧＡＭブイヨン０．９ｍｌを加えて混合し１０倍に希釈した。この溶液を段階的に１０⁷倍まで希釈し、各希釈倍率の糞溶液１０μｌをそれぞれ式（I）で示されるカテキン誘導体（Ｒ１は水素（Ｈ）、Ｒ２は水酸基（ＯＨ）を示す）０．２ｍＭを含むＧＡＭ寒天培地（（組成（１Ｌ中）：ペプトン１０ｇ、ダイズペプトン３ｇ、プロテオーゼペプトン１０ｇ、消化血清末１３．５ｇ、酵母エキス５ｇ、肉エキス２．２ｇ、肝臓エキス１．２ｇ、ブドウ糖３ｇ、リン酸二水素カリウム２．５ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、溶性デンプン５ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩０．３ｇ、チオグリコール酸ナトリウム０．３ｇ、カンテン１５ｇ、ｐＨ７．１、日水製薬（株）社製）２０ｍｌ中に混濁培養した。３７℃で２日間嫌気培養（アネロパックケンキ（三菱ガス化学（株）社製）使用）を行った後、寒天培地中に出現したシングルコロニーをそれぞれ個別に５ｍｌのＧＡＭブイヨンに植菌した。この培地にフィルター滅菌（ＤＩＳＭＩＣ−２５ｃｓ ０．２μｍ アドバンテック東洋（株）社製）した（I）で示されるカテキン誘導体（Ｒ１は水酸基（ＯＨ）、Ｒ２は水素（Ｈ）を示す）水溶液（５０ｍＭ）を５０μｌ添加し、３７℃で２日間嫌気培養を行った。培養液を遠心分離（１５０００×ｇ、１５分）し、上清を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析し、式（II）の５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸（Ｒ１は水素（Ｈ）、Ｒ２は水酸基（ＯＨ）を示す）を生成する菌株のスクリーニングを行った。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析は以下の条件で行った。

使用カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ ＵＧ１２０（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ、資生堂（株）社製）、カラム温度：４０℃、流速：１ｍｌ／分、移動相：水／メタノール／アセトニトリル／リン酸＝８５ /１０ /５ / ０．１（容量比（v/v/v/v））、検出器：ＵＶ２７０ｎｍ。
分析の結果、式（I）で示されるカテキン誘導体を式（II）の５―フェニル―４−ハイドロキシ吉草酸へ変換する能力を持つ微生物ユウバクテリウム・プラウティＭＴ４２（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｌａｕｔｉｉ ＭＴ４２ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７６５）株を単離した。

ユウバクテリウム・プラウティＭＴ４２（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｌａｕｔｉｉ ＭＴ４２ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７６５）株による式（I）で示されるカテキン誘導体（Ｒ１は水酸基（ＯＨ）、Ｒ２は水素（Ｈ）を示す）からの５−（３’、５’−ジハイドロキシフェニル）−４−ハイドロキシ吉草酸および５−（３’、５’−ジハイドロキシフェニル）γ−バレロラクトン含有物の生産
（緩衝液中での生産）
ＧＡＭ寒天培地上に生育したＭＴ４２株を１０ｍｌのＧＡＭブイヨンに植菌し、３７℃で２４時間嫌気培養した。この前培養液を新たに調整した同培地３００ｍｌに植菌し、３７℃で２４時間嫌気培養を行った。培養液を高速遠心分離（１５０００×ｇ、２０分）により集菌し、得られた菌体を滅菌水１００ｍｌで洗浄後、２０ｍｌのリン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．１）に懸濁した。この懸濁液に基質となる式（I）のカテキン誘導体（Ｒ１は水酸基（ＯＨ）、Ｒ２は水素（Ｈ）を示す）を１０ｍｇになるように添加し、３７℃の嫌気条件下で４８時間インキュベーションした。反応液を高速遠心分離（１５０００×ｇ、２０分）し、菌体を除去した。上清に塩酸を適量添加しｐＨを３〜４に調整した後、２０ｍｌの酢酸エチルで３回抽出を行った。酢酸エチル相を合わせて減圧下で濃縮乾固し、乾固物を少量の純水に溶解後、凍結乾燥を行った。その結果、５−（３’、５’−ジハイドロキシフェニル）−４−ハイドロキシ吉草酸および５−（３’、５’−ジハイドロキシフェニル）γ−バレロラクトンを含む含有物８．３ｍｇが得られた。

凍結乾燥後の乾燥粉末の分析はＬＣ／ＭＳ分析によって行った。ＬＣ／ＭＳの分析条件は以下の通りである。
使用カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ Ｃ１８ ＭＧ（２．０×１００．０ｍｍ，５μｍ 資生堂（株）社製）、カラム温度：４０℃、流速：０．２ｍｌ／分、移動相Ａ（水／アセトニトリル／酢酸＝１００／２．５／０．１ 容量比(v/v/v）)，Ｂ（水／アセトニトリル／メタノール／酢酸＝５０／２．５／５０／０．１ 容量比（v/v/v/v））、グラジエント：０−２分 アイソクラティック Ａ１００％、２−２５分 リニアグラジエント Ａ １００−０％、Ｂ０−１００％、２５．１−３３分 アイソクラティック Ａ１００％、検出器：ＵＶ２７０ｎｍ、インターフェース：ＥＳＩ、ポラリティ：ネガティブ。

ユウバクテリウム・プラウティＭＴ４２（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｌａｕｔｉｉ ＭＴ４２ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７６５）株による式（I）で示されるカテキン誘導体（Ｒ１は水素（Ｈ）、Ｒ２は水酸基（ＯＨ）を示す）からの５−（３’、４’−ジハイドロキシフェニル）−４−ハイドロキシ吉草酸および５−（３’、４’−ジハイドロキシフェニル）γ―バレロラクトン含有物の生産
（培養液での生産）
ＧＡＭ寒天培地上に生育したＭＴ４２株をＧＡＭブイヨン１０ｍｌに植菌し３７℃で２４時間嫌気培養した。この前培養液を新たに調整した同培地１００ｍｌに植菌し、式（I）で示されるカテキン誘導体（Ｒ１は水素（Ｈ）、Ｒ２は水酸基（ＯＨ）を表す）を３０ｍｇ添加した。この培地を３７℃で４８時間嫌気培養して変換反応を行った。反応液を高速遠心分離（１５０００×ｇ、２０分）し、菌体を除去した後、上清に酢酸を添加しｐＨを３．５に調整した。１００ｍｌの酢酸エチルで３回抽出を行った後、酢酸エチル溶液を合わせて減圧下で濃縮乾固した。乾固物に少量の純水を加えて溶解し、凍結乾燥を行った結果、５−（３’、４’−ジハイドロキシフェニル）−４−ハイドロキシ吉草酸および５−（３’、４’−ジハイドロキシフェニル）γ−バレロラクトン含有物５６ｍｇを得た。

ユウバクテリウム・プラウティＡＴＣＣ２９８６３（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｌａｕｔｉｉ ＡＴＣＣ２９８６３）株による式（I）で示されるカテキン誘導体（Ｒ１，Ｒ２は水素を表す）からの５−（３’−ハイドロキシフェニル）−４−ハイドロキシ吉草酸および５−（３’−ハイドロキシフェニル）γ−バレロラクトン含有物の生産
（培養液での生産）
ＧＡＭ寒天培地上に生育したＡＴＣＣ２９８６３株をＧＡＭブイヨン１０ｍｌに植菌し、３７℃で２４時間嫌気培養した。この前培養液を新たに調整した同培地１００ｍｌに植菌し、式（I）で示されるカテキン誘導体（Ｒ１、Ｒ２は水素（Ｈ）を表す）を３０ｍｇ添加した。３７℃で４８時間嫌気培養して変換反応を行った後、高速遠心分離１５０００×ｇ、２０分）で菌体を除去した。上清に酢酸を加えｐＨ３．５に調整した。１００ｍｌの酢酸エチルで３回抽出を行った後、酢酸エチルを合わせて無水硫酸マグネシウムを適量添加して脱水を行った。ろ過により硫酸マグネシウムを除去し後、ろ液を減圧下で濃縮乾固した。乾固物に少量の純水を加えて溶解し、凍結乾燥を行った結果、５−（３’−ハイドロキシフェニル）−４−ハイドロキシ吉草酸および５−（３’−ハイドロキシフェニル）γ−バレロラクトン含有物４２ｍｇを得た。

クロストリジウム・オルビシンデンスＡＴＣＣ４９５３１（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｏｒｂｉｓｃｉｎｄｅｎｓ ＡＴＣＣ４９５３１）株による式（I）で示されるカテキン誘導体（Ｒ１，Ｒ２は水酸基（ＯＨ）を表す）からの５−（３’、４’、５’−トリハイドロキシフェニル）−４−ハイドロキシ吉草酸および５−（３’、４’、５’−トリハイドロキシフェニル）γ−バレロラクトン含有物の生産
（培養液での生産）
ＧＡＭ寒天培地上に生育したＡＴＣＣ４９５３１株をＧＡＭブイヨン１０ｍｌに植菌し、３７℃で２４時間嫌気培養した。この前培養液を新たに調製した同培地１００ｍｌに植菌し、式（I）で示されるカテキン誘導体（Ｒ１、Ｒ２は水酸基（ＯＨ）を表す）を３０ｍｇ添加した。３７℃で４８時間嫌気培養して変換反応を行った後、高速遠心分離機（１５０００×ｇ、２０分）に供し菌体を除去した。上清にリン酸を加えｐＨ１．５に調整した後、８０ｍｌの酢酸エチル：ブタノール（１：１、溶量比（v/v））を加えてよく混合した。遠心分離（５０００×ｇ、５分）により２相に分けた後、有機溶媒相を回収した。この抽出を３回繰り返し行った。有機溶媒相を合わせて減圧下で濃縮乾固した。乾固物に５ｍｌの純水を加えて溶解し、再度減圧下で濃縮乾固した。この操作を３回繰り返し行い、有機溶媒相に含まれていた酸を完全に除去した。乾固物に少量の純水５ｍｌを加えて溶解し、凍結乾燥した。その結果、５−（３’、４’、５’−トリハイドロキシフェニル）−４−ハイドロキシ吉草酸、５−（３’、４’、５’−トリハイドロキシフェニル）γ−バレロラクトン含有物４１ｍｇを得た。

式（IV）のカテキン類を式（I）に示されるカテキン誘導体に変換する微生物のスクリーニング
細菌の分離源としてＷｉｓｔａｒ系ラット（♂、日本チャールスリバー（株））を使用した。ラットから新鮮な糞便を採取し、採取直後に白金耳で糞を適量取り、ＧＡＭ寒天培地上に画線した。３７℃で４８時間嫌気培養して菌を充分生育させた後、培地上に生育したコロニー群を数十箇所から掻き取り、式（IV）でされるエピガロカテキン（ＲはＯＨ（水酸基）を示す）を０．５ｍＭ含むＧＡＭブイヨン２ｍｌにそれぞれ植菌した。この培養液を３７℃で４８時間嫌気培養した後、高速遠心分離（１５０００×ｇ、１５分）し、得られた上清を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析し、式（I）のカテキン誘導体（Ｒ１、Ｒ２は水酸基（ＯＨ）を示す）を生成している培養液を選択した。ＨＰＬＣ分析は実施例１の段落００４４に示した条件と同じ条件で行った。目的のカテキン誘導体が生成されていた培養液から菌を取り、再度新たに調製したＧＡＭ寒天培地上に画線した。単菌になるまで上記と同様の操作を繰り返し行った。その結果、（I）のカテキン誘導体を生成する能力をもつアドラークルーツィア・エクオーリファシエンスＭＴ４ｓ−５（Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ ｅｑｕｏｌｉｆａｃｉｅｎｓ ＭＴ４ｓ−５，ＦＥＲＭ Ｐ−２１７３８）株を単離した。

エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ ｌｅｎｔａ ＪＣＭ９９７９）株とユウバクテリウム・プラウティＡＴＣＣ２９８６３（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｌａｕｔｉｉ ＡＴＣＣ２９８６３）株および大腸菌Ｋ１２（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ Ｋ１２）株共存下での式（IV）で示される（Ｒは水素（Ｈ）を示す）エピカテキンからの５−（３’−ハイドロキシフェニル）−４−ハイドロキシ吉草酸ナトリウム塩の生産
（培養液）
ＪＣＭ９９７９株を１０ｍｌのＧＡＭブイヨンに植菌し、３７℃で４８時間嫌気培養し、前培養液とした。大腸菌Ｋ１２株およびＡＴＣＣ２９８６３株は５ｍｌのＧＡＭブイヨンで２４時間嫌気培養し、前培養液とした。式（IV）で示されるエピカテキン（Ｒは水素（Ｈ）を示す）２００ｍｇを含む１００ｍｌのＧＡＭブイヨンにＪＣＭ９９７９株、大腸菌Ｋ１２株の前培養液を加え、３７℃で４８時間嫌気培養した。１ｍｌをサンプリングし、高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分）して、菌体を除去し、上清をＬＣ／ＭＳ分析に供した。式（I）で示されるカテキン誘導体（Ｒ１、Ｒ２は水素（Ｈ）を示す）が生成されているのを確認した後、さらにＡＴＣＣ２９８６３株の前培養液を加え、３７℃で４８時間嫌気培養を行い、５−（３’−ハイドロキシフェニル）−４−ハイドロキシ吉草酸および５−（３’−ハイドロキシフェニル）γ−バレロラクトンへの変換を行った。ＬＣ／ＭＳ分析は実施例２の段落００４６記載の条件で行った。

培養液を高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分、１０℃）し、菌体を除去した。上清にリン酸を加えｐＨ３．５に調整し、１００ｍｌの酢酸エチルを加え、目的化合物を抽出した。有機溶媒相を回収し、水相に再度酢酸エチル１００ｍｌを加えて抽出を行った。この抽出を３回繰り返し行った。回収した酢酸エチル相を合わせ、減圧下で濃縮乾固した。乾固物に３０ｍｌの純水を加えて溶解し、１Ｍの炭酸ナトリウム水溶液を適量加えてｐＨ９．５に調整した。室温で２０時間放置し、５−（３’−ハイドロキシフェニル）γ−バレロラクトンを５−（３’−ハイドロキシフェニル）−４−ハイドロキシ吉草酸に変換した。２Ｍ塩酸を適量加えてｐＨ７．０付近に調整した後、減圧下で濃縮を行った。５ｍｌ程度まで濃縮した後、塩酸で再度ｐＨを２〜５に調整した。この濃縮液を高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分、４℃）後、上清を分取ＨＰＬＣに供した。分取用ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。

カラム：Ｃａｐｃｅｌｌｐａｋ ＭＧ（２０×１５０ｍｍ、５μｍ、（資生堂（株）社製）、流速９．５ｍｌ/分、温度４０℃、溶媒Ａ：アセトニトリル：メタノール：水（５：５：９０ 容量比（v/v/v））、溶媒Ｂ：アセトニトリル：メタノール：水（５：６０：３５ 容量比（v/v/v））、グラジエント；０分：Ａ７０％ Ｂ３０％、５分：Ａ７０％ Ｂ３０％、１５分：Ａ２０％ Ｂ８０％、１８分：Ａ２０％ Ｂ８０％、１９分：Ａ７０％ Ｂ３０％、２４分：Ａ７０％ Ｂ３０％、検出器：ＵＶ２３０ｎｍとした。

得られた５−（３’−ハイドロキシフェニル）−４−ハイドロキシ吉草酸画分（約５０ｍｌ）に１／２量の純水（２５ｍｌ）を添加後、減圧下で濃縮し、溶液中の溶媒を除去して水溶液にした。この水溶液を純水で平衡化した陽イオン交換樹脂（ダイアイオンＳＫ１Ｂ ナトリウム型、１０×６５ｍｍ）に通液し、さらに純水で溶出した。得られた溶液を減圧濃縮し凍結乾燥した結果、５−（３’−ハイドロキシフェニル）−４−ハイドロキシ吉草酸のナトリウム塩９５ｍｇが得られた。

アドラークルーツィア・エクオーリファシエンスＭＴ４ｓ−５（Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ ｅｑｕｏｌｉｆａｃｉｅｎｓ ＭＴ４ｓ−５，ＦＥＲＭ Ｐ−２１７３８）株、ユウバクテリウム・プラウティ ＭＴ４２（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｌａｕｔｉｉ ＭＴ４２ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７６５）株および大腸菌Ｋ１２（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ Ｋ１２）株の共存下での式（IV）で示された（Ｒは水酸基（ＯＨ）を示す）エピガロカテキンからの５−（３’、５’−ジハイドロキシフェニル）−４−ハイドロキシ吉草酸および５−（３’、５’−ジハイドロキシフェニル）γ―バレロラクトン含有物の生産
（培地中）
ＭＴ４ｓ−５株を３０ｍｌのＧＡＭブイヨンに植菌し、３７℃で４８時間嫌気培養し、前培養液とした。大腸菌Ｋ１２株およびＭＴ４２株は１０ｍｌのＧＡＭブイヨンで２４時間嫌気培養し、前培養液とした。式（IV）で示されたエピガロカテキン（Ｒは水酸基（ＯＨ）を示す）２９０ｍｇを含む１００ｍｌのＧＡＭブイヨンに上記３菌株の前培養液を加え、３７℃で４８時間嫌気培養して変換反応を行い、５−（３’、５’−ジハイドロキシフェニル）−４−ハイドロキシ吉草酸および５−（３’、５’−ジハイドロキシフェニル）γ−バレロラクトン含有物を得た。培養液を高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分、１０℃）し、菌体を除去した。上清に塩酸を加えｐＨ３．５に調整した後、１２０ｍｌの酢酸エチルで３回抽出した。酢酸エチル相（約３５０ｍｌ）に４０ｍＭ炭酸ナトリウム水溶液１００ｍｌを加えよく混合した。遠心分離（５０００×ｇ、５分）により２相に分離させ、水相を回収した。再度酢酸エチル相に４０ｍＭ炭酸ナトリウム水溶液１００ｍｌを加え、同様に２相に分離した。回収した炭酸ナトリウム水溶液のｐＨを７．０付近に調整した後、約５ｍｌになるまで減圧濃縮した。さらに塩酸を加えてｐＨ２．０〜５．０に調製し、高速遠心分離（１５０００×ｇ、２０分、４℃）後、上清を分取用ＨＰＬＣに供した。分取ＨＰＬＣの条件は実施例７の段落００５３に示した方法と同様である。ただし、グラジエントは０分：Ａ８０％ Ｂ２０％、５分：Ａ８０％ Ｂ２０％、１５分：Ａ２０％ Ｂ８０％、１８分：Ａ２０％ Ｂ８０％、１９分：Ａ８０％ Ｂ２０％、２４分：Ａ８０％ Ｂ２０％に設定した。得られた５−（３’、５’−ジハイドロキシフェニル）−４−ハイドロキシ吉草酸の画分は実施例７の段落００５４に示した方法で処理した。その結果、５−（３’、５’−ジハイドロキシフェニル）−４−ハイドロキシ吉草酸のナトリウム塩が１０３ｍｇ得られた。

エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ ｌｅｎｔａ ＪＣＭ９９７９）株およびユウバクテリウム・プラウティＭＴ４２（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｌａｕｔｉｉ ＭＴ４２ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７６５）株の共存下での式（IV）のエピカテキンからの５−（３’、４’−ジハイドロキシフェニル）−４−ハイドロキシ吉草酸および５−（３’、４’−ジハイドロキシフェニル）γ―バレロラクトン含有物の生産
（緩衝液中）
ＧＡＭブイヨン３０ｍｌにＪＣＭ９９７９株を植菌し、３７℃で４８時間嫌気培養を行った。この前培養液を新たに調製した同培地５００ｍｌに植菌し、３７℃で４８時間嫌気培養を行った。同様にＭＴ４２株を１０ｍｌのＧＡＭブイヨンで２４時間嫌気培養し、この前培養液を同培地３００ｍｌに植菌し、３７℃で２４時間嫌気培養した。この２菌株の培養液を合わせて高速遠心分離（１５０００×ｇ、１５分、４℃）し、得られた菌体を滅菌水２００ｍｌで一度洗浄した。得られた菌体を予め高圧蒸気滅菌（１１５℃、１５分）した５０ｍｌのリン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．１）に懸濁し、式（IV）で示される（Ｒは水素（Ｈ）を示す）エピカテキン水溶液（３０ｍｇ/３ｍｌ純水）をフィルター滅菌（ＤＩＳＭＩＣ−２５ｃｓ ０．２μｍ アドバンテック東洋（株）社製）処理をして加え、３７℃で３日間嫌気培養を行った。ＬＣ／ＭＳ分析の結果、５−（３’、４’−ジハイドロキシフェニル）−４−ハイドロキシ吉草酸（面積値５５％、ＵＶ２７０ｎｍ）、５−（３’、４’−ジハイドロキシフェニル）γ―バレロラクトン（面積値１４％、ＵＶ２７０ｎｍ）の生成が確認された。ＬＣ／ＭＳ分析は実施例２の段落００４６に示した条件と同様の方法で行った。この溶液を高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分）し、上清に酢酸を添加してｐＨ３．５に調整した。５０ｍｌの酢酸エチルで３回抽出した後、酢酸エチル相を減圧下で濃縮乾固した。乾固物に少量の純水を加えて凍結乾燥に供した結果、５−（３’、４’−ジハイドロキシフェニル）−４−ハイドロキシ吉草酸および５−（３’、４’−ジハイドロキシフェニル）γ―バレロラクトン含有物２７ｍｇが得られた。

エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ ｌｅｎｔａ ＪＣＭ９９７９）株およびユウバクテリウム・プラウティＭＴ４２（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｌａｕｔｉｉ ＭＴ４２ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７６５）株の共存下での式（IV）で示される（Ｒは水素（Ｈ）を示す）エピカテキンからの５−（３’、４’−ジハイドロキシフェニル）−４−ハイドロキシ吉草酸および５−（３’、４’−ジハイドロキシフェニル）γ−バレロラクトン含有物の生産
（培養液中）
ＪＣＭ９９７９株を３０ｍｌのＧＡＭブイヨンに植菌し、３７℃で４８時間嫌気培養した。またＭＴ４２株は１０ｍｌのＧＡＭブイヨンで２４時間嫌気培養した。式（IV）で示される（Ｒは水素（Ｈ）を示す）エピカテキン２１５ｍｇを含む１００ｍｌのＧＡＭブイヨンに上記２株の前培養液を加え、３７℃で４８時間嫌気培養して変換反応を行い、５−（３’、４’−ジハイドロキシフェニル）−４−ハイドロキシ吉草酸および５−（３’、４’−ジハイドロキシフェニル）γ―バレロラクトンを生成させた。培養液を高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分、１０℃）して、菌体を除去後、上清に塩酸を加えｐＨ３．５に調整した。この上清液を１２０ｍｌの酢酸エチルで３回抽出し、酢酸エチル相を減圧下で濃縮乾固した。沈殿を少量の純水に溶解し、凍結乾燥した結果、５−（３’、４’−ジハイドロキシフェニル）−４−ハイドロキシ吉草酸、５−（３’、４’−ジハイドロキシフェニル）γ―バレロラクトン含有物５０６ｍｇを得た。

実施例１０で得られた含有物を純水３０ｍｌに溶解後、２Ｍ塩酸を添加してｐＨ１．５に調整した。この水溶液を室温で２４時間放置し、５−（３’、４’−ハイドロキシフェニル）−４−ハイドロキシ吉草酸を５−（３’、４’−ハイドロキシフェニル）γ―バレロラクトンへ変換した。水溶液のｐＨを１Ｍ炭酸ナトリウムで４．０に調整後、５倍量の純水で平衡化した合成吸着剤ダイアイオンＨＰ−２０（１１０ｍｌ、三菱化学（株）社製）カラムに展開し、カラム容量の５倍量の純水で洗浄した後、吸着画分を５倍量の５０％メタノール水溶液で溶出した。この５０％メタノール溶出画分を減圧下で濃縮乾固し、凍結乾燥した結果、５−（３’、４’−ジハイドロキシフェニル）γ−バレロラクトン２７３ｍｇを得た。

エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ ｌｅｎｔａ ＪＣＭ９９７９）株とユウバクテリウム・プラウティＭＴ４２（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｌａｕｔｉｉ ＭＴ４２ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７６５）株の共存下での式（IV）で示される（Ｒは水酸基（ＯＨ）を示す）エピガロカテキンからの５−（３’、４’、５’−トリハイドロキシフェニル）−４−ハイドロキシ吉草酸および５−（３’、４’、５’−トリハイドロキシフェニル）γ―バレロラクトン含有物の生産
（培地中）
ＪＣＭ９９７９株を３０ｍｌのＧＡＭブイヨンに植菌し、３７℃で４８時間嫌気培養し、前培養液とした。大腸菌Ｋ１２株およびＭＴ４２株は１０ｍｌのＧＡＭブイヨンで２４時間嫌気培養し、前培養液とした。式（IV）で示される（Ｒは水酸基（ＯＨ）を示す）エピガロカテキン２２１．４ｍｇを含む１０％メタノール水溶液１０ｍｌをフィルター滅菌（ＤＩＳＭＩＣ−２５ｃｓ ０．２μｍ アドバンテック東洋（株）社製）し、９．５ｍｌをＧＡＭブイヨン１００ｍｌに加えた。上記３菌株の前培養液を加え、３７℃で３日間嫌気培養を行った。高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分、１０℃）により菌体を除去した後、得られた上清にリン酸を添加してｐＨ１．５に調整した。この溶液に１００ｍｌの酢酸エチル：ブタノール（１：１、v/v）を加えてよく混合した。遠心分離機（５０００×ｇ、５分）で２相に分けた後、有機溶媒相を回収した。この抽出操作を３回繰り返し行った。有機溶媒相（３００ｍｌ）に１／２量（１５０ｍｌ）の０．１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液（０．１％アスコルビン酸ナトリウムを含む）を加えよく混合した後、遠心分離機（５０００×ｇ、５分）で２相に分け、水相を回収した。再度有機溶媒相に０．１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液を加え同様の操作を繰り返した。得られた水相（３００ｍｌ）のｐＨを７．０に調整後、約３０ｍｌになるまで減圧下で濃縮した。この濃縮液に５倍量のエタノールを添加し、高速遠心分離（１５０００×ｇ、１５分、４℃）で不溶物を除去した。得られた上清をさらに減圧下で約１ｍｌになるまで濃縮し、２ＭＨＣｌでｐＨ２.０−３．０に調整した。この溶液を分取ＨＰＬＣに供した。分取ＨＰＬＣの条件は実施例７の段落００５３に記した方法と同じ条件で行った。但し、グラジエントはＡ８０％ Ｂ２０％のアイソクラティックとした。また得られた５−（３’、４’、５’−トリハイドロキシフェニル）γ−バレロラクトンの画分は実施例７の段落００５４に示した同様の方法で処理をした。その結果、５−（３’、４’、５’−トリハイドロキシフェニル）−４−ハイドロキシ吉草酸ナトリウム塩６５ｍｇを得た。

以上の通り、本発明の生物学的変換方法によって、抗炎症作用やガン抑制作用が期待できるカテキン類の代謝産物を簡便に製造することが出来る。

受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１７６５
受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１７３８

Claims (11)

1. 式（Ｉ）
   （式中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ独立に水酸基（ＯＨ）または水素（Ｈ）を表す）
   に示すカテキン誘導体を資化して
   式（II）
   （式中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ独立に水酸基（ＯＨ）または水素（Ｈ）を表す）
   に示す５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸および／または
   式（III）
   （式中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ独立に水酸基（ＯＨ）または水素（Ｈ）を表す）
   で表される５−フェニルγ−バレロラクトンを生成する微生物を、式（Ｉ）に示すカテキン誘導体含有物に作用させることを特徴とする式（II）で表される５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸および／または式（III）で表される５−フェニルγ−バレロラクトン含有物の製造方法。
2. 式（I）に示す化合物を資化して、式(II)に示す５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸および／または式(III)で表される５−フェニルγ−バレロラクトンを生成する微生物を、式(I)に示すカテキン誘導体含有物の存在下嫌気性条件で培養することを特徴とする式(II)で表される５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸および／または式(III)で表される５−フェニルγ−バレロラクトン含有物の製造方法。
3. 式（I）に示す化合物を資化して、式（II）に示す５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸および／または式（III）で表される５−フェニルγ−バレロラクトンを生成する微生物が、ユウバクテリウム属あるいはクロストリジウム属細菌から選ばれる少なくとも1種である請求項１乃至２記載の製造方法。
4. 式（I）に示す化合物を資化して式(II)に示す５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸および／または式（III）で表される５−フェニルγ−バレロラクトンを生成する微生物が、ユウバクテリウム・プラウティＡＴＣＣ２９８６３株、ユウバクテリウム・プラウティＭＴ４２株あるいはクロストリジウム・オルビシンデンスＡＴＣＣ４９５３１株から選ばれる少なくとも1種である請求項１乃至３記載の製造方法。
5. 式（IV）
   （式中、Ｒは水酸基（ＯＨ）または水素（Ｈ）を表す）
   に示すカテキン類を資化して、式（I)に示すカテキン誘導体を生成する能力を有するエガーテラ属および／またはアドラークルーツィア属の微生物を、式（IV）に示すカテキン類に作用させて、式（I)に示すカテキン誘導体を生成させることを特徴とする請求項１乃至４記載の式（II）で表される５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸および／または式（III）で表される５−フェニルγ−バレロラクトン含有物の製造方法。
6. 式（IV）に示すカテキン類を資化して、式（I)に示すカテキン誘導体を生成する能力を有する微生物が、エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株およびアドラークルーツィア・エクオーリファシエンスＭＴ４ｓ−５株である請求項１乃至５記載の式（II）で表される５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸および／または式（III）で表される５−フェニルγ−バレロラクトン含有物の製造方法。
7. 請求項１乃至６記載の製造方法によって得られる式(II)で表される５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸含有物のｐＨを３以下に調整することによって、式(II)の化合物を式（III）に示す５−フェニルγ−バレロラクトンに変換することを特徴とする式（III）で表される５−フェニルγ−バレロラクトン含有物の製造方法。
8. 請求項１乃至６記載の製造方法によって得られる式(III)で表される５−フェニルγ−バレロラクトン含有物のｐＨを８以上に調整することあるいは式(III)の化合物のラクトン環を開環する微生物によって、式(III)の化合物を式（II）に示す５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸に変換することを特徴とする式（II）で表される５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸含有物の製造方法。
9. 請求項1乃至８記載の製造方法で得られる式(II)に示す５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸あるいは式（III）で表される５−フェニルγ−バレロラクトンの少なくとも一つを必須成分として含有することを特徴とする組成物。
10. 請求項９記載の組成物を含有してなる口腔適用対象物。
11. 式(I)に示すカテキン誘導体を資化して式(II)に示す５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸および／または式（III）で表される５−フェニルγ−バレロラクトンを生成するユウバクテリウム・プラウティＭＴ４２株。