JP2014128294A - 癌幹細胞を標的とする薬剤を同定する方法およびその使用 - Google Patents
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Abstract
【課題】癌幹細胞を標的とする薬剤を同定する方法およびその使用の提供。
【解決手段】本発明は、癌幹細胞を標的とする化合物および組成物を同定するための方法に関する。一面において、本発明は、それを必要とする対象において癌幹細胞の増殖および/または生存を阻害するために癌幹細胞を特異的に標的とする化合物および組成物を使用する処置方法に関する。本発明の他の局面は、それを必要とする対象において癌幹細胞の増殖および/または生存を阻害するための処置の選択における、癌幹細胞のバイオマーカーの使用に関する。
【選択図】図3−1
【解決手段】本発明は、癌幹細胞を標的とする化合物および組成物を同定するための方法に関する。一面において、本発明は、それを必要とする対象において癌幹細胞の増殖および/または生存を阻害するために癌幹細胞を特異的に標的とする化合物および組成物を使用する処置方法に関する。本発明の他の局面は、それを必要とする対象において癌幹細胞の増殖および/または生存を阻害するための処置の選択における、癌幹細胞のバイオマーカーの使用に関する。
【選択図】図3−1
Description
関連出願
本願は、2008年4月10日に出願された米国仮出願第61/043,948号および2008年5月15日に出願された出願番号第61/053,563号からの35U.S.C.§119(e)に基づく優先権を主張し、これらの全内容は本明細書において参照として組み込まれる。
本願は、2008年4月10日に出願された米国仮出願第61/043,948号および2008年5月15日に出願された出願番号第61/053,563号からの35U.S.C.§119(e)に基づく優先権を主張し、これらの全内容は本明細書において参照として組み込まれる。
政府の出資
本願は、助成金番号N01-CO-12400に基づく国立保健研究所の国立癌研究所化学遺伝学構想(Initiative for ChemicalGenetics)および助成金番号W81XWH-05-1-0268に基づく合衆国陸軍医学研究資材軍(U.S. Army Medical Researchand Materiel Command)からの政府の支援によりなされた。政府は本発明において特定の権利を有する。
本願は、助成金番号N01-CO-12400に基づく国立保健研究所の国立癌研究所化学遺伝学構想(Initiative for ChemicalGenetics)および助成金番号W81XWH-05-1-0268に基づく合衆国陸軍医学研究資材軍(U.S. Army Medical Researchand Materiel Command)からの政府の支援によりなされた。政府は本発明において特定の権利を有する。
発明の分野
本発明は、癌幹細胞を標的とする化合物および組成物を同定するための方法に関する。一面において、本発明は、そのような処置を必要とする対象における癌幹細胞の増殖および/または生存を阻害するために癌幹細胞を特異的に標的とする化合物および組成物を使用する処置方法に関する。本発明の他の局面は、そのような処置を必要とする対象における癌幹細胞の増殖および/または生存を阻害するための処置の選択における癌幹細胞バイオマーカーの使用に関する。
本発明は、癌幹細胞を標的とする化合物および組成物を同定するための方法に関する。一面において、本発明は、そのような処置を必要とする対象における癌幹細胞の増殖および/または生存を阻害するために癌幹細胞を特異的に標的とする化合物および組成物を使用する処置方法に関する。本発明の他の局面は、そのような処置を必要とする対象における癌幹細胞の増殖および/または生存を阻害するための処置の選択における癌幹細胞バイオマーカーの使用に関する。
発明の背景
癌は、細胞の遊走、増殖、分化および成長を制御する機構において異常を引き起こす多数の遺伝的およびエピジェネティックな変化から発生し得る。最近の発見から、腫瘍の形成および増殖は、腫瘍内における癌幹細胞と名付けられる癌細胞の少数の亜集団により駆動されることが示されている。癌幹細胞(CSC)は、続発性腫瘍を播種して発生させる能力を有する腫瘍塊中の細胞であって、癌による死亡の主要な原因である転移性汎発の原因である。この概念は、潜在的な癌治療の開発および前臨床的評価のために重要な意味を有する。
癌は、細胞の遊走、増殖、分化および成長を制御する機構において異常を引き起こす多数の遺伝的およびエピジェネティックな変化から発生し得る。最近の発見から、腫瘍の形成および増殖は、腫瘍内における癌幹細胞と名付けられる癌細胞の少数の亜集団により駆動されることが示されている。癌幹細胞(CSC)は、続発性腫瘍を播種して発生させる能力を有する腫瘍塊中の細胞であって、癌による死亡の主要な原因である転移性汎発の原因である。この概念は、潜在的な癌治療の開発および前臨床的評価のために重要な意味を有する。
発明の要旨
癌幹細胞(CSC)は、腫瘍の長期の生存を駆動する。従来の癌治療は、腫瘍の大部分を根絶することにおいて成功しているが、典型的には、潜行性のCSCに対してはより効果が低い。これらの悪性細胞により示される選択的薬物耐性は、癌における著しい罹患率および死亡率に寄与する。さらに、CSCは、動物モデルにおいて限界希釈において腫瘍を播種する能力を有する。したがって、特異的におよび選択的にCSCを標的とする薬物に対する必要性が存在する。しかし、いくつかの要因が、かかる薬物を効果的に同定する能力を限定する。一つの重要な制約は、単離された場合に分化して増殖を停止するCSCの培養物を入手して維持することの困難性である。したがって、この悪性のサブセットを標的とする薬物候補を発見することは、癌生物学者の継続中の挑戦であり続ける。
癌幹細胞(CSC)は、腫瘍の長期の生存を駆動する。従来の癌治療は、腫瘍の大部分を根絶することにおいて成功しているが、典型的には、潜行性のCSCに対してはより効果が低い。これらの悪性細胞により示される選択的薬物耐性は、癌における著しい罹患率および死亡率に寄与する。さらに、CSCは、動物モデルにおいて限界希釈において腫瘍を播種する能力を有する。したがって、特異的におよび選択的にCSCを標的とする薬物に対する必要性が存在する。しかし、いくつかの要因が、かかる薬物を効果的に同定する能力を限定する。一つの重要な制約は、単離された場合に分化して増殖を停止するCSCの培養物を入手して維持することの困難性である。したがって、この悪性のサブセットを標的とする薬物候補を発見することは、癌生物学者の継続中の挑戦であり続ける。
本発明の局面は、癌幹細胞を標的とする新規の治療薬を同定するための方法の発見および開発に基づく。本発明のある局面において、癌幹細胞を標的とする治療薬の発見は、ハイスループットスクリーニング法により達成される。本発明の他の局面において、癌幹細胞を特異的に標的とする化合物が開示される。したがって、本発明は、癌幹細胞を標的とする治療であってハイスループットスクリーニング法により同定されるもの、およびそれらの使用を開示する。
本発明の一面によれば、化合物が癌幹細胞の増殖および/または生存を阻害する能力を試験するための方法が提供される。方法は、(a)1または2以上の試験細胞を化合物のサンプルと接触させること、ここで1または2以上の試験細胞は上皮間葉移行を経験したものである、および(b)前記化合物による1または2以上の試験細胞の増殖および/または生存の阻害のレベルを検出することを含む。
一部の態様において、上皮間葉移行は、1または2以上の試験細胞においてE−カドヘリンの活性を阻害することからもたらされる。一部の態様において、1または2以上の試験細胞においてE−カドヘリンの活性を阻害することは、1または2以上の試験細胞をE−カドヘリンに対する遮断抗体と接触させること(これは1または2以上の試験細胞におけるディスアドヘリン(dysadherin)の発現を含む)、または1または2以上の試験細胞において細胞極性遺伝子を干渉することを含む。一部の態様において、1または2以上の試験細胞においてE−カドヘリンの活性を阻害することは、1または2以上の試験細胞を、E−カドヘリンのmRNAに相補的な低分子干渉核酸と接触させることを含む。
一部の態様において、上皮間葉移行は、1または2以上の試験細胞において転写因子の活性を誘導することからもたらされ、ここで転写因子は、Snail1、Snail2、グースコイド、FoxC2、TWIST、E2A、SIP-1/Zeb-2、dEF1/ZEb1、LEF1、Myc、HMGA2、TAZ、Klf8、HIF-1、HOXB7、SIM2sおよびFosから選択される。
一部の態様において、上皮間葉移行は、TWISTの活性を誘導することからもたらされる。一部の態様において、1または2以上の試験細胞においてTWISTの活性を誘導することは、1または2以上の試験細胞をTWISTをコードする発現ベクターと接触させることを含む。
一部の態様において、上皮間葉移行は、TWISTの活性を誘導することからもたらされる。一部の態様において、1または2以上の試験細胞においてTWISTの活性を誘導することは、1または2以上の試験細胞をTWISTをコードする発現ベクターと接触させることを含む。
一部の態様において、上皮間葉移行は、1または2以上の試験細胞を、TGF-β/BMPスーパーファミリーのメンバー、Wnt-ファミリーのメンバー、FGFファミリーのメンバー、Notchリガンド、EGFファミリーのメンバー、IGFファミリーのメンバー、PDGFおよびHGFから選択される増殖因子と接触させることからもたらされる。
一部の態様において、上皮間葉移行は、1または2以上の試験細胞においてシグナル経路の活性を調節することからもたらされ、ここでシグナル経路は、TGF-β、Wnt、BMP、Notch、HGF-Met、EGF、IGF、PDGF、FGF、P38-mapk、Ras、PI3キナーゼ-Akt、SrcおよびNF-kBから選択される。
一部の態様において、上皮間葉移行は、1または2以上の試験細胞においてシグナル経路の活性を調節することからもたらされ、ここでシグナル経路は、TGF-β、Wnt、BMP、Notch、HGF-Met、EGF、IGF、PDGF、FGF、P38-mapk、Ras、PI3キナーゼ-Akt、SrcおよびNF-kBから選択される。
一部の態様において、上皮間葉移行は、1または2以上の試験細胞を、低酸素、放射線照射および慢性化学療法処置から選択されるストレスに供することからもたらされる。一部の態様において、上皮間葉移行は、1または2以上の試験細胞を、ニコチン、または過酸化水素(H2O2)などの反応性酸素種の生成物による処置に供することからもたらされる(例えばDasguptaet al. Nicotine induces cell proliferation, invasion and epithelial-mesenchymaltransition in a variety of human cancer cell lines. Int J Cancer. 2009 Jan 1;124(1): 36-45およびLim et al. Epigenetic changes induced by reactive oxygenspecies in hepatocellular carcinoma: methylation of the E-cadherin promoter.Gastroenterology. 2008 Dec; 135(6): 2128-40, 2140.e18. Epub 2008 Jul 31を参照)。一部の態様において、上皮間葉移行は、1または2以上の試験細胞を、nAChRアゴニスト、C3aまたはMFG-E8による処置に供することからもたらされる(例えばTangZ, et al., C3a mediates epithelial-to-mesenchymal transition in proteinuricnephropathy, J Am Soc Nephrol. 2009 Mar; 20(3): 459-60; Jinushi M, et al., Milkfat globule EGF-8 promotes melanoma progression through coordinated Akt andtwist signaling in the tumor microenvironment, Cancer Res. 2008 Nov 1; 68(21):8889-98を参照)。
一部の態様において、1または2以上の試験細胞は、非腫瘍原性細胞を含む。
一部の態様において、1または2以上の試験細胞は、EMTを経験した後で腫瘍原性を付与されたものである。他の態様において、1または2以上の試験細胞は、EMTを経験する前に腫瘍原性を付与されたものである。
一部の態様において、1または2以上の試験細胞は、EMTを経験した後で腫瘍原性を付与されたものである。他の態様において、1または2以上の試験細胞は、EMTを経験する前に腫瘍原性を付与されたものである。
一部の態様において、方法は、(a)1または2以上の試験細胞および1または2以上の対照細胞を、化合物のサンプルと接触させること、ここで、前記1または2以上の試験細胞は上皮間葉移行を経験しており、前記1または2以上の対照細胞はEMTを経験していない、(b)前記化合物による前記1または2以上の試験細胞および対照細胞の増殖および/または生存の阻害のレベルを検出すること;ならびに(c)前記化合物が前記試験細胞の増殖および/または生存に対して対照細胞よりも高い阻害効果を有する場合、前記化合物をCSC選択的な化学療法剤の候補として同定すること、を含む。ある態様において、試験細胞および対照細胞は、遺伝子的に一致するものである。一部の態様において、試験細胞は、E−カドヘリンの発現を阻害する低分子干渉RNAを発現するかまたは含み、対照細胞はかかるRNAを発現しない。
一部の態様において、方法は、1または2以上の対照細胞を化合物のサンプルと接触させること、ならびに、前記化合物による前記1または2以上の対照細胞の増殖および/または生存の阻害のレベルを検出することをさらに含む。一部の態様において、1または2以上の対照細胞は、上皮間葉移行を経験していない上皮細胞である。ある態様において、1または2以上の対照細胞は、対照発現コンストラクトまたは対照低分子干渉核酸と接触させられる。一部の態様において、対照低分子干渉核酸は、1または2以上の対照細胞の内在遺伝子を標的とせず、随意にここで低分子干渉核酸は、GFPのmRNAを標的とする。一部の態様において、対照発現コンストラクトは、GFPタンパク質またはレポータータンパク質をコードする。一部の態様において、1または2以上の対照細胞は、非腫瘍原性細胞を含む。他の態様において、1または2以上の対照細胞は、腫瘍原性細胞を含む。
方法の一部の態様において、1または2以上の試験細胞の各々は、少なくとも1つの他の試験細胞とは、異なる用量の化合物と、および/もしくは異なる期間、接触させられ;ならびに/または、ここで、1または2以上の対照細胞の各々は、少なくとも1つの他の対照細胞とは異なる用量の化合物と、および/もしくは異なる期間、接触させられる。ある態様において、方法は、試験および/または対照の用量応答曲線を分析することをさらに含み、ここで試験用量応答曲線は、複数の用量での化合物による1または2以上の試験細胞の阻害のレベルを示し;ここで対照用量応答曲線は複数の用量での化合物による1または2以上の対照細胞の阻害のレベルを示す。一部の態様において、分析することは、化合物についての1または2以上の試験細胞および/または1または2以上の対照細胞に対するEC50値を決定することを含む。ある態様において、化合物についての1または2以上の対照細胞に対するEC50値は、該化合物についての1または2以上の試験細胞に対するEC50値よりも統計学的に有意により低い。他の態様において、化合物についての1または2以上の対照細胞に対するEC50値は、該化合物についての1または2以上の試験細胞に対するEC50値よりも統計学的に有意により高い。
一部の態様において、化合物は対照化合物であり、随意にこれは、ドキソルビシン、パクリタキセル、アクチノマイシンD、カンプトテシンおよびスタウロスポリンから選択される。
一部の態様において、1または2以上の対照細胞と1または2以上の試験細胞とは共培養中にある。ある態様において、1または2以上の試験細胞は、検出可能であって1または2以上の対照細胞の識別特徴(identifyingcharacteristic)と区別可能である識別特徴を有し、随意にここで識別特徴は、GFPタンパク質および/または癌幹細胞バイオマーカーの発現のレベルを含む。一部の態様において、1または2以上の試験細胞におけるGFPタンパク質の発現のレベルは、1または2以上の対照細胞におけるGFPタンパク質の発現のレベルと比較される。一部の態様において、方法は、共培養のサンプル中の各々の細胞の識別特徴を検出することにより1または2以上の試験細胞の1または2以上の対照細胞に対する比をモニタリングすることをさらに含み、随意にここで検出することは、蛍光励起細胞ソーティングを含む。
一部の態様において、1または2以上の対照細胞と1または2以上の試験細胞とは共培養中にある。ある態様において、1または2以上の試験細胞は、検出可能であって1または2以上の対照細胞の識別特徴(identifyingcharacteristic)と区別可能である識別特徴を有し、随意にここで識別特徴は、GFPタンパク質および/または癌幹細胞バイオマーカーの発現のレベルを含む。一部の態様において、1または2以上の試験細胞におけるGFPタンパク質の発現のレベルは、1または2以上の対照細胞におけるGFPタンパク質の発現のレベルと比較される。一部の態様において、方法は、共培養のサンプル中の各々の細胞の識別特徴を検出することにより1または2以上の試験細胞の1または2以上の対照細胞に対する比をモニタリングすることをさらに含み、随意にここで検出することは、蛍光励起細胞ソーティングを含む。
一部の態様において、方法は、複数の試験サンプルを試験することをさらに含み、ここで試験サンプルの各々は1または2以上の試験細胞の少なくとも1つを含み;および/または、複数の対照サンプルを試験することをさらに含み、ここで対照サンプルの各々は1または2以上の対照細胞の少なくとも1つを含む。一部の態様において、各々の試験サンプルおよび/または各々の対照サンプルは、別々の培養チャンバー中にあり、随意にここで、各々の培養チャンバーはマルチウェルプレートのウェルである。一部の態様において、マルチウェルプレートは、6、12、24、96、384または1536から選択される数のウェルを有する。
一部の態様において、化合物は、複数の化合物からなるライブラリーから得られ、随意にここでライブラリーは、天然生成物ライブラリー、多様性ライブラリー、キナーゼ阻害剤ライブラリー、HDAC阻害剤ライブラリー、公知の生物活性化合物のライブラリー、ペプチドライブラリー、抗体ライブラリー、またはRNAiライブラリーから選択される。ある態様において、1または2以上の試験細胞を接触させることは、化合物のサンプルをライブラリーから試験サンプルを含む培養チャンバーに移すことを含み;および/またはここで、1または2以上の対照細胞を接触させることは、化合物のサンプルをライブラリーから対照サンプルを含む培養チャンバーに移すことを含む。一部の態様において、方法は、1または2以上の対照細胞よりも1または2以上の試験細胞に対して細胞毒性がより高いリード化合物を、該化合物による1または2以上の試験細胞の増殖および/または生存の阻害のレベルを該化合物による1または2以上の対照細胞の増殖および/または生存の阻害のレベルと比較することにより同定することをさらに含む。ある態様において、方法は、1または2以上の癌細胞をリード化合物のサンプルと接触させること;および前記リード化合物による前記1または2以上の癌細胞の増殖および/または生存の阻害のレベルを検出することをさらに含む。一部の態様において、1または2以上の癌細胞は、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、子宮頚癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、または精巣腫瘍から得られる。ある態様において、1または2以上の癌細胞の少なくとも1つは癌幹細胞であり、これは、癌幹細胞のバイオマーカーを有する。
一部の態様において、癌幹細胞のバイオマーカーは、CD44+およびCD24−の細胞表面マーカープロフィールである。一部の態様において、癌幹細胞は、MDA-MB-231、SUM159またはT47D乳癌細胞である。
一部の態様において、1または2以上の癌細胞の増殖および/または生存の阻害のレベルを検出することは、前記1または2以上の癌細胞のうち少なくとも1種の癌幹細胞であるものの割合を決定することを含む。
一部の態様において、1または2以上の癌細胞の増殖および/または生存の阻害のレベルを検出することは、前記1または2以上の癌細胞のうち少なくとも1種の癌幹細胞であるものの割合を決定することを含む。
一部の態様において、1または2以上の癌細胞の増殖よび/または生存の阻害のレベルを検出することは、前記1または2以上の癌細胞が懸濁培養中でコロニーを形成する能力を決定することを含む。
一部の態様において、1または2以上の癌細胞の増殖よび/または生存の阻害のレベルを検出することは、1または2以上の癌細胞がin vivoで腫瘍を形成する能力を決定することを含む。
一部の態様において、1または2以上の癌細胞の増殖よび/または生存の阻害のレベルを検出することは、1または2以上の癌細胞がin vivoで腫瘍を形成する能力を決定することを含む。
一部の態様において、方法は、(i)効力の改善、(ii)毒性の低減(治療インデックスの改善);(iii)副作用の低減;(iv)治療作用の開始および/もしくは効果の持続期間の改変;ならびに/または(v)薬理動態パラメーター(吸収、分配、代謝および/もしくは排出)の改変を達成するために、リード化合物を改変することにより精製(refined)リード化合物を製造することをさらに含む。ある態様において、方法は、リード化合物または精製リード化合物の定量的構造活性関係性分析を行うことにより、リード化合物または精製リード化合物のinvivoでの毒性学プロフィールを決定することをさらに含む。一部の態様において、方法は、リード化合物または精製リード化合物を薬学的に受容可能なキャリアとともに製剤化することにより医薬組成物を製造することをさらに含む。一部の態様において、方法は、医薬組成物を癌細胞を有する対象に投与し、該対象に対する前記化合物の毒性ならびに/または前記対象における癌細胞の増殖および/もしくは生存に対する前記化合物の影響を評価することにより、リード化合物または精製リード化合物をinvivoで試験することをさらに含む。ある態様において、対象は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、非ヒト霊長類およびヒトから選択される。
一部の態様において、方法は、試験細胞および/または対照細胞における1または2以上の癌幹細胞マーカーの発現を決定することをさらに含む。ある態様において、1または2以上の癌幹細胞マーカーは、CD20、CD24、CD34、CD38、CD44、CD45、CD105、CD133、CD166、EpCAM、ESA、SCA1、PecamおよびStro1から選択される。一部の態様において、1または2以上の癌幹細胞マーカーは、CD24およびCD44である。
一部の態様において、化合物による試験細胞および/または対照細胞の増殖および/または生存の阻害のレベルを検出することは、細胞計数アッセイ、複製標識(replicationlabeling)アッセイ、細胞膜完全性(cell membrane integrity)アッセイ、細胞ATPに基づく生存率アッセイ、ミトコンドリアレダクターゼ活性アッセイ、カスパーゼ活性アッセイ、アネキシンV染色アッセイ、DNA含有量アッセイ、DNA分解アッセイ、および核断片化アッセイから選択されるアッセイを行うことを含む。
本発明の別の局面によれば、1または2以上の細胞を特徴づけるための方法が提供される。方法は、(a)1または2以上の細胞を、ドキソルビシン、パクリタキセル、アクチノマイシンD、カンプトテシンおよびスタウロスポリンから選択される化合物と接触させること、(b)前記化合物による1または2以上の細胞の増殖および/または生存の阻害のレベルを検出すること、ならびに(c)(b)の結果を対照のレベルと比較することを含み、ここで、前記化合物による前記1または2以上の細胞の増殖および/または生存の阻害のレベルが対照のレベルより統計学的に有意により低い場合、前記1または2以上の細胞は癌幹細胞の特徴を有する。
一部の態様において、方法は、1または2以上の細胞において癌幹細胞バイオマーカーを評価することをさらに含む。ある態様において、癌幹細胞バイオマーカーは、E−カドヘリン発現、TWIST発現、およびCD44/CD24細胞表面マーカープロフィールから選択される。一部の態様において、機能的アッセイは、コロニー形成アッセイまたはinvivo腫瘍播種アッセイである。
一部の態様において、対照のレベルは、化合物による、癌幹細胞ではない1または2以上の癌細胞の増殖および/または生存の阻害のレベルである。
一部の態様において、対照のレベルは、化合物による、癌幹細胞ではない1または2以上の癌細胞の増殖および/または生存の阻害のレベルである。
本発明の別の局面によれば、癌を有するかまたは有することが疑われる対象を処置するための方法が提供される。方法は、有効量のパクリタキセルを、エトポシド、サリノマイシン、アバメクチンまたはニゲリシンを含む医薬組成物の有効量と組み合わせて対象に投与することを含む。
本発明の別の局面によれば、癌を有するかまたは有することが疑われる対象を処置するための方法が提供される。方法は、エトポシド、サリノマイシン、アバメクチン、ニゲリシン、または前述のいずれかの誘導体を含む医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む。
本発明の別の局面によれば、癌を有するかまたは有することが疑われる対象を処置するための方法が提供される。方法は、エトポシド、サリノマイシン、アバメクチン、ニゲリシン、または前述のいずれかの誘導体を含む医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む。
本発明の別の局面によれば、癌を有する対象のための処置を選択するための方法が提供される。方法は、癌において癌幹細胞バイオマーカーを評価すること、および、癌幹細胞バイオマーカーが検出された場合は、サリノマイシン、アバメクチン、エトポシドまたはニゲリシンまたはそれらの誘導体を随意にパクリタキセルまたはその誘導体と組み合わせて含む医薬組成物の有効量を対象に投与することにより対象を処置することを含む。
一部の態様において、癌幹細胞バイオマーカーを評価することは、対象から癌のサンプルを得ることを含む。
一部の態様において、癌幹細胞バイオマーカーを評価することは、対象から癌のサンプルを得ることを含む。
一部の態様において、癌幹細胞バイオマーカーは、E−カドヘリン発現;TWIST発現、およびCD44/CD24細胞表面マーカープロフィールから選択される。ある態様において、癌におけるE−カドヘリンおよび/またはTWISTの発現は、癌におけるE−カドヘリンおよび/またはTWISTのタンパク質および/またはRNAの発現のレベルを測定すること、ならびに随意に前記レベルを参照標準と比較することにより決定される。一部の態様において、参照標準は、癌細胞におけるE−カドヘリンおよび/またはTWISTのタンパク質および/またはRNAの発現のレベルである。別の態様において、参照標準は、癌幹細胞ではない癌細胞におけるE−カドヘリンおよび/またはTWISTのタンパク質および/またはRNAの発現のレベルである。
一部の態様において、癌は、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、子宮頚癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、または精巣腫瘍である。ある態様において、癌は乳癌または肺癌である。
一部の態様において、対象は哺乳動物であり、これは随意にヒトである。
一部の態様において、医薬組成物は、静脈内で、筋肉内で、皮下で、腹腔内で、経口で、またはエアロゾルでとして投与される。
本発明の別の局面によれば、癌を有するかまたは有することが疑われる対象を処置するための方法が提供される。方法は、EMTを経験していない対照細胞の増殖(growth)および/または繁殖の阻害と比較して、EMTを経験した試験細胞の増殖および/または繁殖を選択的に阻害する化合物を含む医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む。
一部の態様において、試験細胞と対照細胞とは、遺伝子的に一致する。
一部の態様において、試験細胞は非腫瘍原性である。
一部の態様において、医薬組成物は、静脈内で、筋肉内で、皮下で、腹腔内で、経口で、またはエアロゾルでとして投与される。
本発明の別の局面によれば、癌を有するかまたは有することが疑われる対象を処置するための方法が提供される。方法は、EMTを経験していない対照細胞の増殖(growth)および/または繁殖の阻害と比較して、EMTを経験した試験細胞の増殖および/または繁殖を選択的に阻害する化合物を含む医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む。
一部の態様において、試験細胞と対照細胞とは、遺伝子的に一致する。
一部の態様において、試験細胞は非腫瘍原性である。
本発明の別の局面によれば、癌を有するかまたは有することが疑われる対象を処置するための方法が提供される。方法は、非CSC癌細胞に対するその効果と比較して癌幹細胞の増殖を選択的に阻害するかまたは癌幹細胞を殺傷する化合物の有効量を対象に投与することを含む。
本発明の別の局面によれば、癌を有するかまたは有することが疑われる対象を処置するための方法が提供される。方法は、非癌性細胞に対するその効果と比較して癌幹細胞の増殖を選択的に阻害するかまたは癌幹細胞を殺傷する化合物の有効量を対象に投与することを含む。
本発明の別の局面によれば、癌を有するかまたは有することが疑われる対象を処置するための方法が提供される。方法は、非癌性細胞に対するその効果と比較して癌幹細胞の増殖を選択的に阻害するかまたは癌幹細胞を殺傷する化合物の有効量を対象に投与することを含む。
本発明の別の局面によれば、薬物の発見のための標的を同定する方法が提供される。方法は、試験細胞の増殖および/または繁殖を選択的に阻害する化合物を提供する工程、ここで、前記試験細胞はEMTを経験した細胞である;ならびに前記化合物の生物学的標的を同定する工程を含む。
一部の態様において、生物学的標的は、前記試験細胞により発現されるタンパク質またはRNAである。
一部の態様において、化合物は、表1に列記される化合物またはその誘導体である。
一部の態様において、方法は、生物学的標的と相互作用するかまたはこれに作用する第2の化合物を同定するためのスクリーニングを行うことをさらに含む。
一部の態様において、生物学的標的は、前記試験細胞により発現されるタンパク質またはRNAである。
一部の態様において、化合物は、表1に列記される化合物またはその誘導体である。
一部の態様において、方法は、生物学的標的と相互作用するかまたはこれに作用する第2の化合物を同定するためのスクリーニングを行うことをさらに含む。
本発明の別の局面によれば、薬物の発見のための標的を同定する方法が提供される。方法は、試験細胞または試験細胞溶解物を、前記試験細胞の増殖および/または繁殖を選択的に阻害する化合物と接触させる工程、ここで、接触は、前記化合物が細胞の生体分子と物理的に相互作用することができる条件下において行われ、ここで、前記試験細胞はEMTを経験した細胞である;前記化合物と物理的に相互作用する細胞の生体分子を単離する工程;ならびに前記生体分子を同定する工程を含む。
一部の態様において、方法は、生体分子と相互作用するかまたはこれに作用する第2の化合物を同定するためのスクリーニングを行うことをさらに含む。
一部の態様において、化合物は、表1に列記される化合物またはその誘導体である。
一部の態様において、化合物は、支持体に結合して、それによりアフィニティーマトリックスを形成している。
一部の態様において、化合物は、表1に列記される化合物またはその誘導体である。
一部の態様において、化合物は、支持体に結合して、それによりアフィニティーマトリックスを形成している。
本発明の別の局面によれば、癌幹細胞を生成する方法が提供される。方法は、EMTを経験するように癌細胞を誘導することを含む。
一部の態様において、癌細胞は、実験的に生成された癌細胞である。一部の態様において、実験的に生成された癌細胞は、癌遺伝子をコードする発現ベクターを含む。ある態様において、癌遺伝子はV12H-RASである。
一部の態様において、癌細胞は、天然に存在する癌に由来する。
一部の態様において、癌細胞は、実験的に生成された癌細胞である。一部の態様において、実験的に生成された癌細胞は、癌遺伝子をコードする発現ベクターを含む。ある態様において、癌遺伝子はV12H-RASである。
一部の態様において、癌細胞は、天然に存在する癌に由来する。
一部の態様において、上皮間葉移行は、癌細胞においてE−カドヘリンの活性を阻害することからもたらされる。ある態様において、癌細胞においてE−カドヘリンの活性を阻害することは、癌細胞をE−カドヘリンに対する遮断抗体と接触させること(これは癌細胞におけるディスアドヘリンの発現を含む)、または癌細胞において細胞極性遺伝子を干渉することを含む。ある他の態様において、癌細胞においてE−カドヘリンの活性を阻害することは、癌細胞を、E−カドヘリンのmRNAに相補的な低分子干渉核酸と接触させることを含む。
一部の態様において、癌細胞は、1または2以上の試験細胞において転写因子を発現させることにより、EMTを経験するよう誘導され、ここで転写因子は、Snail1、Snail2、グースコイド、FoxC2、TWIST、E2A、SIP-1/Zeb-2、dEF1/ZEb1、LEF1、Myc、HMGA2、TAZ、Klf8、HIF-1、HOXB7、SIM2sおよびFosから選択される。ある態様において、癌細胞は、転写因子の活性を構成的に誘導することにより、EMTを経験するよう誘導される。
一部の態様において、癌幹細胞が(i)腫瘍を惹起する;(ii)ソフトアガー懸濁培養中でコロニーを形成する;および/または(iii)腫瘍球(tumorsphere)を形成する可能性が、EMTを経験するように誘導されていない癌細胞が有する可能性と比較して増大している。
一部の態様において、方法は、試験剤が癌幹細胞の増殖、ソフトアガー懸濁培養中でのコロニー形成、腫瘍球形成および/または腫瘍惹起能力を阻害する能力を評価することをさらに含む。ある態様において、試験剤は、癌幹細胞の増殖、ソフトアガー懸濁培養中でのコロニー形成、腫瘍球形成および/または腫瘍惹起能力が阻害された場合、癌治療のための候補の薬剤として同定される。
一部の態様において、方法は、試験剤が癌幹細胞の増殖、ソフトアガー懸濁培養中でのコロニー形成、腫瘍球形成および/または腫瘍惹起能力を阻害する能力を評価することをさらに含む。ある態様において、試験剤は、癌幹細胞の増殖、ソフトアガー懸濁培養中でのコロニー形成、腫瘍球形成および/または腫瘍惹起能力が阻害された場合、癌治療のための候補の薬剤として同定される。
一部の態様において、方法は、癌幹細胞の特性を有する癌細胞を動物宿主中へ導入することをさらに含む。ある態様において、方法は、試験剤が動物宿主における癌幹細胞の増殖または腫瘍惹起能力を阻害する能力を評価することをさらに含む。特定の態様において、試験剤は、癌幹細胞の増殖または腫瘍惹起能力が阻害された場合、癌治療のための候補の薬剤として同定される。
本発明の一面によれば、前述の方法のいずれかにより生成された癌幹細胞が提供される。
本発明の他の局面によれば、前述の癌幹細胞を含む動物宿主が提供される。
本発明の他の局面によれば、前述の癌幹細胞を含む動物宿主が提供される。
本発明の他の局面によれば、本明細書において開示される方法のいずれかを用いて癌幹細胞を生成するためにEMTを経験するように誘導された癌細胞を有する容器を含むキットが提供される。一部の態様において、キットは、EMTを経験するように誘導されていない、癌幹細胞を生成するためにEMTを経験するように誘導された癌細胞と遺伝的に一致する癌細胞を有する第2の容器をさらに含む。
本発明の他の局面によれば、本明細書において開示される方法のいずれかを用いて非癌幹細胞を生成するためにEMTを経験するように誘導された非癌細胞を有する容器を含むキットが提供される。一部の態様において、キットは、EMTを経験するように誘導されていない、非癌幹細胞を生成するためにEMTを経験するように誘導された非癌細胞と遺伝的に一致する非癌細胞を有する第2の容器をさらに含む。
ある態様において、キットと共に提供される容器は、凍結保存剤をさらに含む。キットは、任意の1つの特定の凍結保存剤に限定されず、当業者は、適切な凍結保存剤(例えばDMSO)を選択することができることが理解されるべきである。細胞の凍結保存のための例示的な方法および試薬は、FreshneyR.I.、Culture of Animal Cells、A Manual of Basic Technique、第4版、第19章、Wiley-Liss,Inc. (2000)において開示される。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
化合物が癌幹細胞の増殖および/または生存を阻害する能力を試験するための方法であって、
(a)1または2以上の試験細胞を化合物のサンプルと接触させること、ここで前記1または2以上の試験細胞は上皮間葉移行を経験したものである、および
(b)前記化合物による前記1または2以上の試験細胞の増殖および/または生存の阻害のレベルを検出すること
を含む、前記方法。
(項目2)
上皮間葉移行が1または2以上の試験細胞においてE−カドヘリンの活性を阻害することからもたらされる、項目1に記載の方法。
(項目3)
1または2以上の試験細胞においてE−カドヘリンの活性を阻害することが、前記1または2以上の試験細胞をE−カドヘリンに対する遮断抗体と接触させること、前記1または2以上の試験細胞においてディスアドヘリンの発現を誘導すること、または前記1または2以上の試験細胞において細胞極性遺伝子を干渉することを含む、項目2に記載の方法。
(項目4)
1または2以上の試験細胞においてE−カドヘリンの活性を阻害することが、前記1または2以上の試験細胞を、E−カドヘリンのmRNAに相補的な低分子干渉核酸と接触させることを含む、項目2に記載の方法。
(項目5)
上皮間葉移行が1または2以上の試験細胞において転写因子の活性を誘導することからもたらされ、ここで転写因子が:Snail1、Snail2、グースコイド、FoxC2、TWIST、E2A、SIP-1/Zeb-2、dEF1/ZEb1、LEF1、Myc、HMGA2、TAZ、Klf8、HIF-1、HOXB7、SIM2sおよびFosから選択される、項目1に記載の方法。
(項目6)
上皮間葉移行がTWISTの活性を誘導することからもたらされる、項目1に記載の方法。
(項目7)
1または2以上の試験細胞においてTWISTの活性を誘導することが、前記1または2以上の試験細胞をTWISTをコードする発現ベクターと接触させることを含む、項目6に記載の方法。
(項目8)
上皮間葉移行が、1または2以上の試験細胞を、TGF-β/BMPスーパーファミリーのメンバー、Wnt-ファミリーのメンバー、FGFファミリーのメンバー、Notchリガンド、EGFファミリーのメンバー、IGFファミリーのメンバー、PDGFおよびHGFから選択される増殖因子と接触させることからもたらされる、項目1に記載の方法。
(項目9)
上皮間葉移行が、1または2以上の試験細胞においてシグナル経路の活性を調節することからもたらされ、ここでシグナル経路は、TGF-β、Wnt、BMP、Notch、HGF-Met、EGF、IGF、PDGF、FGF、P38-mapk、Ras、PI3キナーゼ-Akt、SrcおよびNF-kBから選択される、項目1に記載の方法。
(項目10)
上皮間葉移行が、1または2以上の試験細胞を、低酸素、放射線照射および慢性化学療法処置から選択されるストレスに供することからもたらされる、項目1に記載の方法。
(項目11)
上皮間葉移行が、1または2以上の試験細胞を、ニコチン、nAChRアゴニスト、過酸化水素、C3aまたはMFG-E8による処置に供することからもたらされる、項目1に記載の方法。
(項目12)
1または2以上の試験細胞が非腫瘍原性細胞を含む、項目1に記載の方法。
(項目13)
1または2以上の試験細胞が腫瘍原性細胞を含む、項目1に記載の方法。
(項目14)
(a)1または2以上の試験細胞および1または2以上の対照細胞を、化合物のサンプルと接触させること、ここで、前記1または2以上の試験細胞は上皮間葉移行を経験しており、前記1または2以上の対照細胞はEMTを経験していない、ならびに
(b)前記化合物による前記1または2以上の試験細胞および対照細胞の増殖および/または生存の阻害のレベルを検出すること;ならびに
(c)前記化合物が前記試験細胞の増殖および/または生存に対して対照細胞よりも高い阻害効果を有する場合、前記化合物をCSC選択的な化学療法剤の候補として同定すること
を含む、項目1に記載の方法。
(項目15)
試験細胞および対照細胞が遺伝子的に一致する、項目14に記載の方法。
(項目16)
試験細胞は、E−カドヘリンの発現を阻害する低分子干渉RNAを発現するかまたは含み、対照細胞はかかるRNAを発現しない、項目14に記載の方法。
(項目17)
1または2以上の対照細胞を化合物のサンプルと接触させること、ならびに、前記化合物による前記1または2以上の対照細胞の増殖および/または生存の阻害のレベルを検出することをさらに含む、項目1〜16のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
1または2以上の対照細胞が上皮間葉移行を経験していない上皮細胞である、項目17に記載の方法。
(項目19)
1または2以上の対照細胞が、対照発現コンストラクトまたは対照低分子干渉核酸と接触させられる、項目17または18に記載の方法。
(項目20)
対照低分子干渉核酸が1または2以上の対照細胞の内在遺伝子を標的とせず、随意にここで低分子干渉核酸がGFPのmRNAを標的とする、項目19に記載の方法。
(項目21)
対照発現コンストラクトがGFPをコードする、項目20に記載の方法。
(項目22)
対照発現コンストラクトがレポータータンパク質をコードする、項目21に記載の方法。
(項目23)
1または2以上の対照細胞が非腫瘍原性細胞を含む、項目18に記載の方法。
(項目24)
1または2以上の対照細胞が腫瘍原性細胞を含む、項目18に記載の方法。
(項目25)
1または2以上の試験細胞の各々は、少なくとも1つの他の試験細胞とは異なる用量の化合物と、および/もしくは異なる期間、接触させられ;ならびに/または、ここで、1または2以上の対照細胞の各々は、少なくとも1つの他の対照細胞とは異なる用量の化合物と、および/もしくは異なる期間、接触させられる、項目1〜24のいずれか一項に記載の方法。
(項目26)
試験および/または対照の用量応答曲線を分析することをさらに含み、ここで試験用量応答曲線は、複数の用量での化合物による1または2以上の試験細胞の阻害のレベルを示し;ここで、対照用量応答曲線は複数の用量での化合物による1または2以上の対照細胞の阻害のレベルを示す、項目25に記載の方法。
(項目27)
分析することが、化合物についての1または2以上の試験細胞および/または1または2以上の対照細胞に対するEC50値を決定することを含む、項目26に記載の方法。
(項目28)
化合物についての1または2以上の対照細胞に対するEC50値が、該化合物についての1または2以上の試験細胞に対するEC50値よりも統計学的に有意により低い、項目27に記載の方法。
(項目29)
化合物についての1または2以上の対照細胞に対するEC50値が、該化合物についての1または2以上の試験細胞に対するEC50値よりも統計学的に有意により高い、項目27に記載の方法。
(項目30)
化合物が対照化合物であり、随意にこれは、ドキソルビシン、パクリタキセル、アクチノマイシンD、カンプトテシンおよびスタウロスポリンから選択される、項目25〜28のいずれか一項に記載の方法。
(項目31)
1または2以上の対照細胞と1または2以上の試験細胞とが共培養中にある、項目17〜24のいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
1または2以上の試験細胞が、検出可能であって1または2以上の対照細胞の識別特徴と区別可能である識別特徴を有し、随意にここで前記識別特徴はGFPタンパク質および/または癌幹細胞バイオマーカーの発現のレベルを含む、項目31に記載の方法。
(項目33)
1または2以上の試験細胞におけるGFPタンパク質の発現のレベルが、1または2以上の対照細胞におけるGFPタンパク質の発現のレベルと比較される、項目32に記載の方法。
(項目34)
共培養のサンプル中の各々の細胞の識別特徴を検出することにより1または2以上の試験細胞の1または2以上の対照細胞に対する比をモニタリングすることをさらに含み、随意にここで検出することは蛍光励起細胞ソーティングを含む、項目32または33に記載の方法。
(項目35)
複数の試験サンプルを試験することをさらに含み、ここで前記試験サンプルの各々は1または2以上の試験細胞の少なくとも1つを含み;および/または、複数の対照サンプルを試験することをさらに含み、ここで前記対照サンプルの各々は1または2以上の対照細胞の少なくとも1つを含む、項目1〜24のいずれか一項に記載の方法。
(項目36)
各々の試験サンプルおよび/または各々の対照サンプルが別々の培養チャンバー中にあり、随意にここで各々の培養チャンバーはマルチウェルプレートのウェルである、項目35に記載の方法。
(項目37)
マルチウェルプレートが、6、12、24、96、384または1536から選択される数のウェルを有する、項目36に記載の方法。
(項目38)
化合物が複数の化合物からなるライブラリーから得られ、随意にここでライブラリーは、天然生成物ライブラリー、多様性ライブラリー、キナーゼ阻害剤ライブラリー、HDAC阻害剤ライブラリー、公知の生物活性化合物のライブラリー、ペプチドライブラリー、抗体ライブラリー、またはRNAiライブラリーから選択される、項目1〜24および35〜37のいずれか一項に記載の方法。
(項目39)
1または2以上の試験細胞を接触させることが、化合物のサンプルをライブラリーから試験サンプルを含む培養チャンバーに移すことを含み;および/またはここで、1または2以上の対照細胞を接触させることが、化合物のサンプルをライブラリーから対照サンプルを含む培養チャンバーに移すことを含む、項目38に記載の方法。
(項目40)
1または2以上の対照細胞よりも1または2以上の試験細胞に対して細胞毒性が実質的により高いリード化合物を、該化合物による前記1または2以上の試験細胞の増殖および/または生存の阻害のレベルを該化合物による前記1または2以上の対照細胞の増殖および/または生存の阻害のレベルと比較することにより同定することをさらに含む、項目39に記載の方法。
(項目41)
1または2以上の癌細胞をリード化合物のサンプルと接触させること;および前記リード化合物による前記1または2以上の癌細胞の増殖および/または生存の阻害のレベルを検出することをさらに含む、項目40に記載の方法。
(項目42)
1または2以上の癌細胞が、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、子宮頚癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、または精巣腫瘍から得られる、項目41に記載の方法。
(項目43)
1または2以上の癌細胞の少なくとも1つが癌幹細胞であり、これは癌幹細胞のバイオマーカーを有する、項目41または42に記載の方法。
(項目44)
癌幹細胞のバイオマーカーがCD44 + およびCD24 − の細胞表面マーカープロフィールである、項目35または43に記載の方法。
(項目45)
癌幹細胞が、MDA-MB-231、SUM159またはT47D乳癌細胞である、項目42または43に記載の方法。
(項目46)
1または2以上の癌細胞の増殖および/または生存の阻害のレベルを検出することが、前記1または2以上の癌細胞のうち少なくとも1種の癌幹細胞であるものの割合を決定することを含む、項目41〜45のいずれか一項に記載の方法。
(項目47)
1または2以上の癌細胞の増殖よび/または生存の阻害のレベルを検出することが、前記1または2以上の癌細胞が懸濁培養中でコロニーを形成する能力を決定することを含む、項目41〜45のいずれか一項に記載の方法。
(項目48)
1または2以上の癌細胞の増殖よび/または生存の阻害のレベルを検出することが、前記1または2以上の癌細胞がin vivoで腫瘍を形成する能力を決定することを含む、項目41〜45のいずれか一項に記載の方法。
(項目49)
(i)効力の改善、(ii)毒性の低減、これは随意に治療インデックスの改善であってもよい;(iii)副作用の低減;(iv)治療作用の開始および/もしくは効果の持続期間の改変;ならびに/または(v)薬理動態パラメーター、これは随意に吸収、分配、代謝および/もしくは排出であってもよい、の改変を達成するためにリード化合物を改変することにより、精製リード化合物を製造することをさらに含む、項目40〜48のいずれか一項に記載の方法。
(項目50)
リード化合物または精製リード化合物の定量的構造活性関係性分析を行うことにより、前記リード化合物または精製リード化合物のin vivoでの毒性学プロフィールを決定することをさらに含む、項目49に記載の方法。
(項目51)
リード化合物または精製リード化合物を薬学的に受容可能なキャリアとともに製剤化することにより医薬組成物を製造することをさらに含む、項目49または50に記載の方法。
(項目52)
癌細胞を有する対象に医薬組成物を投与し、前記対象に対する化合物の毒性、ならびに/または前記対象における癌細胞の増殖および/もしくは生存に対する化合物の影響を評価することにより、リード化合物または精製リード化合物をinvivoで試験することをさらに含む、項目51に記載の方法。
(項目53)
対象が、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、非ヒト霊長類およびヒトから選択される、項目52に記載の方法。
(項目54)
試験細胞および/または対照細胞における1または2以上の癌幹細胞マーカーの発現を決定することをさらに含む、項目1〜24のいずれか一項に記載の方法。
(項目55)
1または2以上の癌幹細胞マーカーが、CD20、CD24、CD34、CD38、CD44、CD45、CD105、CD133、CD166、EpCAM、ESA、SCA1、PecamおよびStro1から選択される、項目54に記載の方法。
(項目56)
1または2以上の癌幹細胞マーカーがCD24およびCD44である、項目55に記載の方法。
(項目57)
化合物による試験細胞および/または対照細胞の増殖および/または生存の阻害のレベルを検出することが、細胞計数アッセイ、複製標識アッセイ、細胞膜完全性アッセイ、細胞ATPに基づく生存率アッセイ、ミトコンドリアレダクターゼ活性アッセイ、カスパーゼ活性アッセイ、アネキシンV染色アッセイ、DNA含有量アッセイ、DNA分解アッセイ、および核断片化アッセイから選択されるアッセイを行うことを含む、項目1〜56のいずれか一項に記載の方法。
(項目58)
1または2以上の細胞を特徴づけるための方法であって、
(a)1または2以上の細胞を、ドキソルビシン、パクリタキセル、アクチノマイシンD、カンプトテシンおよびスタウロスポリンから選択される化合物と接触させること、
(b)前記化合物による1または2以上の細胞の増殖および/または生存の阻害のレベルを検出すること、ならびに
(c)(b)の結果を対照レベルと比較すること、ここで、前記化合物による前記1または2以上の細胞の増殖および/または生存の阻害のレベルが対照レベルより統計学的に有意により低い場合、前記1または2以上の細胞は癌幹細胞の特徴を有する、
を含む、前記方法。
(項目59)
1または2以上の細胞において癌幹細胞バイオマーカーまたは機能的アッセイを評価することをさらに含む、項目58に記載の方法。
(項目60)
癌幹細胞バイオマーカーが、E−カドヘリン発現、TWIST発現、およびCD44/CD24細胞表面マーカープロフィールから選択される、項目59に記載の方法。
(項目61)
機能的アッセイが、コロニー形成アッセイまたはin vivo腫瘍播種アッセイである、項目59に記載の方法。
(項目62)
対照レベルが、化合物による癌幹細胞ではない1または2以上の癌細胞の増殖および/または生存の阻害のレベルである、項目58に記載の方法。
(項目63)
癌を有するかまたは有することが疑われる対象を処置するための方法であって、パクリタキセルの有効量を、エトポシド、サリノマイシン、アバメクチンまたはニゲリシンを含む医薬組成物の有効量と組み合わせて前記対象に投与することを含む、前記方法。
(項目64)
癌を有するかまたは有することが疑われる対象を処置するための方法であって、エトポシド、サリノマイシン、アバメクチン、ニゲリシンまたは前述のいずれかの誘導体を含む医薬組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
(項目65)
癌を有する対象のための処置を選択するための方法であって、癌における癌幹細胞バイオマーカーを評価すること、および、前記癌幹細胞バイオマーカーが検出された場合は、サリノマイシン、アバメクチン、エトポシドまたはニゲリシンまたはそれらの誘導体を随意にパクリタキセルまたはその誘導体と組み合わせて含む医薬組成物の有効量を前記対象に投与することにより該対象を処置することを含む、前記方法。
(項目66)
癌幹細胞バイオマーカーが、E−カドヘリン発現;TWIST発現、およびCD44/CD24細胞表面マーカープロフィールから選択される、項目65に記載の方法。
(項目67)
癌幹細胞バイオマーカーを評価することが、対象から癌のサンプルを得ることを含む、項目63〜66のいずれか一項に記載の方法。
(項目68)
癌におけるE−カドヘリンおよび/またはTWISTの発現が、癌におけるE−カドヘリンおよび/またはTWISTのタンパク質および/またはRNAの発現のレベルを測定すること、ならびに随意に前記レベルを参照標準と比較することにより決定される、項目66に記載の方法。
(項目69)
参照標準が、癌幹細胞におけるE−カドヘリンおよび/またはTWISTのタンパク質および/またはRNAの発現のレベルである、項目68に記載の方法。
(項目70)
参照標準が、癌幹細胞ではない癌細胞におけるE−カドヘリンおよび/またはTWISTのタンパク質および/またはRNAの発現のレベルである、項目68に記載の方法。
(項目71)
癌が、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、子宮頚癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、または精巣腫瘍である、項目63〜70のいずれか一項に記載の方法。
(項目72)
癌が乳癌または肺癌である、項目63〜71のいずれか一項に記載の方法。
(項目73)
対象が哺乳動物であり、これは随意にヒトである、項目63〜72のいずれか一項に記載の方法
(項目74)
医薬組成物が、静脈内で、筋肉内で、皮下で、腹腔内で、経口で、またはエアロゾルとして投与される、項目63〜73のいずれか一項に記載の方法
(項目75)
癌を有するかまたは有することが疑われる対象を処置するための方法であって、EMTを経験していない対照細胞の増殖および/または繁殖の阻害と比較して、EMTを経験した試験細胞の増殖および/または繁殖を選択的に阻害する化合物を含む医薬組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
(項目76)
試験細胞と対照細胞とが遺伝子的に一致する、項目75に記載の方法。
(項目77)
試験細胞が非腫瘍原性である、項目75に記載の方法。
(項目78)
癌を有するかまたは有することが疑われる対象を処置するための方法であって、非CSC癌細胞に対するその効果と比較して癌幹細胞の増殖を選択的に阻害するかまたは癌幹細胞を殺傷する化合物の有効量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
(項目79)
癌を有するかまたは有することが疑われる対象を処置するための方法であって、非癌性細胞に対するその効果と比較して癌幹細胞の増殖を選択的に阻害するかまたは癌幹細胞を殺傷する化合物の有効量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
(項目80)
薬物の発見のための標的を同定する方法であって、
(a)試験細胞の増殖および/または繁殖を選択的に阻害する化合物を提供すること、ここで、前記試験細胞はEMTを経験した細胞である;ならびに
(b)前記化合物の生物学的標的を同定すること
を含む、前記方法。
(項目81)
生物学的標的が、試験細胞により発現されるタンパク質またはRNAである、項目80に記載の方法。
(項目82)
化合物が、表1に列記される化合物またはその誘導体である、項目80に記載の方法。
(項目83)
生物学的標的と相互作用するかまたはこれに作用する第2の化合物を同定するためのスクリーニングを行うことをさらに含む、項目80に記載の方法。
(項目84)
薬物の発見のための標的を同定する方法であって、以下の工程:
(a)試験細胞または試験細胞溶解物を、前記試験細胞の増殖および/または繁殖を選択的に阻害する化合物と接触させること、ここで接触は前記化合物が細胞の生体分子と物理的に相互作用することができる条件下において行われ、ここで前記試験細胞はEMTを経験した細胞である;
(b)前記化合物と物理的に相互作用する細胞の生体分子を単離すること;ならびに
(c)前記生体分子を同定すること
を含む、前記方法。
(項目85)
生体分子と相互作用するかまたはこれに作用する第2の化合物を同定するためのスクリーニングを行うことをさらに含む、項目84に記載の方法。
(項目86)
化合物が表1に列記される化合物またはその誘導体である、項目84に記載の方法。
(項目87)
化合物が支持体に結合してそれによりアフィニティーマトリックスを形成している、項目84に記載の方法。
(項目88)
癌幹細胞を生成する方法であって、EMTを経験するように癌細胞を誘導することを含む、前記方法。
(項目89)
癌細胞が実験的に生成された癌細胞である、項目88に記載の方法。
(項目90)
癌細胞が天然に存在する癌に由来する、項目88に記載の方法。
(項目91)
上皮間葉移行が、癌細胞においてE−カドヘリンの活性を阻害することからもたらされる、項目88に記載の方法。
(項目92)
癌細胞においてE−カドヘリンの活性を阻害することが、前記癌細胞をE−カドヘリンに対する遮断抗体と接触させること、前記癌細胞においてディスアドヘリンの発現を誘導すること、または前記癌細胞において細胞極性遺伝子を干渉することを含む、項目91に記載の方法。
(項目93)
癌細胞においてE−カドヘリンの活性を阻害することが、前記癌細胞をE−カドヘリンのmRNAに相補的な低分子干渉核酸と接触させることを含む、項目92に記載の方法。
(項目94)
癌細胞が、1または2以上の試験細胞において転写因子を発現させることにより、EMTを経験するよう誘導され、ここで前記転写因子は、Snail 1、Snail2、グースコイド、FoxC2、TWIST、E2A、SIP-1/Zeb-2、dEF1/ZEb1、LEF1、Myc、HMGA2、TAZ、Klf8、HIF-1、HOXB7、SIM2sおよびFosから選択される、項目88に記載の方法。
(項目95)
癌細胞が、転写因子の活性を構成的に誘導することにより、EMTを経験するよう誘導される、項目94に記載の方法。
(項目96)
癌幹細胞が(i)腫瘍を惹起する;(ii)ソフトアガー懸濁培養中でコロニーを形成する;および/または(iii)腫瘍球を形成する可能性が、EMTを経験するように誘導されていない癌細胞が有する可能性と比較して増大している、項目88に記載の方法。
(項目97)
実験的に生成された癌細胞が、癌遺伝子をコードする発現ベクターを含む、項目89に記載の方法。
(項目98)
癌遺伝子がV12H-RASである、項目97に記載の方法。
(項目99)
試験剤が癌幹細胞の増殖、ソフトアガー懸濁培養中でのコロニー形成、腫瘍球形成および/または腫瘍惹起能力を阻害する能力を評価することをさらに含む、項目88に記載の方法。
(項目100)
癌幹細胞の増殖、ソフトアガー懸濁培養中でのコロニー形成、腫瘍球形成および/または腫瘍惹起能力が阻害された場合に、試験剤が癌治療のための候補の薬剤として同定される、項目99に記載の方法。
(項目101)
癌幹細胞の特性を有する癌細胞を動物宿主中へ導入することをさらに含む、項目88に記載の方法。
(項目102)
試験剤が動物宿主における癌幹細胞の増殖または腫瘍惹起能力を阻害する能力を評価することをさらに含む、項目101に記載の方法。
(項目103)
癌幹細胞の増殖または腫瘍惹起能力が阻害された場合に、試験剤が癌治療のための候補の薬剤として同定される、項目102に記載の方法。
(項目104)
項目88〜98のいずれか一項に記載の方法により生成された癌幹細胞。
(項目105)
項目104に記載の細胞を含む動物宿主。
(項目106)
項目104に記載の癌幹細胞を有する容器を含むキット。
(項目107)
EMTを経験するように誘導されていない、癌幹細胞を生成するためにEMTを経験するように誘導された癌細胞と遺伝的に一致する癌細胞を有する第2の容器をさらに含む、項目106に記載のキット。
(項目108)
容器が凍結保存剤をさらに含む、項目106または107に記載のキット。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
化合物が癌幹細胞の増殖および/または生存を阻害する能力を試験するための方法であって、
(a)1または2以上の試験細胞を化合物のサンプルと接触させること、ここで前記1または2以上の試験細胞は上皮間葉移行を経験したものである、および
(b)前記化合物による前記1または2以上の試験細胞の増殖および/または生存の阻害のレベルを検出すること
を含む、前記方法。
(項目2)
上皮間葉移行が1または2以上の試験細胞においてE−カドヘリンの活性を阻害することからもたらされる、項目1に記載の方法。
(項目3)
1または2以上の試験細胞においてE−カドヘリンの活性を阻害することが、前記1または2以上の試験細胞をE−カドヘリンに対する遮断抗体と接触させること、前記1または2以上の試験細胞においてディスアドヘリンの発現を誘導すること、または前記1または2以上の試験細胞において細胞極性遺伝子を干渉することを含む、項目2に記載の方法。
(項目4)
1または2以上の試験細胞においてE−カドヘリンの活性を阻害することが、前記1または2以上の試験細胞を、E−カドヘリンのmRNAに相補的な低分子干渉核酸と接触させることを含む、項目2に記載の方法。
(項目5)
上皮間葉移行が1または2以上の試験細胞において転写因子の活性を誘導することからもたらされ、ここで転写因子が:Snail1、Snail2、グースコイド、FoxC2、TWIST、E2A、SIP-1/Zeb-2、dEF1/ZEb1、LEF1、Myc、HMGA2、TAZ、Klf8、HIF-1、HOXB7、SIM2sおよびFosから選択される、項目1に記載の方法。
(項目6)
上皮間葉移行がTWISTの活性を誘導することからもたらされる、項目1に記載の方法。
(項目7)
1または2以上の試験細胞においてTWISTの活性を誘導することが、前記1または2以上の試験細胞をTWISTをコードする発現ベクターと接触させることを含む、項目6に記載の方法。
(項目8)
上皮間葉移行が、1または2以上の試験細胞を、TGF-β/BMPスーパーファミリーのメンバー、Wnt-ファミリーのメンバー、FGFファミリーのメンバー、Notchリガンド、EGFファミリーのメンバー、IGFファミリーのメンバー、PDGFおよびHGFから選択される増殖因子と接触させることからもたらされる、項目1に記載の方法。
(項目9)
上皮間葉移行が、1または2以上の試験細胞においてシグナル経路の活性を調節することからもたらされ、ここでシグナル経路は、TGF-β、Wnt、BMP、Notch、HGF-Met、EGF、IGF、PDGF、FGF、P38-mapk、Ras、PI3キナーゼ-Akt、SrcおよびNF-kBから選択される、項目1に記載の方法。
(項目10)
上皮間葉移行が、1または2以上の試験細胞を、低酸素、放射線照射および慢性化学療法処置から選択されるストレスに供することからもたらされる、項目1に記載の方法。
(項目11)
上皮間葉移行が、1または2以上の試験細胞を、ニコチン、nAChRアゴニスト、過酸化水素、C3aまたはMFG-E8による処置に供することからもたらされる、項目1に記載の方法。
(項目12)
1または2以上の試験細胞が非腫瘍原性細胞を含む、項目1に記載の方法。
(項目13)
1または2以上の試験細胞が腫瘍原性細胞を含む、項目1に記載の方法。
(項目14)
(a)1または2以上の試験細胞および1または2以上の対照細胞を、化合物のサンプルと接触させること、ここで、前記1または2以上の試験細胞は上皮間葉移行を経験しており、前記1または2以上の対照細胞はEMTを経験していない、ならびに
(b)前記化合物による前記1または2以上の試験細胞および対照細胞の増殖および/または生存の阻害のレベルを検出すること;ならびに
(c)前記化合物が前記試験細胞の増殖および/または生存に対して対照細胞よりも高い阻害効果を有する場合、前記化合物をCSC選択的な化学療法剤の候補として同定すること
を含む、項目1に記載の方法。
(項目15)
試験細胞および対照細胞が遺伝子的に一致する、項目14に記載の方法。
(項目16)
試験細胞は、E−カドヘリンの発現を阻害する低分子干渉RNAを発現するかまたは含み、対照細胞はかかるRNAを発現しない、項目14に記載の方法。
(項目17)
1または2以上の対照細胞を化合物のサンプルと接触させること、ならびに、前記化合物による前記1または2以上の対照細胞の増殖および/または生存の阻害のレベルを検出することをさらに含む、項目1〜16のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
1または2以上の対照細胞が上皮間葉移行を経験していない上皮細胞である、項目17に記載の方法。
(項目19)
1または2以上の対照細胞が、対照発現コンストラクトまたは対照低分子干渉核酸と接触させられる、項目17または18に記載の方法。
(項目20)
対照低分子干渉核酸が1または2以上の対照細胞の内在遺伝子を標的とせず、随意にここで低分子干渉核酸がGFPのmRNAを標的とする、項目19に記載の方法。
(項目21)
対照発現コンストラクトがGFPをコードする、項目20に記載の方法。
(項目22)
対照発現コンストラクトがレポータータンパク質をコードする、項目21に記載の方法。
(項目23)
1または2以上の対照細胞が非腫瘍原性細胞を含む、項目18に記載の方法。
(項目24)
1または2以上の対照細胞が腫瘍原性細胞を含む、項目18に記載の方法。
(項目25)
1または2以上の試験細胞の各々は、少なくとも1つの他の試験細胞とは異なる用量の化合物と、および/もしくは異なる期間、接触させられ;ならびに/または、ここで、1または2以上の対照細胞の各々は、少なくとも1つの他の対照細胞とは異なる用量の化合物と、および/もしくは異なる期間、接触させられる、項目1〜24のいずれか一項に記載の方法。
(項目26)
試験および/または対照の用量応答曲線を分析することをさらに含み、ここで試験用量応答曲線は、複数の用量での化合物による1または2以上の試験細胞の阻害のレベルを示し;ここで、対照用量応答曲線は複数の用量での化合物による1または2以上の対照細胞の阻害のレベルを示す、項目25に記載の方法。
(項目27)
分析することが、化合物についての1または2以上の試験細胞および/または1または2以上の対照細胞に対するEC50値を決定することを含む、項目26に記載の方法。
(項目28)
化合物についての1または2以上の対照細胞に対するEC50値が、該化合物についての1または2以上の試験細胞に対するEC50値よりも統計学的に有意により低い、項目27に記載の方法。
(項目29)
化合物についての1または2以上の対照細胞に対するEC50値が、該化合物についての1または2以上の試験細胞に対するEC50値よりも統計学的に有意により高い、項目27に記載の方法。
(項目30)
化合物が対照化合物であり、随意にこれは、ドキソルビシン、パクリタキセル、アクチノマイシンD、カンプトテシンおよびスタウロスポリンから選択される、項目25〜28のいずれか一項に記載の方法。
(項目31)
1または2以上の対照細胞と1または2以上の試験細胞とが共培養中にある、項目17〜24のいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
1または2以上の試験細胞が、検出可能であって1または2以上の対照細胞の識別特徴と区別可能である識別特徴を有し、随意にここで前記識別特徴はGFPタンパク質および/または癌幹細胞バイオマーカーの発現のレベルを含む、項目31に記載の方法。
(項目33)
1または2以上の試験細胞におけるGFPタンパク質の発現のレベルが、1または2以上の対照細胞におけるGFPタンパク質の発現のレベルと比較される、項目32に記載の方法。
(項目34)
共培養のサンプル中の各々の細胞の識別特徴を検出することにより1または2以上の試験細胞の1または2以上の対照細胞に対する比をモニタリングすることをさらに含み、随意にここで検出することは蛍光励起細胞ソーティングを含む、項目32または33に記載の方法。
(項目35)
複数の試験サンプルを試験することをさらに含み、ここで前記試験サンプルの各々は1または2以上の試験細胞の少なくとも1つを含み;および/または、複数の対照サンプルを試験することをさらに含み、ここで前記対照サンプルの各々は1または2以上の対照細胞の少なくとも1つを含む、項目1〜24のいずれか一項に記載の方法。
(項目36)
各々の試験サンプルおよび/または各々の対照サンプルが別々の培養チャンバー中にあり、随意にここで各々の培養チャンバーはマルチウェルプレートのウェルである、項目35に記載の方法。
(項目37)
マルチウェルプレートが、6、12、24、96、384または1536から選択される数のウェルを有する、項目36に記載の方法。
(項目38)
化合物が複数の化合物からなるライブラリーから得られ、随意にここでライブラリーは、天然生成物ライブラリー、多様性ライブラリー、キナーゼ阻害剤ライブラリー、HDAC阻害剤ライブラリー、公知の生物活性化合物のライブラリー、ペプチドライブラリー、抗体ライブラリー、またはRNAiライブラリーから選択される、項目1〜24および35〜37のいずれか一項に記載の方法。
(項目39)
1または2以上の試験細胞を接触させることが、化合物のサンプルをライブラリーから試験サンプルを含む培養チャンバーに移すことを含み;および/またはここで、1または2以上の対照細胞を接触させることが、化合物のサンプルをライブラリーから対照サンプルを含む培養チャンバーに移すことを含む、項目38に記載の方法。
(項目40)
1または2以上の対照細胞よりも1または2以上の試験細胞に対して細胞毒性が実質的により高いリード化合物を、該化合物による前記1または2以上の試験細胞の増殖および/または生存の阻害のレベルを該化合物による前記1または2以上の対照細胞の増殖および/または生存の阻害のレベルと比較することにより同定することをさらに含む、項目39に記載の方法。
(項目41)
1または2以上の癌細胞をリード化合物のサンプルと接触させること;および前記リード化合物による前記1または2以上の癌細胞の増殖および/または生存の阻害のレベルを検出することをさらに含む、項目40に記載の方法。
(項目42)
1または2以上の癌細胞が、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、子宮頚癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、または精巣腫瘍から得られる、項目41に記載の方法。
(項目43)
1または2以上の癌細胞の少なくとも1つが癌幹細胞であり、これは癌幹細胞のバイオマーカーを有する、項目41または42に記載の方法。
(項目44)
癌幹細胞のバイオマーカーがCD44 + およびCD24 − の細胞表面マーカープロフィールである、項目35または43に記載の方法。
(項目45)
癌幹細胞が、MDA-MB-231、SUM159またはT47D乳癌細胞である、項目42または43に記載の方法。
(項目46)
1または2以上の癌細胞の増殖および/または生存の阻害のレベルを検出することが、前記1または2以上の癌細胞のうち少なくとも1種の癌幹細胞であるものの割合を決定することを含む、項目41〜45のいずれか一項に記載の方法。
(項目47)
1または2以上の癌細胞の増殖よび/または生存の阻害のレベルを検出することが、前記1または2以上の癌細胞が懸濁培養中でコロニーを形成する能力を決定することを含む、項目41〜45のいずれか一項に記載の方法。
(項目48)
1または2以上の癌細胞の増殖よび/または生存の阻害のレベルを検出することが、前記1または2以上の癌細胞がin vivoで腫瘍を形成する能力を決定することを含む、項目41〜45のいずれか一項に記載の方法。
(項目49)
(i)効力の改善、(ii)毒性の低減、これは随意に治療インデックスの改善であってもよい;(iii)副作用の低減;(iv)治療作用の開始および/もしくは効果の持続期間の改変;ならびに/または(v)薬理動態パラメーター、これは随意に吸収、分配、代謝および/もしくは排出であってもよい、の改変を達成するためにリード化合物を改変することにより、精製リード化合物を製造することをさらに含む、項目40〜48のいずれか一項に記載の方法。
(項目50)
リード化合物または精製リード化合物の定量的構造活性関係性分析を行うことにより、前記リード化合物または精製リード化合物のin vivoでの毒性学プロフィールを決定することをさらに含む、項目49に記載の方法。
(項目51)
リード化合物または精製リード化合物を薬学的に受容可能なキャリアとともに製剤化することにより医薬組成物を製造することをさらに含む、項目49または50に記載の方法。
(項目52)
癌細胞を有する対象に医薬組成物を投与し、前記対象に対する化合物の毒性、ならびに/または前記対象における癌細胞の増殖および/もしくは生存に対する化合物の影響を評価することにより、リード化合物または精製リード化合物をinvivoで試験することをさらに含む、項目51に記載の方法。
(項目53)
対象が、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、非ヒト霊長類およびヒトから選択される、項目52に記載の方法。
(項目54)
試験細胞および/または対照細胞における1または2以上の癌幹細胞マーカーの発現を決定することをさらに含む、項目1〜24のいずれか一項に記載の方法。
(項目55)
1または2以上の癌幹細胞マーカーが、CD20、CD24、CD34、CD38、CD44、CD45、CD105、CD133、CD166、EpCAM、ESA、SCA1、PecamおよびStro1から選択される、項目54に記載の方法。
(項目56)
1または2以上の癌幹細胞マーカーがCD24およびCD44である、項目55に記載の方法。
(項目57)
化合物による試験細胞および/または対照細胞の増殖および/または生存の阻害のレベルを検出することが、細胞計数アッセイ、複製標識アッセイ、細胞膜完全性アッセイ、細胞ATPに基づく生存率アッセイ、ミトコンドリアレダクターゼ活性アッセイ、カスパーゼ活性アッセイ、アネキシンV染色アッセイ、DNA含有量アッセイ、DNA分解アッセイ、および核断片化アッセイから選択されるアッセイを行うことを含む、項目1〜56のいずれか一項に記載の方法。
(項目58)
1または2以上の細胞を特徴づけるための方法であって、
(a)1または2以上の細胞を、ドキソルビシン、パクリタキセル、アクチノマイシンD、カンプトテシンおよびスタウロスポリンから選択される化合物と接触させること、
(b)前記化合物による1または2以上の細胞の増殖および/または生存の阻害のレベルを検出すること、ならびに
(c)(b)の結果を対照レベルと比較すること、ここで、前記化合物による前記1または2以上の細胞の増殖および/または生存の阻害のレベルが対照レベルより統計学的に有意により低い場合、前記1または2以上の細胞は癌幹細胞の特徴を有する、
を含む、前記方法。
(項目59)
1または2以上の細胞において癌幹細胞バイオマーカーまたは機能的アッセイを評価することをさらに含む、項目58に記載の方法。
(項目60)
癌幹細胞バイオマーカーが、E−カドヘリン発現、TWIST発現、およびCD44/CD24細胞表面マーカープロフィールから選択される、項目59に記載の方法。
(項目61)
機能的アッセイが、コロニー形成アッセイまたはin vivo腫瘍播種アッセイである、項目59に記載の方法。
(項目62)
対照レベルが、化合物による癌幹細胞ではない1または2以上の癌細胞の増殖および/または生存の阻害のレベルである、項目58に記載の方法。
(項目63)
癌を有するかまたは有することが疑われる対象を処置するための方法であって、パクリタキセルの有効量を、エトポシド、サリノマイシン、アバメクチンまたはニゲリシンを含む医薬組成物の有効量と組み合わせて前記対象に投与することを含む、前記方法。
(項目64)
癌を有するかまたは有することが疑われる対象を処置するための方法であって、エトポシド、サリノマイシン、アバメクチン、ニゲリシンまたは前述のいずれかの誘導体を含む医薬組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
(項目65)
癌を有する対象のための処置を選択するための方法であって、癌における癌幹細胞バイオマーカーを評価すること、および、前記癌幹細胞バイオマーカーが検出された場合は、サリノマイシン、アバメクチン、エトポシドまたはニゲリシンまたはそれらの誘導体を随意にパクリタキセルまたはその誘導体と組み合わせて含む医薬組成物の有効量を前記対象に投与することにより該対象を処置することを含む、前記方法。
(項目66)
癌幹細胞バイオマーカーが、E−カドヘリン発現;TWIST発現、およびCD44/CD24細胞表面マーカープロフィールから選択される、項目65に記載の方法。
(項目67)
癌幹細胞バイオマーカーを評価することが、対象から癌のサンプルを得ることを含む、項目63〜66のいずれか一項に記載の方法。
(項目68)
癌におけるE−カドヘリンおよび/またはTWISTの発現が、癌におけるE−カドヘリンおよび/またはTWISTのタンパク質および/またはRNAの発現のレベルを測定すること、ならびに随意に前記レベルを参照標準と比較することにより決定される、項目66に記載の方法。
(項目69)
参照標準が、癌幹細胞におけるE−カドヘリンおよび/またはTWISTのタンパク質および/またはRNAの発現のレベルである、項目68に記載の方法。
(項目70)
参照標準が、癌幹細胞ではない癌細胞におけるE−カドヘリンおよび/またはTWISTのタンパク質および/またはRNAの発現のレベルである、項目68に記載の方法。
(項目71)
癌が、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、子宮頚癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、または精巣腫瘍である、項目63〜70のいずれか一項に記載の方法。
(項目72)
癌が乳癌または肺癌である、項目63〜71のいずれか一項に記載の方法。
(項目73)
対象が哺乳動物であり、これは随意にヒトである、項目63〜72のいずれか一項に記載の方法
(項目74)
医薬組成物が、静脈内で、筋肉内で、皮下で、腹腔内で、経口で、またはエアロゾルとして投与される、項目63〜73のいずれか一項に記載の方法
(項目75)
癌を有するかまたは有することが疑われる対象を処置するための方法であって、EMTを経験していない対照細胞の増殖および/または繁殖の阻害と比較して、EMTを経験した試験細胞の増殖および/または繁殖を選択的に阻害する化合物を含む医薬組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
(項目76)
試験細胞と対照細胞とが遺伝子的に一致する、項目75に記載の方法。
(項目77)
試験細胞が非腫瘍原性である、項目75に記載の方法。
(項目78)
癌を有するかまたは有することが疑われる対象を処置するための方法であって、非CSC癌細胞に対するその効果と比較して癌幹細胞の増殖を選択的に阻害するかまたは癌幹細胞を殺傷する化合物の有効量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
(項目79)
癌を有するかまたは有することが疑われる対象を処置するための方法であって、非癌性細胞に対するその効果と比較して癌幹細胞の増殖を選択的に阻害するかまたは癌幹細胞を殺傷する化合物の有効量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
(項目80)
薬物の発見のための標的を同定する方法であって、
(a)試験細胞の増殖および/または繁殖を選択的に阻害する化合物を提供すること、ここで、前記試験細胞はEMTを経験した細胞である;ならびに
(b)前記化合物の生物学的標的を同定すること
を含む、前記方法。
(項目81)
生物学的標的が、試験細胞により発現されるタンパク質またはRNAである、項目80に記載の方法。
(項目82)
化合物が、表1に列記される化合物またはその誘導体である、項目80に記載の方法。
(項目83)
生物学的標的と相互作用するかまたはこれに作用する第2の化合物を同定するためのスクリーニングを行うことをさらに含む、項目80に記載の方法。
(項目84)
薬物の発見のための標的を同定する方法であって、以下の工程:
(a)試験細胞または試験細胞溶解物を、前記試験細胞の増殖および/または繁殖を選択的に阻害する化合物と接触させること、ここで接触は前記化合物が細胞の生体分子と物理的に相互作用することができる条件下において行われ、ここで前記試験細胞はEMTを経験した細胞である;
(b)前記化合物と物理的に相互作用する細胞の生体分子を単離すること;ならびに
(c)前記生体分子を同定すること
を含む、前記方法。
(項目85)
生体分子と相互作用するかまたはこれに作用する第2の化合物を同定するためのスクリーニングを行うことをさらに含む、項目84に記載の方法。
(項目86)
化合物が表1に列記される化合物またはその誘導体である、項目84に記載の方法。
(項目87)
化合物が支持体に結合してそれによりアフィニティーマトリックスを形成している、項目84に記載の方法。
(項目88)
癌幹細胞を生成する方法であって、EMTを経験するように癌細胞を誘導することを含む、前記方法。
(項目89)
癌細胞が実験的に生成された癌細胞である、項目88に記載の方法。
(項目90)
癌細胞が天然に存在する癌に由来する、項目88に記載の方法。
(項目91)
上皮間葉移行が、癌細胞においてE−カドヘリンの活性を阻害することからもたらされる、項目88に記載の方法。
(項目92)
癌細胞においてE−カドヘリンの活性を阻害することが、前記癌細胞をE−カドヘリンに対する遮断抗体と接触させること、前記癌細胞においてディスアドヘリンの発現を誘導すること、または前記癌細胞において細胞極性遺伝子を干渉することを含む、項目91に記載の方法。
(項目93)
癌細胞においてE−カドヘリンの活性を阻害することが、前記癌細胞をE−カドヘリンのmRNAに相補的な低分子干渉核酸と接触させることを含む、項目92に記載の方法。
(項目94)
癌細胞が、1または2以上の試験細胞において転写因子を発現させることにより、EMTを経験するよう誘導され、ここで前記転写因子は、Snail 1、Snail2、グースコイド、FoxC2、TWIST、E2A、SIP-1/Zeb-2、dEF1/ZEb1、LEF1、Myc、HMGA2、TAZ、Klf8、HIF-1、HOXB7、SIM2sおよびFosから選択される、項目88に記載の方法。
(項目95)
癌細胞が、転写因子の活性を構成的に誘導することにより、EMTを経験するよう誘導される、項目94に記載の方法。
(項目96)
癌幹細胞が(i)腫瘍を惹起する;(ii)ソフトアガー懸濁培養中でコロニーを形成する;および/または(iii)腫瘍球を形成する可能性が、EMTを経験するように誘導されていない癌細胞が有する可能性と比較して増大している、項目88に記載の方法。
(項目97)
実験的に生成された癌細胞が、癌遺伝子をコードする発現ベクターを含む、項目89に記載の方法。
(項目98)
癌遺伝子がV12H-RASである、項目97に記載の方法。
(項目99)
試験剤が癌幹細胞の増殖、ソフトアガー懸濁培養中でのコロニー形成、腫瘍球形成および/または腫瘍惹起能力を阻害する能力を評価することをさらに含む、項目88に記載の方法。
(項目100)
癌幹細胞の増殖、ソフトアガー懸濁培養中でのコロニー形成、腫瘍球形成および/または腫瘍惹起能力が阻害された場合に、試験剤が癌治療のための候補の薬剤として同定される、項目99に記載の方法。
(項目101)
癌幹細胞の特性を有する癌細胞を動物宿主中へ導入することをさらに含む、項目88に記載の方法。
(項目102)
試験剤が動物宿主における癌幹細胞の増殖または腫瘍惹起能力を阻害する能力を評価することをさらに含む、項目101に記載の方法。
(項目103)
癌幹細胞の増殖または腫瘍惹起能力が阻害された場合に、試験剤が癌治療のための候補の薬剤として同定される、項目102に記載の方法。
(項目104)
項目88〜98のいずれか一項に記載の方法により生成された癌幹細胞。
(項目105)
項目104に記載の細胞を含む動物宿主。
(項目106)
項目104に記載の癌幹細胞を有する容器を含むキット。
(項目107)
EMTを経験するように誘導されていない、癌幹細胞を生成するためにEMTを経験するように誘導された癌細胞と遺伝的に一致する癌細胞を有する第2の容器をさらに含む、項目106に記載のキット。
(項目108)
容器が凍結保存剤をさらに含む、項目106または107に記載のキット。
詳細な説明
腫瘍形成は、細胞の繁殖、分化、増殖および生存における異常を引き起こす多数の遺伝子的なおよびエピジェネティックな変化を伴う。これらの細胞異常は、良性または悪性のいずれかであり得る腫瘍を生じさせる。良性腫瘍がしばしば、発生部位に局在化したままであり腫瘍の増殖に関して自己限定的であることが多い原発腫瘍に局在化したままであるのに対して、悪性腫瘍は、増殖が持続する傾向、および遠隔部位へ拡散または転移する能力を有する。悪性腫瘍は、制御されない細胞増殖と周囲の組織に浸潤して異なる器官部位へと転移する能力とをもたらす、一連の段階的な進行性の変化を経て発達する。
腫瘍形成は、細胞の繁殖、分化、増殖および生存における異常を引き起こす多数の遺伝子的なおよびエピジェネティックな変化を伴う。これらの細胞異常は、良性または悪性のいずれかであり得る腫瘍を生じさせる。良性腫瘍がしばしば、発生部位に局在化したままであり腫瘍の増殖に関して自己限定的であることが多い原発腫瘍に局在化したままであるのに対して、悪性腫瘍は、増殖が持続する傾向、および遠隔部位へ拡散または転移する能力を有する。悪性腫瘍は、制御されない細胞増殖と周囲の組織に浸潤して異なる器官部位へと転移する能力とをもたらす、一連の段階的な進行性の変化を経て発達する。
最近の知見は、腫瘍の形成および増殖が、腫瘍中の癌細胞の少数派の亜集団である癌幹細胞により駆動されることを示している(Al-Hajj M, Wicha MS,Benito-Hernandez A, Morrison SJ, Clarke MF., Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100(7): 3983-8)(Li C, Heidt DG, Dalerba P, et al., Cancer Res 2007; 67(3):1030-7)(O'Brien CA, Pollert A, Gallinger S, Dick JE., Nature 2007; 445(7123):106-10)(Ricci-Vitiani L, Lombardi DG, Pilozzi E, et al., Nature 2007;445(7123): 111-5)(Singh SK, Hawkins C, Clarke ID, et ah, Nature 2004;432(7015): 396-401)。癌幹細胞(CSC)は、腫瘍塊中の、続発性腫瘍を播種して発生させる能力を有する細胞として、機能的に定義される。一面において、CSCは、動物モデルにおいてそれらが限界希釈で腫瘍を播種する能力により、操作的に(operationally)定義される。この機能的分類において暗示されるのは、癌幹細胞が、腫瘍中の、癌による死亡の主要な原因である転移性汎発の原因である細胞であるという概念である。この概念は、潜在的な癌治療の開発および前臨床的評価のための重要な意味を有する。本発明は、癌幹細胞を標的とする新規の治療剤を発見することを可能にする新規の方法を記載する。癌幹細胞を標的とする治療の発見は、本明細書において記載される本発明の方法の前では、ハイスループットスクリーニングのセッティングにおいては不可能であった。本発明者らは、記載される方法を実施へと還元することを通して癌幹細胞を特異的に標的とする新規化合物を発見することにより、本発明者らの発明についての原理証明を確立する。したがって、本発明は、ハイスループットスクリーニング法を用いて癌幹細胞を標的とする治療の同定を、初めて可能にするものである。
上皮間葉移行:
正常細胞および腫瘍細胞は、in vitroおよびin vivoで多様な分化の状態において存在する。これらの分化状態は、少なくとも部分的に、細胞が属する組織微小環境から生じる複雑なシグナルの統合を通して調節される。細胞(例えば癌細胞)は、多数の遺伝子撹乱(geneticperturbation)を通して、例えば特定の因子(例えばTwist、Snail、TGF-ベータもしくはMMP類)の過剰発現を介して、またはE−カドヘリンなどの接着性接合部タンパク質の阻害により、上皮間葉移行(EMT)を経験するように誘導され得る。EMTへと誘導された細胞は、用いられた誘導方法に関係なく、類似する表現型の形質およびタンパク質マーカー(例えばバイオマーカー)を発現し、このことは、EMTが主要な分化プログラムであることを示している。本発明は、EMTへと誘導された細胞が、癌幹細胞に関連する細胞表面マーカーの発現、懸濁培養中での増殖、少ない細胞数でのinvivoでの腫瘍形成、および特定の標準的な化学療法薬に対する耐性を含む、癌幹細胞の特性のうちの多数を共有するという発見に関する。したがって、間葉分化転換または上皮間葉分化転換とも称される上皮間葉移行を経験した細胞により示される分化の状態は、癌幹細胞を特異的に標的とする治療を同定するために利用することができる。一部の態様において、上皮間葉移行を誘導する方法が提供される(例えば試験細胞を生成するために)。
正常細胞および腫瘍細胞は、in vitroおよびin vivoで多様な分化の状態において存在する。これらの分化状態は、少なくとも部分的に、細胞が属する組織微小環境から生じる複雑なシグナルの統合を通して調節される。細胞(例えば癌細胞)は、多数の遺伝子撹乱(geneticperturbation)を通して、例えば特定の因子(例えばTwist、Snail、TGF-ベータもしくはMMP類)の過剰発現を介して、またはE−カドヘリンなどの接着性接合部タンパク質の阻害により、上皮間葉移行(EMT)を経験するように誘導され得る。EMTへと誘導された細胞は、用いられた誘導方法に関係なく、類似する表現型の形質およびタンパク質マーカー(例えばバイオマーカー)を発現し、このことは、EMTが主要な分化プログラムであることを示している。本発明は、EMTへと誘導された細胞が、癌幹細胞に関連する細胞表面マーカーの発現、懸濁培養中での増殖、少ない細胞数でのinvivoでの腫瘍形成、および特定の標準的な化学療法薬に対する耐性を含む、癌幹細胞の特性のうちの多数を共有するという発見に関する。したがって、間葉分化転換または上皮間葉分化転換とも称される上皮間葉移行を経験した細胞により示される分化の状態は、癌幹細胞を特異的に標的とする治療を同定するために利用することができる。一部の態様において、上皮間葉移行を誘導する方法が提供される(例えば試験細胞を生成するために)。
本明細書において用いられる場合、「上皮間葉移行」(EMT)とは、1または2以上の間葉系の特徴を有し、1または2以上の癌もしくは非癌性幹細胞の特徴をも有する細胞への、上皮細胞の形質転換または部分的な形質転換を指す。1または2以上の癌もしくは非癌性幹細胞の特徴として、1または2以上のタンパク質(例えば細胞表面マーカー)の存在または不在(高い発現レベルまたは低い発現レベル)、ならびに/または、懸濁培養中で増殖/繁殖(grow/proliferate)する能力、invivoで少ない細胞播種数で腫瘍を形成する能力、特定の化学療法に対する耐性(例えばパクリタキセルに対する耐性)、転移能力、遊走能力、アポトーシスまたはアノイキスに対する耐性および細胞の形状の伸長を含む、1または2以上の(少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6の)機能的特性の増大を挙げることができる。EMTを経験した細胞が、1または2以上のタンパク質の発現の増大または減少、あるいは癌幹細胞の1または2以上の機能的特性の増大を示す程度は、対照細胞、例えばEMTを経験していない細胞(陰性対照細胞)、またはEMTを経験した細胞(陽性対照細胞)、例えば癌幹細胞、との比較を行うことにより評価することができることが理解されるべきである。
EMTを経験していない細胞と比較してEMTを経験した細胞における発現の増大がEMTの指標であるタンパク質の例として、N−カドヘリン、ビメンチン、フィブロネクチン、Snail1(Snail)、Snail2(Slug)、Twist、グースコイド、FOXC2、Sox10、MMP-2、MMP-3、MMP-9、インテグリンvβ6、CD44およびESAが挙げられる。EMTを経験していない細胞と比較してEMTを経験した細胞における発現の減少がEMTの指標であるタンパク質の例として、E−カドヘリン、デスモプラキン、サイトケラチン、オクルディンおよびCD24が挙げられる。上皮細胞がEMTを経験した程度は、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20またはそれより多くのタンパク質の発現を決定することにより評価することができる。かかるタンパク質の発現は、本明細書において開示されるものおよび当該分野において公知の他のものを含む多様なアッセイ方法を用いて決定することができる。その発現レベルが細胞におけるEMTの指標である一部のタンパク質はまた、EMTが起こることを引き起こし得るタンパク質でもあることが理解されるべきである。例えば、上皮細胞におけるTwistの過剰発現は、細胞にEMTを経験させる。同様に、上皮細胞におけるE−カドヘリンの発現の減少は、細胞にEMTを経験させる。したがって、Twistなどのタンパク質の発現を増大させること(例えばcDNA媒介性過剰発現により)またはE−カドヘリンなどのタンパク質の発現を減少させること(例えばRNAi媒介性阻害により)によりEMTが引き起こされる場合、他のタンパク質(例えば、CD44、スモプラキン)の発現の変化が、EMTの好適な指標として利用され得る。
癌または非癌性幹細胞の機能的特性は、当該分野において公知の多様な方法を用いて評価することができることが理解されるべきである。例えば懸濁培養中での増殖は、EMTを経験した細胞をスピナーフラスコ中で増殖させて、スピナーフラスコ中の細胞数の経時的な変化を測定することにより、評価することができる。この細胞数の変化を、EMTを経験していない同じまたは類似の条件下において増殖させた対照細胞の細胞数の変化と比較してもよい。懸濁培養中で増殖させたEMTを経験した細胞の、同じまたは類似の条件下で増殖させたがEMTを経験していない対照細胞と比較しての、倍増時間の10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%まで、またはそれより大きな増大は、懸濁培養中で増殖する能力の増大の指標である。
EMTを経験した細胞がin vivoで少ない細胞播種数で腫瘍を形成する能力は、EMTを経験していない対照細胞との比較により評価することができる。invivoで少ない細胞播種数で腫瘍を形成する能力は、多様な要因に依存し、これは当業者には明らかであり、例えば、細胞が注射される動物のタイプ(例えばマウス)、細胞が播種(例えば注射)される部位、および動物が細胞に対して免疫応答を開始する能力を含む。本明細書において用いられる場合、「少ない細胞播種数」とは、100個まで、101個まで、102個まで、103個まで、104個まで、105個まで、106個までの、またはそれより多くの細胞の播種を意味する。細胞の播種(1または2以上の部位、または1または2以上の動物におけるもの)の後でinvivoで形成される腫瘍の数は、この対象との比較が行われ得る例示的なパラメーターである。細胞の播種の後でin vivoで形成される腫瘍のサイズ(例えば体積)は、この対象との比較が行われ得る別の例示的なパラメーターである。例えば腫瘍の発生率またはサイズの10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%まで、またはこれより大きな増大は、少ない細胞播種数でinvivoで腫瘍を形成する能力の増大の指標であり得る。
癌または非癌性幹細胞の機能的特性を評価するための他の方法は、本明細書において、および他の場所で開示され、当業者には明らかである(例えば、SM Frischand H Francis, Disruption of epithelial cell-matrix interactions inducesapoptosis, J Cell Biol. 1994 Feb; 124(4): 619-26; Mushinski JF, et al.,Inhibition of tumor cell motility by the interferon-inducible GTPase MxA. JBiol Chem. 2009 Mar 18; Liu YN, et al., Activated androgen receptordownregulates E-cadherin gene expression and promotes tumor metastasis. MolCell Biol. 2008 Dec; 28(23): 7096-108; Carpenter PM, et al., Motility Inductionin Breast Carcinoma by Mammary Epithelial Laminin 332 (Laminin 5), Mol CancerRes. 2009 Apr 7; Nakamura M, et al., Polarized hydroxyapatite promotes spreadand motility of osteoblastic cells. J Biomed Mater Res A. 2009 Mar 9; Gu W, etal., Measuring cell motility using quantum dot probes. Methods Mol Biol. 2007;374: 125-31;およびSakai K, et al., Inducible expression of p57KIP2 inhibits gliomacell motility and invasion. J Neurooncol. 2004 Jul; 68(3): 217-23を参照)。
本発明は、細胞においてEMTを誘導するための方法を開示する。ある態様において、上皮間葉移行は、細胞においてE−カドヘリンの発現または活性を阻害することにより引き起こされる。E−カドヘリンの発現または活性は、当業者に公知の方法を用いて阻害することができる。E−カドヘリンの発現または活性を阻害するための例示的方法として、細胞をE−カドヘリンのmRNAに対して相補的な低分子干渉核酸と接触させること、細胞をE−カドヘリンに対する遮断抗体と接触させること;細胞において、例えばcDNAに基づくディスアドヘリンの過剰発現により、ディスアドヘリンの発現を誘導すること;ならびに細胞において細胞極性遺伝子を干渉することが挙げられる。例えば、Scribbleの枯渇は、E−カドヘリン媒介性の細胞−細胞接着を破壊し、EMTを誘導する(QinY, et al., J Cell Biol 2005; 171: 1061-71)。したがって、一部の態様において、RNA干渉などによるScribbleの阻害は、EMTを誘導することができる。また、Drosophilaにおける遺伝子スクリーニングにより、その不活化がE−カドヘリン発現の欠失をもたらす、細胞極性に影響を及ぼす多数の遺伝子が同定された(PagliariniRA, et al., Science 2003; 302: 1227-31)。EMTを誘導するために細胞極性遺伝子を干渉するための他の例示的方法は、当該分野において公知である。
ある態様において、E−カドヘリンの活性は、RNA干渉により阻害される。RNA干渉によりE−カドヘリン発現などの遺伝子発現を阻害するための方法は、本明細書において開示され、当該分野において公知である。一部の態様において、細胞においてE−カドヘリンの活性を阻害するために、細胞を、当該細胞におけるE−カドヘリンのmRNAに対して相補的な低分子干渉核酸でトランスフェクトする。例示的な低分子干渉核酸は、本明細書において開示され、当業者に公知である。低分子干渉核酸(例えばsiRNA)ののトランスフェクションのための方法は、当該分野において周知であり、例は本明細書において開示される。一部の態様において、細胞は、E−カドヘリンのmRNAに対して相補的であってRNA干渉経路を通してE−カドヘリンのmRNAの下方調節を引き起こす低分子干渉核酸(例えば、shRNA、miRNA)を発現する、安定に組み込まれた導入遺伝子を有する。
当該分野において公知の遺伝子のノックダウンのための多様な戦略を用いて、遺伝子、例えばE−カドヘリン、および本明細書において開示されるEMTを誘導するために有用である他のもの、の発現を阻害することができる。例えば、低分子干渉RNA(siRNA)、ショートヘアピンRNA(shRNA)、二本鎖RNA(dsRNA)、miRNAおよび当該分野において公知の他の核酸ベースの分子を含む、RNA干渉(RNAi)および/またはマイクロRNA(miRNA)の経路を利用する遺伝子ノックダウン戦略を用いることができる。一態様において、細胞における遺伝子(例えばE−カドヘリン)の発現を低下させるために、ベクターをベースとするRNAiモダリティー(例えばshRNAまたはshRNA−mir発現コンストラクト)が用いられる。
siRNAベースのオリゴヌクレオチドおよび/または改変siRNAベースのオリゴヌクレオチドなどの、広範なRNAiをベースとするモダリティーもまた、細胞において遺伝子の発現を阻害するために用いることができる。改変siRNAベースのオリゴヌクレオチドは、例えば、効力、標的アフィニティー、安全性プロフィールおよび/または安定性を変化させて、それらに細胞内分解に対する耐性または部分的耐性を付与するように、修飾されたものである。例えばホスホロチオエートなどの修飾を、ヌクレアーゼ分解に対する耐性、結合アフィニティーおよび/または取り込みを増大させるために、オリゴヌクレオチドに行うことができる。さらに、疎水化(hydrophobization)および生体共役(bioconjugation)は、siRNAの送達および標的化を増強し(DePaula et al., RNA. 13(4): 431-56, 2007)、リボジフルオロトルイル(ribo- difluorotoluyl)ヌクレオチドを有するsiRNAは、遺伝子サイレンシング活性を維持する(Xiaet al., ASC Chem. Biol. 1(3): 176-83, (2006))。未修飾のsiRNAよりもS1ヌクレアーゼ分解に対してより耐性が高い、アミド結合したオリゴリボヌクレオシドを有するsiRNAが作製されている(IwaseR et al. 2006 Nucleic Acids Symp Ser 50: 175-176)。さらに、2’−糖部位およびホスホジエステル結合でのsiRNAの修飾は、効力を失うことなく血清安定性の改善を付与する(Chounget al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 342(3): 919-26, 2006)。遺伝子(例えばE−カドヘリンなどのEMTを負に調節する遺伝子)の発現を阻害するために用いることができる他の分子として、センスおよびアンチセンスの核酸(一本鎖または二本鎖)、リボザイム、ペプチド、DNAザイム、ペプチド核酸(PNA)、三重らせん形成性オリゴヌクレオチド、抗体、ならびに遺伝子中の配列を対象とするアプタマーおよびその修飾形態、RNA転写物、またはタンパク質が挙げられる。アンチセンスおよびリボザイム抑制戦略は、遺伝子産物の発現を減少させることにより、または変異の部位において変異転写物を切断することにより、腫瘍表現型の逆転をもたらした(Carterand Lemoine Br. J. Cancer. 67(5): 869-76, 1993; Lange et al., Leukemia. 6(11):1786-94, 1993; Valera et al., J. Biol. Chem. 269(46): 28543-6, 1994;Dosaka-Akita et al., Am. J. Clin. Pathol. 102(5): 660-4, 1994; Feng et al.,Cancer Res. 55(10): 2024-8, 1995; Quattrone et al., Cancer Res. 55(1): 90-5,1995; Lewin et al., Nat Med. 4(8): 967-71, 1998)。リボザイムはまた、変異遺伝子の遺伝子発現を阻害すること、および標的化したトランススプライシングにより変異を修正することの両方の手段として提案されている(Sullengerand Cech Nature 371(6498): 619-22, 1994; Jones et al., Nat. Med. 2(6): 643-8,1996)。リボザイム活性は、例えば非特異的な核酸結合タンパク質または促進型(facilitator)オリゴヌクレオチドの使用により増強することができる(Herschlaget al., Embo J. 13(12): 2913-24, 1994; Jankowsky and Schwenzer Nucleic AcidsRes. 24(3): 423-9, 1996)。複数標的(multitarget)リボザイム(連結またはショットガン)は、遺伝子抑制のためのリボザイムの効率を改善する手段として提案されている(Ohkawaet al., Nucleic Acids Symp Ser. (29): 121-2, 1993)。
三重らせんのアプローチもまた、配列特異的遺伝子抑制のために研究されてきた。三重らせん形成性オリゴヌクレオチドは、いくつかのケースにおいて配列特異的な様式において結合することが見出されている(Postelet al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88(18): 8227-31, 1991; Duval-Valentin etal., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89(2): 504-8, 1992; Hardenbol and Van DykeProc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93(7): 2811-6, 1996; Porumb et al., Cancer Res.56(3): 515-22, 1996)。同様に、ペプチド核酸が遺伝子発現を阻害することが示されている(Hanvey et al., AntisenseRes. Dev. 1(4): 307-17, 1991; Knudsen and Nielson Nucleic Acids Res. 24(3):494-500, 1996; Taylor et al., Arch. Surg. 132(11): 1177-83, 1997)。副溝結合性ポリアミドは、配列特異的な様式においてDNA標的に結合することができ、したがって、DNAレベルでの抑制のための有用な低分子を代表する(Traugeret al., Chem. Biol. 3(5): 369-77, 1996)。さらに、ドミナントネガティブの変異ペプチドおよび抗体を用いて、タンパク質レベルでの干渉により抑制が得られた(HerskowitzNature 329(6136): 219-22, 1987; Rimsky et al., Nature 341(6241): 453-6, 1989;Wright et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86(9): 3199-203, 1989)。一部のケースにおいて、抑制戦略は同時のタンパク質の低下を伴うことなくRNAレベルの低下をもたらしたが、他のケースにおいては、RNAの低下はタンパク質の低下により反映された。
用いることができる多様な多数の抑制戦略として、目的のタンパク質(例えばE−カドヘリン)を標的とするように選択することができるDNAおよび/またはRNAアプタマーの使用が挙げられる。例えば、加齢横斑変性(AMD)の場合、抗VEGFアプタマーが作製されており、一部のAMD患者において臨床的利益を提供することが示されている(UlrichH, et al. Comb. Chem. High Throughput Screen 9: 619-632 , 2006)。
一部の態様において、EMTを負に調節するタンパク質(例えばE−カドヘリン)の活性は、細胞を1または2以上の結合剤(例えばE−カドヘリンに対する遮断抗体)と接触させることにより阻害される。本発明は、したがって、例えばE−カドヘリンなどのタンパク質に選択的に結合してEMTを誘導する能力を有する抗体または抗体のフラグメントであり得る、結合剤を包含する。抗体は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を含み、これは、従来の方法により製造することができる。本明細書において用いられる場合、E−カドヘリンの遮断抗体は、E−カドヘリンに特異的に結合してEMTを誘導する抗体である。
重要なことに、当該分野において周知であるように、抗体分子のほんの小さな部位であるパラトープのみが、抗体のそのエピトープへの結合に関与する(例えば、一般的には、Clark,W.R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology Wiley & Sons,Inc., New York; Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 第7版、Blackwell ScientificPublications, Oxfordを参照)。例えばpFc’およびFc領域は、相補カスケードのエフェクターであるが、抗原結合には関与しない。pFc’領域が酵素により切断されている抗体、またはpFc’領域なしで製造された抗体は、F(ab’)2フラグメントと名付けられ、完全な抗体の抗原結合部位の両方を保持する。同様に、Fc領域が酵素により切断されている抗体、またはFc領域なしで製造された抗体は、Fabフラグメントと名付けられ、完全な抗体分子の抗原結合部位の一方を保持する。さらに進むと、Fabフラグメントは、共有結合した抗体の軽鎖と抗体の重鎖のFdと表わされる一部とからなる。Fdフラグメントは、抗体特異性の主要な決定要因であり(単一のFdフラグメントが、抗体特異性を変化させることなく10個までの異なる軽鎖と関連する)、Fdフラグメントは、単離状態においてエピトープ結合能力を保持する。
当該分野において周知であるように、抗体の抗原結合部分中には、抗原のエピトープと直接相互作用する相補性決定領域(CDR)、およびパラトープの三次元構造を維持するフレームワーク領域(FR)が存在する(一般的には、Clark,1986; Roitt, 1991を参照)。IgG免疫グロブリンの重鎖Fdフラグメントおよび軽鎖の両方において、4つのフレームワーク領域(FR1〜FR4)がそれぞれ3つの相補性決定領域(CDR1〜CDR3)により分離されて存在する。CDR、特にCDR3領域、およびより特に重鎖CDR3が、抗原特異性の主な原因である。
現在、当該分野において、哺乳動物の抗体の非CDR領域は、元の抗体のエピトープ特異性を保持したまま、同種のまたは異種の抗体の類似の領域で置き換えることができることがよく確立されている。これは、非ヒトCDRをヒトのFRおよび/またはFc/pFc’領域に共有結合させて機能的な抗体を産生する「ヒト化」抗体の開発および使用において最も明らかに示される。例えば、米国特許第4,816,567号、同第5,225,539号、同第5,585,089号、同第5,693,762号および同第5,859,205号を参照。
完全ヒトモノクローナル抗体もまた、ヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の遺伝子座の大部分についてトランスジェニックのマウスを免疫することにより製造することができる。これらのマウス(例えばXenoMouse(Abgenix)、HuMAbマウス(Medarex/GenPharm))の免疫の後で、標準的なハイブリドーマ技術に従ってモノクローナル抗体を製造することができる。これらのモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有し、ヒトに投与された場合にヒト抗マウス抗体(HAMA)応答を惹起しない。
したがって、当業者には明らかであるように、本発明はまた、F(ab’)2、Fab、FvおよびFdフラグメント;Fcおよび/またはFRおよび/またはCDR1および/またはCDR2および/または軽鎖CDR3領域が相同なヒトまたは非ヒト配列により置き換えられているキメラ抗体;FRおよび/またはCDR1および/またはCDR2および/または軽鎖CDR3領域が相同なヒトまたは非ヒト配列により置き換えられているキメラF(ab’)2フラグメント抗体;FRおよび/またはCDR1および/またはCDR2および/または軽鎖CDR3領域が相同なヒトまたは非ヒト配列により置き換えられているキメラFabフラグメント抗体;ならびに、FRおよび/またはCDR1および/またはCDR2領域が相同なヒトまたは非ヒト配列により置き換えられているキメラFdフラグメント抗体を提供する。本発明はまた、いわゆる一本鎖抗体を含む。
一部の態様において、E−カドヘリンは、細胞を低分子またはペプチドのE−カドヘリンのアンタゴニストと接触させることにより阻害される。一部の態様において、細胞接着認識(CAR)配列であるHAV(His−Ala−Val)(随意にCAR配列のいずれかの側に隣接配列を伴う)を含む環状ペプチドが用いられる。例えば、米国特許公開番号20060183884を参照。E−カドヘリンに特異的に結合するペプチドは、例えばファージディスプレイなどの技術を用いて当業者により同定され得る。
一部の態様において、EMTは、転写因子(例えばE−カドヘリンの活性を調節する転写因子)の活性を調節することにより引き起こされる。EMTを誘導するための調節の方向性(例えば転写因子の活性を阻害するかまたは活性を誘導する)は、当業者により通例の実験を用いて決定または確認され得る。転写因子の活性を阻害することが望ましい場合、RNA干渉が有用である。例えば、本明細書において開示されるような、転写因子のmRNAに対して相補的な低分子干渉核酸は、転写因子の活性を阻害するために用いることができる。一部の態様において、EMTは、Snail1、Snail2、グースコイド、FoxC2、TWIST、E2A、SIP-l/Zeb-2、dEF1/ZEb1、LEF1、Myc、HMGA2、TAZ、Klf8、HIF-1、HOXB7、SIM2sおよびFosから選択される転写因子の活性を誘導することにより引き起こされる。転写因子の活性を誘導するための例示的な方法は、当該分野において公知である。転写因子の活性を誘導することが望ましい場合、転写因子の外因的な発現が有用である。例えば、細胞におけるTWISTの発現は、細胞においてE−カドヘリンの活性を阻害してEMTを誘導することが、当該分野において公知である。一態様において、TWISTをコードする発現ベクターで細胞をトランスフェクトし、それにより細胞において外因的にTWISTを発現させることにより、細胞においてTWISTを誘導する。一部の態様において、細胞は、安定に導入された、細胞においてEMTを引き起こすTWISTなどの転写因子を発現する導入遺伝子を有する。
一部の態様において、EMTは、細胞においてシグナル経路の活性を調節することにより引き起こされ、ここでシグナル経路は、TGF-β、Wnt、BMP、Notch、HGF-Met、EGF、IGF、PDGF、FGF、P38-mapk、Ras、PI3キナーゼ-Akt、SrcおよびNF-kBから選択される。一部の態様において、EMTを誘導するシグナル経路は、細胞を、TGF-β/BMPスーパーファミリーメンバー、Wnt−ファミリーメンバー、FGFファミリーのメンバー、Notchリガンド、EGFファミリーのメンバー、IGFファミリーのメンバー、PDGFおよびHGFから選択される増殖因子と接触させることにより調節される。一部の態様において、EMTを誘導するシグナル経路は、細胞をTGF-β1と接触させることにより調節される。例示的なTGF-β/BMPスーパーファミリーのメンバーとして、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP10、BMP15、GDF1、GDF2、GDF3、GDF5、GDF6、GDF7、ミオスタチン/GDF8、GDF9、GDF10、GDF11、GDF15、アクチビンAおよびB/インヒビンAおよびB、抗ミュラー管ホルモン、ならびにNodalが挙げられる。例示的なFGFファミリーのメンバーとして、FGF1、FGF2、FGF4、FGF8、FGF10が挙げられる。例示的なWnt-ファミリーのメンバーとして、WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11およびWNT16が挙げられる。例示的なEGFファミリーのメンバーとして、ヘアピン結合EGF様増殖因子(HB-EGF)、トランスフォーミング増殖因子−α(TGF-α)、アンフィレギュリン(AR)、エピレギュリン(EPR)、エピゲン(Epigen)、ベータセルリン(BTC)、ニューレグリン−1(NRG1)、ニューレグリン−2(NRG2)、ニューレグリン−3(NRG3)およびニューレグリン−4(NRG4)が挙げられる。例示的なIGFファミリーのメンバーとして、IGF1およびIGF2が挙げられる。
一部の態様において、EMTは、細胞を、低酸素、放射線照射および慢性化学療法処置
から選択されるストレスに供することにより引き起こされる。細胞においてストレスを誘導するための方法は、当該分野において公知である。例示的な方法は、その内容がその全体において本明細書において参考として組み込まれるDocherty,NG, et al., Am J Physiol Renal Physiol 290: F1202-F1212, 2006およびManotham K, etal., Kidney Int 65: 871-880, 2004において開示される。
から選択されるストレスに供することにより引き起こされる。細胞においてストレスを誘導するための方法は、当該分野において公知である。例示的な方法は、その内容がその全体において本明細書において参考として組み込まれるDocherty,NG, et al., Am J Physiol Renal Physiol 290: F1202-F1212, 2006およびManotham K, etal., Kidney Int 65: 871-880, 2004において開示される。
細胞においてEMTを誘導するための例示的な方法は、Weinberg RA, et al., WO2007/005611; Zavadil J et al.,Oncogene 24: 5764-5774, 2005; Sato M, J Clin Invest 112: 1486-1494, 2003;Gregory PA, et al., Nat Cell Biol. Mar 30, 2008; Zeng R, et. al., J Am SocNephrol. 2008 Feb;19(2): 380-7. Epub 2008 Jan 9; Krawetz R, et al., CellSignal. 2008 Mar;20(3): 506-17; Jiang YG, et al., Int J Urol. 2007 Nov 14(11):1034-9; Lo HW, et al., Cancer Res. 2007 Oct 1, 67(19): 9066-76; Lester RD, etal., J Cell Biol. 2007 Jul 30 178(3): 425-36; Moustakas A, et al., Cancer Sci.2007 Oct 98(10): 1512-20; およびWahab NA, et al., Nephron Exp Nephrol. 2006,104(4): e129-34において開示され、これらのないような本明細書において参考として組み込まれる。しかし、これらの方法は限定することを意図されず、他の適切な方法は当業者に明らかであろう。
本明細書において用いられる場合、「ベクター」とは、所望の配列が、異なる遺伝子的環境間の輸送のためまたは宿主における発現のために、制限酵素切断およびライゲーションにより挿入される、任意の数の核酸分子であってよい。ベクターは、代表的にはDNAからなるが、RNAベクターもまた利用可能である。ベクターとして、プラスミド、ファージミドおよびウイルスゲノムまたはそれらの部分が挙げられるが、これらに限定されない。
発現ベクターは、所望の配列を、例えば制限酵素切断およびライゲーションにより、それが調節配列に作動的に連結してRNA転写物として発現されることができるように、挿入することができるものである。ベクターは、当該ベクターにより形質転換またはトランスフェクトされたかまたはされていない細胞の同定における使用のために好適な1または2以上のマーカー配列をさらに含んでもよい。マーカーとして、例えば、抗生物質または他の化合物に対する耐性または感受性のいずれかを増大または低下させるタンパク質をコードする遺伝子、その活性が当該分野において公知の標準的なアッセイにより検出可能な酵素をコードする遺伝子(例えばβ−ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼ)、および形質転換またはトランスフェクトされた細胞、宿主、コロニーまたはプラークの表現型に可視的に影響を及ぼす遺伝子(例えば緑色蛍光タンパク質)が挙げられる。
本明細書において用いられる場合、コード配列と調節配列とは、これらが、コード配列の発現または転写が調節配列の影響または制御下に置かれるように共有結合される場合に、「作動的に(operably)」連結されると言われる。コード配列が機能的なタンパク質に翻訳されることが望ましい場合、2つのDNA配列は、5’調節配列中のプロモーターの誘導がコード配列の転写をもたらす場合、および、2つのDNA配列の間の連結の性質が(1)フレームシフト変異の誘導をもたらさない、(2)プロモーター領域がコード配列の転写を指揮する能力に干渉しない、または(3)対応するRNA転写物がタンパク質に翻訳される能力に干渉しない場合に、作動的に連結されると言われる。したがって、プロモーター領域は、当該プロモーター領域が、生じる転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳され得るように、そのDNA配列の転写をもたらすことができる場合に、コード配列に作動的に連結される。コード配列はタンパク質をコードする必要はないが、替わりに例えばshRNAなどの機能的RNAをコードしていてもよいことが理解される。
遺伝子発現のために必要な調節配列の正確な性質は、種または細胞型の間で異なり得るが、一般に、必要であれば、TATAボックス、キャッピング配列、CAAT配列などの、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する5’非転写配列および5’非翻訳配列を含むべきである。かかる5’非転写調節配列は、作動的に連結された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。調節配列はまた、所望の場合、エンハンサー配列または上流活性化配列を含んでもよい。本発明のベクターは、随意に5’リーダー配列またはシグナル配列を含んでもよい。適切なベクターの選択および設計は、当業者の能力および裁量の内である。当業者は、例えばshRNA、miRNAなどの干渉RNAの発現のための適切な調節配列を承知しているであろう。
一部の態様において、核酸分子を送達するためのウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルスおよび弱毒化ポックスウイルスを含むポックスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルスおよびTyウイルス様粒子からなる群より選択される。外来性核酸を送達するために用いられてきたウイルスおよびウイルス様粒子の例として、複製欠損アデノウイルス(例えば、Xianget al., Virology 219: 220-227, 1996; Eloit et al., J. Virol. 7: 5375-5381,1997; Chengalvala et al., Vaccine 15: 335-339, 1997)改変レトロウイルス(Townsend et al.,J. Virol. 71: 3365-3374, 1997)、非複製性レトロウイルス(Irwin et al., J. Virol. 68:5036-5044, 1994)、複製欠損セムリキ森林ウイルス(Zhao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA92:3009-3013, 1995)、カナリアポックスウイルスおよび高度に弱毒化されたワクシニアウイルス誘導体(Paoletti, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 93: 11349-11353, 1996)、非複製性ワクシニアウイルス(Moss, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 93: 11341-11348, 1996)、複製性ワクシニアウイルス(Moss, Dev. Biol. Stand. 82: 55-63,1994)、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(Davis et al., J. Virol. 70:3781-3787, 1996)、シンドビスウイルス(Pugachevet al., Virology 212: 587-594, 1995)、レンチウイルスベクター(Naldini L, et al., Proc NatlAcad Sci USA. 1996 Oct 15; 93(21):11382-8)ならびにTyウイルス様粒子(Allsopp et al., EMr. JImmunol 26: 1951-1959, 1996)が挙げられる。
特定の用途のために有用な別のウイルスは、二本鎖DNAウイルスであるアデノ随伴ウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、広範囲の細胞型および種に感染することができ、複製欠損に操作することができる。これはさらに、熱および脂質溶媒安定性、造血細胞を含む多様な系統の細胞における高い伝達頻度、ならびに重感染阻害の欠失により多重の伝達が可能になるという利点を有する。アデノ随伴ウイルスは、部位特異的な様式においてヒトの細胞DNAに組み込まれることができ、それにより挿入変異の可能性および挿入遺伝子発現の変動性を最小化することができる。さらに、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、選択的な圧力の不在下において組織培養において100回より多くの継代を続けられており、このことは、アデノ随伴ウイルスのゲノム組み込みが比較的安定なイベントであることを暗示する。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外の様式においても機能する。
一般に、他の有用なウイルスベクターは、必須ではない遺伝子が目的の遺伝子により置き換えられている、非細胞変性真核生物ウイルスに基づく。非細胞変性ウイルスとして、その生活環がゲノムウイルスRNAのDNAへの逆転写とその後の宿主の細胞DNAへのプロウイルス組み込みとを伴う、特定のレトロウイルスが挙げられる。一般に、レトロウイルスは、複製欠損である(すなわち、所望の転写物の合成を指揮することはできるが、感染性粒子を製造することができない)。かかる遺伝子改変されたレトロウイルス発現ベクターは、効率の高いinvivoでの遺伝子の伝達のために一般的な有用性を有する。複製欠損レトロウイルスを生成するための標準的なプロトコル(外因性遺伝子材料のプラスミドへの組み込み、プラスミドによるパッケージング細胞株のトランスフェクション、パッケージング細胞株による組み替えレトロウイルスの産生、組織培養培地からのウイルス粒子の回収、およびウイルス粒子による標的細胞の感染の工程を含む)は、Kriegler,M.、「Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual」、W.H. Freeman Co., NewYork(1990)およびMurry, EJ.編、「Methods in Molecular Biology」第7版、Humana Press, Inc.,Clifton, New Jersey(1991)において提供される。
本発明の核酸分子を細胞へ導入するために、当該核酸分子がin vitroまたはin vivoのいずれで宿主に導入されるかに依存して、多様な技術を使用することができる。かかる技術として、核酸分子−リン酸カルシウム沈殿物のトランスフェクション、DEAEと結合した核酸分子のトランスフェクション、目的の核酸分子を含む前述のウイルスによるトランスフェクションまたは感染、リポソーム媒介性トランスフェクションなどが挙げられる。他の例として、Sigma-AldrichによるN-TER(登録商標)ナノ粒子トランスフェクションシステム、PolyplusTransfectionによる昆虫細胞のためのFectoFly(登録商標)トランスフェクション試薬、Polysciences, Inc.によるポリエチレンイミン「Max」、CosmoBio Co., Ltd.によるユニークな非ウイルストランスフェクションツール、InvitrogenによるLipofectamine(登録商標) LTXトランスフェクション試薬、StratageneによるSatisFection(登録商標)トランスフェクション試薬、InvitrogenによるLipofectamine(登録商標)トランスフェクション試薬、RocheApplied ScienceによるFuGENE(登録商標)HDトランスフェクション試薬、Polyplus TransfectionによるGMP遵守のinvivo-jetPEI(登録商標)トランスフェクション試薬、およびNovagenによるInsect GeneJuice(登録商標)トランスフェクション試薬が挙げられる。
本発明の一面は、EMTを経験した細胞を、当該細胞が癌幹細胞の特徴を示すか否かを決定するために試験するための方法を提供する。例えば、EMTを経験した細胞を、本明細書において開示される方法を用いて試験し、癌幹細胞と関連する細胞表面マーカーの発現のレベル、懸濁培養中での増殖、少ない細胞数でのinvivoでの腫瘍形成、および特定の標準的な化学療法薬に対する耐性を決定する。
本発明の局面は、試験細胞および対照細胞、例えば癌幹細胞を特異的に標的とする化合物を同定するために有用な試験および対照細胞、を提供する。本明細書において記載される場合、試験または対照細胞は、初代細胞、非不死化細胞株、不死化細胞株、形質転換された不死化細胞株、良性腫瘍由来の細胞または細胞株、悪性腫瘍由来の細胞または細胞株、トランスジェニック細胞株などであってよい。一部の態様において、腫瘍は転移性腫瘍であり、この場合、細胞は、原発腫瘍に由来しても転移に由来してもよい。好ましい態様において、試験細胞は、上皮間葉移行を経験した細胞である。対照細胞は、陽性と陰性の両方の対照細胞を含んでよい。一態様において、陽性対照細胞は、癌幹細胞であり、随意にこれは1または2以上の癌幹細胞のバイオマーカーを発現する。ある態様において、癌幹細胞のバイオマーカーは、E−カドヘリン、TWIST、およびCD44+CD24−マーカープロフィールから選択される。非限定的な癌幹細胞のバイオマーカーとして、CD20、CD24、CD34、CD38、CD44、CD45、CD105、CD133、CD166、EpCAM、ESA、SCA1、Pecam、Stro1、FOXC2pos、N−カドヘリンhigh、E−カドヘリンlow/neg、アルファ−カテニンlow/neg、ガンマ−カテニンlow/neg、ビメンチンpos、およびフィブロネクチンposが挙げられる。他の例示的な癌幹細胞マーカーは、当業者には明らかである。一部の態様において、陽性対照細胞は、EMTを経験した細胞、例えばE−カドヘリン発現が低下している細胞である。
一部の態様において、陰性対照細胞は、癌幹細胞ではない癌細胞であり、随意にこれは1または2以上の癌幹細胞のバイオマーカーの検出可能な発現を示さない。1セットより多くの対照細胞、例えば癌幹細胞ではない癌細胞および非癌細胞、を提供することができる。細胞(試験または対照)を、1または2以上の遺伝子的または化学的撹乱(例えばsiRNA処置または化合物処置)に供し、次いで予め決定された時間の間インキュベートしてもよい。予め決定された時間は、対照細胞において所望の効果をもたらす(例えばその増殖および/または生存を阻害する)ために十分な時間である。
一部の態様において、細胞は哺乳動物細胞、例えばヒト細胞または非ヒト動物細胞、
例えば非ヒト霊長類、げっ歯類(例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ)に由来する、または種間ハイブリッドの細胞である。ある態様において、試験および対照細胞は、癌性または非癌性の状態についての、生検(例えば、組織生検、細針生検など)から、または外科手術において得られる。
例えば非ヒト霊長類、げっ歯類(例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ)に由来する、または種間ハイブリッドの細胞である。ある態様において、試験および対照細胞は、癌性または非癌性の状態についての、生検(例えば、組織生検、細針生検など)から、または外科手術において得られる。
一部の態様において、本発明の細胞(例えば、試験細胞、対照細胞)は、癌(例えば天然に存在する癌)に由来してもよい。一部の態様において、細胞が由来する癌は、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、子宮頚癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、メラノーマまたは精巣腫瘍である。一態様において、癌は肺癌である。一態様において、癌は乳癌である。他の癌は当業者に公知である。一部の態様において、癌は、自然発症した癌である。一部の態様において、癌は、既知の、または特徴的な、遺伝子変異または多型を伴う。一部の態様において、癌は、実験的に発生させられた癌である。一部の態様において、癌は、ホルモン応答性の癌である。一部の態様において、細胞は、初期癌または前癌病変、例えば、パピローマ、腺腫、形成異常病変など、または上皮内癌に由来する。一部の態様において、癌は、化学療法剤またはその組み合わせ(例えば任意の1または2以上の以下に議論する化学療法剤)に対して応答性のものである。一部の態様において、癌は、化学療法剤またはその組み合わせに対して耐性のものである。
一部の態様において、癌細胞は実験的に発生させされる。癌細胞は、非癌細胞(非形質転換細胞)の癌細胞(形質転換細胞)への形質転換をもたらす当該分野において公知の多数の方法により、実験的に生成することができる。かかる実験的に生成された癌細胞は、転移性であっても非転移性であってもよい。
一部の場合において、癌細胞は、癌遺伝子をコードする1または2以上の発現ベクターで非癌細胞を(一時的にまたは安定に)トランスフェクトすることにより、非癌細胞から生成することができる。かかる癌細胞は、発現された場合に、細胞の新生物性または過形成性の形質転換をもたらす。癌遺伝子は、癌遺伝子、好ましくは当該癌遺伝子の発癌性の形態の完全な配列であっても、癌遺伝子の発癌能力を維持する癌遺伝子のフラグメントであってもよい。例示的な癌遺伝子として、MYC、SRC、FOS、JUN、MYB、RAS、ABL、BCL2、HOX11、HOX11L2、TAL1/SCL、LMO1、LMO2、EGFR、MYCN、MDM2、CDK4、GLI1、IGF2、活性化EGFR、変異した遺伝子、例えばFLT3-ITD、TP53の変異したもの、PAX3、PAX7、BCR/ABL、HER2/NEU、FLT3R、FLT3-ITD、SRC、ABL、TAN1、PTC、B-RAF、PML-RAR-アルファ、E2A-PBX1、およびNPM-ALK、ならびにPAXおよびFKHR遺伝子ファミリーのメンバーの融合が挙げられる。他の例示的な癌遺伝子は、当該分野において周知であり、いくつかのかかる例は、例えばTheGenetic Basis of Human Cancer(Vogelstein, B.およびKinzler, K. W.編、McGraw-Hill, NewYork, N. Y., 1998)において記載される。かかる遺伝子のホモログもまた用いることができる。
一部の場合において、癌細胞は、腫瘍抑制遺伝子の発現を阻害することができる阻害分子(例えばshRNA、mirRNA)をコードする1または2以上の発現ベクターで非癌細胞を(一時的にまたは安定に)トランスフェクトすることにより、非癌細胞から生成することができる。かかる阻害分子は、発現された場合に、細胞の新生物性または過形成性の形質転換をもたらす。例示的な腫瘍抑制遺伝子として、RB、TP53、APC、NF-1、BRCA-1、BRCA-2およびWT-1が挙げられる。他の例示的な腫瘍抑制遺伝子は、当該分野において周知である。
一部の場合において、癌細胞は、腫瘍抑制遺伝子の発現を阻害することができる阻害分子(例えばshRNA)をコードする1または2以上の発現ベクターおよび癌遺伝子をコードする1または2以上の発現ベクターで、非癌細胞を(一時的にまたは安定に)トランスフェクトすることにより、非癌細胞から生成することができる。
一部の態様において、本発明の細胞(例えば試験細胞、対照細胞)は、非癌性組織に由来する。例えば、細胞は、任意の上皮組織に由来してよい。当業者は、「上皮」が身体全体の構造の腔および表面を裏打する細胞の層を指し、また多数の腺が少なくとも部分的に形成される組織の型であることを理解する。かかる組織として、例えば、乳房、胃腸管(胃、小腸、結腸)、肝臓、胆管、気管支、肺、膵臓、腎臓、卵巣、前立腺、皮膚、子宮頚部、子宮、膀胱、尿管、精巣、外分泌腺、内分泌腺、血管などにおいて見出される組織が挙げられる一部の態様において、上皮は、内皮または中皮である。ある態様において、細胞はヒトの乳房上皮細胞である。ある態様において、細胞は、整復乳房形成術から得られた非癌性のヒトの乳房細胞である。ある態様において、試験および対照細胞は、E−カドヘリンを通常発現する任意の細胞型に由来する。ある態様において、試験および対照細胞は、N−カドヘリンを通常は発現しない細胞型のものである。ある態様において、試験および対照細胞は、それがN−カドヘリンを発現するよりも平均で少なくとも5、10、20、50または100倍高いレベルで通常E−カドヘリンを発現する細胞型のものである。
一部の態様において、細胞(試験および/または対照)は、1または2以上の癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子を発現、阻害または欠失するように、改変、例えば遺伝子改変されている。一部の態様において、かかる改変は、細胞を不死化する。一部の態様において、かかる改変は、細胞を腫瘍原性細胞に形質転換する。例えば、ある態様において、試験および/または対照細胞は、それらにおいてテロメラーゼ触媒サブユニット(例えばヒトのテロメラーゼ触媒サブユニット;hTERT)を発現させることにより不死化される。ある態様において、試験および/または対照細胞は、それらにおいてSV40(例えば初期領域)またはRas、随意にH-rasV12などの活性化Rasを発現させることにより形質転換される。一部の態様において、細胞は、細胞周期チェックポイントまたはDNA損傷感受性タンパク質、例えばp16、例えばp16INK4a、p53および/または網膜芽細胞腫(Rb)タンパク質の発現および/または機能的活性が低下しているかまたはこれらが本質的に不在であるように、改変または処置される。例えば、細胞を、これらの遺伝子の1または2以上に標的化されたshRNAを発現するように、またはこれらのタンパク質の1または2以上に結合するウイルスタンパク質を発現するように、改変してもよい。かかる改変の組み合わせを用いてもよい。例えば、細胞を、SV40large T(LT)、hTERT、またはH-rasV12を発現するように改変してもよい。細胞を不死化するおよび/または形質転換する他の手段は、当該分野において公知であり、本発明の範囲内である。
本発明のある態様において、試験細胞および対照細胞は、EMTを経験していない、実質的に同一の細胞の最初の集団に由来する。これらの細胞のうちあるものを、例えば制御された様式においてEMTを誘導することができるようにこれらを改変して次いでEMTを誘導することにより、または例えば上記のようなEMTを誘導する薬剤でこれらを処置することにより、試験細胞としての使用に好適となるように操作する。このような特定の態様において、試験および対照細胞は、遺伝子的に一致するが、本明細書において記載されるもののような1つまたはいくつかの規定された遺伝的差異を有し、この結果として、試験細胞はEMTを経験するが対照細胞はEMTを経験しない。ある態様において、2つの細胞の集団は同じ開始集団に由来し、ここで一方の集団はベクターを導入することにより改変されており、他方の集団はそのように改変されていない。ある態様において、2つの細胞の集団は同じ開始集団に由来し、ここで一方の集団は、阻害性の核酸またはタンパク質エレメントをコードする発現コンストラクトを導入することにより改変されており、他方の集団は、対照の核酸またはタンパク質エレメント(例えば、内因性の細胞の遺伝子またはタンパク質を阻害すると予測されないもの)をコードする発現エレメントを導入することにより改変されている。代表的には、発現コンストラクトは、他では類似または同一である。本発明のある態様において、試験および対照細胞は、遺伝子的に一致し、EMTを誘導することができる低分子干渉RNA(E−カドヘリンを標的とするshRNAまたはmiRNAなど)をコードする配列を含む発現コンストラクト(随意にゲノムに組み込まれている)を含み、ここで前記配列は、調節可能な(例えば誘導可能なまたは抑制可能な)プロモーターに作動的に連結している。本発明のある態様において、試験細胞および対照細胞は、遺伝子的に一致し、EMTを誘導することができるタンパク質をコードする配列を含む発現コンストラクト(随意にゲノムに組み込まれている)を含み、ここで前記配列は、調節可能な(例えば誘導可能なまたは抑制可能な)プロモーターに連結している。調節可能な発現系は、当該分野において公知であり、例えば、重金属、低分子などにより誘導可能なプロモーターを利用する系を含む。哺乳動物細胞における使用のために好適な薬物により調節可能なプロモーターとして、テトラサイクリン/ドキシサイクリンにより調節可能なプロモーター系が挙げられる。
「遺伝子的に一致する」は、ほぼ同一のゲノムを有する細胞または細胞の集団を含み、例えば、それらのゲノムは、少なくとも95%、98%、99%、99.5%、99.9%、99.99%同一であるか、またはそれより高い。代表的には、遺伝子的に一致する細胞は、同じ対象に、またはマウスまたはラットなどの特定の種の場合は特定の近交系の系統に属する異なる対象に由来する。一部の態様において、遺伝子的に一致する細胞は、同じ組織サンプルに由来する。本発明の一部の態様において、試験および対照細胞は、遺伝子的に一致する細胞の同じ最初の集団に由来しており、本発明の方法において用いられる前に、2、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90または100回より多い細胞分裂を経験していない。
本発明は、遺伝子的に一致する試験細胞(またはEMTを経験するように誘導されてそれにより試験細胞としての使用のために好適なものとなることができる細胞)および対照細胞、ならびにかかる細胞を含むキットを提供する。いかなる理論によっても拘束されることを望まず、本発明の範囲を決して限定するものではないが、遺伝子的に一致し、試験細胞がEMTを経験しており対照細胞がEMTを経験していないことにおいて主にまたは本質的に異なる試験および対照細胞を用いることにより、本発明は、試験および対照細胞における他の、未知である可能性がある、遺伝子的またはエピジェネティックな差異よりもむしろ、細胞の分化状態の結果として、例えば試験細胞がEMTを経験していること(癌幹細胞様特性を獲得することと関連する)の結果として生じる、試験細胞および対照細胞における相違の結果として、対照細胞に対して試験細胞に差動的に影響を及ぼす化合物(例えば、試験細胞の増殖を、それらが対照細胞の増殖を阻害する程度よりも有意により高い程度まで阻害する化合物)の同定を可能にする。
本発明の実施は、他に示されない限り、分子生物学(組み換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技術を使用し、これらは当該分野の技術の範囲内である。かかる技術は、MolecularCloning:A Laboratory Manual、第2版(Sambrookら、1989年)Cold Spring Harbor Press;OligonucleotideSynthesis(M.J. Gait編、1984年);Methods in Molecular Biology、Humana Press;CellBiology: A Laboratory Notebook(J.E. Cellis編、1998年)Academic Press; Animal CellCulture(R.I. Freshney編、1987年);Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.MatherおよびP.E. Roberts、1998年)Plenum Press;Cell and Tissue Culture: LaboratoryProcedures(A. Doyle、J.B. GriffithsおよびD.G. Newell編、1993-8年)J. Wiley and Sons;Methodsin Enzymology(Academic Press, Inc.);Handbook of Experimental Immunology(D.M. WeirおよびC.C.Blackwell編);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M. MillerおよびM.P. Calos編、1987年);CurrentProtocols in Molecular Biology(F.M. Ausubelら編、1987年);PCR: The Polymerase ChainReaction、(Mullisら編、1994年);Current Protocols in Immunology(J.E. Coliganら編、1991年);ShortProtocols in Molecular Biology(Wiley and Sons、1999年);Immunobiology(C.A. JanewayおよびP.Travers、1997年);Antibodies(P. Finch、1997年);Antibodies: a practical approach(D.Catty.編、IRL Press、1988-1989年);Monoclonal antibodies : a practical approach(P. ShepherdおよびC.Dean編、Oxford University Press、2000年);Using antibodies: a laboratory manual(E.HarlowおよびD. Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press、1999年);The Antibodies(M.ZanettiおよびJ.D. Capra編、Harwood Academic Publishers、1995年);ならびにCancer: Principlesand Practice of Oncology(V.T. De Vitaら編、J.B. Lippincott Company、第7版、2004年または第8版、2008年予定)などの文献において完全に説明される。癌についてのさらなる情報は、TheBiology of Cancer、Weinberg, RAら、Garland Science、2006年において見出される。
CSCを標的とする化合物についてのスクリーニング
一態様において、CSC媒介性の腫瘍の形成または増殖を阻害する化合物または組成物を同定するための方法は、試験細胞を化合物または組成物と接触させること、および前記試験細胞の増殖および/または生存の変化についてアッセイすることを含む。代表的には、試験細胞は、上皮間葉移行を経験した細胞である。スクリーニングは、invitroまたはin vivoで、本明細書において開示されるアッセイのいずれか、または、試験細胞を化合物もしくは組成物と接触させて該試験細胞の増殖および/または生存の変化についてアッセイするために好適であることが当業者に公知の任意のアッセイを用いて、行うことができる。
一態様において、CSC媒介性の腫瘍の形成または増殖を阻害する化合物または組成物を同定するための方法は、試験細胞を化合物または組成物と接触させること、および前記試験細胞の増殖および/または生存の変化についてアッセイすることを含む。代表的には、試験細胞は、上皮間葉移行を経験した細胞である。スクリーニングは、invitroまたはin vivoで、本明細書において開示されるアッセイのいずれか、または、試験細胞を化合物もしくは組成物と接触させて該試験細胞の増殖および/または生存の変化についてアッセイするために好適であることが当業者に公知の任意のアッセイを用いて、行うことができる。
一局面において、化合物を、試験細胞(および随意に対照細胞)と、予め決定された用量で接触させる。一態様において、用量は約1nMまでであってよい。別の態様において、用量は約1nM〜約100nMであってよい。別の態様において、用量は約100nM〜約10uMであってよい。別の態様において、用量は、10uMまたはこれより大きなものであってよい。適切な時間、随意に予め決定された時間のインキュベーションの後で、化合物または組成物の試験細胞の増殖および/または生存に対する効果を、当業者に公知の適切な方法により決定する。細胞を、多様な時間にわたって化合物と接触させることができる。ある態様において、細胞を、12時間〜20日間にわたり、例えば1〜10日間にわたり、2〜5日間、または任意のこの間の範囲もしくは特定の値にわたり、化合物と接触させる。細胞を、一時的にまたは持続的に接触させることができる。所望の場合、増殖および/または生存を評価する前に化合物を取り除いてもよい。本明細書において用いられる場合、「抑制する」、「阻害する」または「低下させる」は、完全であっても完全でなくともよい。例えば、細胞の繁殖(また増殖としても引用される)は、ある効果が細胞増殖の抑制、阻害または低下のいずれかであると考えられるために、完全な停止の状態まで低下していても、低下していなくともよい。同様に、遺伝子発現は、ある効果が遺伝子発現の抑制、阻害または低下のいずれかであると考えられるために、完全な停止の状態まで低下していても、低下していなくともよい。さらに、「抑制」、「阻害」または「低下」は、存在する状態の維持、および状態の変化に影響を及ぼすプロセスを含んでもよい。例えば、細胞増殖の阻害は、非増殖性細胞の増殖の予防(非増殖性状態の維持)、および増殖性細胞の増殖を阻害するプロセス(増殖性状態の変化に影響を及ぼすプロセス)を指してもよい。同様に、細胞の生存の阻害は、ネクローシスまたはアポトーシスなどによる細胞の殺傷、および、抗アポトーシス性調節因子の発現または活性を阻害することなどにより細胞死に対する感受性を細胞に付与するプロセスを指してもよい。抑制、阻害または低下は、参照レベル(例えば対照レベル)の少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%であってよい。
一部の場合において、対照レベルと比較した調節(例えば、抑制、阻害または低下)のレベルは、統計学的に有意である。本明細書において用いられる場合、「統計学的に有意」とは、適切な統計学試験(例えばANOVA、t検定など)を用いて、0.05より低いp値、例えば0.025より低いp値または0.01より低いp値を指す。
ある態様において、試験細胞および/または対照細胞の増殖および/または生存は、細胞計数アッセイ、複製標識アッセイ、細胞膜完全性アッセイ、細胞ATPに基づく生存率アッセイ、ミトコンドリアレダクターゼ活性アッセイ、カスパーゼ活性アッセイ、アネキシンV染色アッセイ、DNA含有量アッセイ、DNA分解アッセイ、および核断片化アッセイから選択されるアッセイにより決定される。他の例示的なアッセイは、BrdU、EdUまたはH3−チミジン組み込みアッセイ;ヘキスト染色、DAPI、アクチノマイシンD、7−アミノアクチノマイシンDまたはヨウ化プロピジウムなどの核酸染色を用いるDNA含有量アッセイ;AlamarBlue、MTT、XTTおよびCellTitreGIoなどの細胞代謝アッセイ;核断片化アッセイ;細胞質ヒストン結合DNA断片化アッセイ;PARP切断アッセイ;TUNEL染色;およびアネキシン染色を含む。
一態様において、遺伝子発現分析(例えば、マイクロアレイ、cDNAアレイ、定量RT−PCR、RNAseプロテクションアッセイ)を用いて、その産生が細胞の周期/増殖および/または生存を媒介する遺伝子の発現を試験する。例示的な細胞の周期/増殖関連遺伝子として、以下が挙げられる:G1期およびG1/S移行に影響を及ぼすもの:ANAPC2、CCND1(サイクリンD1)、CCNE1(サイクリンE1)、CDC7、CDC34、CDK4、CDK6、CDKN1B(p27)、CDKN1C(p57)、CDKN3、CUL1、CUL2、CUL3、CUL4A、CUL5、E2F1、SKP2;S期およびDNA複製:ABL1(C-ABL)、MCM2、MCM3、MCM4(CDC21)、MCM5(CDC46)、MCM6(Mis5)、MCM7(CDC47)、PCNA、RPA3、SUMO1、UBE1:G2期およびG2/M移行:ANAPC2、ANAPC4、ANAPC5、ARHI、BCCIP、BIRC5、CCNA1(サイクリンA1)、CCNB1(サイクリンB1)、CCNG1(サイクリンG1)、CCNH、CCNT1、CCNT2、CDC25A、CDC25C、CDC37、CDK5R1、CDK5R2、CDK5RAP1、CDK5RAP3、CDK2、CDK7、CDKN3、CKS1B、CKS2、DDX11、DNM2、GTF2H1、GTSE1、HERC5、KPNA2、MNAT1、PKMYT1、RGC32、SERTAD1;M期:CCNB2(サイクリンB2)、CCNF、CDC2(CDK1)、CDC16、CDC20(p55cdc)、CDC25A、CDC25C、MRE11A、RAD50、RAD51;
細胞周期チェックポイントおよび細胞周期停止:ATM、ATR、BRCA1、BRCA2、CCNA2(サイクリンA2)、CCNE2(サイクリンE2)、CCNG2(サイクリンG2)、CDC2(CDK1)、CDC25A、CDC34、CDC45L、CDC6、CDK2、CDKN1A(p21)、CDKN1B(p27)、CDKN1C(p57)、CDKN2A(p16)、CDKN2B(p15)、CDKN2C(p18)、CDKN2D(p19)、CDKN3、CHEK1(CHK1)、CHEK2(CHK2/RAD53)、CUL1、CUL2、CUL3、CUL4A、CUL5、GADD45A、HUS1、KNTC1、MAD2L1、MAD2L2、NBS1(NIBRIN)、RAD1、RAD17、RAD9A、RB1、RBBP8、TP53(p53);細胞周期の調節:ABL1(C-ABL)、ANAPC2、ANAPC4、ANAPC5、ARHI、ATM、ATR、BCCIP、BCL2、BRCA2、CCNA1(サイクリンA1)、CCNA2(サイクリンA2)、CCNB1(サイクリンB1)、CCNB2(サイクリンB2)、CCNC(サイクリンC)、CCND1(サイクリンD1)、CCND2(サイクリンD2)、CCND3(サイクリンD3)、CCNE1(サイクリンE1)、CCNE2(サイクリンE2)、CCNF(サイクリンF)、CCNH(サイクリンH)、CCNT1、CCNT2、CDC16、CDC2(CDK1)、CDC20(p55cdc)、CDC25A、CDC25C、CDC37、CDC45L、CDC6、CDK2、CDK4、CDK5R1、CDK5R2、CDK6、CDK7、CDK8、CDKN1A(p21)、CDKN1B(p27)、CKS1B、CUL5、DDX11、E2F1、E2F2、E2F3、E2F4、E2F5、E2F6、GADD45A、KNTC1、MKI67(Ki67)、PCNA、PKMYT1、RAD9A、RB1、SKP2、TFDP1(DPI)、TFDP2(DP2);細胞周期の負の調節:ATM、BAX、BRCA1、CDC7、CDKN2B(p15)、CDKN2D(p19)、RBL1(p107RB)、RBL2(p130 RB2)、TP53(p53)。
例示的な細胞の生存/アポトーシスの遺伝子として、以下のものが挙げられる:TNFリガンドファミリー:LTA(TNF-α)、TNF(TNF-a)、TNFSF5(CD40リガンド)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27リガンド)、TNFSF8(CD30リガンド)、TNFSF9(4-1BBリガンド)、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF18;TNF受容体ファミリー:LTBR、TNFRSF1A(TNFR1)、TNFRSF1B(TNFR2)、TNFRSF5(CD40)、TNFRSF6(Fas)、TNFRSF6B、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF9(4-1BB)、TNFRSF10A(DR4)、TNFRSF10B(DR5)、TNFRSF10C(DcR1)、TNFRSF10D(DcR2)、TNFRSF11B、TNFRSF12A、TNFRSF14(HVEM)、TNFRSF19、TNFRSF21、TNFRSF25;Bcl-2ファミリー:BAD、BAG1、BAG3、BAG4、BAK1、BAX、BCL2、BCL2A1(bfl-1)、BCL2L1(bcl-x)、BCL2L2(bcl-w)、BCL2L10、BCL2L11(bim様タンパク質)、BCL2L12、BCL2L13、BCLAF1、BID、BIK、BNIP1、BNIP2、BNIP3(nip3)、BNIP3L、BOK(Mtd)、HRK、MCL1;カスパーゼファミリー:CASP1、CASP2、CASP3、CASP4、CASP5、CASP6、CASP7、CASP8、CASP9、CASP10、CASP14;IAPファミリー:BIRC1(NIAP)、BIRC2(IAP2)、BIRC3(IAP1)、BIRC4(XIAP)、BIRC5(サバイビン)、BIRC6(Bruce)、BIRC7、BIRC8;TRAFファミリー:TRAF1、TRAF2、TRAF3(CRAF1)、TRAF4、TRAF5;CARDファミリー:APAF1、BCL10(HuE10)、BIRC2、BIRC3、CARD4(NOD1)、CARD6、CARD8、CARD9、CARD10、CARD11、CARD12、CARD14、CARD15、CASP1、CASP2、CASP4、CASP5、CASP9、CRADD、NOL3(Nop30)、PYCARD、RIPK2(CARDIAC);
デスドメインファミリー:CRADD、DAPK1、DAPK2、FADD、RIPK1、TNFRSF10A、TNFRSF10B、TNFRSF11B、TNFRSF1A、TNFRSF21、TNFRSF25、TNFRSF6、TRADD;CIDEドメインファミリー:CIDEA、CIDEB、DFFA、DFFB;p53およびDNA損傷応答:ABL1、AKT1、APAF1、BAD、BAX、BCL2、BCL2L1、BID、CASP3、CASP6、CASP7、CASP9、GADD45A、TP53(p53)、TP53BP2、TP73、TP73L;ならびにAKT1、BAG1、BAG3、BAG4、BCL2、BCL2A1、BCL2L1、BCL2L10、BCL2L2、BFAR、BIRC1、BIRC2、BIRC3、BIRC4、BIRC5、BIRC6、BIRC7、BIRC8、BNIP1、BNIP2、BNIP3、BRAF、CASP2、CFLAR、GDNF、IGF1R、MCL1、TNF(TNF-a)、TNFRSF6、TNFRSF6B、TNFRSF7、TNFSF18、TNFSF5。1または2以上の細胞周期、増殖および/または生存遺伝子の発現を実質的に変化させる化合物または組成物は、癌幹細胞処置のための候補であり得、および/または、本明細書において開示される方法のいずれかを用いてさらに試験/検定され得る。
別の態様において、試験細胞および/または対照細胞の増殖および/または生存の変化を、タンパク質レベル、例えば前述の細胞周期/増殖および/または生存遺伝子によりコードされるタンパク質のレベルを試験することにより評価する。タンパク質レベルは、ウェスタン分析などの当業者に公知の適切な方法により評価することができる。タンパク質レベルを分析するために、当業者に公知の他の方法、例えば、免疫組織化学、免疫細胞化学、ELISA、ラジオイムノアッセイ、質量分析または抗体アレイなどのプロテオミクス法を用いてもよい。
細胞の増殖および/または生存を評価することに関連する、本明細書において開示されるさらに別のパラメーターにより、化合物のスクリーニングのためのアッセイを提供することができる。例えば、細胞のハイコンテントイメージング(high-contentimaging)または蛍光励起細胞ソーティング(FACS)を用いてもよい。一態様において、化合物または組成物の試験細胞および/または対照細胞に対する効果を、自動化された顕微鏡イメージングまたはFACSを用いて試験細胞のアポトーシス状態を評価することにより、評価することができる(例えば米国特許公開20070172818を参照)。一部の場合において、蛍光に基づくTUNEL染色(例えば当該分野において公知の標準的なTUNEL法によりFITC-dUTPを用いるもの)により、試験細胞および/または対照細胞におけるアポトーシスを明らかにすることができる。他の方法として、カスパーゼ活性を検出するための抗体を用いる免疫細胞化学(例えば切断されたPARP、切断されたラミンAなど)が挙げられる。他の態様において、YoungDW, et al., Nat Chem Biol. 2008 Jan;4(1): 59-68において例示されるものの1または2以上などの、画像に基づく細胞周期/増殖マーカーを用いてもよい。これらのイメージングの例は、限定することを意図されず、他の類似の方法は、当業者には容易に明らかであろう。
他の態様において、本明細書において開示されるものなどの、細胞増殖および/または生存遺伝子の活性を、化合物スクリーニングにおいてアッセイすることができる。一態様において、アッセイは、レポーター遺伝子産物(例えばルシフェラーゼ酵素)をコードする配列に作動的に連結された細胞増殖および/または生存遺伝子の調節領域を含む、発現ベクターを含み、ここで、レポーター遺伝子の発現は、細胞増殖および/または生存遺伝子の活性化と相関する。この態様において、レポーター遺伝子発現の評価(例えばルシフェラーゼ活性)は、細胞の増殖および/または生存を評価するための間接的方法を提供する。このアッセイおよび類似のアッセイは、当業者に周知である。レポーター遺伝子産物は、限定することなく、蛍光もしくは発光タンパク質、酵素、または、簡便な検出および随意に定量に適した他のタンパク質であり得る。例として、GFP、RFP、BFP、YFP、CYP、SFP、リーフコーラル蛍光タンパク質、mCherryなどのmFruits、ルシフェラーゼ、エクオリンおよび前述のいずれかの誘導体が挙げられる。ベータ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼなどの酵素レポータータンパク質もまた使用可能である。他の態様において、細胞増殖および/または生存遺伝子の調節DNA領域での転写因子の結合を評価するために、クロマチン免疫沈降アッセイを用いることができる。
本発明の前述のアッセイ方法は、ハイスループットスクリーニング(HTS)の実装に適している。一部の態様において、本発明のスクリーニングアッセイは、ハイスループットまたはウルトラハイスループットである(例えば、Fernandes,P. B., Curr Opin Chem Biol. 1998 2: 597; Sundberg, S A, Curr Opin Biotechnol.2000, 11: 47)。HTSは、1日あたり100,000まで、および100,000を含む化合物の試験を指す。一方、ウルトラハイスループット(uHTP)とは、1日あたり100,000を超える化合物のスクリーニングを指す。本発明のスクリーニングアッセイは、マルチウェルのフォーマット、例えば96ウェル、384ウェルフォーマット、または1,536ウェルフォーマットにおいて行うことができ、自動化に好適である。本発明のハイスループットアッセイにおいて、1日において数千の異なる化合物または組成物をスクリーニングすることが可能である。特に、マイクロタイタープレートの各ウェルは、選択された試験化合物に対する別々のアッセイを実行するために用いることができ、または、濃度もしくはインキュベーション時間の効果が観察される場合、複数のウェルが単一の化合物の試験サンプルを含んでもよい。1日あたり多数のプレートをアッセイすることが可能である。本発明のアッセイを用いて、約6,000個、20,000個、50,000個まで、または100,000個より多くの異なる化合物についてのアッセイスクリーニングが可能である。代表的には、本明細書において開示されるアッセイのHTSの実装は、自動化の使用を伴う。一部の態様において、1または2以上のロボットからなる集積ロボットシステムは、化合物、細胞および/または試薬の添加、混合、インキュベーション、ならびに最終的に読み出しまたは検出のための複数のアッセイステーションの間で、アッセイマイクロプレートを輸送する。一面において、本発明のHTSシステムは、多数のプレートを同時に調製、インキュベートおよび分析することができ、データ収集のプロセスをさらに加速する。ハイスループットスクリーニングの実装は、当該分野において周知である。例示的な方法は、WilliamP. Janzen(2002)によるHigh Throughput Screening: Methods and Protocols(Methods inMolecular Biology)、およびJoerg HueserによるHigh-Throughput Screening in DrugDiscovery(Methods and Principles in Medicinal Chemistry)(2006)においてもまた開示されており、これらの内容はいずれも本明細書において参考としてその全体において組み込まれる。
上記のとおり、試験細胞および/もしくは対照細胞の増殖および/もしくは生存に実質的に影響を及ぼす、ならびに/または癌幹細胞依存性の腫瘍増殖の潜在的なモジュレーターである化合物または組成物を、開示される試験方法を用いて発見することができる。試験することができる化合物または組成物の型の例として、抗転移剤、細胞傷害剤、細胞分裂阻害剤、サイトカイン剤、抗増殖剤、免疫毒素剤、遺伝子治療剤、血管新生抑制剤、細胞を標的とする薬剤(celltargeting agent)、HDAC阻害剤などが挙げられるがこれらに限定されない。本明細書において用いられる場合、化合物または組成物は、一部の場合において、試験剤を指す場合がある。
以下は、試験化合物のさらなる例を提供し、限定することを意味しない。当業者は、本発明の方法、細胞、および/または動物モデルを用いて試験することができる、多数のさらなる型の好適な試験化合物が存在することを理解する。試験化合物は、低分子(例えば、低分子化学物質ライブラリーのメンバーである化合物)であってもよい。化合物は、約3,000ダルトン未満の分子量の有機または無機の低分子であってもよい。低分子は、例えば少なくとも約100Da〜約3,000Da(例えば、約100〜約3,000Da、約100〜約2,500Da、約100〜約2,000Da、約100〜約1,750Da、約100〜約1,500Da、約100〜約1,250Da、約100〜約1,000Da、約100〜約750Da、約100〜約500Da、約200〜約1500,約500〜約1000,約300〜約1000Da、または約100〜約250Da)であってもよい。試験化合物はまた、細菌(例えば、Escherichiacoli、Salmonella typhimurium、Mycobacterium aviumまたはBordetella pertussis)、真菌および原生生物(例えばLeishmaniaamazonensis)などの微生物であってもよく、これらは遺伝子改変されていてもされていなくてもよい。例えば、米国特許第6,190,657号および同第6,685,935号、ならびに米国特許出願第2005/0036987号および同第2005/0026866号を参照。
低分子は、天然の生成物、合成の生成物、またはコンビナトリアルケミストリーライブラリーのメンバーであってよい。多様な分子のセットを、電荷、芳香族性、水素結合、可橈性、サイズ、側鎖の長さ、疎水性および強剛性などの多様な機能をカバーするために用いることができる。低分子を合成するために好適なコンビナトリアル技術は、当該分野において公知であり(例えば、ObrechtおよびVillalgrodo、Solid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis of Small-Molecular-WeightCompound Libraries、Pergamon-Elsevier Science Limited(1998)により例示されるように)、「スプリット・アンド・プール(splitand pool)」または「パラレル」合成技術、固相および液相技術、ならびに符号化技術(encoding technique)などのものを含む(例えばCzarnik,A. W., Curr. Opin. Chem. Biol. (1997) 1: 60を参照)。さらに、多数の低分子ライブラリーが、公共でまたは市販で入手可能である(例えば、Sigma-Aldrich、TimTec(Newark,DE)、Stanford School of Medicine High- Throughput Bioscience Center(HTBC)およびChemBridgeCorporation(San Diego, CA)を通して)。
新規の方法を用いてスクリーニングされる化合物ライブラリーは、多様な型の試験化合物を含んでいてよい。所与のライブラリーは、構造的に関連した、または関連しない、試験化合物のセットを含んでいてよい。一部の態様において、試験化合物は、ペプチドまたはペプチド模倣物分子である。一部の態様において、試験化合物として、天然に存在しないアミノ酸、アミノ酸の亜リン酸アナログ、非ペプチド結合を有するアミノ酸、または有機低分子を含むペプチドを含むペプチドのアナログが挙げられるが、これらに限定されない。一部の態様において、試験化合物は、ペプチド模倣物(例えば、ペプトイドオリゴマー、例えばペプトイドのアミドまたはエステルアナログ、D−ペプチド、L−ペプチド、オリゴウレア(oligourea)またはオリゴカルバメート(oligocarbamate);ペプチド(例えば、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド、またはこれより大きなもの、例えば20マー以上);環式ペプチド;他の非天然のペプチド様構造;および無機分子(例えば複素環式環分子)である。試験化合物はまた、核酸であってもよい。
試験化合物およびそのライブラリーは、リード化合物としても称される、化学療法(例えば抗CSC)効果を有する第1の「ヒット(hit)」化合物の構造を体系的に変化させ、その構造を生じる生物学的活性と相関させること(例えば、構造−活性関係性研究)により、得ることができる。
かかるライブラリーは、ペプトイドライブラリー(ペプチドの機能性を有するが、酵素により分解に対して耐性であるが生理活性を維持する新規の非ペプチド骨格を伴う分子のライブラリー;例えばZuckermann,et al, J. Med. Chem., 37: 2678-85 (1994)を参照);空間的にアドレス可能なパラレル固相または液相ライブラリー;デコンポリューションを必要とする合成ライブラリー法;「1ビーズ1化合物(one-beadone- Compound)」ライブラリー法;およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法(Lam, Anticancer DrugDes. 12: 145 (1997))を含む、当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることができる。分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において、例えば、DeWitt et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6909 (1993); Erb et al, Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 91: 11422 (1994); Zuckermann et al, J. Med. Chem., 37:2678(1994); Cho et al, Science, 261: 1303 (1993); Carrell et al, Angew. Chem. Int.Ed. Engl., 33: 2059 (1994); Carell et al, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 33: 2061(1994)において、およびGallop et al, J. Med. Chem., 37: 1233 (1994)において見出すことができる。化合物のライブラリーは、溶液中で(例えば、Houghten(1992) Biotechniques, 13: 412-421)、またはビーズ(Lam (1991) Nature, 354:82-84)、チップ(Fodor(1993) Nature, 364: 555-556)、細菌(Ladner、米国特許第5,223,409号)、胞子(Ladner、米国特許第5,223,409号)、プラスミド(Cullet al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 1865-1869)またはファージ(Scott and Smith(1990) Science, 249: 386-390;Devlin (1990) Science, 249: 404-406;Cwirla et al.(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6378-6382;Felici (1991) J. MoI. Biol,222: 301-310;Ladner、上記)上で提示することができる。
一部の態様において、本発明の方法は、「承認される薬物(approved drug)」をスクリーニングするために用いられる。「承認される薬物」とは、FDAまたは別の国における類似の政府の機関により、任意の目的のために、ヒトにおける使用について承認されている、任意の化合物(この用語は、タンパク質および核酸などの生物学的分子を含む)である。
出願人は、任意の特定の化合物、化合物群または化合物のクラスを、本発明の「試験化合物」および/または組成物および方法の範囲から除外する権利を留保する。一部の態様において、「試験化合物」は、組織培養培地において見出される、または組織培養培地の材料として当該分野において知られる化合物、例えば、細胞を培養する目的のために提供される化合物ではない。一部の態様において、試験化合物は、組織培養培地において見出される、または組織培養培地の材料として当該分野において知られる化合物であるが、組織培養培地の材料として代表的に用いられる濃度とは異なる濃度において、試験化合物として用いられる。一部の態様において、試験化合物は、癌を処置するため、および/または化学療法に付随する副作用を軽減するために有用であるものとして、当該分野において知られる化合物ではない。
本明細書において開示されるものなどの、化合物がCSC腫瘍の増殖の抑制因子である場合など、本明細書において開示される化合物の同定および特徴づけ方法のある結果は、臨床的に有益であり得る。さらに他の臨床的に有益な結果として、(a)原発腫瘍の増殖の阻害または停止、(b)転移性腫瘍の増殖の阻害、および(c)試験対象の生存の延長が挙げられる。臨床的に有益な結果を有する化合物は、潜在的な化学療法剤であり、そのように製剤化することができる。
化学療法効果または抗CSC効果を有するものとして同定された化合物は、本明細書においてリード化合物と称され、選択されて、例えば結合アフィニティー、アビディティー、特異性または他のパラメーターを至適化するための合理的な設計を用いて、体系的に改変され得る。かかる至適化はまた、本明細書において記載される方法を用いるためにスクリーニングすることができる。したがって、低分子の第1のライブラリーを本明細書において記載される方法を用いてスクリーニングし、「ヒット」または「リード」である1または2以上の化合物を同定し(例えば、それらが試験細胞および/もしくは癌幹細胞の増殖および/もしくは生存を阻害する能力、ならびに/または、例えば移植の元の部位において、および転移部位において、それらがCSC依存性腫瘍のサイズおよび/もしくは数を低下させる能力の長所により)、そしてこれらのヒットを体系的な構造改変に供して、当該ヒットと構造的に関連する化合物(例えば精製リード化合物(refinedlead compound))の第2のライブラリーを作製することができる。第2のライブラリーを、次いで、本明細書において記載される方法を用いてスクリーニングすることができる。精製リード化合物は、リード化合物を、(i)効力の増強、(ii)毒性の低下(治療インデックスの改善);(iii)副作用の低減;(iv)治療作用の開始および/もしくは効果の持続時間の改変;ならびに/または(v)薬物動態パラメーター(吸収、分配、代謝および/もしくは排出)の改変を達成するように改変することにより製造することができる。リード化合物は、例えば、天然のソースから精製しても、化学的に合成してもよい。改変は、リード化合物に対して直接行っても、好適な開始材料から精製リード化合物(例えば誘導体)を合成してもよい。
本発明のある態様において、本発明の方法を用いて同定される化合物は、試験細胞に対して、対照細胞に対するその活性と比較して、選択的な活性(例えば、増殖の阻害、毒性)を示す。例えば、化合物のIC50は、試験細胞について、対照細胞に対して、約2、5、10、20、50、100、250、500、または1000倍低い場合がある。一部の態様において、化合物のIC50は、EMTを経験した細胞について、EMTを経験していない遺伝子的に一致する細胞よりも、約2、5、10、20、50、100、250、500、または1000倍低い場合がある。一部の態様において、化合物のIC50は、CSCについて、非CSC癌細胞よりも、約2、5、10、20、50、100、250、500、または1000倍低い場合がある。一部の態様において、化合物のIC50は、CSCについて、EMTを経験していない正常な(非癌性の)細胞よりも、約2、5、10、20、50、100、250、500、または1000倍低い場合がある。
限定することなく、例において記載されるように、サリノマイシンは、本発明の方法を用いて、癌幹細胞に対して選択的な毒性を有する化合物として同定された。サリノマイシンおよび多様な誘導体および構造的に類似の化合物の合成が報告されている(Allen,PR, et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1: 2403-2411(1998))。本発明は、サリノマイシン、前述の刊行物において記載されるものを含むがこれらに限定されないサリノマイシンの誘導体および構造的に類似の化合物の、本発明の組成物および方法における使用を包含する。
限定することなく、例において記載されるように、アバメクチン(abamectin)は、本発明の方法を用いて、癌幹細胞に対して選択的な毒性を有する化合物として同定された。アバメクチンは、エバーメクチン(avermectin)の混合物であり、エバーメクチンB1aとより少ない量のエバーメクチンB1b、例えば少なくとも80%のエバーメクチンB1aと約20%より少ないエバーメクチンB1bとを含む。エバーメクチンは、土壌細菌Streptomycesavermitilisから一般的に誘導される大環状ラクトンである。アバメクチンは、この細菌の天然の発酵産物である。アバメクチンはまた、エバーメクチンB1およびMK-936としても知られる。エバーメクチンファミリーのメンバーは、イベルメクチン(ivermectin)(22,23−ジヒドロエバーメクチンB1a+22,23−ジヒドロエバーメクチンB1b)、セラメクチン、ドラメクチン、ならびに前述のエバーメクチン類を含む。例えば、米国特許公開第20040101936号、PCT公開WO/1993/018778、WO/1994/029328、WO/1999/005156、WO2008037934、WO2008019784および前述のいずれかにおける参考文献を参照。これらの全ては、多様なエバーメクチン類、エバーメクチン誘導体、および特定のエバーメクチン類、エバーメクチン誘導体を製造するための方法の議論について、本明細書において参考として組み込まれる。本発明はさらに、前述の刊行物において記載されるものを含むがこれらに限定されないエバーメクチン類、エバーメクチン誘導体、および構造的に類似の化合物の、本発明の組成物および方法における使用を包含する。
限定することなく、例において記載されるように、エトポシドは、本発明の方法を用いて、癌幹細胞に対して選択的な毒性を有する化合物として同定された。多様なエトポシドの誘導体および構造的に類似の化合物、ならびにそれらの製造の方法は、例えば、WO/2003/048166、WO/2003/035661、WO2004000859およびWO2005056549、ならびに前述のものにおける参考文献において記載され、これらの全ては本明細書において参考として組み込まれる。本発明は、前述の刊行物において記載されるものを含むがこれらに限定されないエトポシド、エトポシド誘導体、および構造的に類似の化合物の、本発明の組成物および方法における使用を包含する。
限定することなく、例において記載されるように、ニゲリシンは、本発明の方法を用いて、癌幹細胞に対して選択的な毒性を有する化合物として同定された。ニゲリシンは、その構造および特性が抗生物質モネンシンのものに類似する抗生物質であり、これらはいずれもイオノフォアとして作用し、1価または2価のカチオンと複合体を形成する。多様なニゲリシンの誘導体および構造的に類似の化合物、ならびにそれらの製造の方法は、例えば、EP0356944、EP0346760およびEP0336248、ならびに前述のものにおける参考文献において記載され、これらの全ては本明細書において参考として組み込まれる。本発明は、前述の刊行物において記載されるものを含むがこれらに限定されないニゲリシン、ニゲリシン誘導体、および構造的に類似の化合物の、本発明の組成物および方法における使用を包含する。
CSCに対する選択的毒性を有するさらなる化合物は、例において言及される。本発明は、本明細書において開示される2または3以上のCSC特異的化合物を対象に投与することを含む組み合わせ治療を提供する。また提供されるのは、本明細書において開示される2または3以上のCSC特異的化合物を含む組成物である。ある態様において、2または3以上の化合物は、サリノマイシン、サリノマイシンの誘導体および構造的に類似の化合物、エバーメクチン類、エバーメクチンの誘導体および構造的に類似の化合物、エトポシド、エトポシドの誘導体および構造的に類似の化合物、およびニゲリシン、ニゲリシンの誘導体および構造的に類似の化合物から選択される。
一部の場合において、用量応答アッセイを用いて本発明の化合物または組成物の効力を決定することが望ましい。化合物または組成物の効力を決定するための方法は、当該分野において周知である。一部の態様において、効力は、化合物または組成物の半最大有効濃度(halfmaximal effective concentration:EC50)として特徴づけられる。本明細書において用いられる場合、用語、半最大有効濃度(EC50)は、生物システム(例えば1または2以上の細胞)において基線の応答(例えば化合物なし)と最大応答との間の半分の応答を誘導する化合物または組成物の濃度を指す。EC50は、化合物または組成物の効力(例えば薬物の効力)の尺度として、当該分野において一般的に用いられる。用量応答曲線のEC50は、その最大効果(また最大応答とも称される)の50%が観察される化合物または組成物の濃度を表わす。EC50は、半最大阻害濃度(halfmaximal inhibitory concentration:IC50)に関連し、これはしばしば、生化学的アッセイ、例えば、競合結合アッセイおよび機能的アゴニスト/アンタゴニストアッセイにおいて、化合物または組成物による阻害(50%阻害)の尺度として用いられる。EC50/IC50値を決定するための方法は、当該分野において周知である。
化合物の構造を決定するために有用な多様な方法が公知であり、本明細書において記載される方法において用いることができる(例えば、NMR、質量分析、電子捕獲検出器を備えたガスクロマトグラフィー、蛍光、および吸収分光法)。
試験化合物の化学療法活性のアッセイは、in vitroまたはex vivoおよび/またはin vivoで、本発明の細胞(例えば、上皮間葉移行を経験した試験細胞、任意の好適な方法を用いて同定または生成された癌幹細胞、癌細胞、癌細胞株など)および方法、または有効性を試験するための任意の好適な系を用いて行うことができる。例えば、試験化合物を、本明細書において記載される複数の試験細胞、例えば、1または2以上の腫瘍(例えばCSC依存性腫瘍)の形成を誘導するために十分な数の癌幹細胞、腫瘍異種移植片などを投与(例えば移植または注射)された非ヒト対象に投与してもよい。非ヒト対象は、例えば、げっ歯類(例えばマウス)であってよい。随意に、非ヒト対象は、免疫無防備状態の、例えばNude、SCID、NOD-SCID、Rag1−/−およびRag2−/−マウスである。一部の態様において、試験対象は、癌易発性(cancer-prone)動物、例えば、活性化された癌遺伝子を保有するおよび/または腫瘍抑制遺伝子を欠失する動物モデル、またはその動物が癌を発症し易い状態にする条件、化合物または刺激に暴露された動物である。本明細書において用いられる場合、非ヒト試験対象はまた、動物宿主とも称される。
試験化合物は、当該分野において公知の任意のレジメンにより対象に投与することができる。例えば、試験化合物は、本発明の癌幹細胞の投与の前、それと同時に、および/またはその後に、投与することができる。試験化合物はまた、方法の経過全体を通して定期的に、例えば、1日1回、2回、3回、4回またはそれより多く、週1回、隔週で、または月1回、投与することができ、本発明の細胞が投与される前に始めても後に始めてもよい。他の態様において、試験化合物は、対象に持続的に投与される(例えば、静脈内で、またはインプラント、ポンプ、持続放出製剤などからの放出により)。投与されるべき試験化合物の用量は、化合物の型、対象の体重、投与の頻度などを含む複数の要因に依存し得る。投与量の決定は、当業者にとって日常的なことである。代表的な投与量は、0.01〜200mg/kg(例えば0.1〜20または1〜10mg/kg)である。
対象における腫瘍(例えばCSC依存性腫瘍)のサイズおよび/または数は、腫瘍細胞および試験化合物の投与の後で決定することができる。腫瘍のサイズおよび/または数は、当該分野において公知の任意の手段により非侵襲的に決定することができる。例えば、蛍光標識された(例えばGFPなどの蛍光タンパク質を発現することにより)腫瘍細胞は、多様な腫瘍イメージング技術または機器、例えば二光子顕微鏡法などの非侵襲的蛍光法によりモニタリングすることができる。皮下に移植された腫瘍のサイズは、皮膚の下でモニタリングして測定することができる。
化合物がCSC依存性腫瘍形成または癌幹細胞の増殖に影響を及ぼすか否かを決定するために、対象における腫瘍のサイズおよび/または数を、参照標準(例えば対照値)と比較することができる。参照標準は、試験化合物が省略されたかまたは不活性な形態において投与されたことを除いて、癌幹細胞および試験化合物の投与の同じレジメンを受けた対照の対象であってよい。あるいは、その系において不活性であると考えられる化合物を投与してもよい。参照標準はまた、癌幹細胞ではない癌細胞および試験化合物、癌幹細胞ではない癌細胞および試験化合物なし、または癌幹細胞ではない癌細胞および不活性な試験化合物を投与された対照の対象であってもよい。参照標準はまた、未処置の対象において予測されるCSC依存性腫瘍のサイズおよび/または数を代表する数値または数値の範囲であってもよい。この数値または数値の範囲は、未処置の対象の代表的なサンプルの観察により決定することができる。参照標準はまた、化合物の投与の前の試験動物であってもよい。
一部の場合において、化合物(例えばリード化合物)の活性は、共培養中で増殖させられる対照細胞と試験細胞とを接触させることにより試験することができる。共培養により、共通の増殖チャンバー中で化合物と接触した2または3以上の細胞(例えば対照および試験細胞)の集団の選択的な増殖および/または生存の特性の評価が可能になる。代表的には、共培養中で増殖させた細胞の各集団は、検出可能であって共培養中の他の細胞の集団の識別特徴と識別可能な識別特徴を有する。一部の態様において、識別特徴は、GFPタンパク質または上記のものなどの他のレポータータンパク質および/または癌幹細胞バイオマーカーの発現のレベルを含む。しかし、本発明はそのように限定されず、当該識別特徴が、共培養中の2または3以上の細胞の集団の各々の増殖および/または生存のレベルの測定(例えばFACSまたは本明細書において開示される他の好適なアッセイ方法により)を可能にするかぎり、当該分野において公知の他の識別特徴が好適である場合もある。少なくともいくつかの試験細胞(例えば、1〜99%の試験細胞)と少なくともいくつかの対照細胞(例えば、1〜99%の対象細胞)とを含む組成物、例えば共培養物は、本発明の一局面である。一部の態様において、試験細胞のパーセンテージは10%〜90%である。他の態様において、試験細胞のパーセンテージは20%〜80%である。一部の態様において、試験細胞のパーセンテージは30%〜70%である。一部の態様において、試験細胞のパーセンテージは40%〜60%、例えば50%である。一部の態様において、組成物はさらに試験剤を含む。
他の態様において、試験細胞と対照細胞とは、別々の容器(例えばマイクロウェルプレートの別々のウェル)中に、実質的に同一の条件下において維持される。
試験細胞、対照細胞および1または2以上の試験化合物、例えば10、100、1000、10,000個またはそれより多い試験化合物、ここで細胞および試験剤は細胞に対する試験剤の効果を評価するために好適な様式において1または2以上の容器中に配置される、を含むアッセイ系は、本発明の局面である。代表的には、容器は、好適な組織培養培地を含み、試験化合物は、該組織培養培地中に存在する。当業者は、特定の細胞型を培養するために適切な培地を選択することができる。一部の態様において、培地は、血清または組織抽出物を含まないかまたは本質的に含まないが、他の態様においては、かかる成分が存在する。一部の態様において、細胞はプラスチックまたはガラス表面上で培養される。一部の態様において、細胞は、少なくとも幾つかの点で多くの組織において見出される細胞外環境に類似する環境を提供することを意図して、コラーゲン、ラミニン、Matrigel(登録商標)または合成の材料、例えば合成ハイドロゲル、を含む材料において、またはそれらの中で培養される。一部の態様において、試験および/または対照細胞は、非癌性間質細胞と共に培養される。一部の態様において、試験および/または対照細胞は、線維芽細胞と共に培養される。一部の態様において、試験および/または対照細胞は、三次元培養マトリックスにおいて培養される。
試験細胞、対照細胞および1または2以上の試験化合物、例えば10、100、1000、10,000個またはそれより多い試験化合物、ここで細胞および試験剤は細胞に対する試験剤の効果を評価するために好適な様式において1または2以上の容器中に配置される、を含むアッセイ系は、本発明の局面である。代表的には、容器は、好適な組織培養培地を含み、試験化合物は、該組織培養培地中に存在する。当業者は、特定の細胞型を培養するために適切な培地を選択することができる。一部の態様において、培地は、血清または組織抽出物を含まないかまたは本質的に含まないが、他の態様においては、かかる成分が存在する。一部の態様において、細胞はプラスチックまたはガラス表面上で培養される。一部の態様において、細胞は、少なくとも幾つかの点で多くの組織において見出される細胞外環境に類似する環境を提供することを意図して、コラーゲン、ラミニン、Matrigel(登録商標)または合成の材料、例えば合成ハイドロゲル、を含む材料において、またはそれらの中で培養される。一部の態様において、試験および/または対照細胞は、非癌性間質細胞と共に培養される。一部の態様において、試験および/または対照細胞は、線維芽細胞と共に培養される。一部の態様において、試験および/または対照細胞は、三次元培養マトリックスにおいて培養される。
癌幹細胞遺伝子についての遺伝子スクリーニング
一部の態様において、本発明のアッセイ方法は、新規の癌幹細胞遺伝子を同定するために有用である。本明細書において用いられる場合、癌幹細胞遺伝子は、癌幹細胞の増殖および/または生存に影響を及ぼす遺伝子である。一態様において、癌幹細胞遺伝子スクリーニングは、試験細胞および/または対照細胞におけるRNAi媒介性の遺伝子抑制と、細胞の増殖および/または生存についてのアッセイとを組み合わせる。例えば、上皮間葉移行を経験した試験細胞および/または上皮間葉移行を経験していない対照細胞を、試験遺伝子に対するsiRNA(または類似のRNAiベースの抑制モダリティー)と接触させ、それにより試験細胞および/または対照細胞における試験遺伝子の発現を抑制してもよい。試験遺伝子の発現を阻害した後で、試験および/または対照細胞の増殖および/または生存を、例えば本明細書において開示される方法のいずれかを用いて、評価することができる。一態様において、その阻害が、試験細胞の増殖および/または生存に影響を及ぼす(例えば阻害する、活性化する)が、対照細胞の増殖および/または生存には影響を及ぼさない試験遺伝子は、癌幹細胞遺伝子である。
一部の態様において、本発明のアッセイ方法は、新規の癌幹細胞遺伝子を同定するために有用である。本明細書において用いられる場合、癌幹細胞遺伝子は、癌幹細胞の増殖および/または生存に影響を及ぼす遺伝子である。一態様において、癌幹細胞遺伝子スクリーニングは、試験細胞および/または対照細胞におけるRNAi媒介性の遺伝子抑制と、細胞の増殖および/または生存についてのアッセイとを組み合わせる。例えば、上皮間葉移行を経験した試験細胞および/または上皮間葉移行を経験していない対照細胞を、試験遺伝子に対するsiRNA(または類似のRNAiベースの抑制モダリティー)と接触させ、それにより試験細胞および/または対照細胞における試験遺伝子の発現を抑制してもよい。試験遺伝子の発現を阻害した後で、試験および/または対照細胞の増殖および/または生存を、例えば本明細書において開示される方法のいずれかを用いて、評価することができる。一態様において、その阻害が、試験細胞の増殖および/または生存に影響を及ぼす(例えば阻害する、活性化する)が、対照細胞の増殖および/または生存には影響を及ぼさない試験遺伝子は、癌幹細胞遺伝子である。
一態様において、ゲノム規模におけるRNAiに基づく遺伝子スクリーニングが、癌幹細胞遺伝子をゲノム規模のスケールで同定するために用いられる。一部の態様において、RNAiに基づく遺伝子スクリーニングのための試験細胞は、上皮間葉移行を経験した細胞である。前述の遺伝子スクリーニング方法は、単一の遺伝子から、ある生物における調査されている全てまたは実質的に全ての既知の遺伝子を標的とする、RNAi遺伝子抑制モダリティー(例えば、shRNA、siRNA、esiRNAなど)を含むライブラリーを用いる。一態様において、ライブラリーは、shRNA配列が約125塩基の5’および3’の前(pre-)miR-30配列に挟まれている(ChangK, Elledge SJ, Hannon GJ. Nat. Methods. 2006 Sep; 3(9): 707-14)、mir-30に基づくshRNA(shRNAmir)発現ベクターを利用する。発現ベクターは、細胞においてこれらのshRNAの発現を駆動して機能的なshRNAをもたらすために、ポリメラーゼI、ポリメラーゼIIまたはポリメラーゼIIIプロモーターを用いることができる。前者のポリメラーゼは、誘導性および組織特異的発現系を含む古典的なタンパク質発現戦略を使用することを可能にする。レンチウイルスに基づく系、esiRNAライブラリー、siRNAおよびヒト配列を対象とするライブラリーなどの他のライブラリー集積は、容易に入手可能であり、当業者に周知である。癌幹細胞遺伝子についての遺伝子スクリーニングは、RNAi法に限定されず、cDNAに基づく外因性遺伝子発現、または遺伝子抑制因子エレメント(GSE)の使用を含んでもよい。一態様において、ゲノム規模のcDNAに基づく遺伝子スクリーニングが用いられる。したがって、スクリーニング法は、単一の遺伝子から、ある生物における調査されている全てまたは実質的に全ての既知の遺伝子からなる、cDNAまたはGSEに基づくモダリティーを含む、ライブラリーの使用に適用可能である。
標的の同定
本発明は、本発明の方法を用いて同定される化合物、例えば例において開示される化合物の標的を同定することを包含する。用語「標的」は、本明細書において、当該分野におけるその意味と一致し、生物学的に活性な薬剤が効果、例えばCSCの増殖および/または繁殖を阻害するなどの治療上の利益をもたらす効果、を発揮する生体分子(例えば対照の体内に存在する生体分子)を指す。例えば、化合物は、1または2以上の遺伝子産物に対して直接的に(物理的相互作用により)、または間接的に作用することができる。標的は、例えば、細胞表面または細胞内の受容体、酵素、チャネル、分泌タンパク質などであってよい。本発明の方法を用いてCSC選択的化合物であると同定される化合物の標的は、創薬の試みについての候補である(かかる候補はしばしば「創薬標的(drugdiscovery target)」と称される)。本発明は、したがって、創薬標的が有用に対象とする候補生体分子を同定するための方法を提供する。かかる生体分子に作用することが当該分野において既に知られている化合物は、CSC選択的薬剤として有用である場合がある。かかる薬剤を、本明細書において記載される方法を用いて試験してもよい。さらに、かかる生体分子に作用する、低分子、タンパク質、アプタマー、抗体または抗体フラグメント、核酸(例えば低分子干渉RNA)などのさらなる化合物を同定するために、当該分野において公知の標準的なスクリーニング方法を用いてもよい。
本発明は、本発明の方法を用いて同定される化合物、例えば例において開示される化合物の標的を同定することを包含する。用語「標的」は、本明細書において、当該分野におけるその意味と一致し、生物学的に活性な薬剤が効果、例えばCSCの増殖および/または繁殖を阻害するなどの治療上の利益をもたらす効果、を発揮する生体分子(例えば対照の体内に存在する生体分子)を指す。例えば、化合物は、1または2以上の遺伝子産物に対して直接的に(物理的相互作用により)、または間接的に作用することができる。標的は、例えば、細胞表面または細胞内の受容体、酵素、チャネル、分泌タンパク質などであってよい。本発明の方法を用いてCSC選択的化合物であると同定される化合物の標的は、創薬の試みについての候補である(かかる候補はしばしば「創薬標的(drugdiscovery target)」と称される)。本発明は、したがって、創薬標的が有用に対象とする候補生体分子を同定するための方法を提供する。かかる生体分子に作用することが当該分野において既に知られている化合物は、CSC選択的薬剤として有用である場合がある。かかる薬剤を、本明細書において記載される方法を用いて試験してもよい。さらに、かかる生体分子に作用する、低分子、タンパク質、アプタマー、抗体または抗体フラグメント、核酸(例えば低分子干渉RNA)などのさらなる化合物を同定するために、当該分野において公知の標準的なスクリーニング方法を用いてもよい。
化合物が本発明の方法を用いてCSC選択的化合物として同定されると、多様なアプローチを用いて該化合物の1または2以上の生物学的標的を同定することができる。一態様において、RNAiまたは遺伝子抑制因子エレメント(GSE)ライブラリーを用いて、細胞、例えばCSC、またはEMTを経験しており該化合物による増殖阻害に対して感受性である細胞における個々の遺伝子を阻害する。一態様において、cDNAライブラリーを用いて、細胞、例えばCSC、またはEMTを経験しており該化合物による増殖阻害に対して感受性である細胞における各遺伝子を過剰発現する。特定の遺伝子の阻害または過剰発現が、感受性を調節する(例えば、本発明の多様な態様において、抑止する、低下させる、または増大させる)場合、当該遺伝子またはかかる遺伝子の産物は、当該化合物の標的、および/または創薬のための標的となる候補である。当業者は、適切なアッセイまたはアッセイの組み合わせを選択するであろう。
別の態様において、化合物は、その分子標的を同定するために用いられる。標的の道程のために任意の好適な方法を用いることができる。化合物は、標識されるか、または反応性基もしくはタグを含むように改変されてもよい。反応性基またはタグは、例えばそのような組み込みが化合物の活性に実質的に影響を及ぼさない部位において組み込まれる。細胞を化合物と接触させ、化合物がその標的と相互作用する条件下に維持される。細胞は、試験細胞、例えばEMTを経験した細胞であってよいが、そうである必要はない。細胞は、化合物を最初に同定するために用いられた細胞と同じ型のものであってよいが、そうである必要はない。随意に化合物は、それが物理的に相互作用する生体分子と架橋される。化合物は、次いで、それが結合した生体分子とともに単離される(例えば、いくつかのまたは全ての他の細胞構成成分から取り除かれ;部分的に精製される)。化合物がタグ化されている場合、化合物を単離するためにタグを用いてもよい。
別の態様において、アフィニティークロマトグラフィーを用いて化合物の標的を同定する。化合物を、支持体、例えばクロマトグラフィー樹脂または他の支持体に結合させ、それによりアフィニティーマトリックスを形成させる。例えば、リンカー、例えばテトラエチレングリコールリンカーを化合物の好適な位置で結合させ、次いで適切な条件下においてAffi-Gel10樹脂に共役させて、アフィニティーマトリックスを得てもよい。アフィニティーマトリックスを、細胞溶解物(例えば、試験細胞溶解物、対照細胞溶解物)と共にインキュベートし、次いで洗浄し、そして結合した生体分子、例えばタンパク質は、例えばSDS含有バッファー中で煮沸することにより、樹脂から溶出される。アフィニティーマトリックスにより保持されたタンパク質は、例えばSDS/PAGEにより分離し、例えば銀染色または任意の適切な方法により可視化することができる。これらは次いでゲルから単離してもよい。次いで、例えばペプチドシークエンシング、質量分析などを用いて、生体分子を同定する。所望の場合、不活性であるが構造的に類似の化合物を陰性対照として用いてもよい。特異性を確認するために、アフィニティーマトリックスへの結合の間に化合物を細胞溶解物に添加することにより、可溶性化合物との競合を行ってもよい。一部の態様において、試験細胞において選択的に存在し、および/または対照細胞に対して試験細胞において化合物に選択的に結合する生体分子は、目的のものである。
別の態様において、マイクロアレイ分析、遺伝子発現の逐次分析(serial analysis of gene expression:SAGE)、または類似の技術は、本発明の方法を用いて同定された化合物の、選択された型の細胞、例えば試験細胞、対照細胞、癌細胞、CSCなどにおける遺伝子発現に対する効果を評価するために用いられる。化合物に対する暴露の結果としてその発現が調節される遺伝子は、当該化合物の標的および/または創薬のための標的の候補である。本発明の他の態様において、タンパク質のレベル、局在、および/または修飾状態(例えばリン酸化状態)などに対する化合物の効果を決定するために、当該分野において公知の方法を用いる。化合物に対する暴露の結果として、そのレベル、局在、および/または修飾状態が調節されるタンパク質は、当該化合物の標的および/または創薬のための標的の候補である。
したがって、本発明の方法を用いて同定される化合物は、CSCの生物学において重要な役割を果たす遺伝子および遺伝子産物、例えばその活性がCSCの特性に寄与するおよび/またはCSCを非CSC癌細胞、正常細胞などから区別する、遺伝子および遺伝子産物を同定するためのプローブとして有用である。かかる遺伝子および遺伝子産物は、限定することなく、CSCの増殖および/または繁殖を選択的に阻害するさらなる薬剤を同定することを目的とする、創薬のための標的として有用である。
癌幹細胞バイオマーカーおよび対象の処置
本明細書において記載される方法は、癌幹細胞に関連する癌などの障害を処置するための広範な用途を有する。癌は、制御されないまたは異常に制御された細胞増殖および他の悪性の細胞特性により特徴づけられる疾患である。本明細書において用いられる場合、癌という用語は、以下の型の癌を含むがこれらに限定されない:乳癌;胆管癌;膀胱癌;膠芽腫および髄芽腫を含む脳癌;子宮頚癌;絨毛癌;大腸癌;子宮内膜癌;食道癌;胃癌;急性リンパ性白血病および骨髄性白血病を含む血液性新生物;T細胞急性リンパ芽球性白血病/リンパ腫;有毛細胞性白血病;慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫;AIDS関連白血病および成人T細胞白血病/リンパ腫;ボーエン病およびページェット病を含む上皮内新生物;肝臓癌;肺癌;ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫を含むリンパ腫;神経芽細胞腫;扁平上皮細胞癌を含む口腔癌;上皮細胞、間質細胞、生殖細胞および間葉系細胞から生じるものを含む卵巣癌;膵臓癌;前立腺癌;直腸癌;平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫および骨肉腫を含む肉腫;黒色腫、メルケル細胞癌、カポジ肉腫、基底細胞癌および扁平上皮細胞癌を含む皮膚癌;セミノーマ、非セミノーマ(テラトーマ、絨毛癌)、間質腫瘍および生殖細胞腫瘍などの胚性腫瘍を含む精巣癌;甲状腺腺腫および髄様癌を含む甲状腺癌;腺癌およびウィルムス腫瘍を含む腎臓癌。好ましい態様において、癌は、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、子宮頚癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、または精巣腫瘍である。一態様において、癌は肺癌である。一態様において、癌は乳癌である。他の癌は当業者に公知であろう。
本明細書において記載される方法は、癌幹細胞に関連する癌などの障害を処置するための広範な用途を有する。癌は、制御されないまたは異常に制御された細胞増殖および他の悪性の細胞特性により特徴づけられる疾患である。本明細書において用いられる場合、癌という用語は、以下の型の癌を含むがこれらに限定されない:乳癌;胆管癌;膀胱癌;膠芽腫および髄芽腫を含む脳癌;子宮頚癌;絨毛癌;大腸癌;子宮内膜癌;食道癌;胃癌;急性リンパ性白血病および骨髄性白血病を含む血液性新生物;T細胞急性リンパ芽球性白血病/リンパ腫;有毛細胞性白血病;慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫;AIDS関連白血病および成人T細胞白血病/リンパ腫;ボーエン病およびページェット病を含む上皮内新生物;肝臓癌;肺癌;ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫を含むリンパ腫;神経芽細胞腫;扁平上皮細胞癌を含む口腔癌;上皮細胞、間質細胞、生殖細胞および間葉系細胞から生じるものを含む卵巣癌;膵臓癌;前立腺癌;直腸癌;平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫および骨肉腫を含む肉腫;黒色腫、メルケル細胞癌、カポジ肉腫、基底細胞癌および扁平上皮細胞癌を含む皮膚癌;セミノーマ、非セミノーマ(テラトーマ、絨毛癌)、間質腫瘍および生殖細胞腫瘍などの胚性腫瘍を含む精巣癌;甲状腺腺腫および髄様癌を含む甲状腺癌;腺癌およびウィルムス腫瘍を含む腎臓癌。好ましい態様において、癌は、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、子宮頚癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、または精巣腫瘍である。一態様において、癌は肺癌である。一態様において、癌は乳癌である。他の癌は当業者に公知であろう。
本発明の一面は、癌を有するかまたは癌を有することが疑われる対象を処置するための、前記対象に癌幹細胞を選択的に標的とする化合物の有効量を投与することを含む方法である。本発明の他の局面は、癌を有するかまたは癌を有することが疑われる対象を処置するための、前記対象に、癌の化学療法剤(例えば、ドキソルビシン、パクリタキセル、アクチノマイシンD、カンプトテシンおよびスタウロスポリン)の有効量を、癌幹細胞を選択的に標的とする化合物と組み合わせて投与することを含む方法である。本明細書において用いられる場合、癌の化学療法剤は、CSC選択的な化合物ならびに非CSC選択的である化合物を包含する。CSC選択的でない化合物は、CSCと、CSCでない癌細胞との両方を標的とすることが知られている化合物、および、CSCでない癌細胞のみを標的とする化合物を含む。一部の態様において、対象を、エトポシド、サリノマイシン、アバメクチンおよびニゲリシンならびに前述のいずれかの誘導体から選択される選択的幹細胞特異的化合物を含む医薬組成物の有効量と組み合わせたパクリタキセルで処置する。
本明細書において開示される方法により有用である癌の化学療法剤の非限定的な例として、以下が挙げられる:アルキル化剤およびアルキル化様剤(alkylating-likeagent)、例えばナイトロジェンマスタード(例えば、クロラムブシル、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミドおよびメルファラン)、ニトロソウレア(例えば、カルマスティン、ホテムスチン、ロムスチン、およびストレプトゾシン)、白金剤(すなわち、アルキル化様剤)(例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、BBR3464およびサトラプラチン)、ブスルファン、ダカルバジン、プロカルバジン、テモゾロミド、チオテパ、トレオスルファンおよびウラムスチン(Uramustine);葉酸などの抗代謝薬(例えば、アミノプテリン、メトトレキサート、ペメトレキセドおよびラルチトレキセド);クラドリビン、クロフラビン、フルダラビン、メルカプトプリン、ペントスタチン、およびチオグアニンなどのプリン;カペシタビン、シタラビン、フルオロウラシル、フロクスウリジン、およびゲムシタビンなどのピリミジン;タキサン(例えば、ドセタキセル、パクリタキセル)およびビンカ(Vinca)(例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビン)などの紡錘体毒/有糸分裂阻害剤;アントラサイクリン(例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、ピクサントロン、およびバルルビシン)、ストレプトマイセス属の多様な種により天然に産生される化合物(例えば、アクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、プリカマイシン)およびヒドキシウレアなどの細胞傷害性/抗腫瘍性抗生物質;カンプトテカ(例えば、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン)およびポドフィルム(例えば、エトポシド、テニポシド)などのトポイソメラーゼ阻害剤;
抗受容体チロシンキナーゼ(例えば、セツキシマブ、パニツムマブ、トラスツズマブ)、抗CD20(例えば、リツキシマブおよびトシツモマブ)、ならびに他のもの、例えばアレムツズマブ、ベバシズマブ、およびゲムツズマブなどの癌免疫治療のためのモノクローナル抗体;アミノレブリン酸、メチルアミノレブリン酸、ポルフィマーナトリウムおよびベルテポルフィンなどの光感受性物質;セジラニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、ニロチニブ、ソラフェニブ、スニチニブおよびバンデタニブなどのチロシンキナーゼ阻害剤;セリン/スレオニンキナーゼ阻害剤(例えば、AbI、c-Kit、インシュリン受容体ファミリーメンバー、EGF受容体ファミリーメンバー、Akt、mTOR(例えば、ラパマイシンまたはそのアナログ、mTORC1および/またはmTORC2の直接的阻害剤)、Rafキナーゼファミリー、PI3キナーゼなどのホスファジチルイノシトール(PI)キナーゼ、PIキナーゼ様キナーゼファミリーメンバー、サイクリン依存性キナーゼファミリーメンバー、オーロラキナーゼファミリーの阻害剤)、増殖因子受容体アンタゴニスト、ならびに他のもの、例えばレチノイド(例えば、アリトレチノインおよびトレチノイン)、アルトレタミン、アムサクリン、アナグレリド、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ(例えば、ペグアスパルガーゼ)、ベキサロテン、ボルテゾミブ、デニロイキンジフチトクス、エストラムスチン、イクサベピロン、マソプロコール、ミトタンおよびテストラクトン、Hsp90阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、HDAC阻害剤、血管新生阻害剤、例えば、ベバシズマブまたはVEGF-Trapなどの血管内皮増殖因子抑制剤(anti-vascularendothelial growth factor agent)、マトリックスメタプロテアーゼ阻害剤、アポトーシス促進剤(pro-apoptoticagent)(例えばアポトーシス誘導剤)、抗炎症剤など。
一部の場合において、癌を有するかまたは癌を有することが疑われる対象において癌幹細胞バイオマーカーを評価し、バイオマーカーの評価の結果に基づいて前記対象のための処置を選択することが望ましい場合がある。例えば、癌幹細胞バイオマーカーが検出される場合、本明細書において開示される方法を用いて同定されるものなどの癌幹細胞特異的化合物を含む医薬組成物の有効量で対象を処置してもよい。一部の態様において、癌幹細胞バイオマーカーが検出される場合、随意にパクリタキセルまたはその誘導体(例えば水溶性の誘導体または標的化された誘導体または構造的に関連する化合物、例えばドセタキセルなどのアナログ(例えばWO/2003/045932およびUS2008033189を参照))と組み合わせた、サリノマイシン、アバメクチン、エトポシドまたはニゲリシンまたは前述のいずれかの誘導体を含む医薬組成物の有効量で対象を処置してもよい。前述の方法の癌幹細胞バイオマーカーは、本明細書において開示される方法または当該分野において公知の任意の好適な方法を用いて評価することができる。例示的な癌幹細胞バイオマーカーとして、E−カドヘリンの発現、TWISTの発現、およびCD44+CD24−マーカープロフィールが挙げられる。他の例示的な癌幹細胞バイオマーカーは、本明細書において開示され、当業者には明らかであろう。
癌幹細胞バイオマーカーを評価するために、対象からの臨床サンプル(例えば癌のサンプル)を得ることが必要である場合がある。代表的には、臨床サンプルは、腫瘍の生検またはそれから単離された細胞である。しかし、本発明はそのように限定されず、当該サンプルが癌幹細胞を有する対象において検出可能な癌幹細胞バイオマーカーを有することを前提として、任意の好適な臨床サンプルを用いることができる。例示的な臨床サンプルとして、唾液、歯肉分泌物、脳脊髄液、胃腸管液、粘液、泌尿生殖器分泌物、滑液、血液、血清、血漿、尿、嚢胞液、リンパ液、腹水、胸水、間質液、細胞内液、眼液(ocularfluid)、精液、乳腺分泌液、硝子体液および鼻分泌物が挙げられる。
一部の態様において、本発明の処置方法は、癌幹細胞(CSC)および/またはCSC依存性腫瘍を有する(例えば内部に抱える)かそれを有する危険性がある対象の処置を含む。本明細書において用いられる場合、対象は、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、げっ歯類または霊長類を含むがこれらに限定されない哺乳動物である。対象は、家庭のペット(例えば、イヌ、ネコ)、農畜産動物(例えばウシ、ウマ、ブタ、ニワトリなど)、研究動物(例えば、マウス、ラット、ウサギなど)、動物園の動物(例えば、ライオン、キリンなど)であってよいが、そのように限定されない。好ましい対象はヒト対象である。ヒト対象は、小児または成人の対象であってよい。一部の態様において、成人の対象は、老齢期の対象である。対象がCSCまたはCSC依存性腫瘍を有する「危険性がある」とみなされるか否かの決定は、対象を介護する熟練した医師の裁量の範囲内であり得る。任意の好適な診断試験および/または判断基準を用いることができる。例えば、以下の場合、対象はCSCまたはCSC依存性腫瘍を有する「危険性がある」とみなされ得る:(i)変異または遺伝子多型を有しない一般的集団の他のメンバーと比較して癌を発症するかまたは有する危険性が増大することと関連する突然変異、遺伝子多型、遺伝子またはタンパク質の発現プロフィール、および/または血中の特定の物質の存在を、対象が有する場合;(ii)対象が1または2以上の危険因子を有する場合、例えば癌の家族歴を有する場合、発癌性物質または腫瘍を促進する薬剤もしくは状態、例えばアスベスト、タバコの煙、アフラトキシン、放射線、慢性感染/炎症などに暴露された場合、老齢である場合;(iii)対象が1または2以上の癌の症状などを有する場合。一部の態様において、化合物が、先に(本発明より以前に)癌を処置する以外の目的のために、例えば癌以外の状態の処置のために、対象に投与されているものである場合、対象は、通常かかる目的のために当該化合物が投与されるものではなく、および/または当該化合物は、かかる他の目的のために有用であることが当該分野において知られる用量とは区別し得る処方中でまたは用量で投与される。
さらに、本明細書において用いられる場合、処置または処置するとは、障害(例えば、CSC依存性腫瘍)の寛解、治癒、および/または治癒の維持(すなわち、再発の予防または遅延)を含む。障害が開始した後の処置は、当該障害および/またはそれに関連する症状を低減、寛解または完全に取り除くこと、それが悪化を開始することを予防すること、進行の速度を低下させること、または障害が初めに除去された後にそれが再度発生することを予防すること(再発を予防すること)を目的とする。好適な用量および治療レジメンは、用いられる特定の化合物、化合物の送達の様式、およびそれが単独で用いられるか組み合わせにおいて用いられるかに依存して変化し得る。本明細書において用いられる場合、治療有効量とは、化合物または組成物の、CSC依存性腫瘍の形成、進行および/または拡散(例えば転移)を阻害する量である。治療有効量は、本明細書において記載される、または本明細書において記載される方法を用いて発見される、CSC依存性腫瘍を阻害する特性を有する(例えば、CSCの増殖および/または生存を阻害する)化合物または組成物の任意の1または2以上のものを指してもよい。本明細書において記載される任意の化合物または組成物についての治療有効量を確立するための方法は、当業者に公知である。
本明細書において用いられる場合、医薬組成物は、治療上の有用性を有する化合物または組成物、および薬学的に受容可能なキャリア、すなわち化合物または組成物の送達を促進するものを、治療有効量において含む。任意の特定の用途についての有効量はまた、処置される癌、投与される特定の化合物、対象のサイズ、または疾患もしくは状態の重篤度などの要因に依存して変化し得る。当業者は、本発明の特定の分子の有効量を、過度の実験を必要とすることなく、経験的に決定することができる。本明細書において提供される技術と組み合わせて、多様な活性化の中から選択すること、および効力、相対的なバイオアベイラビリティ、患者の体重、有害な副作用の重篤度および好ましい投与の様式などの要因を重みづけすることにより、実質的な毒性を回避しつつなお特定の対象を処置するために有効であるゴールを有する、効果的な予防的または治療的処置レジメンを計画することができる。一部の態様において、有用な化合物は、統計学的に有意な様式において、当該化合物により処置された対象の平均の生存の長さを増大し、無進行生存の長さを増大し、および/または再発の確率を低下させる。
本明細書において記載される化合物の対象の用量は、代表的には、約0.1μg〜10,000mg、より代表的には約1μg〜8000mg、例えば約10μg〜100mgの範囲であり、1日1回、週1回、1か月1回、または他の時間間隔である。対象の体重に関して述べると、本発明のある態様における代表的な投与量は、約0.1μg〜20mg/kg/日、例えば約1〜10mg/kg/日、例えば約1〜5mg/kg/日の範囲である。絶対量は、併用の処置、用量の数、ならびに年齢、身体的状態、サイズおよび体重を含む個々の患者のパラメーターを含む多様な要因に依存し得る。これらの要因は当業者に周知であり、通例の実験のみを用いて取り組むことができる。しばしば、最大用量、すなわち最も高い安全な用量が、確立した医学的判断に従って用いられる場合がある。
用いられる用量は、最大耐用量であっても、治療量以下の用量であっても、これらの間の任意の用量であってもよい。本発明の分子の複数の用量もまた企図される。本発明の分子が組み合わせにおいて投与される場合、分子のいずれかの治療量以下の投与量、または両方の治療量以下の投与量を、癌を有するかまたは発症する危険性を有する対象の処置において用いることができる。2つのクラスの薬物が一緒に用いられる場合、癌の医薬は、所望の治療的結果を提供するために、治療量以下の用量において投与することができる。「治療量以下の用量」とは、本明細書において用いられる場合、他の薬剤の不在下において投与された場合に対象において治療的効果を提供するであろう投与量よりも少ない投与量を指す。したがって、癌の医薬の治療量以下の用量は、本発明の分子の投与の不在下において、対象において所望の治療的効果を提供しないであろうものである。癌の医薬の治療的用量は、癌の処置のための医学の分野において周知である。これらの投与量は、Remington'sPharmaceutical Sciences、第18版、1990年などの参考文献、ならびに癌の処置のためのガイダンスとして医療従事者により信頼される多数の他の医学参考文献において広範に記載されている。
本明細書において開示される組成物は、経口で、鼻内で、皮下で、筋肉内で、静脈内で、動脈内で、非経口で、腹腔内で、くも膜下腔内で、気管内で、眼内で、舌下で、経膣で、直腸で、経皮で、またはエアロゾルとしてなどの任意の好適な手段により投与することができる。処置される状態(例えば癌)の型に依存して、本発明の化合物は、例えば、全身の経路により、吸入、消化、または投与されてもよい。したがって、多様な投与の様式または経路が利用可能である。選択される特定の様式は、もちろん、選択される特定の化合物、処置される特定の状態、および治療の有効性のために必要とされる投与量に依存する。本発明の方法は、一般的に述べると、医学的に受容可能である任意の投与の様式を用いて実施することができ、これは、臨床的に受容することができない有害効果を引き起こすことなしに受容可能な有効レベルを提供する任意の様式を意味する。用語「非経口」とは、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内および胸骨内での注射または注入技術を含む。一部の態様において、吸入される医薬は、例えば肺癌の患者における肺への直接送達のために、特に有用である。任意の型の計量された用量の噴霧式吸入器を、吸入による投与のために定期的に用いる。これらの型のデバイスとして、定量噴霧式吸入器(MDI)、呼吸作動型MDI、ドライパウダー噴霧式吸入器、MDIと組み合わせたスペーサー/ホールディングチャンバー、およびネブライザーが挙げられる。他の適切な経路は、当業者には明らかであろう。
本発明の方法によれば、化合物は、医薬組成物中で投与してもよい。本発明の医薬組成物を投与することは、当業者に公知の任意の手段により達成することができる。本発明の医薬組成物は、活性剤に加えて、代表的には薬学的に受容可能なキャリアを含む。用語「薬学的に受容可能なキャリア」とは、本明細書において用いられる場合、ヒトまたはより下等な動物に対する投与のために好適である、1または2以上の適合性の固体または液体の充填希釈剤またはカプセル化用物質を意味する。好ましい態様において、薬学的に受容可能なキャリアは、活性成分の生物学的活性の有効性に干渉しない非毒性の材料である。用語「適合性」とは、本明細書において用いられる場合、医薬組成物の成分を、本発明の化合物と、および互いに、通常の使用状況下において当該医薬組成物の薬学的有効性を実質的に低下させる相互作用が存在しないような様式において、混合することができることを意味する。薬学的に受容可能なキャリアは、もちろん、それが処置されるヒトまたはより下等な動物に対する投与のために好適となるように、十分に高い純度および十分に低い毒性のものでなければならない。
薬学的に受容可能なキャリアとして役立ち得る物質の幾つかの例は、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖;コーンスターチおよび馬鈴薯デンプンなどのデンプン;セルロース、およびカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロースなどのその誘導体;粉末トラガカント;麦芽;ゼラチン;タルク;ステアリン酸;ステアリン酸マグネシウム;硫酸カルシウム;ピーナッツ油、綿実油、胡麻油、オリーブ油、コーン油およびカカオ油などの植物油;プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール類;糖;アルギン酸;パイロジェンフリー水;等張性食塩水;リン酸緩衝溶液;カカオバター(坐剤の基剤);Tweens.RTM.などの乳化剤;ならびに医薬製剤において用いられる他の非毒性の適合性物質である。ラウリル硫酸ナトリウムなどの湿潤剤および潤滑剤、ならびに着色剤、香味剤、賦形剤、打錠用剤(tabletingagent)、安定化剤、抗酸化剤および保存剤もまた存在していてもよい。
本発明の化合物と組み合わせて使用することができる薬学的に受容可能なキャリアは、実用的なサイズと投与量との関係を提供するために十分な濃度で用いられる。薬学的に受容可能なキャリアは、全体において、本発明の医薬組成物の約60重量%〜約99.99999重量%、例えば約80%〜約99.99%、例えば約90%〜約99.95%、約95%〜約99.9%または約98%〜約99%を含んでよい。
経口投与および局所的摘要のための単位投与形態の製造に好適な薬学的に受容可能なキャリアは、当該分野において周知である。それらの選択は、味、コストおよび保存安定性などの、主題の発明の目的にとって決定的に重要ではない二次的考察に依存し、当業者により困難を伴うことなく行われる。
薬学的に受容可能な組成物は、希釈剤、充填剤、塩、緩衝化剤、安定化剤、可溶化剤、および当該分野において周知である他の物質を含むことができる。本発明の化合物と組み合わせて用いる薬学的に受容可能なキャリアの選択は、基本的には化合物が投与される方法により決定される。特にペプチドのための例示的な薬学的に受容可能なキャリアは、米国特許第5,211,657号において記載される。かかる製剤は、通例、塩、緩衝化剤、保存剤、適合性キャリア、および随意に他の治療剤を含み得る。医薬において用いられる場合、塩は、薬学的に受容可能なものであるべきであるが、薬学的に受容可能でない塩は、その薬学的に受容可能な塩を調製するために便利に用いることができ、本発明の範囲から除外されない。かかる薬理的におよび薬学的に受容可能な塩として、限定されないが、以下の酸から調製されるものが挙げられる:塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸など。また、薬学的に受容可能な塩は、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩などのアルカリ金属またはアルカリ土類金属の塩としても調製することができる。また、化合物は薬学的に受容可能なプロドラッグとして提供され得ること、および活性な代謝物が用いられ得ることも理解される。さらに、薬剤は、例えば標的化部分、それらの取り込み、生物学的半減期を増大させる部分(例えばペグ化)などにより修飾することができることもまた理解される。
本発明の製剤は、薬学的に受容可能な溶液中で投与され、これは通例薬学的に受容可能な濃度の塩、緩衝化剤、保存剤、適合性キャリア、アジュバントおよび随意に他の治療成分を含んでもよい。
本発明の化合物は、固体、半固体、液体または気体の形態の製剤、例えば、錠剤、カプセル、散剤、顆粒、軟膏、溶液、貯留剤(depositories)、吸入剤および注射、ならびに経口、非経口または外科投与のための通常の方法に、製剤化することができる。本発明はまた、インプラントなどによる局所投与のために製剤化される医薬組成物を包含する。
経口投与のために好適な組成物は、カプセル、錠剤、ロゼンジなどの、各々が予め決定された量の活性剤を含む別々の単位として提示することができる。他の組成物として、シロップ、エリキシル剤または乳液などの水性の液体または非水性の液体中の懸濁液が挙げられる。
本発明の化合物は、固体、半固体、液体または気体の形態の製剤、例えば、錠剤、カプセル、散剤、顆粒、軟膏、溶液、貯留剤(depositories)、吸入剤および注射、ならびに経口、非経口または外科投与のための通常の方法に、製剤化することができる。本発明はまた、インプラントなどによる局所投与のために製剤化される医薬組成物を包含する。
経口投与のために好適な組成物は、カプセル、錠剤、ロゼンジなどの、各々が予め決定された量の活性剤を含む別々の単位として提示することができる。他の組成物として、シロップ、エリキシル剤または乳液などの水性の液体または非水性の液体中の懸濁液が挙げられる。
本明細書において記載される化合物が治療上用いられる場合、ある態様においては、所望の投与の経路は、肺のエアロゾルによるものであり得る。化合物を含むエアロゾル送達システムを調製するための技術は、当業者に周知である。一般に、かかるシステムは、ペプチドの生物学的特性を著しく損なうことがない成分を利用すべきである(例えば、参考として組み込まれる、Remington'sPharmaceutical Sciences、第18版、1990年、pp 1694-1712におけるSciarraおよびCutie、「Aerosols」を参照)。当業者は、エアロゾルを製造するための多様なパラメーターおよび状態を、過度の実験を用いることなく容易に決定することができる。
本発明の化合物を、組織に直接的に投与してもよい。好ましくは、組織は、それにおいて癌細胞が見出されるものである。あるいは、組織は、それにおいて癌細胞が発生する可能性があるものである。直接組織投与は、直接注射により達成することができる。ペプチドは、一度に投与してもよく、あるいは、これらは複数の投与において投与してもよい。複数回投与される場合、ペプチドは、異なる経路を介して投与してもよい。例えば、第1の(または最初の数回の)投与は患部組織に直接行い、一方、後の投与は全身性であってもよい。
経口投与のために、活性化を当該分野において周知の薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせることにより、化合物を容易に製剤化することができる。かかるキャリアは、本発明の化合物を、処置される対象による経口での消化のための、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして製剤化することを可能にする。経口での使用のための医薬製剤は、固形の賦形剤として、生じる混合物を随意に粉砕し、そして顆粒の混合物を処理し、所望される場合は好適な助剤を添加した後、錠剤または糖衣錠のコアを得ることにより、得ることができる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤、例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、馬鈴薯デンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース製剤、および/またはポリビニルピロリドン(PVP)である。所望される場合、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの、崩壊剤を添加してもよい。随意に経口製剤はまた、内部酸性状態を中和するための食塩水または緩衝液中で製剤化しても、何らのキャリアをも用いずに投与してもよい。
糖衣錠のコアには、好適なコーティングを施す。この目的のために、濃縮糖溶液を用いてもよく、これは随意にアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、および/または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに任意の好適な有機溶媒または溶媒混合物を含んでよい。錠剤または糖衣錠のコーティングに、識別のため、または活性化合物の用量の異なる組み合わせを特徴づけるために、染料または色素を添加してもよい。
経口で用いることができる医薬製剤として、ゼラチン製の押し込み式カプセル、ならびにゼラチンとグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤とから作られた軟性の密封カプセルが挙げられる。押し込み式カプセルは、活性成分を、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、および/またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および随意に安定化剤との混合物中に含むことができる。ソフトカプセルにおいて、活性化合物は、油脂、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコール類などの好適な液体中に溶解または懸濁することができる。さらに安定化剤を添加してもよい。経口投与のために製剤化されたマイクロスフェアもまた用いることができる。かかるマイクロスフェアは、当該分野においてよく定義されている。経口投与のための全ての製剤は、かかる投与のために好適な投与量であるべきである。
口腔内投与のために、組成物は、従来の様式において製剤化された錠剤またはロゼンジの形態をとることができる。吸入による投与のために、本発明による使用のための化合物は、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー状の形態において、好適な噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適な気体を用いて、便利に送達することができる。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、一定量を送達するための弁を提供することにより決定することができる。化合物とラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末基剤との粉末混合物を含む、噴霧式吸入器(inhaler)または吸入器(insufflator)において用いるための例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジを製剤化してもよい。エアロゾル送達システムを調製するための技術は、当業者に周知である。一般に、かかるシステムは、活性剤の生物学的特性を著しく損なうことがない成分を利用すべきである(例えば、参考として組み込まれる、Remington'sPharmaceutical Sciences、第18版、1990年、pp 1694-1712におけるSciarraおよびCutie、「Aerosols」を参照)。当業者は、エアロゾルを製造するための多様なパラメーターおよび状態を、過度の実験を用いることなく容易に決定することができる。
化合物は、それらを全身送達することが望ましい場合、注射による、例えばボーラス注射または持続注入による、非経口投与のために製剤化することができる。注射のための製剤は、単位投与形態において、例えばアンプルにおいてまたは複数用量容器において、保存剤を添加して、提示することができる。組成物は、油性または水性のビヒクル中の懸濁液、溶液または乳液などの形態をとることができ、懸濁剤、安定化剤および/または分散剤などの製剤化のための薬剤を含んでもよい。
非経口投与のための製剤は、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液および乳液を含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性キャリアとして、水、アルコール性/水性溶液、乳液および懸濁液が挙げられ、これは食塩水および緩衝化溶媒を含む。非経口用ビヒクルとして、塩化ナトリウム水溶液、リンガーブトウ糖液、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸リンガー液、または硬化油が挙げられる。静脈内用ビヒクルとして、液体および栄養補充液(fluidand nutrient replenisher)、電解質補充液(リンガーブトウ糖液に基づくものなど)などが挙げられる。保存剤および他の添加物、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスなどもまた存在してもよい。静脈内投与などの他の投与の形態により、より低い用量がもたらされる場合もある。適用された最初の用量において対象における応答が不完全である場合、患者の耐容性が許容する程度まで、より高い用量(または、異なる、より局所的な送達経路による、有効性がより高い用量)を用いてもよい。化合物の適切な全身レベルを達成するために、1日あたり複数の用量が企図される。
なお他の態様において、好ましいビヒクルは、哺乳動物レシピエントへの移植に好適である生体適合性の微粒子またはインプラントである。この方法に従って有用である例示的な生体内分解性(bioerodible)インプラントは、PCT国際出願番号PCT/US/03307(公開番号WO95/24929、表題「Polymeric Gene Delivery System」、1994年3月15日に出願された米国特許出願第213,668号の優先権を主張する)において記載される。PCT/US/0307は、生物学的巨大分子を含有するための、生体適合性の、好ましくは生分解性の、ポリマーマトリックスを記載する。ポリマーマトリックスは、対象において薬剤の持続放出を達成するために用いることができる。本発明の一局面によれば、本明細書において記載される薬剤は、PCT/US/03307において開示される、生体適合性の、好ましくは生分解性の、ポリマーマトリックス中にカプセル化されるかまたは分散していてもよい。ポリマーマトリックスは、好ましくは、マイクロスフェア(ここで、薬剤は固体のポリマーマトリックス全体に分散している)またはマイクロカプセル(ここで薬剤はポリマーシェルのコア中に貯蔵される)などの微粒子の形態である。薬剤を含有するためのポリマーマトリックスの他の形態として、フィルム、コーティング、ゲル、インプラントおよびステントが挙げられる。ポリマーマトリックスデバイスのサイズおよび組成は、当該マトリックスデバイスが移植される組織において好ましい放出動態をもたらすように選択される。ポリマーマトリックスデバイスのサイズは、用いられるべき送達の方法(代表的には、組織中への注射、または鼻および/または肺領域中へのエアロゾルによる懸濁液の投与)に従ってさらに選択される。ポリマーマトリックスの組成は、好ましい分解速度を有するように、かつまた当該デバイスが血管、肺または他の表面に投与される場合に移動の効率をさらに増大させるために生体粘着性である材料から形成されるように、選択することができる。マトリックスの組成はまた、分解せず、むしろ拡散により長時間にわたって放出するように、選択することもできる。
非生分解性および生分解性の両方のポリマーマトリックスを、本発明の薬剤を対象に送達するために用いることができる。生分解性マトリックスが好ましい。かかるポリマーは、天然ポリマーであっても合成ポリマーであってもよい。合成ポリマーが好ましい。ポリマーは、放出が所望される期間(一般的には数時間〜1年の程度において、またはそれより長く)に基づいて選択される。代表的には、数時間から、3〜12か月の範囲の期間にわたる放出が最も望ましい。ポリマーは、随意にその水中での重量約90%までおよびそれより多くを吸収することができるハイドロゲルの形態であり、随意に多価イオンまたは他のポリマーにより架橋されている。
一般に、本発明の薬剤は、生体内分解性インプラントを用いて、拡散により、またはより好ましくはポリマーマトリックスの分解により、送達することができる。生分解性送達システムを形成するために用いることができる例示的な合成ポリマーとして、以下が挙げられる:ポリアミド類、ポリカーボネート類、ポリアルキレン類、ポリアルキレングリコール類、ポリアルキレンオキシド類、ポリアルキレンテレフタラート類、ポリビニルアルコール類、ポリビニルエーテル類、ポリビニルエステル類、ポリビニルハライド、ポリビニルピロリドン、ポリグリセリド類、ポリシロキサン類、ポリウレタン類およびこれらのコポリマー、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース類、セルロースエーテル類、セルロースエステル類、ニトロセルロース類、アクリル系またはメタクリル系エステル類のポリマー、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシ−プロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシルエチルセルロース、三酢酸セルロース、セルロース硫酸ナトリウム塩、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(エチルメタクリレート)、ポリ(ブチルメタクリレート)、ポリ(イソブチルメタクリレート)、ポリ(ヘキシルメタクリレート)、ポリ(イソデシルメタクリレート)、ポリ(ラウリルメタクリレート)、ポリ(フェニルメタクリレート)、ポリ(メチルアクリレート)、ポリ(イソプロピルアクリレート)、ポリ(イソブチルアクリレート)、ポリ(オクタデシルアクリレート)、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(エチレンテレフタラート)、ポリ(ビニルアルコール)、酢酸ポリビニル、塩化ポリビニル、ポリスチレンおよびポリビニルピロリドン。
非生分解性ポリマーの例として、エチレンビニルアセテート、ポリ(メタ)アクリル酸、ポリアミド類、これらのコポリマーおよび混合物が挙げられる。
生分解性ポリマーの例として、乳酸とグリコール酸とのポリマー、ポリ無水物、ポリ(オルト)エステル類、ポリウレタン類、ポリ(酪酸)、ポリ(吉草酸)およびポリ(ラクチド−コカプロラクトン)、などの合成ポリマー、ならびに、アルギナート、およびデキストランおよびセルロースを含む他の多糖類、コラーゲン、これらの化学誘導体(置換、化学基の添加、例えばアルキル、アルキレン、水酸化、酸化、および当業者により通例行われる他の修飾)、アルブミンおよび他の親水性タンパク質、ゼインおよび他のプロラミンならびに疎水性タンパク質などの天然ポリマー、これらのコポリマーおよび混合物が挙げられる。一般に、これらの材料は、invivoでの酵素による加水分解または水への暴露のいずれかにより、表面またはバルク浸食により、分解する。
生分解性ポリマーの例として、乳酸とグリコール酸とのポリマー、ポリ無水物、ポリ(オルト)エステル類、ポリウレタン類、ポリ(酪酸)、ポリ(吉草酸)およびポリ(ラクチド−コカプロラクトン)、などの合成ポリマー、ならびに、アルギナート、およびデキストランおよびセルロースを含む他の多糖類、コラーゲン、これらの化学誘導体(置換、化学基の添加、例えばアルキル、アルキレン、水酸化、酸化、および当業者により通例行われる他の修飾)、アルブミンおよび他の親水性タンパク質、ゼインおよび他のプロラミンならびに疎水性タンパク質などの天然ポリマー、これらのコポリマーおよび混合物が挙げられる。一般に、これらの材料は、invivoでの酵素による加水分解または水への暴露のいずれかにより、表面またはバルク浸食により、分解する。
特に重要な生体粘着性ポリマーとして、その教示が本明細書において組み込まれるH.S. Sawhney, CP. Pathak and J. A. Hubellin Macromolecules, 1993, 26, 581-587により記載される生体内分解性のハイドロゲル、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルテン(glutin)、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギン酸、キトサン、ポリ(メチルメタクリレート類)、ポリ(エチルメタクリレート類)、ポリ(ブチルメタクリレート)、ポリ(イソブチルメタクリレート)、ポリ(ヘキシルメタクリレート)、ポリ(イソデシルメタクリレート)、ポリ(ラウリルメタクリレート)、ポリ(フェニルメタクリレート)、ポリ(メチルアクリレート)、ポリ(イソプロピルアクリレート)、ポリ(イソブチルアクリレート)およびポリ(オクタデシルアクリレート)が挙げられる。
他の送達システムとして、時間放出(time-release)、遅延放出または持続放出送達システムを挙げることができる。かかるシステムは、ペプチドの繰り返しの投与を回避することができ、対象および医師の利便性を増大する。多数の型の放出送達システムが利用可能であり、当業者に公知である。それらは、ポリ(ラクチド−グリコリド)、コポリシュウ酸(copolyoxalate)、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸およびポリ無水物などのポリマーベースのシステムを含む。薬物を含む前述のポリマーのマイクロカプセルは、例えば、米国特許第5,075,109号において記載される。送達システムはまた、非ポリマーのシステム、すなわち、コレステロール、コレステロールエステルなどのステロール、およびモノ−、ジ−、およびトリグリセリドなどの脂肪酸または中性脂肪を含む脂質;ハイドロゲル放出システム;サイラスティックシステム;ペプチドベースのシステム;ロウコーティング;従来の結合剤および賦形剤を用いる圧縮錠剤;部分的に融合したインプラントなどを含む。具体例として、(a)米国特許第4,452,775号、同第4,675,189号および同第5,736,152号において記載されるものなどのマトリックス中の形態において血小板を減少させる薬剤が含有される、浸食性のシステム、ならびに(b)米国特許第3,854,480号、同第5,133,974号および同第5,407,686号において記載されるものなどのポリマーから活性成分が制御された速度で浸透する、拡散性のシステムが挙げられるがこれらに限定されない。さらに、ポンプに基づくハードウェア送達システムを用いることができ、これらのいくつかは、移植のために適応させられる。
長期持続放出インプラントの使用が、再発癌の発症の危険性がある対象の予防的処置のために特に好適である場合がある。長期放出とは、本明細書において用いられる場合、そのインプラントが、治療的レベルの活性成分を少なくとも30日間、および好ましくは60日間にわたり送達するように、構築され配置されることを意味する。長期持続放出インプラントは当業者に周知であり、上記の放出システムのいくつかを含む。
例
例1:
ハイスループットスクリーニングによる癌幹細胞の選択的阻害剤の同定
最近の研究により、固形腫瘍中の癌幹細胞(CSC)と名付けられる亜集団のみが、移植された場合に新しい腫瘍の形成を播種する能力を有することが示唆されており、これらのCSCは、癌による死亡の主な原因である転移の原因であることが提案されている。この概念は、多数の癌治療が、腫瘍細胞の大部分を殺傷しつつも、CSCを除去しないために最終的には失敗し得ることを示唆する。理想的には、CSCの生物学を研究するために、および薬物開発を行うためのリードとして用いるために、CSCを選択的に標的とする薬剤を同定することが望まれる。残念ながら、かかるスクリーニングは、腫瘍細胞集団中のCSCの希少性、および培養中でのそれらの相対的な不安定性のせいで、以前には可能ではなかった。ここで、本発明者らは、培養上皮細胞の間葉分化転換を誘導することにより、CSCの集団の安定な100倍の増大を達成することが可能であることを報告する。この観察に基づいて、本発明者らは、乳房CSCについて選択的毒性を有する薬剤を発見するための化学物質スクリーニングを設計して執り行った。この結果、いくつかのかかる化合物が同定された。invivoでの腫瘍播種能力の機能的アッセイ(すなわち、in vivo腫瘍播種アッセイ)において、1つの化合物(サリノマイシン)が、CSCを、対象の処置と比較して100倍、および一般的な乳癌薬(パクリタキセル)と比較して1000倍、減少させた。パクリタキセルは、CSCの増大を誘導した。この研究は、上皮CSCについての選択的毒性を示す薬剤の同定への実用的アプローチを実証する。
例1:
ハイスループットスクリーニングによる癌幹細胞の選択的阻害剤の同定
最近の研究により、固形腫瘍中の癌幹細胞(CSC)と名付けられる亜集団のみが、移植された場合に新しい腫瘍の形成を播種する能力を有することが示唆されており、これらのCSCは、癌による死亡の主な原因である転移の原因であることが提案されている。この概念は、多数の癌治療が、腫瘍細胞の大部分を殺傷しつつも、CSCを除去しないために最終的には失敗し得ることを示唆する。理想的には、CSCの生物学を研究するために、および薬物開発を行うためのリードとして用いるために、CSCを選択的に標的とする薬剤を同定することが望まれる。残念ながら、かかるスクリーニングは、腫瘍細胞集団中のCSCの希少性、および培養中でのそれらの相対的な不安定性のせいで、以前には可能ではなかった。ここで、本発明者らは、培養上皮細胞の間葉分化転換を誘導することにより、CSCの集団の安定な100倍の増大を達成することが可能であることを報告する。この観察に基づいて、本発明者らは、乳房CSCについて選択的毒性を有する薬剤を発見するための化学物質スクリーニングを設計して執り行った。この結果、いくつかのかかる化合物が同定された。invivoでの腫瘍播種能力の機能的アッセイ(すなわち、in vivo腫瘍播種アッセイ)において、1つの化合物(サリノマイシン)が、CSCを、対象の処置と比較して100倍、および一般的な乳癌薬(パクリタキセル)と比較して1000倍、減少させた。パクリタキセルは、CSCの増大を誘導した。この研究は、上皮CSCについての選択的毒性を示す薬剤の同定への実用的アプローチを実証する。
CSCは、それらが限界希釈で動物モデルにおいて腫瘍を播種する能力により、操作的に定義される。さらに、CSCはしばしば特定の重要な細胞特性を有する:(1)CSCは、一部の場合において、特異的細胞表面マーカーについて細胞をソーティングすることにより濃縮される(1〜5);例えば乳癌におけるCSCは、細胞のCD44+/CD24−亜分画において濃縮される。(2)CSCは、特殊化した懸濁培養中で球状のコロニーを形成することができる;これらのコロニーは、乳癌の場合、マンモスフィアと名付けられる。(3)CSCはしばしば、多数の化学療法剤に対する耐性の増強を示す(3〜7);この後者の知見は、CSC特異的治療を開発することの重要性を強調する。
CSCを選択的に殺傷する薬剤についてのスクリーニングは、安定な、高純度のCSCの亜集団を、in vitroで得て増殖させる能力に依存する。これは、細胞表面マーカーを用いてソーティングすることにより>90%の純度まで濃縮することができ(8、9)、かつ培養中で維持することができる造血幹細胞については可能であるが、これは固形腫瘍についてはまだ達成されていない。乳癌についての利用可能なマーカー(CD44+/CD24−)によるソーティングは、実質的な濃縮(100倍)を達成するが、CSCは、全体の集団のごく少数(〜10−3)にとどまる。さらに、CSCの濃縮は、おそらくそれらが分化して表現型的に多様な子孫細胞を生じさせるために、細胞培養の間に急速に失われる。
本発明者らは、したがって、乳癌中のCSCのものと類似する特性を有するin vitro系を開発することに関心を抱いた。CSCマーカーについてソーティングされた細胞の視覚的観察により、CSCの頻度は、分化状態と相関し、これにより調節される可能性があることが示唆された。したがって、本発明者らは、乳癌におけるCSCの頻度が分化状態により調節されるか否かの試験に着手した。公開された報告は、特定の遺伝子の発現を変化させることにより、分化した上皮細胞に特徴的な上皮タンパク質を失わせ、基底および間葉系の細胞系統において発現されるタンパク質を獲得させることができることを示している。したがって、本発明者らは、ショートヘアピンRNA干渉(shRNA)媒介性のE−カドヘリン遺伝子の阻害(shEcad)を通して、HMLER乳癌細胞を間葉分化転換(MT)を経験するように誘導した(図1A)。
本発明者らは、間葉分化転換が、CSCに関連するマーカーを保有する乳癌細胞の集団の実質的な増大を引き起こすことを見出した。特に、本発明者らは、CD44+/CD24−細胞のパーセンテージが、HMLERshEcadにおいて、対照細胞(HMLERshCntrl)よりも約10倍高いことを観察した(約90%対5%;図1F)。同様の増大が、Twistの発現によりMTに誘導された細胞において観察された(データは示さず)。
これらの知見は、MT乳癌細胞は、より高い割合のCSCを有する可能性があることを示唆した。本発明者らは、したがって、HMLERshEcad細胞が懸濁中で増殖させられた場合にマンモスフィアを形成する能力を試験した。HMLERshEcad細胞は、対照細胞と比較して約100倍のマンモスフィア形成の増大を示した(細胞100個あたり、15球、対、約0.15球;図1E)(10)。本発明者らはまた、HMLERshEcad細胞がinvivoでマウスにおいて腫瘍を播種する能力をアッセイした。腫瘍は、対照細胞よりも100倍少ない1000個のHMLERshEcad細胞により確実に発生させられた(図1D)。特に、CSCについての約100倍の濃縮は、CD44+/CD24−細胞の約15〜20倍の増大よりもいくらか高い。これらの結果は、MT乳癌細胞が対照乳癌細胞と比較して有意により多い数のCSCを有することを示す。
本発明者らはまた、MT乳癌細胞が、報告されるCSCの特性である薬物耐性の増大を示すか否かを試験した。実際、HMLERshEcad細胞は、一般的に用いられる化学療法薬であるパクリタキセルおよびドキソルビシンに対して、対照細胞よりも有意に耐性が高かった(図2A)。
増大した薬物耐性は、CSCの割合の増大を反映している可能性があるか、または、間葉分化転換の特徴的な状態の、より一般的な特性である可能性がある。本発明者らは、したがって、不死化しているが非腫瘍原性の乳房上皮細胞であり、発癌性のHrasV12導入遺伝子を欠失する点においてHMLER細胞とは異なる、HMLE細胞を研究した。これらの細胞は腫瘍を形成することができず、したがって定義によりCSCを欠失する。HMLERshEcad細胞と同様に、HMLEshEcad細胞は、HMLEshCntrl対照と比較してより多い数のCD44+/CD24−細胞を含むことが見出された。特に、HMLEshEcad細胞はまた、対照細胞と比較して、パクリタキセルおよびドキソルビシンに対する耐性がより高いことを示した(図2B)。HMLEshEcad細胞はまた、他の確立した化学療法薬、アクチノマイシンD、カンプトテシン、および広範なキナーゼの阻害剤であるスタウロスポリンに対しても耐性であった。薬物耐性の増大は、したがって、CSCサブセットの独自の特性というよりむしろ間葉分化転換の結果であると考えられる。
観察された薬物耐性をさらに特徴づけるために、本発明者らは、GFP標識HMLEshEcad細胞と未標識対照細胞との共培養物(1:20の比)を、パクリタキセルで処置した。10nMのパクリタキセル処置による4日間の処置は、DMSO処置された共培養物と比較して、HMLEshEcad細胞の割合の4倍の増大をもたらした(図2C)。これらの結果は、不均一な上皮細胞集団のパクリタキセル処置が、MT細胞の選択的な増殖(outgrowth)をもたらすことを示す。
間葉分化転換されたHMLEshEcad細胞が標準的な化学療法薬に対する耐性の増大を示すことを発見し、本発明者らは、それらがまたCSCをも標的とすることを期待して、これらの細胞を選択的に標的とする薬剤を同定するための概念を証明するスクリーニングを設計した。本発明者らは、HMLEshEcadおよび対照HMLEshCntrl細胞の両方に対する細胞傷害性について化合物をスクリーニングした。細胞を384ウェルのプレートに播種し、1日間増殖させ、化合物で処置し、3日後に発光アッセイを用いて細胞の生存率についてアッセイした。化合物を、各細胞株について2回スクリーニングした(図3A;例3を参照)。本発明者らは、既知の生体活性を有する多数のもの、天然抽出物、ヒストンデアセチラーゼのモジュレーターおよび幾つかの多様な市販のライブラリーを含む、約16,000の化合物の集合をスクリーニングした。
化合物の約10%は、HMLEshEcad細胞の生存能を阻害したが、これらの大部分(98%)はまた対照細胞をも阻害した。32の化合物(全ライブラリーの約0.2%)のみがHMLEshEcadに対する特異的毒性を示した(図3B)。化合物ライブラリー中に含まれる約100の化学療法薬の中で、ヒットの割合は有意により高くはなく、3種のみがいくらかの選択的毒性の証拠を示した。
本発明者らは、32種の化合物のうち8種をさらなる研究のために追求し、多様な用量にわたりそれらの効果を評価した。再試験において、これら8種の化合物のうち4種が、一貫した選択的毒性の証拠を示した(図4A)。3種の化合物(エトポシド、サリノマイシン、アバメクチン)は、中程度〜強力な選択性を示した(IC50が、HMLEshEcad細胞についてHMLEshCntrl細胞に対して約10倍低い)。1種の化合物は、より弱い選択性を示した(ニゲリシン;約7倍)。
MT不死化乳房上皮細胞(HMLEshEcad)を選択的に阻害する化合物はまた、Twistの発現から生じたMT細胞(HMLETwist)をも阻害する。4種の化合物全てについて、HMLETwist細胞についての用量応答曲線は、HMLEshEcad細胞について観察されたものとほぼ同一であった(図4B)。本発明者らはまた、HMLETwistと対照細胞との共培養物(10:1の比)のサリノマイシンまたはアバメクチンによる処置が、HMLETwist細胞の割合の用量依存的な減少をもたらすことを見出した(図3C)。これらの結果は、化合物の作用が間葉分化転換の誘導とは独立したものであることを示唆する。
前記の化合物は、非腫瘍原性でありしたがってCSCを欠失するMT乳房上皮細胞(HMLEshEcad)の選択的阻害剤として同定されたため、それらがMT腫瘍原性細胞(HMLERshEcad)に対して、特にCSCに対して、何らかの選択的効果を有するか否かは不明であった。
本発明者らは、前記化合物がMT腫瘍原性細胞について選択的毒性を示すことを見出した(図4D)。多様な濃度にわたり、サリノマイシンはHMLERshEcadについて選択的に毒性であり、一方アバメクチンはHMLERshEcadについて中程度のしかし選択的な毒性を示した。
本発明者らは、前記化合物がMT腫瘍原性細胞について選択的毒性を示すことを見出した(図4D)。多様な濃度にわたり、サリノマイシンはHMLERshEcadについて選択的に毒性であり、一方アバメクチンはHMLERshEcadについて中程度のしかし選択的な毒性を示した。
本発明者らは次いで、前記化合物が、乳癌細胞株においてCSCを阻害する一般的な能力を有するか否かという重要な問題に取り組んだ。3種の乳癌株(SUM159、T47D、MDA-MB-231)による予備実験は、サリノマイシン感受性がCSCマーカー発現と正に相関することを示した(図5)。本発明者らは次いで、サリノマイシン、対照のビヒクルDMSOおよびパクリタキセルのHMLER細胞に対する効果を比較した。サリノマイシン処置は、CSCが濃縮された画分であるCD44+/CD24−細胞の割合を、ビヒクル処置された対象と比較して20倍減少させた。対照的に、パクリタキセル処置は、CSC画分を18倍増大させた。CD44+/CD24−画分は、したがってサリノマイシンによる処置の後で、パクリタキセルによるものよりも360倍低かった(図6A)。バルク集団の増殖は、サリノマイシンによる処置の後で、ビヒクルまたはパクリタキセル処置のいずれかと比較して、阻害されていなかった(図6B)。類似の結果が、SUM159乳癌株により観察された(図5)。
本発明者らは、乳癌細胞がサリノマイシンによる処置の後でマンモスフィアを形成する能力を試験した。サリノマイシン処置は、対照と比較して約10倍のマンモスフィアの数の減少をもたらした(図6A)。対照的に、パクリタキセルまたはビヒクル処置のいずれも、マンモスフィアの数に影響を及ぼさず、パクリタキセルは実際にマンモスフィアのサイズの有意な増大を引き起こした。
最後に、本発明者らはまた、薬物処置の後でのin vivoでの腫瘍播種能力をアッセイすることにより、CSCの機能的な存在を直接的に評価した。細胞をinvitroで5日間処置し、次いでNOD/SCIDマウスに皮下で注射した。連続希釈実験は、サリノマイシン処置が、ビヒクル処置と比較して約100倍の腫瘍播種能力の低下をもたらしたのに対して、パクリタキセル処置は、対照と比較して約10倍の増大をもたらしたことを示した(データは示さず)。機能的なCSCの割合は、したがって、サリノマイシン処置の後で、パクリタキセル処置と比較して1000倍減少した。したがって、CSCを操作的に定義するためにここで用いられた全てのアッセイが、サリノマイシンが乳癌細胞集団中のCSCの生存能を首尾よく標的とすることを示す。対照的に、一般的な乳癌化学療法薬であるパクリタキセルによる処置は、乳癌細胞集団中のCSCの数の増加をもたらした。
これらの結果は、固形腫瘍の処置のために意義を有する。悪性新生物内における癌細胞の観察された不均一性は、単一の腫瘍の癌細胞は多様な状態において存在し、これらの各々が任意の所与の治療に対して異なる感受性を示し得ることを示唆する。至適に有効であるためには、組み合わせ治療は、理想的には、腫瘍と関連するサブタイプの各々、特にCSCを標的とする薬剤を組み合わせるべきである。本発明者らは、上皮CSCについて特異的毒性を有する薬剤についてスクリーニングすることを可能にするアプローチを記載する。解決されるべき重要な問題は、invivoで癌幹細胞を標的とすることが、患者にとっての治療上の利益となるか否かである。
細胞株:
HMLEは、SV40 large TおよびhTERTにより不死化されたヒト乳房上皮細胞株であり、HMLERは、SV40 large T、hTERTおよびH-rasV12により不死化および形質転換されたヒト乳房上皮細胞株である。例えば、Elenbaas,et. al, Human breast cancer cells generated by oncogenic transformation ofprimary mammary epithelial cells, Genes and Development, Vol. 15, No. 1, pp.50-65, (2001);およびYang, J, Mani, SA, Donaher, JL, Ramaswamy, S, Itzykson, RA,Come, C, Savagner, P, Gitelman, I, Richardson, A & Weinberg, RA. Cell 117,927-939 (2004)を参照。
HMLEは、SV40 large TおよびhTERTにより不死化されたヒト乳房上皮細胞株であり、HMLERは、SV40 large T、hTERTおよびH-rasV12により不死化および形質転換されたヒト乳房上皮細胞株である。例えば、Elenbaas,et. al, Human breast cancer cells generated by oncogenic transformation ofprimary mammary epithelial cells, Genes and Development, Vol. 15, No. 1, pp.50-65, (2001);およびYang, J, Mani, SA, Donaher, JL, Ramaswamy, S, Itzykson, RA,Come, C, Savagner, P, Gitelman, I, Richardson, A & Weinberg, RA. Cell 117,927-939 (2004)を参照。
例2:
一般的な目的:
最近の知見により、腫瘍の形成および増殖は、腫瘍中の癌細胞の少数の亜集団により駆動されることが示されている(Al-Hajj M, Wicha MS,Benito-Hernandez A, Morrison SJ, Clarke MF., Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100(7): 3983-8)(Li C, Heidt DG, Dalerba P, et al, Cancer Res 2007; 67(3):1030-7)(O'Brien CA, Pollett A, Gallinger S, Dick JE., Nature 2007; 445(7123):106-10)(Ricci-Vitiani L, Lombardi DG, Pilozzi E, et al, Nature 2007; 445(7123):111-5) (Singh SK, Hawkins C, Clarke ID, et al, Nature 2004; 432(7015): 396-401)。癌幹細胞(CSC)は、腫瘍塊中の、続発性腫瘍を播種して発生させる能力を有する細胞として、機能的に定義される。この機能的分類において暗示されるのは、癌幹細胞が、腫瘍中の、癌による死亡の主要な原因である転移性汎発の原因である細胞であるという概念である。この概念は、潜在的な癌治療の開発および前臨床的評価のための重要な意味を有する。本発明は、癌幹細胞を標的とする新規の治療剤を発見することを可能にする新規の方法を記載する。癌幹細胞を標的とする治療の発見は、本明細書において記載される本発明の方法の前では、ハイスループットスクリーニングのセッティングにおいては不可能であった。本発明者らは、記載される方法を実施へと還元することを通して癌幹細胞を特異的に標的とする新規化合物を発見することにより、本発明者らの発明についての原理証明を確立する。したがって、本発明は、ハイスループットスクリーニング法を用いて癌幹細胞を標的とする治療の同定を、初めて可能にするものである。
一般的な目的:
最近の知見により、腫瘍の形成および増殖は、腫瘍中の癌細胞の少数の亜集団により駆動されることが示されている(Al-Hajj M, Wicha MS,Benito-Hernandez A, Morrison SJ, Clarke MF., Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100(7): 3983-8)(Li C, Heidt DG, Dalerba P, et al, Cancer Res 2007; 67(3):1030-7)(O'Brien CA, Pollett A, Gallinger S, Dick JE., Nature 2007; 445(7123):106-10)(Ricci-Vitiani L, Lombardi DG, Pilozzi E, et al, Nature 2007; 445(7123):111-5) (Singh SK, Hawkins C, Clarke ID, et al, Nature 2004; 432(7015): 396-401)。癌幹細胞(CSC)は、腫瘍塊中の、続発性腫瘍を播種して発生させる能力を有する細胞として、機能的に定義される。この機能的分類において暗示されるのは、癌幹細胞が、腫瘍中の、癌による死亡の主要な原因である転移性汎発の原因である細胞であるという概念である。この概念は、潜在的な癌治療の開発および前臨床的評価のための重要な意味を有する。本発明は、癌幹細胞を標的とする新規の治療剤を発見することを可能にする新規の方法を記載する。癌幹細胞を標的とする治療の発見は、本明細書において記載される本発明の方法の前では、ハイスループットスクリーニングのセッティングにおいては不可能であった。本発明者らは、記載される方法を実施へと還元することを通して癌幹細胞を特異的に標的とする新規化合物を発見することにより、本発明者らの発明についての原理証明を確立する。したがって、本発明は、ハイスループットスクリーニング法を用いて癌幹細胞を標的とする治療の同定を、初めて可能にするものである。
技術的説明
正常細胞および腫瘍細胞は、in vitroおよびin vivoで、多様な分化の状態において存在する。これらの分化状態は、細胞が属する組織微小環境から生じる組織の複雑なシグナルの統合を通して調節される。癌細胞は、任意の多数の遺伝子撹乱を通して、例えば特定の因子(Twist、Snail、TGF-ベータもしくはMMP類など)の過剰発現を介して、またはE−カドヘリンなどの接着性接合部タンパク質の阻害により、上皮間葉移行(EMT)を経験するように誘導され得る。EMTへと誘導された細胞は、用いられた誘導方法に関係なく、類似する表現型の形質およびタンパク質マーカーを発現し、このことは、EMTが主要な分化プログラムであることを示している。本発明者らは、EMTへと誘導された細胞が、癌幹細胞に関連する細胞表面マーカーの発現、懸濁培養中での増殖、および少ない細胞数でのinvivoでの腫瘍形成を含む、癌幹細胞を機能的に定義する特性のうちの多数を共有することを観察した。さらに、CSCについての場合であるが(Dean M, FojoT, Bates S., Nat Rev Cancer 2005; 5(4): 275-84)(Szotek PP, Pieretti-VanmarckeR, Masiakos PT, et al, Proc Natl Acad Sci U S A 2006; 103(30): 11154-9)、本発明者らは、EMTへと誘導されなかった兄弟細胞株と比較して、EMTへと誘導された細胞は、標準的な化学療法薬を含む広範な群の化合物に対して有意に耐性が高いことを観察した。重要なことに、細胞死誘導性の薬剤に対する応答における細胞死に対する耐性は、EMTにおける細胞が癌性であるか非癌性であるかに関わりなく、顕著であった。本発明の中心的成分として、本発明者らは、上皮間葉移行を経験した細胞により示される分化の状態を、癌幹細胞を特異的に標的とする治療を同定するために利用し得ると結論付けた。本発明の方法において、共通のソースに由来する兄弟細胞株を、EMTを経験した細胞に対して選択的に毒性である化合物を同定するために用いた。以下に、本発明者らは、本発明の実施への一還元の詳細な技術的局面を記載する。この実施への還元は、サリノマイシンおよびアバメクチンを含む、CSC集団を選択的に標的とする2種の化合物の同定をもたらした。
正常細胞および腫瘍細胞は、in vitroおよびin vivoで、多様な分化の状態において存在する。これらの分化状態は、細胞が属する組織微小環境から生じる組織の複雑なシグナルの統合を通して調節される。癌細胞は、任意の多数の遺伝子撹乱を通して、例えば特定の因子(Twist、Snail、TGF-ベータもしくはMMP類など)の過剰発現を介して、またはE−カドヘリンなどの接着性接合部タンパク質の阻害により、上皮間葉移行(EMT)を経験するように誘導され得る。EMTへと誘導された細胞は、用いられた誘導方法に関係なく、類似する表現型の形質およびタンパク質マーカーを発現し、このことは、EMTが主要な分化プログラムであることを示している。本発明者らは、EMTへと誘導された細胞が、癌幹細胞に関連する細胞表面マーカーの発現、懸濁培養中での増殖、および少ない細胞数でのinvivoでの腫瘍形成を含む、癌幹細胞を機能的に定義する特性のうちの多数を共有することを観察した。さらに、CSCについての場合であるが(Dean M, FojoT, Bates S., Nat Rev Cancer 2005; 5(4): 275-84)(Szotek PP, Pieretti-VanmarckeR, Masiakos PT, et al, Proc Natl Acad Sci U S A 2006; 103(30): 11154-9)、本発明者らは、EMTへと誘導されなかった兄弟細胞株と比較して、EMTへと誘導された細胞は、標準的な化学療法薬を含む広範な群の化合物に対して有意に耐性が高いことを観察した。重要なことに、細胞死誘導性の薬剤に対する応答における細胞死に対する耐性は、EMTにおける細胞が癌性であるか非癌性であるかに関わりなく、顕著であった。本発明の中心的成分として、本発明者らは、上皮間葉移行を経験した細胞により示される分化の状態を、癌幹細胞を特異的に標的とする治療を同定するために利用し得ると結論付けた。本発明の方法において、共通のソースに由来する兄弟細胞株を、EMTを経験した細胞に対して選択的に毒性である化合物を同定するために用いた。以下に、本発明者らは、本発明の実施への一還元の詳細な技術的局面を記載する。この実施への還元は、サリノマイシンおよびアバメクチンを含む、CSC集団を選択的に標的とする2種の化合物の同定をもたらした。
潜在的な抗癌化合物の効力は、ここで、免疫無防備状態のマウスにおいて腫瘍異種移植片アッセイを用いて評価される。癌幹細胞はしばしば少数の亜集団を構成するので、癌幹細胞に対して特異的である処置が、これらの短期アッセイにおいて腫瘍サイズ測定に対して知覚可能な影響を与えるとは予測されるべきではない。対照的に、この型のアッセイが、癌幹細胞を標的とする治療の候補を同定することに失敗することは、非常にあり得ることである。したがって、僅かな例外を除いて、現行の治療は、腫瘍中の急速に増殖する癌細胞を殺傷するように開発され、CSCを標的としない。重要なことに、最近の報告は、癌幹細胞が、化学療法、標的化された酵素阻害(targetedenzyme inhibition)および放射線療法を含む、現在使用されている広範囲な癌の処置に対してより耐性が高いことを示している(Dean M, FojoT, Bates S., Nat Rev Cancer 2005; 5(4): 275-84)(Szotek PP, Pieretti-VanmarckeR, Masiakos PT, et al, Proc Natl Acad Sci U S A 2006; 103(30): 11154-9)(Bao S,Wu Q, McLendon RE, et al, Nature 2006; 444(7120): 756-60)(Phillips TM, McBrideWH, Pajonk F., J Natl Cancer Inst 2006; 98(24): 1777-85)(Diehn M, Clarke MF., JNatl Cancer Inst 2006; 98(24): 1755-7)。しかし、この段階において、本発明以前は、癌幹細胞を標的とする処置を同定することがはたして可能であるか否か、または、癌幹細胞は、細胞死に対する内因的な耐性の結果として全ての形態の治療的介入に対して必然的に耐性であるのではないか、ということが不明である。
これらの考察は、癌幹細胞に対する候補処置の特異的効果についてアッセイするための戦略を開発することの重要性および必要性を示す。癌幹細胞集団の濃縮を可能にする細胞表面マーカーが、多様な癌の型について最近報告されている(Al-HajjM, Wicha MS, Benito-Hernandez A, Morrison SJ, Clarke MF., Proc Natl Acad Sci US A 2003; 100(7): 3983-8)((Li C, Heidt DG, Dalerba P, et al, Cancer Res 2007;67(3): 1030-7)(O'Brien CA, Pollett A, Gallinger S, Dick JE., Nature 2007;445(7123): 106-10)(Ricci-Vitiani L, Lombardi DG, Pilozzi E, et al, Nature 2007;445(7123): 111-5)(Singh SK, Hawkins C, Clarke ID, et al, Nature 2004;432(7015): 396-401)。これらのマーカーは、研究者が、in vivoで培養癌細胞または腫瘍のいずれかから、癌幹細胞が濃縮された画分を予め単離することを可能にする。原則として、かかるマーカーを用いる細胞集団の分離は、癌幹細胞に対して特異的に毒性の化合物の同定のために有用であると判明すると考えるであろう。実際には、この目的の達成は、単離された細胞の画分において、しばしば培養中で倍増するいくつかの集団内で、癌幹細胞の濃縮が急速に失われることにより、基本的に妨害されてきた。これらの要因は、腫瘍中のCSCを標的とする新規の治療の同定および開発における主要な障害として働いてきた。実際、これらの困難は、さもなくば原則的にはCSCに対する新規の抗腫瘍化合物の発見を促進し得るスクリーニング技術の適用を不可能にする。本発明において、本発明者らは、癌幹細胞を標的とする化合物の同定のためのハイスループットスクリーニング技術の適用に固有の困難を解決する方法を記載する。
スクリーニングの選択肢
・EMTを誘導する方法
・スクリーニングするライブラリーの型(例えば化学物質ライブラリー、RNAiライブラリーなど)
・細胞の型(例えば試験細胞)は、任意の型の上皮組織に由来してよい。SV40ERおよびhTERTを用いて不死化した細胞に加えて、本発明は、ヒトの初代細胞、任意の好適な不死化の方法を用いて不死化した細胞、または癌性細胞に同等に適用可能である。各々の場合において、EMTおよび非EMT状態にある細胞を、EMT状態にある細胞について選択的毒性を示す実体(例えば化合物)を同定するためにスクリーニングすることができる。
・EMTを誘導する方法
・スクリーニングするライブラリーの型(例えば化学物質ライブラリー、RNAiライブラリーなど)
・細胞の型(例えば試験細胞)は、任意の型の上皮組織に由来してよい。SV40ERおよびhTERTを用いて不死化した細胞に加えて、本発明は、ヒトの初代細胞、任意の好適な不死化の方法を用いて不死化した細胞、または癌性細胞に同等に適用可能である。各々の場合において、EMTおよび非EMT状態にある細胞を、EMT状態にある細胞について選択的毒性を示す実体(例えば化合物)を同定するためにスクリーニングすることができる。
乳腺上皮細胞におけるE−カドヘリンの除去はEMTを誘導する
上皮細胞は、in vivoで異なる分化の状態を表わす。本発明者らは、これらのエピジェネティックに特殊化される状態が、新生物性形質転換の後の腫瘍の表現型に影響を及ぼすか否かを決定することを望んだ。この問題に対するモデルとして、本発明者らは、ヒト乳腺上皮細胞に焦点を当てた。なぜならば、これらの分化の状態に対応する既知の細胞マーカーが存在するからである。本発明者らの目的とする問題に取り組むために、細胞の分化状態を安定に変更することができる系を利用することが必要であった。
上皮細胞は、in vivoで異なる分化の状態を表わす。本発明者らは、これらのエピジェネティックに特殊化される状態が、新生物性形質転換の後の腫瘍の表現型に影響を及ぼすか否かを決定することを望んだ。この問題に対するモデルとして、本発明者らは、ヒト乳腺上皮細胞に焦点を当てた。なぜならば、これらの分化の状態に対応する既知の細胞マーカーが存在するからである。本発明者らの目的とする問題に取り組むために、細胞の分化状態を安定に変更することができる系を利用することが必要であった。
広範な先の研究により、培養上皮細胞において、分化のマーカーの発現の喪失を伴う形態学的な変化を安定に誘導することが可能であることが示されている(ThieryJP., Nat Rev Cancer 2002; 2(6): 442-54)。本発明者らは先に、不死化したHMECにおけるE−カドヘリンの阻害が安定なEMTをもたらす、一つのかかるモデルを記載した(Onderet al 2008 Cancer Research、近刊;図1A)。対照細胞(HMLEsiGFP)と比較して、これらの細胞(HMLEsiEcad)は、上皮細胞の分化に関連するサイトケラチンタンパク質を発現することを停止し、N−カドヘリンおよびビメンチンを含む間葉系の系統と関連するタンパク質の発現を獲得する(図1A)。
これらの結果は、E−カドヘリンの除去は、不死化した上皮細胞においてEMTを誘導するために十分であることを示した。特に、本質的にアイソジェニックな上皮細胞の新生物性転換は、形質転換の時点における細胞の分化の状態にのみ依存して、著しく異なる腫瘍性表現型をもたらした。EMTを経験した上皮細胞の新生物性転換は、invivoで急速に転移する高度に悪性の癌細胞(HMLERsiEcad)を産生し、EMTを経験していない本質的にアイソジェニックな上皮細胞の同様の形質転換は、転移することができない癌細胞(HMLERsiGFP)を生じる(図1B)。さらに、HMLERsiEcad腫瘍は、それらの分化のカウンターパートであるHMLERsiGFPと比較して、短縮された潜伏期を示す(図1C)。したがって、本発明者らは、この区別が、2種の兄弟細胞株における癌幹細胞の数の差異に起因し得るものであったか否かを試験した。
限界希釈アッセイにより、HMLERsiEcad株がin vivoで僅か1000細胞で腫瘍を播種したことが示され、これは、HMLERsiGFP株により腫瘍を形成するために必要とされる最小の細胞数よりも2桁少なかった(図1D)。さらに、本発明者らは、HMLERsiEcad株が、HMLERsiGFP株と比較してより多くの数のマンモスフィア形成細胞を含んだことを観察した(図1E)(DontuG, Abdallah WM, Foley JM, et al, Genes Dev 2003;17(10):1253-70)。癌幹細胞(CSC)を定義するこれらの機能的アッセイは、HMLERsiEcad株が、HMLERsiGFP細胞と比較して有意により多い数のCSCを内抱することを示した。この概念は、乳房癌幹細胞集団を豊富化することが報告されているマーカーに対する抗体によるFACSを用いて、さらに支持された(図1F)(Al-HajjM, Wicha MS, Benito-Hemandez A, Morrison SJ, Clarke MF., Proc Natl Acad Sci U SA 2003; 100(7): 3983-8)。したがって、HMLERsiEcad株は、分化したHMLERsiGFP株と比較して約10倍のCD44+/CD24−細胞のパーセンテージの増大を示した(図1F)。まとめると、これらの知見は、EMTを経験した上皮細胞が、EMTを経験していない上皮細胞から生じる形質転換集団よりも有意により多い数の癌幹細胞を有する形質転換細胞集団を生じさせることを示した。
EMTを経験した上皮細胞は、多様な化学療法薬に対して耐性である
先の研究により、癌幹細胞が広範な細胞傷害性薬剤に対して耐性であることが示されている(Dean M, Fojo T, Bates S., Nat RevCancer 2005; 5(4): 275-84)(Szotek PP, Pieretti-Vanmarcke R, Masiakos PT, et al,Proc Natl Acad Sci U S A 2006; 103(30): 11154-9)(Bao S, Wu Q, McLendon RE, etal, Nature 2006; 444(7120): 756-60)(Phillips TM, McBride WH, Pajonk F., J NatlCancer Inst 2006; 98(24): 1777-85)(Liu G, Yuan X, Zeng Z, et al, MoI Cancer2006; 5: 67)。HMLERsiEcad細胞においては、腫瘍を播種することができる細胞の頻度が100倍に増大されているので、本発明者らは、2種の一般的に用いられる化学療法薬に対するこれらの応答を、HMLERsiGFPと比較して試験した。本発明者らは、培養HMLERsiGFPおよびHMLERsiEcad細胞を、3日間、ドキソルビシンまたはパクリタキセルのいずれかで、多様な濃度において処置した。用量応答曲線の試験により、両方の薬物の場合において、HMLERsiEcad細胞についてのIC50が、HMLERsiGFP細胞についてのIC50よりも有意により高かったことが示された(図2A)。これらのデータは、癌幹細胞が一般的な化学療法薬に対して耐性であるという先に公開された報告と一致した。
先の研究により、癌幹細胞が広範な細胞傷害性薬剤に対して耐性であることが示されている(Dean M, Fojo T, Bates S., Nat RevCancer 2005; 5(4): 275-84)(Szotek PP, Pieretti-Vanmarcke R, Masiakos PT, et al,Proc Natl Acad Sci U S A 2006; 103(30): 11154-9)(Bao S, Wu Q, McLendon RE, etal, Nature 2006; 444(7120): 756-60)(Phillips TM, McBride WH, Pajonk F., J NatlCancer Inst 2006; 98(24): 1777-85)(Liu G, Yuan X, Zeng Z, et al, MoI Cancer2006; 5: 67)。HMLERsiEcad細胞においては、腫瘍を播種することができる細胞の頻度が100倍に増大されているので、本発明者らは、2種の一般的に用いられる化学療法薬に対するこれらの応答を、HMLERsiGFPと比較して試験した。本発明者らは、培養HMLERsiGFPおよびHMLERsiEcad細胞を、3日間、ドキソルビシンまたはパクリタキセルのいずれかで、多様な濃度において処置した。用量応答曲線の試験により、両方の薬物の場合において、HMLERsiEcad細胞についてのIC50が、HMLERsiGFP細胞についてのIC50よりも有意により高かったことが示された(図2A)。これらのデータは、癌幹細胞が一般的な化学療法薬に対して耐性であるという先に公開された報告と一致した。
原則として、HMLERsiEcad株の、HMLERsiGFP細胞株と比較してより高い耐性は、前者の細胞株において存在する、より多い数の癌幹細胞の結果である可能性がある。しかし、本発明者らは、観察された異なる薬物感受性は、むしろ、癌幹細胞が由来する不死化細胞のそれぞれの分化状態の結果であると仮定した。この仮説を直接的に試験するために、本発明者らは、HMLEsiGFPおよびHMLEsiEcad細胞を、4日間、各々3種の異なる濃度での一連の化合物で処置した。これらの化合物に含まれたのは、確立された化学療法薬であるドキソルビシン、パクリタキセル、アクチノマイシンD、カンプトテシン、ならびに広範なキナーゼの阻害剤であるスタウロスポリンであった。HMLEsiEcad細胞は、試験された薬物の各々に対して、HMLEsiGFP細胞と比較してより高い耐性を示した(図2B)。耐性の程度は、必然的に、用いられた特定の薬物に依存するが(cp.アクチノマイシンD、対、カンプトテシン;図2B)、全ての試験された化合物について、より高い耐性が観察された。この観察から、EMTを経験したHMLEsiEcad細胞は、EMTを経験していないそれらのHMLEsiGFPカウンターパートと比較して、用いられた細胞死誘導性薬剤に関らず、細胞死に対して本質的に耐性であることが示された。さらに、これらの知見から、HMLERsiEcad株により示された、HMLERsiGFPと比較した、細胞死に対する異なる感受性は、多岐の分化状態の直接的な結果であったことが示された。
上記の結果は、細胞のEMTおよび非EMT集団が、多様な化合物に対して異なる多感受性を示したことを示した。このことは、その細胞株が新生物性形質転換を経験したか否かに関わりなく観察された。EMTを経験していない上皮細胞を有する上皮細胞の混合物に対する従来の化学療法薬の効果を決定するために、本発明者らは、GFP標識HMLEsiEcadと未標識HMLEsiGFP細胞とを1:20の比で混合し、生じた共培養物をパクリタキセルで処置した。この非化学量論的な混合物は、異なる薬物感受性が、EMTを経験した上皮細胞が少数派である条件下においてもまた顕れるか否かを評価するための、内部標準を有する方法を提供した。3日間のパクリタキセル(10nM)処置の後で、FACS分析により、DMSO処置された共培養物と比較して4倍の、EMTを経験したHMLEsiEcad細胞の増加が明らかとなった(図2C)。EMTを経験したHMLEsiEcad細胞のより控えめな増加もまた、より低い用量のパクリタキセル(2.5nM)により観察された。まとめると、これらの結果は、不均一な上皮細胞集団のパクリタキセル処置は、EMTを経験した細胞の選択的増殖をもたらし得ることを示した。
化合物スクリーニング
まとめると、上記の観察は、上皮細胞のEMTが、腫瘍播種能力および転移能力の増大と関連し、またアポトーシスに対する耐性の増大を伴うことを示した。本発明者らは、したがって、EMTを経験した上皮細胞の生存能を阻害するがEMTを経験していない上皮細胞の生存は阻害しない化合物は、腫瘍を播種することおよび転移することができる癌細胞の亜集団を優先的に標的とするであろうことを結論付けた。本発明者らは、HMLEsiGFPおよびHMLEsiEcad細胞株を、EMTを経験した上皮細胞に対する総合的な致死性を示す化合物を明らかにすることを目的として利用することができると仮定した。
まとめると、上記の観察は、上皮細胞のEMTが、腫瘍播種能力および転移能力の増大と関連し、またアポトーシスに対する耐性の増大を伴うことを示した。本発明者らは、したがって、EMTを経験した上皮細胞の生存能を阻害するがEMTを経験していない上皮細胞の生存は阻害しない化合物は、腫瘍を播種することおよび転移することができる癌細胞の亜集団を優先的に標的とするであろうことを結論付けた。本発明者らは、HMLEsiGFPおよびHMLEsiEcad細胞株を、EMTを経験した上皮細胞に対する総合的な致死性を示す化合物を明らかにすることを目的として利用することができると仮定した。
本発明者らは、384ウェルプレートによるATPに基づく発光生存率アッセイをハイスループットスクリーニングにおいて用いるための条件を開発した(方法については例3を参照)。本発明者らは、全16,000の化合物を本発明者らのスクリーニングの一部としてスクリーニングした。これらの化合物は、既知の生体活性を有する多数のもの、天然抽出物、HDACに偏向した集合、および幾つかの市販のライブラリーを含んだ。厳密なプレートに基づく正規化を可能にするために、各々の化合物のプレートは、DMSOキャリアのみを有する約10%の対照ウェルを保有した。各々の化合物のプレートを、HMLEsiEcadおよびHMLEsiGFP細胞株の各々について、2つの複製へとピンで移した(pin-transfer)。播種の1日後に薬物処置を開始し、薬物処置の3日後に最終的なアッセイを行った(図3A−模式図)。本発明者らは、HMLEsiGFPおよびHMLEsiEcad細胞株の各々について2回ずつスクリーニングを行った。
プレートにより正規化されるDMSO対照ウェルからの測定を用いて、本発明者らは、各々の細胞株についての化合物の不在下における発光強度の分布を構築した(図3A)。対照および試験ウェルの両方についての各測定は、1つの細胞株について2回の平均からなる。これらのヌル分布と相対的に、本発明者らは、各化合物の効果についてのZスコアを、HMLEsiGFPおよびHMLEsiECad細胞株の各々について1つずつ割り当てた。算出されたZスコアは、薬物のプレート、列または行の番号にわたる位置によるバイアスを示さず、このことは、正規化されたデータの分析において体系的なバイアスは存在しなかったことを示唆している(図3B)。
この方法を用いた阻害性化合物の同定により、かかる化合物の大部分は、HMLEsiGFPおよびHMLEsiEcad細胞の両方の生存能を阻害したことを示した。本発明者らは、誘導されたEMTに関連して致死性を示す化合物に関心を有したので、HMLEsiEcad細胞の生存能を阻害するが、HMLEsiGFPの生存能を阻害することの有意性の閾値を超えない化合物を同定した。siEcad細胞に対して毒性の化合物の全数のうち、約2%がsiEcad株に対して特異的毒性を示した。これらの化合物を表1において列記する。
癌の化学療法のために用いられる多様な確立された薬物が、スクリーニングされた化合物プレート中に含まれた。これらの化学療法剤のうち1%未満が、本発明者らのアッセイにおいて正のスコアを有した。このことは、急速に増殖する細胞を標的とする化合物が本発明者らのアッセイにおいて選択的に濃縮されなかったことを示唆する。実際に、HMLEsiGFP細胞は、HLMEsiEcadよりもわずかにより高い増殖の速度を有する(データは示さず)。したがって、本発明者らのスクリーニングにおいて正にスコアを有した希少な化学療法薬(例えばエトポシド、メトトレキサート)は、増殖とは異なる細胞プロセスを標的とする可能性がある。この後者の点に関し、エトポシドまたはメトトレキサートのいずれも、インターカレーションまたは付加物(adduct)形成によりDNAの損傷を直接的に誘導しないことは、重要である。したがって、確立された化学療法薬のサブセットにおいて、スクリーニングされた全化合物と比較して、正のヒットの濃縮は存在しなかった。
本発明者らは、HMLEsiEcad細胞について選択的毒性であるものとして同定された8種の化合物:サリノマイシン、エトポシド、アクリジン、セチルピリジニウム塩化物、レゾルシノール、クロトリマゾール、アバメクチンおよびニゲリシンを、さらなる研究のために追跡することを決定した。これらの化合物の各々について、本発明者らは、EMTへ誘導されたかまたは誘導されないいずれかの兄弟細胞株について、一連の用量にわたって細胞の生存率に対する効果を評価した。前述の化合物のうち3種は、HMLEsiEcad細胞の生存率減少について、HMLEsiGFP細胞と比較して、強力な特異性を示した(エトポシド、サリノマイシン、アバメクチン;図4A)。同定された化合物のうちの1種であるニゲリシンは、HMLEsiEcad細胞に対して、HMLEsiGFP細胞と比較して、中程度の選択的毒性を示した。残りの4種の化合物は、追跡調査において生存率に対する特異的効果を示さなかった。
これらの化合物のHMLEsiEcad細胞についての特異性が、用いられた特定の遺伝子撹乱よりもむしろその株のEMT状態の結果であったか否かを決定するために、本発明者らはまた、Twistの過剰発現に起因してEMTへと誘導された細胞(HMLE-Twist)に対するこれらの化合物の効果を試験した。特に、HMLE-Twist細胞についての用量応答曲線は、試験された化合物の各々にわたり、HMLEsiEcad細胞について観察されたものとほぼ同一であった(図4B)。この観察は、このアッセイにおいて特異的活性を示す化合物が、特定の誘導剤自体よりも、むしろ、異なる分化の状態を標的としていたことを、強く示唆した。
EMTを経験した上皮細胞とEMTを経験していない上皮細胞との不均一な集団に対するサリノマイシンおよびアバメクチン処置の効果を試験するために、本発明者らは、GFP標識HMLE細胞と、未標識HMLE-Twist細胞とを混合し、生じた共培養物を化合物で処置した。この実験の陽性対照として、本発明者らは、共培養物を、ブラストサイジン耐性遺伝子を内抱する分化したHMLE-GFP細胞を選択するブラストサイジンで処置した。本発明者らは、サリノマイシン、アバメクチンまたはブラストサイジンによる処置が、DMSO処置された対象と比較して、GFP陽性画分の増大をもたらしたことを観察し、このことは、EMTを経験していない上皮細胞が選択的に処置を生き延びたことを示す(図4C)。このことは、パクリタキセル処置が、経験した上皮細胞の選択をもたらしたことを示す本発明者らの初期の知見と対照的である(図2C)。したがって、本発明者らのスクリーニングを通して同定された化合物は、一般的に用いられる化学療法薬とは対照的に、EMTを経験した上皮細胞の選択的殺傷をもたらした。本発明者らの先の観察(図2A、B)に従って、非腫瘍原性細胞株を用いて選択的毒性についてスクリーニングすることにより同定されたこれらの化合物のサブセットはまた、EMTを経験した形質転換細胞株について選択的毒性を示した(図4D)。
サリノマイシンはCSC豊富な癌細胞集団を特異的に標的とする
癌幹細胞は、広範な処置および化学療法薬に対して耐性である。記載されたスクリーニングのアプローチを用いて同定された化合物は、EMTを経験した上皮細胞を優先的に標的とするので、本発明者らは、かかる化合物がまた癌幹細胞を標的とするために役立ち得るか否かを決定することを望んだ。この目的のために、本発明者らは、FACSを用いて、いくつかの乳癌株を、癌幹細胞を濃縮することが報告されているマーカー(CD44hi/CD24lo)の発現について分析した。MDA-MB-231およびSUM159細胞は、90%より多いCD44hi/CD24lo細胞を含んだ。対照的に、T47D細胞株は、<1%のCD44hi/CD24lo細胞を示した(図5A)。本発明者らは、サリノマイシン処置の後で、CSC豊富な細胞株であるSUM159およびMDA-MB-231が、広範な用量にわたり、CSCが少ないT47D細胞と比較して、感受性がより高かったことを観察した。同様の結果が、より不明確ではあるが、アバメクチン処置によっても観察された(図5B)。
癌幹細胞は、広範な処置および化学療法薬に対して耐性である。記載されたスクリーニングのアプローチを用いて同定された化合物は、EMTを経験した上皮細胞を優先的に標的とするので、本発明者らは、かかる化合物がまた癌幹細胞を標的とするために役立ち得るか否かを決定することを望んだ。この目的のために、本発明者らは、FACSを用いて、いくつかの乳癌株を、癌幹細胞を濃縮することが報告されているマーカー(CD44hi/CD24lo)の発現について分析した。MDA-MB-231およびSUM159細胞は、90%より多いCD44hi/CD24lo細胞を含んだ。対照的に、T47D細胞株は、<1%のCD44hi/CD24lo細胞を示した(図5A)。本発明者らは、サリノマイシン処置の後で、CSC豊富な細胞株であるSUM159およびMDA-MB-231が、広範な用量にわたり、CSCが少ないT47D細胞と比較して、感受性がより高かったことを観察した。同様の結果が、より不明確ではあるが、アバメクチン処置によっても観察された(図5B)。
癌細胞に対する化合物処置の効果をさらに特徴づけるために、本発明者らは、サリノマイシン、アバメクチン、タキソールまたはDMSOで処置されたSUM159細胞に対するFACS分析を行った。本発明者らは、タキソール処置はCD44hi/CD24lo画分に有意に影響を及ぼさなかったが、サリノマイシンによる処置は、DMSO対照と比較して、CD44hi/CD24lo画分中の細胞の割合を有意に減少させ、同時にCSCが枯渇した画分を増大させた(約3倍)ことを観察した(図5C)。対照的に、アバメクチン処置は、CD44hi/CD24lo画分中の細胞の割合を有意に変化させなかった。
サリノマイシン処置による癌幹細胞の機能的阻害
上記の結果は、サリノマイシン処置が、CSCが豊富であると報告される細胞株および細胞集団を優先的に標的とすることを示した。サリノマイシンの癌幹細胞集団に対する影響を直接的に評価するために、本発明者らは、サリノマイシン、タキソールまたはDMSOで処置された培養物中の癌幹細胞の活性について機能的にアッセイした。SUM159乳癌細胞によるマンモスフィア形成アッセイにより、タキソールは懸濁培養中でコロニーを形成することができる細胞の数の増加をもたらすが、サリノマイシン処置は対照DMSO処置と比較してこの能力を有意に低下させることが示された。また、invivoでの腫瘍形成連続希釈アッセイにより、サリノマイシン処置はDMSO処置された対照と比較してCSCの機能的活性を有意に低下させるが、タキソール処置は反対の結果をもたらすことが示された。CSCを機能的に定義するために用いられる2種のアッセイを利用するこれらの知見は、サリノマイシンが、処置された癌細胞集団中の癌幹細胞の数を有意に減少させることを示した。
上記の結果は、サリノマイシン処置が、CSCが豊富であると報告される細胞株および細胞集団を優先的に標的とすることを示した。サリノマイシンの癌幹細胞集団に対する影響を直接的に評価するために、本発明者らは、サリノマイシン、タキソールまたはDMSOで処置された培養物中の癌幹細胞の活性について機能的にアッセイした。SUM159乳癌細胞によるマンモスフィア形成アッセイにより、タキソールは懸濁培養中でコロニーを形成することができる細胞の数の増加をもたらすが、サリノマイシン処置は対照DMSO処置と比較してこの能力を有意に低下させることが示された。また、invivoでの腫瘍形成連続希釈アッセイにより、サリノマイシン処置はDMSO処置された対照と比較してCSCの機能的活性を有意に低下させるが、タキソール処置は反対の結果をもたらすことが示された。CSCを機能的に定義するために用いられる2種のアッセイを利用するこれらの知見は、サリノマイシンが、処置された癌細胞集団中の癌幹細胞の数を有意に減少させることを示した。
考察
本発明の知見は、癌細胞の集団中の癌幹細胞の画分は、形質転換の前の標的細胞の分化の状態と相関することを示唆する。この原則により、分化の状態においてのみ異なる形質転換細胞を、癌幹細胞特異的毒性を有する薬剤を同定するためのスクリーニングのツールとして利用することが可能となる。本発明者らがスクリーニングのために用いた細胞株が、規定の撹乱以外についてはアイソジェニックであることを考慮し、本発明者らは、HMECsiEcad細胞について総合的な致死性を示す化合物がまた、形質転換されているか形質転換されていないかに関らず、間葉分化転換の状態にある上皮細胞を標的とする可能性が高かったことを結論付けた。
本発明の知見は、癌細胞の集団中の癌幹細胞の画分は、形質転換の前の標的細胞の分化の状態と相関することを示唆する。この原則により、分化の状態においてのみ異なる形質転換細胞を、癌幹細胞特異的毒性を有する薬剤を同定するためのスクリーニングのツールとして利用することが可能となる。本発明者らがスクリーニングのために用いた細胞株が、規定の撹乱以外についてはアイソジェニックであることを考慮し、本発明者らは、HMECsiEcad細胞について総合的な致死性を示す化合物がまた、形質転換されているか形質転換されていないかに関らず、間葉分化転換の状態にある上皮細胞を標的とする可能性が高かったことを結論付けた。
例3:材料および方法
細胞培養
対照shRNA(shCntrl)またはE−カドヘリンを標的とするshRNA(shEcad)のいずれかを発現する、不死化された(HMLE)または形質転換された(HMLER)乳房上皮細胞を、記載されるように(Onderet al. 2008 Cancer Research、近刊)生成して維持した。HMLE-Twist細胞もまた先に記載されている(Yang et al2004)。GFP発現株を生成するために、本発明者らは、HMLEおよびHMLE-shEcad細胞を、ブラストサイジン耐性遺伝子を保有するpWZL-GFPレトロウイルスに、標準的な手順を用いて感染させた(Stewartet al 2003)。
細胞培養
対照shRNA(shCntrl)またはE−カドヘリンを標的とするshRNA(shEcad)のいずれかを発現する、不死化された(HMLE)または形質転換された(HMLER)乳房上皮細胞を、記載されるように(Onderet al. 2008 Cancer Research、近刊)生成して維持した。HMLE-Twist細胞もまた先に記載されている(Yang et al2004)。GFP発現株を生成するために、本発明者らは、HMLEおよびHMLE-shEcad細胞を、ブラストサイジン耐性遺伝子を保有するpWZL-GFPレトロウイルスに、標準的な手順を用いて感染させた(Stewartet al 2003)。
マンモスフィア培養は、培養培地が細胞の凝集を防ぐために0.9%のメチルセルロース(Stem cell technologies)を含んだこと以外は、記載される通りに行った(Dontuet al., 2003)。96ウェルプレート中のプレート毎に102または103の細胞を播種した。マンモスフィアは7〜10日間培養し、次いで撮影して計数した。
抗体、免疫ブロット
免疫ブロットのために利用された抗体は、E−カドヘリン、N−カドヘリン(BD Transduction)、ビメンチンV9(NeoMarkers)、アクチン(Abeam)、H-Ras(SantaCruz)、サイトケラチン8(Troma-1、Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa)であった。全ての手順を、記載される通りにおこなった(Onderet al 2008 Cancer Research、近刊)。
免疫ブロットのために利用された抗体は、E−カドヘリン、N−カドヘリン(BD Transduction)、ビメンチンV9(NeoMarkers)、アクチン(Abeam)、H-Ras(SantaCruz)、サイトケラチン8(Troma-1、Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa)であった。全ての手順を、記載される通りにおこなった(Onderet al 2008 Cancer Research、近刊)。
FACS
FACS分析のために用いられたAPC共役抗CD44(クローンG44-26)抗体、およびPE共役抗CD24抗体(クローンML5)は、BD Bioscienceから得られ、製造者の指示書に従って用いられた。生存細胞を区別するために、ヨウ化プロピジウム(5ug/ml)を染色プロトコルに含んだ。
FACS分析のために用いられたAPC共役抗CD44(クローンG44-26)抗体、およびPE共役抗CD24抗体(クローンML5)は、BD Bioscienceから得られ、製造者の指示書に従って用いられた。生存細胞を区別するために、ヨウ化プロピジウム(5ug/ml)を染色プロトコルに含んだ。
細胞傷害性薬剤に対する耐性の特徴づけ
ドキソルビシン、パクリタキセル、アクチノマイシンD、カンプトテシンおよびスタウロスポリンは、Sigmaから購入し、ジメチルスルホキシド(DMSO)中に溶解した。96ウェルプレート中のプレート毎に、100ulの培地中5000個の細胞を播種した。播種の24時間後、示した濃度での化合物をウェルに添加した(各濃度につき5ウェル)。陰性対照としてDMSO処置を用いた。細胞の生存率を72時間後にCellTiter96AQueous Assay(Promega)を製造者の指示書に従って用いて測定した。用量応答曲線は、GraphPad Prismソフトウェア(GraphPadSoftware, Inc.)により作製した。
ドキソルビシン、パクリタキセル、アクチノマイシンD、カンプトテシンおよびスタウロスポリンは、Sigmaから購入し、ジメチルスルホキシド(DMSO)中に溶解した。96ウェルプレート中のプレート毎に、100ulの培地中5000個の細胞を播種した。播種の24時間後、示した濃度での化合物をウェルに添加した(各濃度につき5ウェル)。陰性対照としてDMSO処置を用いた。細胞の生存率を72時間後にCellTiter96AQueous Assay(Promega)を製造者の指示書に従って用いて測定した。用量応答曲線は、GraphPad Prismソフトウェア(GraphPadSoftware, Inc.)により作製した。
また、低酸素および2−デオキシグルコース処置について、細胞の生存率を72時間後にCellTiter96 AQueous Assay(MTT)を用いて測定した。
混合実験について、未標識およびGFP標識細胞を、示した比で混合し、6ウェルのプレートに播種した。3つの複製のウェルを、次いでDMSOまたは化合物(パクリタキセル、サリノマイシン、アバメクチンおよびブラストサイジン)で48時間処置した。細胞をPBSで洗浄し、トリプシン処理し、FACSによりGFP活性について分析した。
混合実験について、未標識およびGFP標識細胞を、示した比で混合し、6ウェルのプレートに播種した。3つの複製のウェルを、次いでDMSOまたは化合物(パクリタキセル、サリノマイシン、アバメクチンおよびブラストサイジン)で48時間処置した。細胞をPBSで洗浄し、トリプシン処理し、FACSによりGFP活性について分析した。
化学物質スクリーニング
一般的な自動化されたHTSのプロトコルについての情報は、broad.harvard.edu/chembio/index.html.においてオンラインで利用可能である。アッセイは、ウェルあたり1000細胞を含む40μLの培地を、白色の384ウェルの不透明な底部を有するプレート(Nunc,Rochester, NY)中に自動プレートフィラー(Bio-Tek μFiller; Winsooki, VT)を用いて播種し、細胞を24時間にわたり接着させることにより開始した。100nLのDMSO中の化合物のストック溶液を、自動化されたピンベースの化合物輸送ロボット(CyBioCyBi-WeIl vario; Woburn, MA)を用いて、ストックプレートから384ウェルアッセイプレートに移した。ほとんどの化合物について、各ウェルにおける最終濃度は10uMであると計算された。
一般的な自動化されたHTSのプロトコルについての情報は、broad.harvard.edu/chembio/index.html.においてオンラインで利用可能である。アッセイは、ウェルあたり1000細胞を含む40μLの培地を、白色の384ウェルの不透明な底部を有するプレート(Nunc,Rochester, NY)中に自動プレートフィラー(Bio-Tek μFiller; Winsooki, VT)を用いて播種し、細胞を24時間にわたり接着させることにより開始した。100nLのDMSO中の化合物のストック溶液を、自動化されたピンベースの化合物輸送ロボット(CyBioCyBi-WeIl vario; Woburn, MA)を用いて、ストックプレートから384ウェルアッセイプレートに移した。ほとんどの化合物について、各ウェルにおける最終濃度は10uMであると計算された。
スクリーニングは2回ずつ行った。陰性対照について、各化合物のアッセイプレート中に組み込まれたDMSOのみで処置された対照ウェルに加えて、DMSO処置された対照プレート全体を使用した。20ulのCellTiter-GloLuminescent Cell Viability Assay溶液(Promega)の添加により、細胞をルシフェラーゼ活性についてアッセイした。各プレートからの発光シグナルを、自動プレートリーダー(Perkin-Elmer Envision 1;Wellesley, MA)を用いて検出した。
スクリーニングされたプレートについての化合物プレート番号は、2158-2167、2099-2105、2290- 2297、2403-2407、Biokinl-2であった。一次データを市販のソフトウェアパッケージSpotFire(SpotFire,Inc., Somerville, MA)を用いて分析した。
スクリーニングされたプレートについての化合物プレート番号は、2158-2167、2099-2105、2290- 2297、2403-2407、Biokinl-2であった。一次データを市販のソフトウェアパッケージSpotFire(SpotFire,Inc., Somerville, MA)を用いて分析した。
ヒットの検証
個々の化合物を、Sigmaから購入し、100%エタノール中に溶解したニゲリシンを例外として、DMSO中に溶解した。初回スクリーニングについて記載したものと同じ細胞密度および培養条件下において384ウェルプレートに基づく系を用いてHMLE-shCntrl、HMLE-shEcadおよびHMLE-Twistについての用量応答曲線を作成することにより、化合物の活性を定量した。
個々の化合物を、Sigmaから購入し、100%エタノール中に溶解したニゲリシンを例外として、DMSO中に溶解した。初回スクリーニングについて記載したものと同じ細胞密度および培養条件下において384ウェルプレートに基づく系を用いてHMLE-shCntrl、HMLE-shEcadおよびHMLE-Twistについての用量応答曲線を作成することにより、化合物の活性を定量した。
腫瘍形成アッセイ
100μlの、DME中で1:2に希釈されたマトリゲル(Matrigel)中、106、105、104および103のHMLER-shCntrlまたはHMLER-shEcad細胞を、NOD-SCIDマウスに皮下注射した。腫瘍の発生率を、注射の後60日間にわたりモニタリングした。全てのマウスの手順は、マサチューセッツ工科大学の実験動物委員会により承認され、大学の方針に従って行われた。
100μlの、DME中で1:2に希釈されたマトリゲル(Matrigel)中、106、105、104および103のHMLER-shCntrlまたはHMLER-shEcad細胞を、NOD-SCIDマウスに皮下注射した。腫瘍の発生率を、注射の後60日間にわたりモニタリングした。全てのマウスの手順は、マサチューセッツ工科大学の実験動物委員会により承認され、大学の方針に従って行われた。
例4:EMTを誘導するための例示的方法
EMTは、細胞において、特定の転写因子(例えば表1を参照)の活性を誘導することにより引き起こされる。以下から選択されるEMTを誘導する転写因子を発現することができる1または2以上の導入遺伝子を有する上皮細胞(例えばHMLEなどの不死化した細胞またはHMLERなどの形質転換細胞)を作製する:Snail1、Snail2、グースコイド、FoxC2、TWIST、E2A、SIP-l/Zeb-2、dEF1/ZEb1、LEF1、Myc、HMGA2、TAZ、Klf8、HIF-1、HOXB7、SIM2sおよびFos。導入遺伝子の発現は、構成的または誘導性であり、細胞においてEMTを誘導する。
EMTは、細胞において、特定の転写因子(例えば表1を参照)の活性を誘導することにより引き起こされる。以下から選択されるEMTを誘導する転写因子を発現することができる1または2以上の導入遺伝子を有する上皮細胞(例えばHMLEなどの不死化した細胞またはHMLERなどの形質転換細胞)を作製する:Snail1、Snail2、グースコイド、FoxC2、TWIST、E2A、SIP-l/Zeb-2、dEF1/ZEb1、LEF1、Myc、HMGA2、TAZ、Klf8、HIF-1、HOXB7、SIM2sおよびFos。導入遺伝子の発現は、構成的または誘導性であり、細胞においてEMTを誘導する。
EMTは、細胞においてシグナル経路の活性を調節することにより引き起こされる(表2および3を参照)。上皮細胞(例えばHMLEなどの不死化した細胞またはHMLERなどの形質転換細胞)を、TGF-β/BMPスーパーファミリーメンバー、Wnt-ファミリーメンバー、FGFファミリーメンバー、Notchリガンド、EGFファミリーメンバー、IGFファミリーメンバー、PDGF、およびHGFから選択される増殖因子と接触させ、それにより細胞においてEMTを誘導する。
EMTおよび/またはE−カドヘリンの下方調節を引き起こす他のアプローチを、表4にまとめる。EMTは、上皮細胞(例えばHMLEなどの不死化細胞またはHMLERなどの形質転換細胞)を、低酸素条件、放射線照射、および慢性化学療法処置に供することにより;上皮細胞をE−カドヘリンの遮断抗体で処置することにより;上皮細胞においてディスアドヘリンの発現を誘導することにより;および/または上皮細胞においてScribbleの発現を阻害することにより、引き起こされる。
下流の活動の記載(例えばヒットの特徴づけおよび開発)
本発明者らは、スクリーニングのヒットの癌幹細胞に対する効果に関する追跡評価のための幾つかの下流のアッセイを確立した:(1)細胞を、培養において一定の期間、必要な対照を含むスクリーニングのヒット(例えば、化合物、組成物、抗体、shRNAなど)で処置し、次いで、細胞を一定の期間(例えば12時間まで、24時間まで、48時間まで、72時間までなど)回復させ、次いで、癌幹細胞が濃縮された集団を同定するマーカー(例えば、限定されないが、乳癌の場合はCD44+/CD24−)を用いてFACSを行う。(2)細胞を培養において一定の期間スクリーニングのヒットで処置し、予め規定された期間回復させ、次いで、化合物の不在下において懸濁中でコロニー形成アッセイを行う(乳癌細胞については、これらのアッセイはマンモスフィア形成アッセイと称される)。(3)細胞を培養において一定の期間スクリーニングのヒットで処置し、予め規定された期間回復させ、次いで、多様な細胞数において、免疫無防備状態の動物に皮下注射し、腫瘍形成の頻度を評価する。注射される細胞の数として、10^6、10^5、10^4、10^3および10^2細胞が挙げられる。本明細書において開示されるもののような追跡アッセイを用いて、スクリーニングのヒット(またはCSCを標的とする活性を潜在的に有する任意の薬物)が癌幹細胞の本物の阻害剤であるか否かを評価することができる。
本発明者らは、スクリーニングのヒットの癌幹細胞に対する効果に関する追跡評価のための幾つかの下流のアッセイを確立した:(1)細胞を、培養において一定の期間、必要な対照を含むスクリーニングのヒット(例えば、化合物、組成物、抗体、shRNAなど)で処置し、次いで、細胞を一定の期間(例えば12時間まで、24時間まで、48時間まで、72時間までなど)回復させ、次いで、癌幹細胞が濃縮された集団を同定するマーカー(例えば、限定されないが、乳癌の場合はCD44+/CD24−)を用いてFACSを行う。(2)細胞を培養において一定の期間スクリーニングのヒットで処置し、予め規定された期間回復させ、次いで、化合物の不在下において懸濁中でコロニー形成アッセイを行う(乳癌細胞については、これらのアッセイはマンモスフィア形成アッセイと称される)。(3)細胞を培養において一定の期間スクリーニングのヒットで処置し、予め規定された期間回復させ、次いで、多様な細胞数において、免疫無防備状態の動物に皮下注射し、腫瘍形成の頻度を評価する。注射される細胞の数として、10^6、10^5、10^4、10^3および10^2細胞が挙げられる。本明細書において開示されるもののような追跡アッセイを用いて、スクリーニングのヒット(またはCSCを標的とする活性を潜在的に有する任意の薬物)が癌幹細胞の本物の阻害剤であるか否かを評価することができる。
例5:正常および新生物性のヒト乳房幹細胞様細胞はEMTに関連するマーカーを発現する
本発明者らは、整復乳房形成術または乳癌のいずれかから直接単離されたヒト乳腺上皮細胞における幹細胞様マーカーを分析した。本発明者らは、最初に、CD44high/CD24lowおよびCD44low/CD24high乳腺上皮細胞を、正常な整復乳房形成術の組織から単離し(図7A)、それらのmRNA発現パターンをリアルタイムRT−PCRを用いて計測した。CD44high/CD24low細胞は、低レベルのE−カドヘリンのmRNA、高レベルのN−カドヘリンのmRNA、ならびに、2つの重要なEMT誘導性転写因子であるSIP1およびFOXC2を特定するmRNAを、CD44low/CD24high集団における対応するmRNAの発現レベルと比較して、より高いレベルで発現した(図7B)。
本発明者らは、整復乳房形成術または乳癌のいずれかから直接単離されたヒト乳腺上皮細胞における幹細胞様マーカーを分析した。本発明者らは、最初に、CD44high/CD24lowおよびCD44low/CD24high乳腺上皮細胞を、正常な整復乳房形成術の組織から単離し(図7A)、それらのmRNA発現パターンをリアルタイムRT−PCRを用いて計測した。CD44high/CD24low細胞は、低レベルのE−カドヘリンのmRNA、高レベルのN−カドヘリンのmRNA、ならびに、2つの重要なEMT誘導性転写因子であるSIP1およびFOXC2を特定するmRNAを、CD44low/CD24high集団における対応するmRNAの発現レベルと比較して、より高いレベルで発現した(図7B)。
本発明者らはまた、CD44high/CD24low細胞およびCD44low/CD24high細胞を、3つの正常な整復乳房形成の組織から、および5つの新生物性のヒト乳房組織から単離し、組織中で発現される広範囲のmRNAを計測する代替的な方法である遺伝子発現の逐次分析(SAGE)を行った(Shipitsinet al., 2007)。CD44low/CD24high細胞と比較して、CD44high/CD24low細胞は、間葉系マーカー、特にCDH2(N−カドヘリン)、VIM(ビメンチン)、FN1(フィブロネクチン)、ZEB2(SIP-1)、FOXC2、SNAIL1(Snail)、SNAIL2(Slug)、TWIST1およびTWIST2をコードする高レベルのmRNA、ならびに低レベルのCDH11(E−カドヘリン)mRNAを発現した(図7Cおよび表5)。これらのデータは、培養された不死化MECから、ならびに正常および新生物性のヒト組織サンプルから単離されたCD44high/CD24low細胞が、EMTを経験した細胞に関連する複数の遺伝子を発現することを示す。
例6:EMTは癌幹細胞の発生を促進する
本明細書において開示される知見は、乳腺上皮幹細胞様細胞が、EMTを誘導することにより、正常な乳腺上皮細胞のより分化した集団から発生させることができることを示唆する。その延長において、本発明者らは、EMTが、より分化した新生物性細胞からの癌幹細胞の発生を促進し得ることを仮定した。この可能性に取り組むために、本発明者らは、HER2/neu癌遺伝子の活性形態の誘導により形質転換されている、実験的に不死化させたヒト乳腺上皮細胞(HMLEN細胞)においてEMTを誘導した(Elenbaaset al., 2001; Hahn et al., 1999)。これらの細胞をまた、先に記載したSnail(Snail-ER)またはTwist(Twist-ER)転写因子のいずれかのタモキシフェンを活性化することが可能な形態を発現するベクターに感染させた。
本明細書において開示される知見は、乳腺上皮幹細胞様細胞が、EMTを誘導することにより、正常な乳腺上皮細胞のより分化した集団から発生させることができることを示唆する。その延長において、本発明者らは、EMTが、より分化した新生物性細胞からの癌幹細胞の発生を促進し得ることを仮定した。この可能性に取り組むために、本発明者らは、HER2/neu癌遺伝子の活性形態の誘導により形質転換されている、実験的に不死化させたヒト乳腺上皮細胞(HMLEN細胞)においてEMTを誘導した(Elenbaaset al., 2001; Hahn et al., 1999)。これらの細胞をまた、先に記載したSnail(Snail-ER)またはTwist(Twist-ER)転写因子のいずれかのタモキシフェンを活性化することが可能な形態を発現するベクターに感染させた。
これらの細胞は、タモキシフェンで10日間単層培養において処置した場合にEMTを経験する(図8Aおよび8B)。これは、これらのHER2/neu形質転換細胞の、不死化した形質転換されていない前駆体の振る舞いと同様である(図9Aおよび9B)。タモキシフェンの除去の後で、本発明者らは、これらのHMLEN細胞を、タモキシフェンの不在下においてソフトアガーおよび腫瘍球形成アッセイの両方に供した。これらのアッセイの第1のものは、腫瘍原性のinvitroでの代替の尺度として役立ち(Cifone and Fidler, 1980; Singh et al., 2004)、一方、第2のものは、幹細胞性を計測する。興味深いことに、本発明者らは、タモキシフェン処置の後でEMTを経験した細胞は、タモキシフェンに暴露されなかった対照細胞が行うよりも少なくとも10倍多い腫瘍球を形成したことを観察した(図8C)。同等に重要なこととして、EMTを経験した形質転換された細胞は、ソフトアガー懸濁培養中で、対照の未処置の細胞が行うよりも約10倍多いコロニーを形成した(図8D)。
EMTを経験した形質転換細胞の腫瘍原性を計測するために、本発明者らは、Snail-ERまたはTwist-ERのいずれかを保有し、移植の前に4-OHTで12日間処置されたHMLEN細胞を、限界希釈においてマウス宿主の皮下部位に注射した。これらの細胞は、invivoで腫瘍を形成することに失敗し、このことは、EMT/幹細胞状態の長期の維持は、少なくともこの実験モデルにおいては、持続的なEMT誘導シグナルに依存することを示唆した。この概念をさらに試験するために、本発明者らは、EMTを経験したHMLEN細胞を、invitroでさらに15日間の不在下において培養した。これらの細胞は、上皮の表現型へ完全に復帰し(図10)、このことは、これらの細胞による幹細胞状態の維持は、少なくともinvitroでは、持続的なEMT誘導シグナルに依存することを示唆した。
EMT誘導性転写因子の構成的発現が、形質転換細胞の腫瘍発生頻度を変更することに成功したか否かを試験するために、本発明者らは、HMLER細胞(すなわち、V12H-Ras癌遺伝子で腫瘍原性を付与するように形質転換され、SnailまたはTwistのいずれかを構成的に発現するHMLE細胞(Elenbaaset al., 2001))を、免疫不全の宿主に注射した。先に観察されたHMLE細胞の振る舞いと同様に、SnailおよびTwistの両方がこれらのHMLER細胞においてEMTを誘導し、CD44high/CD24low細胞の数およびマンモスフィアを形成する能力を増大させた(図11)。TwistまたはSnailを発現する103のHMLER細胞を注射されたマウスの大多数が腫瘍を形成し(9のうち6−Snail;9のうち7−Twist)、一方、対照ベクターを発現する等しい数の細胞をマウスに注射した場合は、腫瘍は生じなかった(表6)。実際、腫瘍形成を開始させるためには105の対照細胞(TwistまたはSnailのいずれかの発現を欠くもの)が必要とされ、それでもなお腫瘍形成は不十分であった(9個体の注射された宿主のうち3個体)。したがって、TwistまたはSnailのいずれかのEMT誘導性転写因子の発現は、腫瘍発生細胞の数を有意に(約2桁で)増大させる。対照細胞およびTwistまたはSnailを発現する細胞から発症した腫瘍の組織学は、扁平な異形成(squamousmetaplasias)として現れ、これは、先に報告される通り(Elenbaas et al., 2001)、親細胞により形成される腫瘍のものと類似する(図12)。
表5は、本明細書において開示されるEMT遺伝子について特異的なSAGEタグの配列、ならびに正常および新生物性のヒト乳腺から単離されたCD44high/CD24lowおよびCD44low/CD24highの集団において存在する各タグの数を開示する。腫瘍サンプルは、2種の浸潤性乳管癌から、一方は胸水から、もう一方は腹水から調製した。正常サンプルは、2種の整復乳房形成術から調製した。
例7:
細胞培養
不死化したヒト乳腺上皮細胞(HMLE)を、先に記載されるように維持した(Elenbaas et al., 2001)。HMLE細胞またはHMLEN細胞を、pWZL-Snail-ERまたはpWZL-Twist-ERベクターで感染させ、その後5ng/mlのブラストサイジンで選択することにより、HMLE-Snail-ER、HMLE-Twist-ER、HMLEN-Snail-ER、およびHMLEN-Twist-ER細胞を作製した。不死化したヒト乳腺上皮細胞(Elenbaaset al., 2001)を、SnailもしくはTwistを発現するレトロウイルスベクターまたは対照ベクターで感染させ、2μg/mlのピューロマイシンで選択することにより、HMLE-Snail-Ras、HMLE-Twist-Ras、およびHMLE-Vector-Ras細胞を作製した。これらの細胞を、次いで、V12H-RAS癌遺伝子を発現するpWZLレトロウイルスベクターの導入により形質転換し、その後、4μg/mlのブラストサイジンにより選択した。4−ヒドロキシタモキシフェン(4-OHT)処置について、HMLE-Snail-ER、HMLE-Twist-ER、HMLEN-Snail-ERおよびHMLEN-Twist-ER細胞を、20nMの最終濃度における4-OHTに示した日数の間暴露した。この研究において用いられたプラスミド、ウイルスを精製するための手順、およびこれらのウイルスを用いた標的細胞の感染は、本明細書において記載される。
細胞培養
不死化したヒト乳腺上皮細胞(HMLE)を、先に記載されるように維持した(Elenbaas et al., 2001)。HMLE細胞またはHMLEN細胞を、pWZL-Snail-ERまたはpWZL-Twist-ERベクターで感染させ、その後5ng/mlのブラストサイジンで選択することにより、HMLE-Snail-ER、HMLE-Twist-ER、HMLEN-Snail-ER、およびHMLEN-Twist-ER細胞を作製した。不死化したヒト乳腺上皮細胞(Elenbaaset al., 2001)を、SnailもしくはTwistを発現するレトロウイルスベクターまたは対照ベクターで感染させ、2μg/mlのピューロマイシンで選択することにより、HMLE-Snail-Ras、HMLE-Twist-Ras、およびHMLE-Vector-Ras細胞を作製した。これらの細胞を、次いで、V12H-RAS癌遺伝子を発現するpWZLレトロウイルスベクターの導入により形質転換し、その後、4μg/mlのブラストサイジンにより選択した。4−ヒドロキシタモキシフェン(4-OHT)処置について、HMLE-Snail-ER、HMLE-Twist-ER、HMLEN-Snail-ERおよびHMLEN-Twist-ER細胞を、20nMの最終濃度における4-OHTに示した日数の間暴露した。この研究において用いられたプラスミド、ウイルスを精製するための手順、およびこれらのウイルスを用いた標的細胞の感染は、本明細書において記載される。
抗体、ウェスタンブロット、および免疫蛍光法
細胞を、50mMのTris PH7.5、150mMのNaClおよび0.5%のNP-40の存在下において、氷上で溶解した。各サンプルからの全タンパク質の50μgを、4〜12%のビス−Trisゲル上で、MOPsランニングバッファーを用いて分離し、PVDFメンブレンにトランスファーした。ブロットを、次いで、抗β−アクチン(Abeam)、抗E−カドヘリン(BDTransduction)、抗フィブロネクチン(BD Transduction)、抗ビメンチンV9(NeoMarkers)または抗N−カドヘリン(BDTransduction)などの多様な抗体でプローブした。
細胞を、50mMのTris PH7.5、150mMのNaClおよび0.5%のNP-40の存在下において、氷上で溶解した。各サンプルからの全タンパク質の50μgを、4〜12%のビス−Trisゲル上で、MOPsランニングバッファーを用いて分離し、PVDFメンブレンにトランスファーした。ブロットを、次いで、抗β−アクチン(Abeam)、抗E−カドヘリン(BDTransduction)、抗フィブロネクチン(BD Transduction)、抗ビメンチンV9(NeoMarkers)または抗N−カドヘリン(BDTransduction)などの多様な抗体でプローブした。
ソフトアガーおよび腫瘍形成アッセイ
ソフトアガーアッセイを、先に記載される通り行った(Cifone and Fidler, 1980)。培養物を撮影し、500μmより大きなコロニーをImageJソフトウェア(先にはNIHimage)を用いて計数した。105、104および103のHMLE-Snail-RasまたはHMLE-Twist-RasまたはHMLE-Vector-Ras細胞を、胸腺欠損マウスに皮下注射した。注射の後25日間にわたり腫瘍発生率をモニタリングした。全てのマウスの手順は、マサチューセッツ工科大学の実験動物委員会により承認され、大学の方針に従って行われた。
ソフトアガーアッセイを、先に記載される通り行った(Cifone and Fidler, 1980)。培養物を撮影し、500μmより大きなコロニーをImageJソフトウェア(先にはNIHimage)を用いて計数した。105、104および103のHMLE-Snail-RasまたはHMLE-Twist-RasまたはHMLE-Vector-Ras細胞を、胸腺欠損マウスに皮下注射した。注射の後25日間にわたり腫瘍発生率をモニタリングした。全てのマウスの手順は、マサチューセッツ工科大学の実験動物委員会により承認され、大学の方針に従って行われた。
逆転写PCR分析
SYBR-GreenによるリアルタイムRT−PCRおよび対応するデータ分析は、先に記載されている(Yang et al., 2004)。全てのRT−PCR分析について、GAPDHのmRNAをRNAインプットを正規化するために用いた。遺伝子を増幅するために用いたプライマーの配列を、表7に列記する。
SYBR-GreenによるリアルタイムRT−PCRおよび対応するデータ分析は、先に記載されている(Yang et al., 2004)。全てのRT−PCR分析について、GAPDHのmRNAをRNAインプットを正規化するために用いた。遺伝子を増幅するために用いたプライマーの配列を、表7に列記する。
FACS分析
FACS分析のために用いられた抗CD44(クローンG44-26)および抗CD24(クローンML5)抗体は、BD Bioscienceから得た。マウスの初代乳腺上皮細胞をソーティングするために、マウスの乳腺をコラゲナーゼ(1μg/ml)で消化し、短時間の遠心分離(800rpmで45秒間)によりオルガノイドを回収した。オルガノイドを、単一の細胞へ解離させるために、0.025%のトリプシンで5分間37℃で消化した。解離した細胞を、CD49f(Pharmingen)およびCD24(Pharmingen)ならびに幾つかの系統マーカー(CD45、CD31、Ter-119およびCD140a(ebioscience))に対する抗体で、Stinglet al 2006において記載される通りに染色した。Lin−−細胞を、ソーティングのために用いた。
FACS分析のために用いられた抗CD44(クローンG44-26)および抗CD24(クローンML5)抗体は、BD Bioscienceから得た。マウスの初代乳腺上皮細胞をソーティングするために、マウスの乳腺をコラゲナーゼ(1μg/ml)で消化し、短時間の遠心分離(800rpmで45秒間)によりオルガノイドを回収した。オルガノイドを、単一の細胞へ解離させるために、0.025%のトリプシンで5分間37℃で消化した。解離した細胞を、CD49f(Pharmingen)およびCD24(Pharmingen)ならびに幾つかの系統マーカー(CD45、CD31、Ter-119およびCD140a(ebioscience))に対する抗体で、Stinglet al 2006において記載される通りに染色した。Lin−−細胞を、ソーティングのために用いた。
初代ヒトサンプルおよびSAGEライブラリー
CD44high/CD24lowおよびCD44low/CD24high細胞を、正常な整復乳房形成術の組織および乳癌から、多様な細胞マーカーに対して特異的な抗体結合ビーズによる細胞型の連続捕獲により単離した(Shipitsinet al., 2007)。新しい組織サンプルを、ハーバードの提携病院から収集し、細胞画分をすぐに精製した。3つの正常組織、1つの胸水、2つの腹水および3つの浸潤性乳管癌を、3つずつ、異なる患者から収集した。Dana-Farber癌研究所の機関審査委員会により承認されたプロトコルに従って、検体は患者識別コードなしで収集した。
CD44high/CD24lowおよびCD44low/CD24high細胞を、正常な整復乳房形成術の組織および乳癌から、多様な細胞マーカーに対して特異的な抗体結合ビーズによる細胞型の連続捕獲により単離した(Shipitsinet al., 2007)。新しい組織サンプルを、ハーバードの提携病院から収集し、細胞画分をすぐに精製した。3つの正常組織、1つの胸水、2つの腹水および3つの浸潤性乳管癌を、3つずつ、異なる患者から収集した。Dana-Farber癌研究所の機関審査委員会により承認されたプロトコルに従って、検体は患者識別コードなしで収集した。
ヒートマップ
図7Cにおけるヒートマップは、表5におけるSAGEタグのカウントを用いて作製されたものであり、これはMapleTree(L. Simirenkoにより開発された)を用いて可視化した。可視化の前に、タグのカウントをlog2に転換し(0のカウントを1であったものとして処理する)、タグによる中央値を中心とし、中心化されない相関類似性測定基準(uncenteredcorrelation similarity metrics)により、Cluster(Eisen et al., 1998)を用いて、タグおよびSAGEライブラリーによる階層的完全系統クラスター化(hierarchicalcomplete linkage clustering)に供する。
図7Cにおけるヒートマップは、表5におけるSAGEタグのカウントを用いて作製されたものであり、これはMapleTree(L. Simirenkoにより開発された)を用いて可視化した。可視化の前に、タグのカウントをlog2に転換し(0のカウントを1であったものとして処理する)、タグによる中央値を中心とし、中心化されない相関類似性測定基準(uncenteredcorrelation similarity metrics)により、Cluster(Eisen et al., 1998)を用いて、タグおよびSAGEライブラリーによる階層的完全系統クラスター化(hierarchicalcomplete linkage clustering)に供する。
統計学的分析
全てのデータを、他に記述された場合を除き、平均値±SEMとして表わす。2つの群を比較する場合、スチューデントのt検定を用いた(P<0.05を有意とみなした)。
プラスミド、ウイルスの生成および標的細胞の感染
pBp- SnailおよびpBp-Twistの開発は、先に報告されている(Yang et al., 2004)。pWZL-Blast-Snail-ERおよびPWZL-Blast-Twist-ERコンストラクトは、pWZL-Blast-DN-MycER(Littlewoodet al., 1995; Watnick et al., 2003)のMYCのcDNAを、pBp-hSnailからPCRで増幅されたhSnailのcDNAまたはpBpmTwistからPCRで増幅されたmTwistのcDNAで置き換えることにより作製した。レンチウイルスおよび広宿主性レトロウイルスの生成、ならびに標的細胞の感染は、先に記載されている(Stewartet al., 2003)。
全てのデータを、他に記述された場合を除き、平均値±SEMとして表わす。2つの群を比較する場合、スチューデントのt検定を用いた(P<0.05を有意とみなした)。
プラスミド、ウイルスの生成および標的細胞の感染
pBp- SnailおよびpBp-Twistの開発は、先に報告されている(Yang et al., 2004)。pWZL-Blast-Snail-ERおよびPWZL-Blast-Twist-ERコンストラクトは、pWZL-Blast-DN-MycER(Littlewoodet al., 1995; Watnick et al., 2003)のMYCのcDNAを、pBp-hSnailからPCRで増幅されたhSnailのcDNAまたはpBpmTwistからPCRで増幅されたmTwistのcDNAで置き換えることにより作製した。レンチウイルスおよび広宿主性レトロウイルスの生成、ならびに標的細胞の感染は、先に記載されている(Stewartet al., 2003)。
免疫蛍光法
約2.5×104の細胞を、4ウェルのLab-TekIIチャンバースライド上に播種した。24時間後に細胞をリン酸緩衝化食塩水(PBS)で2回洗浄し、PBS緩衝液中2%のパラホルムアルデヒドおよび0.1%のTritonX100中で40℃で30分間浸漬させて固定した。細胞を次いでPBSで3回洗浄し、ブロッキング溶液(PBS中10%のヤギ血清)中でインキュベートした。細胞を次いで一次抗体と共に(2時間〜一晩)インキュベートし、0.1%のTween-20を添加したPBSで15分間3回洗浄し、最後に二次抗体(Invitrogen)およびDAPIと共に2時間インキュベートした。スライドをPBSで念入りに洗浄し、slowfade Light退色防止キット(Invitrogen)と共にマウントした。全ての対応するサンプルを、免疫蛍光顕微鏡および同一の露出時間を用いて撮影した(対照および試験)。
約2.5×104の細胞を、4ウェルのLab-TekIIチャンバースライド上に播種した。24時間後に細胞をリン酸緩衝化食塩水(PBS)で2回洗浄し、PBS緩衝液中2%のパラホルムアルデヒドおよび0.1%のTritonX100中で40℃で30分間浸漬させて固定した。細胞を次いでPBSで3回洗浄し、ブロッキング溶液(PBS中10%のヤギ血清)中でインキュベートした。細胞を次いで一次抗体と共に(2時間〜一晩)インキュベートし、0.1%のTween-20を添加したPBSで15分間3回洗浄し、最後に二次抗体(Invitrogen)およびDAPIと共に2時間インキュベートした。スライドをPBSで念入りに洗浄し、slowfade Light退色防止キット(Invitrogen)と共にマウントした。全ての対応するサンプルを、免疫蛍光顕微鏡および同一の露出時間を用いて撮影した(対照および試験)。
例8
癌幹細胞の増殖に対するサリノマイシンの効果を試験した。HMLER細胞を、サリノマイシン、またはパクリタキセル、または対照としてDMSOで、4日間多様な用量で処置した(図13A)。化合物処置の後でのCD44high/CD24low細胞のパーセンテージを、蛍光励起細胞ソーティングにより定量した。2つの異なるHMLER細胞集団(HMLER_l、HMLER_2)による2回の独立した実験を行い、結果を表わすために棒グラフを作製した(図13A)。サリノマイシンまたはパクリタキセルで処置されたHMLER_2癌細胞集団の蛍光励起細胞ソーティングのプロフィールの散布図もまた試験した(図13B)。
癌幹細胞の増殖に対するサリノマイシンの効果を試験した。HMLER細胞を、サリノマイシン、またはパクリタキセル、または対照としてDMSOで、4日間多様な用量で処置した(図13A)。化合物処置の後でのCD44high/CD24low細胞のパーセンテージを、蛍光励起細胞ソーティングにより定量した。2つの異なるHMLER細胞集団(HMLER_l、HMLER_2)による2回の独立した実験を行い、結果を表わすために棒グラフを作製した(図13A)。サリノマイシンまたはパクリタキセルで処置されたHMLER_2癌細胞集団の蛍光励起細胞ソーティングのプロフィールの散布図もまた試験した(図13B)。
DMSO、パクリタキセル(タキソール)またはサリノマイシンのいずれかにより処置された親HMLER細胞のマンモスフィア形成能をまた、多様な用量において試験した。サリノマイシンは、MCF7Rasまたは4T1細胞においてマンモスフィア形成を阻害したが、パクリタキセルは阻害しなかった(図14)。サリノマイシン、パクリタキセルまたはビヒクル対照処置の、マウスに注射されたSUM159乳癌細胞によるinvivoでの腫瘍形成に対する効果を試験した。サリノマイシンまたはパクリタキセルにより処置されたマウスは、ビヒクル対照により処置されたマウスと比較して、腫瘍体積が減少した(図15A)。サリノマイシン、パクリタキセルまたはDMSOにより処置されたマウスからのSUM159腫瘍から得られた癌細胞のマンモスフィア形成能もまた決定した(図15B)。
サリノマイシン処置が、臨床的に意義のある乳癌CSCおよび前駆体の遺伝子の発現を低下させる程度もまた決定した。遺伝子セットエンリッチメント分析を用いて、3つの先に報告された幹細胞様細胞に関連する遺伝子のセットが、サリノマイシンに対する応答においてパクリタキセル処置と比較して抑圧されるか否かを決定した。グラフ化されているのは、発現差異に基づく遺伝子ランクに対するKolmogorov-Smirnovエンリッチメントスコアである。各分析についての統計学的有意度を反映するP値を示す。3つの先に報告された遺伝子のシグネチャーは、CD44+CD24−IGS(Liuet al., 2007)、CD44+CD24−(Shipitsin et al., 2007)およびマンモスフィア(Dontu et al., 2003)である(図16)。
本発明の少なくとも1つの態様の幾つかの局面をこのように記載したことにより、多様な変更、改変および改善が、当業者には容易に想起し得ることが理解されるべきである。かかる変更、改変および改善は、本開示の一部であるものとして意図され、本発明の精神および範囲のうちであるものとして意図される。したがって前述の記載および図面は単なる例である。本明細書において記載される全ての参考文献は、本明細書において記載される目的のために参考として組み込まれる。
さらに、本発明は、その用途において、開示された記載において記載される、または図面において説明される、成分の構成および配置の詳細に限定されない。本発明は、他の態様も可能であり、多様な方法において実施されるかまたは実行されることができる。また、本明細書において用いられる用語および学術用語は、説明を目的とするものであり、限定するものとしてみなされるべきではない。本明細書における「含む(including)」、「含む(comprising)」または「有する(having)」、「含む(containing)」、「含む(involving)」およびこれらの変化形の使用は、その後に列記される項目およびその等価物ならびにさらなる項目を包含することを意味する。
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- 本願明細書に記載された発明。
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