CN104840961B - 癌症干细胞敏感剂在制备抗癌症干细胞试剂盒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及癌症干细胞敏感剂在制备抗癌症干细胞的试剂盒中的应用，其中所述癌症干细胞敏感剂为癌症干细胞光敏剂、癌症干细胞放敏剂或癌症干细胞超敏剂。其中所述癌症干细胞光敏剂选自：(1)5-氨基酮戊酸(ALA)或其衍生物；(2)含四吡咯环的光敏化合物；(3)中药光敏剂；或(4)ALA或其衍生物分别与(2)或(3)中的化合物的组合。本发明还涉及用于治疗受试者中的癌症的抗癌症干细胞试剂盒，所述试剂盒包括：(1)本发明所述的癌症干细胞光敏剂；以及(2)能够发出波长在可见光范围内的可见光的发光器，或能够产生临床治疗剂量的X线的放疗机，或能够产生临床超声波使用剂量的超声器。所述试剂盒中还包括本发明所述的癌症干细胞放敏剂或癌症干细胞超敏剂。本发明主要检验了(1)ALA用作癌症干细胞光敏剂结合可见光照射；(2)ALA用作癌症干细胞放敏剂结合X线辐射；(3)ALA用作癌症干细胞超敏剂结合超声波对癌症干细胞的杀伤效果。

Description

癌症干细胞敏感剂在制备抗癌症干细胞试剂盒中的应用

技术领域

本发明属于生物物理和生物医学领域。具体而言，本发明涉及癌症干细胞敏感剂在制备抗-癌症干细胞的试剂盒中的应用，其中所述癌症干细胞敏感剂为癌症干细胞光敏剂、癌症干细胞放敏剂或癌症干细胞超敏剂。本发明利用癌症干细胞敏感剂被癌症干细胞摄取后本身或能诱导光敏物质的药物与光照射结合或与X射线结合或与超声波结合，使癌症干细胞发生化学反应，导致癌症干细胞死亡，进而起到根治癌症的治疗效果。

背景技术

如同正常组织起源于正常干细胞，癌组织内也含有癌症干细胞(CancerStemCells，CSC)。第一个发现CSC的科学家是加拿大人JohnDick。他在1994年发现具有细胞表面因子CD34+CD38-表型特征的细胞能够在裸鼠体内建立人AML(急性髓系白血病)模型，而CD34-和CD34+CD38+细胞则没有此功能。之后很多类型的癌组织被发现含有CSC。见下表1-不同种癌组织CSC表面标记因子。

表1.在不同人癌症中发现的癌症干细胞(CSC)标记(参见Neurosurgery，68(2)，p533，2011)

越来越多的研究证实CSC与癌的发生、复发、转移及恶化有着密切的联系。杀死CSC才有可能彻底的消除癌症病灶，使癌症病人得到真正的彻底治愈。

最近的研究已显示CSC对目前临床常规使用的癌症治疗方法，包括化疗(化学治疗)，放疗(放射治疗)均不敏感。对放/化疗敏感的细胞是癌组织中的分化细胞，即非-癌症干细胞(Non-CancerStemCells，NCSC)。在一种癌组织中绝大多数的细胞是NCSC，而CSC细胞只占1％甚至更少。但是，NCSC不是癌发生、复发、转移及恶化的主要元凶。所以放/化疗方法不能从根上彻底消除癌症病灶。

事实上临床现象也支持此结论。多数癌症患者在用常规放/化疗方法后肿瘤体积虽可缩小，但数年后很易复发或转移，且复发后恶性程度极高，难以控制，导致病人短期内死亡。癌症干细胞的新理念(“叶根”理论)解释了此现象。即，传统癌症治疗法只消灭了癌组织中占90％以上的NCSC(见图1，事实上NCSC细胞已丧失了肿瘤形成能力，无复发及转移潜能)，而对真正的恶性细胞-CSC未产生任何杀伤作用.即，只去“叶”不去“根”，因此出现了肿瘤体积短暂缩小而后又迅速生长起来的现象(肿瘤复发)。

如图1显示：当一种疗法或药物只能杀死NCSC(即，只去树叶)时，其结果癌组织(整棵树)还会重新再生(肿瘤复发)。而当一种疗法或药物能杀死CSC(即，去树根)时，癌组织(整棵树)失去了重生的可能，即癌组织被根除(肿瘤治愈)。

参见图2(来自维基百科)：若针对CSC(图中位于中间的黄色细胞)做特异性的治疗，则能够抑制并且消除肿瘤；若针对NCSC(图中位于周围的蓝色细胞)做传统治疗，则续存的CSC仍会发展成肿瘤(肿瘤复发)。

这样目前国际癌症前沿研究就是要找到一种临床可以应用的能够有效杀死CSC的治疗方法。

目前临床传统常规使用的癌症治疗方法最主要的技术缺陷是化疗和放疗均对CSC不敏感，不能有效的杀死CSC，从而不能从根上彻底消除癌症病灶(如前所述)。

图3和图11A，B显示化疗/放疗后不但不能消除癌组织内的CSC反而使CSC存集在癌组织中。即，化疗/放疗后瘤体虽减小(临床称之缩瘤术)，但是恶性可能增强。除叶不除根，治标未治本。给患者和医生留下了治疗假象。

化疗使乳腺癌CSC富集：

图3显示乳腺癌CSC百分比值在化疗后从疗前的5％增至化疗后的76％(数据来自文献-Cell，No.131，p1109，2007)。

放疗使肺癌CSC富集：

图11A和11B显示肺癌CSC百分比值从放疗前的1.17％增至放疗后的6.02％(该数据为本发明人在实施例中获得的数据)。

发明内容

为克服目前临床传统常规使用的癌症治疗方法的技术缺陷，本发明提供已知的普通光敏剂、放敏剂和超敏剂的新用途。本领域技术人员应该理解，术语光敏剂是指对光辐射敏感的试剂，放敏剂是指对放射线(如X射线)敏感的试剂，超敏剂是指对超声波敏感的试剂。在本发明中，将适用于本发明的光敏剂称为“癌症干细胞光敏剂”(也称为“CSC光敏剂”)，将适用于本发明的放敏剂称为“癌症干细胞放敏剂”(也称为“CSC放敏剂”)，和将适用于本发明的超敏剂称为“癌症干细胞超敏剂”(也称为“CSC超敏剂”)，并且将上述“癌症干细胞光敏剂”、“癌症干细胞放敏剂”和“癌症干细胞超敏剂”统称为“癌症干细胞敏感剂”。

本发明涉及癌症干细胞敏感剂在制备抗-癌症干细胞的试剂盒中的应用，其中所述癌症干细胞敏感剂为癌症干细胞光敏剂、癌症干细胞放敏剂或癌症干细胞超敏剂。

其中所述癌症干细胞光敏剂、癌症干细胞放敏剂或癌症干细胞超敏剂具体如下文所定义。

具体而言，在本发明的第一方面中，提供癌症干细胞光敏剂在制备抗-癌症干细胞的试剂盒中的应用。

其中所述CSC光敏剂包括下述化合物：

(1)5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinicacid，ALA)及其衍生物，例如，包括但不限于，甲基-ALA，己基-ALA，辛基-ALA等；

(2)含四吡咯环的光敏化合物，包括：(i)卟啉类的化合物和卟啉类的衍生物，如血卟啉，血卟啉衍生物，Photofrin，原卟啉，原卟啉IX，苯卟啉衍生物，血啉甲醚；(ii)叶绿素类的光敏剂，主要为叶绿素a，b，c，紫红素18等，及其衍生物，例如，包括但不限于，叶绿素衍生物4、甲脂化叶绿素光敏剂等；(iii)不包括TPPS_n(Sulfonatedtetraphenylporphines，磺酸化四甲基卟吩类，其中n取值范围为1-4的整数)和AlPcS_n(Sulfonatedaluminumphthalocyanine，磺酸化酞菁铝，其中n取值范围为1-4的整数)类光敏物；

(3)中药光敏剂，例如，包括但不限于，姜黄素、黄柏、金丝桃素、白芷、独活、蛇床子、被骨脂、补骨脂素或无花果；

(4)ALA或其衍生物分别与上述(2)或(3)中的化合物的组合。

本发明人在研究中发现上述(1)-(4)的癌症干细胞光敏剂除了对波长在一定范围内的可见光敏感之外，也对放射线和超声波敏感。因此，上述癌症干细胞光敏剂除了与波长在一定范围内的可见光结合用于杀伤癌症干细胞之外，也可以与放射线或超声波组合，也能够有效地杀伤癌症干细胞。在此发现的基础上，本发明人主要检验了(1)ALA用作癌症干细胞光敏剂结合可见光照射；(2)ALA用作癌症干细胞放敏剂结合X线辐射；(3)ALA用作癌症干细胞超敏剂结合超声波对癌症干细胞的杀伤效果。

在本发明的第二方面中，提供癌症干细胞放敏剂在制备抗-癌症干细胞的试剂盒中的应用。

所述CSC放敏剂包括：1)在本发明第一方面中所述的癌症干细胞光敏剂，或2)所述癌症干细胞光敏剂与临床已用的放敏剂的组合，包括但不限于乏氧细胞放射增敏剂和非乏氧细胞放射增敏剂，前者包括硝基咪唑类、生物还原剂以及烟酰胺及其衍生物，后者包括前列腺素抑制剂、DNA前体碱基类似物以及某些化疗药物(丝裂霉素、紫杉醇、顺铂等)，以及来自天然的放射增敏物质，如：中药马蔺子甲素、汉防已甲素、青蒿素及它们的衍生物等。

在本发明的第三方面中，提供癌症干细胞超敏剂在制备抗-癌症干细胞的试剂盒中的应用。

所述CSC超敏剂包括：1)在本发明第一方面中所述的癌症干细胞光敏剂，或2)所述癌症干细胞光敏剂与临床已用的超敏剂的组合，包括但不限于用于超声动力学中的声敏剂如镓卟啉(ATX-70)或某些化疗药物(5-氟尿嘧啶，氨甲喋啶、长春新碱)等。

上述应用的原理如下：正常情况下，人体内没有过量的5-氨基酮戊酸(ALA)蓄积。但大量外源性ALA进入体内后，能被癌细胞选择性地吸收，使细胞内积聚过量的具有强光敏性物质的原卟啉IX(protoporphyrinIX，PpIX)(见图4的血红素合成图，含ALA和PpIX的化学结构式)，后者在一定波长的光照下或在X线辐射下或在超声波作用下，发生化学反应，产生单态氧或自由基，引起细胞膜、线粒体和核酸的损伤，使癌细胞坏死、凋亡，从而起到治疗癌症的目的。

ALA作为普通光敏剂的光动力学疗法(Photodynamictherapy，PDT)已在临床上用于治疗皮肤疾病，包括光化性角化病、基底细胞癌、鳞状细胞癌、鲍温病和尿道尖锐湿疣。但ALA作为针对CSC的光敏剂用于抗-CSC治疗癌症(尤指肺癌和乳腺癌)尚没有相关报道。另外，在皮肤ALA-PDT的治疗中，ALA作为外用光敏药(例如，液体或膏剂)外涂在病灶表面。而在应用ALA的CSC靶向疗法治疗中，ALA作为CSC光敏剂、CSC放敏剂或CSC超敏剂(即，ALA除了对光敏感之外，还对X射线和超声波敏感)则使用人体系统用药(治疗流程见图5)，例如，通过静脉注射、点滴、肌肉注射或口服。

相应地，本发明提供了上述抗-CSC的药物，所述药物包含上述光敏剂或光敏剂组合作为活性成分。

如人们所意识到的，PDT疗法在临床使用时的缺陷是由于光对组织穿透力的限度，ALA-PDT仅限于体表肿瘤的治疗。X线和超声波都有对组织很好的穿透能力。目前已发现X线或超声波与光敏剂结合能够治疗肿瘤(PhotochemPhotobiolSci.，Sep；1(9)：686-9，2002；CancerChemotherPharmacol.，Feb；51(2)：174-8.，2003)。但将光敏剂作为CSC放敏剂或CSC超敏剂用于抗CSC治疗尚无报道。

在本发明的第四方面中，还提供用于治疗受试者中的癌症的抗-癌症干细胞试剂盒，所述试剂盒包括：

(1)本发明所述的癌症干细胞敏感剂(即，癌症干细胞光敏剂、癌症干细胞放敏剂或癌症干细胞超敏剂)，以及

(2)能够发出波长在400nm-900nm范围内的可见光的发光器，或能够辐射出剂量大于或等于1Gy的X线的放疗机，或能够产生强度大于或等于20kHz的超声波的超声器。

具体而言，所述试剂盒可以是用于癌症干细胞光靶向疗法(Photo-CSCTargetingTherapy，即PCTT)的试剂盒，所述试剂盒包括：

(a)本发明第一方面中所述的CSC光敏剂；以及

(b)能够发出波长在400nm-900nm范围内的可见光的发光器。

所述试剂盒还可以是用于癌症干细胞放射靶向疗法(Radio-CSCTargetingTherapy，即RCTT)的试剂盒，所述试剂盒包含：

(a)本发明第二方面中所述的CSC放敏剂；以及

(b)能够辐射出剂量大于或等于lGy的X线的放疗机。

所述试剂盒还可以是用于癌症干细胞超声靶向疗法(Sono-CSCTargetingTherapy，即SCTT)的试剂盒，所述试剂盒包含：

(a)本发明第三方面中所述的CSC超敏剂；以及

(b)能够产生强度大于或等于20kHz的超声波的超声器。

上述各试剂盒使用流程如图5所示，即对患有癌症的受试者施用有效量的CSC敏感剂包括：PCTT光敏剂或RCTT放敏剂或SCTT超敏剂，然后对所述受试者的癌症病灶进行光照或X线辐射或超声波处理，持续作用适当时间后，能够将癌症干细胞杀死。从而起到彻底治疗癌症的效果。

其中所述CSC敏感剂(优选ALA及其衍生物或它们与其它普通光敏剂的组合物)可以通过静脉注射或点滴、肌肉注射、口服或局部给药施用到癌症病灶部位，将优先被癌症干细胞选择性地吸收。并且，可以制成合适的剂型，例如，适于系统用药的溶液剂、粉针剂、片剂或胶囊剂等，适于局部用药的液体制剂、半固体制剂、固体制剂或气体制剂等。

其中所用的可见光可以是在400-900nm间单波长或复合波长的可见光，可以通过相干光源或非相干光源发射，包括激光，LED(由发光二极管发射)和普通光，适用的普通光发光器包括但不限于，日光灯、白炽灯、卤钨灯或低压钠灯。给光方式包括但不限于，表面照射、组织内插入照射和内窥镜引导照射等。例如，在手术前可以应用内窥镜引导的癌组织表面或组织内照射；在手术过程中可以在手术切除癌灶后在切除处进行光表面照射；或者在手术后，应用内窥镜引导的癌组织表面照射。

其中所用的X线放疗机包括但不限于临床使用的直线加速器，立体定向放疗(x刀)，三维适形放疗(3DCRT)，逆向调强放疗(IMRT)，图像引导放疗(IGRT)，容积弧形调强放疗(VMAT)等。

其中所用的超声器包括但不限于临床使用的低强度或高强度超声仪(含超声诊断仪和超声理疗仪)，聚焦超声刀等。其可发出脉冲或连续超声波。

本发明的试剂盒适用的受试者为哺乳动物，优选是人。

可以使用本发明的试剂盒进行治疗的癌症可以包括所有临床治疗的癌症，优选是肺癌、乳腺癌、大肠癌或脑癌。

在本发明的第五方面中，还提供通过抑制癌症干细胞治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的癌症细胞敏感剂，然后向癌灶施加治疗有效量的可见光或X射线或超声波。

其中所述癌症干细胞敏感剂选自癌症干细胞光敏剂、癌症干细胞放敏剂或癌症干细胞超敏剂。它们各自的定义如本发明第一、二、三方面所述。

所述受试者为哺乳动物，优选是人。

可以用本发明治疗的癌症可以包括所有临床治疗的癌症，优选是肺癌、乳腺癌、大肠癌或脑癌。

所述可见光的波长在400nm-900nm范围内，所述X射线的剂量大于或等于1Gy，所述超声波的强度大于或等于20kHz。

综上所述，本发明提供下述方案：

1.癌症干细胞敏感剂在制备抗-癌症干细胞的试剂盒中的应用，其中所述癌症干细胞敏感剂为癌症干细胞光敏剂、癌症干细胞放敏剂或癌症干细胞超敏剂。

2.根据第1项所述的应用，其中所述癌症干细胞光敏剂选自：

(1)5-氨基酮戊酸或其衍生物；

(2)含四吡咯环的光敏化合物；

(3)中药光敏剂；或

(4)5-氨基酮戊酸或其衍生物分别与(2)或(3)中的化合物的组合。

3.根据第2项所述的应用，其中所述5-氨基酮戊酸的衍生物选自甲基-ALA、己基-ALA或辛基-ALA。

4.根据第2项所述的应用，其中所述含四吡咯环的光敏化合物包括：

(i)卟啉类的化合物和卟啉类的衍生物；

(ii)叶绿素类的光敏剂；

但不包括：磺酸化四甲基卟吩类TPPS_n类光敏物，其中n取值范围为1-4的整数，和磺酸化酞菁铝AlPcS_n类光敏物，其中n取值范围为1-4的整数。

5.根据第4项所述的应用，其中所述卟啉类的化合物和卟啉类的衍生物选自血卟啉，血卟啉衍生物，Photofrin，原卟啉，原卟啉IX，苯卟啉衍生物，血啉甲醚；所述叶绿素类的光敏剂选自叶绿素a，b，c，紫红素18或它们的衍生物，例如，叶绿素衍生物4或甲脂化叶绿素。

6.根据第2项所述的应用，其中所述中药光敏剂选自姜黄素、黄柏、金丝桃素、白芷、独活、蛇床子、被骨脂、补骨脂素或无花果。

7.根据第1项所述的应用，其中所述癌症干细胞放敏剂为1)第2项所述的癌症干细胞光敏剂，或2)第2项所述的癌症干细胞光敏剂与临床已用的放敏剂的组合，所述临床已用的放敏剂包括：乏氧细胞放射增敏剂、非乏氧细胞放射增敏剂或天然的放射增敏物质，其中所述乏氧细胞放射增敏剂选自硝基咪唑类、生物还原剂以及烟酰胺及其衍生物；所述非乏氧细胞放射增敏剂选自前列腺素抑制剂、DNA前体碱基类似物以及某些化疗药物，例如丝裂霉素、紫杉醇、顺铂；所述天然的放射增敏物质选自马蔺子甲素、汉防已甲素、青蒿素及它们的衍生物。

8.根据第1项所述的应用，其中所述癌症干细胞超敏剂为1)第2项所述的癌症干细胞光敏剂，或2)第2项所述的癌症干细胞光敏剂与临床已用的超敏剂的组合，所述临床已用的超敏剂包括：用于超声动力学中的声敏剂如镓卟啉(ATX-70)或某些化疗药物，例如5-氟尿嘧啶、氨甲喋啶、长春新碱。

9.根据第1项所述的应用，其中所述抗-癌症干细胞试剂盒用于哺乳动物，优选用于人。

10.根据第1项所述的应用，其中所述抗-癌症干细胞试剂盒用于治疗所有临床治疗的癌症，优选是肺癌、乳腺癌、大肠癌或脑癌。

11.癌症干细胞光敏剂在制备抗-癌症干细胞的试剂盒中的应用，其中所述癌症干细胞光敏剂如第2项所述。

12.一种用于治疗受试者中的癌症的抗-癌症干细胞试剂盒，所述试剂盒包括：

(1)第1项所述的癌症干细胞敏感剂，以及

(2)能够发出波长在400-900nm范围内的可见光的发光器；或

能够辐射出剂量大于/等于1Gy的X线的放疗机；或

能够产生强度大于/等于20kHz的超声波的超声器。

13.根据第12项所述的试剂盒，其中所述癌症干细胞敏感剂为第2项所述的癌症干细胞光敏剂，或第2项所述的癌症干细胞光敏剂与普通放敏剂或普通超敏剂的组合物。

14.根据第12项所述的试剂盒，其中所述癌症干细胞敏感剂是癌症干细胞放敏剂，所述癌症干细胞放敏剂为第2项所述的癌症干细胞光敏剂或第2项所述的癌症干细胞光敏剂与临床已用的放敏剂的组合，所述临床已用的放敏剂的组合包括乏氧细胞放射增敏剂、非乏氧细胞放射增敏剂或天然的放射增敏物质，其中所述乏氧细胞放射增敏剂选自硝基咪唑类、生物还原剂以及烟酰胺及其衍生物；所述非乏氧细胞放射增敏剂选自前列腺素抑制剂、DNA前体碱基类似物以及某些化疗药物，例如丝裂霉素、紫杉醇、顺铂；所述天然的放射增敏物质选自马蔺子甲素、汉防已甲素、青蒿素及它们的衍生物。

15.根据第12项所述的试剂盒，其中所述癌症干细胞敏感剂是癌症干细胞超敏剂，所述癌症干细胞超敏剂为第2项所述的癌症干细胞光敏剂或第2项所述的癌症干细胞光敏剂与临床已用的超敏剂的组合，所述临床已用的超敏剂包括：用于超声动力学中的声敏剂如镓卟啉(ATX-70)或某些化疗药物，例如5-氟尿嘧啶、氨甲喋啶、长春新碱。

16.根据第13项所述的试剂盒，其中所述癌症干细胞光敏剂为5-氨基酮戊酸或其衍生物或它们与其它普通光敏剂的组合物。

17.根据第12项所述的试剂盒，其中所述受试者为哺乳动物，优选是人。

18.根据第12项所述的试剂盒，其中所述癌症为所有临床治疗的癌症，优选是肺癌、乳腺癌、大肠癌或脑癌。

19.通过抑制癌症干细胞治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的第1项所述的癌症细胞敏感剂，然后向癌灶施加治疗有效量的可见光或X射线或超声波。

20.根据第19项所述的方法，其中所述受试者为哺乳动物，优选是人。

21.根据第19项所述的方法，其中所述癌症为所有临床治疗的癌症，优选是肺癌、乳腺癌、大肠癌或脑癌。

22.根据第19项所述的方法，其中所述可见光的波长在400nm-900nm范围内，所述X射线的剂量大于或等于1Gy，所述超声波的强度大于或等于20kHz。

本发明的优点在于：目前世界上尚没有能够有效杀死CSC的治疗方法/治疗药物，是本发明人首次发现了普通光敏剂ALA结合特定波长的可见光能够杀死肺癌及乳腺癌CSC(特别是对肺癌，此方法还能特异性选择性的杀死癌组织中的CSC细胞，见下面实施例和图9所示)。本发明将此方法定义为CSC光靶向疗法-PCTT。PCTT使得传统PDT疗法有了新的用途，即杀死CSC。同时本发明人首次发现了ALA也可以用作抗CSC放射敏感剂和超声敏感剂，可以结合或不结合本领域中常用的放敏剂或超敏剂，结合放射性或超声波来治疗癌症，即本发明提供了ALA敏化的CSC放射靶向疗法-RCTT和ALA敏化的CSC超声靶向疗法-SCTT。RCTT不但能有效的增加放疗对CSC的杀伤作用，同时还能降低放疗使用剂量，减少放疗对正常组织的损害。而SCTT开创了传统超声疗法的新用途，即抗CSC作用。如前所述，目前临床上常规使用的癌症治疗方法放疗和化疗均对CSC不敏感，甚至还会起到相反作用，即放疗/化疗后癌组织内的CSC反而富集增多，导致癌的恶性程度增高。所以单纯的放疗/化疗不能有效的杜绝癌的复发、转移及恶化。本发明的PCTT法，RCTT法和SCTT法提供了克服这一缺陷的癌症治疗方法。

附图说明

从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：

图1示意常规抗癌药物与本发明阐述的抗-癌症干细胞药物对癌组织的杀伤效果。

图2示意针对癌症干细胞(中间的黄色细胞)和针对非-癌症干细胞(周围的蓝色细胞)治疗的不同结果。

图3显示乳腺癌癌症干细胞百分比值在化疗后从疗前的5％增加至化疗后的76％(数据来自文献-Cell，No.131，p1109，2007)。

图4显示细胞内血红素的生物合成途径，其中显示了四吡咯环侧链，其中P代表-CH2-CH2-COOH，A代表-CH2-COOH，V代表-CH＝CH2，M代表-CH3。包括5-氨基酮戊酸(ALA)和原卟啉IX(PPIX)的化学结构。

图5示意癌症干细胞(CSC)敏感剂诱导的CSC靶向疗法治疗CSC流程图。

图6显示流式细胞仪分析肺癌细胞各亚群的结果，其中癌症干细胞为FITC-CD44++APC-CD90+亚群细胞(P2)，非-癌症干细胞为：FITC-CD44++APC-CD90-亚群细胞(P4)，FITC-CD44+APC-CD90+亚群细胞(P1)和FITC-CD44+APC-CD90-亚群细胞(P3)。

图7显示肺癌癌症干细胞和肺癌非-癌症干细胞细胞球的形成(×400)，其中图A和C显示肺癌癌症干细胞；图B和D显示肺癌非-癌症干细胞。

图8所示ALA诱发的PpIX在肺癌癌症干细胞(B)和肺癌非-癌症干细胞(A)内的荧光显示。

图9显示ALA癌症干细胞光靶向疗法(PCTT，图B)与放疗(X线，图A)对肺癌干细胞(CSC)和肺癌非-癌症干细胞(NCSC)杀伤效应的比较。

图10显示单独的癌干细胞光敏剂ALA(A)或单独的光辐射(B)对肺癌癌症干细胞(CSC)和非-癌症干细胞(NCSC)的影响。

图11显示放疗或PCTT多次疗法对肺癌干细胞(CSC)百分比的影响，其中图A显示治疗前肺癌CSC的百分比为1.17％；图B显示放疗后肺癌CSC的百分比增至为6.02％；图C显示PCTT疗法后肺癌CSC百分比降至为0.05％。

图12显示流式细胞仪分析的乳腺癌细胞MCF-7(图A)和SKBR-3(图B)的亚群。其中癌症干细胞亚群为FITC-CD44+PE-CD24-。

图13显示X射线放疗(图A)或PCTT疗法(图B)对MCF-7乳腺癌癌症干细胞(CSC)和非-癌症干细胞(NCSC)的杀伤效应。

图14显示X射线放疗或PCTT疗法对SKBR-3乳腺癌癌症干细胞(CSC)和非-癌症干细胞(NCSC)的杀伤效应，其中①表示2Gy(1分钟)X射线辐射SKBR-3乳腺癌CSC后的细胞死亡率，②表示2Gy(1分钟)X射线辐射此乳腺癌NCSC后的细胞死亡率，③表示1分钟ALA-PCTT后此乳腺癌CSC的细胞死亡率，④表示1分钟ALA-PCTT后此乳腺癌NCSC的细胞死亡率。

图15显示不同剂量X线放疗本身或X线结合ALA即RCTT疗法对肺癌癌症干细胞(CSC)的杀伤效应。

图16显示放疗(X线)结合ALA即RCTT疗法与单独放疗对肺癌干细胞(CSC)和肺癌非-癌症干细胞(NCSC)杀伤效应的比较。图A，细胞来自原代培养的肺鳞状上皮细胞癌，从左至右依次为：2Gy(1分钟)X射线辐射肺癌CSC，1分钟RCTT处理肺癌CSC，2Gy(1分钟)X射线辐射肺癌NCSC，1分钟RCTT处理肺癌NCSC；图B，细胞来自原代培养的肺腺癌，从左至右依次为：2Gy(1分钟)X射线辐射肺癌CSC，1分钟RCTT处理肺癌CSC，2Gy(1分钟)X射线辐射肺癌NCSC，1分钟RCTT处理肺癌NCSC。

图17显示单独超声波(图A)或超声波结合ALA即SCTT疗法(图B)对肺癌癌症干细胞(CSC)和肺癌非-癌症干细胞(NCSC)的杀伤效应。

具体实施方式

下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。

I.实验材料

DefinedK-SFM无血清培养基、RPMI1640、PBS、II型胶原酶、细胞消化酶TrypLE^EMExpress购自Invitrogen公司。CD44-FITC、CD90-APC，CD24-PE及相应的同型对照抗体购自BD公司。细胞增殖检测试剂盒MTS购自Promega公司。超低粘附96孔培养板、普通培养瓶及培养板购自Corning公司。5-氨基酮戊酸(ALA)购自Sigma公司。

II.实验方法

1.肺癌原代细胞培养及建系

取新鲜手术切除的肺癌组织，在6孔板中用含青霉素及链霉素的RPMI1640反复冲洗并剔除坏死组织后，用无菌剪刀剪切成约1mm³大小的组织块。收集剪切后的肿瘤组织小块在底面积为25em²的培养瓶中，在加入含II型胶原酶的DefinedK-SFM无血清培养基后放入5％CO₂，37℃培养箱中。随后收集消化后的肺癌细胞。用DefinedK-SFM培养基悬浮细胞，后转移到25cm²的培养瓶中，继续在5％CO₂的培养箱中37℃培养。当细胞贴壁生长到70％-80％融合时，用TrypLE^EMExpress消化酶消化后传代。

2.乳腺癌体外已建细胞系培养

MCF-7(ATCC，HTB-22)和SKBR-3细胞(ATCC，HTB-30)均是已建人乳腺癌细胞系。当用培养液RPMI1640培养两种细胞时，它们呈贴壁生长。但用DefinedK-SFM无血清培养基培养时，它们变转成悬浮生长，此时带CD44+CD24-标记的乳腺癌CSC比值也明显增高。

3.流式细胞术分析及分选癌症干细胞

取对数生长期的肺癌细胞系和乳腺癌细胞系，调整细胞密度浓度为1×10⁷/ml。肺癌细胞加入CD44-FITC及CD90-APC抗体孵育20min，乳腺癌细胞加入CD44-FITC及CD24-PE抗体孵育30min。

应用FACSAriaII流式细胞仪(BDBioscience，USA)分析或分选待检的细胞。细胞样品上机后，收集30,000～50,000个细胞，应用BDFACSDiva软件分析。依据不同抗体的荧光标记特性，分析相应的目的细胞，即CSC和NCSC。最后将目的细胞无菌分选到分选管或96孔板中，进行后续实验。

4.CSC和NCSC细胞球形成实验

在超低粘附的培养板上能否形成细胞球是CSC的主要特点之一。将用流式细胞仪分选的不同亚群细胞，CSC和NCSC培养于超低粘附的96孔培养板中，每孔100个细胞，每孔加入200μlDefinedK-SFM培养基。定期用倒置显微镜观察各孔中细胞形成细胞球的情况。并记录照相。细胞数大于50个的细胞团计为1个细胞球。

5.用5-氨基酮戊酸(ALA)孵育CSC和NCSC细胞

将流式细胞仪分选的CSC和NCSC细胞培养于96孔培养板中，每孔500个细胞，用200μl/孔的DefinedK-SFM无血清培养基培养。每种细胞设5个复孔。细胞在培养箱内过夜培养后，首先用上述无血清培养液洗涤两次，然后在此培养液中加入(避光操作)1mM的ALA孵育4小时。

6.CSC和NCSC细胞内ALA诱发的PpIX荧光检测

在用流式细胞分选后，将约300个CSC或NCSC细胞放入直径35mm的培养皿中培养过夜。然后添加1mMALA孵育4小时。PBS洗涤后在细胞上放置盖玻片移致荧光显微镜下检测细胞内PpIX的荧光强度(PpiX的荧光强度与ALA的含量成正比)。荧光显微镜为NikonEclipseE800，Japan.一个380～420nm的激发滤光器，430nm的光束分离器和450nm的长波发射滤波器被使用于此荧光检测中。

7.可见光、超声波或X射线照射CSC和NCSC细胞

将流式细胞仪分选的不同亚群细胞，即CSC和NCSC细胞培养于96孔培养板中，每孔500个细胞，用200μl/孔的DefinedK-SFM培养基培养。每种细胞设5个复孔。经过24h培养后，分别给予1Gy、2Gy、3Gy和4Gy的X线照射，或在加入1mMALA4小时后(a)分别给予5秒，10秒，30秒和60秒的可见光照射；或(b)分别给予10秒，30秒，60秒和120秒的超声波；或(c)分别给予1Gy、2Gy、3Gy和4Gy的X线照射。

对多次放疗实验组：X线照射为每次剂量2.5Gy，每3天一次照射，共照射3次。ALA-PCTT为每次给予1mMALA，4小时后光照30秒，每3天一次PCTT，共3次。

所用的X射线发射源为SiemensStabilipan放射机(SiemensIndustry，Germany)：总输出200kV，20mA；强度5.3Gy/min，加一0.5mm铜滤器。

所用的可见光照射源为4管荧光灯(PhilipsTLK40W/03，Eindhoven，TheNetherlands)：波长400-460nm，功率密度10mW/cm²。

所用的超声波为ElmasonicS超声器(ElmaHansSchmidbauerGmbH，Germany)：强度30kHz，功率密度0.19W/cm²，连续超声波。

除非另外指明，下述实施例中的可见光照射源、X射线发射源和超声器均同上所述。

8.细胞存活率检测(MTS)

MTS(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium)被称作一步法MTT。MTT是用于测量细胞活性的试验方法。可利用测吸光度得知细胞还原MTT的能力，此吸光度代表了线粒体活性，即活细胞数目。

当肺及乳腺癌CSC和NCSC细胞在光或超声波或X线照射后，继续在37℃培养箱内培养至第6天。然后每孔中加20μl的MTS，在含5％CO₂的培养箱中37℃培养3h。应用酶标仪在490nm波长下检测各孔的吸光度值(D)。被照射各组细胞的细胞死亡率计算公式为：

死亡率％＝(1-试验孔D值/对照孔D值)×100％。

实施例1.流式细胞仪分析肺癌细胞各亚群，筛选并分离肺癌CSC细胞

从人体肺癌组织中分离、鉴定肺癌CSC，为进一步研究肺癌CSC的靶向疗法奠定基础。

方法：II型胶原酶消化新鲜切除的人体肺癌组织，用无血清培养基原代培养肺癌细胞，传代后建立细胞系。应用流式细胞分析及分选技术，从该细胞系前3代的细胞中寻找肺癌CSC。应用单细胞克隆形成实验、平板集落形成试验及细胞球形成实验研究肺癌CSC的生物学特性。人体原代肺癌细胞系鉴定CSC的详细方法和结果可参见文献：PLOSONE，Vol8(3)，2013。

结果：应用原代细胞培养技术成功地从肺癌组织中培养出高纯度的原代癌细胞。流式细胞仪分析显示应用CD44和CD90标记抗体可将此肺癌细胞分为4群，分别是CD44⁺CD90⁺、CD44⁺CD90^-、CD44⁺⁺CD90⁺和CD44⁺⁺CD90^-细胞，其中CD44⁺⁺CD90⁺细胞比例为1.17％。相比于其它细胞亚群，CD44⁺⁺CD90⁺形成细胞球的能力最强，提示此群细胞具有肺癌CSC特性。见图6，图7。从图7中可以看出，肺癌CSC(图7A，C)可形成细胞球，而NCSC(图7B，D)不能形成细胞球(×400)。

实施例2.ALA诱发的PpIX在肺癌CSC和NCSC细胞内的荧光显示

比较肺癌CSC(CD44⁺⁺CD90⁺细胞)和肺癌NCSC(CD44⁺CD90^-细胞)内ALA诱导的PpIX荧光强度。PpIX荧光强度可反映细胞内ALA的含量。

方法：将流式细胞仪分选出的肺癌CSC和肺癌NCSC分别收集培养，后给予CSC光敏剂-ALA1mM，在37℃孵育4小时，用荧光显微镜检测各自细胞内PpIX的荧光及其强度。

结果：肺癌CSC和肺癌NCSC细胞内均有PpIX荧光定位。且CSC的荧光强度高于NCSC。结果见图8，PpIX荧光在肺癌CSC和肺癌NCSC细胞内分布模式相近，但荧光强度上CSC细胞略强，提示肺癌CSC摄取ALA和/或产生PpIX的能力强于NCSC。

实施例3.PCTT疗法(CSC光敏剂+光)与放疗(X线照射)对肺癌CSC和NCSC杀伤效应的比较

将肺癌CSC和肺癌NCSC分别给予PCTT和放疗，比较CSC和NCSC细胞对两种疗法的敏感性。

方法：将流式细胞仪分选出的CSC和NCSC细胞分别在体外培养。后各自给予PCTT(1mMALA，4小时+可见光照射5-60秒，波长400-460nm)或放疗(1戈瑞(Gy)，2Gy，3Gy和4Gy的X射线照射)。

结果：参见图9-11。

1.CSC比NCSC对放疗更不敏感；

2.PCTT不但能杀死CSC和NCSC，而且对CSC有选择性的杀伤作用，即CSC死亡率高于NCSC死亡率；

3.一分钟的PCTT可灭活将近90％的CSC，而一分钟(2Gy)的放疗只能灭活约25％的CSC；

4.当模拟临床治疗，即，细胞给予多次放疗时，不但没有增加CSC对放疗的敏感性，反而使得CSC的百分比值增高。与其相反，多次PCTT能使CSC百分比显著降低(图11)。

图1O显示单独的癌干细胞光敏剂-ALA或单独的光辐射对肺癌CSC和NCSC的杀伤作用近于零作用。

图11显示放疗或PCTT多次疗法对肺癌CSC百分比的影响，可以明显看出，1)多次X线照射导致CSC细胞百分比从治疗前的1.17％增至6.02％；2)多次PCTT疗法后CSC细胞百分比从治疗前的1.17％降至0.05％。

实施例4.PCTT疗法对乳腺癌CSC的杀伤效果

利用流式细胞仪从已建人体乳腺癌细胞系MCF-7和SKBR-3细胞中分离出带表面因子CD44⁺CD24-乳腺癌细胞。CD44⁺CD24-标记的乳腺癌细胞已被公认为具有乳腺癌CSC特性。

方法：将分离到的CD44+CD24-乳腺癌CSC体外培养，后分别给予PCTT(1mMALA，4小时+可见光照射5-60秒)或放疗(1戈瑞(Gy)，2Gy，3Gy和4Gy的X射线照射)。

结果：图12A和12B分别显示流式细胞仪分析的乳腺癌细胞MCF-7和SKBR-3的亚群。图13和14分别显示X线放疗或PCTT疗法对MCF-7或SKBR-3乳腺癌CSC和NCSC的杀伤效应。从中可以看出：

1.与肺癌CSC相同，乳腺癌CSC比NCSC对放疗更不敏感；

2.乳腺癌CSC对PCTT的敏感性比对放疗高；

3.PCTT对乳腺癌CSC和NCSC细胞均有有效的杀伤作用，但PCTT对乳腺癌CSC没有更选择性的杀伤效应；

4.一分钟的PCTT可灭活近50％的乳腺癌CSC，而一分钟(2Gy)的放疗只能灭活约15-20％的乳腺癌CSC。

实施例5.RCTT疗法(CSC放敏剂+X线)与单独的放疗(X线)对肺癌CSC和NCSC杀伤效应的比较

方法：将流式细胞仪分选出的CSC和NCSC细胞分别在体外培养。后各自给予RCTT(1mMALA4小时+X线辐射1-4Gy)或单独X线辐射。

结果：参见图15和16。

1.ALA与X线结合使用(RCTT)对肺癌CSC的杀伤效应明显高于X线本身。结果见图15。

2.与单独X线作用比较，ALA结合X线(RCTT)对肺鳞状上皮细胞癌CSC(图16A)的杀伤作用要高于对肺腺癌CSC(图16B)。

3.图16A显示ALA结合X线选择性的提高了对肺鳞状上皮细胞癌CSC的杀伤。

4.图16B显示ALA结合X线对肺腺癌CSC和NCSC的杀伤作用均有提高。

实施例6.SCTT疗法(CSC超敏剂+超声波)与单独超声对肺癌CSC和NCSC杀伤效应的比较

方法：将流式细胞仪分选出的CSC和NCSC细胞分别在体外培养。后各自给予SCTT(1mMALA4小时+超声波10-120秒)或单独超声。

结果：见图17。

1.单独超声对肺癌CSC和NCSC的杀伤作用小于5％。

2.超声结合ALA(SCTT)对肺癌CSC和NCSC都能产生明显的杀伤作用，且对CSC的杀伤效应强于NCSC。

3.随着超声时间的延长，超声结合ALA对肺癌CSC的杀伤作用更显著。

Claims (12)

1.5-氨基酮戊酸ALA或其衍生物在制备抗-癌症干细胞的试剂盒中的应用，其中所述抗-癌症干细胞的试剂盒还包含能够发出波长在400-900nm范围内的可见光的发光器，或能够辐射出剂量大于或等于1Gy的X线的放疗机或能够产生强度大于或等于20kHz的超声波的超声器，并且所述5-氨基酮戊酸ALA的衍生物选自甲基-ALA、己基-ALA或辛基-ALA。

2.根据权利要求1所述的应用，其中所述抗-癌症干细胞的试剂盒还包含中药光敏剂，其中所述中药光敏剂选自姜黄素、黄柏、金丝桃素、白芷、独活、蛇床子、被骨脂、补骨脂素或无花果。

3.根据权利要求1所述的应用，其中所述抗-癌症干细胞的试剂盒还包含卟啉类的化合物和叶绿素类的光敏剂，其中所述卟啉类的化合物选自血卟啉，Photofrin，原卟啉，原卟啉IX，血啉甲醚；所述叶绿素类的光敏剂选自叶绿素a，b，c，紫红素18或甲脂化叶绿素。

4.根据权利要求1所述的应用，其中所述抗-癌症干细胞的试剂盒还包含普通放敏剂或普通超敏剂，其中所述普通放敏剂选自乏氧细胞放射增敏剂、非乏氧细胞放敏增敏剂或天然的放射增敏物质，其中所述的乏氧细胞放射增敏剂选自生物还原剂或烟酰胺，所述非乏氧细胞放射增敏剂选自前列腺素抑制剂、丝裂霉素、紫杉醇或顺铂，所述天然的放射增敏物质选自马蔺子甲素、汉防已甲素或青蒿素；所述普通超敏剂选自镓卟啉、5-氟尿嘧啶、氨甲喋啶或长春新碱。

5.一种用于治疗受试者中的癌症的抗-癌症干细胞试剂盒，所述试剂盒包括：

(1)5-氨基酮戊酸ALA或其衍生物，以及

(2)能够发出波长在400-900nm范围内的可见光的发光器；或

能够辐射出剂量大于或等于1Gy的X线的放疗机；或

能够产生强度大于或等于20kHz的超声波的超声器，

其中所述5-氨基酮戊酸ALA的衍生物选自甲基-ALA、己基-ALA或辛基-ALA。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述抗-癌症干细胞的试剂盒还包含普通放敏剂或普通超敏剂，其中所述普通放敏剂选自乏氧细胞放射增敏剂、非乏氧细胞放敏增敏剂或天然的放射增敏物质，其中所述的乏氧细胞放射增敏剂选自生物还原剂或烟酰胺，所述非乏氧细胞放射增敏剂选自前列腺素抑制剂、丝裂霉素、紫杉醇或顺铂，所述天然的放射增敏物质选自马蔺子甲素、汉防已甲素或青蒿素；所述普通超敏剂选自镓卟啉、5-氟尿嘧啶、氨甲喋啶或长春新碱。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述抗-癌症干细胞的试剂盒还包含中药光敏剂，其中所述中药光敏剂选自姜黄素、黄柏、金丝桃素、白芷、独活、蛇床子、被骨脂、补骨脂素或无花果。

8.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述抗-癌症干细胞的试剂盒还包含卟啉类的化合物和叶绿素类的光敏剂，其中所述卟啉类的化合物选自血卟啉，Photofrin，原卟啉，原卟啉IX，血啉甲醚；所述叶绿素类的光敏剂选自叶绿素a，b，c，紫红素18或甲脂化叶绿素。

9.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述受试者为哺乳动物。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中所述受试者为人。

11.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述癌症为所有临床治疗的癌症。

12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、大肠癌或脑癌。