JP2014097945A - チロシナーゼ誘導抑制剤及びメラニン合成抑制剤 - Google Patents
チロシナーゼ誘導抑制剤及びメラニン合成抑制剤 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2014097945A JP2014097945A JP2012249917A JP2012249917A JP2014097945A JP 2014097945 A JP2014097945 A JP 2014097945A JP 2012249917 A JP2012249917 A JP 2012249917A JP 2012249917 A JP2012249917 A JP 2012249917A JP 2014097945 A JP2014097945 A JP 2014097945A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- takakuma
- extract
- murasaki
- melanin synthesis
- melanin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Cosmetics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
【課題】シミやソバカス等の色素沈着を効果的に予防、治療することができるチロシナーゼ誘導抑制剤及びメラニン合成抑制剤を提供する。さらに当該チロシナーゼ誘導抑制剤又はメラニン合成抑制剤を用いた化粧料及び医薬組成物を提供することを目的とする。
【解決手段】タカクマムラサキ又はその抽出物を有効成分とするチロシナーゼ誘導抑制剤、及びメラニン合成抑制剤であり、これらチロシナーゼ誘導抑制剤又はメラニン合成抑制剤を用いた化粧料及び医薬組成物である。
【選択図】図3
【解決手段】タカクマムラサキ又はその抽出物を有効成分とするチロシナーゼ誘導抑制剤、及びメラニン合成抑制剤であり、これらチロシナーゼ誘導抑制剤又はメラニン合成抑制剤を用いた化粧料及び医薬組成物である。
【選択図】図3
Description
本発明は、チロシナーゼ誘導抑制剤及びメラニン合成抑制剤に関する。さらに本発明は、チロシナーゼ誘導抑制剤又はメラニン合成抑制剤を用いた化粧料、及び医薬組成物に関する。
シミ、ソバカス等の色素沈着は、太陽光等による紫外線の曝露、ホルモンバランスの異常等により、皮膚内に存在するメラニン細胞(メラノサイト)内において、メラニンが過剰生産されることにより生じることが知られている。メラニンは、チロシナーゼの作用により、必須アミノ酸であるチロシンからドーパキノンを合成し、このドーパキノンが酸化、重合して合成される。このメラニン合成経路をターゲットとしたメラニン合成抑制剤のスクリーニングが精力的に行われており、各種植物の抽出物にメラニン合成の抑制作用があることが報告されている。
例えば、トウセンダン、ソウカ、セネシオグラシリス、及びコクリロの抽出物は、チロシナーゼ活性の抑制作用を備えており、美白作用に有効であることが報告されている(特許文献1)。
カカオニブ、カカオマス、ココア、及びこれらの抽出物は、メラニンの合成抑制作用を備えており、シミ、ソバカス等の色素沈着の予防や治療に有効であることが報告されている(特許文献2)。
特許文献1及び特許文献2に記載の植物には、メラニン合成を抑制する作用があることが開示され、一部の食品、化粧品、医薬品等の各種製品に配合されて実用化されているものもある。しかしながら、メラニン合成抑制効果、及びその安定性については、必ずしも満足のいくものではなかった。
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、チロシナーゼの誘導抑制作用と、メラニンの合成抑制作用とを備え、シミやソバカス等の色素沈着を効果的に予防、治療することができるチロシナーゼ誘導抑制剤又はメラニン合成抑制剤を提供することを目的とする。さらに当該チロシナーゼ誘導抑制剤又はメラニン合成抑制剤を用いた化粧料、及び医薬組成物を提供することを目的とする。
即ち、本発明は以下の発明を含む。
[発明1]
タカクマムラサキ又はその抽出物を有効成分とするチロシナーゼ誘導抑制剤。
[発明2]
タカクマムラサキ又はその抽出物を有効成分とするメラニン合成抑制剤。
[発明3]
還元剤を含有する発明2に記載のメラニン合成抑制剤。
[発明4]
発明1に記載のチロシナーゼ誘導抑制剤、あるいは発明2又は3に記載のメラニン合成抑制剤を含有する化粧料。
[発明5]
発明1に記載のチロシナーゼ誘導抑制剤、あるいは発明2又は3に記載のメラニン合成抑制剤を含有する医薬組成物。
[発明1]
タカクマムラサキ又はその抽出物を有効成分とするチロシナーゼ誘導抑制剤。
[発明2]
タカクマムラサキ又はその抽出物を有効成分とするメラニン合成抑制剤。
[発明3]
還元剤を含有する発明2に記載のメラニン合成抑制剤。
[発明4]
発明1に記載のチロシナーゼ誘導抑制剤、あるいは発明2又は3に記載のメラニン合成抑制剤を含有する化粧料。
[発明5]
発明1に記載のチロシナーゼ誘導抑制剤、あるいは発明2又は3に記載のメラニン合成抑制剤を含有する医薬組成物。
本構成のチロシナーゼ誘導抑制剤及びメラニン合成抑制剤は、チロシナーゼの誘導抑制及びメラニンの合成抑制に優れた効力を発揮し、皮膚におけるメラニンの生成を効果的に抑制することができる。
以下、本発明に係るチロシナーゼ誘導抑制剤及びメラニン合成抑制剤、並びに、当該チロシナーゼ誘導抑制剤又はメラニン合成抑制剤を用いた化粧料及び医薬組成物に関する実施形態を説明する。ただし、本発明は、以下に説明する実施形態に記載される構成に限定されることを意図しない。
クマツヅラ科(Verbenaceae)に属するタカクマムラサキ(Callicarpa longissima (Hemsl.) Merr.)は、中国南部や台湾で広く分布する植物であり、民間薬で消腫(腫れを抑えること)や、止血等に用いられている。しかし、この植物が、チロシナーゼの誘導を抑制したり、メラニンの合成を抑制したりすることは知られていない。
本発明者らは、タカクマムラサキについて鋭意検討を重ねた結果、タカクマムラサキ又はその抽出物が、チロシナーゼの誘導抑制作用と、メラニンの合成抑制作用とを備えていることを見出し、本研究を完成させた。
本発明のタカクマムラサキ又はその抽出物を含有するチロシナーゼ誘導抑制剤及びメラニン合成抑制剤は、色素沈着の疾患の予防や治療に用いることが可能であり、具体的には、シミ、ソバカス、老人性色素斑等の予防や治療に用いることができる。
タカクマムラサキの使用される部位は、特に限定されるものではなく、その植物全体を使用してもよいし、花、果実、葉、茎、芽、根、種子等のいずれの部位を使用してもよいが、好ましくは、葉が使用される。
タカクマムラサキの抽出法としては、特に限定されず、タカクマムラサキをそのまま、含浸法、圧搾法、超音波法、水蒸気蒸留法、溶媒抽出法等で抽出してもよいし、タカクマムラサキを切断、粉砕、破砕したもの、又は乾燥、粉末化したものを上記方法で抽出してもよい。この中でも、好ましい抽出法としては、タカクマムラサキを乾燥、粉末化したものを、溶媒抽出法で抽出することである。
タカクマムラサキの抽出物を、溶媒抽出法で使用する場合、使用する溶媒としては、有機溶媒が好ましく、極性有機溶媒、非極性有機溶媒の何れでもよい。有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、ブチルアルコール等の低級アルコール類;ポリエチレングリコール、グリセリン等の多価アルコール類;アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類;酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類;エチルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類;トルエン、キシレン、ヘキサン等の芳香族炭化水素類;ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類;アセトニトリル等が挙げられるが、好ましくは低級アルコール類、多価アルコール類であり、さらに好ましくはエタノールである。有機溶媒は、一種単独で用いてもよく、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
上記有機溶媒には、水を加水して含水有機溶媒としてもよい。含水有機溶媒に使用される有機溶媒としては、特に限定されないが、好ましくは低級アルコール類及び多価アルコール類であり、さらに好ましくは低級アルコール類であり、特に好ましくはエタノールである。含水有機溶媒中の有機溶剤の割合としては、好ましくは30重量%以上であり、さらに好ましくは50〜99重量%であり、特に好ましくは70〜99重量%である。
タカクマムラサキ抽出物を溶媒抽出法で抽出する方法としては、特に限定されないが、例えば、タカクマムラサキの乾燥粉末1重量部に対して、上記有機溶媒又は含水有機溶媒を1〜50重量部、好ましくは5〜20重量部添加し、抽出温度を5〜60℃、好ましくは10〜40℃で、抽出時間を5〜120時間、好ましくは8〜48時間で、静置又は撹拌しながらタカクマムラサキのエキス分を抽出した後、遠心分離機等で固形分を除去する方法等が挙げられる。また、抽出の際に、窒素ガス等の不活性ガスを通気して溶存酸素を除去しつつ、非酸素条件下で行ってもよい。
得られたタカクマムラサキ抽出物は、そのまま用いてもよいが、希釈、濃縮、凍結乾燥等の処理を行って、液状、ペースト状、又は粉末状の形態に調製して用いることも可能である。また、必要に応じて、タカクマムラサキ抽出物を、活性炭、液体クロマトグラフィー、精留等によりさらに精製してもよいが、好ましい精製法としては、タカクマムラサキの乾燥粉末1〜1/50重量部のエタノール抽出物を活性炭に素通りさせることである。
タカクマムラサキ抽出物に還元剤や還元作用を有する分子を添加することが好ましい。タカクマムラサキ抽出物に還元剤を添加すると、メラニンの合成を相乗的に抑制することが可能となる。使用可能な還元剤としては、例えば、アスコルビン酸及びその誘導体、トコフェロール及びその誘導体、グルタチオン、細胞内でグルタチオンに代謝されるN−アセチル−L−システイン(NAC)等が挙げられるが、好ましくは、NACである。
タカクマムラサキ又はその抽出物は、チロシナーゼの誘導抑制作用及びメラニンの合成抑制作用を有しているため、シミ、ソバカス等の皮膚への色素沈着を予防、改善、治療する組成物として、化粧料、医薬組成物、及び食品等に配合して使用することができる。
化粧料は、タカクマムラサキ又はその抽出物を有効成分とし、化粧料として許容される基材や担体と組み合わせて提供される。化粧料には、必要に応じて、賦形剤、被膜剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、pH調整剤、乳化剤、分散剤、安定剤、酸化防止剤、界面活性剤、防腐剤、紫外線吸収剤、保湿剤、着色剤、香料、増粘剤、殺菌剤、細胞賦活剤、抗炎症剤等の添加剤を適宜配合することもできる。
化粧料におけるタカクマムラサキ又はその抽出物の配合割合は、その有効量や、化粧料の形態等に応じて適宜設定されるが、例えば、化粧料の総量に対して、乾燥重量当たり、0.01〜99重量%であり、好ましくは0.01〜20重量%であり、さらに好ましくは0.1〜5重量%である。
化粧料として、具体的には、乳液、クリーム、クレンジング、パック、オイルリキッド、マッサージ料、美容液、洗浄剤、脱臭剤、ハンドクリーム、リップクリーム等のスキンケア化粧料;メイクアップ下地、白粉、リキッドファンデーション、油性ファンデーション、頬紅、アイシャドウ、マスカラ、アイライナー、アイブロウ、口紅等のメイクアップ化粧料;シャンプ−、リンス、トリートメント、セット剤等の毛髪化粧料;制汗剤、日焼け止め乳液や日焼け止めクリーム等の紫外線防御化粧料、皮膚外用剤等が挙げられ、医薬部外品として使用されるものも含まれる。
医薬組成物は、タカクマムラサキ又はその抽出物を有効成分とし、薬学的に許容される基材や担体と組み合わせて提供される。医薬組成物には、薬学的に許容される限度において、賦形剤、被膜剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、pH調整剤、乳化剤、分散剤、安定剤、酸化防止剤、界面活性剤、防腐剤、紫外線吸収剤、保湿剤、着色剤、香料、増粘剤、殺菌剤、細胞賦活剤、抗炎症剤等の添加剤を適宜配合することもできる。
医薬組成物としては、医薬品又は医薬部外品を含み、タカクマムラサキ又はその抽出物を有効成分として含有する。当該医薬組成物は、経口又は非経口のいずれで適用される剤型であってもよい。経口投与で投与される医薬組成物の剤型としては、例えば、丸剤、散剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤等が挙げられる。非経口で投与される医薬組成物の剤型としては、例えば、外用剤、経皮剤、経鼻剤、液剤、貼付剤、皮膚外用剤等が挙げられる。
医薬組成物におけるタカクマムラサキ又はその抽出物の配合割合は、その有効量や、医薬組成物の剤形や、投与形態等に応じて適宜設定されるが、例えば、医薬組成物の総量に対して、乾燥重量当たり、0.01〜99重量%であり、好ましくは0.1〜50重量%であり、さらに好ましくは0.1〜10重量%である。
食品としては、タカクマムラサキ又はその抽出物を有効成分とし、食品素材として、各種食品に配合されて提供される。特に、タカクマムラサキ又はその抽出物を含有する食品は、機能性食品、栄養補助食品、特定保健用食品として提供され得る。
食品の形態としては、固形、半固形、液状等のいずれの形態であってもよく、錠剤形態、丸剤形態、タブレット、カプセル形態、シロップ形態、粉末形態、顆粒形態等であってもよい。食品として、具体的には、パン類、麺類、スナック類、ケーキ類、冷菓類、飲料類、冷凍食品、インスタント食品等が挙げられる。
食品におけるタカクマムラサキ又はその抽出物の配合割合は、その有効量や、食品の形態等に応じて適宜設定されるが、例えば、食品の総量に対して、乾燥重量当たり、0.1〜99重量%であり、好ましくは0.1〜50重量%であり、さらに好ましくは0.1〜10重量%である。
本発明のチロシナーゼ誘導抑制剤及びメラニン合成抑制剤について、チロシナーゼの誘導抑制作用及びメラニンの合成抑制作用を評価する試験を実施した。試験結果を以下に示す。
<チロシナーゼの誘導抑制作用の評価>
タカクマムラサキ抽出物のチロシナーゼの誘導抑制作用について、チロシナーゼの転写因子であるMITF(Microphthalmia Transcription Factor)及びチロシナーゼの発現量を、タカクマムラサキ抽出物の添加の有無により評価した。試験方法を以下に示す。
タカクマムラサキ抽出物のチロシナーゼの誘導抑制作用について、チロシナーゼの転写因子であるMITF(Microphthalmia Transcription Factor)及びチロシナーゼの発現量を、タカクマムラサキ抽出物の添加の有無により評価した。試験方法を以下に示す。
(タカクマムラサキ抽出物)
タカクマムラサキ(独立行政法人医薬基盤研究所 薬用植物資源研究センター種子島研究部にて栽培)は、収穫した葉を50℃で2日間温風乾燥した(株式会社いすゞ製作所製、型番EPFH−343−2T)。乾燥した葉は、卓上粉砕機(株式会社東京ユニコム、型番T−351)を用いて粉末化した。タカクマムラサキの粉末0.5gに、5mlのエタノールを加え、12時間、1rpmで撹拌し、800g、5分間で遠心後、エタノールを回収した。沈殿物に再度5mlのエタノールを加え、5分間、1rpmで撹拌し、800g、5分間で遠心後、エタノールを回収した。次に、0.05gの乾燥クロマト用活性炭(和光純薬工業株式会社製)を詰めたポリプロピレン製の使い捨てカラム(BioRad社)に、先に回収したエタノール溶液及び2回目に回収したエタノール溶液を素通りさせて混合し、精製したエタノール溶液の抽出物を得た。得られた抽出物を減圧乾燥し、秤量後、10mg/mlになるように100%DMSO(ジメチルスルホキシド)溶液を添加し、タカクマムラサキ抽出物として以下の試験に供した。
タカクマムラサキ(独立行政法人医薬基盤研究所 薬用植物資源研究センター種子島研究部にて栽培)は、収穫した葉を50℃で2日間温風乾燥した(株式会社いすゞ製作所製、型番EPFH−343−2T)。乾燥した葉は、卓上粉砕機(株式会社東京ユニコム、型番T−351)を用いて粉末化した。タカクマムラサキの粉末0.5gに、5mlのエタノールを加え、12時間、1rpmで撹拌し、800g、5分間で遠心後、エタノールを回収した。沈殿物に再度5mlのエタノールを加え、5分間、1rpmで撹拌し、800g、5分間で遠心後、エタノールを回収した。次に、0.05gの乾燥クロマト用活性炭(和光純薬工業株式会社製)を詰めたポリプロピレン製の使い捨てカラム(BioRad社)に、先に回収したエタノール溶液及び2回目に回収したエタノール溶液を素通りさせて混合し、精製したエタノール溶液の抽出物を得た。得られた抽出物を減圧乾燥し、秤量後、10mg/mlになるように100%DMSO(ジメチルスルホキシド)溶液を添加し、タカクマムラサキ抽出物として以下の試験に供した。
(B16メラノーマ細胞の培養)
チロシナーゼの発現量の評価を行うために、メラニン産生細胞であるB16メラノーマ細胞の培養を行った。以下にB16メラノーマ細胞の培養方法を示す。
(1)6穴−ディッシュに、メラニン産成細胞であるB16メラノーマ細胞(JCRB細胞バンク、細胞番号:JCRB0202)を5×103細胞(1ml/ウェル)となるように播種し、1mlの前培養培地を添加後、37℃、5%二酸化炭素気流下で1日間培養した。
前培養培地:10%FCS(ウシ胎児血清)含有DMEM High Glucose培地(抗生物質MIX(和光純薬工業株式会社)終濃度が1×になるように添加)。
(2)(1)で培養したB16メラノーマ細胞の前培養培地を除去した後、2mlのB16メラノーマ細胞の処理用培地を添加して2日間培養し、同じ処理用培地で培地を交換してさらに2日間培養した。
処理用培地:前培養培地に、タカクマムラサキ抽出物を、乾燥重量当たり0〜10μg/ml、ホルスコリン(FSK)を10μM、DMSOを0.2%となるように添加した。FSKは、B16メラノーマ細胞のαメラニン細胞刺激ホルモン(αMSH)と同様にシグナル誘導をおこさせ、メラニン合成を促進させる物質である。
コントロール用処理用培地:上記処理用培地のタカクマムラサキ抽出物を無添加。
ブランク用処理用培地:上記処理用培地のタカクマムラサキ抽出物及びFSKを無添加。
(3)(2)で培養したB16メラノーマ細胞の処理用培地を除去し、リン酸緩衝溶液(PBS;pH7.2)1mlにて2回洗浄した後、PBSを再度1ml添加して、6穴−ディッシュに付着した細胞をピペッティングで完全にはがし取り、1.5mlエッペンドルフチューブに細胞を回収して試験サンプルとした。各試験サンプルは、プロテインアッセイ(バイオラッド社製)を使用して、タンパク質の定量を行った。
MITFは、B16メラノーマ細胞に処理用培地を添加して培養すると、培養の初期段階で発現するため、MITFの発現量の評価には、処理用培地で3時間培養したB16メラノーマ細胞を使用した。
チロシナーゼの発現量の評価を行うために、メラニン産生細胞であるB16メラノーマ細胞の培養を行った。以下にB16メラノーマ細胞の培養方法を示す。
(1)6穴−ディッシュに、メラニン産成細胞であるB16メラノーマ細胞(JCRB細胞バンク、細胞番号:JCRB0202)を5×103細胞(1ml/ウェル)となるように播種し、1mlの前培養培地を添加後、37℃、5%二酸化炭素気流下で1日間培養した。
前培養培地:10%FCS(ウシ胎児血清)含有DMEM High Glucose培地(抗生物質MIX(和光純薬工業株式会社)終濃度が1×になるように添加)。
(2)(1)で培養したB16メラノーマ細胞の前培養培地を除去した後、2mlのB16メラノーマ細胞の処理用培地を添加して2日間培養し、同じ処理用培地で培地を交換してさらに2日間培養した。
処理用培地:前培養培地に、タカクマムラサキ抽出物を、乾燥重量当たり0〜10μg/ml、ホルスコリン(FSK)を10μM、DMSOを0.2%となるように添加した。FSKは、B16メラノーマ細胞のαメラニン細胞刺激ホルモン(αMSH)と同様にシグナル誘導をおこさせ、メラニン合成を促進させる物質である。
コントロール用処理用培地:上記処理用培地のタカクマムラサキ抽出物を無添加。
ブランク用処理用培地:上記処理用培地のタカクマムラサキ抽出物及びFSKを無添加。
(3)(2)で培養したB16メラノーマ細胞の処理用培地を除去し、リン酸緩衝溶液(PBS;pH7.2)1mlにて2回洗浄した後、PBSを再度1ml添加して、6穴−ディッシュに付着した細胞をピペッティングで完全にはがし取り、1.5mlエッペンドルフチューブに細胞を回収して試験サンプルとした。各試験サンプルは、プロテインアッセイ(バイオラッド社製)を使用して、タンパク質の定量を行った。
MITFは、B16メラノーマ細胞に処理用培地を添加して培養すると、培養の初期段階で発現するため、MITFの発現量の評価には、処理用培地で3時間培養したB16メラノーマ細胞を使用した。
(ウエスタンブロッティング)
(1)SDSサンプルバッファ(0.05M Tris−HCl、pH6.8、10%グリセロール、2%SDS、0.01%ブロモフェノールブルー、0.6%2−メルカプトエタノール)に各試験サンプルのB16メラノーマ細胞を溶解して、タンパク質量が同量となるようにポリアクリルアミドゲルに分注し、電気泳動を行った。
(2)ポリアクリルアミドゲルで分離したタンパク質をPVDFメンブレンに転写した後、PVDFメンブレンを1%BSAでブロッキングした。
(3a)チロシナーゼの発現量を評価するために、抗チロシナーゼ抗体(Santacurz社製)で、4℃16時間1次抗体反応を行った。洗浄後、抗ヤギ−HRP抗体(American peptide社製)で2次抗体反応を行った。
(3b)MITFの発現量を評価するために、抗MITF抗体(NeoMarkers社製)で、4℃16時間1次抗体反応を行った。洗浄後、抗マウス−HRP抗体(American peptide社製)で2次抗体反応を行った。
(4)PVDFメンブレン上の抗原を、ECLウエスタンブロッティング検出システム(GEヘルスケア社製)を使用して、化学発光によりMITF(約60kDa)及びチロシナーゼ(約82.5kDa)のシグナル強度を検出した。
試験は、全てn=3で実施した。
(1)SDSサンプルバッファ(0.05M Tris−HCl、pH6.8、10%グリセロール、2%SDS、0.01%ブロモフェノールブルー、0.6%2−メルカプトエタノール)に各試験サンプルのB16メラノーマ細胞を溶解して、タンパク質量が同量となるようにポリアクリルアミドゲルに分注し、電気泳動を行った。
(2)ポリアクリルアミドゲルで分離したタンパク質をPVDFメンブレンに転写した後、PVDFメンブレンを1%BSAでブロッキングした。
(3a)チロシナーゼの発現量を評価するために、抗チロシナーゼ抗体(Santacurz社製)で、4℃16時間1次抗体反応を行った。洗浄後、抗ヤギ−HRP抗体(American peptide社製)で2次抗体反応を行った。
(3b)MITFの発現量を評価するために、抗MITF抗体(NeoMarkers社製)で、4℃16時間1次抗体反応を行った。洗浄後、抗マウス−HRP抗体(American peptide社製)で2次抗体反応を行った。
(4)PVDFメンブレン上の抗原を、ECLウエスタンブロッティング検出システム(GEヘルスケア社製)を使用して、化学発光によりMITF(約60kDa)及びチロシナーゼ(約82.5kDa)のシグナル強度を検出した。
試験は、全てn=3で実施した。
図1は、タカクマムラサキ抽出物のチロシナーゼの誘導抑制を示す写真であり、図2は、タカクマムラサキ抽出物のチロシナーゼの誘導抑制を示すグラフである。図2の縦軸は、タンパク質のシグナル強度を示しており、MITF及びチロシナーゼの相対的な量を表している。図1及び図2に示されるように、コントロールと比較して、タカクマムラサキ抽出物は、チロシナーゼの転写因子であるMITF及びチロシナーゼの誘導を明確に抑制することが確認された。
<メラニンの合成抑制作用を評価>
タカクマムラサキ抽出物の異なる量を添加したB16メラノーマ細胞について、メラニン合成量を分析し、タカクマムラサキ抽出物の添加量に対するメラニン合成抑制効果について評価した。試験方法を以下に示す。
タカクマムラサキ抽出物の異なる量を添加したB16メラノーマ細胞について、メラニン合成量を分析し、タカクマムラサキ抽出物の添加量に対するメラニン合成抑制効果について評価した。試験方法を以下に示す。
(B16メラノーマ細胞の培養)
(1)6穴−ディッシュに、メラニン産成細胞であるB16メラノーマ細胞(JCRB細胞バンク、細胞番号:JCRB0202)を5×103細胞(1ml/ウェル)となるように播種し、1mlの前培養培地を添加後、37℃、5%二酸化炭素気流下で1日間培養した。
前培養培地:10%FCS(ウシ胎児血清)含有DMEM High Glucose培地(抗生物質MIX(和光純薬工業株式会社)終濃度が1×になるように添加)。
(2)(1)で培養したB16メラノーマ細胞の前培養培地を除去した後、2mlのB16メラノーマ細胞の処理用培地を添加して2日間培養し、同じ処理用培地で培地を交換してさらに1日間培養した。
処理用培地:上記10%FCS含有DMEM High Glucose培地に、タカクマムラサキ抽出物を、其々乾燥重量当たり0.1μg/ml、0.3μg/ml、1μg/ml、3μg/ml、10μg/mlとなるように添加した(FSK:10μM、DMSO:0.1%)。
コントロール用処理用培地:上記処理用培地のタカクマムラサキ抽出物を無添加。
ブランク用処理用培地:上記処理用培地のタカクマムラサキ抽出物及びFSKを無添加。
各試験サンプルの調製は、上記方法と同方法で行った。
(1)6穴−ディッシュに、メラニン産成細胞であるB16メラノーマ細胞(JCRB細胞バンク、細胞番号:JCRB0202)を5×103細胞(1ml/ウェル)となるように播種し、1mlの前培養培地を添加後、37℃、5%二酸化炭素気流下で1日間培養した。
前培養培地:10%FCS(ウシ胎児血清)含有DMEM High Glucose培地(抗生物質MIX(和光純薬工業株式会社)終濃度が1×になるように添加)。
(2)(1)で培養したB16メラノーマ細胞の前培養培地を除去した後、2mlのB16メラノーマ細胞の処理用培地を添加して2日間培養し、同じ処理用培地で培地を交換してさらに1日間培養した。
処理用培地:上記10%FCS含有DMEM High Glucose培地に、タカクマムラサキ抽出物を、其々乾燥重量当たり0.1μg/ml、0.3μg/ml、1μg/ml、3μg/ml、10μg/mlとなるように添加した(FSK:10μM、DMSO:0.1%)。
コントロール用処理用培地:上記処理用培地のタカクマムラサキ抽出物を無添加。
ブランク用処理用培地:上記処理用培地のタカクマムラサキ抽出物及びFSKを無添加。
各試験サンプルの調製は、上記方法と同方法で行った。
(メラニンの定量)
回収した各B16メラノーマ細胞からメラニンを抽出した。メラニンの抽出方法を以下に示す。
(1)タンパク質量を合わせた各試験サンプルからPBSを除去し、300μlの1N NaOHを加え、細胞の破片が見えなくなるまでホモジナイズした。
(2)各試験サンプルを45℃、2時間でインキュベートした。
(3)各試験サンプルにメタノール:クロロホルム(1:2)混合溶液を100μl加え、撹拌し、メラニンを抽出した。
(4)1200rpm、10分で遠心分離し、上清を回収し、メラニン抽出液を得た。
(5)メラニン抽出液100μlを、96穴プレートに分注し、405nmの吸光度を測定した。
(6)メラニン標準溶液の吸光度から検量線を作成し、各試験サンプルのメラニン量の濃度を算出した。
メラニン標準溶液は、メラニンの濃度が0μg/ml,6.25μg/ml,12.5μg/ml,25μg/ml,50μg/ml,100μg/mlとなるように、メラニンを、1N NaOH溶液に溶解して調製した。メラニン標準溶液の300μl(n=3)を1.5mlエッペンドルフチューブに加え、上記(3)〜(5)と同じ方法でメラニンを測定し、検量線を作成した。
回収した各B16メラノーマ細胞からメラニンを抽出した。メラニンの抽出方法を以下に示す。
(1)タンパク質量を合わせた各試験サンプルからPBSを除去し、300μlの1N NaOHを加え、細胞の破片が見えなくなるまでホモジナイズした。
(2)各試験サンプルを45℃、2時間でインキュベートした。
(3)各試験サンプルにメタノール:クロロホルム(1:2)混合溶液を100μl加え、撹拌し、メラニンを抽出した。
(4)1200rpm、10分で遠心分離し、上清を回収し、メラニン抽出液を得た。
(5)メラニン抽出液100μlを、96穴プレートに分注し、405nmの吸光度を測定した。
(6)メラニン標準溶液の吸光度から検量線を作成し、各試験サンプルのメラニン量の濃度を算出した。
メラニン標準溶液は、メラニンの濃度が0μg/ml,6.25μg/ml,12.5μg/ml,25μg/ml,50μg/ml,100μg/mlとなるように、メラニンを、1N NaOH溶液に溶解して調製した。メラニン標準溶液の300μl(n=3)を1.5mlエッペンドルフチューブに加え、上記(3)〜(5)と同じ方法でメラニンを測定し、検量線を作成した。
図3は、タカクマムラサキ抽出物の添加量とメラニンの誘導量とを比較したグラフである。グラフは、コントロールのメラニンの誘導量を100とした場合の各試験サンプルのメラニンの誘導量(%)を表している。図3の結果に示されるように、コントロールと比較して、タカクマムラサキ抽出物を添加した試験サンプルは、その濃度に依存して、メラニン合成を抑制することが明確に示された。
<タカクマムラサキ抽出物と還元剤とのメラニン合成抑制の相乗効果>
タカクマムラサキ抽出物と、還元剤であるN−アセチル−L−システイン(NAC)とのメラニンの合成抑制に関する相乗効果を、NACの添加の有無による各B16メラノーマ細胞のメラニンの合成量により評価した。NACの添加量は、100μMとした。評価は、培養後の各B16メラノーマ細胞の目視観察、及びメラニンの定量により評価した。各B16メラノーマ細胞の培養及びメラニンの定量法は、NACの添加の有無以外、<メラニンの合成抑制作用を評価>の項で述べた方法と同じ方法で実施した。メラニンの目視観察は、1.5mlエッペンドルフチューブに各試験サンプルのB16メラノーマ細胞を回収した際に行った。メラニンが過剰に生産されると、B16メラノーマ細胞は、黒色に着色するため、容易に判別可能である。
タカクマムラサキ抽出物と、還元剤であるN−アセチル−L−システイン(NAC)とのメラニンの合成抑制に関する相乗効果を、NACの添加の有無による各B16メラノーマ細胞のメラニンの合成量により評価した。NACの添加量は、100μMとした。評価は、培養後の各B16メラノーマ細胞の目視観察、及びメラニンの定量により評価した。各B16メラノーマ細胞の培養及びメラニンの定量法は、NACの添加の有無以外、<メラニンの合成抑制作用を評価>の項で述べた方法と同じ方法で実施した。メラニンの目視観察は、1.5mlエッペンドルフチューブに各試験サンプルのB16メラノーマ細胞を回収した際に行った。メラニンが過剰に生産されると、B16メラノーマ細胞は、黒色に着色するため、容易に判別可能である。
図4は、タカクマムラサキ抽出物とNACとのメラニン合成抑制の相乗効果を示す写真である。上段は、NACを添加せずに培養したB16メラノーマ細胞の写真であり、タカクマムラサキ抽出物の濃度にしたがって、B16メラノーマ細胞の色は薄くなったが、10μg/mlの添加量でも若干の着色が見受けられた。これに対して、NACを添加した下段の写真では、3μg/mlのタカクマムラサキ抽出物の添加量で、着色が殆ど見られず、ブランクと略同じ結果となった。また、図5は、タカクマムラサキ抽出物とNACとのメラニン合成抑制の相乗効果を示すグラフである。グラフは、コントロール(NAC(−))のメラニンの誘導量を100とした場合の各試験サンプルのメラニンの誘導量(%)を表している。図5の結果から、目視観察の評価と同様に、メラニンの合成量もNACを添加することにより抑制されていることが明確に示された。上記結果から、タカクマムラサキ抽出物に還元剤であるNACを添加すると、メラニンの合成が相乗的に抑制されることが示された。
本発明に係るチロシナーゼ誘導抑制剤及びメラニン合成抑制剤、並びに、当該チロシナーゼ誘導抑制剤又はメラニン合成抑制剤を用いた化粧料及び医薬組成物は、例えば、食品分野、化粧品分野、及び医薬品分野に利用することができる。
Claims (5)
- タカクマムラサキ又はその抽出物を有効成分とするチロシナーゼ誘導抑制剤。
- タカクマムラサキ又はその抽出物を有効成分とするメラニン合成抑制剤。
- 還元剤を含有する請求項2に記載のメラニン合成抑制剤。
- 請求項1に記載のチロシナーゼ誘導抑制剤、あるいは請求項2又は3に記載のメラニン合成抑制剤を含有する化粧料。
- 請求項1に記載のチロシナーゼ誘導抑制剤、あるいは請求項2又は3に記載のメラニン合成抑制剤を含有する医薬組成物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012249917A JP2014097945A (ja) | 2012-11-14 | 2012-11-14 | チロシナーゼ誘導抑制剤及びメラニン合成抑制剤 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012249917A JP2014097945A (ja) | 2012-11-14 | 2012-11-14 | チロシナーゼ誘導抑制剤及びメラニン合成抑制剤 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2014097945A true JP2014097945A (ja) | 2014-05-29 |
Family
ID=50940298
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012249917A Pending JP2014097945A (ja) | 2012-11-14 | 2012-11-14 | チロシナーゼ誘導抑制剤及びメラニン合成抑制剤 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2014097945A (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105078803A (zh) * | 2014-05-16 | 2015-11-25 | 苏州润新生物科技有限公司 | 紫珠属植物提取物的用途 |
US9735328B2 (en) | 2014-10-17 | 2017-08-15 | Lg Innotek Co., Ltd. | Light emitting device package and lighting apparatus including the package |
CN108159195A (zh) * | 2018-01-16 | 2018-06-15 | 广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所 | 一种尖尾枫提取物、制备方法及其应用 |
JP2018193334A (ja) * | 2017-05-18 | 2018-12-06 | 共栄化学工業株式会社 | 皮膚外用剤 |
-
2012
- 2012-11-14 JP JP2012249917A patent/JP2014097945A/ja active Pending
Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105078803A (zh) * | 2014-05-16 | 2015-11-25 | 苏州润新生物科技有限公司 | 紫珠属植物提取物的用途 |
CN105078803B (zh) * | 2014-05-16 | 2020-03-31 | 苏州润新生物科技有限公司 | 紫珠属植物提取物的用途 |
US9735328B2 (en) | 2014-10-17 | 2017-08-15 | Lg Innotek Co., Ltd. | Light emitting device package and lighting apparatus including the package |
US9991433B2 (en) | 2014-10-17 | 2018-06-05 | Lg Innotek Co., Ltd. | Light emitting device package and lighting apparatus including the package |
US10224471B2 (en) | 2014-10-17 | 2019-03-05 | Lg Innotek Co., Ltd. | Light emitting device package having improved electrical reliability and lighting apparatus including the package |
US10475978B2 (en) | 2014-10-17 | 2019-11-12 | Lg Innotek Co., Ltd. | Light emitting device package having improved reliability, and lighting apparatus including the package |
JP2018193334A (ja) * | 2017-05-18 | 2018-12-06 | 共栄化学工業株式会社 | 皮膚外用剤 |
JP7477129B2 (ja) | 2017-05-18 | 2024-05-01 | 共栄化学工業株式会社 | 皮膚外用剤 |
CN108159195A (zh) * | 2018-01-16 | 2018-06-15 | 广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所 | 一种尖尾枫提取物、制备方法及其应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US8969408B2 (en) | Use of lignan-type compounds or extract of nutmeg or aril of nutmeg comprising the same | |
CN108601762A (zh) | 炎性体活性化抑制剂 | |
JP2007261987A (ja) | チロシナーゼ阻害剤、その製法およびその応用 | |
JP2020147527A (ja) | ヒアルロン酸産生促進剤および保湿剤、コラーゲン産生促進剤および抗シワ剤、細胞賦活化剤、ならびに、メラニン産生抑制剤および美白剤 | |
JP2014097945A (ja) | チロシナーゼ誘導抑制剤及びメラニン合成抑制剤 | |
US20120065272A1 (en) | Novel use of panduratin derivatives or extract of kaempferia pandurata comprising the same | |
KR20190064714A (ko) | 레몬머틀 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증제 | |
KR101702621B1 (ko) | 꽃잔디 추출물을 포함하는 항염증제 | |
KR101869639B1 (ko) | 개병풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물 및 이의 용도 | |
KR102212343B1 (ko) | 마리안 플럼 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 항노화 및 보습용 조성물 | |
KR20210131598A (ko) | 동백나무 과피 추출물을 유효성분으로 포함하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물 | |
JP4902967B2 (ja) | メラニン生成抑制剤 | |
JP5946510B2 (ja) | メラニン生成抑制剤、化粧料、及びメラニン生成抑制剤の製造方法 | |
JP7262319B2 (ja) | メラニン生成抑制剤、及びメラニン生成抑制剤の製造方法 | |
KR102443334B1 (ko) | 무궁화 복합추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증, 피부 보습, 피부 가려움증 개선, 및 피부재생 촉진용 조성물 | |
KR101469662B1 (ko) | 비틀대모자반 추출물 함유 탈모방지 또는 발모개선용 조성물 | |
WO2020153466A1 (ja) | 美容用組成物 | |
KR102359044B1 (ko) | 컬러감자 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물 | |
WO2016088907A1 (ko) | 로즈마리 유래의 베르베논을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물 | |
JP2011032176A (ja) | メラニン産生促進剤 | |
JP2018519336A (ja) | ムレスズメ根抽出物を含有する美白用化粧料組成物 | |
WO2020116092A1 (ja) | モリンガ抽出物及び/又は粉砕物を含む組成物 | |
JP6392026B2 (ja) | 美白用組成物 | |
JP2023050030A (ja) | チロシナーゼ阻害剤、並びに該阻害剤を含む医薬製剤及び飲食品 | |
JP2022107445A (ja) | 赤紫蘇抽出物を含有する肌質改善剤及びその使用 |