JP2013529058A - 細菌ｌｕｘオペロンを含む自己発光植物とそれを作製する方法 - Google Patents

Abstract

１つの態様において、本発明は、ＬＵＸ Ａ、ＬＵＸ Ｂ、ＬＵＸ Ｃ、ＬＵＸ Ｄ、ＬＵＸ ｂおよびＬＵＸ Ｇ遺伝子を含む、細菌ＬＵＸオペロンを含む発現可能な異種ヌクレオチド配列を含み、そこで前記異種ヌクレオチド配列が発現して植物の自己発光を与える、トランスジェニック自己発光植物に関する。
【選択図】図１２

Description

参考文献による組み込み
２００８年７月３１日に出願された、「Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｅｎｔ Ｐｌａｎｔｓ Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｌｕｘ Ｏｐｅｒｏｎ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍａｋｉｎｇ Ｓａｍｅ」という題名の国際特許明細書第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００９３１０パンフレット、および２００７年８月１日に出願された、米国特許仮出願第６０／９５３，３３７号は、そのすべてが参考文献によって本明細書に組み込まれる。

自己発光可能な植物のような非細菌有機体は、環境、研究および美的適用のような多くの目的で有用である。しかしながら、そのような有機体は、多くの理由により簡単には達成されてこなかった。たとえば、自己発光に対応可能な遺伝子および機構は複雑である。光放射に関与するもののような複雑な代謝経路を、トランスジェニック植物有機体内に組み込む試みは、遺伝的改変の制限によって妨害されてきた。

発光を達成するための植物遺伝的改変の先行する試みは、明らかに不都合な結果となった。たとえば、植物組織内でルシフェラーゼを発現させることは、典型的に、光を放射するために、基質（たとえばルシフェリン）との組織の接触を必要とする。光放射は典型的には、時間的に制限され、ほんの数時間または分しか維持しない。いくつかのルシフェリン基質は毒性であり、非常に不安定であり、および／または高価である。

したがって、自己生物発光（すなわち自己発光）可能である植物、および複雑な代謝経路の植物内への組み込みを可能にする方法が必要である。

本発明は、これらの、そして他の目的に対処する。

１つの様態において、本発明は、トランスジェニック生物蛍光自己発光植物細胞に関する。植物細胞には、ＬＵＸ Ａ、ＬＵＸ Ｂ、ＬＵＸ Ｃ、ＬＵＸ Ｄ、ＬＵＸ ＥおよびＬＵＸ Ｇ遺伝子を含む、細菌ＬＵＸオペロンを含む異種ヌクレオチド配列が含まれ、そこでは異種ヌクレオチド配列が、短縮Ｐｒｒｎプロモーターに動作可能に連結し、異種ヌクレオチド配列がプラスチド（色素体）ゲノム内に統合される。

他の様態において、本発明は、トランスジェニック自己発光植物細胞を産出するための種子を含むキットに関する。植物細胞には、細菌ＬＵＸオペロンを含む、異種ヌクレオチド配列が含まれる。細菌ＬＵＸオペロンには、ＬＵＸ Ａ、ＬＵＸ Ｂ、ＬＵＸ Ｃ、ＬＵＸ Ｄ、ＬＵＸ ＥおよびＬＵＸ Ｇ遺伝子が含まれ、そこでは異種ヌクレオチド配列が、短縮Ｐｒｒｎプロモーターに動作可能に連結し、異種ヌクレオチド配列がプラスチドゲノム内に統合される。キットにはさらに、植物形質転換ベクターが含まれる。

さらなる様態において、本発明はベクターシステムに関する。ベクターシステムには、ＬＵＸ Ａ、ＬＵＸ Ｂ、ＬＵＸ Ｃ、ＬＵＸ Ｄ、ＬＵＸ ＥおよびＬＵＸ Ｇ遺伝子を含む、細菌ＬＵＸオペロンを含む第一異種ヌクレオチド配列を持つプラスチド形質転換ベクターが含まれ、そこでは前記異種ヌクレオチド配列が、第一プロモーターに動作可能に連結し、前記異種ヌクレオチド配列がプラスチドゲノム中に組み込まれうることが可能である。ベクターシステムにはまた、第二プロモーターと動作可能に連結した、第二異種ヌクレオチド配列を持つベクターが含まれる。

またさらなる様態において、本発明は、ベクターシステムに関する。ベクターシステムには、以下のＬＵＸ Ａ、ＬＵＸ Ｂ、ＬＵＸ Ｃ、ＬＵＸ Ｄ、ＬＵＸ ＥおよびＬＵＸ Ｇ遺伝子の任意の５つを含む、第一異種ヌクレオチド配列を持つプラスチド形質転換ベクターが含まれ、そこで異種ヌクレオチド配列が、短縮Ｐｒｒｎプロモーターに動作可能に連結し、前記異種ヌクレオチド配列がプラスチドゲノム中に組み込まれうることが可能である。ベクターシステムにはまた、プラスチド標的化配列と、第二プロモーターに動作可能に連結した第六ＬＵＸ遺伝子を含む、第二異種ヌクレオチド配列を持つベクターも含まれる。

Ａ）Ｃｏｒｂｉｓからペトリディッシュ内で増殖した、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＺ−１１の培養液。Ｂ）［Ｔｈｅ Ｄａｎｉｓｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈからの］Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｕｍの培養液。Ｃ）異なる発光細菌種中のＬＵＸオペロンの保存された遺伝的構造。略号は、Ｐｐ：Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｕｍ、Ｐｌ：Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｉｏｇｎａｔｈｉ、サブタイプ１および２、Ｖｆ：Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ、Ｖｈ：Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ、Ｘｌ：Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ［Ｅ．Ｍｅｉｇｈｅｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ，１９９１］。Ｄ）細菌蛍光反応の生化学（Ｙ．Ｃ．ＬｉｎおよびＥ．Ｍｅｉｇｈｅｎによる「Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ」より）。 プラスチド形質転換ベクターの葉緑体ゲノムおよび略図的構造および原核生物機能特徴。葉緑体の相同組換え機構は、トランスジーン発現カセットに隣接している配列との相同性を介して、特定のゲノム領域（例えばＴｒｎＩ／ＴｒｎＡ遺伝子座）内への挿入ＤＮＡの標的化を促進する。多シストロン性遺伝子発現機構により、単一のオペロン様構造からの種々のトランスジーンの発現が可能となり、多重遺伝子形質転換ベクターの構築が単純化され、単一形質転換段階での多重トランスジーンの挿入が許容される。典型的には、核トランスジーンに対してよりも、葉緑体に対して有意に高い、組換え体タンパク質発現レベルが、コピー訂正の結果としてさらに増加し、反対側の逆方向反復（すなわちＩＲ_ＡからＩＲ_Ｂへ）上の相同部位への発現カセットの重複が引き起こされる。 Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼタンパク質発現が、核内の組織特異的、またはサーカディアンリズム、さもなくば誘導可能（ストレス、重金属など）プロモーターによって駆動される、遺伝リレーアッセイの概略図である。前述プロモーターが活性である時、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼタンパク質が転写され、Ｎ−末端融合プラスチド運搬ペプチドを用いて、プラスチド（例えば葉緑体）に対して標的化されうる。葉緑体内のＬＵＸ遺伝子は、Ｔ７プロモーターによって駆動され、そのプロモーターにはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼが結合し、したがってＬＵＸ転写が活性化される。したがってＬＵＸオペロンの活性化は間接的である。 （ルシフェラーゼ サブユニットＬｕｘＡのような）発光にとって必要な遺伝子の１つが、核内の誘導可能プロモーターから発現し、運搬ペプチドを用いてプラスチド内に標的化される、遺伝相補性解析の略式図である。発光にとって必要な遺伝的機構の残りが、例えば短縮Ｐｒｒｎプロモーターによって駆動されて、プラスチド内に構造的に発現する一方で、光放射は、光放射機構が、核から標的化されたＬＵＸサブユニットによって補完され、順に誘導可能プロモーターによって調整される場合にのみ発光する。 ｐＳＡＴ４−ＭＣＳ（Ａ）の遺伝マップ。 ｐＣＡＳ３ベクター（Ｂ）の遺伝マップ。 １％アガロースゲル上で還元された、完全構成ｐＣＡＳ３−ａａｄＡベクターの遺伝マップ（Ａ）と実際の実験制限消化（Ｂ）で、Ｐｒｒｎプロモーター（ＡｇｅＩ／ＮｃｏＩ消化、およそ１００ｂｐ断片）、ａａｄＡ遺伝子（ＮｃｏＩ／ＢｇｌＩＩ消化、およそ８００ｂｐ断片）、および３５Ｓターミネーター（ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ消化、およそ２３０ｂｐ断片）を産出する。 １％アガロースゲル上で還元された、完全構成ｐＣＡＳ３−ａａｄＡベクターの遺伝マップ（Ａ）と実際の実験制限消化（Ｂ）で、Ｐｒｒｎプロモーター（ＡｇｅＩ／ＮｃｏＩ消化、およそ１００ｂｐ断片）、ａａｄＡ遺伝子（ＮｃｏＩ／ＢｇｌＩＩ消化、およそ８００ｂｐ断片）、および３５Ｓターミネーター（ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ消化、およそ２３０ｂｐ断片）を産出する。 Ｃ）完全構成ｐＣＡＳ３−ａａｄＡ−ＬＵＸオペロンベクターの遺伝マップと（Ｄ）実際の実験制限消化で、ｐＣＡＳ３−ａａｄＡ骨格内へクローン化されたＬＵＸオペロンを示している（ＥｃｏＲＩ消化、およそ６．５ｋｂのＬＵＸオペロン断片を産する）。マーカーは１ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）である。 Ｃ）完全構成ｐＣＡＳ３−ａａｄＡ−ＬＵＸオペロンベクターの遺伝マップと（Ｄ）実際の実験制限消化で、ｐＣＡＳ３−ａａｄＡ骨格内へクローン化されたＬＵＸオペロンを示している（ＥｃｏＲＩ消化、およそ６．５ｋｂのＬＵＸオペロン断片を産する）。マーカーは１ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）である。 （Ａ）ｐＣＡＳ３−ＬＵＸ−ｒｐｓ１２／ＴｒｎＶおよび（Ｂ）ｐＣＡＳ３−ＬＵＸ−ＴｒｎＩ／ＴｒｎＡベクターの遺伝マップ、および１％アガロースゲル上で還元した、（Ｃ）完全構築上述ベクターの実際の実験的制限消化で、ｐＣＡＳ３−ＬＵＸ−ｒｐｓ１２／ＴｒｎＶベクター内にクローン化したｒｐｓ１２／ＴｒｎＶ相同組換え配列（それぞれＡｇｅＩおよびＮｏｔＩ消化、およそ２．０ｋＢの断片を産する）（Ｃパネルの左側）およびｐＣＡＳ３−ＬＵＸ−ＴｒｎＩ／ＴｒｎＡベクター内にクローン化したＴｒｎＩ／ＴｒｎＡ相同組換え配列（それぞれＡｇｅＩおよびＮｏｔＩ消化、およそ１．６ｋｂ断片を産する）（Ｃパネル右側）。およそ６．５ｋｂ ＬＵＸオペロンの存在が、ＥｃｏＲＩ消化によって示される。マーカーは、１ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。 （Ａ）ｐＣＡＳ３−ＬＵＸ−ｒｐｓ１２／ＴｒｎＶおよび（Ｂ）ｐＣＡＳ３−ＬＵＸ−ＴｒｎＩ／ＴｒｎＡベクターの遺伝マップ、および１％アガロースゲル上で還元した、（Ｃ）完全構築上述ベクターの実際の実験的制限消化で、ｐＣＡＳ３−ＬＵＸ−ｒｐｓ１２／ＴｒｎＶベクター内にクローン化したｒｐｓ１２／ＴｒｎＶ相同組換え配列（それぞれＡｇｅＩおよびＮｏｔＩ消化、およそ２．０ｋＢの断片を産する）（Ｃパネルの左側）およびｐＣＡＳ３−ＬＵＸ−ＴｒｎＩ／ＴｒｎＡベクター内にクローン化したＴｒｎＩ／ＴｒｎＡ相同組換え配列（それぞれＡｇｅＩおよびＮｏｔＩ消化、およそ１．６ｋｂ断片を産する）（Ｃパネル右側）。およそ６．５ｋｂ ＬＵＸオペロンの存在が、ＥｃｏＲＩ消化によって示される。マーカーは、１ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。 （Ａ）ｐＣＡＳ３−ＬＵＸ−ｒｐｓ１２／ＴｒｎＶおよび（Ｂ）ｐＣＡＳ３−ＬＵＸ−ＴｒｎＩ／ＴｒｎＡベクターの遺伝マップ、および１％アガロースゲル上で還元した、（Ｃ）完全構築上述ベクターの実際の実験的制限消化で、ｐＣＡＳ３−ＬＵＸ−ｒｐｓ１２／ＴｒｎＶベクター内にクローン化したｒｐｓ１２／ＴｒｎＶ相同組換え配列（それぞれＡｇｅＩおよびＮｏｔＩ消化、およそ２．０ｋＢの断片を産する）（Ｃパネルの左側）およびｐＣＡＳ３−ＬＵＸ−ＴｒｎＩ／ＴｒｎＡベクター内にクローン化したＴｒｎＩ／ＴｒｎＡ相同組換え配列（それぞれＡｇｅＩおよびＮｏｔＩ消化、およそ１．６ｋｂ断片を産する）（Ｃパネル右側）。およそ６．５ｋｂ ＬＵＸオペロンの存在が、ＥｃｏＲＩ消化によって示される。マーカーは、１ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。 Ａ）通常スペクチノマイシンに感受性の大腸菌ＤＨ５α内でのｐＣＡＳ３−ａａｄＡとｐＣＡＳ３−ａａｄＡ−ＬＵＸオペロンの早期プロトタイプ決定を、ｐＣＡＳ３−ａｄｄＡ（左パネル側）およびｐＣＡＳ３−ａａｄＡ−ＬＵＸオペロン（右パネル側）ベクターで形質導入し、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天上で生長させた。両方のベクターが、ＤＨ５α細胞に対してスペクチノマイシン耐性を与え（上パネル）、ｐＣＡＳ３−ａａｄＡ−ＬＵＸオペロン細胞が、暗所で可視光を放射した（下パネル）。Ｂ）トランスプラストミックタバコ植物。 Ａ）トランスプラストミック植物の同定で使用した、ＰＣＲ−増幅領域の概略図。予想されるＰＣＲ断片サイズおよびプライマー番号を示している。たとえば、プライマー＃７８と＃１０４を、葉緑体ｒｐｓ１２遺伝子内でのベクター統合の結果として、ｒｐｓ１２連結領域を増幅するために使用し、予想されるＰＣＲ断片サイズは２．３５ｋｂである。Ｂ）ｐＣＡＳ３−ＬＵＸ−ｒｐｓ１２／ＴｒｎＶ葉緑体形質導入ベクターを用いて産出したトランスプラストミック植物の同定の間に得た、１％アガロースゲル上で解析した、実際の実験ＰＣＲ断片。アガロースゲル上のそれぞれのレーン対中の左レーンが、陰性対照として使用した野生型植物ＤＮＡであり、右レーンが、トランスプラストミック植物ＤＮＡである。以上で示したそれぞれの各野生型／トランスプラストミック対に対して使用し、（Ａ）でのスキームに対応するプライマー対。プライマー＃７３および＃７９は、天然葉緑体ゲノムの領域を増幅するために設計されており、野生型およびトランスジェニック植物両方のＰＣＲ反応の陽性対照として使用する。マーカーは１ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）である。 （Ａ）ｐＣＡＳ３−ＬＵＸ−ｒｐｓ１２／ＴｒｎＶおよび（Ｂ）ｐＣＡＳ３−ＬＵＸ−ＴｒｎＩ／ＴｒｎＡベクターを用いて産出したトランスプラストミック植物に対して、シンチレーションカウンター（ＬＳ６５００多目的シンチレーションカウンター、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）によって検出した、トランスプラストミック植物による光放射。野生型タバコ組織を、ベースラインノイズを測定するために使用した。Ｃ）写真フィルムに暴露した（下パネル）、ｐＣＡＳ３−ＬＵＸ−ＴｒｎＩ／ＴｒｎＡ（上パネル）を用いて産出したトランスプラストミック植物。野生型組織では、光放射は観察されなかった一方で、トランスプラストミック組織周辺の明確および集中的光放射に留意のこと。曝露中心は、プレート上のトランスプラストミック組織の部分と正確に合致する。これにより、より大きなトランスプラストミック組織切片（トランスプラストミック組織プレートの右下側）に対して、光放射は、全標本にわたって均一ではなく、８の字形の２つの明確な中心（矢印でマークした）中に濃縮され、これはおそらく、初期トランスプラストミック根のヘテロプラストミーからの結果である。 （Ａ）ｐＣＡＳ３−ＬＵＸ−ｒｐｓ１２／ＴｒｎＶおよび（Ｂ）ｐＣＡＳ３−ＬＵＸ−ＴｒｎＩ／ＴｒｎＡベクターを用いて産出したトランスプラストミック植物に対して、シンチレーションカウンター（ＬＳ６５００多目的シンチレーションカウンター、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）によって検出した、トランスプラストミック植物による光放射。野生型タバコ組織を、ベースラインノイズを測定するために使用した。Ｃ）写真フィルムに暴露した（下パネル）、ｐＣＡＳ３−ＬＵＸ−ＴｒｎＩ／ＴｒｎＡ（上パネル）を用いて産出したトランスプラストミック植物。野生型組織では、光放射は観察されなかった一方で、トランスプラストミック組織周辺の明確および集中的光放射に留意のこと。曝露中心は、プレート上のトランスプラストミック組織の部分と正確に合致する。これにより、より大きなトランスプラストミック組織切片（トランスプラストミック組織プレートの右下側）に対して、光放射は、全標本にわたって均一ではなく、８の字形の２つの明確な中心（矢印でマークした）中に濃縮され、これはおそらく、初期トランスプラストミック根のヘテロプラストミーからの結果である。 （Ａ）ｐＣＡＳ３−ＬＵＸ−ｒｐｓ１２／ＴｒｎＶおよび（Ｂ）ｐＣＡＳ３−ＬＵＸ−ＴｒｎＩ／ＴｒｎＡベクターを用いて産出したトランスプラストミック植物に対して、シンチレーションカウンター（ＬＳ６５００多目的シンチレーションカウンター、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）によって検出した、トランスプラストミック植物による光放射。野生型タバコ組織を、ベースラインノイズを測定するために使用した。Ｃ）写真フィルムに暴露した（下パネル）、ｐＣＡＳ３−ＬＵＸ−ＴｒｎＩ／ＴｒｎＡ（上パネル）を用いて産出したトランスプラストミック植物。野生型組織では、光放射は観察されなかった一方で、トランスプラストミック組織周辺の明確および集中的光放射に留意のこと。曝露中心は、プレート上のトランスプラストミック組織の部分と正確に合致する。これにより、より大きなトランスプラストミック組織切片（トランスプラストミック組織プレートの右下側）に対して、光放射は、全標本にわたって均一ではなく、８の字形の２つの明確な中心（矢印でマークした）中に濃縮され、これはおそらく、初期トランスプラストミック根のヘテロプラストミーからの結果である。 Ａ）ハンドヘルドコンシューマーカメラ［ニコンＤ２００、ＡＦ−Ｓ Ｍｉｃｒｏ Ｎｉｋｋｏｒ １０５．０ｍｍ １：２．８Ｇ ＥＤレンズ、ｆ／４．５にて露出５分間、１０５ｍｍ焦点距離、ＩＳＯ３２００］を用いて、暗室で撮影した、ＬＵＸ−ＴｒｎＩ／ＴｒｎＡ植物の写真。 Ｂ）光放射に関して、野生型タバコ植物でのＬＵＸトランスプラストミックの隣り合わせ比較を示している（Ａ）と同様の写真［光オンで撮影した上パネル暴露、光オフで撮影した下パネル暴露］。 Ｃ）最終濃度２ｍＭまでのデカナールの添加により、トランスプラストミックＬＵＸ組織からの光の放射が２倍になる。 ＣｌｕｓｔａｌＷ２を用いて実施した、配列差異を示すためのプロモーターアライメント

トランスジェニック自己発光植物
１つの様態において、本発明は、トランスジェニック自己発光植物細胞に関する。植物には、異種ヌクレオチド配列が含まれ、それには細菌ＬＵＸオペロンが含まれる。ＬＵＸオペロンには、ＬＵＸ Ａ、ＬＵＸ Ｂ、ＬＵＸ Ｃ、ＬＵＸ Ｄ、ＬＵＸ ＥおよびＬＵＸ Ｇ遺伝子が含まれる（「６ＬＵＸ遺伝子」）。異種ヌクレオチド配列は、短縮Ｐｒｒｎプロモーターに動作可能に連結し、異種ヌクレオチド配列は、プラスチドゲノム内に統合される。

本明細書で使用するところの語句「トランスジェニック」、「形質導入」、「形質転換」には、宿主細胞に対して異種核酸が導入された任意の細胞、細胞株、カルス、組織、植物組織または植物が含まれる。本明細書で使用するところの語句「トランスジェニック」は、無作為交差受精、非組換え体ウイルス感染、非組換え体細菌形質転換、非組換え体転位または偶発変異導入のような、従来の植物ブリーディング法による、または天然に発生する事象によるゲノム（染色体または染色体外）の変更を包含しない。語句「トランスジェニック植物」は、遺伝する異種ヌクレオチド配列を含む植物または植物組織を意味する。

本明細書で使用するところの語句「自発的発光」または「自己発光」は、化学反応からのエネルギーが光エネルギーに変換される、植物または植物組織にて発生する発光を意味する。トランスジェニック植物または植物組織は、外部操作の必要なしに、たとえば、外部基質を前記トランスジェニック植物または植物組織に適用する必要なしに、自発的に光を放射する。語句「自己発光」はさらに、植物または植物組織内の発光に必要な化学化合物を含むように改変した組換え体植物または植物組織中の光の産出を意味する。好ましくは、トランスジェニック植物は、「安定的に」自己発光であり、自己発光のための異種ヌクレオチド配列の、形質転換細胞のゲノム内への導入および統合を意味する。

語句「植物」は、本明細書で、プラスチドを含み、任意の生育の段階である、真核有機体を意味するために広く使用される。本明細書で使用するところの語句「植物」は、全植物、植物の一部分（たとえば、植物挿し木、植物細胞、植物細胞培養、植物器官、植物種および胚）、種子、植物由来の細胞または組織培養、植物器官（たとえば胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、分岐、果物、仁、穂、穂軸、殻、茎、根、根端、葯など）を意味する。

任意の植物を本発明のために使用してよい。たとえば、植物研究においてモデル有機体としてよく使用されており、その生物学に関する大量のデータが蓄積されているため、Ｎｉｃｏｔｉｎｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａまたはＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ（タバコ）を使用可能である。また、本発明の自己発光植物に対してよいモデル有機体であるものは、たとえば、アスパラガスまたはチャードのような、大量のＦＭＮＨ_２を本質的に発現する植物である。コストを最小化するために、Ｐｈｏｙｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｉｏｇｎａｔｈｉまたはＢｉｏｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ、ならびにＳｈｅｗａｎｅｌｌａ ｈａｎｅｄａｉのような、種々の高い発光細菌種からの発光システムを、種々の植物種内に移す。本アプローチは、種々の遺伝子の移動において、平行して本質的に同一の技術を適用することが必要であるので、本戦略は、自己発光植物の産出のコストを有意に増加させることはない。

他の好ましい植物には、観賞植物、有用または鑑賞用木、花、切り花、低木または芝生が含まれる。典型的な植物には、カーネーション、菊（ポンポン）、百合、ガーベラ、キンギョソウ、バラ、チューリップ、ペチュニア、ダリア、グラニウム、キク属、ベゴニア、コリウス、チューリップ、グラジオラス、ヒエンソウ、トルコギキョウ、アヤメ、蘭、アルストロメリアなどが含まれる。

本明細書で使用するところの、トランスジェニック自己発光植物には、少なくとも１つの植物細胞が含まれる。「植物細胞」は、直接種子または植物から取り出した、または植物から取り出した細胞の培養に由来する、植物の任意の細胞を意味する。植物細胞には、たとえば、未分化組織（たとえばカルス）、植物種子、珠芽、配偶体、胞子体、花粉、小胞子および胚からの細胞が含まれる。

植物細胞は典型的に、「プラスチド」を含み、これは、植物細胞内で自己の遺伝機構を持つオルガネラを意味する。プラスチドの例には、葉緑体、有色体、黄色体、ゲロントプラスト、白色体、原色素体、アミロプラスト、エライオプラストなどが含まれる。より高等の植物のプラスチドが、遺伝子工学に対して、魅力ある標的である。植物プラスチドは、光合成に加えて、アミノ酸、複合炭水化物、脂肪酸および色素のような重要な化合物の産出に対して関与しうる、主要な生合成中心である。プラスチドは、プロプラスチドとして公知の共通前駆体から由来し、したがって所定の植物種にて存在するプラスチドはすべて、同一の遺伝的成分を持つ。植物細胞は、いずこかに、５００〜１０，０００コピーの１２０〜１６０キロ塩基環状プラスチドゲノムを含んでよく、したがって植物細胞を、対象の特定の遺伝子の多数のコピーを含むように遺伝子工学的に改変し、上述プラスチドゲノム内に統合し、潜在的に結果として、非常に高レベルのトランスジーン発現となりうる。さらに、ほとんどの植物のプラスチドは、母系から遺伝する。その結果として、細胞核内に発現したトランスジーンとは違い、プラスチド中に発現した異種遺伝子は、花粉として広がらず、したがって、植物プラスチド内に導入した形質は、花粉によって野生型相対物まで伝播せず、これによってトランスジーンがエスケープすることを防止する。

トランスジェニック自己発光植物はさらに、発現可能な異種ヌクレオチド配列を含む。語句「発現可能」、「発現した」およびその変異型は、ｍＲＮＡへヌクレオチド配列を転写し、このｍＲＮＡを翻訳して、生物学的または生化学的機能を提供するペプチドを合成する、細胞の能力を意味する。好ましくは、細胞は植物細胞である。

本明細書で使用するように、「異種」は、特定の宿主またはゲノムに対して、外来または非天然であることを意味する。したがって、「異種ヌクレオチド配列」または「トランスジーン」は、宿主有機体に対して外来の種を起源とするヌクレオチド配列を意味し、またはヌクレオチド配列が宿主と同一の種を起源とする場合、ヌクレオチド配列は、熟考された遺伝的操作によって、組成物中および／またはゲノム遺伝子内で、その天然の形態から本質的に改変される。語句「ヌクレオチド配列」は、ＲＮＡまたはＤＮＡのような、２つまたはそれ以上のヌクレオチドの配列を意味する。「異種タンパク質」は、宿主細胞に対して外来または非天然であるタンパク質を意味し、典型的には、異種ヌクレオチド配列によってコードされる。

ＬＵＸオペロン
ＬＵＸオペロンは、以下の順番、Ｃ−Ｄ−Ａ−Ｂ−Ｅ−Ｇで、６つの発光遺伝子を含む。Ｌｕｘ ＡおよびＢ遺伝子は、ルシフェラーゼサブユニットをコードする。ＬｕｘＣ、ＤおよびＥ遺伝子は、反応のためのアルデヒドを産出する脂肪−リダクターゼ複合体をコードする。Ｌｕｘ Ｇ遺伝子は、交換因子をコードし、ＦＭＮＨ_２ターンオーバーを促進する。

Ｌｕｘ ＣＤＥ遺伝子によってコードされる酵素複合体は、基礎脂肪酸生合成サイクルからの脂肪酸の範囲を迂回させ、脂肪酸をアルデヒド基質に変換し、発光反応に向かわせる。他の基質である、ＦＭＮＨ_２は、細菌ならびに植物プラスチド内で天然に産出される。発光細菌中でのＦＭＮＨ_２産出に対する経路の１つは、いくつかの種ではＬＵＸオペロンに近接している、ＲＩＢオペロン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）によってコードされる。

１つの実施様態において、異種ヌクレオチド配列には、細菌ＬＵＸオペロンが含まれる。完全細菌ＬＵＸオペロンの利用によって、本来備わっている発光（または「自己発光」）が許容され、これは化学物質または基質の外部添加、および／または任意の他の種類の外部操作に対する要求なしに、光の産出に対するすべての必要な要素を含む、トランスジェニック細胞の能力を意味する。

語句「オペロン」は、一緒に転写される遺伝子の一群をコードしているヌクレオチド配列を意味する。語句「遺伝子」は、染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはペプチド、ポリペプチド、タンパク質をコードしている他のＤＮＡ、ＲＮＡ分子、および発現の制御に関与しコード配列に隣接する領域を意味する。いくつかの遺伝子は、ｍＲＮＡに転写され、ポリペプチドに翻訳され（構造遺伝子）、他の遺伝子は、ＲＮＡ（例えばｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）に転写され、他の型の遺伝子は発現の調節遺伝子として機能する。

本明細書で使用するところの語句「ＬＵＸオペロン」は、自己発光のための少なくとも６つの遺伝子を含むオペロンを意味する。６つの遺伝子には、ＬＵＸ Ａ、ＬＵＸ Ｂ、ＬＵＸ Ｃ、ＬＵＸ Ｄ、ＬＵＸ ＥおよびＬＵＸ Ｇ遺伝子が含まれる。

本発明の目的のために、ＬＵＸオペロンに相当する遺伝子、および植物中の細菌ルシフェラーゼの適切な機能のために必要な任意の他の遺伝子が、発光細菌のゲノムより単離される。例えば、ＬＵＸオペロンおよびＬＵＸ Ａ、ＬＵＸ Ｂ、ＬＵＸ Ｃ、ＬＵＸ Ｄ、ＬＵＸ ＥおよびＬＵＸ Ｇ遺伝子は、発光を産出するためにＬＵＸ遺伝子を発現する任意の発光細菌より由来してよい。

完全ＬＵＸオペロンをコードしているヌクレオチド配列の例は、登録番号ＡＹ３４１０６２（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ［Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ株ＡＴＣＣ７７４４ ｌｕｘオペロン、完全配列］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、ＥＵ１９２０８２（Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ［Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ ＢＣＢ４４０ｌｕｘオペロン、完全配列］）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ＡＦ４０３７８４（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ（以前はＺｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｋｉｎｅｓｃｅｎｓｅとして呼ばれた［Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ ｌｕｘオペロン、完全配列］）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、およびＡＢ２６１９９２（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｈａｎｅｄａｉ［Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｈａｎｅｄａｉ ｌｕｘオペロン（ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＥ、ｌｕｘＧ）遺伝子および近接領域、株：ＮＣＩＭＢ２１５７］）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、およびＭ６３５９４（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｉｏｇｎａｔｈｉ［Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｉｇｏｎａｔｈｉ ｌｕｘオペロン（ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＥ、ｌｕｘＧ）遺伝子、完全ｃｄｓ］）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）およびＤＱ９８８８７３（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｕｍ［Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｕｍ株ＡＴＣＣ１１０４０、完全ＬＵＸおよびＲＩＢオペロン］）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）下、ＧｅｎＢａｎｋにて存在する。

ＬＵＸ Ａ、ＬＵＸ Ｂ、ＬＵＸ Ｃ、ＬＵＸ Ｄ、ＬＵＸ ＥおよびＬＵＸ Ｇ遺伝子をコードしているヌクレオチドの例は、以上で列記した完全ＬＵＸオペロンをコードしているヌクレオチド配列内に含まれる。例えば、以下のＬＵＸ遺伝子が、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ６３５９４（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｉｏｇｎａｔｈｉ［Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｉｇｏｎａｔｈｉ ｌｕｘオペロン（ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＥ、ｌｕｘＧ）遺伝子、完全ｃｄｓ］）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）から由来した、ＬＵＸ Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、ＬＵＸ Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、ＬＵＸ Ｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、ＬＵＸ Ｄ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、ＬＵＸ Ｅ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）およびＬＵＸ Ｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）。

ＬＵＸ Ｅ遺伝子のさらなる例には、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｈｅｒｉ［Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ ＬｕｘＥ遺伝子、部分ｃｄｓおよびＬｕｘＧ遺伝子、完全ｃｄｓ］）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）に対するＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ６２８１２で存在する。ＬＵＸ Ｇのさらなる例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｉｏｇｎａｔｈｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＃ Ｍ６３５９４由来）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｕｍ（ＤＱ９８８８７３由来））、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７（Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ（ＥＵ１９２0８２由来））、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ（Ｍ６２８１２由来））およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｈａｎｅｄａｉ（ＡＢ２６１９９２由来））の配列中に存在する。

ＬＵＸオペロンおよびＬＵＸ Ａ、ＬＵＸ Ｂ、ＬＵＸ Ｃ、ＬＵＸ Ｄ、ＬＵＸ ＥおよびＬＵＸ Ｇ遺伝子のヌクレオチド配列は、野生型有機体より由来してよい。野生型は、通常の遺伝子、または任意の公知の変異がない天然にて見られる有機体を意味する。本発明内の他のヌクレオチド配列には、ＬＵＸ Ａ、ＬＵＸ Ｂ、ＬＵＸ Ｃ、ＬＵＸ Ｄ、ＬＵＸ ＥおよびＬＵＸ Ｇタンパク質の変異体をコードしているヌクレオチド配列、これらのタンパク質の変異体形態、組換え体形態、または天然に存在しない変異体形態をコードするヌクレオチド配列が含まれる。

いくつかの典型的実施形態において、異種ヌクレオチド配列には、例えばＶｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ ＦＲＰ遺伝子のような、ルシフェラーゼ基質の代謝に関連するさらなる遺伝子が含まれる。

プラスチド標的化配列
他の実施形態において、異種ヌクレオチド配列には、プラスチド標的化配列が含まれる。本明細書で使用するところの「プラスチド標的化配列」は、第二ポリペプチドを、植物細胞のプラスチドに指向させることが可能な、ポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を意味する。好ましくは、プラスチド標的化配列は、葉緑体標的化配列である。

非葉緑体タンパク質は、葉緑体標的化配列によってコードされたペプチドとのタンパク質融合を用いることで、葉緑体を標的としうることが本技術分野で公知である。例えば、異種ヌクレオチド配列のルシフェラーゼ遺伝子を、プラスチド標的化配列に融合してよい。ルシフェラーゼ遺伝子が発現する場合、標的化配列が、翻訳されたポリペプチド内に含まれる。標的化配列はついで、当該ポリペプチドを、葉緑体のようなプラスチドに指向させる。

典型的には、葉緑体標的化配列は、（葉緑体運搬ペプチド（ＣＴＰ）または運搬ペプチド（ＴＰ）と呼ばれる）ポリペプチド伸長をコードする。ポリペプチド伸長は典型的には、異種ヌクレオチド配列によってコードされる異種ペプチドのＮ−末端に連結する。

葉緑体標的化配列の例には、タバコリブロースビスホスフェートカルボキシラーゼ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）小サブユニット（ＲｂｃＳ）運搬ペプチド、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＥＰＳＰＳ葉緑体運搬ペプチド、Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｄｒｉｄａ ＥＰＳＰＳ葉緑体運搬ペプチド、および米ｒｂｃＳ遺伝子葉緑体標的化配列をコードする配列が含まれる。

葉緑体標的ペプチドのさらなる例には、リブロース−１，５−ビホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニット（ＳＳＵ）、集光性複合体タンパク質Ｉおよびタンパク質ＩＩが含まれる。好適な葉緑体標的化ペプチドの組み込みが、異種タンパク質配列を、トランスジェニック植物中で葉緑体に対して標的化することが示されてきた。当業者は、必要であれば、特定のＣＴＰの、所定の遺伝子産物を葉緑体に輸入する機能を利用するために、種々のキメラ構造を作成可能であることを認識するであろう。

本発明を実施するために有用であり得る他のＣＴＰｓには、ＰｓＲｂｃＳ−由来ＣＴＰｓ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ Ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニットＣＴＰ）、ＡｔＲｂｃＳ ＣＴＰ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニット１Ａ ＣＴＰ；ＣＴＰ１）、ＡｔＳｈｋＧ ＣＴＰ（ＣＴＰ２）、ＡｔＳｈｋＧＺｍ ＣＴＰ（ＣＴＰ２合成、単子葉植物発現のために最適化されたコドン）、ＰｈＳｈｋＧ ＣＴＰ（Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ ＥＰＳＰＳ、ＣＴＰ４；単子葉植物発現のために最適化されたコドン）、ＴａＷａｘｙ ＣＴＰ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ微小体結合デンプンシンターゼＣＴＰ合成、モロコシ発現のために最適化されたコドン）、ＯｓＷａｘｙ ＣＴＰ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａデンプンシンターゼＣＴＰ）、ＮｔＲｂｃＳ ＣＴＰ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍリブロース１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ小サブユニット葉緑体運搬ペプチド）、ＺｍＡＳ ＣＴＰ（Ｚｅａ ｍａｙｓアントラニレートシンターゼアルファ２サブユニット遺伝子ＣＴＰ）、およびＲｇＡＳ ＣＴＰ（Ｒｕｔａ ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓアントラニレートシンターゼＣＴＰ）が含まれる。有用であり得る他の運搬ペプチドには、トウモロコシｃａｂ−ｍ７シグナル配列およびエンドウ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）グルタチオンリダクターゼシグナル配列が含まれる。

そのような標的化配列のさらなる例には、ホウレンソウルマジンシンターゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）およびＲｕｂｉｓｃｏアクチバース（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）運搬ペプチドなどが含まれうる。

葉緑体標的化配列を、葉緑体または他のプラスチドに対して、異種ヌクレオチド配列によってコードされた任意のペプチドを標的化するために使用してよい。１つの実施形態において、葉緑体標的化配列は、ＬＵＸ Ａ、ＬＵＸ Ｂ、ＬＵＸ Ｃ、ＬＵＸ Ｄ、ＬＵＸ ＥおよびＬＵＸ Ｇ遺伝子の５’−または３’−末端に連結する。他の実施形態において、葉緑体標的化配列は、蛍光タンパク質をコードしている遺伝子の５’−または３’−末端に連結する。

ベクター
１つの実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、単一のベクター内に配置可能である。例えば、異種ヌクレオチド配列は、単一ベクター内に６ＬＵＸ遺伝子を含んでよい。他の実施形態において、６ＬＵＸ遺伝子の１つをコードしている異種ヌクレオチド配列を、各ＬＵＸ遺伝子のために異なるベクター内に配置可能であり、結果として複数の異なるベクターとなる。異種ヌクレオチド配列は、自己発光を促進するための補因子をコードしている少なくとも１つの遺伝子をさらに含んでよい。

本明細書で使用するところの語句「ベクター」は、ヌクレオチド配列を宿主内に導入するために使用する媒体を意味する。ベクターはプラスチド、コスミド、ファージ、トランスポゾン、ウイルス、または任意の他の好適な媒体であってよい。好ましくは、ベクターはプラスミドである。ベクターには、プロモーター、リボソーム結合部位および末端配列を含むがこれに限定されない、宿主内での遺伝子産物の発現のために有用な制御配列が含まれてよい。１つの好ましい実施形態において、ベクターは、本発明の他の様態にて以下記載するように、プラスチドを形質転換するためのベクターである。

多くのベクターが、植物細胞またはプラスチドの安定的形質転換のために好適である。したがって、ＬＵＸ遺伝子を、核または葉緑体ゲノム内に伝達しうる。

１つの実施形態において、核宿主ＤＮＡの形質転換のために、ベクターはバイナリーベクターである。「バイナリーベクター」は、Ｔｉプラスミドからの改変Ｔ領域を含み、これは大腸菌内およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞内での複製を許容し、通常選別マーカー遺伝子を含む。好ましくは、ベクターは、ｐＳＡＴベクター由来の組み立て利用発現カセット、バイナリーｐＰＺＰ−ＲＣＳベクターである（ＴｚｆｉｒａＴ、Ｔｉａｎ ＧＷ、Ｌａｃｒｏｉｘ Ｂ、Ｖｙａｓ Ｓ、Ｌｉ Ｊ、Ｌｅｉｔｎｅｒ−Ｄａｇａｎ Ｙ、Ｋｒｉｃｈｅｖｓｋｙ Ａ、Ｔａｙｌｏｒ Ｔ、Ｖａｉｎｓｔｅｉｎ Ａ、Ｃｉｔｏｖｓｋｙ Ｖ．（２００５）、”ｐＳＡＴ ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ ｍｏｄｕｌａｒ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｆｏｒ ａｕｔｏｆｌｏｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｇｇｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ．”Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５７（４）：５０３−１６）。

ｐＳＡＴベクターは、植物プロモーター、ＭＣＳおよび植物ターミネーターを含み、１つのトランスジーンのサブクローニングと発現を許容する。プロモーター／対象の遺伝子／ターミネーター配列を含むカセットは、ホーミングエンドヌクレアーゼを用いてｐＳＡＴベクターより由来し、ｐＰＺＰ−ＲＣＳベクターの同一部位内にサブクローン化される。ｐＰＺＰ−ＲＣＳは、そのＭＣＳ中のホーミングエンドヌクレアーゼ酵素認識部位を含み、多数（６以上）のｐＳＡＴｓ由来カセットの、その中へのクローニングを許容し、したがって、単一のバイナリー（アクセプター）ベクターが供給される。このベクターシステムは、バイシストロニックＲＮＡまたは内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）を必要とすることなしに、多数の核トランスジーン発現を許容する。したがって、ｐＳＡＴベクターの利用によって、単一アクセプターベクター内への多数の遺伝子の導入が許容される。多数の遺伝子を含む単一ｐＰＺＰ−ＲＣＳアクセプターベクターが、ついで３またはそれ上の続く植物形質転換の必要なく、単一形質転換事象にて植物内に導入される。

特定のｐＳＡＴｓおよびＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号は、ｐＳＡＴ１−ＥＧＦＰ−Ｃ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、ｐＳＡＴ２−ＥＧＦＰ−Ｃ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）、ｐＳＡＴ３−ＥＧＦＰ−Ｃ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）、ｐＳＡＴ４−ＥＧＦＰ−Ｃ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）、ｐＳＡＴ５−ＥＧＦＰ−Ｃ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）、ｐＳＡＴ６０ＥＧＦＰ−Ｃ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）およびｐＳＡＴ７−ＥＧＦＰ−Ｃ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）であり、各々のＮＣＢＩ番号は、ＡＹ８１８３６３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、ＡＹ８１８３６５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）、ＡＹ８１８３６６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）、ＡＹ８１８３６７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）、ＡＹ８１８３６８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）、ＡＹ８１８３７７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）およびＡＹ８１８３８４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）である。

他の実施形態において、ベクターはプラスチド（葉緑体）形質転換ベクターである。典型的には、葉緑体形質転換ベクター中のトランスジーンには、プラストームの領域に相同的であるＤＮＡ領域である、「相同組換え部位」が隣接する。「プラストーム」はプラスチドのゲノムを意味する。相同組換え部位は、相同組換えの工程による、トランスジーン発現カセットのプラストームへの部位特異的統合を可能にする。相同組換えは、プラスチド内で天然に発生する工程である。相同組換えは、植物核ゲノム内のランダムトランスジーン統合とは異なる。葉緑体形質転換ベクターの例は、ｐＰＲＶベクターシリーズ（Ｌｕｔｚ Ｋ．Ａ．，Ａｚｈａｇｉｒｉ Ａ．Ｋ．，Ｔｕｎｇｓｕｃｈａｔ−Ｈｕａｎｇ Ｔ．，Ｍａｌｉｇａ Ｐ．（２００７）”Ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｃｈｏｏｓｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｓｔｉｄ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ”Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４５（４）：１２０１−１０）である。

本発明の好ましい実施形態において、完全または部分的ＬＵＸオペロンは、葉緑体ゲノムより直接発現される。葉緑体ゲノム内への遺伝子の挿入は、全ＬＵＸオペロンを葉緑体形質転換ベクター内にクローン化することによって実施される。そのようなクローニングの方法には、葉緑体をベクターで形質導入すること、および葉緑体ゲノムコピーの集団を標準の方法を用いて同質までもっていくことが含まれてよい（Ｌｕｔｚ Ｋ．Ａ．，Ｓｖａｂ Ｚ．，Ｍａｌｉｇａ Ｐ．（２００６）“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｒｋｅｒ−ｆｒｅｅ ｔｒａｎｓｐｌａｓｔｏｍｉｃ ｔａｂａｃｃｏ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．”Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．１（２）：９００−１０）。

プロモーター
本明細書で記載するところの異種ヌクレオチド配列またはベクターには、プロモーターのような、宿主内の遺伝子産物の発現のために有用な制御配列が含まれてよい。語句「プロモーター」は、コード配列の発現を管理することが可能なヌクレオチド配列を意味する。プロモーターは、動作可能に連結したヌクレオチド配列の発現を駆動する。本明細書で記載するところの「動作可能に連結する」は、プロモーターがヌクレオチド配列の転写を仲介するようなヌクレオチド配列に対するプロモーターの連結を意味する。「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を意味する。プロモーターは典型的には、コード配列に対して上流（５’）に位置する。

広く種々のプロモーターが本技術分野で公知であり、異種ヌクレオチド配列中の遺伝子の発現を促進するために使用してよい。好適なプロモーターの例には、構成的プロモーター、植物組織−特異的プロモーター、植物発育−特異的プロモーター、誘導可能プロモーター、サーカディアンリズムプロモーター、ウイルスプロモーター、オス生殖細胞−特異的プロモーター、メス生殖細胞−特異的プロモーター、花−特異的プロモーターおよび野菜根頂端分裂組織−特異的プロモーターが含まれる。

「構成的」プロモーターは、すべての時点で、すべての細胞型にて遺伝子の発現となるプロモーターを意味する。構成的プラスチドプロモーターの例は、（ｐＣＬＴ１４６、ＧｅｎｅＢａｎｋ＃ＤＱ４６３３５９由来の）ｐｓｂＡ、光化学系ＩＩ反応中心プロモーター、および、（ｐＮ−ＩＣ１０１、ＧｅｎｅＢａｎｋ ＃ＡＹ４４２１７１由来の）ｒｒｎ葉緑体１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子プロモーターである。

核ゲノム構成的植物プロモーターの例には、ほとんどの植物細胞内での構成的な、高レベル発現を与える、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、オクトパインシンターゼプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス１９Ｓプロモーター、米アクチンＩプロモーター、マノパインシンターゼプロモーターおよびヒストンプロモーターが含まれる。さらに好適な構成的プロモーターには、Ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニット（ＳＳＵ）プロモーター、レグミンＢプロモーター、ＴＲデュアルプロモーター、ユビキチンプロモーターおよびＳｕｐｅｒプロモーターが含まれる。異なる異種ヌクレオチド配列またはベクターは、クロモソーム上の種々の構成的遺伝子が、同一のプロモーターから発現する場合に、遺伝子サイレンシングを防止するために、異なるプロモーターを含んでよい。

「誘導可能」プロモーターは、ストレスまたは刺激に対する応答にて調節されるプロモーターを意味する。誘導可能プロモーターの例には、テトラサイクリンレプレッサーシステム、Ｌａｃレプレッサーシステム、銅−誘導可能システム、（ＰＲ１ａシステムのような）サリチル酸塩−誘導可能システム、およびアルコール−誘導可能システムが含まれる。さらなる例には、環境、ホルモン、化学物質および／または発生上ストレスまたは刺激に対する応答で調節される誘導可能なプロモーターが含まれる。そのようなストレスまたは刺激には、熱（たとえばトマトｈｓｐ７０プロモーターまたはｈｓｐ８０プロモーター）、光、アブシジン酸のようなホルモン（たとえば、ステロイド−誘導可能ＭＭＴＶ ＬＴＲプロモーター）、メチルジャスモン酸、サリチル酸のような化学物質、塩分増加、干ばつ、病原菌（たとえばＰＲＰ１遺伝子のプロモーター）、重金属（たとえば重金属−誘導可能メタロチオネイン１プロモーターおよびタバコ遺伝子ｃｄｉＧＲＰのプロモーター管理発現、および傷（たとえばｐｉｎＩＩプロモーター）が含まれる。好ましくは、プロモーターは、重金属によって誘導されるプロモーターである。

本明細書で使用するところの「組織特異的」プロモーターは、特定の組織に対して動作可能に連結したヌクレオチド配列の発現を駆動するプロモーターを意味する。組織特異的プロモーターは、（葉または種子のような）特定の器官、（胚または子葉のような）特定の組織または（種子保存細胞または葉柔組織のような）特定の細胞型中の１つまたはそれ以上の細胞型での遺伝子の発現を駆動する。例には、カルコンシンターゼ（ＮＣＢＩ登録ＡＢ００５４８４）に対するＧｅｎｔｉｎａ ｔｒｉｆｌｏｒａプロモーター、β−コングリシニン、ナピンプロモーターおよびファセオリンのような種子−特異的プロモーター、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからのＳＡＧプロモーターのような、成熟葉−特異的プロモーターが含まれる。

サーカディアンリズムサイクルに応答性のプロモーターもまた、異種ヌクレオチド配列またはベクター内で使用可能である。そのようなプロモーターには、天然ＥＬＦ３プロモーターおよびクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質からのプロモーター（ＣＡＢ２プロモーター）が含まれる。

Ｐｒｒｎプロモーター
１つの実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、短縮Ｐｒｒｎプロモーターに動作可能に連結する。Ｐｒｒｎプロモーターは、１６Ｓ ｒＲＮＡオペロンプロモーターであり、典型的には、タバコプラスチド１６Ｓ ｒＲＮＡオペロンプロモーターである。典型的Ｐｒｒｎプロモーターは、長さにして約１５０ｂｐである。Ｐｒｒｎプロモーターの配列の例を以下に示す。

本明細書で使用するところの、「短縮」Ｐｒｒｎプロモーターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１のＰｒｒｎプロモーターより短いヌクレオチドをもつＰｒｒｎプロモーターを意味する。たとえば図１２を参照のこと。短縮Ｐｒｒｎプロモーターは、Ｐｒｒｎプロモーターと比較して、５’末端および／または３’末端にて短縮化されてよい。

１つの実施形態において、短縮Ｐｒｒｎプロモーターは長さにして１０ｂｐより長く、１５０より短い。好ましくは、短縮Ｐｒｒｎプロモーターは長さにして約８０ｂ〜１００ｂｐである。より好ましくは、短縮Ｐｒｒｎプロモーターは長さにして約９０〜９８ｂｐである。もっとも好ましくは、短縮Ｐｒｒｎプロモーターは長さにして約９５ｂｐである。

典型的な短縮Ｐｒｒｎプロモーターは、以下の配列を持つプロモーターを含む。

１つの実施形態において、プロモーターには、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘに記載している配列の位置１〜３９、４６〜６３および７０〜９５に、少なくとも９５％同一である配列が含まれ、そこで前記プロモーターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘに記載している配列の位置４０〜４５に１００％同一である。たとえば、プロモーターは、以下の位置、３、４、６、１６、３３、８４、７４、５６、９２または６１の任意の１つで、少なくとも１つの置換を持ってよい。

他の実施形態において、プロモーターには、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘに記載した配列の位置１〜３９、４６〜６３および７０〜９５に少なくとも９８％同一である配列が含まれる。

また他の実施形態において、プロモーターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘに記載した配列の位置１〜３９、４６〜６３および７０〜９５に少なくとも９９％同一である配列が含まれる。

典型的な短縮Ｐｒｒｎプロモーターは好ましくは保存領域を含む。本明細書で使用するところの語句「保存領域」または「保存ドメイン」は、原核生物およびプラスチドプロモーター中で保存される領域、すなわち−１０ ＴＡＴＡ領域および−３５要素を意味する。たとえば、保存領域には、異なる配列間で存在する比較的高い程度の配列同一性（約９８％〜１００％）が含まれる。１つの実施形態において、短縮Ｐｒｒｎプロモーターの保存領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に記載した配列の位置４０〜４５および／または位置６４〜６９である。

他の実施形態において、短縮Ｐｒｒｎプロモーターには、転写リーダー配列が含まれる。典型的な実施形態において、短縮Ｐｒｒｎプロモーターはさらに、たとえばＮｃｏＩ部位のような、プロモーターへリーダー配列を融合するための制限部位を含む。好ましい実施形態において、（イタリック体での）リーダー配列およびＮｃｏＩ部位（ＣＣＡＴＧＧ）を含む短縮Ｐｒｒｎプロモーターが、以下示すような配列を持つ。

リーダーおよびターミネーター配列
異種ヌクレオチド配列またはベクターはまた、（ｐＣＬＴ５１６、ＧｅｎｅＢａｎｋ ＃ＤＱ８８２１７７：（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）から由来する）ｒｂｃＬ、リブロース−ビスホスフェートカルボキシラーゼ遺伝子リーダー配列、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏコンセンサスリボソーム結合配列（ＡＧＧＡＧＧ）および（ｐＣＬＴ１４６由来、ＧｅｎｅＢａｎｋ ＃ ＤＱ４６３３５９、（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）光化学系ＩＩ反応中心ターミネーターであるｐｓｂＡ、およびｒｐｓＩ６遺伝子ｒｐｓＩ６ターミネーター（ｐＬ３ベクターシリーズ由来、ＧｅｎｅＢａｎｋ ＃ ＥＵ５２０５８９、ＥＵ５２０５８８、ＥＵ５２０５８７：（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）のようなターミネーターを含んでもよい。他の典型的ターミネーターは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓターミネーターである。

マーカー
さらに、異種ヌクレオチド配列またはベクターには、選別可能および／またはスクリーン可能マーカーに関するヌクレオチド配列が含まれうる。「選別マーカー」は、選択培地レジメ中で増殖した、形質転換植物細胞の生存または増殖のために必要なタンパク質を意味する。典型的な選択マーカーには、抗生物質、農薬または他の毒素のような、選択的薬剤に対する抵抗性を与えるタンパク質をコードする配列が含まれる。選別マーカーの例には、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、Ｇ４１８、ネオマイシン、ブレオマイシン、ヒグロマイシン、メトトレキサート、ジカンバ、グルホシネートまたはグリホサートのような抗生物質に対する抵抗性を与えるための遺伝子が含まれる。

種々の他の選別マーカーが、非形質転換細胞に対して、形質転換した細胞に、増殖に関連したアドバンテージを与える。例には、（たとえば、サイトカイニン グルクロナイドに連結した）β−グルクロニダーゼ、（マンノースに連結した）マンノース−６−リン酸イソメラーゼ、および（たとえばガラクトースに連結した）ＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼが含まれる。

選別マーカーには、（たとえば、耐性遺伝子、ａａｄＡによってコードされた）スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、ゲンタマイシン、ヒグロマイシン、メトトレキサート、ブレオマイシン、フィレオマイシン、ブラスチシジン、スルホンアミド、ホスフィノスレシン、クロルスルフロン、ブロモキシニル、グリホサート、２，４−Ｄ、アトラジン、４−メチルトリプトファン、硝酸塩、Ｓ−アミノエチル−Ｌ−システイン、リシン／スレオニン、アミノエチル−システインまたはベタインアルデヒドに対する耐性を与えるものが含まれる。好ましくは、選別マーカーは、プラスチド内で機能的である。とりわけ好ましいのは、遺伝子ａａｄＡ（ＧｅｎｅＢａｎｋ ＮＣ＿００９８３８）、ｎｐｔＩＩ（ＧｅｎｅＢａｎｋ ＦＭ１７７５８３）、ＢＡＤＨ（ＧｅｎｅＢａｎｋ ＡＹ０５０３１６）、ａｐｈＡ−６（ＧｅｎｅＢａｎｋ Ｘ０７７５３）である。

異種ヌクレオチド配列を宿主細胞内に導入した後、植物または細胞のプラストーマまたはゲノムから、特定の配列を除去するまたは削除することが有益であり得る。たとえば、選別マーカーがもはや選別相以降必要ではない場合、ゲノム内へ導入した選別マーカー遺伝子を除去することが有益であり得る。配列の有向削除のための方法が本技術分野で公知である。たとえば、選別マーカーをコードしているヌクレオチド配列には好ましくは、部位特異的組換えを用いて選別マーカー遺伝子の除去を許容する、Ｃｒｅ−ｌｏｘおよびａｔｔB／ａｔｔＰ認識配列のような、相同性に基づく切除要素が含まれる。

１つの実施形態において、異種ヌクレオチド配列またはベクターには、レポーター遺伝子が含まれる。レポーター遺伝子は、その色または酵素活性を介して、形質転換効率、発現の部位または時間の査定、またはトランスジェニック植物の同定を許容する、容易に定量可能なタンパク質をコードしている。レポーター遺伝子の例には、グリーンフルオレセントタンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダ−ゼ（ＧＵＳ）、Ｒ−Ｌｏｃｕｓ遺伝子産物、β−ラクトマーゼ、ｘｙ１Ｅ遺伝子産物、アルファ−アミラーゼおよびチロシナーゼが含まれる。

異種ヌクレオチド配列またはベクターは、異なる波長で、異なる時間間隔で、または異なる条件下で、励起または蛍光を発する蛍光タンパク質をコードしている配列を含んでよい。そのような蛍光タンパク質の例には、赤色波長にて蛍光を発し、光を放射する、ＤｓＲｅｄ（ＧｅｎｅＢａｎｋ ＃ＥＵ８２７５２７、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ遺伝子、合成構造）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）、または緑色波長にて蛍光を発し、光を放射するＧＦＰが含まれる。

機能的要素
異種ヌクレオチド配列またはベクターには、本発明の範囲内で使用される異種ヌクレオチド配列またはベクターの産出、操作、機能、利用または値に影響を与える、機能的要素が含まれてよい。機能的要素の例には、たとえば大腸菌中、またはプラスチド中で、本発明にしたがった異種核酸配列またはベクターの増幅を可能にする、複製起源（ＯＲ１）、１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列の挿入を許可し、促進する、多重クローニング部位（ＭＣＳｓ）、プラスチドゲノム内へトランスジーンの安定組換えを許容する、異種組換え部位、およびたとえばＴ−ＤＮＡの右または左ボーダー、またはｖｉｒ領域のような、植物ゲノム内への伝達または統合のための、植物細胞内への異種ヌクレオチドまたはベクターのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−仲介伝達を可能にするボーダー配列が含まれる。

異種ヌクレオチド配列またはベクターには任意に、異種ヌクレオチド配列中のポリペプチド−コード配列の上流または下流または内に位置してよい、ＲＮＡプロセシングシグナル、例えばイントロンが含まれてよい。イントロン配列が、植物細胞内の異種ヌクレオチド配列の発現を、補助することが、本技術分野で公知である。

補因子
他の実施形態において、異種ヌクレオチド配列またはベクターには、自己発光を促進するための補因子をコードしている少なくとも１つの遺伝子が含まれる。本明細書で使用するところの、語句「補因子」は、酵素活性に必要な有機分子、無機分子、ペプチドまたは
タンパク質を意味する。ＬＵＸ遺伝子によってコードされたタンパク質産物は、自己発光を誘導するために、ＦＭＮＨ_２プールおよび脂肪酸前駆体を再生成し、増幅するための補因子を必要としてよい。

本発明のいくつかの適用において、発光のレベルは、リボフラビン生合成に関与する遺伝子（すなわちＲＩＢオペロンまたはフラビンリダクターゼ）および／または脂肪酸ドナーをコードしている遺伝子（すなわち、脂肪酸シンターゼ［ＦＡＳＩまたはＦＡＳＩＩいずれか］経路に属する遺伝子）の導入によって促進されてよい。とりわけ、ある実施形態において、リボフラビン合成に関与する（たとえば（それぞれリボフラビンシンターゼまたはルマシンシンターゼをコードしている）ｒｉｂＥおよびｒｉｂＨ遺伝子または全体としてＲＩＢオペロンのような）ＲＩＢオペロンの一成分、および／または細菌または植物アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）のようなアルデヒド合成のための脂肪酸のドナーを、異種ヌクレオチド配列またはベクターの部分として、植物細胞内に形質転換可能である。植物内で、ＡＣＰは、脂肪酸生合成および代謝の反応中に参加する、小補因子タンパク質として存在する。また、大腸菌からのＦｒｅ、Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉからのＦｒｐのような、フラビンリダクターゼ酵素を、ＦＭＮＨ_２ターンオーバーを増加させるために導入可能である。

自己発光を増幅するために好適な補因子の特定の例には、ＲＩＢオペロンによってコードされたポリペプチド（ＧｅｎｅＢａｎｋ登録ＡＦ３６４１０６）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８）、細菌アシルキャリアタンパク質、植物アシルキャリアタンパク質、形質転換活性物、およびルミネッセンス（Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ（ＧｅｎｅＢａｎｋ ＃Ｄ１７７４５）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）およびＶ ｆｉｓｃｈｅｒｉ（ＧｅｎｅＢａｎｋ ＃Ｄ１７７４４）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０）またはＶｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉＦＲＰ（ＧｅｎｅＢａｎｋ ＃ＶＨＵ０８９９６）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４）または他の細菌（大腸菌ＦＲＥ、ＧｅｎｅＢａｎｋ＃ＮＣ＿０１０４７３）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）いずれかからのＦＲＥフラビンリダクターゼ酵素によってコードされたポリペプチドが含まれる。好適な補因子のさらなる例には、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＲＦＫ（ＧｅｎｅＢａｎｋ ＃ＮＣ＿００３０７５）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２）または細菌大腸菌ＲＦＫ（ＧｅｎｅＢａｎｋ ＃ＮＣ＿００９８０１）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３）のような、リボフラビンキナーゼ（ＰＦＫ）が含まれる。

本明細書で使用するところの自己発光を「増幅する」は、補因子なしでの場合よりも自己発光強度が増加するか、または明るさが大きいことを意味する。自己発光を増幅することにはさらに、自己発光のための反応を続けるかまたは復活させるために、枯渇したルシフェラーゼまたは他の基質または補因子または他のタンパク質に活気を与えることが含まれる。

語句「ＲＩＢオペロン」は、リボフラビンの産出に必須のタンパク質をコードしている遺伝子を含むオペロンを意味する。Ｂａｃｉｌｌｕｓ種に属する細菌内でのＲＩＢオペロンには、以下の遺伝子、制御要素をコードしているｒｉｂＯ遺伝子、デアミナーゼ／リダクターゼをコードしているｒｉｂＧ遺伝子、リボフラビンシンターゼ（ａ−サブユニット）をコードしているｒｉｂＢ遺伝子、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ／３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン−４−ホスフェートシンターゼをコードしているｒｉｂＡ遺伝子、ルマシンシンターゼをコードしているｒｉｂＨ遺伝子、未知の機能を持つタンパク質をコードしているｒｉｂＴ遺伝子が含まれる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのｒｉｂＧ、ｒｉｂＢ、ｒｉｂＡ、ｒｉｂＨおよびｒｉｂＨ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにて、登録番号Ｘ５１５１０（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓリボフラビン生合成オペロンｒｉｂＧ、ｒｉｂＢ、ｒｉｂＡ、ｒｉｂＨおよびｒｉｂＴ遺伝子）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５）下提示されている。大腸菌に対するｒｉｂ遺伝子には、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ、３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン−４−ホスフェート（ＤＨＢＰ）シンターゼおよびリボフラビンシンターゼをそれぞれコードするｒｉｂ、ｒｉｂＡ、ｒｉｂＥが含まれる。大腸菌のｒｉｂ、ｒｉｂＡおよびｒｉｂＥ遺伝子のヌクレオチド配列は、ＥＢＩにて、それぞれ登録番号ＡＢＶ１７１５８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）およびＣＡＡ４８８６１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）下で提示される。同様に、ｒｉｂＥ、Ｈ、ＢおよびＡ遺伝子をコードしている、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｉｏｇｎａｔｈｉ株ＰＬ７４１、ＲＩＢオペロンが、登録番号ＡＦ３６４１０６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８）下、ＧｅｎｅＢａｎｋにて見ることができる。

語句「植物アシルキャリアタンパク質」または「細菌シルキャリアタンパク質」は、それぞれ、植物または細菌中に見られる天然に存在するＡＣＰ分子の必須機能的特性を持つ、任意のアシルキャリアタンパク質を意味する。植物または細菌シルキャリアタンパク質をコードしているヌクレオチド配列には、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＡＣＰ（ＥＢＩ＃ Ｘ１３７０８）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９）およびＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＡＣＰ（ＥＢＩ＃：ＥＡＲ５３４５９）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）のように、ＧｅｎｅＢａｎｋにて提示されるものが含まれる。

発光の増加および／または改変
他の実施形態において、自己発光レベルは、光放射反応に関与する酵素の活性の増加によって増大可能である。たとえば、ＬＵＸオペロンまたはルシフェラーゼを、強力なプロモーター下で発現させることが可能であり、それによって当該細胞内でのＬＵＸオペロンタンパク質の濃度が上昇し、したがって強力なプロモーターなしでの細胞と比較して、より大きな光出力となる。

ＬＵＸオペロンによってコードされたルシフェラーゼおよび／または他のタンパク質を増加させるためのさらなる例示的方法には、指向進化、タンパク質工学および合理的デザインが含まれる。たとえば、指向進化は、指向進化を受けなかった同一の天然に存在する酵素と比較して、酵素活性、選択性、安定性および他のパラメーターを有意に改善するために使用可能な、本技術分野で公知のツールである。たとえば、グリホサートＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ）に対する指向進化法の適用によって、結果として、親酵素のものと比較して、触媒効率が１０，０００−倍改善した変異体となり、他の例は、親ルシフェラーゼよりも、不活性化に対して２００倍耐性であり、４倍高い光出力を産する、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼがあげられる。さらなる例示的方法には、本技術分野で公知のようなコドン最適化、および／またはプラスチド内で、特定の遺伝子の発現を増強するか、または遺伝子発現を調整するための、種々のリボソーム結合部位の利用が含まれる。

他の実施形態において、放射光の波長（色）を改変可能である。植物発現細菌ルシフェラーゼによって放射される光の色は、２つの以下の例示的アプローチのいずれかによって、変化させ、改変することが可能である。（ｉ）異なるルシフェラーゼの酵素特性を変化させるために本技術分野で公知のような、指向進化およびタンパク質遺伝的改変を用いる、ルシフェラーゼ特性の変化、（ｉｉ）適切な発色団に連結すること。たとえば、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）は、約４９０ｎｍにて励起ピークを、約５１０ｎｍにて放射ピークを持つ。細菌ルシフェラーゼ（約４９０ｎｍにて放射）のＥＧＦＰとの連結によって、異なる放射スペクトルへの発光のさらなるシフトと、当該組織中の色素干渉の防止が許容される。他の例は、特定のＶ．ｆｉｓｃｈｅｒｉ株からのＬｕｘＹにコードされる黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）が挙げられる。ＹＦＰは、約４９０ｎｍからより長い波長への発光のシフトを引き起こし、結果として、青−緑光ではなく、黄色の放射となる。光放射のシフトは、同一の観賞植物産物の多数の改変物の産出、放射光の色の違い両方のために、ならびに色素吸収ピークからの放射ピークのシフトによる植物色素によるルシフェラーゼ放射光の吸収の減少のために有益である。

他の実施形態において、自己発光植物は、不稔性にされ、生殖不可能にされる。たとえば、異種ヌクレオチド配列は、不稔オペロンを含んでよく、これは、再生産不可能な植物を与える、１つまたはそれ以上の遺伝子を意味する。不稔オペロンは本技術分野で公知である。

他の実施形態において、異種ヌクレオチド配列には、植物−胚特異的プロモーターに動作可能に連結した毒素コード配列が含まれる。植物胚の発達における毒素の産出は、それらの胚内での細胞死を導き、したがって、その発生を終了させ、植物を不稔性にする。

ベクターシステム
他の態様において、本発明は、ベクターシステムに関する。ベクターシステムには、第一異種ヌクレオチド配列を持つプラスチド形質転換ベクターを含む、第一異種ヌクレオチド配列が含まれる。第一異種ヌクレオチド配列には、ＬＵＸ Ａ、ＬＵＸ Ｂ、ＬＵＸ Ｃ、ＬＵＸ Ｄ、ＬＵＸ ＥおよびＬＵＸ Ｇ遺伝子を含む、細菌ＬＵＸオペロンが含まれ、ここで異種ヌクレオチド配列は第一プロモーターに動作可能に連結し、異種ヌクレオチド配列は、プラスチドゲノム内に組み込まれることが可能である。ベクターシステムにはさらに、第二プロモーターに連結した第二異種ヌクレオチド配列を持つベクターが含まれる。

１つの実施形態において、第一プロモーターは、以上で記載したような、短縮Ｐｒｒｎプロモーターである。

他の実施形態において、第一プロモーターは、第二異種ヌクレオチド配列によってコードされたタンパク質によって誘導可能な、誘導可能プロモーターである。たとえば、第一異種ヌクレオチド配列には、ＬＵＸオペロンと誘導可能プロモーターが含まれる。第二異種ヌクレオチド配列には、プロモーターと、転写因子をコードしている遺伝子が含まれる。転写因子は、誘導可能プロモーターを誘導し、それによって、ＬＵＸオペロン遺伝子の転写を活性化する。図３および４を参照のこと。

語句「転写因子」は、転写の開始に関与する任意のタンパク質を意味する。本実施形態において、プロモーターを指向活性化しているＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ中のような、ＲＮＡポリメラーゼであってよく、またはそうでなくてよい（図３を参照のこと）。転写因子は、特定のヌクレオチド配列、すなわち調節配列と好ましく相互作用し、適切な条件下で、転写を刺激する（「転写アクチベーター」）か、転写を抑制する（「転写リプレッサー」）。

また他の実施形態において、第一プロモーターは構成的プロモーターであり、第二異種ヌクレオチド配列はさらに、プラスチド標的化配列を含む。

たとえば、第一異種ヌクレオチド配列に対するプロモーターは、ＬＵＸオペロンの転写を活性化するために、転写因子によって誘導可能である。例示的プロモーターは、Ｔ７プロモーター（たとえば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１）であり、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（たとえば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２）によって誘導可能である（図３）。

１つの実施形態において、第二異種ヌクレオチド配列に対するプロモーターは、タバコｃｄｉＧＲＰ遺伝子からの重金属感受性プロモーターまたは組織特異的プロモーターのような、誘導可能プロモーターである。

例示的第二異種ヌクレオチド配列にはさらに、プラスチド標的化配列および／またはレポーター遺伝子が含まれる。図３および４を参照のこと。たとえば、第一異種ヌクレオチド配列は、ＬＵＸオペロンと、Ｔ７プロモーターのような誘導可能プロモーターを含む。第二異種ヌクレオチド配列は、核内の組織特異的プロモーターまたはサーカディアンリズムプロモーターまたは他の誘導可能（ストレス、重金属など）プロモーターを含む。第二異種ヌクレオチド配列はさらにＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードする。したがって、第二プロモーターが活性である場合に、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼに対する遺伝子が転写され、ついでＮ−末端融合プラスチド運搬ペプチドにより、プラスチド（たとえば葉緑体）を標的とする。葉緑体中のＬＵＸ遺伝子は、Ｔ７プロモーターによって駆動され、そのプロモーターにＴ７ ＲＮＡが結合し、したがって、ＬＵＸ転写を活性化する。したがって、ＬＵＸオペロンの活性化は間接的である（図３）。

また他の様態において、本発明はベクターシステムに関する。ベクターシステムには、第一異種ヌクレオチド配列を持つプラスチド形質転換ベクターが含まれる。第一異種ヌクレオチド配列には、以下のＬＵＸ Ａ、ＬＵＸ Ｂ、ＬＵＸ Ｃ、ＬＵＸ Ｄ、ＬＵＸ ＥおよびＬＵＸ Ｇ遺伝子の任意の５つが含まれ、そこで異種ヌクレオチド配列は、短縮Ｐｒｒｎプロモーターに動作可能に連結し、異種ヌクレオチド配列は、プラスチドゲノム内に組み込まれることが可能である。ベクターシステムにはさらに、プラスチド標的化配列と、第二プロモーターに動作可能に連結した第六ＬＵＸ遺伝子を含む、第二異種ヌクレオチド配列を持つベクターが含まれる。

たとえば、一つの実施形態において、第一異種ヌクレオチド配列には、ＬＵＸ Ｂ、ＬＵＸ Ｃ、ＬＵＸ Ｄ、ＬＵＸ ＥおよびＬＵＸ Ｇ遺伝子が含まれ、第二異種ヌクレオチド配列にはＬＵＸ Ａ遺伝子が含まれる。ＬＵＸ Ａ遺伝子は、核中の誘導可能プロモーターから発現され、運搬ペプチドを用いてプラスチド内に標的化される。発光に必要な残りの遺伝的機構が、たとえば、短縮Ｐｒｒｎプロモーターによって駆動された、プラスチド中で常に発現している一方で、光放射機構が、核から標的化され、そして誘導可能プロモーターによって制御される、ＬＵＸ Ａサブユニットによって補足された場合に光放射が発生する。図４を参照のこと。

キット
本発明の他の様態において、キットが提供される。キットには、ＬＵＸ Ａ、ＬＵＸ Ｂ、ＬＵＸ Ｃ、ＬＵＸ Ｄ、ＬＵＸ ＥおよびＬＵＸ Ｇ遺伝子を含む、細菌ＬＵＸオペロンを含む、異種ヌクレオチド配列を持つトランスジェニック自己発光植物細胞を産出するための種子が含まれ、そこで異種ヌクレオチド配列は、短縮Ｐｒｒｎプロモーターに動作可能に連結し、異種ヌクレオチド配列はプラスチドゲノム内に統合される。キットにはまた、以上で記載したように、植物形質転換ベクターが含まれる。

キットにはさらに、試薬、緩衝液、および以上で記載した任意のヌクレオチド配列およびタンパク質に関連した物質が含まれてよい。さらに、キットは、本発明によって産出された植物または植物細胞を含んでよい。

変異体
本発明はさらに、本明細書で記載したヌクレオチド配列の変異体に関する。変異体は、天然対立遺伝子変異体のように、天然に発生してよい。他の変異体には、ヌクレオチド置換、欠失または付加によって産出されるものが含まれる。置換、欠失または付加は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドに関与してよい。これらの変異体は、コード領域、非コード領域または両方で変化してよい。コード領域での変化は、構成的または非構成的アミノ酸置換、欠失または付加を産出してよい。好ましくは、変異体は、サイレント置換、付加または欠失であり、本明細書で記載したヌクレオチド配列によってコードされるペプチドの特性および活性を変化させない。保存的置換もまた好ましい。

本発明のさらなる実施形態には、本明細書で記載したヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％同一である、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を含む、変異体ヌクレオチド配列が含まれる。本明細書で記載したヌクレオチド配列は、「参照」配列である。

例えば、本明細書で記載した参照ヌクレオチド配列（例えばＬＵＸオペロン）に少なくとも９５％同一である変異体ヌクレオチド配列は、当該変異体ヌクレオチド配列が、本明細書で記載した参照ヌクレオチド配列（例えばＬＵＸオペロン）の各１００ヌクレオチドあたり、５つまでの点変異までを含みうる場合に、本明細書で記載した配列に対して同一である。

言い換えれば、本明細書で記載した参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一である変異体ヌクレオチド配列を得るために、参照配列中の５％までのヌクレオチドが、欠失するか、または他のヌクレオチドで置換されてよく、参照配列中の総ヌクレオチドの５％までのヌクレオチドの数が参照配列内に組み込まれてよい。

これらの参照配列の変異は、参照ヌクレオチドの５’または３’末端位置にて、またはこれらの末端位置間のいずれかの位置で発生してよく、参照配列中のヌクレオチド個々の間、または参照配列内の１つまたはそれ以上の連続群中いずれかで散在してよい。

本明細書で使用するところの語句「十分同一」は、第二ヌクレオチド配列に対して同一であるか、等価のヌクレオチドの十分な、または最小の数を含む第一配列を意味し、それによって第一および第二ヌクレオチド配列が、共通の構造ドメインまたはモチーフ、および／または共通の機能的活性を共有する。例えば、配列にわたって、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を持つ共通の構造ドメインを共有し、共通の機能的活性を共有するヌクレオチド配列が、本明細書で十分同一と定義される。

２つの核酸配列の同一率を決定するために、配列を、最適比較の目的のために並べる（例えば、ギャップを、最適配列のために、第一および第二ヌクレオチド配列の１つまたは両方に導入可能である）。例えば、１０ヌクレオチドを持つ第一配列と第二配列に対して並べるときに、第一および第二配列間の１０ヌクレオチドの、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％を並べる。第一配列中の位置が、第二配列中の相当する位置と同じヌクレオチドである場合、分子がその位置で同一である。２つの配列間の割合同一性は、ギャップの数、配列の長さ、および２つの配列の最適な配列のために導入する必要がある各ギャップの長さを考慮に入れて、配列によって共有される同一位置の数の関数である。本技術分野で公知のアルゴリズムを、２つの配列間の割合同一性を決定するために使用してよい。

配列リストの組み込み
申請のために、配列リストを、そのすべてを参考文献によって本明細書に組み込む。配列リストは、２０１０年２月２５日に作成された、表題”ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ１７９５−３ＰＣＴ．ｔxｔ”というコンピュータ読み取り可能ＡＳＣＩＩテキストファイル上で開示される。配列リストテキストファイルは、サイズにして２５８ｋｂである。

実施例１：葉緑体形質転換ベクターの構築
ｐＣＡＳシリーズの葉緑体形質転換ベクターを、ｐＳＡＴ４−ＭＣＳベクター（ＧｅｎＢａｎｋ：ＤＱ００５４６６．１、図５Ａおよび配列リスト中ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３）の骨格を用いて構築した。ｐＳＡＴシリーズ（Ｔｚｆｉｒａ Ｔ，Ｔｉａｎ ＧＷ，Ｌａｃｒｏｉｘ Ｂ，Ｖｙａｓ Ｓ，Ｌｉ Ｊ．Ｌｅｉｔｎｅｒ−Ｄａｇａｎ Ｙ．Ｋｒｉｃｈｅｖｓｋｙ Ａ，Ｔａｙｌｏｒ Ｔ，Ｖａｉｎｓｔｅｉｎ Ａ，Ｃｉｔｏｖｓｋｙ Ｖ．（２００５）、”ｐＳＡＴ ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ ｍｏｄｕｌａｒ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｆｏｒ ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｇｇｉｎｉｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ．”Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５７（４）：５０３−１６）からの任意の他のベクター、および（ｐＵＣ１８またはｐＵＣ１９［Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ］のような）通常のクローニング目的のために日常的に使用する任意のＤＮＡベクターを、ｐＣＡＳ葉緑体形質転換ベクターに対する骨格として使用可能であることに留意のこと。ｐＳＡＴ４−ＭＣＳの真核細胞３５Ｓ ＣａＭＶプロモーターを、短縮型の葉緑体Ｐｒｒｎプロモーター（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）によって置換した。Ｐｒｒｎを、フォワード５’−ＴＣＡＣＣＧＧＴＣＧＣＣＧＴＣＧＴＴＣＡＡＴＧＡＧＡＡＴＧＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６）およびリバース５’−ＧＡＧＣＧＡＡＣＴＣＣＧＧＧＣＧＡＡＴＡＴＣＣＡＴＧＧＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７）プライマー、および鋳型としてＮｉｃｏｔｉｎａ ｔａｂａｃｕｍ（タバコ）プラスチドゲノムＤＮＡを用いて増幅した、ＡｇｅＩ／ＮｃｏＩ ＰＣＲ断片としてクローン化した。ＣａＭＶ ３５Ｓターミネーター配列（３５ＳＴ）は、多くの例で、ターミネーター配列が葉緑体トランスジーン発現に対して余分であると示されているので、そのまま残る。得られたベクターを、ｐＣＡＳ３と指定する（図５Ｂ）。ｒｂｃＬリーダー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）に融合した、スペクチノマイシン耐性遺伝子ａａｄＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５）を、フォワード５’−ＡＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＧＴＡＧＧＧＡＧＧＧＡＴＴＴＡＴＧＧＧＧＧＡＡＧＣＧＧＴＧＡＴＣＧＣＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）およびリバース５’−ＴＧＧＡＧＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＧＣＣＧＡＣＴＡＣＣＴＴＧＧＴＧＡＴＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９）プライマーおよび鋳型としてクローニングベクターｐＰＺＰ−ＲＣＳ２を用いて増幅した、ＢｇｌＩＩ／ＮｃｏＩ ＰＣＲ断片としてｐＣＡＳ３内にクローン化した。ａａｄＡ遺伝子配列を含む任意の他の葉緑体形質導入ベクターを本質的に、ｐＣＡＳベクターに対してａａｄＡを産出するＰＣＲ反応に対する鋳型として使用してよい。得られたベクターを、ｐＣＡＳ３−ａａｄＡとして指定した（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７および図６Ａ）。ｐＣＡＳ３−ａａｄＡベクター内のすべてのクローン化遺伝的要素の存在を示している実際の制限消化を図６Ｂにて示している。

次に、ＬＵＸ遺伝子ＣＤＡＢＥＧを含む、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｉｏｇｎａｔｈｉ（ＡＴＣＣ２５５２１）からのＬＵＸオペロン（ＧｅｎＢａｎｋ ＃Ｍ６３５９４に基づいたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８）を、フォワード５’−ＡＣＡＧＡＡＴＴＣＣＣＡＡＡＧＧＡＧＡＴＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＡＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０）およびリバース５’−ＴＴＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＧＴＡＴＡＧＣＴＡＡＡＴＧＣＡＴＣＡＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１）プライマーおよび鋳型としてＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｉｇｏｎａｔｈｉゲノムＤＮＡを用いて増幅したＥｃｏＲＩ ＰＣＲ断片としてｐＣＡＳ３−ａａｄＡの同一部位内にクローン化した。クローン化ＬＵＸオペロンの方向性を、（ＰａｃＩ／ＳａｃＩＩのような）指向性制限消化と配列決定を用いて決定した。Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｉｏｇｎａｔｈｉ（Ｐｌ）ＬＵＸオペロンを持つ得られたベクターを、ｐＣＡＳ３−ａａｄＡ−ＬＵＸオペロン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９および図６Ｃ）として指定した。ＬＵＸオペロンのｐＣＡＳ３−ａａｄＡベクター内の存在を示している実際の制限消化を図６Ｄにて示している。

ＬＵＸオペロンは、それらのリードスルー転写活性、ｒｐｓ１２／ＴｒｎＶ遺伝子座、相対的により転写活性なＴｒｎＩ／ＴｒｎＡ遺伝子座によって種々である、葉緑体ゲノム内の２つの遺伝子座内へ導入される意図がある。上記遺伝子座内への統合のために好適なｐＣＡＳ３−ａａｄＡ−ＬＵＸオペロンベクターを作製するために、相同組換え（ＨＲ）配列を、ＬＵＸオペロン発現カセットに隣接するようにクローン化した。ｒｐｓＩ１／ＴｒｎＶおよびＴｒｎＩ／ＴｒｎＡ遺伝子座内へのＬＵＸオペロン挿入のために必要なすべてのＨＲ配列を、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ（タバコ）プラスチドゲノムＤＮＡ鋳型よりＰＣＲ増幅し、次いでｐＣＡＳ３−ａａｄＡ−ＬＵＸオペロンベクター内にクローン化した。特に、ＬＵＸオペロンのｒｐｓ１２／ＴｒｎＶ遺伝子座への挿入を標的化するために、ｒｐｓ１２相同組換え配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０）を、フォワード５’−ＡＧＴＴＡＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＡＧＴＧＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＧＣＴＡＴＴＴＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２）およびリバース５’−ＣＧＡＴＣＴＡＡＣＣＧＧＴＴＴＡＴＣＡＡＣＴＧＣＣＣＣＴＡＴＣＧＧＡＡＡＴＡＧＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３）プライマーを用いて増幅したＡｇｅＩ ＰＣＲ断片として、ｐＣＡＳ３−ａａｄＡ−ＬＵＸオペロンベクター内にクローン化した。

ｐＣＡＳ３−ａａｄＡ−ＬＵＸオペロン（＞１０Ｋｂｐ）のような大きなサイズのプラスチド内へ直接ＰＣＲ断片をクローニングすることにおける技術的な困難さのために、本発明者らは、種々の特定のクローニング技術を用いた。まず、本発明者らは、中間段階クローニングを使用し、そこでは、本発明者らはまず、ｒｐｓ１２のようなＨＲ配列ＰＣＲ断片を、より小さな大きさのｐＳＡＴ４−ＭＣＳベクター（＜４．０Ｋｂｐ）内にサブクローン化し、ついで適切な酵素（すなわちｒｐｓ１２に対してＡｇｅＩ）を用いて切断し、ついでｐＣＡＳ３−ａａｄＡ−ＬＵＸオペロンの同一の部位内にクローン化した。さらに、いくつかの例では、本発明者らは、制限酵素不活性化技術を用い、アガロースゲル上での還元した大きなＤＮＡ骨格ベクターの還元を避けた。ｒｐｓ１２ ＨＲ配列の、ｐＣＡＳ３−ａａｄＡ−ＬＵＸオペロン骨格ベクター内へのクローニングを本方法の例として明示可能である。まず本発明者らは、ＤＮＡ挿入物を、中間クローニングベクターから切断、すなわちＡｇｅＩを用いてｐＳＡＴ４−ＭＣＳからｒｐｓ１２ ＨＲ配列を切り出し、断片をアガロースゲル上で分解し、Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（ザイモゲン（Ｚｙｍｏｇｅｎ））を用いて、ｒｐｓ１２挿入物断片を一掃した。ついで本発明者らは、適切な酵素−ｒｐｓ１２クローニングの場合ＡｇｅＩにて、骨格ｐＣＡＳ３−ａａｄＡ−ＬＵＸオペロンを完全に消化し、製造会社説明書にしたがって、ＡｇｅＩの熱不活性化を進めた。

酵素制限の後、後期クローニング段階のベクター自己ライゲーションを防止するために、完全消化骨格ベクターをＡｎｔａｒｃｔｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ酵素（ＡＰ、ニューイングランドバイオラボズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））で処理し、ＡＰ酵素をまた、製造会社説明書にしたがって、熱不活性化した。消化し、脱リン酸化した骨格ｐＣＡＳ３−ａａｄＡ−ＬＵＸオペロンの一部を、先にゲルで精製したｒｐｓ１２ ＨＲ挿入物ＤＮＡと混合し、２つの断片を、製造会社説明書にしたがって、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランドバイオラボズ）を用いてライゲートした。ライゲーション産物で、高効率での大きなＤＮＡ分子の形質導入に好適な、ＸＬ１０−Ｇｏｌｄコンピテント細胞（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を形質転換した。最後に、ｒｐｓ１２のような、挿入の指向性を、指向性制限消化と配列決定によって確認した。本明細書で言及し、ｐＣＡＳ３−ａａｄＡ−ＬＵＸオペロン骨格内に導入した他のＨＲ配列ならびに他のＤＮＡ挿入物をしばしば、同様の様式でクローン化した。ｒｐｓ１２相同組換え部位と同様に、ＴｒｎＶ ＨＲ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１）を、フォワード５’−ＡＴＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＡＴＴＧＡＡＴＣＣＧＡＴＴＴＴＧＡＣＣＡＴＴＡＴＴＴＴＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４）および５’−ＡＴＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＧＡＡＧＣＡＧＴＧＴＣＡＡＡＣＣＡＡＡＡＴＡＣＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５）プライマーを用いてＰＣＲ増幅させ、すでにｒｐｓ１２相同組換え配列を含んでいるｐＣＡＳ３−ａａｄＡ−ＬＵＸオペロンのＮｏｔＩ部位内にクローン化した。クローン化ＴｒｎＶ ＨＲ断片の指向性を、指向性制限消化および配列決定を用いて決定した。得られたベクターを、ｐＣＡ３−ＬＵＸ−ｒｐｓＩ１／ＴｒｎＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２および図７Ａ）と指定した。

ＬＵＸオペロンを葉緑体ゲノムのＴｒｎＩ／ＴｒｎＡ遺伝子座内に統合するために、ＴｒｎＩ／ＴｒｎＡ ＨＲ配列をｐＣＡＳ３−ａａｄＡ−ＬＵＸオペロンベクター内にクローン化しなければならなかった。ＴｒｎＡ ＨＲ配列がＡｇｅＩ認識配列を含むことから、ＴｒｎＩ ＤＮＡ断片をまずクローン化することが要求された。ＴｒｎＩ ＨＲ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３）を、フォワード５’−ＡＧＴＴＡＧＡＡＣＣＧＧＴＣＴＴＣＧＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＣＡＣＡＧＧＴＧＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６）およびリバース５’−ＣＧＡＴＣＴＡＡＣＣＧＧＴＡＧＡＴＧＣＴＴＣＴＴＣＴＡＴＴＣＴＴＴＴＣＣＣＴＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７）プライマーを用いてＰＣＲ増幅し、ｐＣＡＳ３−ａａｄＡ−ＬＵＸオペロンベクターの同一の部位にＡｇｅＩを用いてクローン化した。ＴｒｎＡ ＤＮＡ断片（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４）を、フォワード５’−ＣＴＡＴＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＴＡＣＴＴＣＡＴＧＣＡＴＧＣＴＣＣＡＣＴＴＧＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８）およびリバース５’−ＧＡＡＴＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＴＡＴＧＡＡＧＡＣＴＣＧＣＴＴＴＣＧＣＴＡＣＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９）プライマーを用いてＰＣＲ増幅し、ＴｒｎＩ ＨＲ配列を含むｐＣＡＳ３−ａａｄＡ−ＬＵＸオペロンベクターの同一の部位内にＮｏｔＩを用いてクローン化した。クローン化したＨＲ配列の指向性を、指向性制限消化および配列決定を用いて決定した。得られたベクターを、ｐＣＡ３−ＬＵＸ−ＴｒｎＩ／ＴｒｎＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５および図７Ｂ）として指定した。クローン化したＨＲ配列のｐＣＡ３−ＬＵＸ−ｒｐｓ１２／ＴｒｎＶおよびｐＣＡ３−ＬＵＸ−ＴｒｎＩ／ＴｒｎＡベクター内での存在を表している実際の制限酵素消化を図７Ｃにて示している。すべての構築したベクターを配列決定によって確認したことを留意のこと。

実施例２：大腸菌内でのｐＣＡＳ−３ ＬＵＸベクター実行可能性の査定
トランスプラストミック植物の産出の前に、種々のｐＣＡＳ３ベクターの実行可能性を大腸菌内で査定した。細菌とプラスチド間のプロモーターと他の遺伝的要素の高い機能的類似性により、多くの場合で、細菌中の色素体発現カセットの発現が許容される。図８Ａ（上パネル）にて示したように、ｐＣＡＳ３−ａａｄＡおよびｐＣＡＳ３−ａａｄＡ−ＬＵＸオペロンベクターが、色素体短縮Ｐｒｒｎプロモーターによって駆動された抗生物質耐性ａａｄＡ遺伝子の発現のために、５０〜１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを加えたＬＢ培地上の、ＤＨ５α大腸菌細胞の増殖を与えた。さらに、ｐＣＡＳ３−ａａｄＡ−ＬＵＸオペロンベクターを含むＤＨ５α大腸菌細胞は、ａａｄＡスペクチノマイシン耐性遺伝子を含む同一のポリシストロニックｍＲＮＡ上で発現したＬＵＸオペロンの発現のために、可視光を放射した（図８Ａ、下パネル）。葉緑体形質導入ベクターｐＣＡＳ３−ＬＵＸ−ＴｒｎＩ／ＴｒｎＡおよびｐＣＡ３−ＬＵＸ−ｒｐｓ１２／ＴｒｎＶの実行可能性を、自己発光トランスプラストミック植物の産出におけるその利用の前に、大腸菌内で同様に確認した。

実施例３：トランスプラストミック植物の産出
トランスプラストミックＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ（タバコ）植物を、文献（非常に詳細なプロトコールは、Ｌｕｔｚ Ｋ．Ａ．、Ｓｖａｂ Ｚ．，Ｍａｌｉｇａ Ｐ．（２００６）”Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｒｋｅｒ−ｆｒｅｅ ｔｒａｎｓｐｌａｓｔｏｍｉｃ ｔａｂａｃｃｏ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．”１（２）：９００−１０にて見ることができる）にて広範囲にわたって記載された方法にしたがって作製した。簡単に記すと、ｐＣＡ３−ＬＵＸ−ＴｒｎＩ／ＴｒｎＡまたはｐＣＡ３−ＬＵＸ−ｒｐｓ１２／ＴｒｎＶベクターＤＮＡいずれかでコートした０．６ミクロン金粒子（バイオラド（ＢｉｏＲａｄ））を、ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（システム設定：照射Ｈｅ圧、ラプチャーディスク圧上約２５０ｐｓｉ［１，１００ｐｓｉのラプチャーディスクを使用した］、チャンバーの最上部からの距離９ｃｍ［第三スロット］、チャンバー吸引圧２８ｉｎ Ｈｇ）を用いて、無菌増殖４〜６週齢タバコ植物（ｅｖ．Ｐｅｔｉｔ Ｈａｖａｎａ）の葉内に照射した。照射した葉を、２５〜２６℃、暗所にて２〜３日間インキュベートし、５×５ｍｍ四方に刻み、５００μｌ／ｍｌのスペクチノマイシン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を含む、５０ｍｌのＲＭＯＰ培地（ＲＭＯＰ／リットル：ＭＳ塩、Ｃａｉｓｓｏｎ、カタログ番号ＭＳＰ０１、製造会社取扱説明書にしたがう、１００ｍｇ ミオ−イノシトール、１ｍｇチアミンＨＣｌ、１ｍｇ ６−ベンジルアミノプリン、０．１ｍｇ １−ナフタレン安息香酸、３０ｇｒスクロース、６ｇフィトブレンド、（Ｃａｉｓｓｏｎ）、ＫＯＨにてｐＨ＝５．８調整）を含むディープペトリディッシュ中に配置した。ペトリディッシュをパラフィンで封印し、１６時間光／８時間暗サイクルにて２６℃で冷−白色蛍光ランプ（１，９００〜２，０００ルクス）下培養した。図８Ｂにて示したトランスジェニック植物が、照射後４〜８週間以内に現れた。植物を移し、さらに５００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシン（シグマ）を含むＭＳＯ培地（ＭＳＯ／リットル、ＭＳ塩、Ｃａｉｓｓｏｎ、カタログ番号ＭＳＰ０１、製造会社取扱説明書にしたがう、３０ｇｒスクロース、６ｇフォトブレンド（Ｃａｉｓｓｏｎ）、ＫＯＨにてｐＨ＝５．８調整）上、１６時間光／８時間暗サイクルにて２６℃で冷−白色蛍光ランプ（１，９００〜２，０００ルクス）下、マジェンダボックス中で無菌維持した。

実施例４：トランスプラストミック植物の同定
タバコトランスプラストミック植物の産出におけるチャレンジの１つは、「真の」トランスプラストミック植物として間違えて認識されうる、植物変異体の出現である。トランスジェニック植物の産出の間、遺伝的に改変された植物組織が、ホルモンを含む増殖培地を介して選別され、単一の細胞からの完全植物の再生が促進され、選択的抗生物質が非形質導入植物細胞を全滅させる。トランスプラストミック植物を生じさせる、遺伝的に改変した植物細胞は、そのトランスジェニックＤＮＡ内に、非形質導入細胞を殺す選別工程の間に使用した抗生物質である、スペクチノマイシンに対する耐性を確かにする、ａａｄＡ遺伝子を持つ。しかしながら、選別工程の間に絶滅されるべきいくつかの非形質導入植物細胞が、そのプラスチド小リボソームＲＮＡ（ｒｒｎｌ６）遺伝子内で、天然に発生する変異を持ち、これが、スペクチノマイシン選別から生き延びることを許容する。照射植物組織から得た植物の総数は通常、１０〜２５％のスペクチノマイシン耐性リボソーム変異を持つ野生型タバコ植物を含み、したがって、真のトランスプラストミック植物をさらに同定しなければならない。ＰＣＲ、サザンブロットまたは（リボソームＲＮＡ変異のみがスペクチノマイシンに耐える一方で、ａａｄＡ遺伝子が、スペクチノマイシンとストレプトマイシン抗生物質両方に対する耐性を与えるため）ストレプトマイシンに対する耐性のような種々の方法を使用可能である。本発明者らは、非常に短時間に、高い精度の結果を産出することから、真のトランスプラストミック植物を確実に同定するために、ジャンクションＰＣＲアプローチを使用することを選択した。

ジャンクションＰＣＲ法において、１つのプライマーが、葉緑体統合発現カセット内に局在し、第二プライマーが、任意のベクター配列（相同組換え配列−ベクターＨＲＳ−は２つのプライマーの間に局在する）の外側の葉緑体ゲノム上に位置し、したがって、ゲノム−トランスジーンジャンクションの増幅を導く。ジャンクションＰＣＲは、トランスジーンが、葉緑体ゲノム内に統合された場合にのみ、陽性の結果を産する。ｐＣＡ３−ＬＵＸ−ｒｐｓ１２／ＴｒｎＶベクターを用いて産出したトランスプラストミック植物の同定のために、ジャンクションＰＣＲ法を使用する例を図９に示している。パネルＡは、ｐＣＡ３−ＬＵＸ−ｒｐｓ12／ＴｒｎＶベクターを用いて産出したトランスプラストミック植物ＤＮＡから増幅したＤＮＡ断片を略図的に表している。パネルＢは、アガロースゲル上で解析した、実際のＰＣＲ断片を示している（野生型タバコＤＮＡを陰性対照として使用した）。ベクター相同組換え配列（ＨＲＳ）の外側の葉緑体ゲノム上に局在する、プライマー＃７８（５’−ＴＴＧＡＧＴＡＴＣＣＧＴＴＴＣＣＣＴＣＣ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０）と、ベクター配列内のａａｄＡ遺伝子内（図９Ａ）に局在する＃１０４（５’−ＣＣＡＧＣＡＡＡＴＣＡＡＴＡＴＣＡＣＴＧＴＧＴＧＧ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１）を用いて増幅した２．３５ｋｂ断片は、ベクター発現カセットがｒｐｓ１２／ＴｒｎＶ葉緑体遺伝子座内に統合される場合にのみ産出可能である。同様に、ベクター相同組換え配列（ＨＲＳ）の外側の葉緑体ゲノム上に局在するプライマー＃７９（５’−ＡＡＧＣＴＣＡＴＧＡＣＧＴＴＧＧＴＴＧＧＴＣＴＴＡＣ−３’）(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:９２)と、ベクター配列内のＬＵＸオペロン内に局在する＃４６（５’−ＣＡＧＡＴＴＴＡＴＣＴＧＡＣＴＴＴＧＡＴＡＴＣＴＡＴＧ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３）を用いて増幅した２．４５ｋｂの断片は、ＬＵＸオペロンがこの遺伝子座内に局在する場合にのみ産出可能である。図９Ｂにて示すように、すべてのジャンクションＰＣＲ反応が、実際の予測した大きさの、明確な単一バンドを産出したので、ｐＣＡ３−ＬＵＸ−ｒｐｓ１２／ＴｒｎＶ発現カセットは、解析したトランスジェニック植物の葉緑体ゲノム内に疑いもなく統合された。

さらに、本発明者らは、トランスプラストミックゲノム内でのＬＵＸオペロンの存在をさらに確認するために、ＬＵＸ遺伝子ＢおよびＣ（図９Ｂ）に対して、内部発現カセット遺伝子の追加ＰＣＲ反応を実施した。トランスプラストミック植物ＤＮＡ（および陰性対照として野生型タバコＤＮＡ）を用いた、ＬｕｘＢ（５’−ＡＴＧＡＡＴＴＴＣＧＧＧＴＴＡＴＴＴＴＴＣＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４）および５’−ＴＴＡＴＴＴＡＡＴＡＡＧＧＴＴＡＴＣＴＴＴＧ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５）およびＬｕｘＸ遺伝子（５’−ＡＴＧＡＴＴＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣＣＡＡＴＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６）および５’−ＣＴＡＣＧＧＴＡＣＡＡＡＴＡＣＧＡＧＧＡＡＣ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７）に対して特異的なプライマー対でのＰＣＲ反応がさらに、タバコ葉緑体ゲノム内へのＬＵＸオペロンの統合を確認した。プライマー＃７３（５’−ＡＡＴＴＧＡＡＴＣＣＧＡＴＴＴＴＧＡＣＣＡＴＴＡＴＴＴＴＣ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８）および＃７９（５’−ＡＡＧＣＴＣＡＴＧＡＧＣＴＴＧＧＴＣＴＴＡＣ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９）が、天然葉緑体ゲノムの領域を増幅するために設計され、野生型およびトランスジェニック植物両方のＰＣＲ反応に対する陽性対照として使用される。ｐＣＡＳ３−ＬＵＸ−ＴｒｎＩ／ＴｒｎＡ葉緑体形質導入ベクターを用いて産出したトランスプラストミック植物を、ＴｒｎＩ（５’−ＣＧＴＴＣＧＣＡＡＧＡＡＴＧＡＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００）およびＴｒｎＡ（５’−ＣＧＣＴＧＡＴＴＣＴＴＣＡＡＣＡＴＣＡＧＴＣＧ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１）遺伝子座に対して特異的なジャンクションＰＣＲプライマーを用いて、同様の様式で同定された。

重要なことに、各植物細胞は、細胞あたり１０，０００までのプラスチドゲノムの多重コピーを含む。形質導入事象の間、ただ数コピーのプラスチドゲノムが形質導入され、トランスプラストミック植物の第一世代はしたがってキメラで有り、野生型とトランスジェニックゲノムの混合物が含まれる。植物内のすべてのプラスチドＤＮＡのコピーがトランスジーンを含む、ホモプラストミーに達するために、スペクチノマイシン上での選別の第二（および時々第三）ラウンドが必要である。選別の第二ラウンドのために、最初に得たトランスプラストミック植物の葉を、５×５ｍｍ切片に切断し、５００μｇ／ｍｌスペクチノマイシンを含むＲＭＯＰ培地上に配置した。３〜４週間以内に切断した葉から再生した新規の、第二ラウンド植物を、発根のために、ＭＳＯ培地を含むマゼンタボックス内に移す。発育根を持つ植物を、ＭＳＯ培地から取り出し、温室内で土壌に移した。マゼンタボックス増殖植物を、土壌に移す間により低い湿度条件まで慣れさせなければならない。これに対して、移した植物を含むポットを、最初の２４時間セランラップにて覆い、ついで次の１〜２日以内に徐々に移した。最後に、トランスジェニック植物のホモプラストミーを、本技術分野で公知のサザンブロット（例えばＬｕｔｚ Ｋ．Ａ．，Ｓｖａｂ Ｚ．，ＭａｌｉｇａＰ．（２００６）”Ｃｏｎｓｔｒｕｔｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｒｋｅｒ−ｆｒｅｅ ｔｒａｎｓｐｌａｓｔｏｍｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ ｓｉｔｅ＾ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．”Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１（２）：９００−１０にてみられるプロトコール）を用いて確認する。

実施例５：自発的蛍光植物の特性化
実施例１〜４にて記載したような、ＴｒｎＩ／ＴｒｎＡまたはｒｐｓ１２／ＴｒｎＶ遺伝子座いずれか内で統合したＬＵＸオペロンを含むトランスプラストミックタバコ植物の同定の後、これらのトランスジェニック有機体の光放射特性を特性化した。まず、照射の後現れた（実施例３）、最初のトランスプラストミック根からの組織を、シンチレーションカウンター（ＬＳ６５００多目的シンチレーションカウンター、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて光放射に関して試験した。それぞれおよそ１５０ｍｇに標準化した新規に現れたトランスプラストミック根および（陰性対照として使用されるべき）野生型タバコ組織を、シンチレーションカウンターバイアル内に配置し、暗所で５〜１０分間インキュベートして自己蛍光を除去し、光子計数を２０分間記録した（図１０ＡおよびＢ）。ｒｐｓ１２／ＴｒｎＶ遺伝子座に統合されたＬＵＸオペロンを持つトランスプラストミック植物からの組織試料をＬＵＸ−ｒｐｓＩ１／ＴｒｎＶとして指定し、ＴｒｎＩ／ＴｒｎＡ遺伝子座内に統合されたＬＵＸオペロンを持つトランスジェニック植物から得たものを、ＬＵＸ−ＴｒｎＩ／ＴｒｎＡと定義した。図１０ＡおよびＢにて見ることができるように、トランスプラストミックＬＵＸ植物組織は、ＬＵＸ−ｒｐｓＩ１／ＴｒｎＶおよびＬＵＸ−ＴｒｎＩ／ＴｒｎＡそれぞれ最初に、約３．３×１０^６および８２．０×１０^６光子／分を放射して、非常に有意な数の可視光光子を放射し、一方で、野生型非放射組織のベースラインノイズは、たった６０〜７０×１０^３と記録された。本発明者らはまた、実験の間の発光レベルにおける減少に気がつき（図１０ＡおよびＢ）、これは明らかにきつく閉めたシンチレーションバイブルからの酸素レベルの枯渇が理由である。さらに、ＬＵＸ−ＴｒｎＩ／ＴｒｎＡ植物が、ＬＵＸ−ｒｐｓ１２／ＴｒｎＶ植物の同量の組織から比べておおよそ２５倍の光子を放射した。これはおそらく、ｒｐｓ１２／ＴｒｎＶ遺伝子座と比較して、ＴｒｎＩ／ＴｒｎＡ遺伝子座での非常に高い通読転写活性からの結果であり得、連続して、ＬＵＸ−ＴｒｎＩ／ＴｒｎＡ植物中のＬＵＸタンパク質のより高い発現となり、したがって有意により高い光放射となる。これらの発見は、種々のプロモーター、ならびに他の遺伝的、転写および翻訳要素および以上で記載した方法の利用によるＬＵＸ転写活性の制御が、おそらく、トランスプラストミックＬＵＸ植物からの光放射レベルを調節することにおいて、有益でありうることを示している。

シンチレーションカウンター実験後すぐに、本発明者らが、トランスプラストミックＬＵＸ組織の比較的大きな部分を増殖させた時に、本発明者らは、それを写真フィルムに暴露した。図１０Ｃにて示すように、ＬＵＸ−ＴｒｎＩ／ＴｒｎＡトランスプラストミック組織の一晩暴露が、結果として、トランスプラストミック組織周辺の光放射の明確および集中的な検出となった一方で、野生型組織では、光放射は検出されなかった。暴露中心は、プレート上のトランスプラストミック組織の位置で正確に同時に起こることに留意のこと。これとともに、より大きなトランスプラストミック組織切片（トランスプラストミック組織プレートの右下部分）に対して、光放射は、全切片を通して均質ではなく、８の字形の２つの明確な中心（矢印でマークした）中に集中した。これは、初期照射の後に加えた、トランスプラストミック植物の発育が、キメラであり、野生型とトランスプラストミック組織両方のセクターを含むという事実からの結果でありうる。非常に放射している中心は、より低い放射中心よりも、より大きな数の形質転換されたプラスチドコピーを含むことが予想される。

最後に、本発明者らが、完全増殖トランスプラストミック植物を入手した時に、本発明者らは、ハンドヘルドコンシューマーカメラ［ニコンＤ２００、ＡＦ−Ｓ Ｍｉｃｒｏ Ｎｉｋｋｏｒ １０５．０ｍｍ １：２．８Ｇ ＥＤレンズ、ｆ／４．５にて露出５分間、１０５ｍｍ焦点距離、ＩＳＯ３２００］を用いて、図１１ＡおよびＢにて示したように、写真撮影が可能であった。明らかに、ＬＵＸトランスプラストミック植物の冷光は、暗さに目が適合する約５〜１０分後に、暗室にて裸眼で明白に見ることができた。それらは単に冷光であった。

実施例６：植物自己発光の改変
本発明者らが、裸眼で明らかに見ることができる、第一の自己増殖植物を産出可能であった一方で、冷光効果は、冷光強度、色などに関して将来の改善がさらに必要である。そのようなことを実施する多数の方法が存在し、以上で概要を述べた。本発明者らは、これらのアプローチの実現可能性を示すために、シミュレーション実験を実施した。本発明者らは、たとえば、デカナールの外来添加によって、植物リン脂質合成経路の遺伝的改変を介して達成可能な、アルデヒド基質レベルの増加をシミュレートした。デカナールは、細菌ルシフェラーゼの公知の基質であり、その外来添加は、それ相応に遺伝的に改変した植物内のリン脂質の産出の増加および／または改変をシミュレートする。ＬＵＸ−ｒｐｓ１２／ＴｒｎＶと野生型植物組織の小さな切片を、シンチレーションカウンターバイアル中に配置し、水中に沈め、自己発光レベルを測定した。ついで、バイアルを開けて、酸素へのアクセスを許容し、試料にデカナールを最終濃度２ｍＭまで加え、自己発光レベルを再び記録した。図１１Ｃにて示すように、デカナールの添加は、自己発光を約２倍増加させ、ルシフェリン濃度の増加が、事実光放射レベルの増加を増加させることが確かめられた。結論として、以上で概要を述べた、植物遺伝的改変の方法によって達成される、ルシフェラーゼ基質レベルの同様の増加は、望むレベルまでの、植物光放射効果を増加させる。他の記載した方法も相応に、色、組織特異性および他のパラメータにおける冷光を改変するために使用可能である。

Claims (23)

1. ＬＵＸ Ａ、ＬＵＸ Ｂ、ＬＵＸ Ｃ、ＬＵＸ Ｄ、ＬＵＸ ＥおよびＬＵＸ Ｇ遺伝子を含む、細菌ＬＵＸオペロンを含む異種ヌクレオチド配列を含む、トランスジェニック自己発光植物細胞であって、
   そこで前記異種ヌクレオチド配列が、短縮Ｐｒｒｎプロモーターに動作可能に連結し、前記異種ヌクレオチド配列がプラスチドゲノム内に統合されている、トランスジェニック自己発光植物細胞。
2. 前記プロモーターに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に記載された配列が含まれる、請求項１に記載の細胞。
3. 前記異種ヌクレオチド配列に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に記載された配列が含まれる、請求項１に記載の細胞。
4. 前記プロモーターが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に記載された配列の位置１〜３９、４６〜６３および７０〜９５に少なくとも９５％同一である配列を含み、前記プロモーターが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に記載された配列の位置４０〜４５に対して１００％同一である、請求項１に記載の細胞。
5. 前記プロモーターが、以下の位置、３、４、６、１６、３３、８４、７４、５６、９２または６１の任意の１つで、少なくとも１つ置換を持つ、請求項４に記載の細胞。
6. 前記プロモーターが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に記載された配列の位置１〜３９、４６〜６３および７０〜９５に少なくとも９５％同一である配列を含み、前記プロモーターが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に記載された配列の位置６４〜６９に対して１００％同一である、請求項１に記載の細胞。
7. 前記プロモーターが、以下の位置、３、４、６、１６、３３、８４、７４、５６、９２または６１の任意の１つで、少なくとも１つ置換を持つ、請求項６に記載の細胞。
8. 前記プラスチドが葉緑体である、請求項１に記載の細胞。
9. 前記異種ヌクレオチド配列がさらに、補因子をコードしている少なくとも１つの遺伝子を含む、請求項１に記載の細胞。
10. 前記補因子が、ＬＵＸ Ｈ遺伝子および／またはリボフラビン（ＲＩＢ）オペロンにコードされるポリペプチドを含む、請求項９に記載の細胞。
11. 前記補因子が、細菌または植物アシルキャリアタンパク質を含む、請求項９に記載の細胞。
12. 前記補因子が、フラビンリダクターゼ酵素を含む、請求項９に記載の細胞。
13. 前記異種ヌクレオチド配列がさらに、不稔オペロンを含む、請求項１に記載の細胞。
14. さらに、蛍光タンパク質をコードしている遺伝子を含む第二異種ヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載の細胞。
15. ａ）ＬＵＸ Ａ、ＬＵＸ Ｂ、ＬＵＸ Ｃ、ＬＵＸ Ｄ、ＬＵＸ ＥおよびＬＵＸ Ｇ遺伝子を含む、細菌ＬＵＸオペロンを含む異種ヌクレオチド配列を持つ、トランスジェニック自己発光植物細胞を産出するための種子であり、そこで前記異種ヌクレオチド配列が、短縮Ｐｒｒｎプロモーターに動作可能に連結し、前記異種ヌクレオチド配列がプラスチドゲノム中に統合されている、種子、および
    ｂ）植物形質転換ベクター
    を含むキット。
16. ａ）ＬＵＸ Ａ、ＬＵＸ Ｂ、ＬＵＸ Ｃ、ＬＵＸ Ｄ、ＬＵＸ ＥおよびＬＵＸ Ｇを含む、細菌ＬＵＸオペロンを含む第一異種ヌクレオチド配列を持つ、プラスチド形質転換ベクターであり、そこで前記異種ヌクレオチド配列が、第一プロモーターに動作可能に連結し、前記異種ヌクレオチド配列がプラスチドゲノム中に組み込まれることが可能である、プラスチド形質転換ベクター、および
    ｂ）第二プロモーターに動作可能に連結した第二異種ヌクレオチド配列を持つベクター
    を含むベクターシステム。
17. 前記第二異種ヌクレオチド配列を持つベクターが、バイナリーベクターである、請求項１６に記載のベクター。
18. 前記第二異種ヌクレオチドがさらに、プラスチド標的化配列を含む、請求項１７に記載のベクター。
19. 前記第一プロモーターが、前記第二異種ヌクレオチド配列によってコードされたタンパク質によって誘導されうる、誘導可能なプロモーターである、請求項１６に記載のベクター。
20. 前記第一プロモーターが、 構成的プロモーターであり、前記第二異種ヌクレオチド配列がさらに、プラスチド標的化配列を含む、請求項１６に記載のベクター。
21. 前記第一プロモーターが短縮Ｐｒｒｎプロモーターである、請求項１６に記載のベクター。
22. ａ）ＬＵＸ Ａ、ＬＵＸ Ｂ、ＬＵＸ Ｃ、ＬＵＸ Ｄ、ＬＵＸ ＥおよびＬＵＸ Ｇ遺伝子の任意の５つを含む第一異種ヌクレオチド配列を持つ、プラスチド形質転換ベクターであり、そこで前記異種ヌクレオチド配列が、短縮Ｐｒｒｎプロモーターに動作可能に連結し、前記異種ヌクレオチド配列がプラスチドゲノム中に組み込まれることが可能である、プラスチド形質転換ベクター、および
    ｂ）プラスチド標的化配列と、第二プロモーターに動作可能に連結した第六のＬＵＸ遺伝子とを含む、第二異種ヌクレオチド配列を持つベクター、
    を含むベクターシステム。
23. 前記第一異種ヌクレオチド配列が、ＬＵＸ Ｂ、ＬＵＸ Ｃ、ＬＵＸ Ｄ、ＬＵＸ ＥおよびＬＵＸ Ｇ遺伝子を含み、前記第二異種ヌクレオチド配列が、ＬＵＸ Ａ遺伝子を含む、請求項２２に記載のベクターシステム。