JP2006042768A - 発光バラ科植物 - Google Patents
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Abstract
【課題】花部を含む植物の組織および器官において、発光が認められる観賞用バラ科植物を提供すること。
【解決手段】この発明の形質転換バラ科植物は、ルシフェラーゼをコードする遺伝子を有し、かつ該遺伝子から発現したルシフェラーゼが生物学的に活性であるバラ科(Rosaceae)の形質転換植物であって、植物細胞内で作動可能なルシフェラーゼ遺伝子をバラ科に属する植物の細胞に導入する工程、および該ルシフェラーゼ遺伝子が導入された細胞より植物体を再生させる工程、を包含する方法によって得られる。
【選択図】なし
【解決手段】この発明の形質転換バラ科植物は、ルシフェラーゼをコードする遺伝子を有し、かつ該遺伝子から発現したルシフェラーゼが生物学的に活性であるバラ科(Rosaceae)の形質転換植物であって、植物細胞内で作動可能なルシフェラーゼ遺伝子をバラ科に属する植物の細胞に導入する工程、および該ルシフェラーゼ遺伝子が導入された細胞より植物体を再生させる工程、を包含する方法によって得られる。
【選択図】なし
Description
この発明は、遺伝子組換えにより形質転換された発光バラ科(Rosaceae)植物に関する。更に詳細には、この発明は、ルシフェラーゼをコードする遺伝子を細胞中に導入し発現させて発光し得る形質転換バラ科植物に関する。
バラ科の植物は、観賞用植物として、切り花などとして広く愛用されている。もし暗い環境下で、照明を照らすことなく観賞または装飾の目的を果たすことが可能になれば、鑑賞用植物としての価値が格段と高まることになり、商品価値を一段と高めることができることになる。
発光能を有する生物としては、ホタルおよびウミホタルなどが代表的なものとして知られている。これらの発光は、酸化酵素であるルシフェラーゼがルシフェリンを酸化することにより生起されていることが知られている。かかるホタル(Photinus pyralis)のルシフェラーゼは、その酵素学的性質およびその遺伝子の塩基配列は解明されていて、約6万の分子量を有し、ATP、Mg2+および酸素の存在下でルシフェリンをオキシルシフェリンに酸化して、562nmに極大を有する光を発する(非特許文献1)。
ホタルルシフェラーゼ遺伝子が導入された形質転換タバコ(Nicotiana tabacum)の根部、茎部および葉部において発光することが報告されている(例えば、非特許文献2)。しかしながら、形質転換されたタバコにおける発光はいずれも花部では認められていない上に、その発光の程度も観賞用植物としては不十分であった。
最近、花部を含む植物の組織および器官において、肉眼で発光が認められる観賞用植物を作製することができる技術が示されている(特許文献1)。この形質転換植物は、ルシフェラーゼをコードする遺伝子を有し、かつ、該遺伝子から発現したルシフェラーゼが生物学的に活性であるナデシコ科の形質転換植物であることが開示されている。この特許文献には、この技術は、Rosa属(例えば、バラ)などのバラ科(Rosaceae)の植物にも適用できると記載されている。しかしながら、この技術をそのまま適用してもバラ科植物に対しては所定の作用効果が発揮されない。
Gould,S.J.ら、Anal.Biochem.175:5−13,1988 Mitsuhara,I.ら、Plant Cell Physiol.37:49−59,1996 特開平11−56141号公報
Gould,S.J.ら、Anal.Biochem.175:5−13,1988 Mitsuhara,I.ら、Plant Cell Physiol.37:49−59,1996
本発明者は、バラ科植物、特にその花部を発光させる技術を開発すべく鋭意検討研究した結果、バラ科植物の花部をも発光させることができる技術を見出して、この発明を完成するに到った。
この発明は、特に花部を含むバラ科植物体の種々の器官または組織が発光し得る形質転換したバラ科植物ならびにその作製方法およびその発光方法を提供することを目的とする。
上記目的を達成するために、この発明は、特に花部を含むバラ科植物体の種々の器官または組織が発光し得る形質転換したバラ科植物を提供する。
また、この発明は、特に花部を含むバラ科植物体の種々の器官または組織が発光し得る形質転換したバラ科(Rosaceae)の植物を作製する方法を提供する。
更に、この発明は、特に花部を含むバラ科植物体の種々の器官または組織を発光させることからなる形質転換バラ科(Rosaceae)植物の発光方法を提供する。
更に、この発明は、特に花部を含むバラ科植物体の種々の器官または組織を発光させることからなる形質転換バラ科(Rosaceae)植物の発光方法を提供する。
この発明は、その1つの態様として、バラ(Rosa)属などに属する形質転換バラ科(Rosaceae)植物であって、その器官または組織、好ましくはその花部を含む器官が発光する形質転換バラ科植物を提供する。
この発明は、その1つの実施態様として、ルシフェラーゼをコードする遺伝子を有し、かつ該遺伝子から発現したルシフェラーゼが活性化して、特にその花部を含む組織や器官などが発光するバラ科(Rosaceae)の形質転換植物を提供する。
この発明は、その1つの実施態様として、ルシフェラーゼをコードする遺伝子を有し、かつ該遺伝子から発現したルシフェラーゼが活性化して、特にその花部を含む組織や器官などが発光するバラ科(Rosaceae)の形質転換植物を提供する。
この発明は、その別の態様として、ルシフェラーゼを発現して発光する形質転換バラ科植物の作製方法を提供する。
この発明は、その1つの実施態様として、バラ科植物の細胞内で作動可能なルシフェラーゼ遺伝子をバラ科に属する植物の細胞に導入し、その細胞中において該ルシフェラーゼ遺伝子を発現させて発光させることからなる形質転換バラ科植物を調製する方法を提供する。
この発明は、その1つの実施態様として、バラ科植物の細胞内で作動可能なルシフェラーゼ遺伝子をバラ科に属する植物の細胞に導入し、その細胞中において該ルシフェラーゼ遺伝子を発現させて発光させることからなる形質転換バラ科植物を調製する方法を提供する。
この発明は、その更に別の態様として、ルシフェリンを供給して発光させることからなる形質転換植物の発光方法を提供する。
この発明は、その1つの実施態様として、バラ科植物の細胞内で作動可能なルシフェラーゼ遺伝子をその細胞に導入し、その細胞中において該ルシフェフーゼ遺伝子を発現させて、ルシフェリンを供給して発光させることからなる形質転換バラ科植物の発光方法を提供する。
この発明は、その1つの実施態様として、バラ科植物の細胞内で作動可能なルシフェラーゼ遺伝子をその細胞に導入し、その細胞中において該ルシフェフーゼ遺伝子を発現させて、ルシフェリンを供給して発光させることからなる形質転換バラ科植物の発光方法を提供する。
この発明に係る形質転換バラ科植物は、特に花部を含む種々の器官または組織が発光し得る形質転換したバラ(Rosaceae)科の植物である。この発明において、バラ(Rosaceae)科の植物には、バラ(Rosa)属などに属する植物が挙げられる。
この発明に係る発光可能な形質転換バラ科植物の作製方法は、バラ科植物の細胞内で作動可能なルシフェラーゼ遺伝子をバラ科にその植物細胞に導入し、その細胞中において該ルシフェラーゼ遺伝子を発現させることから構成される。
この発明に使用することができるルシフェラーゼ遺伝子は、特に限定されるものではなく、バラ科植物の細胞中で発現して発光することができるものであればいずれも使用することができる。
かかるルシフェラーゼ遺伝子としては、例えば、ホタルなどの昆虫(例えば、Photinuspiralis、Luciola lateralis、Luciola cruciata)、発光細菌(例えば、Photobacterium luminescens、Photobacterium phosphoreum、Vibrio harveyi)、海洋性甲虫類(例えば、Cypridina hilgendorfii)、および藻類(例えば、Gonyaulax polyedra)などの生物に由来するルシフェラーゼ遺伝子が挙げられるが、562nmに発光極大を有するホタル(Photinus piralis)ルシフェラーゼをコードする遺伝子が好ましい。またホタルの発光と異なる色調(すなわち、異なる発光波長)を得るためには、例えば、470nmに発光極大を有するウミホタル(Cypridina hilgendorfii)ルシフェフーゼをコードする遺伝子を使用することもできる。
上記のルシフェラーゼ遺伝子は単離されていて、そのヌクレオチド配列はGenBankなどの遺伝子配列登録機関に登録されている。当業者は、遺伝子配列登録機関または遺伝子配列登録機関の登録配列に基づく各種のデータベース(例えば、DNASISTM)から、ルシフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を入手することができる。
この発明に使用することができるルシフェラーゼ遺伝子は、公知のヌクレオチド配列に基づいて、当業者に周知の方法を用いて発光生物から直接単離することもできるし、あるいは、既に単離され、クローン化されているルシフェラーゼ遺伝子を使用することもできる。さらに、公知のヌクレオチド配列に基づいて化学合成した遺伝子も使用することができる。
更に詳細には、この発明において発光生物からのルシフェラーゼ遺伝子を使用する場合には、市販の各種のキットを用いて単離することができる。この単離操作は、例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual第2版(Sambrook,J.ら編、Cold Spring Harborlaboratory Press,1989)およびCurrent Protocols in Molecular Biology(Ausubel,F.M.ら編、John Wiley & Sons,1987)などの当該分野の標準的な実験マニュアル、ならびに使用するキットの使用説明書に記載された条件および手順に従って実施することができる。
また、この発明に使用されるルシフェラーゼ遺伝子は、上記のように既にクローン化された遺伝子を含有するベクターから適切な制限酵素を用いて切断して分離することもできる。かかるクローン化ルシフェラーゼ遺伝子を含有するベクターとしては、例えば、ホタル(Photinus piralis)ルシフェラーゼのコード領域を含有するpT3/T7−LUC(Clontech、細菌発現用)、pMANneo−LUC(Clontech、動物細胞用)などが挙げられる。これらのベクターからのルシフェラーゼ領域の取り出しは、使用説明書に従って適切な制限酵素を用いた消化などの当該技術分野で慣用されている方法に従って実施することができる。
このようにして得られたルシフェラーゼ遺伝子は、必要に応じて、その活性および特異性を変更するため、あるいはその後の遺伝子組換え操作を容易にするためにその配列の一部または領域を改変することができる。このような改変は、部位特異的変異誘発法またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などの当業者に周知の方法を用いて行うことができる。このようなヌクレオチド配列の改変により、1つ以上のアミノ酸またはアミノ酸配列領域が変更されることは当業者にとっては周知である。これらの標準的な方法や条件などは、上記の実験マニュアルに記載されている。
植物細胞内でルシフェラーゼを効率的に発現させるための発現ユニットは、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子のコード領域以外に、ルシフェラーゼ遺伝子をmRNAに転写するためのプロモーター領域、そして必要に応じてプロモーターに作用してその転写活性を調節するエンハンサー領域、および転写されたmRNAの安定性に関与しているターミネーター領域から構成されている。
このようなプロモーターとしては、導入された植物細胞内でルシフェラーゼ遺伝子をmRNAに転写することができるものであれば、いずれのプロモーターも使用することができ、特に限定されるものではない。かかるプロモーターとしては、例えば、非植物に由来するプロモーター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス35S(CaMV35S)、ノパリン合成酵素(nos)、またはオクトピン合成酵素(ocs)のプロモーター)であっても、また植物に由来するプロモーター(例えば、カルコン合成酵素などの二次代謝系の酵素のプロモーター、またはグリシニンなどの貯蔵タンパク質のプロモーターなど)であってもよい。植物の種々の組織において発光を可能にするために好適なプロモーターとしては、例えば、CaMV35Sプロモーターを使用することができる。上記CaMV35Sプロモーターとしては、例えば、pBI121(Clontech)、pBI221(Clontech)およびpCaMVCN(Pharmacia)などのベクター中にクローン化されているものが挙げられる。この発明においては、形質転換植物の細胞内でのルシフェラーゼ遺伝子の発現のために、CaMV35Sプロモーターを使用するのが好ましい。
この発明において導入されたルシフェラーゼ遺伝子の発現レベルは、エンハンサー領域を導入することにより変化させることができる。このエンハンサー領域は、イントロンなどの非翻訳領域またはプロモーター領域内の特定の領域部分に存在し、用いるプロモーター領域の5’または3’、あるいはその両方に配置されることができる。かかるエンハンサー領域としては、例えば、CaMV35Sプロモーター内の−343〜−90の領域(Kar,R.ら、Science,236:1299−1302,1987)、Ω配列と呼ばれるタバコモザイクウイルスの5’非翻訳領域(Gallie,D.R.ら、Nucl.Acids.Res.,15:3257−3272,1987)、およびアルファルファモザイクウイルスの5’非翻訳領域(Jobling,S.A.ら、Nature,325:622−625,1987)などがある。これらのエンハンサー領域は、単独で使用しても、複数個で使用してもよく、また互いに組み合わせて使用してもよい。この発明においては、好ましくは、タバコモザイクウイルスΩ配列またはCaMV35Sプロモーター内の領域を使用するのが好ましく、またその両方を使用するのがより好ましい。また、その両方のエンハンサー配列をCaMV35Sプロモーターと組み合わせて使用する場合には、Ω配列はCaMV35Sプロモーターのコア領域(−90〜−1)に対して3’側に、CaMV35Sプロモーター内の領域のエンハンサー領域は5’側に配置するのが好ましい。更に、エンハンサー配列の数は形質転換を行う植物に依存する。その上、この発明に用いられるCaMV35Sプロモーター内のエンハンサー領域は、通常2個用いるのが好ましいが、この数は特に限定されない。
この発明に使用することができるルシフェラーゼ発現ベクターは、ルシフェラーゼ遺伝子以外に、形質転換された植物細胞または植物体を容易に選択することができるようにするための選択マーカーとなる耐性などの形質を付与する遺伝子を含有しているのがよい。かかる形質付与遺伝子としては、例えば、カナマイシンおよびネオマイシンの両抗生物質に対する耐性を付与するためのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(NPTII)遺伝子、ならびにハイグロマイシン耐性を付与するためのハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(HPT)遺伝子などが挙げられる。これらの選択マーカーとしての遺伝子は、単独でも、または2つ以上を組合せて使用してもよい。この発明において、ルシフェラーゼ発現ベクターは、選択マーカー遺伝子としてNPTII遺伝子およびHPT遺伝子を含有するのが好ましい。これらの遺伝子は、例えば、CaMV35Sプロモーターまたはnosプロモーターなどの上記のプロモーターの制御下にあり、また代表的なプロモーターは、nosターミネーターをその3’に有している。その結果、得られる形質転換植物は、カナマイシンおよびハイグロマイシンの両方に対して耐性を有することになる。
また、この発明に使用することができるルシフェラーゼ発現ベクターは、必要に応じて、植物細胞内で安定に発現可能なルシフェフーセ遺伝子および選択マーカー遺伝子を含む領域を植物細胞の染色体内に組み込むための領域や、植物細胞内に発現ベクターを導入するために使用される細菌内での複製に必要な領域をさらに含んでいてもよい。ルシフェラーゼ遺伝子および選択マーカー遺伝子を含む領域を植物細胞の染色体内に組み込むための領域としては、例えば、土壌細菌アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)の感染による腫瘍誘発に関係するTiプラスミドのRB配列領域およびLB配列領域などが挙げられる。さらに、このようなベクター上での遺伝子組換え操作を容易に行うために、かかる発現ベクターには、大腸菌(E.coli)での複製および選択を可能にするマーカー、例えば、アンピシリン耐性遺伝子領域などが含まれているのがよい。したがって、この発明に使用することができる発現ベクターとしては、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、薬剤耐性選択マーカー遺伝子、植物細胞の染色体内への組み込みを可能にするRBおよびLB配列領域、土壌細菌内での複製に必要な領域、および大腸菌での複製ならびに選択マーカー遺伝子領域を含むのが好ましい。
上記発現ベクターは、上記配列領域を含む発現ベクターであって、例えば、Tiプラスミドに由来するpBI121(Clontech)などの植物用の発現ベクターを用いて構築することができる。この発現ベクターpBI121は、LB配列とRB配列に挟まれた領域内に、CaMV35Sプロモーター制御下のβ−グルクロニダーゼ(GUS)およびNosプロモーター制御下のNPTII遺伝子の2つの発現ユニットを有している。
この発明に使用することができるルシフェラーゼ発現ベクターは、例えば、pBI121のGUS領域をルシフェラーゼのコード領域に置換することによっても得ることができる。この発現ベクターは、例えば、制限酵素(BamHIおよびSacI)消化によりGUS領域を除いたpBI121に、制限酵素(BamHIおよびSacI)消化によりpT3/T7−LUCから得られたルシフェラーゼのコード領域を挿入することによって作製することができる。エンハンサー配列は、例えば、pL11A−A25(Nishiguchi,Mら、Nucl.Acids Res.,13:5585−5590,1985)および上記のpBI121から制限酵素による消化、またはこれらをテンプレートとして、適切なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により得た後、例えば、HindIII部位を用いて、CaMV35Sプロモーターの5’側に、および/またはBamHI部位を用いてその3’側に導入することによって得るできる。
また、この発明に使用することができるルシフェラーゼ発現ベクターは、他のクローニングベクター、例えば、pUC18およびpBluescriptTM(Stratagene)上で、必要な領域の所定の部分、例えば、エンハンサー配列を伴うプロモーター領域、コード領域とプロモーター領域またはターミネーター領域とを組み合わせた領域、またはそれらの一部を構築することによっても作製することができる。そのような部分領域を、例えば、pBI121などの植物細胞発現用ベクターへ置換などすることにより導入して、目的とする最終の植物細胞導入用のルシフェラーゼ発現ベクターを構築することもできる。発現ベクターの構築方法は、上記の手順に限定されることなく、当業者に慣用されているいずれの手順に従っても容易に行なうことができる。
上記のようにして構築されたルシフェラーゼ発現ベクターを植物細胞に導入する方法としては、例えば、植物に対して感染能を有する土壌細菌、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスまたはアグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rizogenes)などを介する方法、エレクロポレーションによる方法などを用いて実施することができる。
上記した植物細胞への導入方法のうち、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスなどの土壌細菌を介する導入方法は、植物細胞への感染に先立って、構築した発現ベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンスなどの土壌細菌に導入することが必要である。このような土壌細菌を介する植物細胞への導入は、例えば、E.coliに対する方法と同様にして、カルシウム処理による導入方法、凍結融解法、またはエレクロポレーンョン法などを用いて行なうことができる。なお、アグロバクテリウム・ツメファシエンスなどの土壌細菌の培養は、例えば、LB培地またはYEB培地などの培地を用いて、適切な条件下、例えば、25〜30℃で、24〜36時間の振盪培養で行うことができる。
アグロバクテリウム・ツメファシエンスなどの土壌細菌の感染による発現ベクターの植物細胞内への導入は、例えば、植物の組織片、葉および/または茎の切片と、発現ベクターを含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスの菌体もしくはその培養液とを所定の時間接触させることにより行うことができる。例えば、葉の切片を用いる方法は、リーフディスク法として当業者には公知である(例えば、Horsch,R.B.ら、Science227:1229,1985)。アグロバクテリウム・ツメファシエンスが感染する植物の範囲およびその効率は、その菌種によって異なる。例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA4404株は、双子葉植物、特にタバコに対しては容易に感染するが、イネなどの単子葉植物に対しては容易には感染しない。これに対して、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスEHA101株は、LBA4404株と比較して、単子葉植物に対しても十分に高い感染効率を有している。
より具体的に説明すると、発現ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス(例えば、EHA101株)の培養液に、葉片などの組織片を浸漬し、一定時間、例えば、10分間放置する。その後、植物細胞から植物体を分化/誘導させるために、例えば、0.1ppmインドール酢酸および1ppmベンジルアデニンならびに糖(通常、3%スクロース)を添加した植物組織培養用培地(例えば、ムラシゲ−スクーグ(MS)培地、リンスマイヤー−スクーグ(LS)培地、またはガンボルグB5培地など)の寒天培地上に組織片を置いた後、例えば、27℃で2日間培養する。ここで使用される培地の組成は、形質転換する植物およびその組織に応じて変えることができることは、当業者にとっては周知である。
上記の培養後、感染させたアグロバクテリウム・ツメファシエンスの除菌処理と合わせて、ルシフェラーゼ遺伝子を含む感染細胞の選択が行われる。なお、この除菌処理は、公知の方法によって行なうことができる。
この発明に係る形質転換バラ科植物におけるルシフェラーゼの発現は、種々の方法により定量的または定性的に分析することができる。例えば、形質転換植物の組織、例えば、根、茎、葉などを、例えば、リン酸緩衝液、リン酸緩衝化生理食塩水、トリス緩衝液などの適切な緩衝液中で破砕し、遠心分離により得られた上清中のルシフェラーゼの酵素活性を発光量としてルミノメーターで定量的に測定することによって、その発現を測定することができる。また、この反応液を暗所中に放置することにより、その発光を定性的に観測することもできる。酵素活性測定用の反応液には、例えば、クエン酸ナトリウム(10mM、pH5.0)中に1mMルシフェリンおよび1%DMSOが含まれていて、さらに、ルシフェラーゼの酵素活性の発現に必要な物質、例えば、金属イオン、ATPが含まれていてもよい。
上記のようにして作製されたこの発明の形質転換植物は、ルシフェリンを植物組織または器官に供給することによって発光することができる。すなわち、形質転換植物の細胞内において、導入ルシフェラーゼ遺伝子に由来する生物学的に活性なルシフェラーゼの酵素機能により、供給されたルシフェリンが酸化され、暗所において肉眼で観察できる十分な強度で発光することができることになる。
この発明に係る形質転換バラ科植物は、ルシフェリンまたはその塩、例えば、ナトリウム塩などを含有する溶液、例えば、上記の酵素活性測定用の溶液を、根より吸収させるか、または切り花とした場合には、その切り口、すなわちその茎から吸収させることによって発光させることができる。また、この発明の形質転換植物は、上記のルシフェリン含有溶液を噴霧することによって、または上記のルシフェリン含有溶液中へ浸漬させることによっても発光させることができる。つまり、供給されたルシフェリンがルシフェラーゼを発現している植物の器官および組織に到達すると、そこでルシフェラーゼによる酵素反応により発光する。これにより、例えば、この発明に係る形質転換バラ科植物の茎部、葉部および花部で発光させることができる。
この発明を実施例によって以下に説明するが、この発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、またこれらの実施例からの改良ならびに改変もしくは修飾などもまたこの発明の範囲に包含されるものと解釈されるべきである。本実施例において用いた遺伝子組換え操作ならびに植物の形質転換の標準的な手順や条件などは、上記の実験マニュアルに記載されている。
実施例1:ルシフェラーゼ発現ベクターpBE2113H−LUCの構築およびアグロバクテリウム・ツメファシエンスEHA101株のリーフディスク法によるバラ(Rosaceae)の形質転換
ルシフェラーゼ発現ベクターpBE2113H−Lucの構築は、以下の通りに行った。
カリフラワーモザイクウイルスCaMV35Sプロモーターのコア領域(−1〜−90)は、pBI121(Clontech)からポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって得た。このPCRにおいて、プライマーとしては、A5:5’−ATCTCCACTGACGTAAGGGATGACG−3’(配列番号:1)およびA3:5’−TTGTAAAAATACGTACCTCTCCAAATGAAATGAACTTCC−3’(配列番号:2)を使用した。PCRは、95℃で30秒間の変性反応、50℃で60秒間のアニーリング反応、および72℃で60秒間の伸長反応からなるサイクルを25回行った。A3プライマーは、制限酵素SnaBIの認識部位を含み、タバコモザイクウイルスのΩ配列の5’領域と相補的であった。得られたPCR増幅フラグメントを、EcoRVおよびSnaBIの制限酵素で37℃で1時間消化した後、MERMAIDTMKit(BIO101,Inc.)を用いて、その使用説明書に従って精製した。
カリフラワーモザイクウイルスCaMV35Sプロモーターのコア領域(−1〜−90)は、pBI121(Clontech)からポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって得た。このPCRにおいて、プライマーとしては、A5:5’−ATCTCCACTGACGTAAGGGATGACG−3’(配列番号:1)およびA3:5’−TTGTAAAAATACGTACCTCTCCAAATGAAATGAACTTCC−3’(配列番号:2)を使用した。PCRは、95℃で30秒間の変性反応、50℃で60秒間のアニーリング反応、および72℃で60秒間の伸長反応からなるサイクルを25回行った。A3プライマーは、制限酵素SnaBIの認識部位を含み、タバコモザイクウイルスのΩ配列の5’領域と相補的であった。得られたPCR増幅フラグメントを、EcoRVおよびSnaBIの制限酵素で37℃で1時間消化した後、MERMAIDTMKit(BIO101,Inc.)を用いて、その使用説明書に従って精製した。
タバコモザイクウイルスのΩ配列は、タバコモザイクウイルスのcDNAプラスミドpL11A−A25(Nishiguchi,Mら、Nucl.Acids Res.,13:5585−5590,1985)を、B5:5’−TTTCATTTGGAGAGGTACGTATTTTTACAACAATTACCAACAA−3’(配列番号:3)およびB3:5’−GTACGAGCTCTGATCAACGTCCATGGTGGATCCTCTAGATGTAGTTGATGTTAGAAAAATGTAATGTTG−3’(配列番号:4)の2つのプライマーを用いてPCRにより増幅した(95℃で30秒間の変性反応、50℃で60秒間のアニーリング反応、および72℃で60秒間の伸長反応からなるサイクルの25回)。B5プライマーは、CaMV35Sプロモーターの3’と同じ配列を有し、B3はポリリンカー配列(XbaI.BamHI、NcoI.BclIおよびSacI)を有する。得られたPCRフラグメントを、SnaBIおよびSacIの制限酵素で37℃で1時間消化した後、MERMAIDTMKit(BIO101,Inc.)を用いて精製した。
上記の制限酵素処理したPCRフラグメント(CaMV35Sプロモーターのコア領域のEcoRV/SnaBIおよびΩ配列のSnaBI/SacIフラグメント)を、EcoRVおよびSacIの制限酵素で消化したpREX−1(特開平4−169185号)に16℃で30分間処理して連結した。その後、この連結反応混合液を用いて、熱ショック法によりE.coli JM109株を形質転換し、アンピシリン(50μg/ml)を含むLB寒天培地に塗布した後、一晩培養(37℃)して耐性クローンを選択した。耐性クローンに含まれるプラスミドをアルカリ−SDS法(1.5mlスケール)により単離し、制限酵素分析により、目的の挿入フラグメントを含むクローン(pE7113)を選択した。pE7113は、CaMV35Sプロモーターのエンハンサー様配列(−290〜−90)が7個連結した構造を有していた。
上記で得られたpE7113に、β−グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子(pBI221(Clontech)のEcoRI−HindIIIフラグメント)を挿入することによってpE7113−GUSを得た。その後、pE7113−GUSのエンハンサー様配列の置換を以下のようにして行った。得られたpE7113−GUSをHindIIIおよびEcoRVの制限酵素で消化し、大きい方のフラグメントを単離した。一方、−419〜−90のエンハンサー様配列を、pFF19G(Timmermans,M.C.P.ら、J.Biotechnol.,14:333−344,1990)のHindIIIおよびEcoRVによる制限酵素消化よって得た。これらの2つのフラグメントを、16℃で30分の連結反応により連結した。連結反応混合液を用いて上記と同様の操作を行って目的のクローン(pE2113−GUS)を得た。
次に、pE2113−GUSのHindIII−EcoRIフラグメントを、HindIIIおよびEcoRIの制限酵素で消化したpBI121(Clontech)に挿入することによって、pBE2113−GUSを得た。pFF19(Timmermans.M.C.P.ら、J.Biotechnol.,14:333−344,1990)を制限酵素(BamHIおよびSacI)で消化することにより、CaMV35SプロモーターおよびCaMV35Sターミネーターを含むハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(HPT)遺伝子を単離した。得られたHPT遺伝子フラグメントの両端を平滑化した後にSmaIリンカーを連結し、そしてSmaIのアイソシゾマーの制限酵素Cfr9Iで消化した後、このHPT遺伝子フラグメントをpBE2113−GUSのGUS遺伝子の3’に位置するSmaI(Cfr9I)部位に挿入して、pBE2113GUS−HPTを得た。
続いて、pBE2113GUS−HPTをBamHIおよびSacIの制限酵素で消化して、GUSのコード領域を除いた。ルシフェラーゼ遺伝子を含有するpT7/T3−LUCをBamHIおよびSacIの制限酵素で消化し、ルシフェラーゼのコード領域を単離した。単離したルシフェラーゼのコード領域を、BamHIおよびSacIで処理したpBE2113GUS−HPTに挿入し、ルシフェラーゼ発現ベクターpBE2113H−LUCを得た。
ルシフェラーゼ発現ベクターpBE2113H−LUCのアグロバクテリウム・ツメファシエンスEHA101株への導入は以下の通りに行った。
アグロバクテリウム・ツメファシエンスEHA101株を、5mlのYEB培地(0.1%酵母抽出物、0.5%肉抽出物、0.5%ペプトン、0.5%スクロース、0.05%MgSO4・7H2O)で一晩30℃で振盪培養した。次いで、1リットルフラスコ中で200mlのYEB培地に5mlの培養物を加え、さらに30℃で5〜6時間培養した。続いて、4000rpmで5分間遠心分離して菌体を集め、集めた菌体を100mlの10mM Tris−HCl(pH8.0)中に懸濁した。この懸濁液を上記と同一条件で再度遠心分離を行って得られた菌体を2mlのYEB培地中に懸濁した。微量遠心チューブ中でこの懸濁液の100μlと1μgのpBE2113H−LUCを含む5μlのDNA溶液とを混合して、ドライアイス/エタノール浴中で5分間凍結させた。次いで、凍結した溶液を37℃の温浴中で融解し、25分間放置した後、1mlのYEB培地を添加し、1時間30℃で振盪培養した。このようにして得られた培養液100μlをカナマイシン(50μg/ml)およびハイグロマイシン(50μg/ml)を含有するYEB培地上に塗布し、約36時間30℃で培養して耐性クローンを得た。得られた耐性クローン中のルシフェフーゼ発現ベクターpBE2113H−LUCをアルカリ−SDS法により単離して、制限酵素分析によりその存在および構造を確認した。
アグロバクテリウム・ツメファシエンスEHA101株を、5mlのYEB培地(0.1%酵母抽出物、0.5%肉抽出物、0.5%ペプトン、0.5%スクロース、0.05%MgSO4・7H2O)で一晩30℃で振盪培養した。次いで、1リットルフラスコ中で200mlのYEB培地に5mlの培養物を加え、さらに30℃で5〜6時間培養した。続いて、4000rpmで5分間遠心分離して菌体を集め、集めた菌体を100mlの10mM Tris−HCl(pH8.0)中に懸濁した。この懸濁液を上記と同一条件で再度遠心分離を行って得られた菌体を2mlのYEB培地中に懸濁した。微量遠心チューブ中でこの懸濁液の100μlと1μgのpBE2113H−LUCを含む5μlのDNA溶液とを混合して、ドライアイス/エタノール浴中で5分間凍結させた。次いで、凍結した溶液を37℃の温浴中で融解し、25分間放置した後、1mlのYEB培地を添加し、1時間30℃で振盪培養した。このようにして得られた培養液100μlをカナマイシン(50μg/ml)およびハイグロマイシン(50μg/ml)を含有するYEB培地上に塗布し、約36時間30℃で培養して耐性クローンを得た。得られた耐性クローン中のルシフェフーゼ発現ベクターpBE2113H−LUCをアルカリ−SDS法により単離して、制限酵素分析によりその存在および構造を確認した。
バラのリーフディスク法による形質転換および植物体の分化ならびに誘導は、以下の手順に従って行なった。
この実験には、無菌下で茎頂培養により誘導したバラの多芽体を用いた。多芽体の誘導は、ムラシゲ−スクーグ(MS)培地の無機塩(以下、MS無機塩)、ガンボルグB5培地の有機物(以下、B5有機物)、ベンジルアデニン(1ppm)、インドール酢酸(0.02ppm)、スクロース(3%)、およびゲランガム(Sigma、0.25%)からなる培地(基本培地)を用いて行った(温度:24℃、明期:16時間、暗期:8時間)。MS無機塩は、KNO3(1900mg/l)、NH4NO3(1650mg/l)、KH2PO4(170mg/l)、CaCl2・2H2O(440mg/l)、MgSO4・7H2O(370mg/l)、FeSO4・7H2O(27.8mg/l)、Na2EDTA(37.3mg/l)、MnSO4・4H2O(22.3mg/l)、ZnSO4・7H2O(8.6mg/l)、H3BO3(6.2mg/l)、CuSO4・5H2O(0.025mg/l)、Na2MoO4・2H2O(0.25mg/l)、KI(0.83mg/l)、およびCoCl2・6H2O(0.025mg/l)を含む。B5有機物は、ミオイノシトール(100mg/l)、チアミン塩酸塩(10mg/l)、ピリドキシン塩酸塩(1mg/ml)、およびニコチン酸(1mg/l)を含んでいた。得られた多芽体は、上記の多芽体誘導培地および条件下で継代培養することにより維持した。
この実験には、無菌下で茎頂培養により誘導したバラの多芽体を用いた。多芽体の誘導は、ムラシゲ−スクーグ(MS)培地の無機塩(以下、MS無機塩)、ガンボルグB5培地の有機物(以下、B5有機物)、ベンジルアデニン(1ppm)、インドール酢酸(0.02ppm)、スクロース(3%)、およびゲランガム(Sigma、0.25%)からなる培地(基本培地)を用いて行った(温度:24℃、明期:16時間、暗期:8時間)。MS無機塩は、KNO3(1900mg/l)、NH4NO3(1650mg/l)、KH2PO4(170mg/l)、CaCl2・2H2O(440mg/l)、MgSO4・7H2O(370mg/l)、FeSO4・7H2O(27.8mg/l)、Na2EDTA(37.3mg/l)、MnSO4・4H2O(22.3mg/l)、ZnSO4・7H2O(8.6mg/l)、H3BO3(6.2mg/l)、CuSO4・5H2O(0.025mg/l)、Na2MoO4・2H2O(0.25mg/l)、KI(0.83mg/l)、およびCoCl2・6H2O(0.025mg/l)を含む。B5有機物は、ミオイノシトール(100mg/l)、チアミン塩酸塩(10mg/l)、ピリドキシン塩酸塩(1mg/ml)、およびニコチン酸(1mg/l)を含んでいた。得られた多芽体は、上記の多芽体誘導培地および条件下で継代培養することにより維持した。
pBE2113H−LUCを含有する上記のアグロバクテリウム・ツメファシエンスEHA101株を、LB培地中で30℃で2日間培養した。この培養液に、上記の多芽体から得られた葉片(大きさ:約3mm×約20mm)を約10分間浸漬した。その後、葉片を共存培地上に置床した。共存培地は、上記の基本培地にオーキシンおよびサイトカイニンを添加した培地である(共存培地1:0.2ppmチジアズロン+0.5ppmインドール酪酸、共存培地2:0.5ppmベンジルアデニン+0.5ppm1−ナフタレン酢酸、および共存培地3:0.5ppmベンジルアデニン+0.5ppm2,4−ジクロロフェノキシ酢酸)。培養は、24℃で、16時間の明期(5000lux)および8時間の暗期で、3日、5日、7日、10日、および14日の各期間行った。
次に、アグロバクテリウム・ツメファシエンスEHA101株の除菌と形質転換植物の分化/誘導のために、上記の葉片を、共存培地1〜3にハイグロマイシン(30μg/ml)およびカルベニシリン(500μg/ml)を添加した選択培地に移した。培養は、16時間の明期(5000lux)および8時間の暗期で、24℃でさらに16〜27日間(上記の共存培地への置床から合計30日間)行い、不定芽を形成させた。その結果を表1に示す。共存培地2上で形成された不定芽の葉片を上記の不定芽誘導培地に置床することにより不定芽を誘導し、そして32個体の形質転換体を得た。
選択された不定芽から育成した幼植物体を発根培地(B5有機物を含まない基本培地)に移し、30日間培養して根を形成させた。この幼植物体を、バーミキュライト(日本耐火(株))とパーライト(日本セメント(株))との1:1の混合物に移し、1000倍希釈のハイポネックスTM(ハイポネックスジャパン(株))を液肥として与え馴化処理を行った。この馴化処理は、16時間照明(20000lux)の明期(24℃)および8時間の暗期(20℃)の人工気象室で30日間行った。その後、植物体を、土を主体とする用土(クレハ園芸培土:呉羽化学(株))に移植(鉢上げ)し、上記の条件の人工気象室内で栽培した。
形質転換されたバラの発光は、不定芽の葉片および鉢上げ直後の植物体の葉を用いてルシフェリン溶液を葉の切り口から吸収させることによって行った。上記の最初に得られた32個体の形質転換されたバラのうち、13個において肉眼で明瞭な発光が認められた。次に、これらの13個体について、開花期の形質転換体の地上部を用いて、茎からルシフェリン溶液を吸収させることによって発光検定を行った。このうちの1個体は、茎、葉および花部が肉眼ではっきりと認められる程度に発光した。残りの12個体は、かすかに発光するか、または肉眼でその発光を確認することができなかった。
上記の発光検定で発光が認められた形質転換体1つの不定芽の葉片を、再度、選択培地に置床することにより不定芽を誘導し、形質転換体をさらに選択した。このようにして得られた20個体を鉢上げし、上記のように発光検定を行ったところ、鉢上げ直後の20個体すべての葉には、発光が認められた。また、開花期の地上部は、茎からルシフェリン溶液を吸収させることによって発光検定を行ったところ、2個体において、茎、葉および花部に発光が肉眼ではっきりと認められる程度に認められた。しかし、残りの18個体においては、かすかに発光を確認することができるか、またはその発光を肉眼で確認することができなかった。
これらの形質転換植物については、鉢上げ直後の植物の葉の発光は、50cmの距離からでも肉眼で充分に観察することが可能であった。特に、茎、葉および花部において最も強い発光強度を有した上記の形質転換体では、2〜3mの距離からでも肉眼でその発光が十分に観察できた。この形質転換植物の発光は、茎をルシフェリン溶液に1〜2時間浸すことによって約12時間持続し、さらに、茎をルシフェリン溶液に浸したままの状態では、最大3日間持続した。
発光のために使用したルシフェリン溶液は、10mMリン酸緩衝液(pH7.0)中に、0.25mMルシフェリンナトリウム塩(Sigma)、2.5mM補酵素A三ナトリウム(和光純薬工業(株))、2.5mM ATP(オリエンタル酵母工業(株))および2.5mM MgSO4・7H2Oを含有していた。
この発明によれば、植物細胞内で作動可能なルシフェラーゼ遺伝子をバラ科に属する植物の細胞に導入し、導入された植物細胞から分化/誘導された植物体を再生させることにより形質転換植物を得ることができる。この形質転換植物に、ルシフェリンを供給することによって、形質転換植物の組織および器官を発光させることができる。この発明により得られる形質転換植物は、肉眼で十分にその発光が認められ、暗所での観賞に好適である。
Claims (6)
- ルシフェラーゼをコードする遺伝子を有し、かつ、該遺伝子から発現して発光することができる形質転換バラ科植物。
- 前記バラ科(Rosaceae)に属する植物がバラ属(Rosa)に属することを特徴とする請求項1に記載の形質転換バラ科植物。
- ルシフェリンを供給することにより植物体の器官または組織が発光することを特徴とする請求項1または2に記載の形質転換バラ科植物。
- 花部を含む器官が発光することを特徴とする請求項1ないし3のいずれか1項に記載の形質転換バラ科植物。
- バラ科(Rosaceae)に属する植物の細胞内に、植物細胞内で作動可能なルシフェラーゼ遺伝子を導入することと、該細胞中においてルシフェラーゼ遺伝子を発現させて発光することができる形質転換バラ科植物の作製方法。
- バラ科(Rosaceae)に属する植物の細胞内に、植物細胞内で作動可能なルシフェラーゼ遺伝子を導入することと、該細胞中においてルシフェラーゼ遺伝子を発現させて発光することを特徴とする形質転換バラ科植物の発光方法。
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JP2011217662A (ja) * | 2010-04-08 | 2011-11-04 | Senshukai Co Ltd | 改変型ルシフェラーゼを大量発現する葉緑体形質転換植物 |
JP2013529058A (ja) * | 2010-02-25 | 2013-07-18 | バイオグロウ インク. | 細菌luxオペロンを含む自己発光植物とそれを作製する方法 |
WO2019235483A1 (ja) * | 2018-06-04 | 2019-12-12 | 国立大学法人大阪大学 | 発光蛋白質、その基質、及びそれらの使用 |
CN114080949A (zh) * | 2020-05-26 | 2022-02-25 | 中国林业科学研究院资源昆虫研究所 | 一种调控滇丁香花期的方法 |
-
2004
- 2004-07-30 JP JP2004247591A patent/JP2006042768A/ja active Pending
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