ES2614499T3 - Método para la transformación de plastidios de células vegetales - Google Patents

Método para la transformación de plastidios de células vegetales Download PDF

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Abstract

Un método para transformar plastidios en una células vegetales, el método comprende: 1) introducir en el núcleo de dicha células vegetales una secuencia de ácidos nucleicos que comprende un promotor nuclear de planta ligado operablemente a una primera secuencia de ácidos nucleicos que comprende un casete de transgén de plastidio, una secuencia de traslocación de plastidios (PTS) es decir una secuencia de ARN capaz de unirse a una proteína de unión de PTS de planta, y un dominio de unión de cebador seleccionado de aquel de un retrotransposón o un retrovirus; 2) introducir en el núcleo de dicha células vegetales una segunda secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de unión de secuencia de traslocación de plastidios fusionada a un primer péptido de tránsito de plastidio, en el que dicha segunda secuencia de ácidos nucleicos se une operablemente a un promotor nuclear de planta; y 3) introducir en el núcleo de dicha células vegetales una tercera secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de transcriptasa inversa fusionada a un segundo péptido de tránsito de plastidio, en el que la tercera secuencia de ácidos nucleicos se une operablemente a un promotor nuclear de planta que acciona la expresión en un núcleo de células vegetales; en el que el casete de transgén de plastidio de planta comprende: i) una secuencia de flanqueo izquierda y una secuencia de flanqueo derecha seleccionada de secuencias de nucleótidos para recombinación homóloga en los plastidios; y ii) por lo menos un ácido nucleico aislado de interés.

Description

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DESCRIPCION
Metodo para la transformacion de plastidios de celulas vegetales
La presente invencion se relaciona con un metodo para producir especie de ARN heterologa o exogena en material de celulas vegetales tal como celulas vegetales transformadas geneticamente en cultivos, tejidos de planta y plantas derivadas a partir de celulas vegetales transformadas geneticamente. En particular, el metodo se relaciona con un metodo mas eficiente para producir especies de ARN y/o protelnas heterologas o exogenas en plastidios comprendidos en material de celulas vegetales, el material genetico requerido para ello, tal como ADN y ARN, vectores, celulas anfitrionas, introduction de metodos de material genetico en celulas vegetales, celulas vegetales que comprenden plastidios modificados geneticamente, y usos de los mismos.
Una desventaja de los metodos de transformacion de plastidios vegetales de la tecnica anteriores es que la eficiencia de transformacion en terminos de numeros de plastidios transformados por celula tiende a ser baja. Una desventaja adicional de los metodos de la tecnica anterior es que el suministro de information genetica en el plastidio tiende a ser erratico en el sentido de que los mecanismos de suministro empleados dependen de la oportunidad para el suministro exitoso de informacion genetica, tal como ARN, en el genoma del plastidio. Los metodos de la tecnica anterior no se basan en procesos celulares endogenos eficientes para la transferencia de ARN en el genoma del plastidio, la transcription inversa posterior y recombination de este dentro del genoma del plastidio, y cuando se desea, seguido por la expresion de protelna de interes de la misma. Como tal, los procesos de la tecnica anterior para modificar geneticamente los plastidios parecen ineficientes. Estas y otras desventajas de la tecnologla de transformacion de plastidios de la tecnica anterior seran evidentes a partir de la description anterior.
Lutz, Kerry Ann et al: “A guide to choosing vectors for transformation of the plastid genome of higher plants”, Plant Physiology, American Society of Plant Physiologists, Rockville, MD, US LNKD-DOI:10.1104/PP.107.106963, vol. 145, no. 4, 1 de diciembre de 2007, paginas 1201-1210, ensena el suministro de un casete de transgen a solo unos pocos de los plastidios de la cantidad total de los plastidios presentes en una celulas vegetales.
Los presentes inventores han encontrado que al utilizar o adaptar los procesos celulares endogenos para la transferencia de secuencias de polinucleotidos, tales como ARN, desde el citoplasma hasta el plastidio en la celulas vegetales, las secuencias de polinucleotidos derivados de la transformacion nuclear del nucleo de una planta de celulas se puede transferir de manera eficiente o dirigir en el genoma del plastidio dentro de una celulas vegetales que se transforma de esta manera, y se expresa de manera mas eficiente en el plastidio como se describe aqul. Adicionalmente, es evidente que una vez que el plastidio se transforma con secuencias de la invencion, no es necesario que los transgenes codificados nucleares que se requieren para la transformacion inicial del plastidio permanezcan en el genoma nuclear. Como consecuencia, se pueden eliminar los transgenes codificados nucleares a traves de la segregacion deliberada o natural en las siguientes generaciones de plantas. Para los propositos de la presente invencion los terminos “plastidio” y “plastidios” y “poblacion de plastidios” se utilizan de forma intercambiable, como lo son los terminos “celulas vegetales” y “celulas vegetales”, a menos que el contexto exija otra cosa. Al emplear o adaptar los procesos celulares endogenos para la transferencia de ARN derivado de las secuencias de polinucleotidos introducidos en el nucleo para el genoma del plastidio, tal como se describe aqul, se considera que el metodo de la invencion es unico sobre los metodos de la tecnica anterior para la generation de celulas vegetaless o plantas que poseen plastidios geneticamente modificados. La poblacion de plastidios de la celulas vegetales se bombardea constantemente mediante ARN que se deriva del nucleo de la celula, que se lleva sobre la membrana de plastidios y en el plastidio donde se transcribe de forma inversa, se integra en el genoma y luego se transcribe, lo que resulta en la generacion de ARN a partir del cual se pueden expresar las protelnas de interes.
Subsiste la necesidad de un metodo de transformacion de plastidios mas eficiente para la production de ARN, y cuando se requiera, las protelnas de interes en los plastidios de celulas vegetaless transformadas y tejidos de planta derivados de las mismas.
La base para la presente invencion, que no parece haber sido realizada en la tecnica anterior, es el suministro de una unidad de transformacion de plastidio de planta que comprende secuencias de acidos nucleicos que codifican:
i) una unidad de transformacion de plastidio de planta (PTU); ii) una transcriptasa inversa fusionada a una secuencia de peptidos de transito de cloroplasto derivada de planta; y iii) una protelna de union de ARN fusionada a un peptido de transito de plastidio de planta. No parecen haber sido descritos o aludidos dichos sistemas de fusion de plastidios en la tecnica anterior. Las modificaciones simples adicionales de esta clase de unidad de transformacion de plastidio de planta incluyen aquellas que comprenden secuencias de acidos nucleicos que codifican i) una unidad de transformacion de plastidio de planta [PTU, por ejemplo, una unidad de transformacion de cloroplasto (CTU)]; una secuencia de traslocacion de plastidios de planta (PPS-5'), por ejemplo, una secuencia de translocation de cloroplastos (CTS-5'), fusionada al extremo 5' de la PTU; una secuencia de traslocacion de plastidios de planta adicional (PPS-3'), por ejemplo una secuencia de translocacion de cloroplastos (CTS-3') fusionada al extremo 3' de la CTU; y un dominio de union de cebador disenado para transcripcion inversa en plastidios utilizando tRNA-Met de plastidio, tal como tRNA-Met(PBD- CHL) de cloroplasto. Al colocar el PBD-CHL junto al extremo 3' de la CTS-3', es decir, fuera del intron LtrB como se
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representa en la Figura 3 (A), la protelna Ltra es capaz de funcionar como una protelna de translocacion y como fuente de la transcriptasa inversa. En dicha variante, no subsiste la necesidad de introducir un segundo gen para la funcionalidad de la transcriptasa inversa. En una segunda variante de este sistema, en el que el PBD (PBD-CYT) se disena para interactuar con tRNA-Met citoplasmico endogeno, el PBD se ubica adyacente en el extremo 3' de la PTU (o, preferiblemente, una CTU) y una secuencia de translocacion de plastidios, preferiblemente una secuencia de translocacion de cloroplastos, se fusionan a esta en direccion 3'. En esta segunda variante, cuando se emplea un PBD que es capaz de unirse con tRNA-Met citoplasmatico como cebador, la transcripcion se inicia por la transcriptasa inversa endogena en el citoplasma utilizando tRNA-Met citoplasmico inverso. Por lo tanto, la segunda variante del sistema no requiere el cosuministro de una secuencia de acidos nucleicos a la transcriptasa inversa para los plastidios, tales como cloroplastos. El uso de dichos sistemas de transformacion de plastidios proporciona un rendimiento mejorado de ARN y por lo tanto la protelna de interes a partir de fuentes de plastidios que hasta ahora se ha alcanzado en la tecnica anterior.
De acuerdo con un primer aspecto de la presente invencion se proporciona un metodo para transformar una celulas vegetales de acuerdo con la reivindicacion 1.
La palabra “plastidio” para los propositos de la presente invencion abarca cloroplastos, proplastidios, etioplastos, cromoplastos, amiloplastos, leucoplastos y elaioplastos. Preferiblemente, el “plastidio” se refiere a cloroplastos. Para los propositos de la descripcion, los terminos “cloroplasto” y “cloroplastos” se utilizan de forma intercambiable a menos que el contexto demande lo contrario como son los terminos “plastidio” y “plastidios”.
En una preferencia del metodo anterior, el casete de transgen de plastidio es un casete de transgen de cloroplasto, y la secuencia de traslocacion de plastidios (PTS) es una secuencia de translocacion de cloroplastos (CTS), y la protelna de transcriptasa inversa es una transcriptasa inversa de un retrotransposon o un retrovirus que se fusiona a un peptido de transito de cloroplasto para dirigirse en el cloroplasto.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invencion se proporciona un metodo para producir por lo menos una especie de ARN heterologa o exogena en una planta de acuerdo con reivindicacion 8.
Preferiblemente, la planta obtenida de acuerdo con el metodo anterior se hace crecer bajo condiciones en las que dicha especie de ARN heterologa o exogena codificada por el transgen integrado en el plastidio se expresa como protelna heterologa o exogena.
Naturalmente, el experto en la tecnica entendera que el promotor nuclear de la planta se une operativamente a las secuencias de acidos nucleicos proporcionadas aqul acciona la expresion de dichas secuencias en el nucleo de la planta.
El “casete de transgen de plastidio” comprende una secuencia de flanqueo izquierda (LFS) y una secuencia de flanqueo derecha (RFS) que se utilizan para recombinacion homologa del casete en el genoma de plastidio. Entre las LFS y RFS se ubican por lo menos un promotor especlfico de secuencia de plastidios (tal como un promotor especlfico de cloroplasto, por ejemplo Prrn) y por lo menos una secuencia terminadora especlfica de plastidio (tal como un terminador especlfico de cloroplasto, por ejemplo la secuencia de 3'UTR del gen psbA del tabaco) que a su vez flanquea por lo menos un gen aislado o secuencia de acidos nucleicos aislada de interes, tal como una secuencia de ADN recombinante (por ejemplo cADN) o una secuencia de ADN nativa introducida. La secuencia LFS y RFS puede incluir el promotor especlfico de cloroplasto y secuencias terminadoras, respectivamente, si por ejemplo, el acido nucleico aislado de interes se fusiona un acido nucleico de cloroplasto nativo de interes. Por lo tanto, el promotor y las secuencias terminadora necesariamente no se incluyen en la LFS o RFS, respectivamente per se, o entre la LFS y RFS si se inserta un transgen en el genoma del cloroplasto como una unidad de cistron o si un transgen se fusiona traduccionalmente a un gen nativo. En tal caso, cuando un transgen se fusiona a una secuencia de codificacion del cloroplasto nativo es despues de que el evento de transformacion ha tenido lugar que el promotor se puede encontrar en direccion 5' de la secuencia que es homologa a la LFS en el genoma del cloroplasto y esta disponible para conducir la expresion del gen fusionado al transgen de interes. Para los propositos de la presente invencion “transgen” incluye secuencias de acidos nucleicos aisladas que en ultima instancia pueden dar lugar a la expresion de protelnas o peptidos de interes en el plastidio (por ejemplo, del cloroplasto) como se describe aqul. Por lo tanto, la secuencia de acidos nucleicos aislada puede ser una que da lugar a una secuencia de ARN de interes que puede no codificar o dar lugar a la expresion de un producto traducible, o la secuencia de acidos nucleicos aislada puede dar lugar a una secuencia de ARN que codifica o da lugar a la expresion de un producto traducible tal como una protelna o peptido de interes. El experto en la tecnica tambien apreciara que el transgen que se lleva en el acido nucleico aislado tambien se puede disenar para dar lugar a una secuencia de ARN que da lugar a la expresion de un producto o productos traducible, y ARN intraducibles. Dichos ARN que no dan lugar a la expresion de protelnas pueden dar lugar a secuencias de ARN que contienen supresiones u otras mutaciones y estos pueden encontrar uso como herramientas de investigacion para estudiar la funcion de genes en el plastidio, por ejemplo cloroplasto. Cuando el “transgen” da lugar a la expresion de protelnas o peptidos, los transgenes adecuados de interes incluyen protelnas de planta capaces de conferir las caracterlsticas deseadas para hacer crecer plantas y protelnas farmaceuticas para uso en mamlferos, que incluyen el hombre, tal como insulina, preproinsulina, proinsulina, glucagon, interferones tales como a-interferon, p-interferon, Y-interferon, factores de
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coagulacion de sangre seleccionados de Factor VII, VIII, IX, X, XI, y XII, hormonas de fertilidad, que incluyen la hormona luteinizante, factores de crecimiento hormonal que estimulan foliculos, que incluyen factor de crecimiento epidermico, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor estimulante de colonias de granulocitos y similares, prolactina, oxitocina, hormona estimulante de tiroides, hormona adrenocorticotropica, calcitonina, hormona paratiroidea, somatostatina, eritropoyetina (EPO), enzimas tales como la p-glucocerebrosidasa, hemoglobina, albumina de suero, colageno, proteinas de estres bioticas y abioticas, tales como proteinas toxicas insecticida y de insectos, por ejemplo de, o derivada de Bacillus thuringiensis, proteinas nematicidas, proteinas de resistencia a herbicidas (por ejemplo, a glifosato), proteinas tolerantes a sal, proteinas tolerantes a sequia, proteinas de mejora nutricionales implicadas en la biosintesis de compuestos fenolicos, almidones, azucares, alcaloides, vitaminas y vacunas comestibles, y similares. Adicionalmente, el metodo de la invencion se puede utilizar para la produccion de anticuerpos monoclonales especificos o fragmentos activos de los mismos y de enzimas industriales o fragmentos activos de las mismas.
Todas las proteinas mencionadas anteriormente son de tipo planta y humano. Otras proteinas que se contemplan para la produccion en la presente invencion incluyen proteinas para uso en el cuidado veterinario, y pueden corresponder a homologos animales de las proteinas humanas, tales como las proteinas humanas mencionadas anteriormente.
Las LFS y RFS se pueden seleccionar de cualquiera de las secuencias de nucleotidos que se pueden utilizar para recombinacion homologa en el plastidio. Los ejemplos adecuados incluyen secuencias de codificacion tales como la secuencia que codifica los genes psbA, rbcL de cloroplastos.
El promotor de plastidio de planta se puede seleccionar de entre el grupo que consiste del promotor de polimerasa de ARN, elemento de promotor rpo B, elemento de promotor atpB, elemento de promotor clpP, elemento de promotor de rADN 16S, PrbcL, Prps16, el promotor Prrn16, Prrn-62 , Pycf2-1577, PatpB-289, Prps2-152, Prps16-107, Pycf1-41, PatpI-207, PclpP-511, PclpP-173, PaccD- 129, PaccD-129 del gen accD del tabaco, el promotor PclpP-53 del gen clpP, el promotor Prrn-62 del gen rrn, el promotor Prps16-107 del gen rps16, el promotor PatpB/e-290 del gen de tabaco atpB/e, y el promotor PrpoB-345 del gen rpoB. Adicionalmente, todos aquellos promotores que pertenecen a la clase III (Hajdukiewicz P T J et al. (1997) EMBO J 16:4041-4048) y todos los fragmentos de los promotores de clase II que controlan el inicio de la transcripcion por NEP se pueden utilizar en el metodo de la invencion. Dichos promotores o unidades estructurales de promotor en general no se conocen por estar muy conservados. La ATAGAATAAA se da como consenso cerca del sitio de inicio de la transcripcion de los promotores NEP ((Hajdukiewicz P T J et al (1997) EMBO J 16:4041-4048).
El terminador de plastidio de planta, tales como un terminador de transcripcion de cloroplasto se puede seleccionar de cualquier terminador de plastidios tales como psbA, ATPA, rbcL de region 3'-UTR, y terminadores de la transcripcion bacteriana tales como rrnB descrito por Orosz A., et al., Eur. J. Biochemistry, 2005, Volume 201, Issue 3, pp 653-659.
Naturalmente, el experto en la tecnica apreciara que otras secuencias de ADN terminadoras pueden estar presentes en las construcciones utilizadas en la invencion.
El casete del transgen de plastidio de planta (por ejemplo, cloroplasto) tambien comprende un dominio de union de cebador (PBD) que una vez dentro del plastidio (por ejemplo, del cloroplasto) es capaz de capturar tARNs como cebadores para formar ARN de plantilla para iniciar la transcripcion inversa de la unidad de transformacion de cloroplasto planta introducida de la invencion. Un tARN adecuado para uso en la presente invencion como un cebador es tRNA-fMet que forma un ARN de plantilla listo para transcripcion inversa. El experto en la tecnica apreciara que los PBD se encuentran naturalmente en retroelementos que incluyen retrovirus y retrotransposones. Los PBD comprenden dominios de ARN especificos que se hibridan con secuencias especificas en las moleculas de tARN. El tARN en si mismo no sirve como un PBD pero como un cebador para transcripcion inversa, la plantilla para la transcripcion inversa es la molecula de ARN que lleva un PBD. Se pueden disenar facilmente PBD novedosos que se pueden hibridar con otros tARNs. Los PBD se pueden disenar para unir a otros tipos de tARNs tales como, tRNA-Lys y tRNA-Met de tabaco y otros que son conocidos en la tecnica
http://www.unibayreuth.de/departments/biochemie/trna/).
Ciertos elementos de retroelementos tales como retrovirus o retrotransposones, tienen PBD nativos que poseen dominios conservados que se hibridan con los dominios complementarios de tARN (por lo general el tRNA-Met, o tRNA- trp); debido a las estructuras conservadas de todos los tARNs (la denominada estructura de hoja de trebol), los PBD se pueden disenar para que lleven a dominios especificos que se hibridan con un tARN de eleccion.
Una “secuencia de translocacion plastidios” (PTS, por ejemplo una secuencia de translocacion de cloroplasto (CTS)) es una secuencia de ARN que es capaz de unirse a una proteina de union de PTS de planta y, por tanto, la PTS y otras secuencias de ARN que se pueden asociar con este o fusionar con el mimo se pueden transportar a traves de y en el plastidio (por ejemplo, del cloroplasto). El CTS se puede seleccionar de virus de ARN desnudos, que incluyen los ARN virales tales como aquellos de los virus de ARN de cadena positiva tales como el virus X de papa (PVX), el virus del mosaico del tabaco (TMV), virus del mosaico del tomate (ToMV), y ARN virales de virus de ARN de cadena negativa, como el virus de tomate silvestre moteado (TSWV) y virus moteado necrotico del impaciente (INSV), viroides tales como viroide latente de mosaico de melocoton (PLMVd) o viroide de mancha solar del aguacate (ASBV), virus satelites tales como virus del mosaico del tabaco de satelite (STMV) y similares. Otras fuentes de las PTS/CTS incluyen ARN del
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intron del grupo I y II o versiones modificadas de los mismos en las que se han eliminado los sitios de corte y empalme crlpticos que se pueden derivar de una bacteria, un hongo o un plastidio/cloroplasto de una planta, tal como un intron de LTRB que carece de la secuencia que codifica la LTRA (protelna codificada por una secuencia de LTRA sea capaz de servir como una protelna de union PTS/CTS en el metodo de la invention).
Preferiblemente, se han eliminado el intron es un intron del grupo II, tal como el intron Ll.ltrB de Lactococcus lactis o una version modificada de la misma en la que los sitios de corte y empalme crlpticos como se describe aqul. Los intrones del grupo II ampliamente se representan en los organulos de plantas y hongos, y en bacterias. Los intrones del grupo II utiles en el metodo de la invencion son retroelementos moviles, altamente estructurales que codifican protelna multifuncional (protelna codificada de intron o IEP) que posee actividad transcriptasa inversa (RT). El IEP facilita el empalme de ARN de intron mediante estabilizacion de la estructura de ARN catallticamente activa, realiza la transcription inversa y la insertion del intron en los sitios objetivo de ADN especlficos del genoma bacteriano a alta frecuencia (Moran et al. (1995) Mol Cell Biol 15:2828-2838; Cousineau et al. (1998) Cell 94:451-462).
Los intrones del grupo II de origen bacteriano, tales como aquellos derivados de Lactococcus que comprenden un gen LtrA, se utilizan preferiblemente en el metodo de la invencion. La secuencia de polinucleotidos LtrA de una bacteria Lactococcus, tal como Lactococcus lactis se puede modificar para la expresion optima en plantas al insertar en este por lo menos una secuencia de polinucleotido que comprende uno o mas intrones de por lo menos una secuencia de acidos nucleicos de planta, tales como de uno o mas genes de planta y al sustituir ciertos codones seleccionados que tienen una baja frecuencia de uso en las plantas nativas con codones que se producen con una mayor frecuencia en dichas plantas. Normalmente, la secuencia de LtrA bacteriana de interes se analiza con referencia a la utilization de codones de planta que utilizan comparaciones in silico tales como aquellas encontradas en el sitio web
www.kazusa.or.jp/codon para los codones bacterianos que se producen con baja frecuencia en las plantas. Dichos codones luego se pueden sustituir con codones que tienen una alta frecuencia de ocurrencia en las plantas, y se genera una secuencia de polinucleotidos modificada derivada in silico. A partir de esta secuencia de LtrA optimizada se elabora una secuencia de polinucleotidos LtrA sintetica correspondiente a la secuencia generada in silico mediante procedimientos de slntesis de polinucleotidos estandar conocidos en la tecnica, y luego se puede utilizar en la preparation de construcciones de uso en la presente invencion como se describe aqul. Se considera que al utilizar una secuencia modificada que comprende sustituciones de codones de plantas como se describio anteriormente se generan secuencias de ARN de polinucleotidos mas estable en el entorno celulas vegetales.
Otros tipos de intrones que se pueden utilizar en el metodo de la invencion incluyen, por ejemplo, el intron del grupo I de Tetrahymena (GenBank Acc. No.: X54512; Kruger K et al. (1982) Cell 31:147-157; Roman J and Woodson S A (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95:2134-2139), intrones rIl del grupo II de Scenedesmus oblicuo (No. de Acceso GenBank: nucleotidos 28831-29438 X17375.2; Hollander V y Kuck U (1999) Nucl Acids Res 27: 2339-2344; Herdenberger F et al. (1994) Nucl Acids Res 22: 2869-2875; Kuck U et al. (1990) Nucl Acids Res 18:2691-2697), y el intron Ll.LtrB (No. de Acceso GenBank: nucleotidos U50902 2854 a 5345).
Aparte de los intrones heterologos descritos aqul, los intrones endogenos de origen natural en el plastidio, por ejemplo, en el cloroplasto, tales como intrones del grupo II de los cloroplastos de plantas, por ejemplo el atpF, rpl, ARNt, trnI, trnK, petD, petB (Jenkins BD et al., The Plant Cell, Vol. 9, 283-296, marzo de 1997).
Los intrones que se producen de forma natural en los plastidios, tales como cloroplastos de la planta de interes se pueden modificar de tal manera que tienen una homologla de secuencia de aproximadamente 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90 % o 95%, o de cualquier homologla de secuencia entre los mismos porcentajes, con la secuencia del intron de partida, mientras que conserva la funcionalidad, tambien se puede emplear en el metodo de la invencion. Otros MTS incluyen dominios de ARN que se encuentran en TNT1, retrotransposones similares de Ty1 y Ty3 de levadura u otro RNA que alberga un dominio que es reconocido por una protelna de union de ARN que es accionado en los cloroplastos.
Una “protelna de union de secuencia de translocation de plastidios” (PTS-BP, por ejemplo, una CTS-BP) puede ser cualquier protelna de union de ARN que reconoce y se une a dominios de ARN especlficos de interes y se fusiona a un peptido de transito de plastidio, tal como un peptido de transito de cloroplasto. Ejemplos de protelnas PTS-BP/CTS-BP adecuadas se pueden seleccionar de la protelna Ltra del intron II LtrB del grupo II, protelnas de cubierta que se unen a los virus de ARN tales como la protelna de la cubierta del virus X de papa (PVX), la protelna de la cubierta de TMV, polimerasas de ARN dependientes de ARN (RdRPs) de los virus de ARN tales como las replicasas de PVX o TMV, protelnas de plantas nativas que son responsables de la translocacion del ARN viroide (tal como tiroides PLMVd y ASBV) en los cloroplastos, protelna de transcriptasa inversa de retrotransposones , tal como tabaco TnT1, levadura Tyl- 1 que reconocen estructuras en el ARN de molecula de retrotransposon, y protelnas que se unen a los ARN celulares. Preferiblemente, la protelna PTS-BP/protelna CTS-BP es la protelna de la LtrA desde el intron LtrB del grupo II.
Un “peptido de transito de cloroplasto de planta” (TP) es uno que se puede derivar u obtener de una protelna dirigida a plastidio, por ejemplo peptido de transito de una subunidad pequena de Rubisco (rbcS) o protelnas HSP70 (Marshall & Keegstra (1992) Plant Physiology, 100, 1048-1054), y aquellos que se pueden predecir por los programas de secuencias de localization de cloroplasto (
http://www.psort.org).
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La protelna de “transcriptasa inversa”, si se emplea, se puede seleccionar de una fuente de retrovirus, tal como de retrovirus de plantas tales como SIRE-1 de soja, o de una fuente retrotransposon tal como el retrotransposon de levadura TYl1, por ejemplo el dominio de transcriptasa-RNasa H inversa (Goffeau et al., Science 274 (5287), 546-547 (1996)) o el retrotransposon Tnt1 de tabaco (dominio RTRH) (Vernhettes et., al.; Mol. Biol. Evol. 15 (7), 827-836 (1998)).
Un promotor nuclear de planta (por ejemplo, un promotor especlfico de nucleo exogeno) es una que es capaz de accionar la expresion de una secuencia de acidos nucleicos tal como una secuencia de cADN o una secuencia de genes de longitud completa en el nucleo de una celulas vegetales, que forma una secuencia de ARN transcrita. El promotor nuclear de planta es uno que se introduce en la parte delantera de una secuencia de acidos nucleicos de interes y se asocia de forma operable con esta. De esta manera un promotor nuclear de planta es uno que se ha colocado en la parte delantera de un componente de polinucleotido seleccionado. Normalmente, un promotor nuclear de planta, tal como un promotor especlfico de nucleo exogeno, es uno que se transfiere a una celula anfitriona o planta anfitriona a partir de una fuente diferente de la celula anfitriona o planta anfitriona.
Los cADN que codifican un polinucleotido de la invencion contienen por lo menos un tipo de promotor especlfico de nucleo que es operable en una celulas vegetales, por ejemplo, un promotor inducible o constitutivo ligado operativamente a una primera y/o segunda secuencia de acidos nucleicos o componente de secuencia de acidos nucleicos como se define aqul y segun se proporciona por la presente invencion. Como se ha discutido, esto permite el control de la expresion de polinucleotidos de la invencion. La invencion tambien proporciona plantas transformadas con secuencias de polinucleotidos o construcciones y metodos que incluyen la introduccion de dichas secuencias de acidos nucleicos o polinucleotidos o construcciones en una celulas vegetales y/o induction de la expresion de dicha primera o segunda secuencia de acidos nucleicos o construction dentro de una celulas vegetales, por ejemplo, mediante aplicacion de un estlmulo adecuado, tal como un inductor de exogeno efectivo.
El termino “inducible” como se aplica a un promotor es bien conocido por aquellos expertos en la tecnica. En esencia, la expresion bajo el control de un promotor inducible se “activa” o aumenta en respuesta a un estlmulo aplicado (que se puede generar dentro de una celula o proporcionar exogenamente). La naturaleza del estlmulo varla entre promotores. Algunos promotores inducibles provocan pocos o indetectables niveles de expresion (o ninguna expresion) en ausencia del estlmulo apropiado. Otros promotores inducibles provocan expresion constitutiva detectable en ausencia del estlmulo. Cualquiera que sea el nivel de expresion es en ausencia de estlmulo, la expresion de cualquier promotor inducible se incrementa en presencia del estlmulo correcto. La situation preferible es cuando el nivel de expresion aumenta despues de la aplicacion del estlmulo pertinente mediante una cantidad efectiva para alterar una caracterlstica fenotlpica. De esta manera, un promotor inducible (o “activable”), se puede utilizar lo que provoca un nivel basico de expresion en ausencia del estlmulo cuyo nivel es demasiado bajo para provocar un fenotipo deseado (y de hecho puede ser cero). Luego de aplicacion del estlmulo, se incrementa la expresion (o se activa) a un nivel, que lleva al fenotipo deseado. Un ejemplo de un promotor inducible es el interruptor de gen inducible etanol descrito en Caddick et al (1998) Nature Biotechnology 16: 177-180. Se conoce una cantidad de promotores inducibles en la tecnica.
Se pueden utilizar promotores qulmicamente regulados para modular la expresion de un gen o una secuencia de polinucleotidos de la invencion en una planta a traves de la aplicacion de un regulador qulmico exogeno. Dependiendo del objetivo, el promotor puede ser un promotor qulmicamente inducible, donde la aplicacion de los productos qulmicos induce la expresion del gen, o un promotor qulmico-reprimible, donde la aplicacion del producto qulmico reprime la expresion genica. Se conocen los promotores qulmicamente inducibles en la tecnica e incluyen, pero no se limitan a, el promotor In2-2 de malz, que se activa mediante los protectores herbicidas de bencenosulfonamida, el promotor GST del malz, que se activa por compuestos electrofllicos hidrofobos que se utilizan como preherbicidas emergentes, y el promotor PR-1a del tabaco, que se activa por el acido salicllico. Otros promotores qulmicamente regulados de interes incluyen promotores sensibles a esteroides (vease, por ejemplo, el promotor inducible por glucocorticoides en (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421-10425 y McNellis et al. (1998) Plant J. 14(2):247-257) promotores inducibles por tetraciclina y sensibles a tetraciclina (vease, por ejemplo, Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237, y Patentes Estadounidenses Nos. 5,814,618 y 5,789,156).
Cuando se desea una expresion mejorada en tejidos particulares, se pueden utilizar promotores especlficos de tejido. Los promotores especlficos a tejido incluyen aquellos descritos por Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2)255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol. 23(6):1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; and Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505.
Los llamados promotores constitutivos tambien se pueden utilizar en los metodos de la presente invencion. Los promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, promotor 35S de CaMV (Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812); actina de arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163-171); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 619-632 y Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol 18: 675-689); pEmu (Last et al (1991) Theor. Appl. Genet. 81: 581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3: 2723-2730); Promotor ALS (Solicitud Estadounidense No. de Serie 08/409,297), y
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similares. Otros promotores constitutivos incluyen aquellos en las patentes Estadounidenses Nos 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; y 5,608,142. En una preferencia, el promotor nuclear de planta utilizado en el metodo de la invencion es un promotor constitutivo.
La expresion en el plastidio, tal como en el cloroplasto, se efectua al emplear un promotor de plastidios vegetales tales como promotores especlficos de plastidios y/o elementos de regulacion de la transcripcion. Ejemplos incluyen el promotor de ARN de polimerasa (WO 97/06250) y otros promotores descritos en la tecnica, por ejemplo, en el documento WO 00/07431, Patente Estadounidense No. 5,877,402, WO 97/06250, WO 98/55595, WO 99/46394, WO 01/42441 y WO 01/07590; el elemento de promotor rpo B, el elemento de promotor atpB, el elemento de promotor clpP (vease tambien el documento WO 99/46394) y el elemento de promotor 16S rADN. El promotor especlfico de plastidio tambien puede tener un “operon” policistronico asignado a este (documento EP-A 1 076 095; Wo 00/20611). Los promotores que se pueden utilizar en el metodo de la invencion tambien incluyen el promotor PrbcL, el promotor Prps16, y el promotor Prrn-62, Pycf2-1577, PatpB-289, Prps2-152, Prps16-107, Pycf1-41, PatpI-207, PclpP-511, PclpP-173 y PaccD-129 (WO 97/06250; Hajdukiewicz P T J et al. (1997) EMBO J 16:4041-4048), el promotor PaccD-129 del gen accD de tabaco (WO 97/06250), el promotor PclpP- 53 del gen clpP como promotor NEP altamente activo en cloroplastos (WO 97/06250), el promotor Prrn-62 del gen rrn, el promotor Prps16-107 del gen rps16, el promotor PatpB/e-290 del gen atpB/e de tabaco (Kapoor S et al. (1997) Plant J. 11: 327-337), y el promotor PrpoB-345 del gen rpoB (Liere K & Maliga P (1999) EMBO J. 18: 249-257). Adicionalmente, todos aquellos promotores que pertenecen a la clase III (Hajdukiewicz P T J et al. (1997) EMBO J 16:4041-4048) y todos los fragmentos de los promotores de clase II que controlan la inicio de la transcripcion por NEP se pueden utilizar en el metodo de la invencion. Dichos promotores o unidades estructurales de promotor en general no se conocen por ser muy conservados. La ATAGAATAAA se da como consenso cerca del sitio de inicio de la transcripcion de los promotores NEP (Hajdukiewicz PTJ et al (1997) EMBO J 16: 4041-4048).
Naturalmente, el experto en la tecnica apreciara que otras secuencias de ADN terminadoras pueden estar presentes en las construcciones utilizadas en la invencion. Un terminador se contempla como una secuencia de ADN en el extremo de una unidad transcripcional que senala la terminacion de la transcripcion. Estos elementos son secuencias no traducidas 3' que contienen senales de poliadenilacion, que actuan para provocar la adicion de secuencias de poliadenilato en el extremo 3' de los transcritos primarios. Para expresion en celulas vegetales, la secuencia terminadora de transcripcion de nopalina sintasa (A. Depicker et al., 1982, J. of Mol. & Applied Gen. 1:561-573) sirve como una senal de terminacion de la transcripcion.
El casete de transgen de plastidio comprende una secuencia de flanqueo izquierda (LFS) y una secuencia de flanqueo derecha (RFS) como se describe aqul, y puede incluir una region promotora y/o una region terminadora procedente de un plastidio de planta superior o inferior, tal como un cloroplasto, por ejemplo, de tabaco, Arabidopsis, Brassica sp., papa, malz (malz), canola, arroz, trigo, cebada, Brassica sp., algodon, algas (por ejemplo, especies azul verde), lemnospora (“la lenteja de agua”), o musgo (por ejemplo, Physcomitrella patens). Preferiblemente, las regiones de promotor y terminador se obtienen de especies de plantas superiores. Cuando la LFS y RFS no incluyen un promotor y/o una region terminadora, estos componentes se pueden colocar adyacentes a la LFS y/o RFS, segun sea apropiado, o puede haber una region espaciadora entre ellas. Se incluye dentro del casete de plastidio por lo menos un transgen o una secuencia de nucleotidos de eleccion que esta destinada a ser transcrita y/o traducida en el cloroplasto de acuerdo con el diseno del metodo de la presente invencion, por ejemplo, para la produccion de protelna(s) deseada, ARN de interes, o inactivos de genes endogenos de plastidios y secuencias reguladoras. Los transgenes adecuados de interes que se contemplan para la produccion de protelna o peptido en un metodo de la presente invencion incluyen protelnas de planta y protelnas farmaceuticas para uso en mamlferos, que incluyen el hombre, tal como insulina, preproinsulina, proinsulina, glucagon, interferones tales como a-interferon, p- interferon, Y-interferon, factores de coagulacion de sangre seleccionados de Factor VII, VIII, IX, X, XI, y XII, hormonas de fertilidad, que incluyen la hormona luteinizante, factores de crecimiento de hormona de estimulacion de follculo que incluyen factor de crecimiento epidermico, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor estimulante de colonias de granulocitos y similares, prolactina, oxitocina, hormona estimulante de tiroides, hormona adrenocorticotropica, calcitonina, hormona paratiroidea, somatostatina, eritropoyetina (EPO), enzimas tales como la p-glucocerebrosidasa, hemoglobina, albumina de suero, colageno, protelna toxica de insectos de Bacillus thuringiensis; protelna resistente herbicidas (glifosato); protelnas tolerante a sal; protelnas implicadas en conferir esterilidad masculina citoplasmatica a las estirpes de fitomejoramiento; protelnas de mejora nutricionales implicadas en la bioslntesis de compuestos fenolicos, almidones, azucares, alcaloides, vitaminas y vacunas comestibles, y similares. Adicionalmente, el metodo de la invencion se puede utilizar para la produccion de anticuerpos monoclonales especlficos o fragmentos activos de los mismos y de enzimas industriales.
Todas las protelnas mencionadas anteriormente aqul son del tipo de planta y humano. Otras protelnas que se contemplan para la produccion en la presente invencion incluyen protelnas para uso en el cuidado veterinario, y pueden corresponder a homologos animales de protelnas humanas, tales como las protelnas humanas mencionadas anteriormente.
Naturalmente, el experto en la tecnica apreciara que cuando secuencias de ADN terminadoras nucleares esten presentes en las construcciones utilizadas en los metodos de la invencion secuencias, estas se contemplan como que comprenden una secuencia de ADN en el extremo de una unidad transcripcional que senala la terminacion de la
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transcripcion. Estos elementos son secuencias no traducidas 3' que contienen senales de poliadenilacion, que actuan para provocar la adicion de secuencias de poliadenilato al extremo 3' de los transcritos primarios. Para la expresion en celulas vegetales la secuencia terminadora de transcripcion de nopalina sintasa (A. Depicker et al., 1982, J. of Mol. & Applied Gen. 1:561-573) sirve como una senal de terminacion de transcripcion.
Aquellos expertos en la tecnica seran capaces de construir vectores y disenar protocolos para secuencias de acidos nucleicos recombinantes o expresion de genes. Los vectores adecuados se pueden elegir o construir, conteniendo secuencias reguladoras apropiadas, que incluyen secuencias promotoras, fragmentos de terminacion, secuencias de poliadenilacion, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias segun sea apropiado. Para detalles adicionales vease, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2a edicion, Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas tecnicas y protocolos conocidos para la manipulacion de acido nucleico, por ejemplo en la preparacion de construcciones de acido nucleico, mutagenesis, secuenciacion, introduccion de ADN en celulas y expresion de genes, y analisis de protelnas, se describen en detalle en Current Protocols in Molecular Biology, Segunda Edicion, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992. Los procedimientos y vectores especlficos utilizados previamente con gran exito en plantas son descritos por Bevan (Nucl. Acids Res. 12, 8711-8721 (1984)) y Guerineau y Mullineaux (1993) (Plant transformation and expression vectors. In: Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD ed.) Oxford, BIOS Scientific Publishers, pp 121-148).
Naturalmente, el experto apreciara que cada transgen introducido en un casete de transgen estara bajo el control regulador de su propio promotor de plastidio exogeno, por ejemplo un promotor y terminador de cloroplasto. Cuando dos o mas protelnas objetivo estan destinadas a ser producidas a partir de un unico ARN portador, es preferible si son capaces de ser separadas facilmente, por ejemplo al unirse a diferentes anticuerpos especlficos de protelnas (monoclonales o policlonales) en la fase de recoleccion del sistema de cultivo de celulas vegetales.
Los marcadores geneticos seleccionables pueden facilitar la seleccion de plantas transgenicas y estos pueden consistir de genes quimericos que confieren fenotipos seleccionables tales como resistencia a antibioticos tales como la espectinomicina, estreptomicina, kanamicina, neomicina, higromicina, puramicina, fosfinotricina, clorsulfuron, metotrexato, gentamicina, espectinomicina, imidazolinonas y glifosato.
Al introducir secuencias de acidos nucleicos seleccionadas de acuerdo con la presente invencion en una celula, se deben tener en cuenta ciertas consideraciones, bien conocidas por aquellos expertos en la tecnica. El acido nucleico que se va a insertar debe ser ensamblado dentro de una construccion, que contiene elementos reguladores eficaces, que accionaran la transcripcion. Debe estar disponible un metodo para transportar la construccion en la celula. Una vez que la construccion esta dentro de la celula, ocurrira o no ocurrira la integracion en el material cromosomico endogeno. Finalmente, en lo que se refiere a plantas del tipo de celula objetivo debe ser tal que las celulas se pueden regenerar en plantas completas.
Las plantas transformadas con los segmentos de ADN que contienen secuencias de interes que se proporcionan aqul se pueden producir mediante tecnicas estandar, que ya son conocidas para la manipulacion genetica de las plantas. El ADN se puede transformar en celulas vegetales utilizando cualquier tecnologla adecuada, tal como un vector de plasmido Ti desarmado llevado por Agrobacterium aprovechando su capacidad de transferencia de genes natural (EP- A-270355, EP-A-0116718, NaR 12(22) 8711-87215 1984), bombardeo de partlculas o con microproyectiles (US 5100792, EP-A-444882, EP-A-434616) microinyeccion (WO 92/09696, WO 94/00583, EP 331083, EP 175966, Green et al. (1987) Plant Tissue and Cell Cultivo, Academic Press), electroporacion (EP 290395, WO 8706614) otras formas de absorcion directa de ADN (DE 4005152, WO 9012096, Us 4684611),, absorcion de ADN mediada por liposoma (por ejemplo, Freeman et al. Plant Cell Physiol. 29: 1353 (1984)), o el metodo de agitacion en vortex <por ejemplo, Kindle, PNAS U.S.A. 87: 1228 (1990d). Los metodos flsicos para la transformacion de celulas vegetales se revisan en Oard, 1991, Biotech. Adv. 9: 1-11.
De esta manera, una vez se ha identificado una secuencia de acidos nucleicos o gen, se puede volver a introducir en celulas vegetales utilizando tecnicas bien conocidas por aquellos expertos en la tecnica para producir plantas transgenicas del fenotipo correspondiente.
La transformacion de Agrobacterium es ampliamente utilizada por aquellos expertos en la tecnica para transformar especies dicotiledoneas. La produccion de plantas transgenicas fertiles estables en casi todas las plantas monocotiledoneas economicamente relevantes tambien es ahora rutina: (Toriyama, et al (1988) Bio/Technology 6, 1072 a 1074; Zhang, et al (1988) Plant Cell Rep 7, 379-384; Zhang, et al (1988) Theor Appl Genet 76, 835-840; Shimamoto, et al (1989) Nature 338, 274-276; Datta, et al (1990) Bio/Technology 8, 736-740; Christou, y otros (1991) Bio/Technology 9, 957-962; Peng, et al (1991) International Rice Research Institute, Manila, Filipinas 563-574;. Cao, et al (1992. ) Plant Cell Rep 11, 585-591; Li, et al (1993) Plant Cell Rep 12, 250-255; Rathore, et al (1993) Plant Molecular Biology 21, 871884; Fromm, et al. (1990) Bio/Technology 8, 833-839; Gordon-Kamm, et al (1990) Plant Cell 2, 603-618;. D'Halluin, et al (1992) Plant Cell 4, 1495-1505;. Walters, et al (1992) Plant Molecular Biology 18, 189-200; Koziel, et al (1993) Biotechnology 11, 194-200; Vasil, IK Biologla (1994) Plant Molecular 25, 925-937; Semanas, et al. (1993) Fisiologla Vegetal 102, 1077-1084; Somers, et al. (1992) Bio/Technology 10, 1589-1594; WO92/14828). En particular, la transformacion mediada por Agrobacterium es ahora un metodo de transformacion altamente eficiente alternativo en
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monocotiledoneas (Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6, 271-282).
Se ha logrado la generacion de plantas transgenicas fertiles en los cereales arroz, malz, trigo, avena, y cebada (revisado en Shimamoto, K. (1994) Current Opinion in Biotechnology 5, 158-162.; Vasil, et al. (1992) Bio/Technology 10, 667-674; Vain et al., 1995, Biotechnology Advances 13 (4): 653-671; Vasil, 1996, Nature Biotechnology 14 pagina 702). Wan y Lemaux (1994) Plant Physiol. 104: 37-48 describen tecnicas para la generacion de grandes cantidades de plantas de cebada fertiles transformadas independientemente.
Se prefieren bombardeo de microproyectiles, electroporacion y absorcion directa de ADN cuando Agrobacterium es ineficiente o inefectivo. Alternativamente, se puede emplear una combinacion de diferentes tecnicas para mejorar la eficiencia del proceso de transformacion, por ejemplo bombardeo con micropartlculas recubiertas de Agrobacterium (EP-A-486234) o bombardeo de microproyectil para inducir lesiones seguido por cocultivo con Agrobacterium (EP-A- 486233).
Despues de la transformacion, una planta se puede regenerar, por ejemplo a partir de celulas individuales, tejido de callo o discos de hojas, como es convencional en la tecnica. Casi cualquier planta se puede regenerar totalmente a partir de celulas, tejidos y organos de la planta. Las tecnicas disponibles son revisadas en Vasil et al., Cell Cultivo and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. I, II y III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984, y Weiss Bach and Weiss Bach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989.
La eleccion particular de una tecnologla de transformacion estara determinada por su eficiencia para transformar ciertas especies de plantas, as! como la experiencia y preferencia de la persona que practica la invencion con una metodologla particular de eleccion. Sera evidente para el experto que la eleccion particular de un sistema de transformacion para introducir acido nucleico en celulas vegetales no es esencial para o una limitacion de la invencion, ni es la eleccion de la tecnica para la regeneracion de planta.
El termino “heterologo” se puede utilizar para indicar que el gen/secuencia de nucleotidos en cuestion se ha introducido en dichas celulas de la planta o un antecesor de la misma, utilizando ingenierla genetica, es decir, mediante intervencion humana. Se puede proporcionar una celulas vegetales transgenica, es decir, transgenica para la secuencia de nucleotidos en cuestion. El transgen puede estar en un vector extra-genomico o incorporar, preferiblemente de forma estable, en el genoma. Un gen heterologo puede reemplazar un gen equivalente endogeno, es decir, uno que normalmente realiza la misma o una funcion similar, o la secuencia insertada puede ser adicional al gen endogeno u otra secuencia. Una ventaja de la introduccion de un gen heterologo es la capacidad de colocar la expresion de una secuencia bajo el control de un promotor de eleccion, con el fin de ser capaz de influir en la expresion de acuerdo con la preferencia. Adicionalmente, se pueden utilizar mutantes, variantes y derivados del gen de tipo silvestre, por ejemplo con actividad superior a aquella del tipo silvestre, en lugar del gen endogeno. Las secuencias de nucleotidos heterologos o exogenos o extranos, a una celulas vegetales pueden no ser de origen natural en celulas de ese tipo, variedad o especie. Por lo tanto, una secuencia de nucleotidos puede incluir una secuencia de codificacion de o derivada de un tipo particular de celulas vegetales o especie o variedad de planta, situada en el contexto de una celulas vegetales de un tipo o especie o variedad de planta diferente. Una posibilidad adicional es una secuencia de nucleotidos que se coloca dentro de una celula en la que esta o se encuentra un homologo de forma natural, pero en la que la secuencia de nucleotidos esta ligada y/o adyacente al acido nucleico que no se produce naturalmente dentro de la celula, o celulas de ese tipo o especie o variedad de planta, tal como ligada operablemente a una o mas secuencias reguladoras, tales como una secuencia promotora, para el control de expresion. Una secuencia dentro de una planta u otra celula anfitriona puede ser de forma identificable heterologa, exogena o extrana.
Tambien se proporcionan plantas que incluyen una celulas vegetales transformada mediante un metodo de acuerdo con la invencion, junto con cualquier parte o propagulo de la misma, semilla, progenie autofecundada o hlbrida y descendientes. Particularmente se proporcionan plantas de cultivo transgenicas, las cuales se han disenado para llevar los genes identificados como se ha indicado anteriormente. Ejemplos de plantas adecuadas incluyen tabaco (Nicotiana tabacum) y otras especies de Nicotiana, zanahoria, verduras y Brassica de semillas oleaginosas, melones, Pimientos, vides de uva, lechuga, fresa, la remolacha azucarera, trigo, cebada, malz (malz), arroz, soja, guisantes, sorgo, girasol, tomate, algodon, y papa. Las plantas transgenicas especialmente preferidas de la invencion incluyen algodon, arroz, especies de Brassica de semillas oleaginosas tales como canola, malz (malz) y soja.
Ademas de una planta, la presente invencion proporciona cualquier clon de dicha planta, semilla, progenie y descendientes autofecundados o hlbridos, y cualquier parte de cualquiera de estos, tales como esquejes, semillas. La invencion proporciona cualquier propagulo de planta que es cualquier parte que se puede utilizar en la reproduccion o propagation, sexual o asexual, que incluye esquejes, semillas, etcetera. Tambien se abarca por la invencion una planta que tiene una descendencia propagada sexual o asexualmente, clon o descendiente de dicha planta, o cualquier parte o propagulo de dicha planta, descendencia, clon o descendiente.
La presente invencion tambien abarca el producto de expresion del polipeptido de una molecula de acido nucleico de acuerdo con la invencion como se describe aqul u obtenible de acuerdo con la information y sugerencias aqul. Tambien se proporcionan metodos de fabrication de dicho producto de expresion mediante la expresion de una secuencia de
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nucleotidos que por lo tanto se codifica bajo condiciones adecuadas en celulas anfitrionas adecuadas, por ejemplo E. coli. Aquellos expertos en la tecnica seran capaces de construir vectores y disenar protocolos y sistemas para la expresion y recuperacion de productos de expresion de genes recombinantes.
La protelna objetivo heterologa o exogena se contempla por ser cualquier protelna de interes que se puede producir por el metodo de la invencion.
Un polipeptido de acuerdo con la presente invencion puede ser un alelo, variante, fragmento, derivado, mutante u homologo de los polipeptidos como se menciona aqul. El alelo, variante, fragmento, homologo derivado, mutante o sustancialmente puede tener la misma funcion de los polipeptidos aludida anteriormente y como se muestra aqul o puede ser un mutante funcional del mismo.
“Homologla”, en relacion a una secuencia de secuencia de aminoacidos o polipeptidos producida por el metodo de la invencion se puede utilizar para referirse a identidad o similitud, preferiblemente identidad. Como se observo ya anteriormente, se puede limitar el alto nivel de identidad de aminoacidos a dominios o regiones funcionalmente significativas.
En ciertas realizaciones, un alelo, variante, derivado, derivado mutante, mutante u homologo de la secuencia especlfica puede mostrar poca homologla general, digamos aproximadamente 20%, o aproximadamente 25%, o aproximadamente 30%, o aproximadamente 35%, o aproximadamente 40% o aproximadamente 45%, con la secuencia especlfica. Sin embargo, en dominios o regiones funcionalmente significativos, la homologla de aminoacidos puede ser mucho mayor. Se pueden identificar dominios o regiones significativos funcionalmente putativos mediante procesos de bioinformatica, que incluyen la comparacion de las secuencias de homologos.
Los dominios o regiones de diferentes polipeptidos funcionalmente importantes se pueden combinar para expresion del acido nucleico de codificacion como una protelna de fusion. Por ejemplo, las propiedades particularmente ventajosas o deseables de diferentes homologos se pueden combinar en una protelna hlbrida, de tal manera que el producto de expresion resultante, puede incluir fragmentos de diversas protelnas progenitoras, si es apropiado.
La similitud de las secuencias de aminoacidos puede ser como se define y determina por el programa TBLASTN, de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10, que es de uso estandar en la tecnica. En particular, se puede utilizar TBLASTN 2.0 con Matrix BLOSUM62 y penalizaciones por hueco: existencia: 11, extension: 1. Otro programa estandar que se puede usar es BestFit, que es parte del Paquete de Wisconsin, Version 8, septiembre de 1994, (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA, Wisconsin 53711). BestFit hace un alineamiento optimo del mejor segmento de similitud entre dos secuencias. Los alineamientos optimos se encuentran al insertar huecos para maximizar el numero de coincidencias utilizando el algoritmo de homologla local de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. (1981) 2: 482-489). Otros algoritmos incluyen GAP, que utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch para alinear dos secuencias completas que maximizan el numero de coincidencias y minimiza el numero de huecos. Como con cualquier algoritmo, generalmente se utilizan parametros predeterminados, para los cuales el GAP es una penalizacion por creacion de hueco = 12 y penalizacion de extension de hueco = 4. Alternativamente, se puede utilizar una penalizacion por creacion de hueco de 3 y la penalizacion por extension de hueco de 0.1. El algoritmo FASTA (que utiliza el metodo de Pearson y Lipman (1988) PnAs EE.UU. 85: 2444-2448) es una alternativa adicional.
El uso de cualquiera de los terminos “homologla” y “homologo” aqul no implica ninguna relacion evolutiva necesaria entre secuencias comparadas, en mantenimiento, por ejemplo con el uso estandar de terminos tales como “recombination homologa”, que requiere simplemente que dos secuencias de nucleotidos sean suficientemente similares para recombinarse en las condiciones apropiadas. Se encuentra a continuation la discusion adicional de polipeptidos de acuerdo con la presente invencion, que se puede codificar por el acido nucleico de acuerdo con la presente invencion.
Ahora se siguen los ejemplos no limitantes y las figuras que ilustran la invencion.
Figuras
Figura 1: los principales componentes del sistema de transformation de cloroplasto.
(1) El vector de transformacion contiene (i) la secuencia de translocation de cloroplasto (CTS); (ii) casete de transgen de cloroplasto que comprende la secuencia de flanqueo izquierda (LFS) y secuencia de flanqueo derecha (RFS) para facilitar la insercion del casete en el genoma del cloroplasto utilizando recombinacion homologa, region promotora del gen rrn 16 de cloroplasto de tabaco (Prrn), el gen aadA como marcador seleccionable (aadA), terminador de transcription del genoma de cloroplasto (term); y (iii) dominio de union de cebador (PBD). (2) el gen de la transcriptasa RNasa H inversa translacionalmente fusionada al peptido de transito de cloroplasto de la subunidad pequena de gen Rubisco de tabaco (GR-CTP). (3) Peptido de union a CTS traslacionalmente fusionado al peptido de transito del cloroplasto del gen Hsp60 de Arabidopsis (Hsp60-CTP).
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Figura 2: grupo de construcciones utilizadas para la transformation de cloroplasto en tabaco (ALG298, ALG327 y ALG 344) y en Arabidopsis (ALG347 y ALG327)
El casete de transformacion de cloroplasto contiene secuencias de flanqueo izquierda y derecha (LFS y RFS), promotor Prrn (Prrn), gen aadA para la selection de espectinomicina (aadA), y terminador de transcription rrnB (rrnB ter). El dominio de union del cebador (PBD) del retrotransposon de levadura Ty1 disenado para capturar tRNA-Met de los cloroplastos se fusiono al casete de transgen de cloroplasto. El casete resultante se inserto dentro del dominio IV del intron LtrB (LtrB5' y LtrB3') de Lactococcus lactis (ALG298 y ALG347) o se fusiono a la secuencia de translocation de cloroplasto del viroide de mancha solar del aguacate (ASB-CTS en ALG344). El casete del transgen de cloroplasto se expreso a partir del casete insertado nuclear y el ARN resultante se transloco en el cloroplasto utilizando la protelna LtrASi para los vectores (ALG298 y ALG347), o utilizando las protelnas de plantas nativas para el vector ALG344. La transcripcion inversa del ARN se realizo mediante transcriptasa-RNasaH inversa fusionada a peptido de transito de cloroplasto (cTP-RTRH) del gen Hsp60 (ALG327). El promotor Ubiq3 Pro-Arabidopsis del gen de ubiquitina 3; Promotor 35S Pro del gen del virus mosaico de coliflor 35S, promotor TAF2 Pro-Arabidopsis del gen TAF 2; terminador de transcripcion del gen nos de Agrobacterium.
Figura 3: se realizaron modificaciones del casete de transformacion del cloroplasto al disenar el dominio de union a cebador y posicionar los elementos fundamentales del casete del transgen.
CTU- unidad de transformacion de cloroplasto; CTS-5' Secuencia de translocacion de cloroplasto localizada en el extremo 5' del casete de transformacion; CTS-3' secuencia de translocacion de cloroplasto localizada en el extremo 3' del casete de transformacion; PDB-CHL- Dominio de union a cebador disenado para la transcripcion inversa en los cloroplastos utilizando tRNA-Met de cloroplastos; PBD-CYT- Dominio de union de cebador disenado para la transcripcion inversa en el citoplasma utilizando tRNA-Met citoplasmatico.
Las modificaciones detalladas en la section 1B de Ejemplos en adelante y que corresponde a las figuras incluyen una primera modification del uso de PBD para la union de tRNA-Met citoplasmico como cebador [Figura 3 (C)]. Como segunda modificacion la CTS se puede situar en los extremos 5' y 3' del casete de transformacion tal como en el caso con el intron LtrB. El casete de transgen se inserta en el interior del intron LtrB (dominio IV). El PDB-CHL se ubica en direction 3' del extremo 3' LtrB del casete (CTS-3'), de tal manera que la protelna LtrA es capaz de funcionar como una protelna de translocacion y transcriptasa inversa. La protelna LtrA tiene tres funciones principales: (1) como una maturasa (se une a ARN LtrB y estabiliza la estructura secundaria del ARN, y ayuda a corte y empalme); (2) como una endonucleasa (induce rupturas de ADN de cadena sencilla en el sitio objetivo); y (3) como una transcriptasa inversa (que realiza transcripcion inversa del ARN del intron despues de la insertion del aRn de intron LtrB en el sitio donante).
La protelna LtrA es incapaz de realizar la reaction de transcripcion inversa de manera eficiente si el PBD-CYT se ubica adyacente a, y en frente de una secuencia de translocacion de cloroplastos en el extremo 3 'de la CTU (CTS-3') como en la figura 3 (B), pero puede transcribir de forma inversa eficientemente el ARN si el PBD se ubica en direccion 3' de una secuencia de translocacion de cloroplastos (CTS- 3') como se muestra en la figura 3A. Dicho posicionamiento o la combination de los componentes del casete de transformacion como se muestra en la figura 3 (A) permite la translocacion de la CTU en el cloroplasto y la transcripcion inversa de la CTU mediante la protelna LtrA. Por lo tanto, al posicionar los componentes de CTS y de PBD-CHL como se muestra en la figura 3 (A) el procedimiento de transformacion se simplifica ya que no hay ningun requisito para cosuministrar otro gen para proporcionar una funcion de transcriptasa inversa.
Se consigue una simplification similar del procedimiento si se utiliza un PBD-CYT, ya que existe una cantidad significativa de transcriptasa inversa endogena nativa en el citoplasma, y la transcripcion se inicia por la transcriptasa inversa endogena utilizando tRNA-Met citoplasmico inverso. Esto tambien elimina la necesidad del cosuministro de otro gen para transcripcion inversa en los cloroplastos.
El caso de la figura 1A y B se atribuye al intron LtrB, el caso en la figura 1C se atribuye a ASB-CTS.
Figura 4: presentation esquematica de las construcciones basadas en el LtrB-CTS para transformacion de cloroplastos en tabaco.
Nos ter terminador de transcripcion nos, LtrB3 extremo cebador 3' del intron LtrB, PBD-CHL- dominio de union de cebador para cloroplasto tRNA-Met, PDB- CYT- dominio de union de cebador para tRNA-Met citoplasmatico, trnA flanco- flanco izquierdo del casete de transgen, psbA ter- terminador de transcripcion del cloroplasto del tabaco, gen mGFP- mGFP4, aadA- gen aadA, Trrn- promotor del cloroplasto rrn16 del tabaco, trnI flanco- flanco derecho del casete del transgen, LtrB5- extremo de cebador 5' del intron LtrB, 35S Pro- promotor 35S del virus del mosaico de coliflor (CaMV), TAF2 Pro-promotor de gen TAF2 de Arabidopsis, CTP- peptido de transito del cloroplasto del gen rbcS de tabaco, LtrA- gen codificado por el marco de lectura abierto del intron LtrB, ags ter- terminador de transcripcion del gen ags.
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Figura 5: Presentacion esquematica de construcciones basadas en LtrB-CTS para transformacion de cloroplastos en el arroz.
Nos ter- terminador de transcripcion nos, LtrB3- extremo de cebador 3' del intron LtrB, PBD-CHL- dominio de union de cebador para cloroplasto tRNA-Met, PDB-CYT- dominio de union de cebador para tRNA-Met citoplasmatico, trnA flanco- flanco izquierdo del casete de transgen, AtpA ter- terminador de transcripcion de cloroplasto del trigo, mGFP- gen mGFP4, aadA- gen aadA, Wrrn- promotor del cloroplasto rrn 16 de trigo, trnI flanco- flanco derecho del casete del transgen, LtrB5- extremo de cebador 5' de intron LtrB, 35S Pro- promotor 35S del virus del mosaico de coliflor (CaMV), Act1 Pro- promotor del gen actina 1 del arroz, cTP- peptido de transito del cloroplasto del gen rbcS de tabaco, LtrA- gen codificado por el marco de lectura abierto del intron LtrB, ags ter- terminador de transcripcion del gen ags.
Figura 6: Presentacion esquematica de las construcciones basadas en ASB-CTS para la transformacion de cloroplastos en el tabaco.
Nos ter- terminador de transcripcion nos, ASB- secuencia de viroide de mancha solar del aguacate (ASBVd) como CTS, PBD-CHL- dominio de union de cebador para cloroplasto tRNA-Met, PDB- CYT- dominio de union de cebador para tRNA-Met citoplasmatico, trnA flanco- flanco izquierdo del casete del transgen, psbA ter- terminador de transcripcion de cloroplasto del tabaco, mGFP- gen mGFP4, aadA- gen aadA, Trrn- promotor de cloroplasto rrn 16 del tabaco, trnI flanco- flanco derecho del casete de transgen, 35S Pro- promotor 35S del virus del mosaico de coliflor (CaMV) , TAF2 Propromotor de gen TAF2 de Arabidopsis, cTP- peptido de transito de cloroplasto del gen rbcS del tabaco, RT-Ty1- gen de transcriptasa inversa del retrotransposon de levadura Ty1, ags ter- terminador de la transcripcion de gen ags.
Figura 7: Amplificacion por PCR de union de flanqueo izquierdo en el tabaco transformado por los vectores basados en LtrB-CTS.
M- ADN marcador, 1-6- estirpes transgenicas independientes, wt- tabaco no transgenico, NC- control negativo sin ADN.
Figura 8: Hibridacion Southern para tabaco transformado con vectores basados en ASB-CTS y CTS-LtrB.
El tamano esperado de la banda de ADN de tipo silvestre es ~1.3 kb, y la banda con la insercion del transgen ~3.6 kb. Se utilizo sonda de cloroplasto en direccion 5' de LFS como una sonda. M- ADN marcador, wt- ADN de la estirpe no transgenica, 1-3- estirpes ASB-CTS, 4-8- estirpes transgenicas LtrB-CTS.
Figura 9: Analisis Northern para plantas de tabaco transformadas con vector basado en LtrB-CTS.
Se utilizo la sonda de ADN aad-GFP para la hibridacion. El tamano esperado de la banda es -1.5 kb. Carril 1- ARN de plantas transformadas con casete35S-aadA-GFP-nos; carril 2- ARN WT; carriles 3-8- estirpes transgenicas independientes.
SECCION EXPERIMENTAL 1A
Un metodo novedoso para transformacion de cloroplastos eficiente
Un nuevo metodo para la transformacion de cloroplastos en plantas comprende (1) un vector de transformacion que consiste en 3 dominios principales: (i) secuencia de translocacion de cloroplastoa (CTS), (ii) casete de transgen de cloroplastos, (iii) dominio de union de cebador (PBD), que utiliza cloroplasto tRNA-fMet o cualquier otro cloroplasto tARNs como un cebador para transcripcion inversa;
(2) Transcriptasa- RNasa H inversa (RT-RH) del retrotransposon o retrovirus fusionados al peptido de transito de cloroplasto para orientacion en los cloroplastos;
(3) protelna de union a RNA que se une a la secuencia de translocacion de cloroplastos (CTS) del vector de transformacion, fusionado al peptido de transito al cloroplasto (Figura 1).
Fundamento de Tecnologla
El proceso de transformacion de cloroplastos comprende dos etapas:
(1) la orientacion del complejo de ARN-protelna a los cloroplastos.
Despues del suministro de la construccion de transformacion de cloroplastos en la celulas vegetales una fuerte expresion del ARN que contiene el casete de transgen de la secuencia de translocacion de cloroplasto (CTS) y el dominio de union de cebador (PBD) se consigue del promotor especlfico nuclear. La protelna de union de CTS (CTS-
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BP) fusionada a un peptido de transito de cloroplasto, tambien sera sobre-expresada en cosuministo de la misma o de un vector diferente y luego se unira al CTS, y facilitara la translocacion del ARN en los cloroplastos.
Una vez que el vector de transformacion del cloroplasto se presenta en la celulas vegetales a traves de transformacion nuclear, el cloroplasto entonces sera bombardeado de forma permanente por el complejo CTS-BP-ARN expresado. Dicho bombeo estable y continuo del complejo en el organulo objetivo es un requisito previo para lograr una alta eficiencia de transformacion de organulo. La tecnologla explota el descubrimiento de que la secuencia de transito de cloroplastos es suficiente para permitir que el complejo CTS-BP-ARN completo luego se tome por el cloroplasto.
La secuencia de translocacion cloroplastos (CTS) se puede seleccionar de una serie de secuencias de ARN tal como el ARN viroide, intron de ARN del grupo I y grupo II, grupo que son reconocidos por las protelnas nativas correspondientes de union de ARN.
(2) Transcripcion inversa del casete del transgen e insertion en el genoma del cloroplasto.
Una vez que el ARN del vector de transformacion esta dentro del organulo, el dominio de union de cebador (PBD) del ARN de vector captura tRNA-fMet como cebador, y la sobreexpresion de la transcriptasa inversa (RT-RH) fusionada al peptido de transito de cloroplasto facilita la transcripcion inversa del ARN en ADN de cadena sencilla. Esto es seguido por la insercion del casete de transcripcion inversa en el genoma de cloroplasto utilizando recombination homologa entre las secuencias de flanqueo del casete de transgen y las regiones homologas en el genoma del cloroplasto.
Se disena el dominio de union a cebador (PBD) para capturar la protelna RT-RH y el cloroplasto tRNA-fMet (u otro cloroplasto tARNs) como cebador, e iniciar la transcripcion inversa del ARN del casete de transgen de cloroplasto en un ADN de cadena sencilla.
Una vez que se ha transformado la poblacion de genomas de organulos en la estirpe de planta inicial, los transgenes codificados nucleares ya no son necesarios y luego se pueden eliminar a traves de la segregation en generaciones subsiguientes de plantas, dejando una estirpe de plantas transformada de organulos limpia.
Materiales y Metodos
Preparation de la secuencia de translocacion de cloroplastos (CTS) con base en intron del Grupo II
Se sintetizo el intron LtrB de Lactococcus lactis por el proveedor de slntesis de ADN comercial. Los sitios potenciales de corte y empalme se eliminaron de esta secuencia como se describe en nuestra patente anterior. El dominio de insercion de casete del transgen (sitios AscI-MluI-NotI) esta subrayado y se muestra en negrita.
Secuencia de intron LtrB
GGATCCCTC GAGGTGCG CCCAGATAGGGT GT T AAGT CAAGTAGTTTAftGGTACTAG TCAGTAAGAT AACACT GAAAACAG CC AACCTAACCGAAAAGCGAAAGCT GATA CGGGAAC AGAGCAC GGTT GGAAA GCGAT GAGTTAGC TAAAG ACAAT CGGCTAC GA C TG AG TCGC AA TGTT AATC AGATATAAGC TAT A A GT T GT G T TTAC TG AACG CAAGTT T CTAAT TTCGGIT ATGTGT CGATAGAGGAAAGTGTCTG AA AC C T CT AGTA CAAAGAAAGC TAAGTTATGGT TGT GGACT T AGCT G T TAT CACCACATTT GTACAATCTG CCGGAGAACCAAT G G GAACGAAACGAAA G CGAT GGCGAGAAT C TGAATTTAC C AAGACTTAACAC T AAC TGGG GAT AGCC TAAACAAGAATGCCT AATAGAAAG GAG GAAAAAGGCT ATAGCACT AGAGCTT GAAAAT C TT GC AAGGCT ACG GAG T A GT C G TAG T AGT C T G AGAA GGC T AACG GC CTT T AC AT GGC A A AGG GCT A C ACT T AT T GT G T A CT A AA AT T A AA AATTG AT T AG GGaGGaaaAC Ct CAaAATGAaACCA ACAATGG CAAT TT TA GAAAGAAT CAGTAAAAATTCAC AAGAAAATATAGAC GAAGTTTTTACAAG A
ctttatcgttatcttttacgtcctgatatttattacgtggc gggcgcgccacgcgtgcggcCgctg
G GAAATG GCAATGATAGC GAAAGAA CCTAAAACTCTGGT TC T A TGCT TTCAT T GTCATCGTCACG T GATTCATAAACAC AAGT GAA T TT T TAC GAACGAACAATAACAGAGCCGTAT AC TCCGAGAGGGGT A CGT ACGG T TCC CGAAGAGGG T GG T GCAAACCAG TCACAGTAATGTGAACAAGG CGGTACCT CCCT A CTTCACCATATCAT T TT TAAT TC T ACG AATCT't TAT AC TGGCAAAC AATTT GACTG
SEQ ID NO.1
La secuencia de translocacion de (CTL) del viroide de mancha solar de aguacate (No. de Acceso Bank J02020) se sintetizo por PCR utilizando el grupo de los siguientes cebadores superpuestos:
5
AS839
AS840
AS841
AS842
AS843
ASS44
G AACTAATTTTTTTAATAAAAGTT CACCACGACTCCTCCTTCTCTCACAA
SEQ ID NO.2
TAAAAAAATTAGTTCACTCGTCTTCAATC TC TTGATCACTTC GTC TC TTC
SEQ ID NO.3
TG C G AG ACTC ATC AGTGTTCTTCC CATCTTTC C CTGAAGAGAC GAAGTGA
SEQ ID NO.4
C TG ATG AGTCTC G C AAG GTTTACTC CTCTATCTTC ATTGTTTTTTTAC AA
SEQ ID NO.5
G G GC GC G CC AAGATTTT GTAAAAAAAC AAT G AAG A SEQ ID NO.6 G CTCG AG ACTTGTGAG AG AAG GAG GAGTC S EQ ID N 0.7
La secuencia CTL de viroide de mancha solar de aguacate
GCTCGAGACTTGTGAGAGAAGGAGGACTCGTGCTGAACTTTTATTAAAAAAATTAGTTCACTCGTC TTC AATCTCTTGATCACTTCGTCTCTTCAGGGAAAGATGGGAAGAACACTGATGAGTCTCGCAAGG TTTACTCCTCTATCTTCA7TGTTTTTTTACAAAATCTTGGGCC-CGCCC SEQ ID NO. 8
La expresion de la secuencia de translocacion de cloroplastos y el casete de cloroplasto fusionado a este que fue accionado por el promotor 35S del virus del mosaico de coliflor obtenido mediante slntesis de ADN
10 Secuencia de promotor 35S
CAAT CCC AC AAAA ATCTGAG CTTAACAG CACAG TTGCTC C TCTCAGAGCAGAATCGGGTATT C AA C ACCCTCATATCAACTACTACGTTGTGTATAACGGTCCACATGCCGGTATATACGATGAC TGGGG TT GT ACAAAGGCGGC AACAAAC G GCGT T C C C GGAGTTGCAC ACAAGAAAIT TG CCAC TAT TACAG AG G CA A G AGC AGCA GCTGACG C GTAC AC AAC A AGTC AGC AAAC AG AC A GGTT GA AC T T CATC CCCAAAG GAG AAGC TCAACTCAAGCCCAAGAG CT T T GCT AAGGCCC TAACAAGC CC AC CAAAGCAAAAAG C CC A CT GG CT CACGCT AGGAAC CAAAAGGC C CAGCAGTGATC CAGCCCCAAAAGAGATCTCC TTTC C C C C GGAGATTACAAT GGACGAT T TCCT CT AT CT TT AC GAT C TAGGAAGGAAGT TC GAAGGT GAAG TA G ACGACAC TATG TT CACCAC T GAT AA TGAGAAGGT TAGC C T C TT CA AT TTCAGAAAGAAT GCTGAC C CAC AGATGG7 TAGAG AGGC C TACGCAGCAGGTCTCAT CAAGACGATC TACCCGAG TAAC AATCTCC A GGAGAT CAAATACC TTCC CAAGAAGGTTAAAGAT GCAG T CAAAAGATT CAGGAC TAAT TGCATCA A GAACACAGAGAAAGACATAT T TCTCAAGATCAGAAGTAC TAT T CCA GT ATGGAC GAT T CAAG GCT T GC TT CATAAACCAAGGCAAG TAATAGAG A TTGGA GT C T C TAAAAAG GT AGTTC C TAC TGAAT C TA AGGCCATGCAT GGAGTCT AAGAT TCAAAT C GAGGA TCIA ACAGAA CT CGCCGTGAAGAC TGGC GAA C AGT TCATACAGAGT CTTTTAG GAC TC AA TGAC AA GAAG AAAAT CTT CGTCAACATGGTGGAG CAC GAC ACTC T G GT C T AC TCC AAA AAT G TC AA A GAT AC AGT C TCAGAA GACCAAAGGG CT AT TGAGAC T T TT CAAC AAAG GAT A AT T T C G GGAAACC TCC TC GGATT C CATTGC CCAGC TATCTGT CACT TCAT C GAAAGGACAGTAGAAAAGG AAGGTG GCT C CTAC AAATGC CATC AT TG CGATAAAGGAAAGGCT AT C ATTCAAGAT CT CT CT GCCG ACAGT GGTCCCAAAGATGGAC CCCCAC C CACGACCAGCAT CGTGGAA. AAAGAAGAC GT T CCAACCAC G TCT T CAAAQCAAGTGGAT T GAT GT GA CAT CTCC A CT GACGTAAG G
GAT GACGCACAAT CCCAC TATCC TTCGCAAGAC CCTT C C TC TATATAAGGAAG T T CAT T TC AT TTG GAG AGG AC ACG S,£Q ID NO, 9
El casete de transgen de cloroplastos contiene secuencias de flanqueo izquierda y derecha (LFS y RFS) para insercion del casete entero en el genoma del cloroplasto utilizando recombinacion homologa, region de promotor Prrn16 de 5 tabaco, el gen aadA como un marcador seleccionable, y la secuencia de 3'UTR del gen psbA como terminador de transcripcion (Figura 1).
Se amplificaron loas secuencias LFS para el tabaco y Arabidopsis utilizando los siguientes cebadores de PCR:
AS699
AS70O
GG CG CG CC GTG GG ATC CG G GC GGTCC G S EQ ID NO. 10 GGCATGCTGGCGCAGCTGGGCCATCC SEQ ID NO. 11
10 Secuencia LFS de Tabaco
GGCGCGCCATGGG AT C C GGGC C GTCCGG GGGGGAC C ACCAC GGCT CCT CT C T TCTC G AGAATCCAT ACATCCC TT AT CAGTGT AT'GGAC AGC TA TCT C T CGAGCACftGGTT TAGCAAT GGGAAAATAAAAT G GAG CACC TAA CAACGCATCTTC ACAGA CCAAGAACTACGAGATCG CCCCTT TCAT TCTGGGGT GAC GGA GGGA.TC GT AC CAT TCG AGCCGT T T T TTT C T TG AC TCGAAAT GGGAGC AGG T T T G AAAAAGGAT C TTAGAGTGT CTAGGGT TGGGC CAGGAGGGT C TC T TAACGCCT T C TT T 7 T T C T TC T CATCG GAGTT AT T TC AC AAAG AC T TGC CAGGC-T AAGG AAG AAGGGGG G A AC AA GC ACACT T GGAG AG CGCAGT AC A AC G GAGAGTT GTAT GC T GCGT T C GGGAAGGAT GAAT C GCT C CC GAAAAGGA AT CT AT TGAT TCT C T C CCAAT TGGT TGGACCGTAGGTGCGAT GA TT TA CTTCACGG GCGAGGTCTC TGGTTCAAGT CC AG G ATGGCCGCATGCC SEQ ID NO.12
Secuencia de LFS Arabidopsis
GGC GCGC CGTG GGAT CGGGGCGGTCCG GA GGGG A CCAC TAT G G CT C CTC TC TT CTCG AGAATC CAT ACAT C CC TTAT CAGTGTATGGAC AGCTAT CTCTC GAGCGCAGGTTTAGGTTCGGCCT CAATGG GAA AAT AAAATGGAGCACCTAACAAC GTAT C T TCACAGAC CAAGAAC T AC GA GAT CACCC C T TT CA TT C TGGGGTGAC GGAGGG AT'CGT ACCGTTC GAGCCT T TTT T T CAT G TTAT CT AT CT C T TGAC TCGAAAT GGGAGCAGGTT TGAA AAAGGATC T TAG AG TGT C TAGG G T TAGGCCACTA GG G T C TCT TAACGC CCT CT T T TTT CT TC TC AT CGAAC-T T AT T TC AC AA AT AC TT C C TAT G GT AA CG A AG AGGGGGG GA AC AAG CAC AC TT GGAG AGC G CAGTACAAC GGAGAGT T GTATGC T GC GTTC GG GAAG GAT GAATCGCTC CCG AAAAGGAATC TATT GATTCTCTC C CAAT TGGT T G GAC CATAGG TGCGATGAT TTACT T CACGG GCG AGGTCTCTGGTTCAAATCCAGGATGGCCCAGCTGCGCCAGCATGC SEQ ID NO. 13
5
Se amplificaron las secuencias RFS utilizando los siguientes cebadores de PCR:
AS764 TG AT ATCG G ATGG CCCTGCTGCGCCAGGGAAAAG AAT SEQIDNO.14 AS845 G CC GC GG ATTG CC CTTCT C CG AC CCT GAC SEQIDNO.15
Secuencia RFS de Tabaco
GATAT CGGA TGGC CCT G CTGC G C CAGG GAAAAGAATAGAAG AAGCATCTGACTACT TCATGCATGC 7 C CAC TTGGC TCGGGGG GATATA GCTCAGTT GGTAGAGCTC CGCTCTTGCAAT TGGGTCGTTGC G A TTACGGGTTGGATG TCT A ATTGTCCA GGCGGT AATGATAGTATC TTGTACCTGAAC CGGTGGCT C A C T T TT T c TA A GTAATGG G GAAGAGGAC CGAAACGT GC CACT GAAAGACTC T ACTGAGAC AAAGAT G GGCTGTC AAGA AC GT AG AGGAG G T AGG ATGG G C AGT T GGTC AG AT C T AGT ATGG AT CGT AC ATC-G A CGGTAGT TGGAGT CGGC GGCTCT C CCAGGGTTCCCT CAT CTGAGATCTCTGGGGAAGAGGATCAAG TTGGCCCTTGCGAA C A GC T TGA TG CAC TAT C T CCC T TCAACCCT7TGAGCGAA ATGCGGCA AAAGA AAAGGAAGGAAAATCCATGGAC C GACC C CAT CAT CTC CACCCCGTAGGAAC TACGAGATCACCC CA AGG ACGC CTTCGGCA TCCAGGGG T CAC G GAC C GACCATA GAAC CCT G TTCAATAAGT GGAACGCAT TAG CTGTCCGC TC TCAGGTTGGGC A GT CA GGGTCGGAGAAGG GCAATCCG C G G
SEQ ID NO.16
Secuencia RFS de Arabidopsis
GAT AT CG G AT GGCC CTGC'T GCGC CAAG GA AAAG AAT ATAAGAAGGAT C TGA C TCCT T CAT G CAT G C TCC ACTTGGC TCGGGGGATATAG CTC AGTTGGTAGAG C T CC GC TC 7T GCAA T T GGGT C GTTGCGAT TAC GGGTTGGGTGTCTAAT TGTC CAGG CGGTAA TGATA GTAT C TT G T A CC TGAACC G GTGGCTCAC
TT T TTCT AAGT AA1GGGGAAA AGGACC GAAACATGCC ACTGAAAGAC T CTAC T GAGAC AAAGATGG
GC T G TCAAGAA CGTA GAGG AGGTAGGATGGTCAGTTG G TCAGATCTAGTAT GGAT CG TACATGGAC GGT AGT TGGAG I'CGGCGGCTCTC C'TAGGG T T C C CTCG TCTGGGAT T G ATCC C T GGGGAAGA G GAT C AAGT TGGCCCTTGCGAACAGCTTGAT GCACT AT CTC CCT TCAACCC T T TGA G C GAAA TGCGGCAAA A GGAAGG AA AATCC A TGGACCG A CCCC ATCGT C TCCACC CCGT AGGAA.CTAOGAGAT C ACCCC AAG GAC GCCTTCGGTATC CAG G GGTC GCGGACCGAC CATAGAACCCTGT TC AATAAGTGGAAT GCATTA GCTGTCCGCTCGCAGGTTGGGCAGTAAGGGTCGGAGAAGGGCAATCCG CGG SEQ ID NO. 17
5 El promotor Prrn se amplified del ADN genomico de tabaco cv. Petite Gerard utilizando los siguientes cebadores de PCR:
AS750 GGCATGCC GC AAT GT GAGTTTTT GTAGTTG SEQ ID NO. 1B Pmi-R ACTTGTATCGATGCGCTTCATATT C GC C CG GA SEQ ID NO. 19
Secuencia promotora Prrn16
G C ATGCC GC AATG7 GAG TT T T TGTA G TTG G A TT T G CT C C C CC G C CGT C GTTC AAT GAGA AT GG AT A A GAG GCT C G TGGGAT TG ACGT GAGG G GGCAG GGAT GGCTATATTTCT GG GAGCG AACTC CGGGCGA ATATGAAGCGCATCGATACAAGT SEQ ID NO.20
el gen aadA se sintetizo por el proveedor de slntesis de ADN comercial. Tres intrones de genes de At2g29890 Arabidopsis se insertaron en la secuencia de codificacion para optimizar la expresion de la aadA en el citoplasma de las celulas vegetales. Los intrones estan subrayados y aparecen en negrita.
Secuencia del gen aadA
ATGGCAGAAGCGGTGATCGCCGAAGTATCGACTCAACTATCAGAGGTAAGTAACTTTTAGCTCTCA
gctgctgtttactaagttcatgccatacattgattctggtttattaagggttatgttcagtattac
TAGTAACAAAATCTATTrCTTCGTTrCCGTCrGCAGGTAGTTGGCGTCATCGAGCGCCATCTCGAA
ccgacgttgctggccgtacatttgtacggctccgcagtggatggcggcctgaagccacacagtgat
ATTGATTTGCTGGTTACGGTGACCGTAAC-GCTTGATGAAACAACGCGGCGAGCTTTGATCAACGAC
CTTTTGGAAACTTCGGCTTCCCCTGGAGAGAGCGAGATTCTCCGCGCTGTAGAGGTAATTTTCATC
TTTGTTTGGCCTTCCAAGTGCTTTTTTTGCTGTTTACGGGTGGAACTTCAGTAAAAATGGGATCAA
AACATCATArGGCATAAATAAATTTTAAGAATGGCGAACTCGGGGTTACCGAATATGGCTTCCTTT
TTCAGTGTTTCTTAGTCCATTGTACTTATGAGATTGCAGGTCACCATTGTTGTGCACGACGACATC
attccgtggcgttatccagctaagcgcgaactgcaatttggagaatggcagcgcaatgacattctt
gcaggtatcttcgagccagccacgatcgacattgatctggctatcttgctgacaaaagcaagagaa
catagcgttgccttggtaggtccagcggcggaggaactctttgatccggttcctgaacaggatcta
tttgaggcgctaaatgaaaccttaacgctatggaactcgccgcccgactgggcaggtaagaaatct
TTrCCCATCTTGAAGTCACCTCAAACCGAACGTTAGGAAATTCCAAAATGTTTTGATAGTAGTCTA
CTTAGTTTCAAGTTTTGGGTTTGTGTATACTTTCACTAATAATATGCGTGGAAACATTGCAGGTGA
tgagcgaaatgtagtgcttacgttgtcccgcatttggtacagcgcagtaaccggcaaaatcgcgcc gaaggatgtcgctgccgactgggcaatggagcgcctgccggcccagtatcagcccgtcatacttga agctagacaggcttatcttggacaagaagaagatcgcttggcctcgcgcgcagatcagttggaaga ATT TGT C C AC T ACGT GA AAG GCG AG ATCAC C AAGG 'I AGTCGG c a aat aa
SEQ 3D HO.21
El terminador psbA 3'UTR se amplified a partir del ADN del tabaco genomico cv Petite Gerard utilizando los siguientes cebadores:
AS749 GGATATCAAACAAATACAAAATCAAAATAGA SEQIDNG.22
AS778 GGAATTCTGAGCGCGCTAGAGCGATCCTG 3EGIDN0.23 5
Secuencia psbA 3'UTR del cebador
GAATTCT GAG C GCGC TAGAGCGATCCTGGCC TAGTCT AT AGGAGGTTTT GAAAAGAAAG GAGCAA T AAT CATTTTCTTGTTCTAT CAAGAG G G TGC TAT T GCT CC TTTCT T TTTT T C T T TT TAT T TATT TAG TAG TATT TT AC TTACATAGACTTTT TTGT T TAC AT TAT AGAAAAA GAAG GAGA GGTTATTT TC T TG CATTTATTCATGATTGAGTATTCTATTTTGATTTTGTATTTGTTTCATAT SEQ ID no. 24
Se diseno el dominio de union de cebador (PBD) como se describe por Friant et al., ((1998) Mol. Cellul. Biology, 18: 10 799-806) y se amplifico mediante PCR utilizando el siguiente grupo de cebadores superpuestos:
AS830 CCGCGGTATCTCACATTCACC CAATTGTCATG GTT AS831 TTAGAAGTATC CTG TG C AC ATC C G C AACC ATG AC AATTGG AS832 ACAGGATACTTCTAAGGAAGTCCACACAAATCAAGAACCCTTAGA AS833 TC AC ATTC TTCTG TTTTG G TAG CTG AAAC GTCT AAG G GTTCTTG A
SEQ ID NO.25 SEQ ID NO.26 SEQ ID NO.27 SEQ ID NO.28
AS834 AC AG AAG AAT GT GAGAAG G CTTC C AC TAAG GCTAACTCTCAACAG 3EQ ID NO.29 AS835 CGCGGCCGCGTTGTCTGTTGAGAGTTAGC SEQ ID NO.30
Secuencia PBD
CCGCGGTATCTCACATTCACCCAA7TGTCATGGTTGCGGATGTGCACAGGATACTTCTAAGGAAGT C CACACAAA TC AAGAAC CCT T AGACGTTTC AGCTACCAAAACAGAAGAAT G T GAGAAGGCTTCCAC TAAGGCTAACTCTCAACAGACAACGCGGCCGC SEQ ID NO,31
5 El gen LtrA de Lactococcus lactis codificado por el intron LtrB se sintetizo por el proveedor de slntesis de ADN comercial. La secuencia de la protelna LtrA primero se optimizo para el uso de codones en las plantas y 5 intrones de plantas se insertaron en la secuencia de codificacion para mejorar la expresion LtrA en las plantas. Los intrones de plantas insertados en la secuencia de codificacion del gen LtrA estan subrayados y se muestran en negrita. Los intrones 1,2 4 son del gen At5g01290 de Arabidopsis, el intron 3 y 5 se seleccionaron de los genes At5g43940de Arabidopsis. El 10 clon fue nombrado como LtrASi.
Secuencia de gen LtrASi:
GCATGCATGAAGCCAACAATGGCAATCCTCGAACGAATCTCTAAGAACTCACAGGAGAACATCGAC G AGGTACAATAACCCATATATATGAATTGATTCATGTGTTACTCGTACTTGTTTGRATATGTrr&G AGCAAGTTTGATACTTTTGGATGATGATArCGCAAATTCGTTATCTTTTTGGCGT TATAGGTC TT C
ACAAGACTTTAC CGT TAC C TTCTCCG TCCTGACATC TACTACG TGGCATATCAGAACCT CTACTC T AACAA GGGA GCT T CTACAAAG G GAAT CCT CGAT GATACAG CTG ATGGATT C T CTG AGGAGAAG AT C AAGAAGATCATCCAATCT XTGAAGGACGGAACT TACTACOCTCAGCC TGT C CGAAGAATGTACAT C GCAAAGAAGAACTCT AAGAAGATGAGACC TCTTGGAATCCCAACTTTCACAGACAAGTTGATCCAG GAG GC TGTG A GAATC ATC C T T GAAT C T AT CT AT GAGCCT C T CT TOGA GGAT C T GT C T CAC GGT TT C CGACCTCAGCGAAGCTGTCACACAGCTTTGAAGACAATCAAGAGAGAGTTCGGAGGTAAATTATAT gctttgccacttcct CAAAAGATCAT T TTAG3T TCAT TGGTAT GTGGTTTT T T TCT r AACAGG TC- c AAGATGGTTCGTGGAGGGAGATATCAAGGGATGCTTCGATAACATCGACCACGTCACACTCATCGG AC T CAT C AAC CT T AAG AT C AAGG AT AT G A AG ATG AGC C AGT TG ATC T AC A AG T TC C T C A AGGC AG G . TTACCTCGAAAACTGGCAGTACCACAAGACTTACAGCGGAACACCTCAGGGCGGAATCCTCTCTCC TCT CCTCGC TAACATC TAT C T T C ATGAATT GGACAAGTTCGTTCTCCAACTCAAGAT GAAGTTCGA CCGAGAGAGT CC AGAGAGAATC ACACC TGAA TACCGG GAGC TTCACAACGAGA TC AA AAG AAT CT C TCAC C GT CT C AAG AAG TT G G AGGGCGAGGAG AAG GCT AAlGG TTCT CT TGG A AT ACCAGG AG AAGA G G AAGAGG TT GCCT AC ACTCOCT TGTAC AT C AC AAAC AAAC AAC-GriCGT TCTC TCCATTTICATT C G TT TGAGTCTGAT TTAGTSTT TTGTGGTTGATCTGAATCGATTTATTGTTGAT TAGTGAATCAATT TGAGGCTGTGTCCTAATGTTTTGACTTTTGATTACAGGTCTTGAAGTACGTCCGATACGCTGACGA CTTCATCATCTCTGTTAAGGGAAGCAAGGAGGACTGTCAATGGATCAAGGAGCAATTGAAGCTCTT CATCCATAACAAGCT CAAGATGGAAT TGAG TGAGGAGAAGACAC TCATCACACATAGCAGTCAGCC TGCTCGTTTCCTC GGATACGACATCCGAGTCAGGAGAAGT GGAAC TAT CAAGC GAT C TGGAAAGG T tcaattctttctttcacatttgtacttgttcactcgttttattaatcctctttagaatggagattc T TACC TCTGTGTGGCCTTTGGCAGGTCAAGAAGAGAAC ACT CAAC GGGAGTGT GGAG CT T CTC AT C
cctctccaagacaagatccgtcaattcatcttcgacaagaagatcgctatccagaagaaggatagc TCATGGT TC CCAGTTCACAGGAAGTACCTTATCC GTTCAACAGACTTGGAGAT CATCACAATCTA C AAC TCTGAATTGAGAGGTAAGC rGCTACCTCAAACTTTCTAGTGCTTQCATATrTCC TT TC T T CT G CAAGGCAGAGAACCATTGTGGTTAAGTGTTTTAAATTGTGAATGTATAGGTATCTGCAACTACTAC
G GT CTC G C AAGTAA CT T CAACCAG CT CAAC TAC T TCGC TTACCT TAT G GAAT ACTCT TGCT TGAA G ACTATCGCATCTAAGCATAAGGGAACACTCTCAAAGAC CATCTCTATGTTCAAGGATGGAAGTGGT TCTTGGGGAATCCCTTACGAGATCAAGCAGGGGAAGCAGAGGAGATACTTCGCCAACTTCAGTGAA TGCAAATCTCCTTACCAATTCACTGATGAGATCAGTCAAGCTCCTGTGCTTTACGGATACGCTCGG AACACTCTTGAGAACAGACTTAAGGCTAAGTGTTGTGAGCTTTGTGGAACATCTGATGAGAACACA T CTTACGAGATCCACCACGT CAACAAG G TCAAGAACCTTAAGGGAAAGGAGAAGTGGGAGATGGC A ATG ATCG CT MGC AGCGG A AG ACT C TT G T T G TT T G CT T CC ATTGT c ATCCTC ACGTGATCC at AA G CACAAGTGAACTAGTAA EEQ ID NO.32
El gen LtrA se fusiono traduccionalmente con el peptido de transito de cloroplasto (GR-CTP) del gen de subunidad
pequena de Rubisco de tabaco (Acceso Bank No. AY220079), que se amplifico utilizando los siguientes cebadores de
PCR:
AS794 G CTC GAG AC AATG G CTTC CTC AGTTCTTTC CTCT SEQ ID NO.33
ASG39 CGCATGCTACCTGCATAC ATT GCACTCTTCCACCAT SEQ ID NO.34
Secuencia rbcS-CTP
CTC GAGACAATGGC T T CCT C AGO TCT T TCCTCT GCAGCAGT T G C CACTCGCACCAATGT TG CTC A A GOTAACATGGTTGCAC CT TTCACTGGTC T TAAG TCAGC T GCCT CAT TCC CT GTTT CAAGGAAGCAA AAC CTTGACAT CACT TCCAT TGCT AGCAATGGTGGAAGAGTGCAATGTAT G CAGGTAGCATGC
SEQ ID NO.34
5 La region promotora 5' del gen 3 ubiquitina de Arabidopsis se amplified con los siguientes cebadores:
AS724 C GGTAC CTACCGG ATTTG GAGC CAAGTC SEQ ID N0.35
AS726 GT GTTT G G TG ACC TG AAATAAAAC AATAG AAC AAGT SEQ ID NO. 36
Secuencia promotora de ubiq3 de Arabidopsis
C AC CG GATT T GGAGCCAAG TC TCAT AAACGCCAT T GTGGAAGAAAGTCTTGAGTTGGTGGT AAT C T AAC AG AGT AGTAAGAACAGAGAAGAGAGAGAGTGT GAGATAGATG AATTG TCC GGCAACAAAAAT C C TG AACATC TTAT TTTAG CAAAGAGAA AGAG TTCC GAGT C T GT AGCAGAAG AG TGAGGAGAAATT T AAG CT CT TGG ACTT GTGAAT TGTTCC G CC TCTTGAATAC TTCTTCAATCCTCATATATTCT TCT T C T AT GT TACC T GAAAA CC GG CATT TAAT CTCGCGGGT TTAT TCCGGT TCAACAT TT T T TTT GTTT T G AGTTATTAT CTGGGCT TAATAACGC AG G C CT GAAATAAA T T CAAGGCCC AACT GT TTTTTTT7TTA AGAAGTTGC T G TT AAAAAAAAAAAAAG G GAAT TAACAACAACAAC AAAAAA AGATAAAGAAAATAA TAACAATT AC T T TAAT T G TAGACTAAAAAAA CATAGATT T T AT CATGAAAAAAAGAG AAAAGAAAT AAAAACTT GGATCAAAAAAAAAACATACAfiATCT T CTAAT TATTAACT T T T C TTAAAAAT TAGGT C CTTTTTCCCAACAATTAGGTTTAGAGTTTTGGAATTAAACCAAAAAGATXGTT CTAAAAAATACT C AAATT T GGT AGATAAGT T T CCTT AT T T TAAT TAGT CAAT GG TAGATACT T T T T TTTC TTTTCTTTA TTAGAGT AG AT TAG A AT CTTTT.A TGCC AAGT ATT G AT AA AT T AAATCAAGA AG AT AAACTATC AT A ATC AAC AT G AAAT T A AAAG A A AAATC T C A.TAT AT AGT AT T AGT AT TCTCT AT AT AT A T TAT GAT T G CT T ATTCTT AATGG GT TGG GTTAACCAAGACATAG T CTTAATGGAAAGAAT C T TTTTT GAACTTT T JCC TTATTGATTAAATT CT TCTATAGAAAAGAAAG AAAT TATTTGAGGAAA AG TAT A TA CAAAAAG AAAAATAGAAAAATGT CAGTGAAGCAGATGTAA T G G A TGACCT AATCC AACCACCAC CA TAGGAT G
5
10
TTTCTACTTGAGTCGGTCTTTTAAAAACGCACGGTGGAAAATATGACACGTATCATATCATTCCTT CCTTTAGTTTCGTGATAATAATCCTCAACTGatATCTTCCTTTTTTTGTTTTGGCTAAAGATATTT TATTCTCATT AATAG AAAAG ACGGTTTTGGGCTTTTGGT TTGC GA TAT AAA GAAGACCT T CGT G T G GAAGATAATAATTCAT CCT T T CGT CTTTTTCTGACTCTTCAATC T CTCC CA AAGCC T AAAG CGAT C TCT G CAAATCT C TCGC GAC T C TCTC T TT CAAGG TATATT TTCTGATTCT T T T T GT T T TT GATT CGT ATCTGATCTCCAATTTTTGTTATGTGGATTATTGAATCTTTTGTATAAATTGCTTTTGACAATATT GTTCGTTTCGTCAATCCAGCTTGTAAATTTTGTCCTGATTACTAAGATATCGATTcGTAGTGTTT A CATC T GT G TAATT TCTT GCT T GATT G T GAAATT AG GA T T T T CAAGGACGAT C T AT T C AAT T TT TG T GTTT T CT T TGT T'C G ATTCTCT CTGT T T T AGGTTTCTT AT G T TT AG ATCC GT T T CTC T TTGG TGTT G TTTTGATTTCTCTTACGGCTTTTGATTTGGTATATGTTCGCTGATTGGTTTCTACTTGTTCTATTG TTTTATTTCAGGTCACCAAACA SEQ ID NO.37
El fragmento teminador nos se sintetizo con base en el acceso de secuencia de banco de genes EU048864.
Secuencia terminadora nos
TCTAGAGTCAAGCAGA?CG TTCAAACA TT TGGC AATA AA GT T T CT TAAGAT T G AATC C T GT TGCC G GTC TTGC GATGATTAT CA TA TAAT T TC T G TT GAAT TA C G TG AAGC AT GTAATAATTAACATGTAAT GCAT GAC G TTATTT A T G A G A T GG GT TT T TAT GATTAG A GTCCCGCAATTAT AC ATTT AATACGCGA TAG AAAACAAAATAT AGCG C G CAAACTAGGAT AAAT TATCGCGCGCGGTGT CATCTATGTT ACTAG ATCGACCTGCAG BEQ ID NO.33
El gen de la transcriptasa RNasa H inversa del clon de levadura Ty1-H3 (Boeke et al., Mol. Cellul. Biology (1988), 8: 1432-1442; acceso bank No. M18706) se optimizo para uso de codon en plantas, y mediante insercion de 5 intrones de genoma de Arabidopsis (intron 1- de At1g04820, intron 2- de At2g2955o, intron 3- de At1g31810, intron 4 y 5- de At1g09170). Los intrones estan subrayados y aparecen en negrita. El clon se sintetizo por el proveedor de slntesis de ADN comercial y fur nombrado como RTRHi-Ty1.
Secuencia RTRHi-Ty1
ATGAACAAT T CAT C GCACAACAT CG T TCC TAT CAAGACT C CAAC TACTGTT TC TG AG CAGAACACT GAAGAATCTATCATCGCTGAT C T TC CACT TCC TGATC TT C C TCCAGAAT CTC CTACT GAAT TTCCT GAT CC ATTC AAAG AACT TCCAC CTAT CAAC T CAAGACAAAC TAAC TCTT CATTGGGCGGAATTGGC GATT C T AAT GCT T AC AC TACT ATC AACT C T AAGA AG AG GTATTGT AGCCAGCCTCAACCAjGTCTTT1 TTGCTGTTACATTTTCTTGGGCTCATCTAATGTTATTTTOCTATTTTGTTTTCAGG'L c act t G AAG ATAAT GAAACT GAAATCAAAG T TTCTAGGGATACATGGAATACT AAGAATATGAGAT CACT T GAAC
C T CCAAGATC TAAGAAGAGAATCCATC TTATTGCAGCTG TT AAAGCT G TGAAATCAATCAAAGCAA T TAGAACAACT CT T AGATA GGAT CAAC CAAT TACAT ACAAC AAAGACATCAAG GAGAAGGAGAAAT ACATCGA GG C TTAC CAC AAAGAAG T TAAC GAACT T C TT AAGATGAAAACT T G G GATACTGAT GAAT ACTAC GA TAGAAAAGAGATTGAC C CTAAGAGAG TT AT CAACT CAATGTTCATCTTCAACAAGAAGA GAGACGGAACT CACAAAGC TAGAT C C G TTGC AAGAGG AGAT AT TC AG CAT C C T GACACTTAC GAT T CAGGTAAGTATTCCAATGTTCTTCGATTATGAGTCftATGTTGTTACTGTATCTGTCTCTGTGGTTT attgtttcaggcttagttattgatTAGTATTGaaacttcactcacatatITTTTTGTTTGTTTTCT GAATTGTGCAGGTATG caatct AAT AC tc-t c catcac t acgcattgatgac at c tct t t cac ttg c
ATT GGACAATAAC TACTACATTACACAAC T T GACATATC TT C T GCATACCT T TACGCT GAT ATCAA GGAGGAG CT TTACAT TAGAC C T CC ACC ACAT T T GGGAA"' GAAT GATAAG TT GA T C CG T T TGAA GAA AT C AC T T TACGGATTGAAACAATCTGGAGCTAAT7GGTACGAAACT ATCAAAT CAT A CCITATTCA GCAAT GCGGT A TCGAGGAAGTTAG G 3GATGG TCAT G C GTAT T CAAGAACTCTC AAGT TACAATCT G CC T CT T CGTT GATGATATGG TGC T CTT C TCTAAGAAT CTTAAC TCAAACAAGAGAAlCA T T GA GAA GT T GAAGATGCAATACGACAC TAAGAT CA TC AAC CTT G GAGAATCTGAT GAGG AAAT T CAATACGA CATTCTTGGATTGGAAAT C AAATACCAAAGAGGTGflGTTATATTTAAGAGCTCATCAGTTAC T TAA ACACTTT TT6GGACAAGCAGTTCAAACTCATGT TCCAATCCTAAAATTjUVTTGCAATTCACAGGT A A GT AC AT GAAG TTGG GAAT G GAAAA CT CA TTGACTGAGAAGAT T C C T AAAC T T AACGT T CC T T TGA AT C C AAAG GGAAG AA AC- CT C T CT GC TCC AGG AC AAC C AGG AC T T T AC AT TG ACCAGG AT G A AC TT G A GAT TGAT GAGGAT GAATACAAC GAGAAAC TA CACG A GATGCACAAC T T CA T T C GACT TGCT TCAT ACGTTGGAT ACAAAT T CAGAT TCGACCTT CT TT ACTACATCAACACAC TTG CTCAGCATAT AC TT T 7 CC CAT C T AlGGC AAGT TCT T GAC AT GACATACGAGC T T A TCCAATTC AT GT C-GGAC ACT AGAGACA AGC AAC T CAT ATC-GC ACAAG AAC AA CC C TAG AG A GC C A GAT AAC AAGC TCGT T G CAAT C TC T GAT C C T T CTTACGGAAACCAACCAT ACTAC AAATCAC AAAT TGG A AAC A'TC T ACT T GCTTAACGCJAAAQG TACTTTTCTCAAAGACTTTACCTTATTGTGGAATATTGAATTTTCTGAAAGACTTCAOCTTATCTA CATTTGTAATTTTACTArGGTAATCAGGTGAT T GGAGGAAAGAGCAC T'AAGGCTTCACTTACATGC AC T TCAACT AC TC-AG G CAGA GAT C C ACG C TAT ATC AG AATC T GTAC C ACTTCT T AAC AACCT TTC T TAG CTTA TCCAAGAGCTTAACAAGAAGCCAATCATCAAGGGAC TTCT TACTGAC TCAAGAT CAACA A rC TC?A TCAT TAAGTCTACAAAT GAAGAGAAATTCA GAAACAGA ?T C TTCGGAACAAA GGC AAT G AGACTTAGAGATGAAGTTT CAG GTAAGTATTAACTTACCAAATGATCAATATTAr TTTGAAATGCA GGTTTT AGAArAATACTCPCTGCOGTT CTTGTT TATT TCCAGG 7h AC AACCT T TACGT T TACTACA TCGAGAC TAAGAAGAACAT TGCTGACG TTAT GACAAAGCCTC TTCCTATCAAGACCTT CAAGTTGC T T ACT AACAAATG GATTCATTAA SEQ ID GO.39
La secuencia RT-RH-Ty1 se fusiono traduccionalmente con el peptido de transito de cloroplasto de protelna de choque termico Hsp60 de cloroplasto de guisante (No. de acceso L03299). La secuencia para el peptido de transito (Hsp60- 5 CTP) se amplifico de ADN genomico de guisante utilizando los siguientes cebadores de PCR:
AS293 T CT CG AGTTG AT GG CTT CTTC TG CT C AAATA SEQ ID NO. 40
AS294 GGCATGCAACTCTCAAAGTG AAACCCTTC SEQ ID NO.41
Secuencia Hsp60-CTP
C TCGAGATGGCTTCT T CTGCTCAAAT ACACG GTCTCG GAACC G CTTC T T TC T C TTCC C T CAAAAAA C CC TC TTCC AT TTCC GGTAATTC CAAAACCCIT TTCI1CGGTCAGC GAG TCAATT CC AA CC ACTCT C CC TTC ACC C G CGCCGC AT T CCC T A AGT TMGT AG C AAMC C T T T MG AAGGGTT T C AC TT TGAGA GTTGCATGC SEQ ID NO.42
5
La expresion de la fusion de RTRHi-Ty1 y Hsp60-CTP se acciono por el promotor de gen TAF2 del gel taf2 de Arabidopsis. Se amplifico de ADN genomico de Arabidopsis (Col-0) utilizando el siguiente conjunto de cebadores:
AG 3 GGTACCATGATCGCTTCATGTTTTTATC AG 4 CTCGAGGTT CC TTTTTTGC C G ATATG TTAG
SEQ ID NG.43 SEQ ID NQ.44
10 Secuencia de promotor TAF2
STAG CATGATCG C TTCATG T TT rTATCTAAT TTGT TAGCATATTGAATGAT T GAT T TTCTTTTAAT TTG G AT ATGTTGA'TTGTCT T G TT GCATC ATC AAT G T AT GT TTT AT TT AAC AC CGG AA GATCTTAT G AT GG G TT CATTACTT CATAAT AATCTCCG AG TTCTACAAGA CTACAACTT T CACGT GACTTTT AC A GCGACAAAAAATGCATCTAGC GAAAATT AAT CCACAACC TA TGCATTTT T G T CAC TCTT CACACGC GT AT GTGCA T A AAT AT A TAG T A T AT ACT C GAC A AT CG AT GC GT AT G T GT AC AC A AT T AC C A A AAC A AT T A T TT G AAT A T TC AG AC A T GGGT TG AC A T C AC C A AGT AA TAT T CAC AG T AT CT G A A A AC TAT G T T T T G AC AT C CCT A AATA GT T T G AC T A AC C AGT'TT AAT AT GA G AGC AT TTGT AAG AG G C A AG AGC C A TGGT T TT G T TGGCTCGT TT AATATGCTCatTTAAC CCCCC CAAAAAATAC TATTAGATT TAAAC G T A AAAG AAT TAACGAACACAAGAACTGCT AAAAC AAAA AAAAATCAAT GGCC G A.C AT TTC AT AGT T C ATACATCAC TAATACTAAAAGATGCATCAT T TCAC TAGGGT CTCATGAAATAGGAG T TGACAT T T T TTTTTGTAACGACAGAAGTTGACATGTTAAGCATCAA'TTTTTTTAAGAGTGGATTATACTAGTTTT T T T T T TT T T TT T T A ATG T AT G G T AT G AT AC A AC AAC A AA AA CT AT AA A AT AG A A AAA G7 C A GT G A A ACC T cAAAT TGAAGGAAAAA C1TT T TGCAC AA AAAGAGAGAG AGAGAGAAAG AATGTAAAT C CAAA T AAATGGGCCTAATTGAGAATGCTTTAACTTTTTTTTTTTGGCTAAAAGAGAATGCTTTAACTAAGC ccataaaatgaacatcaaactcaaagggtaagattaatacatttagaaaacaatagccgaatattt
AATAAGT T TAAGACATA GAG GAGT T TTAT G TAAT TTAG GAACCGATCCAT C G T TGGCTGTATAAAA
aggttacatctccggctaacatatcggcaaaaaaggaacctcgag SEQ ID NO. 45
La senal polyA de sintasa agropina (terminador ags) se sintetizo con base en la secuencia de banco de genes EU181145.
La secuencia de termination ags
GAAT TAACAGAGGTGGAC G CACAGACCCGTTCT TACACC GGAC TGGGCGCGGGATAGGATATT CAG ATTGGGAT GC GATT GAGC T TAAAGCCGG C GC T G AGAC CATGCT CAAGGTAGGCAATGTC CTCAGCG T GG AG GC C GGC AT CT AT GT C GAGG GCAT T GGT G G A GC GCGCT T C G GGGA T ACC GT GCT T GT AACTG AGAG GGGATATG AGGCCCTCACT CC GC T TGATCTTGGCAAAGATATTCGAC GCATTTATTAST ATG TGT TAAT T T T CATTT G CAGT G CAGTAT T T TCTAT T CGATCTT T AT GTAAT T C G TTACAAT TAATAA ATAT T CAAAC CAG AT TAT T G A C : G T CAT T T GT AT C AA AT CC- T G T T TAAT G GAT AT T T T T AT T AT A A tAttGATGAT STQ ID Ho.46
Transformation de plantas de Arabidopsis
5 La transformation de plantas de Arabidopsis se realizo como se describe por Clough & Bent (Clough & Bent (1998)
Plant Journal 16:735-743). Se utilizo la cepa de Agrobacterium tumefacience GV3101 (Koncz & Schell (1986) Mol Gen Genet 204:383-396) para la transformation. La transformation de plantas se llevo a cabo con construcciones de transformation de cloroplasto (Figura 2), basadas en el vector binario pGreen 0029 (Hellens et al (2000) Plant Mol. Biol. 42: 819-832). En resumen, un casete de transformation del cloroplasto que contiene trnl flanco, promotor Prrn, gen 10 aadA, psbA 3 'UTR, flanco trnA y dominio de union de cebador (PBD) se inserto en el dominio IV de LtrB o se fusiono a CTL de ASB utilizando enzimas Ascl-Notl. El fragmento de ADN resultante se fusiono con el promotor 35S y el terminador nos y se introdujo en el vector binario pGreen0029 (EU048864). El fragmento de LtrASi se fusiono a un peptido de transito de cloroplasto (GR-CTP) y promotor ubiq3 de Arabidopsis. El casete resultante se inserto en pGreen 0029 junto con el casete de transformation de cloroplastos. La transcriptasa RNasa H inversa (RTRHi-Ty1) se fusiono al 15 peptido de transito Hsp60-CTP, el promotor TAF2 y el terminador ags. El casete resultante se inserto en el vector pSoup (EU048870) que lleva T-ADN del vector pGreen0179 (EU048866). La construction que lleva el casete de cloroplasto y LtrASi se cotransformo con la construction que lleva casete RTRHi-Ty1 en la misma cepa de Agrobacterium y se utiliza para la transformation de Arabidopsis (Col-0).
Las estirpes transgenicas se recuperaron en medio de selection suplementado con 100 mg/l de espectinomicina.
20 Transformation de plantas de tabaco
Las plantas de tabaco se transformaron como se describe por Horsch et al., (1985) Science 227: 1229-1231, utilizando cepa AGL1 de Agrobacterium (vease protocolo a continuacion).
Las construcciones fueron similares a las construcciones utilizadas para la transformation de Arabidopsis con exception de las secuencias de flanqueo trnl y trnA del casete de cloroplasto se amplificaron de ADN genomico de tabaco (Figura 25 2).
Las plantas de tabaco transgenicas se regeneraron en medio de selection suplementado con 500 mg/l de espectinomicina.
Transformation de explantes de hojas de tabaco con cepa AGL1 de Agrobacterium Todos los artlculos se esterilizan en autoclave antes de uso.
30 El filtro esteriliza los antibioticos para prevenir el crecimiento de hongos, mantener a los antibioticos para cultivo de tejidos de planta en caja separada
Esterilizar material de planta: tomar las plantas de aproximadamente 9 cm de alto, que no deberlan haber empezado a florecer. Cortar las hojas con cutlcula (4-6 hojas por construction, lo suficiente para cortar 100 explantes), se sumerge en etanol al 70% y se sumerge inmediatamente en hipoclorito de Na al 1% (cat. No. 01032500; utilice botella de 35 blanqueador que no tenga mas de 3 meses de edad, ya que se evapora el gas de cloro), mantenga las hojas con unas pinzas y agite por 20 min. Evite danar la cutlcula de otro modo blanqueada, que entrara en el sistema vascular. Enjuague brevemente en agua esteril 5-6 veces y deje en agua hasta que este listo para ser cortado.
Co-cultivo de agro con explantes de tabaco: se hace crecer AGL1 en caldo de LB o L con los antibioticos apropiados durante la noche a 28-30°C, al dla siguiente se vuelven a suspender en solution agro de cocultivo de tal manera que la
concentration final es de alrededor de 0.4-0.6 DO600nm. Coloque las hojas de tabaco en el caldo de cocultivo y corte cuadrados de 1-1.5 cm x 1-1.5 cm con un bisturl esteril redondeado utilizando una action de rodadura. Sumerja los explantes de hoja en la solution agro con pinzas esteriles (almacenadas en etanol al 100%, flamee y deje que se enfrle antes de tocar el tejido de la hoja) se necesita la mancha en papel Whatman esteril y transfiera sobre placas de TSM no 5 selectivas (6 explantes por placa) para preparar aproximadamente 15 placas por construction. Repita este procedimiento para cada construccion, asegurandose de que el bisturl y unas pinzas se sumergen en etanol y se flamean entre cada construccion para evitar la contamination cruzada. Deje durante 2 dlas solo para AGL1 (3-4 dlas para otras cepas agro)
Transferencia en placas selectivas de TSM: utilice pinzas esteriles para recoger y lavar los explantes en 100 ml de caldo 10 cocultivo suplementado con 320 mg/l de timentina (un pote por construccion), agitar bien, secar sobre papel Whatman esteril y colocar los explantes lavados en placas de tSm selectivas suplementadas con antibioticos selectivos apropiados y timentina 320 mg/l para matar Agrobacterium.
Regeneration de brotes: tarda alrededor de 1 mes para que aparezcan los brotes, los explantes deben ser transferidos en placas frescas cada 10-14 dlas. Observe hacia fuera para el crecimiento recurrente de AGL1, si la timentina no es 15 suficiente para matar agro, anada cefotaxima 250 mg/l.
Regeneracion de la ralz: Toma alrededor de 1 semana. Los brotes se cortan de los explantes y se colocan en cajas de crecimiento que contienen TRM suplementado con los antibioticos apropiados selectivos y timentina 320 mg/l + cefotaxima 250 mg/l para evitar el crecimiento de Agrobacterium recurrente.
Mantener plantas en cajas de TRM: sustituya cada dos semanas hasta que este listo para ser transferido al invernadero
20 Adaptation a condiciones de invernadero: remoje granulos de turba en agua esteril hasta que se hinchan a su tamano
normal y coloque cuidadosamente una planta por granulo, se incuban las plantas por debajo de 100% de condiciones de humedad en un propagador, abriendo gradualmente las pequenas ventanas hasta que las plantas se adaptan a la atmosfera normal durante varios dlas.
Recetas:
25 Cocultivo: MS con vitaminas y MES + 0.1 mg/l de NAA + 1 mg/l de BA + 3% de sacarosa, pH 5.7
TSM: MS con vitaminas y MES + 0.1 mg/l de NAA + 1 mg/l de BA + 3% de sacarosa, pH 5.7, 0.2% de gelrita TRM: A de sales MS con vitaminas y MES + 0.5% de sacarosa, pH 5.7, 0.2% de gelrita.
Autoclave.
Concentracion de antibioticos 30 Para cultivos LB o L de Agrobacterium:
Para crecer AGL1 llevar pGreen/pSoup: carbenicilina 100 mg/l, tetraciclina 5 mg/ml, rifampicina 50 mg/ml, kanamicina 50 mg/ml
AGL1 que lleva pSoup: carbenicilina 100 mg/l, Tetraciclina 5 mg/ml, rifampicina 50 mg/ml.
AGL1 vaclo: carbenicilina 100 mg/l, 50 mg rifampicina/ml.
35 Para cultivo de plantas:
Kanamicina: 300 mg/l (100 mg/l si se utiliza benthamiana)
Higromicina: 30 mg/l (10 mg/l si se utiliza benthamiana)
PPT: 20 mg/l (2 mg/l si se utiliza benthamiana)
Espectinomicina: 500 mg/l
40 Timentina: 320 mg/l. Se utiliza para matar agro, pequena cantidad bastante inestable constituida, para almacenamiento, almacenar en el congelador por hasta 1 mes despues de que el antibiotico no es mas eficiente.
Cefotaxima: 250 mg/l. Tambien se utiliza para matar agro, agregue a TS Analsis PCR de plantas transgenicas.
Los siguientes cebadores se han utilizado para la amplificacion de secuencias flanqueantes de union:
LFS1 G AG ATGTG G ATCATCC AAGG C A
RFS1 CTACCATAGAGGCCAACGATAG
AS527 AACGTCGGTTCGAGATGG (aadA-R1)
aadA-F1 C G AAGG AT GT CG CT GC CG ACT:
SEQ ID NO.47 SEQ ID NO.48 SEQ ID NO.49 SEQ ID NO.50
5 y cebadores anidados:
LFS2 RFS2 AS 526 aadA-F2
CTCCTCCTCAGGAGGATAGATG AACTTTCATCGTACTGTGCTCTC GAGTCG ATACTTC GG CG ATC (aad A- R2) CTAGACAGGCTTATCTTGGACA
SEQ ID NO.51 SEQ ID NO.52 SEQ ID NO.53 SEQ ID NO.54
Los siguientes cebadores se utilizaron para la amplificacion de la sonda de cloroplasto para hibridacion Southern:
LP-F CGTGTTTAGTTGCCATCGTTGA LP-R GCTGAGAGCCCTCACAGCCCA RP-F TGTCAGCGGTTCGAGTCCGCTTA RP-R TAACCAAGCCACTGCCTATGAGT
SEQ ID NO.55 SEQ ID NO.56 SEQ ID NO.57 SEQ ID NO.58
10
Los siguientes cebadores se utilizaron para la amplificacion del gen aadA como una sonda para hibridacion de Northern:
aadA1
aadA2
GTGATCGCCGAAGTATCGACT SEQ ID NO. 59 ATCTCGCCTTTCACGTAGTGG SEQ ID NO.60
Resultados y Discusion
15 La transformacion de Arabidopsis y tabaco con nuestros vectores que contienen casetes de transgen generaron plantas transgenicas de cloroplastos por seleccion en medio suplementado con 100 mg/l de espectinomicina para Arabidopsis y 500 mg/l para tabaco (Figura 2). En todos los casos hemos sido capaces de detectar la insertion del casete de transgen en el genoma del cloroplasto utilizando amplificacion por PCR de las regiones de union. Cinco estirpes transgenicas independientes se analizaron para todas las construcciones y podlan amplificar el fragmento de ADN de tamano 20 correcto para uniones de insercion en todas las estirpes. Los fragmentos amplificados fueron secuenciados y se confirmaron los sitios de insercion correctos.
Tambien se realizo analisis Southern y Northern para confirmar la presencia de la insercion y las transcripciones del cloroplasto.
Section experimental 1B
25 Las modificaciones del metodo de transformacion del cloroplasto utilizado en la seccion experimental 1A se puede mejorar utilizando PBD disenada para transcription inversa en el citoplasma o en plastidios, y mediante el reposicionamiento de los elementos fundamentales del casete de transformacion (Figura 3).
El grupo de construcciones se preparo para transformacion de tabaco y arroz con intron LtrB (LtrB-CTS) o con secuencias de ASB (ASB-CTS) como el CTS (Figura 4-6). El posicionamiento de los elementos fundamentales del 30 casete de transgen se diseno como se describe en la Figura 3, A-B para LtrB-CTS y la Figura 3, C-D para ASB-CTS.
El PBD-CHL se diseno como se describio anteriormente.
El dominio de union de cebador de retrotransposon Tnt1 de tabaco se utilizo como el PBD-CYT, y se amplifico de ADN genomico de tabaco cv Petit Gerard utilizando los siguientes cebadores:
AS912 GCCGCGGCTTTATTACCGTGAATATTA SEQ ID NG.61
AS913 CGCGGCCGCTCTGATAAGTGCAACCTGATT SEQ ID N0.62
5
PBD-CYT
CTT TATTACCG TGAATAT TAT TT T G GTAAGG GGTTTAT T CCCAAC AAC T GGTATGAG AG CACAGG T TCT GCT C GTT C ACTG AAAT A C TAT T CAC T G T CGGTAGTACTATAC TTGG TGAAAAAT AAAAAT gt c TGG AGT AAAG TACGAGGTAGCAAAATTCAA TGGAGAT AACGGT T T CT CAACATGG CAAAGAAGGA T GAGAGAT CT GC T CAT CCAACAAGGATTACACAAGGTTCT AGATGT TGAT TC CAAAAAGCCT GAT A C CAT GAAAGCTG AG GATTGG G C TGACT TGG AT GAAAGAGC T G CTAG TGCAAT CAGGTT GCACT TAT C AGA
SEQ ID NO.63
En el primer caso, el PBD-CHL se fusiono al extremo 3' del intron LtrB (figura 3A, figura 4A para el tabaco y figura 5A para el arroz). Como la protelna LtrA posee caracterlstica de union LtrB-CTS y actividad de transcripcion inversa se 10 pueden cumplir ambas funciones de la translocacion de ARN transgen en plastidios y la transcripcion inversa del casete de ARN utilizando plastidios tRNA-Met como un cebador.
En el segundo caso, el PBD-CYT se fusiono a CTU (figura 3B, figura 4B para el tabaco y figura 5B para el arroz), de tal manera que la transcripcion inversa del casete del transgen se inicia y se lleva a cabo por transcriptasas inversas endogenas en el citoplasma utilizando tRNA-Met citoplasmico. La protelna LtrA sirve como peptido de union a CTS para 15 la translocacion del complejo ARN: ADN iniciado por las transcriptasas inversas en los plastidios.
El ASB-CTS se fusiono a la CTU con PBD-CHL o AP-CYT (figura 3 C-D, figura 6, A y B). La transcriptasa inversa del retrotransposon de levadura Ty1 fue cosuministrada con la construccion que contiene PBD-CHL para facilitar la reaccion de transcripcion inversa en los plastidios.
El casete de cloroplasto para la transformacion de arroz se diseno utilizando secuencias especlficas a arroz (Fig 5).
20 El fragmento trnI del genoma del cloroplasto de arroz se utilizo como el EPA, y se amplifico utilizando los siguientes cebadores:
AS699 GGC GC GC C GTG GG ATCC GG G C G GTCC G SEQ ID N0.64
AS700 GGCATGCTGGCGCAGCTGGGCCATCC SEQ ID NO.65
Arroz trnI-LFS
Gggatccgggcggtccggggggggcactacggcecctctcttctcgagaatccatacatoccttat cagtgtatggagagctatctctcgagcacaggttgaggttcgtcctcaatgggaaaatggagcacc taacaacgcatcttGafragaGc'aagaan+.acgagatcaccctttcat'ict ggggtgacggagggat cgtaccattcgagcctttttttcatgcttttcccggcggtctggagaaagcagcaatcaataggac ttccctaatcctcccttcc tgaaaggaagaacgz-gaaatttitttttcc tttccgcagggaccagga ggttggatctagccataagaggaatgcttggtataaataagccacttctt ggtcttcgactccota agtcactacgagcgccctogatcagtgcaatgggatgtggctatttatctatctcttgactcgaaa tgggagcagagcaggtttgaaaaaggatcttagagtgtctagggLtgggccaggagggtctci cgccttcctttttctgcccatcggagttatttcccaaggacttgccatggtaagggggagaagggg a a g aagca c a c t tga a g agcg ca gt. a caa c ggag agt t g t at gc t gc g 11 cggga agga tga a t eg ctcccgaaaaggagtctat zgattCtctCCCaa’c.tggtt ggat.cgtaggggcgatgatt tact tea cgggcgaggtctctggttcaagtccaggatggcccagctgogsca SEQ ID NO.66
El fragmento trnA del genoma del cloroplasto de arroz se utilizo como el RFS, y se amplified utilizando los siguientes cebadores:
AS701 gatatcggatggcccagctgcgcca SEQ ID NO.67 AS702 Gcggccgcattgcccttctccgaccct SEQ ID NO.68
5 Arroz ARNt RFS
G ga t g g cc cag ct gege ca ggga aa a ga at a g aaga agea t c tga c t ct 11 c a tgca t a ct c c act tggctcggggggatatagctcagttggtagagctccgc Lcttgcaattgggtcgt tgegattaegg gttggctgtctaattgtccaggcggtaatggtagtatcttgtacctgaaccggtggctcacttttt Ctaagtaatggggaagaggactgaaacatgccactgaaagactctsctgagacaaaaagatgggct gtcaaaaaggtag&ggaggtaggatgggcagttggtoagatctagtatggcLtcgtacfltggacgat agttggagtcggcggctctcctsggcttccctcatctgggatccctggggaagaggatcaagttgg cccttgcgaatagcttgatgcactatctcocttcaaccctt“gagcgaaatgtggcaaaaggaagg aaaatccatggaccgaccccattatctccaccccgtaggaaetacgagatcaccccaaggacgcct tcggcgtccaggggteacggaccgaccatagacccfcgttcaataagtggaacacattagccgtccg cLctcGggttgggcagtaagggtcggagaagggcaat
SEQ ID NO.69
El promotor rrn 16 especlfico a cloroplasto de trigo cv. Pavon se amplified utilizando PCR con los siguientes cebadores:
AS 518 ATC GATAACATTCC TC TAATTTCATTG CA S E Q ID NO. 70
AS720 GG CATGCAGGCTTGTGGGATTGACGTGATAG SEQ ID NO.71
10 Secuencia de promotor rrn de trigo (Wrrn)
Agg ct tg t gggat tga c gt gata ggg t a. gggt tggc tatactgct ggtggcga a ct c c a ggct aa t aat c t gaagc g cat g gat acaagttat e c ttggaaggaaoga caat t ocga at ctgc tttgt ctac gaataaggaagctatAagtaatgcaactatgaat etcatg
SEQ TE NO.72
Secuencia de fusion aadA-mGFP4
atggcagaagcggtgatcgccgaagtatcgactcaactatcagaggtagttggcgtcatcgagcgc catetcgaaccgacgttgctggccgLa catt Lgtacggctccgcagtggatggcggcctgaagcca cacagtgatattgatttgctggttacggtgaccgtaaggcttgatgaaacaacgcggcgagct t hg
atcaacgaccttttggaaacttcggcttcccctggagagagcgagattctccgcgctgtagaagtc accattgttgtgcacgacgacatcattccgtggcgttatccagctaagcgcgaactgcaatttgga gaatggcagcgcaatqacattcttgcaggtatcttcgagccagccacg&tcgacattgatCtggct atcttqctgacaaaagcaagagaacatagcgttgccTitggtaggtccagcggcggaggaactcttt gatccggttcctgaacaggazctatttgaggcgctaaatga'iaccttaacgctatggaactcgccg cccgactgggctggcga tgagcgaaatgt agtg ctt acgttgtcccgcat ttggtacagcgcagta a c c ggca a a atcgcgcc ga a ggat gt. eg ct gc ega c t ggg ca at gg ag eg c c t g cegge ccagtat cagcccgtcatacttgaagctagacaggcttatcttggacaagaagaagatcgcttggcetcgcge gcagatcagttggaagaatttgtccactacgtgaaaggcgagatcaccaaggtagtcggeaaatca ggatccatgagtaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggt gatgttaatgggcecaaattttctgtcagtggagagggtqaagqtqatgcaacatacggaaaactt acccttaaatttatttgcactactggaaaactacctgttccatggccaacac"tgtcactactttc tcttatggtgttcaatgcttttcaagatacccagatcatatgaagcggcacgacttettcaagagc gccatgcctgagggatacgtgcaggagaggaccatcttcttcaaggacgacgggaactacaagaca cgtgctgaagtcaagtttgagggagacaccctcgtcaacaggatcgagcltaagggaatcgatttc aaggaggacggaaacatcctcggccacaagttggaatacaactaoaactcccacaacgtatacatc atggcagacaaacaaaagaatggaatcaaagttaacttcaaaattagacacaacattgaagatgga agcgttcaactagcagaccattfltcaacaaaatacLccaattggcgatggccctgtccttttacca gacaaccattacctqtccacacaatctgccctt tcgaaagatcccaacgaaaagagagaccacatg gtccttcttgagtttgtaacagctgctgggattacacatggcatggatgaactatacaaataatct aga
SEQ ID NO.73
Se amplified el terminador atpA de ADN de trigo utilizando los siguientes cebadores:
AS753 Accgcggtcaaataaattttgcatgtcta SEQ ID N0.74
AS723 Gatatctccatactccttctttatgata SEQ ID NO.75
Terminador atpA de trigo
Caaataaattttgcatgtctactcttgttagtagaataggaatcgttgagaaagatc attest ttg aatcatgcaaaaa&gttttct“tgttt:ttagtttagtatagttatttaaagraatagacsgaaataia gattgcgteeaataggatttgaacctataccaaa.ggtttagaagacctc;tgtcetaccta.ttagac aatgqacgcttt'ctt*cata’tttattct“tcttttat"tttttttctccttccgagaaaaaact gttagaccaaaact.cttttaggaaatcaaaaaatccaga’iacaaatgcatgatgtatatatt atat catgcatatat cataaagaaggagtatgga
SEQ ID NO.76
El gen LtrA se acciono por el promotor de actina 1 de arroz amplificado utilizando los siguientes cebadores:
ARP1 gtcattcatatgcttgagaaga SEQ ID N0.77 ARP2 gcctacaaaaaagctccgcacg SEQ ID N0.78
Secuencia promotora act1 de arroz
gt cat t cat a tg c t tga gaagagagt c ggga tagt ccaaa a t aaaa caaaggtaaga 11ac c t ggt caaaagtgaaaacatC-s.gttaaaa.ggt ggtat aag-aaaa tat cggtaataaaaggtgg eccaaag t gaaa 111 a c t ct r. t tc t a ct at t at aaaaa t tgagga tg 11t tgtcggtactttgatacgtcratt tttgtatgaattggttt ttaagtttattcgcgatctggaaatgcatatctgtaTittgagtccg'ttt ttaagttcgttgcttttgc aaatacagagggatttgtataagaaatat cttt.aaaaaacccatatg ctaatttgacacaatttttgagafiaastatatatncaggcgaattccacaatgaacaataataaga t taaaatagcc tgcccccgt tgeagega tgggta 11 tttt c t.agtaaaat aaaagttaaactt aga ctcaaaacatttacaaaaacaacccctaaagccctaaagcccaaagtgctatgcatgatdcatagc aagcccagcccaaccdaacccaacccaacccaccccagtgcagccaactggfiaaatagtctcc^Cc cccggcactatcaccgtgagttgtccgcaccaccgcacgtctcgcagccaaaaaaaaaaaaagaaa gaaaaaaaagaaaaagaa&&acagcaggtgggtccgggtcgtgggggccggaaaagcgaggagga.t cgcgagcagcgacgaggcccggccctccctccgcctccsaagaaacgccccccaccgccactatat acatacccccccctctcctcccatccccccaaccctaccacoaccaccaccaccacctcctceccc
ctcgctgccggacgacgagctcctcccccctccccctccgccgccgccggtaaccaccccgcccct' ctcctctttctttctccgttttttttttcgtctcggtctcgatott t.ggccttggtag’ittgggtg ggcgagagcggcttcgtcgcccagatcggtgcgcgggaggggcgggatctcgcggctggcigtctcc gggcgtgagtcggcccggatcctcgcggggaatggggctctcggatgtagatctgcgatccgccgt tgttgggggagatgatggggggtttaaaalLLccgccatgctaaacaagatcaggaagaggggaaa agggcactatggtttatatttttatatatttctgctgcttcgtcaggcttagatgtgecagatett ctttctttcttctttttgtggtagaatttgaatccctcagcattgLtcatcggtagtttttctttt catgattt.gtgacaaatgcagcctcgtgcggagcttttttgtaggc
SEQ ID NO.79
Transformacion de embriones inmaduros de arroz.
5
10
15
20
25
30
Escision de embriones inmaduros Dla 1:
Retirar las semillas inmaduras de etapa lechosa/post-lechosa de panlcuias (se desean embriones inmaduros de 1-2 mm de tamano).
Esterilizar semillas inmaduras: hipoclorito de sodio al 50% (12%) + 1 gota de Tween 20. Agitar 10 min.
Enjuagar 3-5x en agua desionizada esteril. Escurrir el exceso de agua. Las semillas de allcuotas (alrededor de 40) se colocan en placas de Petri esteriles.
Establecer una placa de Petri de 60 x 15 mm que contiene una solucion al 50% de hipoclorito de sodio y junto a esta un vaso de precipitacion esteril en su lado con un papel de filtro esteril en esta. Utilizar pinzas esteriles para eliminar de forma aseptica glumas de la primera semilla. Sumergir esta semilla en el hipoclorito de sodio al 50%. Eliminar las glumas de una segunda semilla y sumergir la segunda semilla en solucion de hipoclorito de sodio, mientras tanto eliminar la primera semilla y almacenar esta semilla descascarillada/esterilizada en el papel de filtro en el vaso de precipitacion. Continue de esta manera con todas las semillas.
Despues se eliminan todas las glumas:
Esterilizar semillas descascarilladas: hipoclorito de sodio al 50%: 5 min. con agitacion.
Enjuague: 5-7 x en agua desionizada esteril, escurrir.
Colocar todas las semillas en una placa de Petri esteril grande. Allcuota para la escision de embriones (mantener las semillas secas, trabajar solo con 50-100 en el plato a la vez dejando el resto de la placa maestra).
Eliminar el embrion de cada semilla y colocar el embrion, el escutelo se deja hacia arriba, en una placa de Petri de 90 x 15 mm que contiene medio de proliferacion (40-50 embriones/placa). Cultivar a 28°C en la oscuridad durante 2 dlas antes del bombardeo
Dla 3:
Verificar cada embrion para contaminacion antes de limpieza
Retirar los embriones del medio de proliferacion. Distribuir 35 a 40 escutelo de embriones hacia arriba en un area de 1 cm2 en el centro de una placa objetivo de 60 x 15 mm que contiene 10 ml de medio de proliferacion + tratamiento osmotico (0.6 M). Verificar cada placa objetivo de tal manera que el escutelo es recto. Permitir suficiente espacio para que los escutelos no se hagan sombra unos a otros.
Bombardeo:
Pistola 14 kV
Vaclo: 25 pulgadas de Hg
1er bombardeo 4 horas despues de tratamiento osmotico
2do bombardeo 4 horas despues de 1er bombardeo
Dla 4:
4 a 16 horas despues de la 2a transferencia a chorro de embriones inmaduros al medio de proliferacion sin tratamiento osmotico. Cultivo en la oscuridad a 28°C durante 2 dlas.
Seleccion:
5
10
15
20
25
30
Dla 5:
Cortar asepticamente con tijeras el brote germinacion. Transferir 16 a 20 embriones inmaduros a medio de proliferacion fresco que contienen 30 a 50 mg/l de higromicina (dependiendo del genotipo); cultivar en la oscuridad a 28°C; numero total record de embriones.
Despues de 10 dlas eliminar cuidadosamente el callo desde el escutelo al romperlo en trozos pequenos 2 a 10; subcultivar en medio de proliferacion fresco + higromicina. No subcultivar el tejido marron y los embriones inmaduros restantes que pueden inhibir aun mas el crecimiento de callos sanos.
Subcultivar cada 10 dlas al seleccionar tejido sano: (embriogenico si esta presente) y transferir a medio de proliferacion fresco + higromicina. Retirar el callo de color marron, que se puede inhibir adicionalmente del callo embriogenico.
30 a 40 dlas despues de bombardeo cambie el procedimiento de seleccion. En lugar de eliminar el tejido de aspecto malo solo mantenga el tejido embriogenico (eliminar el tejido sano no embriogenico)
Regeneracion:
Despues de 40 a 60 dlas, transfiera el callo embriogenico establecido que muestra crecimiento diferencial en medio de proliferacion + higromicina al medio de regeneracion + higromicina. Cultive 28°C bajo poca luz durante 10 dlas luego bajo alta luz durante 10 dlas adicionales. Compruebe las placas periodicamente a la luz para el desarrollo de embriones y los brotes verdes. A medida que los brotes se desarrollan a veces es beneficioso mover suavemente el brote en desarrollo lejos del callo originado y eliminar el tejido muerto del brote por si mismo para evitar la inhibition del crecimiento.
Germinacion:
Transfiera de embriones compactos blancos y brotes verdes que inician ralces al medio de germinacion bajo alta luz a 28°C durante 1 a 2 semanas. Compruebe periodicamente las placas. Elimine el tejido necrotico y divida los embriones que germinan si es necesario.
Resultados
Se realizo el analisis de plantas transgenicas utilizando PCR para la insertion de secuencias de flanqueo utilizando los siguientes cebadores para flanco izquierdo de tabaco:
AS 548 ACG GT G AAGTAAG AC C AAG CT CAT SEQ ID NO.30
AS 549 CTAGGTCGGAACAAGTTGATAGGAC SEQ ID NO.31
Flanco derecho:
AS 550 GGCTATGCCATCCTAAGGTGCTGCT SEGIDN0.82 AS 551 C C AT GAATG ATAAATC ATAG AT CG AAC: SEGIDNG.83
Para flanco izquierdo de arroz:
RC1 CCTGACCCGAAGATGTGGATC RC2 ACATTAGCATGGCGTACTCCT
SEQ ID NO.84 SEQ ID N0.85
flanco derecho:
5
10
15
RC3 AACCAGGAACGGGGAGCTCTC RC4 CGACTCTTTGATCTTAAACTT
SEQ ID NO.86 SEQ ID NO.87
cebadores internos especlficos para el gen aadA:
AS 526 G AGT C G ATACTTC GG C G ATC SEQIDN0.88
AS527 AACGTCGGTTCGAGATGG SEQ ID NO.89
para el gen mGFP
AS 52 8 TTAC C AG AC AAC CATTACCTGTC SEQIDNO.90 AS529 GCTGGGATTACACATGGCAT SEQ ID NO.91
El tamano esperado (1.1 kb) de los productos de PCR se obtuvo para todas las construcciones de tabaco (figura 7). El analisis de secuenciacion ha confirmado el sitio de union entre el transgen y el genoma del plastidio.
El analisis Southern tambien ha confirmado inserciones de transgenes en la ubicacion correcta del genoma del cloroplasto del tabaco (Figura 8).
El analisis Northern indica la presencia de la transcripcion del transgen en la fraccion del ARN de cloroplastos (Figura 9).

Claims (12)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    Reivindicaciones
    1. Un metodo para transformar plastidios en una celulas vegetales, el metodo comprende:
    1) introducir en el nucleo de dicha celulas vegetales una secuencia de acidos nucleicos que comprende un promotor nuclear de planta ligado operablemente a una primera secuencia de acidos nucleicos que comprende un casete de transgen de plastidio, una secuencia de traslocacion de plastidios (PTS) es decir una secuencia de ARN capaz de unirse a una protelna de union de PTS de planta, y un dominio de union de cebador seleccionado de aquel de un retrotransposon o un retrovirus;
    2) introducir en el nucleo de dicha celulas vegetales una segunda secuencia de acidos nucleicos que codifica una protelna de union de secuencia de traslocacion de plastidios fusionada a un primer peptido de transito de plastidio, en el que dicha segunda secuencia de acidos nucleicos se une operablemente a un promotor nuclear de planta; y
    3) introducir en el nucleo de dicha celulas vegetales una tercera secuencia de acidos nucleicos que codifica una protelna de transcriptasa inversa fusionada a un segundo peptido de transito de plastidio, en el que la tercera secuencia de acidos nucleicos se une operablemente a un promotor nuclear de planta que acciona la expresion en un nucleo de celulas vegetales;
    en el que el casete de transgen de plastidio de planta comprende:
    i) una secuencia de flanqueo izquierda y una secuencia de flanqueo derecha seleccionada de secuencias de nucleotidos para recombinacion homologa en los plastidios; y
    ii) por lo menos un acido nucleico aislado de interes.
  2. 2. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el casete de transgen de plastidio de planta comprende por lo menos un promotor especlfico de plastidio y por lo menos una secuencia terminadora especlfica de plastidio.
  3. 3. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 o reivindicacion 2, en el que dicha secuencia de acidos nucleicos aislada es una secuencia de ADN recombinante (por ejemplo cADN) o una secuencia de ADN genomica nativa y aislada introducida seleccionada de secuencias de acidos nucleicos de mamlfero o planta aisladas.
  4. 4. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el dominio de union de cebador es aquel del retrotransposon Ty1 de la levadura.
  5. 5. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la secuencia de PTS se selecciona de viroides de ARN desnudos, virus, dominios de union a protelna de cubierta viral, ARN de intron del grupo I y grupo II, sitios de union de cebador de retrotransposon, o ARN que alberga un dominio es decir se reconoce por protelnas de union de ARN, tales como la PTS derivada de intron del grupo II del intron LtrB de Lactococus lactis.
  6. 6. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la secuencia de acidos nucleicos de transcriptasa inversa de plastidio se selecciona de ARN de retrotransposon o ARN retroviral tal como del retrotransposon Ty1 de levadura, por ejemplo, transcriptasa-RNasa H inversa.
  7. 7. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el peptido de transito de cloroplasto de la segunda y tercera secuencia de acidos nucleicos se selecciona independientemente de la protelna rsbc-cTP de tabaco y la protelna HSP70-cTP de Arabidopsis.
  8. 8. Un metodo para producir por lo menos una especie de ARN heterologa o exogena en una planta, el metodo comprende:
    1) introducir en el nucleo de una celulas vegetales regenerable una secuencia de acidos nucleicos que comprende un promotor nuclear de planta ligado operablemente a una primera secuencia de acidos nucleicos que comprende un casete de transgen de plastidio de planta, una secuencia de traslocacion de plastidios de planta es decir una secuencia de ARN capaz de unirse a una protelna de union de PTS de planta, y un dominio de union de cebador seleccionado de aquel de un retrotransposon o retrovirus;
    2) introducir en el nucleo de dicha celulas vegetales regenerable una segunda secuencia de acidos nucleicos que codifica una protelna de union de secuencia de translocacion fusionada a un peptido de transito de plastidio de planta, en el que dicha segunda secuencia de acidos nucleicos se une operablemente a un promotor nuclear de planta;
    3) introducir en el nucleo de dicha celulas vegetales regenerable una tercera secuencia de acidos nucleicos que codifica
    una protelna de transcriptasa inversa fusionada a un peptido de transito de plastidio de planta, en el que la tercera secuencia de acidos nucleicos se une operablemente a un promotor nuclear de planta;
    4) hacer crecer dicha celulas vegetales regenerable de las etapas 1) a 3);
    5) seleccionar una celulas vegetales de (4), en la que el transgen comprendido dentro del casete de transgen de 5 plastidio de planta se integra en el genoma de plastidio;
    6) regenerar una planta de la celulas vegetales de (5); y
    7) hacer crecer la planta de (6), en la que la especie de ARN heterologa o exogena codificada por el transgen es decir integrada en el plastidio se expresa como una protelna heterologa o exogena.
  9. 9. Uso de una secuencia de polinucleotidos aislada que comprende un promotor nuclear de planta ligado operablemente 10 a una primera secuencia de acidos nucleicos que comprende un casete de transgen de plastidio de planta, una
    secuencia de traslocacion de plastidios de planta, y un dominio de union de cebador, en un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
  10. 10. Uso de una secuencia de polinucleotidos aislada que codifica una secuencia de traslocacion de protelna de union a plastidios fusionada a un peptido de transito de plastidio de planta, en el que la secuencia de polinucleotidos se une
    15 operablemente a un promotor nuclear de planta, en un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
  11. 11. Uso de una secuencia de polinucleotidos aislada que codifica una protelna de transcriptasa inversa fusionada a un peptido de transito de plastidio de planta en el que la secuencia de polinucleotidos se une operablemente a un promotor nuclear de planta, en un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
    20 12. Uso de una secuencia de polinucleotidos aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, que
    comprende ADN o cADN genomico.
  12. 13. Un metodo para producir una planta, el metodo incluye incorporar un polinucleotido como se define en cada una de las reivindicaciones 9 a 12 en un nucleo de celulas vegetales y regenerar una planta a partir de dicha celula.
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