JP2013511720A - ヒトｎｔプロｂ型ナトリウム利尿ペプチド、ヒトプロｂ型ナトリウム利尿ペプチドおよびヒトｂ型ナトリウム利尿ペプチドのためのアッセイ - Google Patents

Abstract

本発明は、試験試料中のヒトＮＴプロＢ型ナトリウム利尿ペプチド、ヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチドおよびヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドの量を検出および／または定量するためのアッセイに関する。

Description

一態様において、本発明は、試験試料から得られたアリコート中のヒトＮＴプロＢ型ナトリウム利尿ペプチド、ヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチドおよびヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドの量を検出および／または定量するためのアッセイに関する。別の態様において、本発明は、試験試料中のヒトＮＴプロＢ型ナトリウム利尿ペプチド、ヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチドおよびヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドの量を検出および／または定量するためのアッセイに使用される免疫診断試薬に関する。さらに別の態様において、本発明は、試験試料中のヒトＮＴプロＢ型ナトリウム利尿ペプチド、ヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチドおよびヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドの量を検出および／または定量するためのアッセイの実施に使用されるキットに関する。

心房性ナトリウム利尿ペプチド（以下、「ＡＮＰ」）、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（以下、「ＢＮＰ」と言う）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（以下、「ＣＮＰ」）およびマンバ（Ｄｅｎｄｒｏａｓｐｉｓ）ナトリウム利尿ペプチド（以下、「ＤＮＰ」）は、それぞれ「ナトリウム利尿ペプチド」と呼ばれるホルモンファミリーのメンバーである。ＡＮＰとＢＮＰは広範な生物学的性質を共有し、心臓由来ナトリウム利尿系に属する。ＡＮＰとＢＮＰは両方とも心筋細胞に由来し、ＣＮＰは内皮細胞に由来する。ＤＮＰはグリーンマンバヘビの毒から単離され、ＡＮＰ、ＢＮＰおよびＣＮＰと構造的類似性を有する。

ＡＮＰは心臓により心房内で分泌される。ＡＮＰは２個のシステイン残基間のジスルフィド結合により閉環した１７アミノ酸環を有する。環内の１７個のアミノ酸のうちの１１個は、ＡＮＰ、ＢＮＰ、ＣＮＰおよびＤＮＰ間で保存されている。１７アミノ酸環構造に加え、ＡＮＰは６アミノ酸のアミノ末端尾部および５アミノ酸のカルボキシ末端尾部を有する。ＡＮＰは、ＡＮＰの主要保存形態である１２６アミノ酸プロＡＮＰ形態として産生される。アミノ酸９８および９９間のタンパク質分解開裂後、冠静脈洞血漿中に成熟２８アミノ酸ペプチドＡＮＰが見出される（Ｙａｎｄｌｅ，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄ．，２３５：５６１−５７６（１９９４）参照。）。

ＢＮＰは、最初にブタの脳から単離されたことから命名され、従って、当初は「ＢＮＰ」は「脳性ナトリウム利尿ペプチド」を意味した。しかしながら、ＢＮＰは心臓由来ナトリウム利尿系に属することが見出されたため、「脳（ｂｒａｉｎ）」という単語は「Ｂ型」に変更された。従って、「ＢＮＰ」は現在では「Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド」を指す。ヒトにおいて、ＢＮＰは心臓により冠静脈洞を通って主に心室から分泌される。ヒトＢＮＰのプレプロペプチド前駆体（以下、「ヒトプレプロＢＮＰ」）は１３４アミノ酸長（配列番号１）であり、酵素により開裂されて１０８アミノ酸長（配列番号２）のＢＮＰのヒトプロペプチド（以下、「ヒトプロＢＮＰ」）を遊離させる短いシグナルペプチドを含む。ヒトプロＢＮＰはさらに開裂され、７６アミノ酸長（配列番号３）のヒトＢＮＰのＮ末端プロペプチド（以下、「ヒトＮＴ−プロＢＮＰ」）および３２アミノ酸長（配列番号４）の活性ホルモン、ヒトＢＮＰ（以下、「ｈＢＮＰ」または「ｈＢＮＰ−３２」）となる。ヒトＮＴ−プロＢＮＰ、ｈＢＮＰ−３２、およびヒトプロＢＮＰはそれぞれ、ヒト血漿中で循環し得ることが示唆されている（Ｔａｔｅｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１８５：７６０−７（１９９２）；Ｈｕｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２１４：１１７５−８３（１９９５）参照。）。

ＣＮＰは最初に脳内で見出されたが、この大半は内皮細胞および腎細胞に由来する。ＣＮＰは、脈管構造、脳、骨および内皮に広く分布している。ＣＮＰは、心臓内に存在するとしても僅かである。プロＣＮＰは１０３アミノ酸ペプチドであり、活性ペプチドであるＣＮＰ−５３（アミノ酸５１から１０３）またはＣＮＰ−２２（アミノ酸８２から１０３）にプロセシングされる。ＡＮＰと同様に、ＣＮＰはシステイン残基間のジスルフィド結合により閉環した１７アミノ酸環を有する。この１７アミノ酸環構造に加え、ＣＮＰ−２２は５アミノ酸のアミノ末端尾部を有し、カルボキシ末端尾部を含有しない。ＣＮＰ−５３はアミノ末端の３１アミノ酸延長部を除いてＣＮＰ−２２と同一である。

上記のとおり、ＤＮＰはグリーンマンバヘビの毒から単離された。ＤＮＰの成熟形態は３８アミノ酸から構成される。ヒト血漿中でＤＮＰ様免疫反応性（ＤＮＰ−ＬＩ）が報告されており、鬱血性心不全患者ではＤＮＰ−ＬＩの血漿濃度が上昇していることが見出されている（Ｃａｔａｌｉｏｔｔｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．，７６：１１１−１１１９（２００１）参照。）。さらに、合成ＤＮＰの注入が、血漿および尿中の環状グアノシン一リン酸の増加に伴う顕著なナトリウム利尿および利尿をもたらすことが知られている。同上参照。

ヒトにおいて、心疾患がＡＮＰおよびＢＮＰの分泌を刺激し得る。実際に、ヒトにおけるＡＮＰおよびＢＮＰの分泌は、典型的には心機能の変化を反映する。具体的には、ＡＮＰの分泌は典型的には心房に負荷がかかっているときに加速され、ＢＮＰの生合成および分泌は心室に負荷がかかっているときに刺激される。従って、ＡＮＰとＢＮＰは両方とも心疾患の診断における指標として有用である。しかしながら、このことにかかわらず、徐々に、ＢＮＰはＡＮＰよりも心疾患の診断における有用な指標として認識されるようになっている。例えば、ＢＮＰの血中濃度は正常対象においてはＡＮＰの１／６にすぎないが、心不全の患者においてはＡＮＰよりも高くなる。さらに、心不全の症例においてはＢＮＰの血中濃度はＡＮＰと同様に増加し、ＢＮＰの血漿濃度はＡＮＰを超過することが多く、こうして心機能不全の重篤度をより正確に反映する。さらに、心不全患者のＢＮＰレベルは健常対象の数十倍から数百倍まで増加することもある。

ヒトプロＢＮＰ、ヒトＮＴ−プロＢＮＰおよびｈＢＮＰは循環し得、心血管疾患、特に心不全の患者の試験試料中で検出することができることが知られている。ｈＢＮＰとヒトＮＴ−プロＢＮＰは両方とも心不全を検出し、患者におけるその危険を評価するためのマーカーとして多用されている。しかしながら、循環する個々の型のＢＮＰ（即ちヒトプロＢＮＰ、ヒトＮＴ−プロＢＮＰおよびヒトＢＮＰ）のそれぞれの実際の量はこれらの種々の型の現行市販アッセイの交差反応性に起因して不明である（Ｌｉａｎｇ Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，４９（１０）：１０７１−１０７８（２００７）参照。）。

さらに、ヒトプロＢＮＰおよびヒトＮＴ−プロＢＮＰは糖鎖付加され得ることが公知であり（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｕ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，４５１：１６０−１６６（２００６）参照。）、これらの糖鎖付加体はヒト試料から単離されている（Ｈａｍｍｅｒｅｒ−Ｌｅｒｃｈｅｒ Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５４（５）：８５８−８６５（２００８）：およびＳｅｆｅｒｉａｎ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５４（５）：８６６−８７３（２００８）参照。）。ペプチドのＮ末端部分内の３６アミノ酸領域（アミノ酸３６から７１）に限られた７個の考えられる糖鎖付加部位が存在する。この領域に対して生成された抗体は１）抗体を産生するために使用する免疫原；および２）分析物の糖鎖付加の有無に応じて、分析物ヒトプロＢＮＰまたはＮＴプロＢＮＰを含有する試料と結合する場合と結合しない場合がある。ヒトプロＢＮＰおよびＮＴプロＢＮＰのための任意選択アッセイはこれらの領域を避ける抗体を使用すべきである。

Ｙａｎｄｌｅ，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄ．，２３５：５６１−５７６（１９９４） Ｔａｔｅｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１８５：７６０−７（１９９２） Ｈｕｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２１４：１１７５−８３（１９９５） Ｃａｔａｌｉｏｔｔｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．，７６：１１１−１１１９（２００１） Ｌｉａｎｇ Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，４９（１０）：１０７１−１０７８（２００７） Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｕ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，４５１：１６０−１６６（２００６） Ｈａｍｍｅｒｅｒ−Ｌｅｒｃｈｅｒ Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５４（５）：８５８−８６５（２００８） Ｓｅｆｅｒｉａｎ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５４（５）：８６６−８７３（２００８）

上記に鑑み、試験試料中のヒトＮＴ−プロＢＮＰ、ヒトプロＢＮＰおよびヒトＢＮＰの量を同時に定量することができる新規アッセイが当分野において必要とされている。本発明は、新規アッセイおよび方法を提供することを目的とする。本発明はまた、このようなアッセイおよび方法に使用されるキットを提供することを目的とする。本方法およびキットは、ヒトＮＴ−プロＢＮＰ、ヒトプロＢＮＰおよびヒトＢＮＰのための定性または定量アッセイにおいて使用することができる。これらおよび他の目的および利点、並びに他の追加的な特徴は本明細書に提供される詳細な説明から明らかとなる。

一態様において、本発明は、ヒトＮＴ−プロＢＮＰ、ヒトプロＢＮＰおよびｈＢＮＰについて試験する試験試料またはこれらを含有している疑いのある試験試料中に存在するヒトＮＴプロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（「ヒトＮＴ−プロＢＮＰ」）、ヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（「ヒトプロＢＮＰ」）およびヒト脳性ナトリウム利尿ペプチド（ｈＢＮＰ）の量を定量するための免疫アッセイに関する。本方法は：
（ａ）試験試料（例えば、試験試料に由来するまたは試験試料から得られたアリコートなど）を、（ｉ）ヒトＮＴ−プロＢＮＰと結合し、第１の固定化抗体を生成するために固相上に固定化されている第１の捕捉抗体と接触させ、第１の捕捉抗体−ヒトＮＴ−プロＢＮＰ複合体を含む第１の混合物を形成し；（ｉｉ）ヒトプロＢＮＰと結合し、第２の固定化抗体を生成するために固相上に固定化されている第２の捕捉抗体と接触させ、第２の捕捉抗体−ヒトプロＢＮＰ複合体を含む第２の混合物を形成し；（ｉｉｉ）ヒトプロＢＮＰと結合することに加え、ｈＢＮＰにも結合し、第３の固定化抗体を生成するために固相上で固定化されている該第２の捕捉抗体と接触させ、第２の捕捉抗体−ヒトｈＢＮＰ複合体を含む第３の混合物を形成する工程（前記第１の捕捉抗体は抗体１５Ｆ１１を含み、該第２の捕捉抗体は抗体８．１を含む。）；
（ｂ）ヒトＮＴ−プロＢＮＰと結合し、検出可能標識にコンジュゲートされている第１の検出抗体と、該第１の捕捉抗体−ヒトＮＴ−プロＢＮＰ複合体を含む前記第１の混合物を、接触させて、第１の捕捉抗体−ヒトＮＴ−プロＢＮＰ−第１の検出抗体複合体を含む第４の混合物を形成する工程（該第１の検出抗体は１５Ｃ４である。）；
（ｃ）ヒトＮＴ−プロＢＮＰと結合することに加え、ヒトプロＢＮＰにも結合し検出可能標識にコンジュゲートされている該第１の検出抗体と、該第２の捕捉抗体−ヒトプロＢＮＰ複合体を含む前記第２の混合物を、接触させて、第２の捕捉抗体−ヒトプロＢＮＰ−第１の検出抗体複合体を含む第５の混合物を形成する工程（該第１の検出抗体は１５Ｃ４である。）；
（ｄ）ｈＢＮＰと結合し、検出可能標識にコンジュゲートされている第２の検出抗体と、該第２の捕捉抗体−ヒトｈＢＮＰ複合体を含む前記第３の混合物を、接触させて、第２の捕捉抗体−ｈＢＮＰ−第２の検出抗体複合体を含む第６の混合物を形成する工程（該第２の検出抗体は抗体２０１．３である。）；
（ｅ）（ｉ）該試験試料中に含有されるヒトＮＴ−プロＢＮＰの量の尺度として該検出可能標識を検出することにより、工程（ｂ）において形成された第１の捕捉抗体−ヒトＮＴ−プロＢＮＰ−第１の検出抗体複合体の量を測定し；（ｉｉ）該試験試料中に含有されるヒトプロＢＮＰの量の尺度として該検出可能標識を検出することにより、工程（ｃ）において形成された該第２の捕捉抗体−ヒトプロＢＮＰ−第１の検出抗体複合体の量を測定し；（ｉｉｉ）該試験試料中に含有されるｈＢＮＰの量の尺度として該検出可能標識を検出することにより、工程（ｄ）において形成された該第２の捕捉抗体−ｈＢＮＰ−第２の検出抗体複合体の量を測定する工程
を含む。

または、上記方法において、試験試料から得られたまたは試験試料に由来する第１のアリコートを第１の捕捉抗体と接触させて第１の捕捉抗体−ヒトＮＴ−プロＢＮＰ複合体を形成することができる。試験試料から得られたまたは試験試料に由来する第２のアリコートを第２の捕捉抗体と接触させて第２の捕捉抗体−ヒトプロＢＮＰ複合体を形成することができる。試験試料から得られたまたは試験試料に由来する第３のアリコートを第２の捕捉抗体と接触させて第２の抗体−ｈＢＮＰ複合体を形成することができる。

上記免疫アッセイにおいて、固相は磁気粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、膜、足場分子、フィルム、ろ紙、ディスク、およびチップからなる群から選択される。

上記免疫アッセイにおいて、第１の検出抗体の検出可能標識は、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識、温度測定標識（ｔｈｅｒｍｏｍｅｔｒｉｃ ｌａｂｅｌ）、および免疫ポリメラーゼ連鎖反応標識からなる群から選択される。第２の検出抗体の検出可能標識は、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識、温度測定標識、および免疫ポリメラーゼ連鎖反応標識からなる群から選択される。

別の態様において、本発明の免疫アッセイは、ヒトＮＴ−プロＢＮＰ、ヒトプロＢＮＰおよびｈＢＮＰについて試験する試験試料またはこれらを含有している疑いのある試験試料中に存在するヒトＮＴ−プロＢＮＰ、ヒトプロＢＮＰおよびｈＢＮＰの量を定量する方法に関する。本方法は：
（ａ）試験試料を（ｉ）ヒトＮＴ−プロＢＮＰと結合し、検出可能標識にコンジュゲートされている第１の検出抗体と接触させてヒトＮＴ−プロＢＮＰ−第１の検出抗体複合体を含む第１の混合物を形成し；（ｉｉ）ヒトＮＴ−プロＢＮＰと結合することに加え、ヒトプロＢＮＰにも結合し、検出可能標識にコンジュゲートされている該第１の検出抗体と接触させてヒトプロＢＮＰ−第１の検出抗体複合体を含む第２の混合物を形成し；（ｉｉｉ）ｈＢＮＰと結合し、検出可能標識にコンジュゲートされている第２の検出抗体と接触させてｈＢＮＰ−第２の検出抗体複合体を含む第３の混合物をさらに形成する工程（該第１の検出抗体は抗体１５Ｃ４であり、該第２の検出抗体は抗体２０１．３である。）；
（ｂ）ヒトＮＴ−プロＢＮＰ−第１の検出抗体複合体を含む前記第１の混合物を、ヒトＮＴ−プロＢＮＰと結合し、第１の固定化抗体を生成するために固相上で固定化されている第１の捕捉抗体と接触させて第１の捕捉抗体−ヒトＮＴ−プロＢＮＰ−第１の検出抗体複合体を含む第４の混合物を形成する工程（前記第１の捕捉抗体は抗体１５Ｆ１１を含む。）；
（ｃ）ヒトプロＢＮＰ−第１の検出抗体複合体を含む該第２の混合物を、ヒトプロＢＮＰと結合し、第２の固定化抗体を生成するために固相上で固定化されている第２の捕捉抗体と接触させて第２の捕捉抗体−ヒトプロＢＮＰ−第１の検出抗体複合体を含む第５の混合物を形成する工程（前記第２の捕捉抗体は抗体８．１を含む。）；
（ｄ）ｈＢＮＰ−第２の検出抗体複合体を含む該第３の混合物を、ヒトプロＢＮＰと結合することに加え、ｈＢＮＰにも結合し、第３の固定化抗体を生成するために固相上に固定化されている第２の捕捉抗体と接触させて第２の捕捉抗体−ｈＢＮＰ−第２の検出抗体複合体を含む第６の混合物を形成する工程（前記第２の捕捉抗体は抗体８．１を含む。）；および
（ｅ）（ｉ）該試験試料中に含有されるヒトＮＴ−プロＢＮＰの量の尺度として該検出可能標識を検出することにより、工程（ｂ）において形成された第１の捕捉抗体−ヒトＮＴ−プロＢＮＰ−第１の検出抗体複合体の量を測定し；（ｉｉ）該試験試料中に含有されるヒトプロＢＮＰの量の尺度として該検出可能標識を検出することにより、工程（ｃ）において形成された該第２の捕捉抗体−ヒトプロＢＮＰ−第１の検出抗体複合体の量を測定し；（ｉｉｉ）該試験試料中に含有されるｈＢＮＰの量の尺度として該検出可能標識を検出することにより、工程（ｄ）において形成された該第２の捕捉抗体−ｈＢＮＰ−第２の検出抗体複合体の量を測定する工程
を含む。

または、上記方法において、試験試料から得られたまたは試験試料に由来する第１のアリコートを第１の検出抗体と接触させてヒトＮＴ−プロＢＮＰ−第１の検出抗体複合体を形成することができる。試験試料から得られたまたは試験試料に由来する第２のアリコートを第１の検出抗体と接触させてヒトプロＢＮＰ−第１の検出抗体複合体を形成することができる。試験試料から得られたまたは試験試料に由来する第３のアリコートを第２の検出抗体と接触させてｈＢＮＰ−第２の検出抗体複合体を形成することができる。

上記免疫アッセイにおいて、固相は磁気粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、膜、足場分子、フィルム、ろ紙、ディスク、およびチップからなる群から選択される。

上記免疫アッセイにおいて、第１の検出抗体の検出可能標識は、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識、温度測定標識、および免疫ポリメラーゼ連鎖反応標識からなる群から選択される。第２の検出抗体の検出可能標識は、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識、温度測定標識、および免疫ポリメラーゼ連鎖反応標識からなる群から選択される。

さらに別の態様において、本発明は免疫診断試薬に関する。具体的には、本発明の免疫診断試薬は：
（ａ）ヒトＮＴプロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（「ヒトＮＴ−プロＢＮＰ」）に特異的な第１の捕捉抗体；
（ｂ）ヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（「ヒトプロＢＮＰ」）およびヒト脳性ナトリウム利尿ペプチド（「ｈＢＮＰ」）にそれぞれ特異的な第２の捕捉抗体；
（ｃ）ヒトＮＴ−プロＢＮＰおよびヒトプロＢＮＰにそれぞれ特異的な第１の検出抗体；
（ｄ）ｈＢＮＰに特異的な第２の検出抗体
を含む。

上記キットにおける免疫診断試薬として使用することができる第１の捕捉抗体の例は、抗体１５Ｆ１１である。上記キットにおける免疫診断試薬として使用することができる第２の捕捉抗体の例は、抗体８．１である。

上記キットにおける免疫診断試薬として使用することができる第１の検出抗体は、抗体１５Ｃ４である。上記キットにおける免疫診断試薬として使用することができる第２の検出抗体の例は、抗体２０１．３である。

さらに別の態様において、本発明は、試験試料中のヒトＮＴ−プロＢＮＰ、ヒトプロＢＮＰおよびｈＢＮＰの量を定量または検出するためのアッセイにおいて使用されるキットであって、前記キットは：
（ａ）該試験試料の該アッセイを実施するための取扱説明書と；
（ｂ）（ｉ）ヒトＮＴ−プロＢＮＰに特異的な第１の捕捉抗体；
（ｉｉ）ヒトプロＢＮＰおよびｈＢＮＰにそれぞれ特異的な第２の捕捉抗体；
（ｉｉｉ）ヒトＮＴ−プロＢＮＰおよびヒトプロＢＮＰにそれぞれ特異的な第１の検出抗体；
（ｉｖ）ｈＢＮＰに特異的な第２の検出抗体
を含む免疫診断試薬
を含むキットに関する。

上記キットにおいて免疫診断試薬として使用することができる第１の捕捉抗体の例は、抗体１５Ｆ１１である。上記キットにおいて免疫診断試薬として使用することができる第２の捕捉抗体の例は、抗体８．１である。

上記キットにおいて免疫診断試薬として使用することができる第１の検出抗体は、抗体１５Ｃ４である。上記キットにおいて免疫診断試薬として使用することができる第２の検出抗体の例は、抗体２０１．３である。

実施例１に記載の本発明の免疫アッセイの結果を示す図である。 実施例１に記載の本発明の免疫アッセイの結果を示す図である。 実施例１に記載の本発明の免疫アッセイの結果を示す図である。 実施例１に記載の本発明の免疫アッセイを使用して検出されたエピトープを示す図である。 実施例１に記載の本発明の免疫アッセイを使用して検出されたエピトープを示す図である。

本発明は、ヒトＮＴ−プロＢＮＰ、ヒトプロＢＮＰおよびｈＢＮＰについて試験する試験試料またはこれらを含有している疑いのある試験試料中に存在する（１）ヒトＮＴプロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（「ヒトＮＴ−プロＢＮＰ」）；（２）ヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（「ヒトプロＢＮＰ」）；および（３）ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド（「ｈＢＮＰ」）の量を同時に検出または定量するための免疫アッセイに関する。さらに別の実施形態において、本発明は、ヒトＮＴ−プロＢＮＰに特異的な少なくとも１種の第１の捕捉抗体；ヒトプロＢＮＰおよびｈＢＮＰにそれぞれ特異的な少なくとも１種の第２の捕捉物、ヒトＮＴ−プロＢＮＰおよびヒトプロＢＮＰにそれぞれ特異的な少なくとも１種の第１の検出抗体並びにｈＢＮＰに特異的な少なくとも１種の第２の検出抗体を含む免疫診断試薬に関する。さらに別の実施形態において、本発明は免疫アッセイを実施するためのキットに関する。このようなキットは、このような免疫アッセイを実施するための取扱説明書および上記免疫診断試薬を含むことができる。

Ａ．定義
本明細書において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」はそうでないことが内容から明白である場合を除き、複数形の対象が含まれる。本明細書における数値範囲の記述については、同程度の精度でこの範囲内の各数値を明確に想定する。例えば、６から９の範囲については、６および９に加えて数値７および８を想定し、６．０から７．０の範囲については、数値６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９および７．０が明確に想定する。

ａ）抗体
本明細書において使用される場合、用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」および「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体（完全または部分ヒト化）、動物抗体（一態様において、トリ（例えば、アヒルまたはガチョウ）、別の態様において、サメまたはクジラ、さらに別の態様において、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウスなど）および非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、チンパンジーなどのサル）を含む哺乳動物）、組換え抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆａｂ’’断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む。）、並びに上記のいずれかの機能的に活性なエピトープ結合断片を指す。特に、抗体には、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性断片、即ち、抗原結合部位を含有する分子が含まれる。免疫グロブリン分子は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１およびＩｇＡ_２）またはサブクラスとすることができる。

ｂ）１５Ｃ４
本明細書において使用される場合、用語「１５Ｃ４」は、ＨｙＴｅｓｔ（Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）（カタログ番号４ＮＴ１）から入手可能な、配列番号３のアミノ酸残基６３から７１と結合するＩｇＧ１モノクローナル抗体を指す。

ｃ）１５Ｆ１１
本明細書において使用される場合、用語「１５Ｆ１１」は、ＨｙＴｅｓｔ（Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）（カタログ番号４ＮＴ１）から入手可能な、配列番号３のアミノ酸残基１３から２４と結合するＩｇＧ２ｂモノクローナル抗体を指す。

ｄ）２４Ｅ１１
本明細書において使用される場合、用語「２４Ｅ１１」は、ＨｙＴｅｓｔ（Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）（カタログ番号４ＮＴ１）から入手可能な、配列番号３のアミノ酸残基６７から７６と結合するＩｇＧ２ａモノクローナル抗体を指す。

ｅ）８．１
本明細書において使用される場合、「８．１」は、１９９６年２月２１日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）に寄託され、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．アクセッション番号ＨＢ−１２０５６を付与されたハイブリドーマ細胞系８．１により産生されるモノクローナル抗体またはこの誘導体を指す。８．１および８．１の作製方法は、内容が参照により本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，１６２，９０２に記載されている。８．１は、ｈＢＮＰ上のアミノ酸残基２６から３２を含むエピトープと結合する。

ｆ）２０１．３
本明細書において使用される場合、「２０１．３」は、１９９６年２月１４日にＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に寄託され、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．アクセッション番号ＨＢ−１２０４５を付与されたハイブリドーマ細胞系２０１．３により産生されるモノクローナル抗体またはこの誘導体を指す。２０１．３および２０１．３の作製方法は、内容が参照により本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，１６２，９０２に記載されている。２０１．３は、ｈＢＮＰ上のアミノ酸残基１から１０を含むエピトープと結合する。

ｇ）エピトープ
本明細書において使用される場合、用語「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」または「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅｓ）」は、対象において抗原活性または免疫原生活性を有するポリペプチドまたはタンパク質の部位または断片を指す。免疫原生活性を有するエピトープは、動物において抗体応答を誘発するポリペプチドまたはタンパク質の部位または断片である。抗原活性を有するエピトープは、当業者に周知の任意の方法、例えば、免疫アッセイにより判定した場合に、抗体が免疫特異的と結合するポリペプチドまたはタンパク質の部位または断片である。

ｈ）ヒト脳性ナトリウム利尿ペプチド
本明細書において使用される場合、用語「ヒト脳性ナトリウム利尿ペプチド」、「ヒトＢＮＰ」、「ｈＢＮＰ」、「ｈＢＮＰ−３２」、「ｈＢＮＰペプチド」、「ｈＢＮＰポリペプチド」、または「Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する３２アミノ酸分子を指す。配列番号４に示されるアミノ酸配列は、ヒトプロＢＮＰの１０８アミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸残基７７から１０８により表される。

ｉ）免疫診断試薬
本明細書において使用される場合、用語「免疫診断試薬」は、ヒトＮＴ−プロＢＮＰ、（２）ヒトプロＢＮＰ、（３）ヒトＢＮＰ、または（４）（１）、（２）若しくは（３）の任意の組合せのある領域（例えばエピトープ）に特異的と結合する１種以上の抗体を指す。

ｊ）ヒトＢＮＰのプレプロペプチド前駆体
本明細書において使用される場合、用語「ヒトＢＮＰのプレプロペプチド前駆体」または「ヒトプレプロＢＮＰ」は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する１３４アミノ酸分子を指す。

ｋ）ヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチド
本明細書において使用される場合、語句「ヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチド」または「ヒトプロＢＮＰ」は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する１０８アミノ酸分子を指す。ヒトプロＢＮＰは、ヒトプレプロＢＮＰから誘導される。

ｌ）ヒトＮ末端プロＢ型ナトリウム利尿ペプチド
本明細書において使用される場合、語句「ヒトＮ末端プロＢ型ナトリウム利尿ペプチド」または「ヒトＮＴ−プロＢＮＰ」は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する７６アミノ酸分子を指す。ヒトＮＴ−プロＢＮＰは、ヒトプロＢＮＰ（配列番号２）から誘導される。

ｍ）対象
本明細書において使用される場合、用語「対象」および「患者」は、同じ意味で使用されるが、本発明の対象は、必ずしも免疫アッセイ時に医療治療を受けているかまたは受けたことがある必要はない。本明細書において使用される場合、用語「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）および「対象（ｓｕｂｊｅｃｔｓ）」は、動物を意味し、一態様において、トリ（例えばアヒルまたはガチョウ）、別の態様において、サメまたはクジラ、さらに別の態様において、非霊長類（例えばウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、およびマウス）および霊長類（例えばカニクイザル、チンパンジーなどのサル、およびヒト）を含む哺乳動物を指す。対象はヒトが好ましい。

ｎ）試験試料
本明細書において使用される場合、用語「試験試料」は、ヒトＮＴ−プロＢＮＰ、プロＢＮＰおよびｈＢＮＰについて試験する対象およびまたはこれらを含有している疑いのある対象の、組織、血清、血漿、全血、リンパ、ＣＮＳ液、尿または他の体液に由来する生物学的試料を指す。試験試料は、当業者に公知の日常的技術を使用して調製することができる。

Ｂ．免疫アッセイおよび免疫診断試薬
本明細書に簡潔に記載されているとおり、一実施形態において、本発明は、試験試料中の（１）ヒトＮＴ−プロＢＮＰ；（２）ヒトプロＢＮＰ；および（３）ｈＢＮＰの同時定性検出および／または定量のための免疫アッセイに関する。本発明の免疫アッセイは、多数の利益を提供する。第１に、本発明の免疫アッセイにより、試験試料中の（１）ヒトＮＴ−プロＢＮＰ；（２）ヒトプロＢＮＰ；および（３）ｈＢＮＰの同時および特異的検出が可能となる。第２に、本発明の免疫アッセイにより、（１）ヒトＮＴ−プロＢＮＰ；（２）ヒトプロＢＮＰ；および（３）ｈＢＮＰを、同一（または単一）試験試料（単一試験試料に由来するまたは単一試験試料から得られたアリコートを本発明の方法において使用することができる。）中で個々におよび別の１種と関連づけて評価が可能となる。第３に、本発明の免疫アッセイは、試験試料中の３種の異なる分析物（即ち（１）ヒトＮＴ−プロＢＮＰ；（２）ヒトプロＢＮＰ；および（３）ｈＢＮＰ）を検出するために２種の捕捉抗体および２種の検出抗体のみを要求するにすぎず、こうしてこのような免疫アッセイの実施に伴うコストが低減される。

本発明の免疫アッセイは、当分野において公知の任意のフォーマット、例えば限定されるものではないがサンドイッチフォーマットを使用して実施することができる。さらに、本発明の免疫アッセイは、複数の反応器中で実施される。例示的フォーマットにおいて、本発明の免疫アッセイは、３個の別個の反応器中で実施される。換言すると、ヒトＮＴ−プロＢＮＰのための免疫アッセイが１個の反応器中で実施され、ヒトプロＢＮＰのための免疫アッセイが１個の反応器（第２の反応器である。）中で実施され、ｈＢＮＰのための免疫アッセイが１個の反応器（第３の反応器である。）中で実施される。

本発明のある実施形態において、２種の捕捉抗体および２種の検出抗体は、試験試料中のヒト（１）ＮＴプロＢＮＰ；（２）ヒトプロＢＮＰ；および（３）ｈＢＮＰを分離および定量するために用いられる。より具体的には、２種の捕捉抗体および２種の検出抗体は、（１）ヒトＮＴ−プロＢＮＰ；（２）ヒトプロＢＮＰ；および（３）ｈＢＮＰのあるエピトープと結合し、「サンドイッチ」と称される免疫複合体を形成する。一般に、免疫アッセイにおいて、２種の抗体が試験試料中の（１）ヒトＮＴ−プロＢＮＰ；（２）ヒトプロＢＮＰ；および（３）ｈＢＮＰを捕捉するために使用され（これらの抗体は、「捕捉」抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）または「捕捉」抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）と称されることも多い。）、２種の抗体が検出可能（即ち定量可能）標識をサンドイッチと結合させるために使用される（これらの抗体は、「検出抗体（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」、「検出抗体（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」、「コンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」または「コンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）」と称されることも多い。）。

本発明者らは、抗体のある組合せを捕捉および検出抗体として使用して優れた免疫アッセイ、特にサンドイッチアッセイを実施することができることを発見した。より具体的には、ヒトＮＴ−プロＢＮＰと結合する第１の捕捉抗体が使用される。第１の捕捉抗体として使用することができるこのような抗体の例は、抗体１５Ｆ１１である。さらに、（１）ヒトプロＢＮＰ；および（２）ｈＢＮＰにそれぞれ結合する第２の捕捉抗体も使用される。使用することができる第２の捕捉抗体の例は、抗体８．１である。

本明細書において既に記載されているとおり、２種の検出抗体が本発明において使用される。第１の検出抗体は、（１）ヒトＮＴ−プロＢＮＰ；および（２）ヒトプロＢＮＰにそれぞれ結合する。使用することができる第１の検出抗体の例は、抗体１５Ｃ４である。さらに、第２の検出抗体は、ｈＢＮＰと結合する抗体である。使用することができる第２の検出抗体の例は、抗体２０１．３である。

（１）ヒトＮＴ−プロＢＮＰ；（２）ヒトプロＢＮＰ；および（３）ｈＢＮＰについて試験する（例えば、これらを含有している疑いのある）試験試料は、２種の捕捉抗体および２種の検出抗体と同時にまたは連続的に任意の順序で接触させることができる。または、試験試料に由来する任意数のアリコート（例えば、限定されるものではないが、試験試料に由来する少なくとも３個のアリコート）を試験することができる。例えば、試験試料を、最初に少なくとも１種の捕捉抗体と接触させ、次いで（連続的に）少なくとも１種の検出抗体と接触させることができる。または、試験試料を最初に少なくとも１種の検出抗体と接触させ、次いで（連続的に）少なくとも１種の捕捉抗体と接触させることができる。さらに別の代替例において、試験試料を捕捉抗体および検出抗体と同時に接触させることができる。

サンドイッチアッセイフォーマットにおいて、（１）ヒトＮＴ−プロＢＮＰ；（２）ヒトプロＢＮＰおよび（３）ｈＢＮＰを含有すると考えられる試験試料を最初に上記２種の捕捉抗体と、以下の複合体の形成を可能とする条件下で接触させる：（ａ）第１の捕捉抗体−ヒトＮＴ−プロＢＮＰ複合体（例えば第１の混合物）；（ｂ）第２の捕捉抗体−ヒトプロＢＮＰ複合体（例えば第２の混合物）；および（ｃ）第２の捕捉抗体−ｈＢＮＰ複合体（例えば第３の混合物）。試験試料の別個のアリコート（例えば少なくとも３個のアリコート）を使用して第１の捕捉抗体−ヒトＮＴ−プロＢＮＰ複合体、第２の捕捉抗体−ヒトプロＢＮＰ複合体および第２の捕捉抗体−ｈＢＮＰ複合体を形成することができる。本明細書において既に記載されているとおり、ヒトＮＴ−プロＢＮＰと結合する少なくとも１種の第１の捕捉抗体が使用される。このような第１の捕捉抗体の例は、１５Ｆ１１である。第２の捕捉抗体は、（１）ヒトプロＢＮＰ；および（２）ｈＢＮＰにそれぞれ結合する。このような第２の捕捉抗体の例は、抗体８．１である。上記複合体を形成するために捕捉抗体を試験試料と接触させる順序は重要ではない。または、試験試料は、（別個の反応器中で）捕捉抗体のそれぞれと同時に接触させることができる。サンドイッチアッセイにおいて、抗体、好ましくは２種の捕捉抗体は、試験試料中で予測される（１）ヒトＮＴ−プロＢＮＰ；（２）ヒトプロＢＮＰおよび（３）ｈＢＮＰの最大量のモル過剰量で使用される。例えば、約５μｇ／ｍＬから約１ｍｇ／ｍＬの１ｍＬ緩衝液（例えば微粒子被覆緩衝液）当たりの抗体を使用することができる。

場合により、試験試料を２種の捕捉抗体と接触させる前に、捕捉抗体の少なくとも１種を、上記複合体（即ち、（ａ）第１の捕捉抗体−ヒトＮＴ−プロＢＮＰ複合体；（ｂ）第２の捕捉抗体−ヒトプロＢＮＰ複合体；および（ｃ）第２の捕捉抗体−ｈＢＮＰ複合体）の試験試料からの分離を促進する固体担体と結合させることができる。さらに、場合により、試験試料を２種の捕捉抗体と接触させる前に、捕捉抗体の全てを、上記複合体（即ち、（ａ）第１の捕捉抗体−ヒトＮＴ−プロＢＮＰ複合体；（ｂ）第２の捕捉抗体−ヒトプロＢＮＰ複合体；および（ｃ）第２の捕捉抗体−ｈＢＮＰ複合体）の試験試料からの分離を促進する固体担体と結合させることができる。限定されるものではないが、ウェル、チューブまたはビーズの形態のポリマー材料製の固体担体を含む当分野において公知の任意の固体担体を使用することができる。抗体は、吸着により、化学カップリング剤を使用する共有結合により、または当分野において公知の他の手段により固体担体と結合させることができるが、このような結合が、抗体の（１）ヒトＮＴ−プロＢＮＰ；（２）ヒトプロＢＮＰ；および（３）ｈＢＮＰへの結合能を妨害しないことを条件とする。または、抗体は、ストレプトアビジンにより事前に被覆された微粒子により結合させることができる（例えば、Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａから入手可能なＰｏｗｅｒ−Ｂｉｎｄ（商標）−ＳＡ−ＭＰストレプトアビジン被覆微粒子を使用）。または、抗体は、抗種特異的モノクローナル抗体により事前に被覆された微粒子を使用して結合させることができる。さらに、必要な場合、固体担体を誘導体化して抗体上の種々の官能基との反応性を可能とすることができる。このような誘導体化は、あるカップリング剤、例えば限定されるものではないが、無水マレイン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの使用を要求する。

（１）ヒトＮＴ−プロＢＮＰ；（２）ヒトプロＢＮＰ；および（３）ｈＢＮＰについて試験する試験試料および／またはこれらを含有している疑いのある試験試料に存在する２種の捕捉抗体と接触させた後、混合物をインキュベートして少なくとも以下の複合体を含有する混合物の形成を可能とする：（ａ）第１の捕捉抗体−ヒトＮＴ−プロＢＮＰ複合体（第１の混合物）；（ｂ）第２の捕捉抗体−ヒトプロＢＮＰ複合体（第２の混合物）；および（ｃ）第２の捕捉抗体−ｈＢＮＰ複合体（第３の混合物）。インキュベーションは、約４．５から約１０．０のｐＨにおいて、約２℃から約４５℃の温度において、少なくとも約１分間から約１８時間、好ましくは約１から２０分間、最も好ましくは約２から４分間の期間実施することができる。本明細書に記載の免疫アッセイは、１工程（試験試料、少なくとも３種の捕捉抗体および少なくとも３種の検出抗体を反応器に全て連続的にまたは同時に添加することを意味する。）または１つ超の工程、例えば２工程、３工程などにおいて実施することができる。

第１の捕捉抗体−ヒトＮＴ−プロＢＮＰ複合体、第２の捕捉抗体−ヒトプロＢＮＰ複合体および第２の捕捉抗体−ｈＢＮＰ複合体を含有する混合物の形成後、次いで複合体を２種の検出抗体と、第１の捕捉抗体−ヒトＮＴ−プロＢＮＰ第１の検出抗体複合体（こうして第４の混合物を形成する。）、第２の捕捉抗体−ヒトプロＢＮＰ第１の検出抗体複合体（こうして第５の混合物を形成する。）および第２の捕捉抗体−ｈＢＮＰ第２の検出抗体複合体（こうして第６の混合物を形成する。）の形成を可能とする条件下で接触させる。第１の捕捉抗体−ヒトＮＴ−プロＢＮＰ複合体および第２の捕捉抗体−ヒトプロＢＮＰ複合体を検出するために使用される検出抗体は、互いに同一である。捕捉抗体（例えば第１の捕捉抗体）に関して、第１の検出抗体を捕捉抗体−ヒトＮＴ−プロＢＮＰ複合体と接触させ、第１の検出抗体を第２の捕捉抗体−ヒトプロＢＮＰ複合体と接触させ、第１の検出抗体を第２の捕捉抗体−ヒトプロＢＮＰ複合体と接触させ、第２の検出抗体を捕捉抗体−ｈＢＮＰ複合体と接触させる場合、上記のものと同様の条件下のインキュベーション期間が、第１の捕捉抗体−ヒトＮＴ−プロＢＮＰ−第１の検出抗体複合体、第２の捕捉抗体−ヒトプロＢＮＰ−第１の検出複合体、第２の捕捉抗体−ｈＢＮＰ−第２の検出抗体複合体またはこれらの組合せの形成に要求される。好ましくは、２種の検出抗体の少なくとも１種は検出可能標識を含有する。最も好ましくは、検出抗体は両方とも検出可能標識を含有する。検出可能標識は、第１の捕捉抗体−ヒトＮＴ−プロＢＮＰ−第１の検出抗体複合体の形成前に、形成と同時にまたは形成後に少なくとも１種の検出抗体（例えば第１の検出抗体）と結合させることができる。当分野において公知の任意の検出可能標識を使用することができる。例えば、検出可能標識は、放射性標識、例えば^３Ｈ、^１２５Ｉ、^３５Ｓ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３３Ｐ、酵素標識、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼなど、化学発光標識、例えばアクリジニウムエステル、ルミノール、イソルミノール、チオエステル、スルホンアミド、フェナントリジニウムエステルなど、蛍光標識、例えばフルオレセイン（５−フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、３’６−カルボキシフルオレセイン、５（６）−カルボキシフルオレセイン、６−ヘキサクロロ−フルオレセイン、６−テトラクロロフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネートなど）、ローダミン、フィコビリタンパク質、Ｒ−フィコエリスリン、量子ドット（硫化亜鉛によりキャップされたセレン化カドニウム）、温度測定標識または免疫−ポリメラーゼ連鎖反応標識であり得る。標識、標識手順および標識の検出の概論は、Ｐｏｌａｋ ａｎｄ Ｖａｎ Ｎｏｏｒｄｅｎ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２^ｎｄｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９９７）およびＨａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（１９９６）（モレキュラー・プローブズ社、ユージーン、オレゴン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）により出版されているハンドブック兼カタログである。）に見出される。さらに、１種超の標識を使用することができる。例えば、それぞれが異なる標識を含有する二重コンジュゲートを使用することができる。例えば、１種のコンジュゲート抗体はビオチンを含有することができ、第２のコンジュゲートはアクリジニウムにより標識されている抗ビオチン抗体であり得る。他のバリエーションは、当業者により容易に認識される。

検出可能標識は、抗体に直接またはカップリング剤を介して結合させることができる。使用することができるカップリング剤の例は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから市販されているＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）である。使用することができる他のカップリング剤は、当分野において知られている。検出可能標識を抗体と結合させる方法は、当分野において知られている。さらに、検出可能標識の抗体へのカップリングを促進する末端基、例えば別名ＣＰＳＰ−アクリジニウムエステルとして公知のＮ１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−アクリジニウム−９−カルボキサミド活性エステルまたは別名ＳＰＳＰ−アクリジニウムエステルとして公知のＮ１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（３−スルホプロピル）−アクリジニウム−９−カルボキサミド活性エステルを既に含有する多くの検出可能標識を購入または合成することができる。

第１の捕捉抗体−ヒトＮＴ−プロＢＮＰ−第１の検出抗体複合体、第２の捕捉抗体−ヒトプロＢＮＰ−第１の検出複合体、第２の捕捉抗体−ｈＢＮＰ−第２の検出抗体複合体のいずれかまたは全てを、必須ではないが、標識の定量前に試験試料の残部から分離することができる。例えば、少なくとも１種の捕捉抗体（例えば第１の捕捉抗体）を固体担体、例えばウェルまたはビーズと結合させる場合、分離は（試験試料の）液を固体担体との接触から除去することにより達成することができる。または、第１の捕捉抗体を固体担体と結合させる場合、第１の捕捉抗体をヒトＮＴ−プロＢＮＰ含有試料および第１の検出抗体と同時に接触させて第１の捕捉抗体−ヒトＮＴ−プロＢＮＰ−第１の抗体複合体を形成し、次いで液（試験試料）を固体担体との接触から除去することができる。第１の捕捉抗体を固体担体と結合させない場合、第１の捕捉抗体−ヒトＮＴ−プロＢＮＰ−第１の検出抗体複合体は、標識の量の定量のために試験試料から除去しなくてよい。または、第２の捕捉抗体を固体担体と結合させる場合、第２の捕捉抗体をヒト捕捉プロＢＮＰ含有試料および第１の検出抗体と同時に接触させて第２の捕捉抗体−ヒトプロＢＮＰ−第２の抗体複合体を形成し、次いで液（試験試料）を固体担体との接触から除去することができる。第２の捕捉抗体を固体担体と結合させない場合、第２の捕捉抗体−ヒトプロＢＮＰ−第１の検出抗体複合体は標識の量の定量のために試験試料から除去しなくてよい。または、第２の捕捉抗体を固体担体と結合させる場合、第２の捕捉抗体をｈＢＮＰ含有試料および第２の検出抗体と同時に接触させて第２の捕捉抗体−ｈＢＮＰ−第２の抗体複合体を形成し、次いで液（試験試料）を固体担体との接触から除去することができる。少なくとも１種の第２の捕捉抗体を固体担体と結合させない場合、第２の捕捉抗体−ｈＢＮＰ−第２の検出抗体複合体は、標識の量の定量のために試験試料から除去しなくてよい。

標識された第１の捕捉抗体−ヒトＮＴ−プロＢＮＰ第１の検出抗体複合体、標識された第２の捕捉抗体−ヒトプロＢＮＰ第１の検出抗体複合体および標識された第２の捕捉抗体−ｈＢＮＰ第２の検出抗体複合体の形成後、複合体のそれぞれの標識の量（従って、第４、第５および第６の混合物のそれぞれ）を当分野において公知の技術を使用して定量する。例えば、酵素標識を使用する場合、標識された複合体を、定量可能反応、例えば発色を付与する標識用基質と反応させる。標識が放射性標識である場合、標識はシンチレーションカウンターを使用して定量する。標識が蛍光標識である場合、標識をある色（「励起波長」として公知）の光により刺激し、刺激に応答して標識により発せられる別の色（「発光波長として公知」）を検出することにより定量する。標識が化学発光標識である場合、目視またはルミノメーター、Ｘ線フィルム、高速写真フィルム、ＣＣＤカメラなどを使用して発光を検出することにより標識を定量する。複合体中の標識の量を定量したら、既知濃度のヒトＮＴ−プロＢＮＰ、ヒトプロＢＮＰおよびｈＢＮＰの希釈系列を使用して作成した標準曲線の使用により試験試料中のヒトＮＴ−プロＢＮＰ、ヒトプロＢＮＰおよびｈＢＮＰの濃度を測定する。ヒトＮＴ−プロＢＮＰ、ヒトプロＢＮＰおよびｈＢＮＰの希釈系列の使用以外に、重量測定、質量分析法および当分野において公知の他の技術により標準曲線を作成することができる。

別の実施形態において、本発明は免疫診断試薬に関する。具体的には、本明細書に記載の少なくとも１種の捕捉抗体（即ち、配列番号３のアミノ酸残基１３から２４を含むまたはこれからなるエピトープと結合する抗体）および少なくとも１種の検出抗体（即ち、配列番号３のアミノ酸残基６３から７１または配列番号３のアミノ酸残基６７から７６を含むまたはこれからなるエピトープと結合する抗体）を個々にまたは組合せにおいて１種以上の免疫診断試薬として１種以上の免疫アッセイ、例えば上記のものにおいて使用することができる。本明細書に記載の少なくとも１種の捕捉抗体および少なくとも１種の検出抗体を免疫アッセイ（例えば、本明細書において既に記載されているもの）において一緒に使用する場合、免疫アッセイは、試験試料中のあらゆるヒトプロＢＮＰについて約１．０％未満の交差反応性を示す。より具体的には、免疫アッセイは、試験試料中に存在し得るあらゆるヒトプロＢＮＰについて約０．９％未満、約０．８％未満、約０．７％未満、約０．６％未満、約０．５％未満、約０．４％未満、約０．３％未満、約０．２％未満、約０．１％未満または約０．００１％未満を示す。

または、本明細書に記載の少なくとも１種の捕捉抗体（即ち、配列番号２のアミノ酸残基１０３から１０８を含むまたはこれからなる１種のエピトープと結合する抗体）および少なくとも１種の検出抗体（即ち、配列番号２の６３から７１を含むまたはこれからなるエピトープと結合する抗体）を個々にまたは組合せにおいて１種以上の免疫診断試薬として１種以上の免疫アッセイ、例えば上記のものにおいて使用することができる。

または、本明細書に記載の少なくとも１種の捕捉抗体（即ち、配列番号４のアミノ酸残基２８から３２を含むまたはこれからなる１種のエピトープと結合する抗体）および少なくとも１種の検出抗体（即ち、配列番号４の１から１０を含むまたはこれからなるエピトープと結合する抗体）を、個々にまたは組合せにおいて１種以上の免疫診断試薬として１種以上の免疫アッセイ、例えば上記のものにおいて使用することができる。

Ｃ．方法の応用
本発明はまた、例えばＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．５，０８９，４２４ ａｎｄ ５，００６，３０９に記載され、例えばＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）から市販されているような種々の自動および半自動システム（固相が微粒子を含む。）における使用のために応用させることができ、このようなシステムとしては限定されるものではないが、Ａｂｂｏｔｔ社のＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）、ＡｘＳＹＭ（登録商標）、ＩＭｘ（登録商標）、ＰＲＩＳＭ（登録商標）、およびＱｕａｎｔｕｍ（商標）ＩＩ機器、並びに他のプラットフォームが挙げられる。さらに、本発明は場合により、サンドイッチ免疫アッセイを実施するためのＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社の市販ポイントオブケア（ｉ−ＳＴＡＴ（商標））電気化学免疫アッセイシステムに応用可能である。免疫センサ、およびこの製造方法並びに使い捨て試験装置における操作方法は、例えばＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，０６３，０８１、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ２００３／０１７０８８１、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ２００４／００１８５７７、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ２００５／００５４０７８、およびＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ２００６／０１６０１６４に記載されており、これらは同一物に関するこの教示について全体として参照により組み込まれる。

Ｄ．典型的キット
本発明はまた、例えばＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）から市販されている自動および半自動システム並びにプラットフォームに使用される種々のキットにおける使用に応用させることができ、このようなシステムおよびプラットフォームとしては限定されるものではないが、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社のＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）、ＡｘＳＹＭ（登録商標）、ＩＭｘ（登録商標）、ＰＲＩＳＭ（登録商標）、およびＱｕａｎｔｕｍ（商標）ＩＩ機器、サンドイッチ免疫アッセイを実施するためのＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社の市販ポイントオブケア（ｉ−ＳＴＡＴ（商標））電気化学免疫アッセイシステム、並びに他のプラットフォームが挙げられる。

このようなキットは、本明細書に記載の免疫診断試薬（例えば、捕捉および検出抗体）の１種以上を含むことができる。より具体的には、キットが免疫アッセイを実施するためのキットである場合、キットは、（１）ヒトＮＴ−プロＢＮＰ、ヒトプロＢＮＰおよびヒトＢＮＰと結合する少なくとも２種の捕捉抗体および２種の検出抗体；並びに（２）免疫アッセイを実施するための１種以上の取扱説明書を場合により含有することができる。本発明の免疫診断試薬は、このような試験キットに捕捉抗体として、検出抗体として、または捕捉抗体と検出抗体の両方として含めることができる。例えば、抗体１５Ｆ１１はキット中に捕捉抗体として含めることができ、抗体１５Ｃ４はキット中に検出抗体として含めることができる。または、抗体１５Ｆ１１は、キット中に捕捉抗体として含めることができ、抗体２４Ｅ１１はキット中に検出抗体として含めることができる。場合により、キットは少なくとも１種の較正物質または対照を含有することもできる。任意の較正物質または対照をキット中に含めることができる。しかしながら好ましくは、較正物質または対照は本明細書に既に記載されているヒトＮＴ−プロＢＮＰ、特に配列番号３、ヒトプロＢＮＰ、特に配列番号４、ｈＢＮＰ、特に配列番号２またはこれらの組合せである。従って、キットは少なくとも１種の較正物質、若しくは少なくとも１種の対照、または少なくとも１種の較正物質および少なくとも１種の対照の組合せを含むことができる。

場合により、キットは品質管理試薬（例えば感度パネル、較正物質、および陽性対照）を含むこともできる。品質管理試薬は当分野において周知であり、例えば種々の免疫診断製品挿入シートに記載されている。ヒトＮＴ−プロＢＮＰ、ヒトプロＢＮＰ、ｈＢＮＰまたはこれらの組合せの感度パネルメンバーは、例えば既知量のヒトＮＴ−プロＢＮＰ抗原、ヒトプロＢＮＰ、ｈＢＮＰまたはこれらの組合せを適切なアッセイ緩衝液（例えばリン酸緩衝液）中にスパイクすることにより、例えば「低い」から「高い」範囲の既知量のヒトＮＴ−プロＢＮＰ抗原、ヒトプロＢＮＰ抗原、ｈＢＮＰ抗原またはこれらの組合せを含有する変動量で場合により調製することができる。これらの感度パネルメンバーは、アッセイ実施特性を確立するために場合により使用され、さらに場合により免疫アッセイキット試薬の統合性、およびアッセイの標準化の有用な指標である。ヒトＮＴ−プロＢＮＰ抗原、ヒトプロＢＮＰ抗原、ｈＢＮＰ抗原またはこれらの組合せは、較正物質として用いることもできる。

キット中で提供される抗体は、例えばフルオロフォア、放射性部分、酵素、ビオチン／アビジン標識、発色団、化学発光標識などの検出可能標識を取り込むことができ、またはキットは抗体を標識するための試薬若しくは抗体（例えば検出抗体）を検出するための、および／または抗原を標識するための試薬、または抗原を検出するための試薬を含むことができる。抗体、較正物質および／または対照は、別個の容器中で提供することができ、または適切なアッセイフォーマット、例えばマイクロタイタープレート中に事前に分注することができる。

さらに別の実施形態において、キットは、１５Ｆ１１、１５Ｃ４、８．１、２０１．３および２４Ｅ１１からなる群から選択される１種以上の抗体を含む免疫診断剤を単独、取扱説明書とともに、または他の態様のキットおよびキット構成成分とともに、含むことができる。

キットは、診断アッセイを実施するまたは品質管理評価を促進するために必要な他の試薬、例えば緩衝液、塩、酵素、酵素補因子、基質、検出試薬などを場合により含むことができる。他の構成成分、例えば試験試料の単離および／または処理のための緩衝液および溶液（例えば前処理試薬）をキット中に含めることもできる。キットは、１種以上の他の対照をさらに含むことができる。キットの構成成分の１種以上は凍結乾燥させることができ、キットは凍結乾燥された構成成分の再構築に好適な試薬をさらに含むことができる。

キットの種々の構成成分は、場合により好適な容器中で提供される。上記のとおり、容器の１種以上はマイクロタイタープレートであり得る。キットは、試料を保持または貯蔵するための容器（例えば血液または尿試料のための容器またはカートリッジ）をさらに含むことができる。必要に応じて、キットは、反応器、混合器および試薬または試験試料の調製を促進する他の構成成分を場合により含有することもできる。キットは、試験試料の採取補助用の１種以上の器具、例えばシリンジ、ピペット、鉗子、計量スプーンなどを含むこともできる。

キットは、紙形態で、または、例えばディスク、ＣＤ、ＤＶＤなどのコンピュータ読み込み可能な形式で提供することができる、使用説明書をさらに場合により含むことができる。

非限定的な例示として本発明の実施例を以下に挙げる。

［実施例１］
ヒトＮＴプロＢ型ナトリウム利尿ペプチド、ヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチドおよびヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドの同時検出および定量
材料、方法および結果
本実施例において、自動ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）システム（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｒｋ，ＩＬ）を使用してヒトＮＴ−プロＢＮＰ、ヒトプロＢＮＰおよびヒトＢＮＰを定量する免疫アッセイを実施した。これらの３種の分析物の検出を、２種のタイプのモノクローナル抗体被覆磁気微粒子および２種のタイプの標識モノクローナル抗体を使用して達成する。

ヒトＮＴ−プロＢＮＰ（０．０ｐＭ−５７７．４ｐＭ）を１０ｍＭのＮａＯＡｃ、１０ｍＭのＤＴＰＡ、２％のＢＳＡ、０．１％のＰｒｏＣｌｉｎ３００、０．１％のＮａＮ３、ｐＨ５．６（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）中に含有するヒトＮＴ−プロＢＮＰ（ＨｙＴｅｓｔ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ；カタログ番号８ＮＴ１）の希釈物を試験した。試験は、自動ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）システムにおいて個々の試験に使用される反応器（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）中で実施した。記載の工程は全て、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）機器中で行った。

ヒトプロＢＮＰ（０．０ｐＭ−５７７．４ｐＭ）を１０ｍＭのＮａＯＡｃ、１０ｍＭのＤＴＰＡ、２％のＢＳＡ、０．１％のＰｒｏＣｌｉｎ３００、０．１％のＮａＮ３、ｐＨ５．６（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）中に含有するヒトプロＢＮＰ（ＨｙＴｅｓｔ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ；カタログ番号８ＰＲＯ８）の希釈物を試験した。試験は、自動ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）システムにおいて個々の試験に使用される反応器（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）中で実施した。記載の工程は全て、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）機器中で行った。

ヒトＢＮＰ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ ＢＮＰ較正物質（リスト８Ｋ２８０２，Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ，）（０．０ｐＭ−５７７．４ｐＭ）を試験した。試験は、自動Ａｂｂｏｔｔ ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）システムにおいて個々の試験に使用される反応器（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）中で実施した。記載の工程は全て、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）機器中で行った。

これらの試料は、記載されている慣用の２工程免疫アッセイフォーマットを使用して試験した。２工程アッセイフォーマットは単一反応器中で行う。２工程アッセイフォーマットは、試料を添加する工程、抗体被覆磁気微粒子を添加する工程、分析物を結合させる工程、磁気微粒子−分析物複合体を洗浄する工程、標識コンジュゲート抗体を添加する工程、標識コンジュゲートを磁気微粒子−分析物複合体と結合させる工程、得られた磁気微粒子−分析物−標識コンジュゲート抗体複合体を洗浄する工程、および反応器中に残留する複合体化標識により生成されたシグナルを読み取る工程を含む。

ヒトＢＮＰ検出
各試料希釈物を個々の反応器中に１００μＬの量で分注した。同時に、抗ヒトＢＮＰ／ヒトプロＢＮＰモノクローナル抗体８．１（Ｓｃｉｏｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ；Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．アクセッション番号ＨＢ−１２０５６）により被覆された０．１０％ＥＤＡＣ−被覆磁気微粒子（５０μＬ）（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ，目下Ｖａｒｉａｎ，Ｉｎｃ．の部門，Ｓｈｒｏｐｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を同一の反応器中に５０μＬの量で分注した。次いで、反応器をボルテックスにかけて試料および磁気微粒子を混合した。各反応混合物を３７℃において１８分間インキュベートした。

このインキュベーションの間、試料中のあらゆるヒトＢＮＰを磁気微粒子上に被覆されたモノクローナル抗体８．１により捕捉した。

１８分間のインキュベーションを完了したら、モノクローナル抗体８．１被覆磁気微粒子およびモノクローナル抗体８．１／ＢＮＰ複合体を磁気的に捕捉し、反応器の側部上でペレット中に固定化した。次いで、固定化された磁気微粒子およびモノクローナル抗体８．１／ＢＮＰ複合体ペレットを、液体を容器から交互に吸引し、次いでアッセイキット洗浄緩衝液（ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）洗浄緩衝液、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬから入手可能である。）を反応器中に添加することにより洗浄した（１ｍＬの洗浄緩衝液、繰り返し４回）。この工程は、あらゆる未結合ヒトＢＮＰを反応混合物から除去した。１８分間のインキュベーションの間に形成された磁気的に捕捉された微粒子、ヒトＢＮＰモノクローナル抗体８．１／ＢＮＰ複合体が反応器中で残留した。次いで、磁気微粒子モノクローナル抗体８．１／ヒトＢＮＰ複合体ペレットを遊離させた。

４分間の第２のインキュベーションの間、抗ヒトＢＮＰ／抗ヒトプロＢＮＰ、アクリジニウム（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ）標識モノクローナル抗体２０１．３（Ｓｃｉｏｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ；Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．アクセッション番号ＨＢ−１２０４５）を、モノクローナル抗体８．１被覆磁気微粒子およびモノクローナル抗体８．１／ＢＮＰ複合体のみを含有する個々の反応器中に５０μＬの量で分注した。次いで、この反応混合物をボルテックスにかけて微粒子ペレットを分散させた。

磁気微粒子およびモノクローナル抗体８．１／ＢＮＰ複合体を、アクリジニウム（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，コード８８３３３）標識抗ヒトＢＮＰ２０１．３モノクローナル抗体と、緩衝液中で３７℃において４分間インキュベートした。このインキュベーションの間、抗ヒトＢＮＰ２０１．３アクリジニウム標識抗体は磁気微粒子／モノクローナル抗体８．１／ＢＮＰ複合体と結合した。

４分間のインキュベーションが完了したら、磁気微粒子／モノクローナル抗体８．１／ヒトＢＮＰ／標識モノクローナル抗体２０１．３およびモノクローナル抗体８．１／ＢＮＰ複合体をペレット中に磁気的に再度捕捉した。次いで、再捕捉されたペレットを緩衝液（１ｍＬ）により、繰り返し４回繰り返し洗浄した。次いで、磁気的に捕捉されたモノクローナル抗体８．１被覆磁気微粒子、ヒトＢＮＰおよび標識モノクローナル抗体２０１．３）およびモノクローナル抗体８．１／ＢＮＰ複合体ペレットを遊離させた。

次いで、アクリジニウム標識（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，コード６１４４４）に発光を誘発させた。このことは、Ｈ_２Ｏ_２（１．３２％）を含有する低ｐＨ（ｐＨ１）緩衝液（リスト６Ｅ２３−６５，Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）を添加することにより達成した。これを、微粒子複合体を含有する個々の反応器中に（１００μＬ）の量で分注し、次いでボルテックスにかけた。この工程は、微粒子により捕捉されたヒトＢＮＰと結合したアクリジニウム標識抗ヒトＢＮＰ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）モノクローナル抗体２０１．３（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）を遊離させた。

次いで、磁気微粒子を磁気的に捕捉し、遊離させたアクリジニウム標識抗ＢＮＰ抗体（モノクローナル抗体２０１．３）を反応混合物溶液中に残した。この後、溶液中に遊離させたアクリジニウムからの産物である光、相対発光単位（ＲＬＵ）を「誘発」するｐＨ１３緩衝液（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）を添加した（３００μＬ）。生成された光の量を使用して試料中で検出されるヒトＢＮＰの量を測定した。

ヒトプロＢＮＰ検出
各試料希釈物を、個々の反応器中に１００μＬの量で分注した。同時に、抗ヒトＢＮＰ／ヒトプロＢＮＰモノクローナル抗体８．１（Ｓｃｉｏｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ；Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．アクセッション番号ＨＢ−１２０５６）により被覆された０．１０％ＥＤＡＣ被覆磁気微粒子（５０μＬ）（（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ，目下Ｖａｒｉａｎ，Ｉｎｃ．の部門，Ｓｈｒｏｐｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を同一の反応器中に５０μＬの量で分注した。次いで、反応器をボルテックスにかけて試料および磁気微粒子を混合した。各反応混合物を３７℃において１８分間インキュベートした。

このインキュベーションの間、試料中のあらゆるヒトプロＢＮＰを磁気微粒子上に被覆されたモノクローナル抗体８．１により捕捉した。

１８分間のインキュベーションを完了したら、モノクローナル抗体８．１被覆磁気微粒子およびモノクローナル抗体８．１／プロＢＮＰ複合体を磁気的に捕捉し、反応器の側部上でペレット中に固定化した。次いで、固定化された磁気微粒子およびモノクローナル抗体８．１／ヒトプロＢＮＰ複合体ペレットを、液体を容器から交互に吸引し、次いでアッセイキット洗浄緩衝液（ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）洗浄緩衝液、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬから入手可能である。）を反応器（１ｍＬの洗浄緩衝液、繰り返し４回）中に添加することにより洗浄した。この工程は、あらゆる未結合ヒトプロＢＮＰを反応混合物から除去した。１８分間のインキュベーションの間に形成された磁気的に捕捉された微粒子ヒトプロＢＮＰモノクローナル抗体８．１／プロＢＮＰ複合体が反応器中で残留した。次いで、磁気微粒子モノクローナル抗体８．１／ヒトプロＢＮＰ複合体ペレットを磁気物から遊離させた。

４分間の第２のインキュベーションの間、抗ヒトＮＴ−プロＢＮＰ／抗ヒトプロＢＮＰアクリジニウム（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ）標識モノクローナル抗体１５Ｃ４（ＨｙＴｅｓｔ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ；カタログ番号４ＴＮ１）を、モノクローナル抗体８．１被覆磁気微粒子モノクローナル抗体８．１／ヒトプロＢＮＰ複合体のみを含有する個々の反応器中に５０μＬの量で分注した。次いで、この反応混合物をボルテックスにかけて微粒子ペレットを分散させた。

磁気微粒子およびモノクローナル抗体８．１／プロＢＮＰ複合体を、アクリジニウム（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，コード８８３３３）標識抗ヒトプロＢＮＰ１５Ｃ４モノクローナル抗体と、緩衝液中で３７℃において４分間インキュベートした。このインキュベーションの間、抗ヒトプロＢＮＰ１５Ｃ４アクリジニウム標識抗体はモノクローナル抗体８．１／プロＢＮＰ複合体を有する磁気微粒子と結合した。

４分間のインキュベーションが完了したら、磁気微粒子、モノクローナル抗体８．１／ヒトプロＢＮＰ／標識モノクローナル抗体１５Ｃ４複合体をペレット中に磁気的に再度捕捉した。次いで、再捕捉されたペレットを緩衝液（１ｍＬ）により、繰り返し４回繰り返し洗浄した。次いで、磁気的に捕捉されたモノクローナル抗体８．１被覆磁気微粒子、ヒトプロＢＮＰおよび標識抗体モノクローナル抗体１５Ｃ４およびモノクローナル抗体８．１／プロＢＮＰ複合体ペレットを遊離させた。

次いで、アクリジニウム標識（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ）に発光を誘発させた。このことは、Ｈ_２Ｏ_２（１．３２％）を含有する低ｐＨ（ｐＨ１）緩衝液（リスト６Ｅ２３−６５，Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）を添加することにより達成した。これを、微粒子複合体を含有する個々の反応器中に（１００μＬ）の量で分注し、次いでボルテックスにかけた。この工程は、微粒子により捕捉されたヒトプロＢＮＰと結合したアクリジニウム標識抗ヒトプロＢＮＰ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）モノクローナル抗体１５Ｃ４を遊離させた。

次いで、磁気微粒子を磁気的に捕捉し、遊離させたアクリジニウム標識抗プロＢＮＰ抗体（モノクローナル抗体１５Ｃ４）を反応混合物溶液中に残した。この後、溶液中に遊離させたアクリジニウムからの産物である光、相対発光単位（ＲＬＵ）を「誘発」するｐＨ１３緩衝液（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）を添加した（３００μＬ）。生成された光の量を使用して試料中で検出されるヒトプロＢＮＰの量を測定した。

ヒトＮＴ−プロＢＮＰ検出
各試料希釈物を、個々の反応器中に１００μＬの量で分注した。同時に、抗ヒトＮＴ−プロＢＮＰ／抗ヒトプロＢＮＰモノクローナル抗体１５Ｆ１１（ＨｙＴｅｓｔ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ；カタログ番号４ＴＮ１）により被覆された０．１０％ＥＤＡＣ被覆磁気微粒子（５０μＬ）（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ，目下Ｖａｒｉａｎ，Ｉｎｃ．の部門，Ｓｈｒｏｐｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を同一の反応器中に５０μＬの量で分注した。次いで、反応器をボルテックスにかけて試料および磁気微粒子を混合した。各反応混合物を３７℃において１８分間インキュベートした。

このインキュベーションの間、試料中のあらゆるヒトＮＴ−プロＢＮＰを磁気微粒子上に被覆されたモノクローナル抗体１５Ｆ１１により捕捉した。

１８分間のインキュベーションを完了したら、１５Ｆ１１被覆磁気微粒子およびモノクローナル抗体１５Ｆ１１／ＮＴプロＢＮＰ複合体を磁気的に捕捉し、反応器の側部上でペレット中に固定化した。次いで、固定化された磁気微粒子およびモノクローナル抗体１５Ｆ１１／ＮＴプロＢＮＰ複合体ペレットを、液体を容器から交互に吸引し、次いでアッセイキット洗浄緩衝液（ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）洗浄緩衝液、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬから入手可能である。）を反応器（１ｍＬの洗浄緩衝液、繰り返し４回）中に添加することにより洗浄した。この工程は、あらゆる未結合ヒトＮＴ−プロＢＮＰを反応混合物から除去した。１８分間のインキュベーションの間に形成された磁気的に捕捉された被覆磁気微粒子ヒトＮＴ−プロＢＮＰモノクローナル抗体１５Ｆ１１／ＮＴプロＢＮＰ複合体ペレットが反応器中で残留した。次いで、磁気微粒子モノクローナル抗体１５Ｆ１１／ヒトＮＴ−プロＢＮＰ複合体ペレットを磁気物から遊離させた。

４分間の第２のインキュベーションの間、抗ヒトＮＴ−プロＢＮＰ／抗ヒトプロＢＮＰアクリジニウム（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ）標識モノクローナル抗体１５Ｃ４（ＨｙＴｅｓｔ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ；カタログ番号４ＴＮ１）を、１５Ｆ１１被覆磁気微粒子およびモノクローナル抗体１５Ｆ１１／ＮＴプロＢＮＰ複合体のみを含有する個々の反応器中に５０μＬの量で分注した。次いで、この反応混合物をボルテックスにかけて微粒子ペレットを分散させた。

４分間のインキュベーションが完了したら、磁気微粒子モノクローナル抗体１５Ｆ１１／ＮＴプロＢＮＰ／標識モノクローナル抗体１５Ｃ４複合体をペレット中に磁気的に再度捕捉した。次いで、再捕捉されたペレットを緩衝液（１ｍＬ）により、繰り返し４回繰り返し洗浄した。次いで、磁気的に捕捉された被覆磁気微粒子、抗ヒトＮＴ−プロＢＮＰ／抗ヒトプロＢＮＰ標識モノクローナル抗体１５Ｃ４およびモノクローナル抗体１５Ｆ１１／ヒトＮＴ−プロＢＮＰ複合体ペレットを磁気物から遊離させた。

次いで、アクリジニウム標識（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ）に発光を誘発させた。このことは、Ｈ_２Ｏ_２（１．３２％）を含有する低ｐＨ（ｐＨ１）緩衝液（リスト６Ｅ２３−６５，Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）を添加することにより達成した。これを、微粒子複合体を含有する個々の反応器中に（１００μＬ）の量で分注し、次いでボルテックスにかけた。この工程は、微粒子により捕捉されたヒトＮＴ−プロＢＮＰと結合したアクリジニウム標識抗ヒトＮＴ−プロＢＮＰ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）モノクローナル抗体１５Ｃ４（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）を遊離させた。

次いで、磁気微粒子を磁気的に捕捉し、遊離させたアクリジニウム標識ＮＴプロＢＮＰ抗体（モノクローナル抗体１５Ｃ４）を反応混合物溶液中に残した。この後、溶液中に遊離させたアクリジニウムからの産物である光、相対発光単位（ＲＬＵ）を「誘発」するｐＨ１３緩衝液（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）を添加した（３００μＬ）。生成された光の量を使用して試料中で検出されるヒトＮＴ−プロＢＮＰの量を測定した。

結果を以下に表１並びに図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃに示す。

結果の考察
２工程サンドイッチ免疫アッセイを使用してヒトＮＴ−プロＢＮＰ、ヒトプロＢＮＰおよびヒトＢＮＰを定量した。３種の分析物は、２種の免疫アッセイキットのみを使用して検出した。本明細書において使用される場合、「免疫アッセイキット」により意味されるものは、分析物捕捉試薬（即ち、意図された分析物に特異的なモノクローナル抗体により被覆された磁気微粒子）および検出試薬（即ち、意図された分析物に特異的な、アクリジニウムにより標識されたモノクローナル抗体）から構成されるキットである。２種の典型的な免疫アッセイキットの代表例を以下に表３に示す。

ある免疫アッセイキット（例えばキットＡ）からの捕捉試薬および別の免疫アッセイキット（例えばキットＢ）からの検出試薬を使用することにより、エピトープＡおよびＢを共有する第３の分析物を検出することができる（ＡＢ）。この代表例を以下に表４に示す（図２Ａおよび２Ｂ参照。）。

本発明は、異なる捕捉モノクローナル抗体によりそれぞれ被覆された２種のタイプの磁気粒子のみ、および２種の異なる標識モノクローナル抗体のみを使用して３種の分析物であるヒトＢＮＰ、ヒトプロＢＮＰおよびヒトＮＴ−プロＢＮＰを特異的に検出する。

ヒトＢＮＰは、ヒトＢＮＰ上に見出された２種の別個のＢＮＰエピトープに特異的なモノクローナル抗体を使用して「サンドイッチ」を作出することにより検出した。

ヒトＮＴ−プロＢＮＰは、ヒトＮＴ−プロＢＮＰ上に見出された２種の別個のヒトＮＴ−プロＢＮＰエピトープに特異的なモノクローナル抗体を使用して「サンドイッチ」を作出することにより検出した。

ヒトプロＢＮＰは、一方がヒトＢＮＰエピトープに特異的であり、他方がヒトＮＴ−プロＢＮＰエピトープに特異的なモノクローナル抗体である２種のモノクローナル抗体を使用して検出した。ヒトプロＢＮＰは、ヒトＢＮＰおよびヒトＮＴ−プロＢＮＰ中に見出されたエピトープを含有する。ＢＮＰ捕捉モノクローナル抗体はヒトプロＢＮＰ標識検出モノクローナル抗体とサンドイッチを形成し、ヒトプロＢＮＰの検出を可能とする。

１種の分析物の捕捉モノクローナル抗体を第２の分析物の標識検出抗体とともに使用することは、２種のキットのみを使用する３種の分析物（ヒトＢＮＰ、ヒトプロＢＮＰおよびヒトＮＴ−プロＢＮＰ）の検出の基盤である。

当業者に容易に理解されるように、本発明は目的を実施し、記載した結果と利点を得ると共に、それらに内在する結果と利点を得るために好適である。本明細書に記載する分子複合体と方法、手順、処理、分子、特定化合物は好ましい態様の現在の代表例であり、例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。当業者に容易に理解されるように、発明の範囲と精神から逸脱せずに本発明に種々の置換及び変更を加えることができる。

本明細書に引用した全ての特許および刊行物は、本発明が属する分野の当業者の技術水準を示すものである。全ての特許および刊行物は、各個々の刊行物が具体的および個別的に参照により組み込まれることが示されるかのごとく、同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書に具体的に記載する発明は本明細書に具体的に開示しない要素、限定の不在下で適切に実施することができる。従って、例えば、本明細書の各箇所で「〜を含む」、「〜から本質的に構成される」及び「〜から構成される」なる用語はいずれも相互に置き換えることができる。利用した用語及び表現は説明として使用するものであり、限定ではなく、このような用語及び表現の使用において表示及び記載する特徴又はその部分の等価物を排除する意図はなく、請求する発明の範囲内で種々の変更が可能であるとみなされる。従って、好ましい態様と非必須の特徴により本発明を具体的に開示したが、当然のことながら、当業者は本明細書に開示する概念の変更及び変形も採用することができ、このような変更及び変形も特許請求の範囲に定義するような本発明の範囲に含むものとみなす。

Claims (18)

1. ヒトＮＴ−プロＢＮＰ、ヒトプロＢＮＰおよびｈＢＮＰについて試験する試験試料またはこれらを含有している疑いのある試験試料中に存在するヒトＮＴプロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（「ヒトＮＴ−プロＢＮＰ」）、ヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（「ヒトプロＢＮＰ」）およびヒト脳性ナトリウム利尿ペプチド（「ｈＢＮＰ」）の量を定量するための免疫アッセイであって、該方法が：
   （ａ）試験試料を、（ｉ）ヒトＮＴ−プロＢＮＰと結合し、第１の固定化抗体を生成するために固相上に固定化されている第１の捕捉抗体と接触させ、第１の捕捉抗体−ヒトＮＴ−プロＢＮＰ複合体を含む第１の混合物を形成し；（ｉｉ）ヒトプロＢＮＰと結合し、第２の固定化抗体を生成するために固相上に固定化されている第２の捕捉抗体と接触させ、第２の捕捉抗体−ヒトプロＢＮＰ複合体を含む第２の混合物を形成し；（ｉｉｉ）ヒトプロＢＮＰと結合することに加え、ｈＢＮＰにも結合し、第３の固定化抗体を生成するために固相上で固定化されている該第２の捕捉抗体と接触させ、第２の捕捉抗体−ｈＢＮＰ複合体を含む第３の混合物を形成する工程（前記第１の捕捉抗体は抗体１５Ｆ１１を含み、該第２の捕捉抗体は抗体８．１を含む。）；
   （ｂ）ヒトＮＴ−プロＢＮＰと結合し、検出可能標識にコンジュゲートされている第１の検出抗体と、該第１の捕捉抗体−ヒトＮＴ−プロＢＮＰ複合体を含む前記第１の混合物を、接触させて、第１の捕捉抗体−ヒトＮＴ−プロＢＮＰ−第１の検出抗体複合体を含む第３の混合物を形成する工程（該第１の検出抗体は１５Ｃ４である。）；
   （ｃ）ヒトＮＴ−プロＢＮＰと結合することに加え、ヒトプロＢＮＰにも結合し、検出可能標識にコンジュゲートされている該第１の検出抗体と、該第２の捕捉抗体−ヒトプロＢＮＰ複合体を含む該第２の混合物を、接触させて、第２の捕捉抗体−ヒトプロＢＮＰ−第１の検出抗体複合体を含む第５の混合物を形成する工程（該第１の検出抗体は１５Ｃ４である。）；
   （ｄ）ｈＢＮＰと結合し、検出可能標識にコンジュゲートされている第２の検出抗体と、該第２の捕捉抗体−ｈＢＮＰ複合体を含む該第３の混合物を、接触させて、第２の捕捉抗体−ｈＢＮＰ−第２の検出抗体複合体を含む第６の混合物を形成する工程（該第２の検出抗体は抗体２０１．３である。）；
   （ｅ）（ｉ）該試験試料中に含有されるヒトＮＴ−プロＢＮＰの量の尺度として該検出可能標識を検出することにより、工程（ｂ）において形成された第１の捕捉抗体−ヒトＮＴ−プロＢＮＰ−第１の検出抗体複合体の量を測定し；（ｉｉ）該試験試料中に含有されるヒトプロＢＮＰの量の尺度として該検出可能標識を検出することにより、工程（ｃ）において形成された該第２の捕捉抗体−ヒトプロＢＮＰ−第１の検出抗体複合体の量を測定し；（ｉｉｉ）該試験試料中に含有されるｈＢＮＰの量の尺度として該検出可能標識を検出することにより、工程（ｄ）において形成された該第２の捕捉抗体−ｈＢＮＰ−第２の検出抗体複合体の量を測定する工程
   を含む免疫アッセイ。
2. 固相が、磁気粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、膜、足場分子、フィルム、ろ紙、ディスク、およびチップからなる群から選択される、請求項１に記載の免疫アッセイ。
3. 第１の検出抗体の該検出可能標識が、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識、温度測定標識、および免疫ポリメラーゼ連鎖反応標識からなる群から選択される、請求項１に記載の免疫アッセイ。
4. 第２の検出抗体の該検出可能標識が、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識、温度測定標識、および免疫ポリメラーゼ連鎖反応標識からなる群から選択される、請求項１に記載の免疫アッセイ。
5. ヒトＮＴ−プロＢＮＰ、ヒトプロＢＮＰおよびｈＢＮＰについて試験する試験試料またはこれらを含有している疑いのある試験試料中に存在するヒトＮＴプロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（「ヒトＮＴ−プロＢＮＰ」）、ヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（「ヒトプロＢＮＰ」）およびヒト脳性ナトリウム利尿ペプチド（「ｈＢＮＰ」）の量を定量するための免疫アッセイであって、該方法が：
   （ａ）試験試料を（ｉ）ヒトＮＴ−プロＢＮＰと結合し、検出可能標識にコンジュゲートされている第１の検出抗体と接触させてヒトＮＴ−プロＢＮＰ−第１の検出抗体複合体を含む第１の混合物を形成し；（ｉｉ）ヒトＮＴ−プロＢＮＰと結合することに加え、ヒトプロＢＮＰにも結合し、検出可能標識にコンジュゲートされている該第１の検出抗体と接触させてヒトプロＢＮＰ−第１の検出複合体を含む第２の混合物を形成し；（ｉｉｉ）ｈＢＮＰと結合し、検出可能標識にコンジュゲートされている第２の検出抗体と接触させてｈＢＮＰ−第２の検出抗体複合体を含む第３の混合物をさらに形成する工程（該第１の検出抗体は抗体１５Ｃ４であり、該第２の検出抗体は抗体２０１．３である。）；
   （ｂ）該ヒトＮＴ−プロＢＮＰ−第１の検出抗体複合体を含む前記第１の混合物を、ヒトＮＴ−プロＢＮＰと結合し、第１の固定化抗体を生成するために固相上で固定化されている第１の捕捉抗体と接触させて第１の捕捉抗体−ヒトＮＴ−プロＢＮＰ−第１の検出抗体複合体を含む第４の混合物を形成する工程（該第１の捕捉抗体は１５Ｆ１１である。）；
   （ｃ）該ヒトプロＢＮＰ−第１の検出抗体複合体を含む前記第２の混合物を、ヒトプロＢＮＰと結合し、第２の固定化抗体を生成するために固相上で固定化されている第２の捕捉抗体と接触させて第２の捕捉抗体−ヒトプロＢＮＰ−第１の検出抗体複合体を含む第５の混合物を形成する工程（該第２の捕捉抗体は８．１である。）；
   （ｄ）該ｈＢＮＰ−第２の検出抗体複合体を含む該第３の混合物を、ヒトプロＢＮＰと結合することに加え、ｈＢＮＰにも結合し、第２の固定化抗体を生成するために固相上で固定化されている該第２の捕捉抗体と接触させて第２の捕捉抗体−ヒトＢＮＰ−第２の検出抗体複合体を含む第６の混合物を形成する工程（該第２の捕捉抗体は８．１である。）；
   （ｄ）（ｉ）該試験試料中に含有されるヒトＮＴ−プロＢＮＰの量の尺度として該検出可能標識を検出することにより、工程（ｂ）において形成された第１の捕捉抗体−ヒトＮＴ−プロＢＮＰ−第１の検出抗体複合体の量を測定し；（ｉｉ）該試験試料中に含有されるヒトプロＢＮＰの量の尺度として該検出可能標識を検出することにより、工程（ｃ）において形成された該第２の捕捉抗体−ヒトプロＢＮＰ−第１の検出抗体複合体の量を測定し；（ｉｉｉ）該試験試料中に含有されるｈＢＮＰの量の尺度として該検出可能標識を検出することにより、工程（ｄ）において形成された該第２の捕捉抗体−ｈＢＮＰ−第２の検出抗体複合体の量を測定する工程
   を含む免疫アッセイ。
6. 固相が、磁気粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、膜、足場分子、フィルム、ろ紙、ディスク、およびチップからなる群から選択される、請求項５に記載の免疫アッセイ。
7. 第１の検出抗体の検出可能標識が、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識、温度測定標識、および免疫ポリメラーゼ連鎖反応標識からなる群から選択される、請求項５に記載の免疫アッセイ。
8. 第２の検出抗体の検出可能標識が、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識、温度測定標識、および免疫ポリメラーゼ連鎖反応標識からなる群から選択される、請求項５に記載の免疫アッセイ。
9. 免疫診断試薬であって、
   （ａ）ヒトＮＴプロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（「ヒトＮＴ−プロＢＮＰ」）に特異的な第１の捕捉抗体と；
   （ｂ）ヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（「ヒトプロＢＮＰ」）およびヒト脳性ナトリウム利尿ペプチド（「ｈＢＮＰ」）にそれぞれ特異的な第２の捕捉抗体と；
   （ｃ）ヒトＮＴ−プロＢＮＰおよびヒトプロＢＮＰにそれぞれ特異的な第１の検出抗体と；
   （ｄ）ｈＢＮＰに特異的な第２の検出抗体
   を含む前記免疫診断試薬。
10. 第１の捕捉抗体が抗体１５Ｆ１１である、請求項９に記載の免疫診断試薬。
11. 第２の捕捉抗体が抗体８．１である、請求項９に記載の免疫診断試薬。
12. 第１の検出抗体が抗体１５Ｃ４である、請求項９に記載の免疫診断試薬。
13. 第２の検出抗体が抗体２０１．３である、請求項９に記載の免疫診断試薬。
14. 試験試料中のヒトＮＴプロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（「ヒトＮＴ−プロＢＮＰ」）、ヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（「ヒトプロＢＮＰ」）およびヒト脳性ナトリウム利尿ペプチド（「ｈＢＮＰ」）の量を検出するためのキットであって：
    （ａ）該試験試料のアッセイを実施するための取扱説明書と；
    （ｂ）（ｉ）ヒトＮＴ−プロＢＮＰに特異的な第１の捕捉抗体；
    （ｉｉ）ヒトプロＢＮＰおよびｈＢＮＰにそれぞれ特異的な第２の捕捉抗体；
    （ｉｉｉ）ヒトＮＴ−プロＢＮＰおよびヒトプロＢＮＰにそれぞれ特異的な第１の検出抗体；
    （ｉｖ）ｈＢＮＰに特異的な第２の検出抗体
    を含む免疫診断試薬
    を含むキット。
15. 第１の捕捉抗体が抗体１５Ｆ１１である、請求項１４に記載のキット。
16. 第２の捕捉抗体が抗体８．１である、請求項１４に記載のキット。
17. 第１の検出抗体が抗体１５Ｃ４である、請求項１４に記載のキット。
18. 第２の検出抗体が抗体２０１．３である、請求項１４に記載のキット。

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