JP2013220104A - ポリユビキチンを標的とする方法と組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】第一リジン結合が第二リジン結合と異なる場合に、第一リジン結合を含む第一ポリユビキチンを特異的に結合し、第二リジン結合を含む第二ポリユビキチンを特異的に結合しない単離された抗体。
【選択図】なし
Description
本発明は、抗ポリユビキチン抗体の分野、および特にモノユビキチンに特異的に結合せず、異なるイソペプチド結合を有するポリユビキチンを区別することができる抗ポリユビキチン抗体に関する。
ユビキチンは、多種多様な細胞経路において重要な調整の役割を有する小タンパク質である。中でもタンパク質分解でのユビキチンの役割は最も周知であり、標的タンパク質にユビキチンが共有結合するとその標的タンパク質が26Sのプロテアソームによって認識され、破壊される(Wilkinson, Semin. Cell Devel. Biol. 11(3): 141-148 (2000)を参照)。様々なシグナル伝達経路のプロテインキナーゼ制御はユビキチン化とも相関している(Sun and Chen, Curr. Opin. Cell Biol. 16: 119-126 (2004)を参照)。例えば、IκBキナーゼによるIκBのリン酸化により、IκBのユビキチン化とその後の26Sのプロテアソームによる分解が促される;IκBはNKκBのインヒビターであるので、IκBの分解はNKκBを活性化する(Ghosh and Karin, Cell 109 (Suppl.): S81-S96 (2002);Palombella等, Cell 78: 773-785 (1994))。また、ユビキチン化はDNA修復を媒介する(Sun and Chen, Curr. Opin. Cell Biol. 16:119-126 (2004)を参照)。DNAが損傷されると、増殖性細胞核抗原(PCNA)のモノユビキチン化により、DNAが破壊されていてもDNAを合成することができる損傷耐性ポリメラーゼが活性化される(Stelter and Ulrich, Nature 425: 188-191 (2003)。ユビキチン化が伴うことが知られている他の生理学的なプロセスには、細胞分裂、細胞増殖、細胞移動、及びアポトーシス/細胞死が含まれる(Johnson, Nat. Cell Biol. 4: E295-E298 (2002);Pickart, Mol. Cell. 8: 499-504 (2001))。
本発明は、ポリユビキチンに結合する及び/又はポリユビキチンと関係する生物学的活性を制御することができる新規の抗体を提供する。
ある実施態様では、ポリユビキチンに特異的に結合し、モノユビキチンに特異的に結合しない単離された抗体が提供される。ある実施態様では、第一リジン結合が第二リジン結合と異なる場合に、第一リジン結合を含む第一ポリユビキチンを特異的に結合し、第二リジン結合を含む第二ポリユビキチンを特異的に結合しない単離された抗体を提供する。ある実施態様では、前記抗体はさらに、リジン6-結合性ポリユビキチン、リジン11-結合性ポリユビキチン、リジン27-結合性ポリユビキチン、リジン29-結合性ポリユビキチン、リジン33-結合性ポリユビキチン、リジン48-結合性ポリユビキチン、又はリジン63-結合性ポリユビキチンを特異的に結合する。
ある実施態様では、第一K63-結合性ポリユビキチンを特異的に結合し、ポリユビキチンの異なるリジン-結合性型(すなわち、K63-結合性ポリユビキチンでないもの)を含む第二ポリユビキチンを特異的に結合しない単離された抗体を提供する。ある実施態様では、前記第二ポリユビキチンがK48-結合性ポリユビキチンである。
ある実施態様では、リジン48-結合性ポリユビキチンを特異的に結合し、モノユビキチンを特異的に結合しない単離された抗体を提供する。ある実施態様では、前記抗体はさらに、それぞれ配列番号:1−25、151−175、265−279、392−459及び695−704;配列番号:27−51、177−201、281−295、461−528および706−715;配列番号:53−77、203−227、297−311、530−597および717−726;及び配列番号:313−327および728−737のいずれかのHVR-H1、HVR-H2、HVR-H3及びHVR-L3から選択される少なくとも一の高頻度可変(HVR)配列を含んでなる。ある実施態様では、前記抗体はさらに、HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3から選択される少なくとも一の配列を含んでなり、該HVR-H1がアミノ酸配列 a b c d e f g h i j(配列番号:825)を含み、このときアミノ酸aがグリシンであり、アミノ酸bがフェニルアラニンであり、アミノ酸cがアスパラギンであり、アミノ酸dがバリン、フェニルアラニン、ロイシンおよびイソロイシンから選択され、アミノ酸eがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸fがチロシンであり、アミノ酸gがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸hがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸iがイソロイシンおよびメチオニンから選択され、そしてアミノ酸jがヒスチジンであり、該HVR-H2がアミノ酸配列 k l m n o p q r s t u v w x y z a'(配列番号:826)を含み、このときアミノ酸kがセリンであり、アミノ酸lがイソロイシンであり、アミノ酸mがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸nがプロリンおよびセリンから選択され、アミノ酸oがチロシンであり、アミノ酸pがチロシンであり、アミノ酸qがセリンおよびグリシンから選択され、アミノ酸rがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸sはスレオニンであり、アミノ酸tはセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸uがチロシンであり、アミノ酸vがアラニンであり、アミノ酸wがアスパラギン酸であり、アミノ酸xがセリンであり、アミノ酸yがバリンであり、アミノ酸zがリジンであり、そして、アミノ酸a'がグリシンであり、該HVR-H3がアミノ酸配列 b' c' d' e' f' g' h' i' j' k' l'を含み、このときアミノ酸b'がグルタミン酸、セリン、グリシンおよびチロシンから選択され、アミノ酸c'がグリシン、チロシン、セリンおよびアスパラギンから選択され、アミノ酸d'がチロシン、セリン、リジン、フェニルアラニンおよびグルタミン酸から選択され、アミノ酸e'がセリン、チロシン、グリシンおよびトリプトファンから選択され、アミノ酸f'がグルタミン、チロシン、セリンおよびグリシンから選択され、アミノ酸g'がグリシン、セリン、チロシン、メチオニンおよびアラニンから選択され、アミノ酸h'がグリシン、アラニン、プロリンおよびイソロイシンから選択され、アミノ酸i'がフェニルアラニン、イソロイシン、メチオニン、アラニンおよびロイシンから選択されるか又は存在せず、アミノ酸j'がフェニルアラニンであるかまたは存在せず、アミノ酸k'がアスパラギン酸であり、そして、アミノ酸l'がチロシンである。ある実施態様では、前記抗体はさらに、図10Aおよび10Bのクローンapu01、apu02、apu03、apu04、apu05、apu06、apu07、apu08、apu09、apu10、apu11、apu12、apu13、apu14又はapu15に記載のものに対応するHVR-H1、HVR-H2およびHVR-H3配列を含んでなる。
ある態様では、試料を本発明の少なくとも一の抗体と接触させることを含んでなる、試料中の非ポリユビキチン化タンパク質からポリユビキチン化タンパク質を分離する方法を提供する。
ある態様では、試料を本発明の少なくとも一の抗体と接触させ、そして、細胞に対する該接触工程の効果を評価することを含んでなる、試料でのポリユビキチンの機能及び/又は活性を決定する方法を提供する。
一般的技術
特に示さない限り、本発明の実施には、当業者の技量内にある分子生物学(組換え技術を含む)、細菌学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の一般的な技術を用いる。このような技術は、文献、例えば「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」第3版(Sambrook等, 2001);「Oligonucleotide Synthesis」(M. J. Gait編, 1984);「Animal Cell Culture」(R. I. Freshney編, 1987);「Methods in Enzymology」(Academic Press, Inc.);「Current Protocols in Molecular Biology」(F. M. Ausubel等編, 1987, 及び定期更新物);「PCR:The Polymerase Chain Reaction」(Mullis等編, 1994);PCR2:A Practical Approach (M. J. MacPherson, B. D. Hames 及び G. R. Taylor編(1995)); Harlow及びLane, 編 (1988 Antibodies, A Laboratory Manual; 「A Practical Guide to Molecular Cloning」(Perbal Bernard V., 1988;及び「Phage Display: A Laboratory Manual」(Barbas等、2001)に十分に説明されている。
本明細書において使用する「ユビキチン」及び「モノユビキチン」という用語は互換可能に使用され、アミノ酸6、アミノ酸22、アミノ酸27、アミノ酸29、アミノ酸33、アミノ酸48、及び/又はアミノ酸63に少なくとも1のリジン残基を有する76アミノ酸タンパク質と実質的に同じ天然ヒト及び合成ユビキチンの全ての種と定義される。
本明細書において使用する「ポリユビキチン」という用語は、ユビキチンの異なる重合体結合のヒト及び合成クラスに含まれる天然ヒト及び合成のユビキチン重合体鎖として定義され、それらには、限定されるものではないが、K6結合性ポリユビキチン、K22結合性ポリユビキチン、K27結合性ポリユビキチン、K29結合性ポリユビキチン、K33結合性ポリユビキチン、K48結合性ポリユビキチン及びK63結合性ポリユビキチンが含まれる。ポリユビキチンは、どのような長さを有してもよく、少なくとも2のユビキチン部分を含む。ポリユビキチンは、元来一本鎖タンパク質として発現されるユビキチンのタンデムリピートとは区別される。
本明細書において使用する、「ユビキチン経路」という用語は、ユビキチン及び/又はポリユビキチンを含む細胞又は再構成されたインビトロ中の生化学的経路を指す。
本明細書で使用する「抗ポリユビキチン抗体」という用語は、ポリユビキチン分子に対する特異的結合能を有する抗体を指す。
本明細書で使用する「抗K63-結合性ポリユビキチン抗体」とは、K63-結合性ポリユビキチンに対する結合能を有する抗体を指す。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の相補性決定領域(CDR)又は高頻度可変領域と呼ばれる3つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(FR)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、3つのCDRにより連結されたβシート配置を主にとる4つのFR領域をそれぞれ含んでいる。各鎖のCDRは、FRによって近接して結合され、他の鎖のCDRと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabatら, Sequence of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. National Institutes of Health, BEthesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞毒性への抗体の関与を示す。
カバットループ AbM Chothia 接触
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B
(カバット番号付け)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35
(Chothia番号付け)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
「カバット(Kabat)による可変ドメイン残基番号付け」又は「カバットに記載のアミノ酸位番号付け」なる用語およびその異なる言い回しは、Kabat 等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)の抗体の編集の軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインに用いられる番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを用いると、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのFR又はHVR内の短縮又は挿入に相当する2、3のアミノ酸又は付加的なアミノ酸を含みうる。例えば、重鎖可変ドメインには、重鎖FR残基82の後に挿入された残基(例えばカバットによる残基82a、82bおよび82cなど)と、H2の残基52の後に単一アミノ酸の挿入(Kabatによる残基52a)を含んでもよい。残基のKabat番号は、「標準の」カバット番号付け配列によって抗体の配列の相同領域でアライメントすることによって与えられる抗体について決定してもよい。
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するもの、及び/又はここに開示されたヒト抗体を作製する任意の技術を使用して製造されたものである。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を除く。
本明細書において使用する「アゴニスト」抗体は、対象とするポリペプチドの機能活性の少なくとも一つを模倣する抗体である。
「細胞増殖不全」及び「増殖不全」という用語は、ある程度の異常な細胞増殖に関連する障害を指す。ある実施態様では、細胞増殖不全は癌である。
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長/増殖を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫(ホジキン及び非ホジキンリンパ腫)、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより具体的な例には、扁平細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平癌腫、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝癌、白血病及びその他リンパ球増殖性疾患、並びに頭頸部癌の様々なタイプが含まれる。
治療目的の「哺乳動物」とは、ヒト、家畜、並びに動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、等を含む、哺乳動物に分類されるあらゆる動物を類意味する。特定の実施形態では、哺乳動物はヒトである。
本発明の物質/分子の「治療的有効量」は、病状、年齢、性別、個体の体重、及び個体に所望する反応を引き出すための物質/分子の能力等の要因に応じて変わり得る。また、治療的有効量とは、物質/分子の任意の毒性又は有害な影響を、治療的に有益な効果が上回る量である。「予防的有効量」は、所望する予防的結果を達成するのに必要な期間、用量で有効な量を意味する。必ずではないが、典型的には、予防的用量は、疾病の前又は初期の段階に患者に使用されるために、予防的有効量は治療的有効量よりも少ない。
ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び/又は細胞破壊を生ずる物質を意味する。この用語は、放射性同位元素(例えば、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及びLuの放射性同位元素)、化学治療薬、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド類(ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤、酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素、抗生物質、及び毒素、例えばその断片及び/又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、そして下記に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を含むように意図されている。他の細胞毒性剤を以下に記載する。殺腫瘍性剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
が含まれる。
本発明は、ポリユビキチンに特異的に結合するが、モノユビキチンには結合しない抗体を提供する。具体的には、第1のリジン結合を有するポリユビキチンに対する結合能を有するが、第2の、異なるリジン結合を有するポリユビキチンに対する結合能を有さない抗体が提供される。
(i) 配列番号1−26、81−90、151−176、229−240、265−280、329−337、392−460、599−630、695−705、739−749及び789−800の内の少なくとも一つの配列を含むHVR−H1配列;
(ii) 配列番号27−52、91−100、177−202、241−252、281−296、338−346、461−529、631−662、706−716、750−760及び801−812の内の少なくとも一つの配列を含むHVR−H2配列;
(iii) 配列番号53−78、101−110、203−228、253−264、297−312、347−355、530−598、663−694、717−727、761−771及び813−824の内の少なくとも一つの配列を含むHVR−H3配列;並びに
(iv) 配列番号313−328、356−364、728−738及び772−782の内の少なくとも一つの配列を含むHVR−L3配列。
(i) 配列番号1−26、151−176、265−280、392−460及び695−705の内の少なくとも一つの配列を含むHVR−H1配列;
(ii) 配列番号27−52、177−202、281−296、461−529及び706−716の内の少なくとも一つの配列を含むHVR−H2配列;
(iii) 配列番号53−78、203−228、297−312、530−598及び717−727の内の少なくとも一つの配列を含むHVR−H3配列;並びに
(iv) 配列番号313−328及び728−738の内の少なくとも一つの配列を含むHVR−L3配列。
(i) 配列番号81−90、229−240、329−337、599−630、739−749及び789−800の内の少なくとも一つの配列を含むHVR−H1配列;
(ii) 配列番号91−100、241−252、338−346、631−662、750−760及び801−812の内の少なくとも一つの配列を含むHVR−H2配列;
(iii) 配列番号101−110、253−264、347−355、663−694、761−771及び813−824の内の少なくとも一つの配列を含むHVR−H3配列;
(iv) 配列番号356−364及び772−782の内の少なくとも一つの配列を含むHVR−L3配列。
本発明の抗体の一部の実施形態は、下記の配列番号783に示すように、ヒト化4D5抗体(huMAb4D5-8)(HERCEPTIN(登録商標)Genentech, Inc.、米国カリフォルニア州サウスサンフランシスコ)(米国特許第6407213号及びLee等、J. Mol. Biol (2004), 340(5):1073-93においても言及される)の軽鎖可変ドメインを含む。
1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107(配列番号783)(HVR残基を下線で示す)
1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107(配列番号784)(HVR残基を下線で示す)
huMAb4D5-8に関する置換された残基は、上記に太字及び斜体で示される。
本願明細書において示されるように、本発明の抗体は、特定のリジン結合を有する単離されたポリユビキチンと特異的に結合する。本願明細書において示されるように、そのポリユビキチンを異種タンパク質に付着させるとき、本発明の抗体も特定のリジン結合を有するポリユビキチンと特異的に結合する(例えば実施例3及び4を参照)。
単離された抗体及びポリヌクレオチドも提供される。特定の実施形態では、単離された抗体及びポリヌクレオチドは実質的に純粋である。
対象とする抗体が得られるファージディスプレイライブラリを生成するための様々な方法が従来技術に既知である。対象とする抗体の一生成法では、Lee等、J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93に記載されているファージ抗体ライブラリを使用する。
本発明の抗ポリユビキチン抗体は、所望される活性を有する合成抗体クローンをスクリーニングするために、コンビナトリアルライブラリを用いて同定することができる。原則として、合成抗体クローンを、ファージコートタンパク質と融合した抗体可変領域(Fv)の種々の断片を表示するファージを有するファージライブラリをスクリーニングすることによって選択される。このようなファージライブラリは、所望される抗原に対するアフィニティークロマトグラフィーによって選別される。所望される抗原と結合することができるFv断片を発現するクローンは抗原へ吸収され、それによって、ライブラリの非結合クローンから分離される。次いで、この結合クローンは、抗原から溶出させることが可能であり、抗原吸収/溶出の付加的サイクルによってさらに濃縮することができる。本発明の任意の抗ポリユビキチン抗体は、興味の対象であるファージクローンを選択するために適切な抗原スクリーニング手法を設計し、続いて、興味の対象であるファージクローンからのFv配列、及びKabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3に記載の適切な定常領域(Fc)配列を用いての全長抗ポリユビキチン抗体クローンの構築によって得ることができる。
あるいは、非免疫化供与体からの脾臓細胞及び/又はB細胞又は他のPBLの利用によって可能性のある抗体レパートリーのより良い表示が提供され、また、ポリユビキチンが免疫原ではない任意の動物(ヒト又は非ヒト)種を利用した抗体ライブラリの構築が可能となる。インビトロの抗体遺伝子コンストラクトを取り込むライブラリに関しては、幹細胞を被検体から収集して非再配列の抗体遺伝子セグメントをコードする核酸を提供する。対象の免疫細胞は、種々の動物種、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ目、オオカミ、犬科、ネコ科、ブタ、ウシ、ウマ、及びトリ種等から得ることができる。
ライブラリのスクリーニングは、いずれかの既知の技術によって行うことができる。例えば、ポリユビキチンを使用して、吸着プレートの壁をコーティングし、吸着プレートに固定した宿主細胞上に発現させることができるか、細胞選別に使用することができるか、ビオチンにコンジュゲートさせて、ストレプトアビジンでコーティングしたビーズにて捕捉することができるか、又はファージディスプレイライブラリをパニングするための何れかの既知の方法に使用することができる。
選択の効率は、洗浄の間の解離の動力学、及び単一のファージ上の多数の抗体断片が同時に抗原と結合できるかどうかを含む、多数の要因によって決まる。短時間の洗浄、多価のファージディスプレイ、及び固体相の抗原の高いコーティング密度により、速い解離動態(及び弱い結合親和性)を有する抗体を保持することができる。密度が高いことは、多価の相互作用によりファージを安定させるだけでなく、解離したファージの再結合に有利である。遅い解離動態(及び良好な結合親和性)を有する抗体の選択を、長時間の洗浄及びBass等、Proteins, 8: 309-314 (1990)及びWO 92/09690に記載のような単価ファージディスプレイ、並びにMarks等Biotechnol., 10: 779-783 (1992)に記載のような抗原の低いコーティング密度によって促進することができる。
本発明のDNAコード化Fvクローンを、重鎖及び/又は軽鎖の定常領域をコードする既知のDNA配列(例えば、適切なDNA配列をKabat等、上掲から得ることができる)と組み合わせ、完全長又は部分長の重鎖及び軽鎖を形成することができる。IgG、IgM、IgA、IgD、及びIgE定常領域を含む、任意のアイソタイプの定常領域をこの目的のために使用できること、及びそのような定常領域は任意のヒト又は動物の種から採取できることを理解されたい。「ハイブリッド」の完全長重鎖及び/又は軽鎖のコード化配列を形成するために、一の動物(例えばヒト)の種の可変ドメインDNAから採取し、次いで別の動物種の定常ドメインDNAに融合させるFvクローンは、本明細書で使用する「キメラ」抗体及び「ハイブリッド」抗体の定義に含まれる。一実施形態では、ヒト可変DNA由来のFvクローンをヒトの定常領域DNAに融合させ、全ヒトの完全長又は部分長重鎖及び/又は軽鎖のコード化配列を形成する。
更に、抗体を生成して親和性を評価する他の方法が従来技術に既知であり、例えばKohler等、Nature 256: 495 (1975);米国特許第4816567号;Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986;Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984);Brodeur等、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987;Munson等、Anal. Biochem., 107:220 (1980);Engels等、Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 28: 716-734 (1989);Abrahmsen等、EMBO J., 4: 3901 (1985);Methods in Enzymology, vol. 44 (1976);Morrison等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)に記載されている。
概して、本発明は、一以上のポリユビキチン活性の部分的又は全体的遮断が所望されるポリユビキチン媒介性障害の治療に有用な抗ポリユビキチン抗体を提供する。一実施態様では、本発明の抗ポリユビキチン抗体は、癌の治療に使用される。別の実施態様では、ここに提供される抗ポリユビキチン抗体は、上記のような筋疾患の治療に使用される。別の実施態様では、ここに提供される抗ポリユビキチン抗体は、上記のような神経障害の治療に使用される。別の実施形態では、本発明の抗ポリユビキチン抗体は、遺伝的疾患の治療に使用される。別の実施形態では、ここに提供される抗ポリユビキチン抗体は、免疫異常/炎症性疾患の治療に使用される。
本発明の抗ポリユビキチン抗体の独特の特性は、わずらわしい過度の遺伝子操作又は質量分析等の生物物理学的方法を実施することなく、ポリユビキチンの異なるリジン結合形態を区別するのに特に有用である。本発明の抗ポリユビキチン抗体は、インビトロ及びインビボの両方において特定のリジン結合性ポリユビキチンの機能及び活性を特徴付けるために使用することができる。本発明の抗ポリユビキチン抗体は、疾病の進行及び病因における特定のリジン結合性ポリユビキチンの役割を決定するのにも使用することができる。更に、本発明の抗ポリユビキチン抗体は、一以上の特定のリジン結合性ポリユビキチンが、抗ポリユビキチン抗体が特異的でないポリユビキチンの正常な活性に干渉することなく、異常制御されるか又は異常に機能する疾病の治療に使用することができる。
また別の態様では、本抗ポリユビキチン抗体は、本発明の課題の抗体と類似の遮断活性パターンを有するポリユビキチンアンタゴニストの開発に有用である。例えば、本発明の抗K48結合性ポリユビキチン抗体を使用して、同じK48結合性ポリユビキチンの結合特性及び/又はK48結合性ポリユビキチン媒介経路遮断能を有するほかの抗体を決定及び同定することができる。同様に、本発明の抗K63結合性ポリユビキチン抗体を使用して、同じK63結合性ポリユビキチンの結合特性及び/又はK63結合性ポリユビキチン媒介経路の遮断能を有するほかの抗体を決定及び同定することができる。
本発明の抗ポリユビキチン抗体を、ポリユビキチンを用いる生理学的経路に基づくアッセイに使用することにより、一以上の特定のリジン結合を有するポリユビキチンに対する一以上の結合パターンでの結合の遮断に同様の製薬的効果を示す、そのような一以上のリジン結合を有するポリユビキチンの小分子アンタゴニストをスクリーニングすることができる。例えば、K48結合性ポリユビキチンが、標的とする特定のタンパク質のプロテアソーム分解に関与していることが知られている(例えば、Chau等、Science 243: 1576-1583 (1989); Finley et等、Mol. Cell. Biol. 14: 5501-5509 (1994); Flick等、Nat. Cell. Biol. 6:634-641 (2004)参照)ことから、抗K48結合性ポリユビキチン抗体は、候補となる一以上の小分子アンタゴニストの活性を、当該経路における抗K48結合性ポリユビキチン抗体の活性と比較することにより、K48結合性ポリユビキチン媒介性標的プロテアソーム分解の小分子アンタゴニストを同定するためのスクリーニングに使用することができる。同様に、別の実施例では、K63結合性ポリユビキチンがDNA修復に関与することが知られている(例えば、Pickart及びFushman, Curr. Opin. Chem. Biol. 8: 610-616 (2004)参照)ことから、DNA修復経路をアンタゴナイズする抗K63結合性ポリユビキチン抗体の活性を、同じDNA修復経路におけるK63結合性ポリユビキチンの一以上の候補小分子アンタゴニストの活性と比較することができる。同様に、別の実施例では、K63結合性ポリユビキチンはパーキンソン病のレビー小体の形成に関与していることが知られている(例えば、Lim et等、J. Neurosci. 25(8): 2002-9 (2005)参照)ことから、抗K63結合性ポリユビキチン抗体の、レビー小体の形成をアンタゴナイズする活性を、レビー小体の形成のアンタゴナイズにおける、K63結合性ポリユビキチンの一以上の候補となる小分子アンタゴニストの活性と比較することができる。
簡潔に説明すると、本発明の抗ポリユビキチン抗体は、一又は複数の所望の活性を有する合成抗体クローンをスクリーニングするために、コンビナトリアルライブラリを用いて作製することができる。原則として、合成抗体クローンは、ファージコートタンパク質と融合した抗体可変領域(Fv)の種々の断片を表示するファージを有するファージライブラリをスクリーニングすることによって選択される。このようなファージライブラリは、所望される抗原に対するアフィニティークロマトグラフィーによって選別される。所望される抗原と結合することができるFv断片を発現するクローンは抗原に吸収され、それによってライブラリーの非結合クローンから分離される。次いで、この結合クローンを抗原から溶出することができ、抗原吸収/溶出のサイクルを繰り返すことによってさらに濃縮することができる。本発明の任意の抗ポリユビキチン抗体は、対象のファージクローンを選択するために適切な抗原スクリーニング手法を設計し、続いて対象のファージクローン由来のFv配列、及びKabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3に記載の適切な定常領域(Fc)配列を用いて完全長抗ポリユビキチン抗体クローンを構築することにより、得ることができる。国際公開第03/102157号パンフレット及びその引用文献も参照されたい。
モノクローナル抗体は、ほぼ同種の抗体の集団から得ることができる。つまり、集団を構成する個々の抗体は、少量だけ存在する可能性のある天然に発生する突然変異を別にすれば同一である。従って、形容詞「モノクローナル」とは、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特性を示す。
本発明の抗ポリユビキチンモノクローナル抗体は、Kohler等、Nature, 256:495 (1975)によって最初に開示されたハイブリドーマ法を含む、従来技術に既知の様々な方法を用いて作製することができるか、或いは組換えDNA法によって作製することができる(例えば、米国特許第4816567号)。
本発明の抗体の組み換え生成のために、コードする核酸を単離して、更なるクローニング(DNAの増幅)又は発現のために複製ベクターに挿入する。抗体をコードするDNAは従来の手順で簡単に単離し、配列決定される(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて)。多くのベクターが利用可能である。用いる宿主細胞にある程度依存してベクターを選択する。宿主細胞は、限定するものではないが、原核生物又は真核生物(一般的に哺乳動物)由来の細胞を含む。この目的のために、IgG、IgM、IgA、IgD、及びIgEの定常領域を含め、いずれかのアイソタイプの定常領域を使用することができ、そのような定常領域は何らかのヒト又は動物種から採取することができる。
ベクターの構築
本発明の抗体のポリペプチド成分をコードしているポリヌクレオチド配列は標準的な組換え技術を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列はハイブリドーマ細胞のような抗体産生細胞から単離し配列決定することができる。あるいは、ポリヌクレオチドはヌクレオチド合成機又はPCR法を使用して合成することができる。ひとたび得られると、ポリペプチドをコードしている配列は原核生物宿主中で異種ポリヌクレオチドを複製し、発現することが可能な組換えベクター中に挿入される。当該分野において入手でき知られている多くのベクターを本発明の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主として、ベクターに挿入される核酸のサイズとベクターで形質転換される特定の宿主に依存する。各ベクターは、機能(異種性ポリヌクレオチドの増幅又は発現ないしその両方)及び属する特定の宿主細胞への適合性に応じて、様々な成分を含む。一般的に、限定するものではないが、ベクター成分には複製起源、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボゾーム結合部位(RBS)、シグナル配列、異種性核酸挿入及び転写終末配列が含まれる。
また、レプリコン及び宿主微生物と適合性のあるコントロール配列を含んでいるファージベクターを、これらの宿主との関連でトランスフォーミングベクターとして使用することができる。例えば、λGEM.TM.-11のようなバクテリオファージを、大腸菌LE392のような感受性の宿主細胞を形質転換するために使用できる組換えベクターを作製する際に利用することができる。
様々な潜在的宿主細胞によって認識されるプロモーターが非常にたくさん公知となっている。選択したプロモーターを、制限酵素消化によって供給源DNAからプロモーターを除去し、本発明のベクター内に単離したプロモーターを挿入することによって軽鎖又は重鎖をコードするシストロンDNAに作用可能に連結することができる。天然プロモーター配列と多くの異種プロモーターの双方を、標的遺伝子の増幅及び/又は発現を生じさせるために使用することができる。ある実施態様では、天然の標的ポリペプチドプロモーターと比較して、一般的に発現する標的遺伝子をより多く転写させ、効率をよくするので、異種プロモーターが有用である。
本発明の一態様では、組換えベクター内の各シストロンは、膜を貫通して発現されるポリペプチドの転写を誘導する分泌シグナル配列成分を含む。一般に、シグナル配列はベクターの成分でありうるか、ベクター中に挿入される標的ポリペプチドDNAの一部でありうる。この発明の目的のために選択されるシグナル配列は宿主細胞によって認識されプロセシングされる(つまりシグナルペプチダーゼにより切断される)ものでなければならない。異種ポリペプチドに天然のシグナル配列を認識せずプロセシングする原核生物宿主細胞に対しては、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ippあるいは熱安定性エンテロトキシンII(STII)リーダー、LamB、PhoE、PelB、OmpA及びMBPからなる群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。一実施態様では、発現系の双方のシストロンに使用されるシグナル配列はSTIIシグナル配列又はその変異体である。
本発明の抗体は、発現されるポリペプチド成分の量的な比を変更することにより、分泌されて適切に集合体化(アセンブル)された本発明の抗体の産出を最大化することができる発現系を用いても生成することができる。このような変更は、少なくとも部分的にはポリペプチド成分の翻訳強度を同時に変更することにより行われる。
本発明の抗体を発現するのに適した原核生物宿主細胞には、古細菌及び真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物が含まれる。有用な細菌の例には、エシェリキア属(例えば大腸菌)、バシラス属(例えば枯草菌)、エンテロバクター属、シュードモナス種(例えば緑膿菌)、ネズミチフス菌、霊菌(Serratia marcescans)、クレブシエラ属、プロテウス属、赤痢菌、根粒菌、ビトレオシラ(Vitreoscilla)又はパラコッカス(Paracoccus)が含まれる。一実施態様では、グラム陰性菌が使用される。一実施態様では、大腸菌細胞が本発明の宿主として使用される。大腸菌株の例として、遺伝子型W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR を有する33D3株(米国特許第5639635号)を含むW3110株 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), 1190-1219頁;ATCC寄託番号27,325)及びその誘導体が含まれる。また、大腸菌294 (ATCC 31,446), 大腸菌B, 大腸菌λ 1776 (ATCC 31,537)及び大腸菌RV308(ATCC 31,608) など、他の株及びその誘導体も好適である。この例は限定的なものでなく例示的なものである。定義した遺伝子型を有する上記の何れかの細菌の誘導体の構築方法は当業者に公知であり、例として, Bass等, Proteins, 8:309-314 (1990)に記載されている。一般的に、細菌細胞中でのレプリコンの複製能を考慮して適した細菌を選択することが必要である。pBR322、pBR325、pACYC177、又はpKN410のようなよく知られたプラスミドを使用してレプリコンを供給する場合、例えば、大腸菌、セラシア属、又はサルモネラ種を宿主として好適に用いることができる。典型的に、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌しなければならず、望ましくは更なるプロテアーゼインヒビターを細胞培養中に導入することができる。
上述した発現ベクターで宿主細胞を形質転換又は形質移入し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように修飾された通常の栄養培地中で培養する。
形質転換とは、DNAを原核生物宿主中に導入し、そのDNAを染色体外要素として、又は染色体組込みによって複製可能にすることを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換はそのような細胞に適した標準的技術を使用してなされる。塩化カルシウムを用いるカルシウム処理は実質的な細胞壁障害を含む細菌細胞のために一般に使用される。形質転換のための他の方法はポリエチレングリコール/DMSOを用いる。さらに別の方法はエレクトロポレーションである。
本発明のポリペプチドを生産するために使用される原核生物細胞は当該分野で知られ、選択された宿主細胞の培養に適した培地中で増殖させられる。好適な培地の例には、ルリア培地(LB)プラス必須栄養分サプリメントが含まれる。ある実施態様では、培地は発現ベクターを含む原核生物細胞の増殖を選択的に可能にするために、発現ベクターの構成に基づいて選択される選択剤をまた含む。例えば、アンピシリンがアンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖用培地に加えられる。
原核生物宿主細胞は適切な温度で培養される。例えば、大腸菌の増殖に対しては、限定するものではないが、約20℃から約39℃、約25℃から約37℃の範囲、及び約30℃を含む温度範囲で増殖が起こる。培地のpHは、主として宿主生物に応じて、約5から約9の範囲の任意のpHでありうる。大腸菌に対しては、pHは約6.8から約7.4、又は約7.0とすることができる。
本発明の発現ベクターに誘導性プロモーターが用いられる場合、プロモーターの活性に適する条件下でタンパク質発現を誘導する。本発明の一態様では、ポリペプチドの転写制御のためにPhoAプロモーターが用いられる。したがって、形質転換した宿主細胞を誘導のためにリン酸限定培地で培養する。一実施態様では、リン酸限定培地はC.R.A.P培地である(例として、Simmons等, J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147を参照)。様々な他の誘導因子は用いるベクターコンストラクトに応じて当業者に知りうるように用いてよい。
本発明の一態様では、抗体産生は発酵法によって多量に受け継がれる。組換えタンパク質の生産には様々な大規模流加発酵法を利用することができる。大規模発酵は少なくとも1000リットルの容量、例えば約1000から100000リットルの容量である。これらの発酵槽は、酸素と栄養分、特にグルコース(一般的炭素/エネルギー源)を分散させる撹拌翼を使用する。小規模発酵とは一般におよそ100リットル以下の容積で、約1リットルから約100リットルの範囲でありうる発酵槽での発酵を意味する。
本発明のポリペプチドの生産収量と品質を改善するために、様々な発酵条件を変更することができる。例えば、分泌される抗体ポリペプチドの正しい組み立てとフォールディングを改善するために、例えばDsbタンパク質(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD及び/又はDsbG)又はFkpA(シャペロン活性を持つペプチジルプロピルシス、トランス-イソメラーゼ)のようなシャペロンタンパク質を過剰発現する更なるベクターを用いて宿主原核細胞を同時形質転換させることができる。シャペロンタンパク質は細菌宿主細胞中で生産される異種性タンパク質の適切な折り畳みと溶解性を容易にすることが実証されている。Chen等 (1999) J Bio Chem 274:19601-19605;Georgiou等, 米国特許第6083715号;Georgiou等, 米国特許第6027888号;Bothmann及びPluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105;Ramm及びPluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113;Arie等 (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210。
ある実施態様では、タンパク質溶解性酵素を欠損した、一以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換した大腸菌株を本発明の発現系の宿主細胞として用いる。
一実施態様では、ここで生成される抗体タンパク質を更に精製することにより、更なるアッセイ及び使用のためにほぼ同種の調製物を得る。当分野で公知の標準的なタンパク質精製方法を用いることができる。以下の方法は好適な精製手順の例である:免疫親和性又はイオン交換カラムによる分画化、エタノール沈降法、逆相HPLC、シリカ又はDEAEなどの陽性交換樹脂によるクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、SDS-PAGE、硫酸アンモニウム沈降法及び、例えばSephadex G-75を用いたゲル濾過法。
一態様では、固形層に固定したプロテインAを本発明の抗体産物の免疫親和性精製法に用いる。プロテインAは抗体のFc領域に高い親和性で結合する黄色ブドウ球菌から単離した41kDの細胞壁タンパク質である。Lindmark 等 (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13。プロテインAを固定した固形層は、ガラス又はシリカ表面、或いは孔を調節したガラスカラム又はケイ酸カラムを含むカラムとすることができる。ある方法では、カラムは非特異的な混入物の接着をできるだけ防ぐように、グリセロールなどの試薬でコートされる。
精製の初めの工程では、上記に記載のように細胞培養物からの調製物をプロテインA固定固形層に適応し、プロテインAに対象とする抗体を特異的に結合させることができる。ついで、固形層を洗浄して、固形層に非特異的に結合した混入物を除去する。最後に、対象とする抗体を溶出により固形層から除去する。
一般的に、ベクターは、限定するものではないが、以下の一以上を含む:シグナル配列、複製起点、一以上のマーカ遺伝子、エンハンサー因子、プロモーター及び転写終末因子。
真核生物の宿主細胞に用いるベクターは、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいは対象とするポリペプチドのN末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドを含んでいてもよい。通常選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスgDシグナルが利用できる。
このような前駆体領域のDNAは、多価抗体をコードするDNAに読み取り枠を一致させて結合される。
一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である。例えば、SV40開始点は典型的にはただ初期プロモーターを有しているために用いられる。
発現及びクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)必要があれば栄養要求性欠陥を補い、又は(c)複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択方法の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
例えば、DHFR選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、DHFRの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Mtx)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型DHFRを用いた場合の好適な宿主細胞は、例えば、DHFR活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(CHO)株化細胞 (例として、ATCC CRL-9096)を含む。
あるいは、抗体をコードするDNA配列、野生型DHFRタンパク質、及びアミノグリコシド3'-ホスホトランスフェラーゼ(APH)のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性DHFRを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはG418のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第4965199号を参照のこと。
発現及びクローニングベクターは通常、宿主生物体によって認識され、対象のポリペプチドをコードする核酸(例えば抗体)に作用可能に結合しているプロモーターを含む。真核生物のプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ25ないし30塩基上流に見出されるATリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から70ないし80塩基上流に見出される他の配列は、Nが任意のヌクレオチドであるCNCAAT領域である。大部分の真核生物遺伝子の3'末端には、コード配列の3'末端へのポリA尾部の付加に対するシグナルであるAATAAA配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗体ポリペプチドの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、伝染性上皮腫ウイルス、アデノウイルス(例えばアデノウイルス2)、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルス及びサルウイルス40(SV40)のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、或いは熱ショックプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節されうる。
SV40ウイルスの初期及び後期プロモーターは、SV40ウイルスの複製起点を更に含むSV40制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、HindIIIE制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウイルスを用いて哺乳動物宿主中でDNAを発現させる系が、米国特許第4419446号に開示されている。この系の変形例は米国特許第4601978号に開示されている。単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下におけるマウス細胞内のヒトβインターフェロンcDNAの発現に関するReyes等、Nature 297:598-601 (1982)も参照されたい。あるいは、ラウス肉腫ウイルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
より高等の真核生物による本発明の抗体ポリペプチドをコードしているDNAの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強され得る。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のSV40エンハンサー(100−270塩基対)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、抗体ポリペプチドコード配列の5'又は3'位でベクター中にスプライシングされうるが、通常プロモーターから5'位に位置している。
また、真核生物宿主細胞に用いられる発現ベクターは、典型的には、転写の終結及びmRNAの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウイルスのDNA又はcDNAの5'、時には3'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、抗体をコードしているmRNAの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第94/11026号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
ここに記載のベクター中のDNAをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、脊椎動物の宿主細胞を含む本明細書中に記載の高等真核生物細胞を含む。培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株 (COS-7, ATCC CRL1651);ヒト胚腎臓株(293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977));ハムスター乳児腎細胞(BHK, ATCC CCL10);チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR(CHO, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980));サルの腎細胞 (CV1 ATCC CCL70);アフリカミドリザルの腎細胞(VERO-76, ATCC CRL-1587);ヒト子宮頸癌細胞 (HELA, ATCC CCL2);イヌ腎細胞 (MDCK, ATCC CCL34);バッファーローラット肝細胞 (BRL3A, ATCC CRL1442);ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL75);ヒト肝細胞 (Hep G2, HB8065);マウス乳房腫瘍細胞 (MMT060562, ATCC CCL51);TRI細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982));MRC5細胞;FS4細胞;及びヒト肝癌株(HepG2)である。
宿主細胞は、抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
本発明の抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のF10(Sigma)、最小必須培地((MEM),(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)及びダルベッコの改良イーグル培地((DMEM),Sigma)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第4767704号;同4657866号;同4927762号;同4560655号;又は同5122469号;国際公開第90/03430号;国際公開第87/00195号;又は米国再発行特許第30985号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び/又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばHEPES)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、GENTAMYCINTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、pH等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内で生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第1の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばAmicon又はPelliconの限外濾過装置を用いて濃縮する。PMSFなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
任意の予備的精製工程に続いて、目的の抗体及び混入物を含む混合液を、例えばpH約2.5−4.5、一般的には低塩濃度(例として、約0−0.25M塩)の溶出緩衝液を用いて低pH疎水性作用クロマトグラフィーにより、必要な精製ステップを更に行う。
一般に、研究、試験及び臨床用に使用される抗体を調製するための技術及び方法は従来技術において既に確立されており、上記と合致している及び/又は対象とする特定の抗体について当業者により適切とみなされることに注意されたい。
本発明の抗体は、従来技術に既知の様々なアッセイにより、その物理的/化学的特性及び生物学的機能について特徴付けることができる。
精製された抗体は、N末端配列決定、アミノ酸分析、非変性サイズ排除高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、質量分析、イオン交換クロマトグラフィー及びパパイン消化を含むがこれらに限定されない一連のアッセイにより、更に特徴付けることができる。
必要に応じて、抗体の生物学的活性が分析される。一部の実施態様では、本発明の抗体の抗原結合活性について試験する。従来技術に既知の、本発明に使用可能な抗原結合アッセイには、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着検定法)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びプロテインAイムノアッセイ等のあらゆる直接的又は競合的結合アッセイを含むがこれらに限定されない。
本発明は抗体断片を包含する。特定の場合では、全抗体よりも抗体断片の利用に利点がある。より小さいサイズの断片によりクリアランスが速くなり、固形腫瘍へのアクセスが改善されうる。
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、完全な抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimotoら, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennanら, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、Fab、Fv及びScFv抗体断片はすべて、大腸菌で発現され、分泌されるため、この断片の大規模産生が容易となる。抗体断片は上述において検討した抗体ファージライブラリーから分離することができる。別法として、Fab'-SH断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してF(ab')2断片を形成することができる(Carterら, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、F(ab')2断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。サルベージレセプター結合エピトープ残基を含有する、インビボ半減期が増加したFab及びF(ab')2断片は米国特許第5869046号に記載される。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Fv断片(scFV)である。国際公開93/16185;米国特許第5571894号;及び米国特許第5587458号を参照のこと。Fv及びsFvは、定常領域が欠けている完全な結合部を有する唯一の種である;したがって、それらは、インビボでの使用の間の非特異的結合を減らすために適する。sFv融合タンパク質は、sFvのアミノ末端又はカルボキシ末端の何れかで、エフェクタータンパク質の融合物を得るために構築されうる。上掲のAntibody Engineering, ed. Borrebaeckを参照。また、抗体断片は、例えば米国特許第5641870号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。このような直線状の断片は単特異的又は二重特異的であってもよい。
本発明は、ヒト化抗体を含む。非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法が従来技術に既知である。例えば、ヒト化抗体は、非ヒトのソースからそれに導入された一以上のアミノ酸残基を有することができる。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「重要な」残基と呼ばれ、一般に「重要な」可変ドメインに由来する。ヒト化は、基本的にヒト抗体の該当する配列を高頻度可変領域配列で置換することにより、Winter及び共同研究者(Jones等(1986)Nature 321:522-525;Riechmann等(1988)Nature, 332:323-327;Verhoeyen等(1988)Science 239:1534-1536)の方法に従って実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4816567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかの高頻度可変領域残基が、及び場合によっては幾つかのFR残基が齧歯類抗体の類似する部位由来の残基によって置換されたヒト抗体である。
更には、抗体は、抗原に対する高い親和性及びその他の望ましい生物学的特性を保持してヒト化されることが一般に好ましい。この目的を達成するために、一方法では、親の配列及びヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列及び様々な概念上のヒト化産物を分析するプロセスにより、ヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用可能であり、当技術分野の当業者に周知である。選択された候補免疫グロブリン配列の、有望な三次元立体配置的構造を図解及び表示するコンピュータプログラムが利用可能である。このような表示を検査することにより、候補免疫グロブリン配列が機能する際に残基が果たすと思われる役割を分析することができ、つまり候補免疫グロブリンの、その抗原に対する結合能に影響する残基を分析することができる。このように、レシピエント及び重要な配列からFR残基を選択して組み合わせることにより、所望の抗体特性、例えば標的とする抗原に対する親和性の増大を達成することができる。一般に、高頻度可変領域残基は、抗原の結合に対する影響に、直接的に且つ最も有意に関わっている。
本発明のヒト抗ポリユビキチン抗体は、上記のように、ヒト由来のファージディスプレイライブラリから選択したFvクローン可変ドメイン配列を公知のヒト定常ドメイン配列と結合することによって構築することができる。あるいは、本発明のヒトモノクローナル抗ポリユビキチン抗体は、ハイブリドーマ法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の生産のためのヒトミエローマ及びマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株は,例えば,Kozbor, J. Immunol. 133, 3001(1984);Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987);及びBoerner 等, J. Immunol., 147: 86 (1991)によって記載されている。
免疫化することで、内因性免疫グロブリンの生産なしに、ヒト抗体の完全なレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物(例えばマウス)を生産することが現在は可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系変異体マウスでの抗体重鎖結合領域(JH)遺伝子のホモ接合体欠失は、内因性抗体の生産の完全な阻害をもたらすことが記載されている。そのような生殖細胞系変異体マウスでのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子配列の転移は、抗原の挑戦によってヒト抗体の生産を引き起こす。例えば、Jakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551-255(1993);Jakobovits等, Nature 362, 255-258(1993)を参照のこと。
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ヒト抗体ないしヒト化抗体である。特定の実施形態では、結合特異性の一つは特定のリジン結合を含むポリユビキチンに対するものであり、他は他の任意の抗原に対するものである。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、2つの異なるリジン結合を含む2つの異なるポリユビキチンに結合しうる。二重特異性抗体は完全長抗体又は抗体断片(例えばF(ab')2二重特異性抗体)として調製することができる。
異なる実施形態によれば、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原−抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は、例えば、少なくともヒンジの一部、CH2及びCH3領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。特定の実施形態では、軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(CH1)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているDNAを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、コンストラクトに使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が特に重要性を持たないときは、2または3個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。界面は抗体定常ドメインのCH3ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第1抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第2の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Science, 229:81 (1985) は完全な抗体をタンパク分解性に切断してF(ab')2断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたFab'断片はついでチオニトロベンゾアート(TNB)誘導体に転換される。Fab'-TNB誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりFab'-チオールに再転換し、他のFab'-TNB誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び/又は異化)されうる。本発明の抗体は、3又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(IgMクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと3又はそれ以上の抗原結合部位を有する。二量化ドメインは、例えば、Fc領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体はFc領域と、Fc領域のアミノ末端に3又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。一実施形態では、多価抗体は、例えば、3ないし8、又は4の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも1つのポリペプチド鎖(例えば2つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖(類)は2又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖(類)はVD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fcを有し、ここでVD1は第1の可変ドメインであり、VD2は第2の可変ドメインであり、FcはFc領域のポリペプチド鎖の一つであり、X1及びX2はアミノ酸又はポリペプチドを表し、nは0又は1である。例えば、ポリペプチド鎖(類)は:VH-CH1-柔軟なリンカー-VH-CH1-Fc領域鎖;又はVH-CH1-VH-CH1-Fc領域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、少なくとも2つ(例えば4つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有することができる。ここで多価抗体は、例えば約2〜約8の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、場合によってはCLドメインを更に有する。
一部の実施態様では、ここで記載の抗体のアミノ酸配列の修飾を考察する。例えば、抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的特性が改善されることが望ましい。抗体のアミノ酸配列変異体は、適当なヌクレオチド変化を抗体核酸に導入することにより、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、及び/又は挿入及び/又は置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせは、最終コンストラクトに達するまでなされるが、その最終コンストラクトは所望の特徴を有する。アミノ酸変化は、配列を作製する時点で対象とする抗体のアミノ酸配列に導入してもよい。
突然変異のための好ましい位置にある抗体の特定の残基又は領域の同定のために有用な方法は、Cunningham及びWells (1989) Science 244:1081-1085に記載されているように「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基の残基又は基が同定され(例えば、arg、asp、his、lys及びglu等の荷電残基)、中性又は負荷電アミノ酸(例えばアラニン又はポリペプチドアニリン)に置換され、アミノ酸と抗原との相互作用に影響を及ぼす。次いで置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置は、置換部位において又はそれに対して更に又は他の置換を導入することにより精密にされる。即ち、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異自体の性質は予め決める必要はない。例えば、与えられた部位における変異の性能を分析するために、alaスキャンニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で実施し、発現された免疫グロブリンを所望の活性についてスクリーニングする。
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、異なる残基によって置換された抗体分子に少なくとも一つのアミノ酸残基を有する。置換突然変異について最も対象となる部位は高度可変領域を含むが、FR変化も考慮される。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表Aに示す。これらの置換により生物学的活性に変化が生じる場合、表Aに「例示的置換」と称した又はアミノ酸の分類を参照して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングしてよい。
(1)無極性:Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2)無電荷極性:Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(3)酸性:Asp (D), Glu (E)
(4)塩基性:Lys (K), Arg (R), His(H)
別法では、天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいて群に分けることができる:
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性の親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖配向に影響する残基:Gly、Pro; 及び
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。このような置換された残基も、保存的置換部位か、残存する(非保存的)部位に、導入することができる。
本発明の抗体のFc領域に一以上のアミノ酸修飾を導入することにより、Fc領域変異体を生成することが望ましい場合がある。Fc領域変異体は、ヒンジシステインのアミノ酸位置を含む一以上のアミノ酸位置に一のアミノ酸修飾(例えば置換)を含むヒトFc領域配列(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4のFc領域)を含みうる。
本明細書及び従来技術の教示によれば、一部の実施態様では、本発明の抗体は、対応する野生型の抗体と比較した場合、例えばFc領域内に、一以上の変更を有すると考えられる。それでも、これらの抗体は、その野生型の同等物と比較した場合、治療的有効性に必要なほぼ同一の特性を保持している。例えば、国際公開第99/51642号等に記載されているように、Fc領域に、C1q結合及び/又は補体依存性細胞障害性(CDC)に変化(つまり効果の改善又は低減)をもたらす特定の変更を実施することが考慮される。Fc領域の変異体の他の例に関し、Ducan及びWinterによるNature 322:738-40 (1998);米国特許第5648260号;同第5624821号;及び国際公開第94/29351号も参照されたい。
一態様では、本発明は、Fc領域を含むFcポリペプチドのインターフェースに変更を含む抗体を提供し、この場合前記変更によりヘテロ二量体化が促進及び/又は増長される。これらの変更には、第1のFcポリペプチドへの隆起の導入及び第2のFcポリペプチドへの空洞の導入を含み、前記隆起が前記空洞に配置可能であることにより、第1及び第2のFcポリペプチドの複合が促進される。このような変更を有する抗体の生成方法は、米国特許第5731168号に記載のように、従来技術に既知である。
別の態様では、本発明は、化学療法剤、薬剤、成長阻害剤、毒素(例えば、細菌、糸状菌、植物又は動物由来の酵素活性性毒素、又はその断片)、又は放射性同位体(すなわち放射性コンジュゲート)などの細胞障害剤にコンジュゲートした抗体を含んでなる、免疫コンジュゲート又は抗体-薬剤コンジュゲート(ADC)を提供する。
細胞障害性又は細胞分裂停止性の薬剤、すなわち癌治療における腫瘍細胞を殺す又は阻害するための薬剤の局部運搬に抗体-薬剤コンジュゲートを用いると(Syrigos及びEpenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614;Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172;米国特許第4975278号)、腫瘍への薬剤成分の標的とする運搬とそこでの細胞内集積が可能となるものであり、この非コンジュゲート薬物作用剤の全身性投与により正常細胞並びに除去しようとする腫瘍細胞への毒性が容認できないレベルとなりうる(Baldwin等, (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05;Thorpe, (1985) 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,」 in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera等 (編), pp. 475-506)。これによって、最小限の毒性で最大限の効果を求める。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体はこの方策に有用であるとして報告されている(Rowland等, (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87)。この方法に用いる薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビジン、メトトレキサート及びビンデジンが含まれる(Rowland等, (1986)、上掲)。抗体-毒素コンジュゲートに用いる毒素には、ジフテリア毒素などの細菌性毒素、ゲルダナマイシン(Mandler等(2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581;Mandler等(2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028;Mandler等(2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791)、メイタンシノイド(欧州特許第1391213号;Liu等, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)、及びカリケアマイシン(Lode等 (1998) Cancer Res. 58:2928;Hinman等 (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)などのリシン、小分子毒素などの植物毒が含まれる。該毒素は、チューブリン結合、DNA結合又はトポイソメラーゼ阻害を含む機能によりその細胞障害性及び細胞分裂停止性の効果に影響しうる。ある種の細胞障害性剤は、大きな抗体又はタンパク質レセプターリガンドにコンジュゲートした場合に、不活性又は活性が低減する傾向がある。
14-標識1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸(MX-DTPA)は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。国際公開94/11026参照。
抗体のコンジュゲートと一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウロスタチン、トリコセン(trichothene)及びCC1065、及び毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体が、ここで考察される。
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは、一又は複数のメイタンシノイド分子にコンジュゲートした本発明の抗体を含んでなる。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第3896111号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びC-3メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第4151042号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第4137230号;同4248870号;同4256746号;同4260608号;同4265814号;同4294757号;同4307016号;同4308268号;同4308269号;同4309428号;同4313946号;同4315929号;同4317821号;同4322348号;同4331598号;同4361650号;同4364866号;同4424219号;同4450254号;同4362663号;及び同4371533号に開示されている。
メイタンシノイド薬剤成分は、(i) 発酵又は化学修飾、発酵産物の誘導体化によって調製するために相対的に利用可能である(ii) 抗体に対する非ジスルフィドリンカーによる共役に好適な官能基による誘導体化に従う、(iii) 血漿中で安定、そして(iv) 様々な腫瘍細胞株に対して有効であるため、抗体薬剤コンジュゲートの魅力的な薬剤成分である。
例えば、米国特許第5208020号又は欧州特許第0425235号B1、Chari等, Cancer Research, 52:127-131(1992)、及び2004年10月8日に出願の米国特許出願番号10/960602(2005年8月4日に発行の米国公開2005/0169933)(これらの開示内容は出典明記により特別に組み込まれる)に開示されているもの等を含め、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。リンカー成分SMCCを含んでなる抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、2004年10月8日に出願の米国公開特許第10/960602号に開示されるように調製されうる。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれる。更なる結合基を本願明細書中に記載し、例示する。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するC-3位、ヒドロキシメチルで修飾されたC-14位、ヒドロキシル基で修飾されたC-15位、及びヒドロキシル基を有するC-20位で生じる。一実施態様では、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のC-3位で形成される。
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは、ドラスタチン又はドロスタチンペプチジル類似体及び誘導体、アウリスタチン(auristatin) (米国特許第5635483号;同第5780588号)にコンジュゲートした本発明の抗体を含んでなる。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、GTP加水分解及び核と細胞の分割を妨げ(Woyke 等 (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584)、抗癌活性(米国特許第5663149号)及び抗真菌性活性(Pettit 等 (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)を有することが示されている。ドラスタチン又はアウリスタチン薬剤成分は、ペプチジル薬剤分子のN(アミノ)末端又はC(カルボキシル)末端により抗体に接着しうる(国際公開第02/088172号)。
例示的なアウリスタチンの実施態様は、N末端連結モノメチルアウリスタチン薬剤成分DE及びDFを含み、"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、2004年11月5日に出願の米国特許第10/983340号(2005年10月27日に発行の米国公開2005/0238649)に開示される。この開示内容は出典明記によってその全体が特別に組み込まれる。
一般的に、ペプチドベースの薬剤成分は、2以上のアミノ酸及び/又はペプチド断片間でペプチド結合を形成することによって調製されうる。このようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野において周知の液相合成方法に従って調製することができる(E. Schroder and K. Lubke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Pressを参照)。アウリスタチン/ドラスタチン薬剤成分は、US 5635483; US 5780588;Pettit 等 (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 5463-5465;Pettit 等 (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277;Pettit, G.R., 等 Synthesis, 1996, 719-725;及びPettit 等 (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863の方法に従って調製されうる。また、Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7): 778-784; "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、2004年11月5日に出願の米国公開特許第10/983340号も参照のこと。これらは出典明記によってその全体が本願明細書中に組み込まれる(例えば、リンカー及びモノメチルバリン化合物、例えばMMAE及びリンカーにコンジュゲートしたMMAFの調整方法を開示している)。
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した本発明の抗体を含んでなる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖DNA破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第5712374号、同5714586号、同5739116号、同5767285号、同5770701号、同5770710号、同5773001号、同5877296号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ1 I、α2 I、α3 I、N-アセチル-γ1 I、PSAG及びθI 1(Hinman等, Cancer Research, 53:3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58:2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるQFAである。カリケアマイシン及びQFAは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
本発明の抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤には、BCNU、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び5-フルオロウラシル、米国特許第5053394号、同5770710号に記載されており、集合的にLL-E33288複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第5877296号)が含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素A鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシン(modeccin)A鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(PAPI、PAPII及びPAP-S)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、1993年10月28日公開の国際公開第93/21232号を参照のこと。
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はDNAエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ;DNアーゼ)との間に形成される免疫コンジュゲートをさらに考察する。
放射又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-19を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばtc99m又はI123、Re186、Re188及びIn111は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-90はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57)は、ヨウ素-123の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
本発明の化合物は、限定するものではないが、架橋剤:市販されている(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aより)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、及びスルホ-SMPB、及びSVSB (succinimidyl-(4-ビニルスルホン)安息香酸塩)にて調製したADCが特に考えられる。2003-2004 Applications Handbook and Catalogの467-498頁を参照。
本発明の抗体薬剤コンジュゲート(ADC)において、抗体(Ab)を、リンカー(L)を介して、一つ以上の薬剤部分(D)、例えば抗体につき約1〜約20の薬剤部分にコンジュゲートする。式IのADCはいくつかの手段、当業者に公知の有機化学反応、状態及び試薬を用いて調製されうる:(1) 共有結合の後に薬剤部分Dと反応してAb-Lを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた抗体の求核基の反応;及び(2) 共有結合の後に抗体の求核基と反応してD-Lを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた薬剤部分の求核基の反応、が含まれる。ADCを調製するための更なる方法は本願明細書中に記載される。
Ab−(L−D)p I
リンカーは、一つ以上のリンカー成分から成ってもよい。例示的なリンカー成分は、6-マレイミドカプロイル(「MC」)、マレイミドプロパノイル(「MP」)、バリン-シトルリン(「val-cit」)、アラニン-フェニルアラニン(「ala-phe」)、p-アミノベンジルオキシカルボンイル(「PAB」)、N-スクシンイミジル4(2-ピリジルチオ)ペンタノエート(「SPP」)、N-スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1カルボキシレート(「SMCC」)、及びN-スクシンイミジル(4-イオド-アセチル)アミノ安息香酸エステル(「SIAB」)を含む。更なるリンカー成分は当分野で公知であり、そのいくつかは本願明細書において、記述される。また、"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、2004年11月5日に出願した米国公開特許第10/983340号を参照。その内容は出典明記により本願明細書に組み込まれる。
別法として、抗体及び細胞障害剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。DNAの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの2つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
他の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から非結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
抗体-MC-val-cit-PAB-MMAEは、Ab-MC-MMAEの調製のためのプロトコールによるMC-val-cit-PAB-MMAEと本明細書において、提供される何れかの抗体とのコンジュゲートにより調製される。
抗体-MC-val-cit-PAB-MMAFは、Ab-MC-MMAEの調製のためのプロトコールによるMC-val-cit-PAB-MMAFと本明細書において、提供される何れかの抗体とのコンジュゲートにより調製される。
抗体-SMCC-DM1は、以下のSMCC-DM1と本明細書において、提供される何れかの抗体とのコンジュゲートにより調製される。精製された抗体は、(スクシンイミジル4(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(SMCC、Pierce Biotechnology, Inc) で誘導体化して、SMCCリンカーを導入する。具体的には、50mM リン酸カリウム/50mM 塩化ナトリウム/2mM EDTA、pH6.5中で、7.5モル等量のSMCC(DMSO中に20mM、6.7mg/ml)にて20mg/mlの抗体を処理した。室温のアルゴン下で2時間撹拌した後に、反応混合物を、50mM リン酸カリウム/50mM 塩化ナトリウム/2mM EDTA、pH6.5にて平衡化したSephadex G25カラムにてろ過する。抗体を含有する分画をプールして、アッセイする。
Ab-SPP-DM1は、本明細書中で提供される何れかの抗体と以下のSPP-DM1とのコンジュゲートにより調製される。精製された抗体は、ジチオピリジル基を導入するために、N-スクシンイミジル-4-(2-ピリジルチオ)ペンタノエートによって、誘導体化される。NaCl(50mM)及びEDTA(1mM)を含有する44.7mlの50mM リン酸カリウムバッファー(pH6.5)中の抗体(376.0mg、8mg/ml)を、SPP(2.3ml エタノール中に5.3のモル等量)にて処理した。室温、アルゴン下にて90分間インキュベートした後、抗応混合物を、35mMのクエン酸ナトリウム、154mM NaCl、2mM EDTAバッファーにて平衡化したSephadex G25カラムにろゲル濾過する。抗体含有分画をプールして、アッセイした。抗体の修飾の程度は、上記の通りに決定される。
抗体-BMPEO-DM1は、本明細書中に示される何れかの抗体と以下のBMPEO-DM1とのコンジュゲートにより調製される。抗体を、ビスマレイミド試薬BM(PEO)4 (Pierce Chemical)にて修飾して、抗体の表面上の反応していないマレイミド基を除去する。これは、BM(PEO)4を50%のエタノール/水混合液に10mMの濃度になるまで溶解して、およそ1.6mg/ml(10マイクロモル)の濃度でリン酸緩衝食塩水に抗体を含有する溶液に10倍のモル過剰量を加え、1時間反応させて、抗体-リンカー中間生成物である2H9-BMPEOを形成させることにより達成される。150mMのNaClバッファーと0mMのクエン酸塩、pH6のゲル濾過(HiTrap column, Pharmacia)によって、過剰なBM(PEO)4を取り除く。およそ10倍のモル過剰DM1を、ジメチルアセトアミド(DMA)に溶解して、2H9-BMPEO中間生成物に加える。また、ジメチルホルムアミド(DMF)を用いて薬剤成分試薬を溶解してもよい。反応混合物を終夜反応させて、PBSでゲル濾過ないし透析を行って反応していないDM1を取り除く。PBSのS200カラムによるゲル濾過を用いて、高分子量凝集塊を取り除いて、精製された2H9-BMPEO-DM1に供給する。
本発明の抗体を更に変更し、従来技術に既知で容易に入手可能な非タンパク質性成分を更に含有させる。一実施態様では、抗体の誘導体化に適した成分は、水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定されないが、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/マレイン無水物共重合体、ポリアミノ酸(ホモポリマー又はランダムな共重合体)、及びデキストラン又はポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド/エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水に対する適性を有しており、製造するのに有利である。ポリマーは任意の分子量を有することができ、分枝していてもしていなくともよい。抗体に付着しているポリマーの数は変動し、複数のポリマーが付着している場合、それらは同じ分子であるか、又は異なる分子である。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び/又は種類は、改善される抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が決まった条件の下に治療に使用されるかどうか等を含むがこれらに限定されない検討材料に基づいて決定される。
別の実施形態では、放射線照射に暴露することにより選択的に加熱することができる非タンパク質性部分と抗体とのコンジュゲートが提供される。一実施形態では、非タンパク質性部分はカーボンナノチューブである(Kam等, Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 11600-11605 (2005))。照射はどのような波長のものでもよく、限定するものではないが、通常の細胞を傷つけないが、非タンパク質性の部分を抗体−非タンパク質性部分に近接する細胞が死滅する温度まで加熱する波長を含む。
本発明の抗体を含んでなる治療用製剤は、所望の純度を持つ抗体と、場合によっては生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤を混合することにより(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osool, A. Ed. (1980))、水溶液、凍結乾燥又は他の乾燥製剤の形態に調製されて保存される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスフェート、シトレート、ヒスチジン及び他の有機酸等のバッファー;アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤;保存料(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;ヘキサメトニウムクロリド;ベンザルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド;フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;及びm-クレゾール);低分子量(約10残基未満)のポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸;グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物;EDTA等のキレート化剤;スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖;ナトリウム等の塩形成対イオン;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質複合体);及び/又はTWEENTM、PLURONICSTM又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤を含む。
また活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリー系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ-粒子及びナノカプセル)に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
本発明の抗体を、例えば、インビトロ、エクスビボ及びインビボの治療法に用いてもよい。本発明の抗体をアンタゴニストとして使用し、インビトロ、エキソビボ及び/又はインビボにおいて、特定の抗原活性を部分的又は完全に遮断することができる。更に、本発明の少なくともいくつかの抗体は、他の種由来の抗原活性を中和することができる。従って、本発明の抗体を使用することにより、抗原を含む細胞培養物、或いはヒト被験者又は本発明の抗体と交差反応する抗原を有する他の哺乳類の被験体(例えばチンバンジー、ヒヒ、マモセット、カニクイザル及びアカゲザル、ブタ又はマウス)において特定の抗原活性を阻害することができる。一実施態様では、本発明の抗体は、抗体に抗原を接触させて抗原活性を阻害することにより、抗原活性を阻害するために使用することができる。一実施態様では、抗原はヒトタンパク質分子である。
一実施態様では、本発明の抗体は、抗原活性が有害な疾患に罹患している被験体の抗原を阻害する方法に使用することができる。この方法では、本発明の抗体を被験体に投与することにより、被験体の抗原活性を阻害する。一実施態様では、抗原はヒトタンパク質分子であり、被験体はヒト被験者である。或いは、被験体は、本発明の抗体が結合する抗原を発現している哺乳動物とすることができる。更には、対象は、(例えば、抗原の投与によるか、又は抗原導入遺伝子の発現により)抗原が導入された哺乳動物でもよい。本発明の抗体は、治療的目的のためにヒト被験者に投与することができる。更に、獣医学的な目的のために、又はヒトの疾病の動物モデルとして、当該抗体に交差反応する抗原を発現する非ヒト哺乳動物(例えば霊長類、ブタ又はマウス)に本発明の抗体を投与することができる。動物モデルに関して言えば、このようなモデルは、本発明の抗体の治療有効性を評価するために有用であり得る(例えば、投与量及び時間経過の試験)。本発明の抗体は、ポリユビキチン及びポリユビキチン化したタンパク質の異常発現及び/又は活性に関連する疾病、障害又は症状を、治療、阻害、進行を遅延、再発を予防/遅延、寛解、或いは予防に使用することができ、前記疾病、障害又は症状には、癌、筋疾患、ユビキチン経路に関連する遺伝的疾患、免疫異常/炎症性疾患、神経障害、及びその他ユビキチン経路に関連する疾患が含まれるがこれらに限定されない。
ある実施態様では、一の細胞障害性剤とコンジュゲートした抗体を含んでなる免疫コンジュゲートを患者に投与する。いくつかの実施態様では、免疫コンジュゲート及び/又はそれが結合する抗原が細胞に内在化されていると、結合する標的細胞を殺す際の免疫コンジュゲートの治療効果が増す。一実施態様において、細胞障害性剤は標的細胞内の核酸を標的とするか又は妨げる。このような細胞障害性剤の例には、本明細書に記載の何れかの化学療法剤(例えばメイタンシノイド、又はカリケアマイシン)、放射性同位元素、又はRNA分解酵素ないしDNAエンドヌクレアーゼが含まれる。
本発明の抗体(及び補助治療薬)は、非経口的、皮下、腹膜内、肺内、鼻腔内、そして、必要に応じて局所の治療のために、病巣内投与を含む任意の好適な手段によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹膜内、又は皮下的な投与を含む。加えて、抗体を、特に抗体の用量を減少して、パルス注入によって好適に投与する。投与が短期のものであるか長期のものであるかにある程度依存して、任意の好適な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射によって投与することができる。
別の実施形態では、内部移行する抗体が提供される。抗体は、細胞内への抗体の送達を増強する特定の特徴を有することができるか、又はそのような特徴を有するように修飾することができる。これを達成する技術は従来技術に既知である。例えば、抗体のカチオン化は、細胞内へのその取り込みを容易にすることが知られている(例えば、米国特許第6703019号参照)。リポフェクション又はリポソームも、細胞内に抗体を送達するために使用することができる。抗体断片を使用する場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小の抑制性断片が一般に有利である。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的のタンパク質配列に対する結合能を有するペプチド分子を設計することができる。このようなペプチドは、化学的に合成することができる、及び/又は組換えDNA技術によって製造することができる。例えば、Marasco等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)を参照されたい。
結合標的が脳に位置する場合、本発明の特定の実施形態は、血液脳関門を横切る抗体又はその抗原結合断片を提供する。特定の神経変性疾患は、血液脳関門の透過性の増大に関連しており、これにより抗体又は抗原結合断片を脳に容易に導入できる。血液脳関門が完全に保持されているとき、そこに分子を搬送するための複数の従来技術に既知の手法が存在し、それらには、限定するものではないが、物理的方法、脂質に基づく方法、及びレセプターとチャネルに基づく方法が含まれる。
血液脳関門に抗体又は抗原結合断片を搬送する脂質に基づく方法には、限定されるものではないが、血液脳関門の血液内皮上のレセプターに結合する抗体結合断片に連結されるリポソームに抗体又は抗原結合断片を封入すること(例えば、米国特許出願公開第2002/0025313号参照)、及び低密度リポプロテイン粒子(例えば、米国特許出願公開第2004/0204354号参照)、又はアポリポタンパク質E(例えば、米国特許出願公開第2004/0131692号参照)中の抗体又は抗原結合断片をコーティングすることが含まれる。
本発明の抗体組成物は、医学的実用性に合わせた様式で調製し、1回分に分けて、投与される。ここで考慮する要因は、治療する特定の疾患、治療する特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の運搬部位、投与の方法、投与の日程計画、及び医師が知る他の因子を含む。必要ではないが場合によっては、問題の疾患を予防するか又は治療するために一般に用いられる一つ以上の作用剤と抗体とを調製する。そのような他の作用剤の有効量は、製剤中の本発明の抗体の量、疾患の型又は治療、及び上記の他の因子に依存する。これらは、一般的に、ここに記載されるものと同じ用量及び投与経路で、又はここに記載される用量の1〜99%で、或いは経験的/臨床的に適切と判断される任意の用量及任意の投与経路で、用いられる。
本発明の他の態様では、上記の疾患の治療、予防及び/又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。該製造品は容器と該容器上又は該容器に付随するラベル又はパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。容器は、症状を治療、予防及び/又は診断するのに有効な組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる(例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる)。組成物中の少なくとも一つの活性剤は本発明の抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が選択された症状の治療に使用されることを示す。更に、製造品は、(a)本発明の抗体を含有する組成物を中に収容する第一の容器;と(b)更なる細胞障害剤又はそれ以外の治療薬を含有する組成物を中に収容する第二の容器とを含みうる。本発明のこの実施態様における製造品は、組成物を特定の症状の治療に使用することができることを示しているパッケージ挿入物を更に含む。あるいは、もしくは付加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用の静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の(又は第三の)容器を更に具備してもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
A) ライブラリ分類
ナイーブ抗体ライブラリからのファージを、K48-結合性ポリユビキチン又はK63-結合性ポリユビキチンを模倣するイソペプチド結合を含む固定した合成ペプチドに対して結合選別を行った。6ラウンドの選別の後に濃縮は観察されなかった。合成ペプチドを長くして、ナイーブ抗体ライブラリを再びスクリーニングした。またしても6ラウンドの結合選別の後に濃縮は観察されなかった。
ナイーヴYS-B抗体ライブラリからのファージを、異なる公知のユビキチンイソペプチド結合を有するポリユビキチン鎖に対して、4ラウンドの結合選別を行った。YS-B抗体ライブラリは、3つすべての重鎖CDRと軽鎖CDR3にランダムなアミノ酸を含有し(米国公開特許第2005-0106667号を参照)、ヒト化抗体4D5をベースとしている。
前のラウンドで用いた同じ標的に対する更なる選別ラウンドに、増幅したファージを用いた。選別ラウンド2〜4では、対抗選択として分類バッファに10μg/ml ユビキチンを含めた。また、ラウンド3および4は付加的な対抗選択がある場合とない場合の両方で分類した:K48-結合性ポリユビキチン選別では10μg/ml K63-結合性ポリユビキチン又はK63-結合性ポリユビキチン選別では10μg/ml K48-結合性ポリユビキチンのいずれか。
選別ラウンド2〜4において、クローンの異なる一群は、10μg/mlの異なるリジン結合のポリユビキチン(K48-結合性ポリユビキチン又はK63-結合性ポリユビキチン)による対抗選択を含んだ。14選別ランドから溶出したファージの10μlを用いて、20分間の大腸菌CJ236の成長に影響を与え、次いでカルベニシリンを含有する固形アガー上で終夜生育させた。カルベニシリンおよびクロラムフェニコールを添加した15ミリリットルの2YT培養液をプレートに加え、ファジミドを含有するCJ236細胞を再懸濁した。M13-KO7ヘルパーファージを加えた。撹拌しながら37℃で1時間インキュベートした後、2.5mlの懸濁液をカルベニシリンおよびカナマイシンを添加した250mlの2YT培養液に加えた。懸濁液を終夜生育させた。
Fab産生のために、ペンタヒスチジンタグ陽性の特定のクローンからのファージ上清を用いて大腸菌FF34B8に感染させた。この大腸菌FF34B8はXL1と交配させて選択固形培地にて培養することによって34B8株にF’エピソームを付加した細胞株である。感染した細胞をカルベニシリンを含有する固形アガー上に塗り拡げ、終夜生育させた。ファジミドを含有するFF34B8の単一クローンをプレートからピックアップし、カルベニシリンを含有するLB中で37℃で終夜生育させた。次いで、これらの培養物を用いて500mlのカルベニシリンを含有する完全CRAP培地(3.57g (NH4)2SO4、0.71g クエン酸ナトリウム・2H2O、1.07g KCl、5.36g 酵母抽出物(certified)、5.36g Hycase SF (Sheffield)、KOHを加えてpHを7.3に調整し、超純水にて872mlに量を調節し、オートクレーブにかけ、55℃まで冷まし、L当たり110mlの1M MOPS pH7.3、11mlの50% グルコース、及び7mlの1M MgSO4を加えた)に播き、撹拌しながら30℃で24時間生育した。遠心分離を行って細胞を回収し、細胞ペレットを−20℃で保存した。各細胞ペレットを0.2mg/ml ライソザイム及び0.3U/ml DNアーゼIを含有する35mlの冷却洗浄バッファ(PBS+150mM NaCl)に再懸濁してFabを精製した。再懸濁した細胞ペレットを50mlの遠心チューブに移し、素早くボルテックスにかけ、25℃に45分置いた。ペレットを遠心分離して、溶菌液を4℃の洗浄バッファにて予め平衡化した1mlのプロテインG-セファロースカラムに添加した。50mlの冷却洗浄バッファにてカラムを洗浄し、3mlの0.1M 酢酸にて溶出し、150μlの2M トリス塩基にて中和した。溶出したFabをPBSにバッファ交換し、Centriprep 10遠心フィルター(Millipore)を用いて濃縮した。結果として生じたFab濃度を分光光度的に決定した(1OD280nm=1.55mg/ml)。濃縮したFabを4℃で保存した。
すべてのFabをDNA配列分析した。K48-結合性ポリユビキチンに特異的に結合した各々のFabの高頻度可変領域HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3およびHVR-L3のアミノ酸配列を図10A-Cに示す。K63-結合性ポリユビキチンに特異的に結合した各々のFabの高頻度可変領域HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3およびHVR-L3のアミノ酸配列を図11A-Cに示す。各Fabの重鎖および軽鎖フレームワーク配列を図6に示す。ライブラリ設定(上で、配列番号:79および80が、知る)に記載の、第一2の軽鎖高度変異部(HVR-L1およびHVR-L2)は、各々のクローンで同一だった。
ユビキチンおよびそのリジン-結合性型に対する選択されたFab(上記のセクション(B)を参照)の親和性は、BIACORE(登録商標)3000システム(Biacore)を用いた表面プラスモン共鳴で測定した。およそ100共鳴単位のユビキチン、K48-結合性ないしはK63-結合性ジユビキチン、又はK48-結合性ないしはK63-結合性ポリユビキチン(鎖長3〜7)を、製造業者が提供するアミンカップリングプロトコールを用いたCM5チップの異なるフローセルに固定した。各実験において、フローセル1を活性化し、タンパク質を固定せずにエタノールアミンにで反応を止め、参照、減算に用いた。apu01からapu24それぞれのFabタンパク質の段階希釈物(1.6−100nM)を各フローセルに対して注入した(総量50μl、流速25μl/分)。各フローセルのシグナルを記録し、参照シグナルを減算した。解離期間(5分)の後、チップ表面を13μlの20mM HClにて再生した。Fab apu09およびapu18の例示的な結合曲線を図12および13に示す。図12に示すように、Apu09はK48-結合性ポリユビキチンに結合するが、K63-結合性ポリユビキチンには結合しない。図13Aは、K48-結合性ポリユビキチンに対するapu18の結合曲線を示す。いくつかの結合が観察されるが、それは実質的に、K63-結合性ポリユビキチンに観察される結合よりも少ない(図13B)。各Fabについて同様の分析を行った。
反応速度定数と結合定数は製造業者によって提供されるソフトウェアを用いた非線形回帰分析によって同時に算出し、表Bに示した。表Bの「NB」なる文字は示した相互作用に結合が検出されなかったことを示す。表Bの「nd」なる文字は示した相互作用にデータが測定されなかったことを示す。結果から、ジユビキチンへの結合についての特定のFabの反応速度定数がポリユビキチンへの結合についてのものと非常に類似していることが示される。ゆえに、Fabは、2つのユビキチン成分間の特定のイソペプチド結合を認識するように思われる。
*既に得られたK63-結合性ジユビキチン相互作用の反応速度定数を確認したApu18の2回目のBiscore分析。
テトラユビキチン(必要に応じてK48-結合性又はK63-結合性)とジユビキチン(K48-結合性又はK63-結合性)(Boston Biochem)をポリアクリルアミドゲルで分離し、ニトロセルロースメンブレンに電気的ブロッティングにより転移させた。0.5% Qiagenブロッキング試薬(Qiagen)中でメンブレンを4℃で終夜インキュベートして、メンブレン上の非特異的結合部位をブロックした。ブロックしたメンブレンをminiblotter装置にお配置した。Fabクローン(1μg/ml)を、0.5% Qiagenブロッキング試薬(Qiagen)中のメンブレンの連続切片にアプライした。1時間のインキュベート期間の後、メンブレンを洗浄した。メンブレンに結合した抗ユビキチン抗体を、製造業者の指示に従ってHRP-コンジュゲート抗ペンタヒスチジン抗体(Qiagen)を用いて明らかにした。
クローンapu01からapu15から産生されたK48-結合性ポリユビキチン特異的Fabは、ニトロセルロースに固定したK48-結合性テトラユビキチンに特異的に結合した(図19Bを参照)。クローンapu17からapu24から産生されたK63-結合性ポリユビキチン特異的Fabの、ニトロセルロースメンブレン上に固定したK63-結合性ポリユビキチンへの結合は観察されなかった(図19Aを参照)。
Fabディスプレイの第二世代ライブラリは、予め同定されたクローンapu05(K48-結合性ポリユビキチン選別)およびapu18(K63-結合性ポリユビキチン選別)をコードするファジミドから構築した(図10および11を参照)。これらのクローンからのファージを用いてCJ236細胞に感染させ、キュンケルDNA鋳型を調製した。その後、それらの鋳型に停止コドンを挿入するように突然変異させ、以下のように停止含有鋳型をライブラリ構築に用いた。
第三apu18ライブラリでは、HVR-H2およびHVR-H3を突然変異させた。第二apu18ライブラリにおいてHVR-H2に行った修飾と同様に、同じ4つの突然変異原性オリゴヌクレオチドを用いてHVR-H2を修飾した。第一apu18ライブラリにおいてHVR-H3に行った修飾と同様に、同じ初めの6つの突然変異原性オリゴヌクレオチドを用いてHVR-H3を修飾した。
第五apu18ライブラリでは、HVR-H1およびHVR-H2を突然変異させた。第二apu18ライブラリにおいてHVR-H2に行った修飾と同様に、同じ4つの突然変異原性オリゴヌクレオチドを用いてHVR-H2を修飾した。HVR-H1は停止コドンを含むように修飾し、位置30のセリンと位置33のチロシンをNNS混合コドンセットを用いてランダム化し、位置29のアミノ酸はフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシンおよびバリンから選択し、位置34のアミノ酸はイソロイシン及びメチオニンから選択し、位置31と32のアミノ酸は、上記のソフトランダム化命名法に従ってソフトランダム化した。HVR-H1の突然変異誘発に用いたオリゴヌクレオチドは、GCAGCTTCTGGCTTCAACTAATAACACTGGGTGCGTCAGG (配列番号:371)及びGCAGCTTCTGGCTTCAACNTCNNS567567NNSATSCACTGGGTGCGTCAGG (配列番号:391)であった。
第六apu18ライブラリでは、HVR-H1、HVR-H2およびHVR-L3を突然変異した。第五apu18ライブラリにおいてHVR-H1に行った修飾と同様に、同じ突然変異原性オリゴヌクレオチドを用いてHVR-H1を修飾した。第二apu18ライブラリにおいてHVR-H2に行った修飾と同様に、同じ4つの突然変異原性オリゴヌクレオチドを用いてHVR-H2を修飾した。第四apu18ライブラリにおいてHVR-L3に行った修飾と同様に、同じ突然変異原性オリゴヌクレオチドを用いてHVR-L3を修飾した。
その後の選別ラウンドは溶液-段階分類とした。ファージプールを、溶液-分類バッファ(0.05% Superblock (Pierce)を含むPBST)中でビオチン化(スルホ-NHS-ビオチン、Pierce)ポリユビキチン鎖とともに室温で1〜2時間インキュベートした。混合物を溶液-分類バッファにて5倍から10倍に希釈し、ビオチン化ポリユビキチンを短い間(5分)捕獲するためにニュートラビジン-コートウェルに加えた。非ビオチン化ポリユビキチン鎖を含有する反応は、バックグラウンドファージ結合をモニターするためのコントロールとした。プレートをPBSTにて洗浄し、0.1M HClにて10分間溶出した。
溶液分類の第一ラウンドの後、apu05ベースのライブラリでは40倍以下の濃縮が、apu18ベースのライブラリでは7倍以下の濃縮が観察された(表Cを参照)。第二選別の後には、K48-特異的クローンではさらに11倍、K63-特異的クローンではさらに3倍濃縮された(緩慢な解離速度の場合には溶液分類)(表Cを参照)。3回目の選別により(親和性分類と解離速度分類)、K48-特異的クローンでは18倍濃縮し、K63-特異的クローンでは4倍濃縮した(表C参照)。
実施例1に記載のように、最も大きな結合が観察された20のクローン(10のK48-結合性ポリユビキチン-特異的及び10のK63-結合性ポリユビキチン-特異的)をFabとして産生した。Fab apu2.01からapu2.20をDNA配列分析した。これらのクローンのHVR-H1、HVR-H2、HVR-H3およびHVR-L3配列を図16AおよびB(K48-特異的Fab)および図17AおよびB(K63-特異的Fab)に示す。
既に実施例1(C)に記載のように、各FabもBIAcoreによって分析した。得られた反応速度定数と結合定数を表Dに示す。表Dの「NB」なる文字は、示した相互作用について結合が検出されなかったことを示す。
今までの実験によって、近位のTNFレセプター1(TNFR1)シグナル伝達複合体の140kDの必須メディエーターであるレセプター共役タンパク質(RIP)の活性がポリユビキチン化によって調節されていることが示されていた(Wertz等, Nature 430: 694-699 (2004))。RIPがK63-結合性ポリユビキチン鎖とポリユビキチン化される場合、TNFR1によるシグナル伝達が促される。A20のN末端の脱ユビキチン化によるRIPからのK63-結合性ポリユビキチン鎖の除去と、A20 C末端のユビキチンリガーゼ機能によるK48-結合性ポリユビキチン鎖への置換により、RIPが不活性化され、プロテアソームの分解のためにそれを標的とする。このメカニズムは、K48-結合性又はK63-結合性のポリユビキチンのみを形成することができる変異ユビキチンを発現する細胞株を用いて解明された。
本発明の2つの抗K48-結合性及び抗K63-結合性のポリユビキチン結合タンパク質が持つ、TNF処理後の異なる時点でHeLa S3細胞に存在するRIPの異なるポリユビキチン化型を特異的に認識する能力を評価した。4リットルのおよそ1.5×106細胞/mlのHeLa S3細胞を21μM MG-132で処理した。処理後すぐに、主な培養物から1リットルの細胞を取り出し、遠心分離によって回収し、200mlのPBSにて洗浄し、再び遠心分離した。この試料をゼロ時間点として用いた。細胞培養物の残りの3リットルは100ng/mlのTNFで処理した。1リットルの細胞を取り出し、回収して、200mlのPBSにて洗浄し、TNFによる処理後5、15及び25分にそれぞれ再び遠心分離した。各時点の細胞を30mlのIP溶解バッファ(LB)(20mM トリスpH7.5、150mM NaCl、1% Triton x-100、1mM EDTA、25μM MG-132、10mM NEM、各々30μlの脱リン酸化酵素インヒビター混合液1及び2(Sigma)、及び完全プロテアーゼインヒビタータブレット(Roche))中で溶解し、回転させながら4℃で20〜60分インキュベートした。各々の溶解物を50mlの遠心チューブに移し、10000×gで5分間、2回繰り返してペレット化した。各時点からの溶解物のタンパク質濃度を概算した。各溶解物(規準化したタンパク質濃度の各時点ごとに30ml)を1mlのブロックしていないプロテインA/Gビーズとともに4℃で1.25〜1.5時間インキュベートした。ビーズおよび細片を、2000回転数/分で5分間遠心分離して溶解物から分離した。直接的なウェスタンブロット分析のために各溶解物から試料を取り出し、残りの量を−80℃で凍結させた。
Fabディスプレイの第三世代のライブラリは、既に同定されたクローンapu2.16(K63-結合性ポリユビキチン-選択)をコードするファジミドから構築した(実施例2と図17A及び17Bを参照)。クローンからのファージを用いてCJ236細胞に感染させ、キュンケルDNA鋳型を調製した。その後、その鋳型に停止コドンを挿入するように突然変異させ、以下のように停止含有鋳型をライブラリ構築に用いた。
3つの異なるスキームに従ってFab apu2.16を突然変異させて、3つの異なるapu2.16-由来のライブラリを作製した。第一ライブラリでは、HVR-H1およびHVR-H2を突然変異させた。HVR-H1をキュンケル鋳型に停止コドンを含むように修飾し、その後1つの突然変異原性オリゴヌクレオチドを利用した突然変異誘発を行った。停止コドンコード化オリゴヌクレオチド配列は、GCAGCTTCTGGCTTCAACTAATAACACTGGGTGCGTCAGG (配列番号:371)であった。突然変異原性オリゴヌクレオチドにより、NNS混合コドンセットを用いて、位置29のイソロイシンはフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン及びバリンから選択され、位置34のイソロイシンはメチオニン及びイソロイシンから選択され(このときNはG、C、A又はTに対応し、SはG又はCに対応する)、そして、アミノ酸K30、T31、G32およびL33がソフトランダム化された。この場合のソフトランダム化は、特定のヌクレオチド位は示した塩基が占める頻度の70%であり、他の3塩基のうちの1つが占める頻度の10%であったことを示す。このようなソフトランダム化が特定の塩基に含まれる以下のオリゴヌクレオチドでは、ソフトランダム化の存在は塩基の位置での数字によって示す。「5」なる数は、塩基アデニンがその位置で70%の頻度で存在し、一方塩基グアニン、シトシン及びチミジンがそれぞれ10%の頻度で存在することを示す。同様に、「6」なる数はグアニン、「7」はシトシン、「8」はチミジンを指し、それぞれの場合において、他の3つの塩基それぞれは10%の頻度でしか存在しない。apu3.16 HVR-H1を突然変異させるために用いるオリゴヌクレオチド配列は、GCAGCTTCTGGCTTCAACNTC556577668788ATSCACTGGGTGCGTCAGG (配列番号:785)であった。
apu2.16 HVR-H2を突然変異するために用いたオリゴヌクレオチドは、GGCCTGGAATGGGTTGCANNSATC567CCGTACTACGGT567ACC567TATGCCGATAGCGTCAAGG (配列番号:786)、GGCCTGGAATGGGTTGCATACATC567CCGTACNNSGGT567 ACC567TATGCCGATAGCGTCAAGG (配列番号:787)、及びGGCCTGGAATGGGTTGCANNS ATC567CCGTACNNSGGT567ACC567TATGCCGATAGCGTCAAGG (配列番号:788)であった。
第三apu2.16ライブラリでは、HVR-H1およびHVR-H3を突然変異させた。第一apu2.16ライブラリにおいてHVR-H1に行った修飾と同様に、同じ停止コドン含有オリゴヌクレオチドと突然変異原性オリゴヌクレオチドを用いてHVR-H1を突然変異させた。第一apu18ライブラリにおいてHVR-H3に行った修飾(実施例2に記載)と同様に、同じ停止コドン含有オリゴヌクレオチドと同じ6つの突然変異原性オリゴヌクレオチドを用いてHVR-H3を突然変異させた。
実施例1(A)に記載のように、Maxisorpプレート(NUNC)に固定したK63-結合性ポリユビキチンに対して別々に分類した。ストリンジェンシーは3つの方法:ビオチン化ポリユビキチンの濃度によって;過剰な非ビオチン化ポリユビキチンを添加してニュートラビジン-コートウェル上に捕獲する前に結合について競合させることによって;及び、競合の継続期間によって調節した。各分類ラウンドでは、3μM モノユビキチンと30μg/ml K48-結合性ポリユビキチンをインキュベーション工程の間の分類バッファに加えた。溶出したファージを増やして、分類の更なるラウンドのためにプールした。その後の選別ラウンドは溶液-段階であった。溶液分類の第一ラウンドには、室温で1時間ファージプールとインキュベートした100nM ビオチン化(スルホ-NHS-ビオチン、Pierce)ポリユビキチンを含めた。次いで、混合物を溶液-分類バッファ(0.05% Superblock (Pierce)を含むPBST)にて10倍に希釈し、ニュートラビジンコートウェルを用いて5分間キャプチュアした。非ビオチン化ポリユビキチン鎖を含有する反応は、バックグラウンドファージ結合をモニターするためのコントロールとした。プレートをPBSTにて洗浄し、0.1M HClにて10分間溶出した。第二溶液-分類ラウンドでは、ラウンド1のようにファージを30nMのビオチン化ポリユビキチンにて平衡化したが、5分の解離速度選別のために30μg/mlの非ビオチン化ポリユビキチン(K63-結合性)を含む溶液-分類バッファにて10倍に希釈し、その後ニュートラビジンコートウェル上で捕獲した。
溶液分類の第一ラウンドの後、apu2.16ベースの組み合わせライブラリに関して6.5倍の濃縮が観察された(表Eを参照)。緩慢な解離速度についての第二溶液分類の後に、さらに10倍の濃縮が観察された(表Eを参照)。
Apu2.07(実施例2と図16Aおよび16Bを参照))とapu3.07(上記と図23Aおよび23Bを参照)はヒトIgGのように、CHO細胞又は293細胞において発現された。ヒトIgGの重鎖および軽鎖をコードする適当なpRK哺乳動物発現ベクターのキュンケル突然変異誘発によって発現コンストラクトを作製した(Gorman等, DNA Prot. Eng. Tech. 2:3-10(1990))。標準的な方法を用いた親和性クロマトグラフィによってIgGを精製した。
ポリユビキチンと抗K63-結合性ポリユビキチン fabの相互作用をさらに理解するために、抗K63-結合性ポリユビキチン fab apu2.16を、K63-結合性ジユビキチンと共結晶化した。1μlのapu2.16溶液(10mM トリス、75mM NaCl pH8.0中15mg/ml)と1μlのウェル溶液(0.1M LiCl、0.1M トリスpH8.2、1M クエン酸塩)を用いた懸滴において結晶を大きくした。各滴下に0.5μlの0.1Mの塩化第二銅を加え、各滴下を線状に播いた。数日にわたって結晶クラスターを大きくし、単一の回析用結晶が得られるように操作してもよい。分子置換により構造を測定した。100Kで生データを集め、HKL2000によって処理した。結晶は、a=177.7Å、b=94.9Å、c=97.9Å、そしてβ=107の細胞寸法と、非対称性ユニットの2つの複合体を有するC2空間群に属した。プログラムPhaserとヒト化4d5 fab断片の変異体の配位を用いた分子置換により構造を解析した(4D5ではPDB:PDBコード1FVE)。プログラムCootにモデル構築を行い、Refmac5を用いて構造を改良した。構造の分解は3.1Åである。複合体は24.5%のRおよび30.4%のRfreeに改善した。
apu2.16とK63-結合性ジユビキチンとの間の相互作用を図26A−26Cに示す。構造的エピトープは、fabを結合する際に溶媒にアクセス可能な表面領域の少なくとも25%を埋没する、および/またはfabの重鎖又は軽鎖の4.5Åの範囲内に複数のある原子を有する残基の組合せである。K63を呈するユビキチン鎖は鎖Aであり、C末端を呈するユビキチン鎖は鎖Bである。Fab軽鎖残基は鎖Lに属し、fab重鎖残基は鎖Hに属する。以下の表の残基番号の前に鎖番号を付し、fab残基を順に番号付けする。
Claims (68)
- ポリユビキチンに特異的に結合し、モノユビキチンに特異的に結合しない単離された抗体。
- 第一リジン結合が第二リジン結合と異なる場合に、第一リジン結合を含む第一ポリユビキチンを特異的に結合し、第二リジン結合を含む第二ポリユビキチンを特異的に結合しない単離された抗体。
- リジン6-結合性ポリユビキチン、リジン11-結合性ポリユビキチン、リジン27-結合性ポリユビキチン、リジン29-結合性ポリユビキチン、リジン33-結合性ポリユビキチン、リジン48-結合性ポリユビキチン、又はリジン63-結合性ポリユビキチンを特異的に結合する、請求項2に記載の抗体。
- 前記第一ポリユビキチンがリジン48-結合性である、請求項2に記載の抗体。
- 前記第二ポリユビキチンがリジン63-結合性である、請求項4に記載の抗体。
- 前記第一ポリユビキチンがリジン63-結合性である、請求項2に記載の抗体。
- 前記第二ポリユビキチンがリジン48-結合性である、請求項6に記載の抗体。
- 第一リジン結合を含む第一ポリユビキチンと第二リジン結合を含む第二ポリユビキチンをともに特異的に結合する単離された抗体であって、該第一リジン結合が第二リジン結合と異なり、該抗体はモノユビキチンを特異的に結合せず、該抗体は、第一ポリユビキチンに対する抗体の結合親和性と比較して、実質的に減少した結合親和性で第二ポリユビキチンを結合する、抗体。
- リジン48-結合性ポリユビキチンを特異的に結合し、モノユビキチンを特異的に結合しない単離された抗体。
- それぞれ配列番号:1−25、151−175、265−279、392−459及び695−704;配列番号:27−51、177−201、281−295、461−528および706−715;配列番号:53−77、203−227、297−311、530−597および717−726;及び配列番号:313−327および728−737のいずれかのHVR-H1、HVR-H2、HVR-H3及びHVR-L3から選択される少なくとも一の高頻度可変(HVR)配列を含んでなる、請求項9に記載の抗体。
- HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3から選択される少なくとも一の配列を含んでなり、該HVR-H1がアミノ酸配列 a b c d e f g h i j(配列番号:825)を含み、このときアミノ酸aがグリシンであり、アミノ酸bがフェニルアラニンであり、アミノ酸cがアスパラギンであり、アミノ酸dがバリン、フェニルアラニン、ロイシンおよびイソロイシンから選択され、アミノ酸eがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸fがチロシンであり、アミノ酸gがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸hがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸iがイソロイシンおよびメチオニンから選択され、そして、アミノ酸jがヒスチジンであり、該HVR-H2がアミノ酸配列 k l m n o p q r s t u v w x y z a'(配列番号:826)を含み、このときアミノ酸kがセリンであり、アミノ酸lがイソロイシンであり、アミノ酸mがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸nがプロリンおよびセリンから選択され、アミノ酸oがチロシンであり、アミノ酸pがチロシンであり、アミノ酸qがセリンおよびグリシンから選択され、アミノ酸rがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸sはスレオニンであり、アミノ酸tはセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸uがチロシンであり、アミノ酸vがアラニンであり、アミノ酸wがアスパラギン酸であり、アミノ酸xがセリンであり、アミノ酸yがバリンであり、アミノ酸zがリジンであり、そして、アミノ酸a'がグリシンであり、該HVR-H3がアミノ酸配列 b' c' d' e' f' g' h' i' j' k' l'を含み、このときアミノ酸b'がグルタミン酸、セリン、グリシンおよびチロシンから選択され、アミノ酸c'がグリシン、チロシン、セリンおよびアスパラギンから選択され、アミノ酸d'がチロシン、セリン、リジン、フェニルアラニンおよびグルタミン酸から選択され、アミノ酸e'がセリン、チロシン、グリシンおよびトリプトファンから選択され、アミノ酸f'がグルタミン、チロシン、セリンおよびグリシンから選択され、アミノ酸g'がグリシン、セリン、チロシン、メチオニンおよびアラニンから選択され、アミノ酸h'がグリシン、アラニン、プロリンおよびイソロイシンから選択され、アミノ酸i'がフェニルアラニン、イソロイシン、メチオニン、アラニンおよびロイシンから選択されるか又は存在せず、アミノ酸j'がフェニルアラニンであるかまたは存在せず、アミノ酸k'がアスパラギン酸であり、そして、アミノ酸l'がチロシンである、請求項9に記載の抗体。
- HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3から選択される少なくとも一の配列を含んでなり、該HVR-H1がアミノ酸配列 a b c d e f g h i j(配列番号:827)を含み、このときアミノ酸aがグリシンであり、アミノ酸bがフェニルアラニンであり、アミノ酸cがアスパラギンであり、アミノ酸dがイソロイシンであり、アミノ酸eがセリンおよびフェニルアラニンから選択され、アミノ酸fがチロシンであり、アミノ酸gがセリンおよびグリシンから選択され、アミノ酸hがセリンおよびグリシンから選択され、アミノ酸iがイソロイシンおよびメチオニンから選択され、そして、アミノ酸jがヒスチジンであり、該HVR-H2はアミノ酸配列 k l m n o p q r s t u v w x y z a'(配列番号:828)を含み、このときアミノ酸kはセリンであり、アミノ酸lがイソロイシンであり、アミノ酸mがチロシンであり、アミノ酸nがセリンであり、アミノ酸oがチロシンであり、アミノ酸pがチロシンであり、アミノ酸qがセリンであり、アミノ酸rがチロシンであり、アミノ酸sはスレオニンであり、アミノ酸tはセリンであり、アミノ酸uがチロシンであり、アミノ酸vがアラニンであり、アミノ酸wがアスパラギン酸であり、アミノ酸xがセリンであり、アミノ酸yがバリンであり、アミノ酸zがリジンであり、そしてアミノ酸a'がグリシンであり、該HVR-H3がアミノ酸配列 b' c' d' e' f' g' h' i' j' k'(配列番号:829)を含み、このときアミノ酸b'がセリンおよびグリシンから選択され、アミノ酸c'がチロシンであり、アミノ酸d'がセリンであり、アミノ酸e'がチロシンおよびトリプトファンから選択され、アミノ酸f'がセリン、チロシン、アルギニン、フェニルアラニンおよびヒスチジンから選択され、アミノ酸gがグルタミン酸、セリン、ロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、アスパラギンおよびバリンから選択され、アミノ酸h'がアラニンおよびグリシンから選択され、アミノ酸i'がロイシン、メチオニン、フェニルアラニンおよびイソロイシンから選択され、アミノ酸j'がアスパラギン酸であり、そして、アミノ酸k'がチロシンである、請求項9に記載の抗体。
- アミノ酸配列 m' n' o' p' q' r' s' t' u' v' w'(配列番号:830)を含むHVR-L3配列を含んでなり、このときアミノ酸m'がグルタミンであり、アミノ酸n'がグルタミンであり、アミノ酸o'がセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸p'がセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸q'がセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸r'がセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸s'がセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸t'がロイシン、セリン、プロリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸u'がプロリンであるかまたは存在せず、アミノ酸v'がフェニルアラニン、イソロイシン、バリンおよびロイシンから選択され、そして、アミノ酸w'がスレオニンである、請求項9に記載の抗体。
- 配列番号:728のアミノ酸配列を含むHVR-L3配列を含んでなる、請求項9に記載の抗体。
- 図10Aおよび10Bのクローンapu01、apu02、apu03、apu04、apu05、apu06、apu07、apu08、apu09、apu10、apu11、apu12、apu13、apu14又はapu15に記載のものに対応するHVR-H1、HVR-H2およびHVR-H3配列を含んでなる、請求項11に記載の抗体。
- 図16Aのクローンapu2.01、apu2.02、apu2.03、apu2.04、apu2.05、apu2.06、apu2.07、apu2.08、apu2.09又はapu2.10に記載のものに対応するHVR-H1、HVR-H2およびHVR-H3配列を含んでなる、請求項12に記載の抗体。
- 配列番号:79のHVR-L1配列、配列番号:80のHVR-L2配列、および図10Cのクローンapu01、apu02、apu03、apu04、apu05、apu06、apu07、apu08、apu09、apu10、apu11、apu12、apu13、apu14又はapu15に記載のHVR-L3配列に対応するHVR-L3配列を含んでなる、請求項13に記載の抗体。
- 配列番号:79のHVR-L1配列、配列番号:80のHVR-L2配列、および図16Bのクローンapu2.01、apu2.02、apu2.03、apu2.04、apu2.05、apu2.06、apu2.07、apu2.08、apu2.09又はapu2.10に記載のHVR-L3配列に対応するHVR-L3配列を含んでなる、請求項14に記載の抗体。
- 配列番号:269のHVR-H1配列、配列番号:285のHVR-H2配列、配列番号:301のHVR-H3配列、配列番号:79のHVR-L1配列、配列番号:80のHVR-L2配列、および配列番号:317のHVR-L3配列を含んでなる、請求項9に記載の抗体。
- 配列番号:701のHVR-H1配列、配列番号:712のHVR-H2配列、配列番号;723のHVR-H3配列、配列番号:79のHVR-L1配列、配列番号:80のHVR-L2配列、および配列番号:734のHVR-L3配列を含んでなる、請求項9に記載の抗体。
- リジン63-結合性ポリユビキチンに特異的に結合し、モノユビキチンに特異的に結合しない単離された抗体。
- それぞれ配列番号:81−89、229−239、329−336、599−629、739−748および789−799;配列番号:91−99、241−251;338−345、631−661、750−759および801−811;配列番号:101−109、253−263、347−354、663−693、761−770および813−823;及び配列番号:356−363および772−781のいずれかのHVR-H1、HVR-H2、HVR-H3およびHVR-L3から選択される少なくとも一の高頻度可変性(HVR)配列を含んでなる、請求項21に記載の抗体。
- HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3から選択される少なくとも一の配列を含んでなり、該HVR-H1がアミノ酸配列a b c d e f g h i j(配列番号:831)を含み、このときアミノ酸aがグリシンであり、アミノ酸bがフェニルアラニンであり、アミノ酸cがアスパラギンであり、アミノ酸dがバリン、イソロイシンおよびフェニルアラニンから選択され、アミノ酸eがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸fがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸gがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸hがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸iがイソロイシンおよびメチオニンから選択され、そして、アミノ酸jがヒスチジンであり、該HVR-H2がアミノ酸配列 k l m n o p q r s t u v w x y z'(配列番号:832)を含み、このときアミノ酸kはセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸lがイソロイシンであり、アミノ酸mがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸nがプロリンおよびセリンから選択され、アミノ酸oがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸pがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸qがセリンおよびグリシンから選択され、アミノ酸rがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸sはスレオニンであり、アミノ酸tはセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸uがチロシンであり、アミノ酸vがアラニンであり、アミノ酸wがアスパラギン酸であり、アミノ酸xがセリンであり、アミノ酸yがバリンであり、アミノ酸zがリジンであり、そして、アミノ酸a'がグリシンであり、該HVR-H3がアミノ酸配列 b' c' d' e' f' g' h' i' j' k' l' m' n' o' p' q' r' s' t' u' v'を含み、このときアミノ酸b'がセリン、グルタミン酸、グリシンおよびトリプトファンから選択され、アミノ酸c'がグリシン、チロシン、イソロイシン、グルタミンおよびセリンから選択され、アミノ酸d'がチロシン、メチオニン、グリシンおよびイソロイシンから選択され、アミノ酸e'がチロシン、アルギニン、フェニルアラニン、トリプトファン、アラニンおよびプロリンから選択され、アミノ酸f'がチロシン、トリプトファン、セリンおよびグリシンから選択され、アミノ酸g'がグルタミン、チロシン、セリン、フェニルアラニンおよびバリンから選択され、アミノ酸h'がグリシン、スレオニン、トリプトファン、リジンおよびプロリンから選択され、アミノ酸i'がチロシン、アラニン、トリプトファン、グルタミン酸、プロリンおよびセリンから選択され、アミノ酸j'がトリプトファン、イソロイシン、チロシンおよびアラニンから選択され、アミノ酸k'がトリプトファン、チロシン、グリシンおよびアスパラギン酸から選択されるかまたは存在せず、アミノ酸l'がチロシン、セリン、フェニルアラニンおよびトリプトファンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸m'がチロシン、アスパラギン酸およびセリンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸n'がチロシンおよびアラニンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸o'がスレオニン、セリン、バリン、グリシンおよびチロシンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸p'がグリシン、アスパラギン酸、セリン、メチオニンおよびチロシンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸q'がチロシン、アラニンおよびグリシンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸r'がチロシン、ロイシンおよびグリシンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸s'がグリシンであるかまたは存在せず、アミノ酸t'がメチオニンおよびロイシンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸u'がアスパラギン酸であり、そしてアミノ酸v'がチロシンである、請求項21に記載の抗体。
- HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3から選択される少なくとも一の配列を含んでなり、該HVR-H1がアミノ酸配列 a b c d e f g h i j(配列番号:833)を含み、このときアミノ酸aがグリシンであり、アミノ酸bがフェニルアラニンであり、アミノ酸cがアスパラギンであり、アミノ酸dがイソロイシン、バリンおよびロイシンから選択され、アミノ酸eがセリン、リジンおよびバリンから選択され、アミノ酸fがセリン、トリプトファン、グリシンおよびスレオニンから選択され、アミノ酸gがセリン、アスパラギンおよびグリシンから選択され、アミノ酸hがチロシン、イソロイシン、ロイシンおよびフェニルアラニンから選択され、アミノ酸iがイソロイシンおよびメチオニンから選択され、そしてアミノ酸jがヒスチジンであり、該HVR-H2がアミノ酸配列 k l m n o p q r s t u v w x y z a' b'(配列番号:834)を含み、このときアミノ酸kがアラニンであり、アミノ酸lがチロシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、ヒスチジンおよびアラニンから選択され、アミノ酸mがイソロイシンであり、アミノ酸nがセリン、アラニンおよびグルタミンから選択され、アミノ酸oがプロリンであり、アミノ酸pがチロシンであり、アミノ酸qがロイシン、チロシンおよびフェニルアラニンから選択され、アミノ酸rがセリンおよびグリシンから選択され、アミノ酸sがセリン、スレオニンおよびトリプトファンから選択され、アミノ酸tはスレオニンであり、アミノ酸uはセリン、アスパラギン、リジンおよびイソロイシンから選択され、アミノ酸vがチロシンであり、アミノ酸wがアラニンであり、アミノ酸xがアスパラギン酸であり、アミノ酸yがセリンであり、アミノ酸zがバリンであり、アミノ酸a'がリジンであり、そしてアミノ酸b'がグリシンであり、該HVR-H3がアミノ酸配列 c' d' e' f' g' h' i' j' k' l' m' n' o'(配列番号:837)を含み、このときアミノ酸c'がセリンであり、アミノ酸d'がアルギニンであり、アミノ酸e'がグルタミン酸であり、アミノ酸f'がチロシンであり、アミノ酸g'がチロシンであり、アミノ酸h'がアルギニンであり、アミノ酸i'がトリプトファンであり、アミノ酸j'がチロシンであり、アミノ酸k'がスレオニンであり、アミノ酸l'がアラニンであり、アミノ酸m'がイソロイシンであり、アミノ酸n'がアスパラギン酸であり、そしてアミノ酸o'がチロシンである、請求項21に記載の抗体。
- アミノ酸配列 w' x' y' z' A B C D E F Gを含むHVR-L3配列を含んでなり、このときアミノ酸w'がグルタミンであり、アミノ酸x'がグルタミンであり、アミノ酸y'がセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸z'がセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸Aがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸Bがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸Cがプロリン、セリンおよびロイシンから選択され、アミノ酸Dがセリン、プロリンおよびチロシンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸Eがロイシンおよびフェニルアラニンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸Fがフェニルアラニン、バリン、スレオニンおよびイソロイシンから選択され、そして、アミノ酸Gがアルギニン、スレオニンおよびフェニルアラニンから選択される、請求項21に記載の抗体。
- アミノ酸配列Q-Q-Y-S-S-Y-S-S-L-F-T(配列番号:772)を含むHVR-L3配列を含んでなる、請求項21に記載の抗体。
- 図11Aおよび11Bのクローンapu17、apu18、apu19、apu20、apu21、apu22、apu23およびapu24に記載のものに対応するHVR-H1、HVR-H2およびHVR-H3配列を含んでなる、請求項23に記載の抗体。
- 図17Aのクローンapu2.11、apu2.12、apu2.13、apu2.14、apu2.15、apu2.16、apu2.17、apu2.18、apu2.19およびapu2.20に記載のものに対応するHVR-H1、HVR-H2およびHVR-H3配列を含んでなる、請求項24に記載の抗体。
- 配列番号:79のHVR-L1配列、配列番号:80のHVR-L2配列、及び図11Cのクローンapu17、apu18、apu19、apu20、apu21、apu22、apu23およびapu24に記載のHVR-L3配列に対応するHVR-L3配列を含んでなる、請求項25に記載の抗体。
- 配列番号:79のHVR-L1配列、配列番号:80のHVR-L2配列、及び図17Bのクローンapu2.11、apu2.12、apu2.13、apu2.14、apu2.15、apu2.16、apu2.17、apu2.18、apu2.19およびapu2.20に記載のHVR-L3配列に対応するHVR-L3配列を含んでなる、請求項26に記載の抗体。
- 配列番号:330のHVR-H1配列、配列番号:339のHVR-H2配列、配列番号:348のHVR-H3配列、配列番号:79のHVR-L1配列、配列番号:80のHVR-L2配列、および配列番号:357のHVR-L3配列を含んでなる、請求項21に記載の抗体。
- 配列番号:739のHVR-H1配列、配列番号:750のHVR-H2配列、配列番号:761のHVR-H3配列、配列番号:79のHVR-L1配列、配列番号:80のHVR-L2配列、および配列番号:772のHVR-L3配列を含んでなる、請求項21に記載の抗体。
- 配列番号:740のHVR-H1配列、配列番号:751のHVR-H2配列、配列番号:762のHVR-H3配列、配列番号:79のHVR-L1配列、配列番号:80のHVR-L2配列、および配列番号:773のHVR-L3配列を含んでなる、請求項21に記載の抗体。
- HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3から選択される少なくとも一の配列を含んでなり、該HVR-H1がアミノ酸配列 a b c d e f g h i j(配列番号:835)を含み、このときアミノ酸aがグリシンであり、アミノ酸bがフェニルアラニンであり、アミノ酸cがアスパラギンであり、アミノ酸dがイソロイシン、バリンおよびロイシンから選択され、アミノ酸eがリジンおよびメチオニンから選択され、アミノ酸fがスレオニン、メチオニン、アスパラギン、アルギニンおよびイソロイシンから選択され、アミノ酸gがグリシン、バリンおよびフェニルアラニンから選択され、アミノ酸hがチロシン、イソロイシン、ロイシンおよびフェニルアラニンから選択され、アミノ酸iがイソロイシンおよびメチオニンから選択され、そしてアミノ酸jがヒスチジンであり、該HVR-H2がアミノ酸配列 k l m n o p q r s t u v w x y z a' b'(配列番号:836)を含み、このときアミノ酸kがアラニンであり、アミノ酸lがチロシンであり、アミノ酸mがイソロイシンであり、アミノ酸nがセリン、イソロイシンおよびスレオニンから選択され、アミノ酸oがプロリンであり、アミノ酸pがチロシンであり、アミノ酸qがロイシン、チロシン、アスパラギン酸、セリンおよびトリプトファンから選択され、アミノ酸rがグリシンであり、アミノ酸sがトリプトファン、バリン、セリン、アスパラギン、アルギニンおよびチロシンから選択され、アミノ酸tはスレオニンである、アミノ酸uはアルギニン、アスパラギン、バリン、スレオニン、セリンおよびリジンから選択され、アミノ酸vがチロシンであり、アミノ酸wがアラニンであり、アミノ酸xがアスパラギン酸であり、アミノ酸yがセリンであり、アミノ酸zがバリンであり、アミノ酸a'がリジンであり、そしてアミノ酸b'がグリシンであり、該HVR-H3がアミノ酸配列 c' d' e' f' g' h' i' j' k' l' m' n' o'(配列番号:837)を含み、このときアミノ酸c'がセリンであり、アミノ酸d'がアルギニンであり、アミノ酸e'がグルタミン酸であり、アミノ酸f'がチロシンであり、アミノ酸g'がチロシンであり、アミノ酸h'がアルギニンであり、アミノ酸i'がトリプトファンであり、アミノ酸j'がチロシンであり、アミノ酸k'がスレオニンであり、アミノ酸l'がアラニンであり、アミノ酸m'がイソロイシンであり、アミノ酸n'がアスパラギン酸であり、そしてアミノ酸o'がチロシンである、請求項21に記載の抗体。
- 図23Aおよび23Bのクローンapu3.01、apu3.02、apu3.03、apu3.04、apu3.05、apu3.06、apu3.07、apu3.08、apu3.09、apu3.10および3.11に記載のものに対応するHVR-H1、HVR-H2およびHVR-H3配列を含んでなる、請求項34に記載の抗体。
- 配列番号:79のHVR-L1配列、配列番号:80のHVR-L2配列、および配列番号:777のHVR-L3配列に対応するHVR-L3配列を含んでなる、請求項34又は請求項35に記載の抗体。
- 配列番号:744のHVR-H1配列、配列番号:755のHVR-H2配列、配列番号:766のHVR-H3配列、配列番号:79のHVR-L1配列、配列番号:80のHVR-L2配列、および配列番号:777のHVR-L3配列を含んでなる、請求項21に記載の抗体。
- 配列番号:795のHVR-H1配列、配列番号:807のHVR-H2配列、配列番号:819のHVR-H3配列、配列番号:79のHVR-L1配列、配列番号:80のHVR-L2配列、および配列番号:777のHVR-L3配列を含んでなる、請求項21に記載の抗体。
- 配列番号:701のHVR-H1配列、配列番号:712のHVR-H2配列、配列番号:723のHVR-H3配列、および配列番号:79のHVR-L1配列、および配列番号:80のHVR-L2配列、および配列番号:734のHVR-L3配列を含んでなる、請求項9に記載の抗体。
- 請求項1から39のいずれかの抗体と同じポリユビキチン上の抗原決定基に結合し、モノユビキチンに特異的に結合しない単離された抗体。
- ポリユビキチンへの結合について請求項1から39のいずれかの抗体と競合し、モノユビキチンに特異的に結合しない単離された抗体。
- 前記抗体がポリユビキチン化されたタンパク質に特異的に結合する、請求項1から39のいずれか一に記載の抗体。
- 前記抗体がポリユビキチン化されたタンパク質の分解を阻害する、請求項42に記載の抗体。
- 前記抗体が少なくとも一のポリユビキチンが媒介するシグナル伝達経路を調節する、請求項42に記載の抗体。
- 前記抗体が少なくとも一のポリユビキチンが媒介するシグナル伝達経路を阻害する、請求項42に記載の抗体。
- 前記抗体が少なくとも一のポリユビキチンが媒介するシグナル伝達経路を刺激する、請求項42に記載の抗体。
- 請求項1から39のいずれかに記載の抗体をコードする核酸分子。
- 請求項47に記載の核酸を含んでなるベクター。
- 請求項48に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
- 請求項1から39のいずれかに記載の抗体を産生することができる細胞株。
- 抗体が産生される条件下で抗体をコードする核酸分子を含んでなる宿主細胞を培養することを含んでなる、請求項1から39のいずれかに記載の抗体の産生方法。
- 請求項1から39のいずれかに記載の抗体の有効量と薬学的に受容可能な担体とを含有してなる組成物。
- 試料を請求項1から39のいずれか一に記載の少なくとも一の抗体と接触させることを含んでなる、試料中のポリユビキチン又はポリユビキチン化されたタンパク質の存在を同定する方法。
- 請求項1から39のいずれか一に記載の少なくとも一の抗体の有効量を患者に投与することを含んでなる、患者のポリユビキチンの調節不全が関連する疾患又は症状の治療のための方法。
- 前記患者が哺乳類の患者である、請求項54に記載の方法。
- 前記患者がヒトである、請求項55に記載の方法。
- 前記疾患が、癌、筋疾患、ユビキチン経路関連の遺伝的疾患、免疫性/炎症性の疾患および神経学的疾患から選択される、請求項54に記載の方法。
- 前記疾患が、上皮癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、白血病、筋ジストロフィー、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リデル症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、ピック病およびパジェット病から選択される、請求項57に記載の方法。
- ポリユビキチン又はポリユビキチン化タンパク質を含有すると思われる試料中のポリユビキチン又はポリユビキチン化タンパク質の存在を決定する方法であって、該試料を請求項1から39のいずれか一に記載の少なくとも一の抗体に曝し、そして、試料中のポリユビキチン又はポリユビキチン化タンパク質への少なくとも一の抗体の結合を決定することを含んでなる方法。
- 試料を請求項1から39のいずれか一に記載の少なくとも一の抗体と接触させることを含んでなる、試料中の非ポリユビキチン化タンパク質からポリユビキチン化タンパク質を分離する方法。
- 細胞を請求項1から39のいずれか一に記載の少なくとも一の抗体と接触させ、そして、細胞に対する該接触工程の効果を評価することを含んでなる、細胞でのポリユビキチンの機能及び/又は活性を決定する方法。
- 試料を請求項1から39のいずれか一に記載の少なくとも一の抗体と接触させ、そして、細胞に対する該接触工程の効果を評価することを含んでなる、試料でのポリユビキチンの機能及び/又は活性を決定する方法。ユビキチン分子の第一アミノ酸位の第一リジン残基への少なくとも一のイソペプチド結合を含む第一ポリユビキチンに特異的に結合し、該抗体がユビキチン分子の第二アミノ酸位の第二リジン残基への少なくとも一のイソペプチド結合を含む第二ポリユビキチンに特異的に結合せず、このとき該第一および該第二のアミノ酸位が異なる、単離された抗体。
- 前記抗体がリジン-63結合性ポリユビキチンのエピトープに結合する、請求項21に記載の単離された抗体。
- 前記エピトープは、リジン-63結合性ポリユビキチンの第二ユビキチンサブユニットと第一ユビキチンサブユニットの両方に残基を含む、請求項63に記載の単離された抗体。
- 前記エピトープが、Glu-18、Pro-19、Ser-20、Asp-21、Thr-55、Leu-56、Ser-57、Asp-58、Asn-60、Ile-61、及びGln-62から選択される第一ユビキチンサブユニットに少なくとも一の残基を含む、請求項64に記載の単離された抗体。
- 前記エピトープが、Leu-8、Thr-9、Glu-34、Gly-35、Ile-36、Pro-37、Asp-39、Gln-40、Leu-71、Arg-72、Leu-73、Arg-74、Gly-75から選択される第二ユビキチンサブユニットに少なくとも一の残基を含む、請求項64に記載の単離された抗体。
- 前記エピトープが、Glu-18、Pro-19、Ser-20、Asp-21、Thr-55、Leu-56、Ser-57、Asp-58、Asn-60、Ile-61、及びGln-62から選択される第一ユビキチンサブユニットに少なくとも一の残基と、Leu-8、Thr-9、Glu-34、Gly-35、Ile-36、Pro-37、Asp-39、Gln-40、Leu-71、Arg-72、Leu-73、Arg-74、及びGly-75から選択される第二ユビキチンサブユニットに少なくとも一の残基を含む、請求項64に記載の単離された抗体。
- 請求項1から39及び63から67のいずれか一に記載の抗体の抗原結合断片。
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