JP2013155185A - 腫瘍細胞活性を調節する方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】薬剤は、クラステリンを標的とする抗体であって、クラステリンのβ−サブユニットに結合してもよく、より具体的には、薬剤はクラステリンβ−サブユニットのC末端部分に結合してもよいモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を含む抗体。またはクラステリンのβ−サブユニットの特異的なアミノ酸配列を有するペプチドワクチン。
【選択図】図7
Description
)EMTを促進する作用が阻害されるものであり得る。そのような阻害剤を開発するために、経路の1つの支流におけるメディエータがEMT反応に関与するが、TGF−βに対する増殖阻害反応に関与しないように、TGF−βシグナル伝達経路の分岐のある点を同定することが必要だろう。TGF−βシグナル伝達経路のEMTを促進する支流にのみにあるメディエータを阻害する治療薬は、前癌病変部の亢進に対する効果がほとんど又はまったくないが、転移を減少させるだろう。
クロアレイ分析によって検出されたEMTに関連する転写の変化のいくつかが、メッセージ(message)及びタンパク質の存在量の変化に反映されていたことが確認された(クラ
ステリン及びカベオリンは図3に示される)。抗ペプチド抗体は、クラステリンがTGF−βの増殖阻害経路に関与しない必須のEMTメディエータであることを実証するために使用された(図4〜図6)。これらの結果は、クラステリンが接近可能な治療の標的であり、その阻害がTGF−βの抗増殖的な腫瘍抑制作用を妨げずにEMTをブロックすることを示す。
ンのアミノ酸421〜437(VEVSRKNPKFMETVAEK、配列番号1)に対応する合成ペプチドに対して製造され(RDIと名付けられる)、第2の抗体(Santa Cruz Biotechnology Inc.製)は、クラステリンのアミノ酸432〜443(ETVAEK
ALQEYR、配列番号2)に対応する合成ペプチドに対して製造された(C−18と名付けられる)。同じペプチド(配列番号2)に対する抗ペプチドモノクローナル抗体も購入した(B5と名付けられる)。これらの2つのエピトープの間の重複は以下で示される。これらの抗体調製物がEMTをブロックする能力は、EMTの誘導におけるクラステリンβサブユニットのC末端部分の重要性を示す(図4〜図6、C−18の結果が示され、同じような結果がRDIで得られた)。
一般に、クラステリンはモルテングロビュール断片を含み、部分的にのみ構造化されるタンパク質であると考えられる。さらに、それは本質的に無秩序なタンパク質として分類されている。クラステリンは多数の他の結合パートナーと相互作用することができるいくつかの独立したクラスの結合部位を含むことが想定される。
PredictProtein(Rost, 1996)、
GenTHREADER(Jones, 1999)、
COILS(Lupas, 1996)、
PONDR(Li他, 1999)
を使用して試験した。
リンに対するモノクローナル抗体を生成させる抗原として使用するために精製した。12個のモノクローナル抗体が全長のクラステリンに対して作製され、ELISAによってクラステリンと相互作用することが実証された。これらの12個の抗体は、6E12、7B7、21B12、20G3、20E11、18F4、16C11、16B5、11E2、8F6、7D6、7C12と命名される。
1)モノクローナル抗体(antibodes)は、ラビット抗マウスFc抗体が共有結合で固定
されたCM5センサーチップ表面に別々に捕捉された(捕捉された場合、このmAbはこの実験的なアプローチにおいてmAb1と名付けられる)。次にmAb1にクラステリンを結合させた。次に、5つのモノクローナル抗体はすべて、mAb1及びmAb2の両方がクラステリンと同時に相互作用することができるか否かを決定するために、mAb1に結合したクラステリンの上に連続して注入された(注入されたmAbはこの実験的なアプローチにおいてmAb2と名付けられる)(図11)。すべての5つの中和mAb(いくつかの場合における20E11を除く)は、互いにクラステリンへの結合を競合する(mAb1又はmAb2の両方として使用された場合)ことが見出された。さらにそれらの抗体は、C18、pAb#10及びB5抗ペプチド抗体と競合することが見出され、5つの中和mAbがpAb#10、pAbC18及びmAb B5の重複ペプチドエピトープと相互作用することを示唆する。Ab 20E11は、いくつかの場合において(mAb1又はmAb2のいずれかとして使用された場合)、異なるエピトープを有すると思われたが、この結論は第2の実験的なアプローチの結果によって支持されなかったことは留意されるべきである。
2)モノクローナル抗体は、別々にアミンカップリングを使用して、CM5センサーチップ表面に共有結合で固定された(固定されたとき、このmAbはこの実験的なアプローチにおいてmAb1と名付けられる)。次に、クラステリンへの結合についての競合を実証するために、Ab(このアプローチにおいてAb2名付けられる)は、mAb1表面上への複合体の注入に先立ってクラステリンと共にインキュベートされた(図11)。すべての5つの中和mAbが、クラステリンへの結合に関して互いに、並びにC18抗ペプチド抗体、pAb#10抗ペプチド抗体及びB5抗ペプチド抗体と競合したことが確認された。これにより、5つの中和mAbがpAb#10、pAbC18及びmAb B5の重複ペプチドエピトープと相互作用することが確認される。
CDRは適切に設計されたオリゴヌクレオチドプライマーセットの使用によって、PCRを用いて特異的に増幅することができた(図12)。次に、これらの産物は直接シークエンシングされた(配列番号8〜配列番号30、図13を参照)。
記述されるように、BRI−JM01細胞は単離され特徴づけられた(Lenferink他, Breast Cancer Res., 6, R514-30 (2004))。細胞を加湿された5%CO2環境中で37℃で維持し、且つDF/5% FBS(5%のウシ胎仔血清(FBS)及び抗生物質/抗真菌剤(anti-micotics)(共にWisent Inc.)を添加したハムF12及びダルベッコ改変イ
ーグル培地(DMEM)の1:1混合物)中で維持した。ヒト組換えTGF−β1及びpan−TGF−β中和抗体1D11は、製造業者の説明書(R&D Systems)に従って再構
成された。精製ヒト血清クラステリンは、MR Wilson博士によって快く提供された(Wilson and Easterbrook-Smith, 1992)。精製ヒト組換えクラステリンは、HEK−293細
胞において産生された(Durocher他, 2002中で記述される一般的な発現系)。以下のタンパク質に対する抗体を購入し、示された容積/容積希釈で使用した:E−カドヘリン(E−cad、抗ウボモルリンクローンDecma−1、Sigma)、閉鎖帯−1(ZO−1、Chemicon))、ヒトクラステリンβ鎖のC末端に対して作製されたポリクローナル抗体(
cluβ、RDI及びSanta Cruz)、及びカベオリン−1(cav−1、Santa Cruz)。ホ
ースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)結合抗体はJackson ImmunoResearch Laboratories Incから得られ、アレクサ−488(Alexa-488)標識抗体及びテキサスレッド標識ファロイジンはMolecular Probesから購入された。すべての実験は、DF/5%中で75〜80%コンフルエントのBRI−JM01細胞の単層で行なわれた。指示された場合には、細胞は、それぞれ100pM又は200nMの最終濃度のTGF−β1又は精製クラステリンにより24時間又は48時間処理された。
BRI−JM01細胞の単層を、TGF−β1非存在下又は存在下において30分間、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間又は24時間増殖させた。PolyA+mRNAは、FastTrack(商標)2.0キット(Invitrogen)を使用して、製造業者の説明書に従って抽出された(1時点当たり4×150mmディッシュ)。RNAは、Schade他, 2004に従って単離及び標識された。
cDNAマイクロアレイ(15,264配列が確認されたマウスEST、http://lgsun.grc.nia.nih.gov/cDNA/15k.html)はトロントの大学ヘルスネットワークマイクロアレイセンター(University Health Network Microarray Center in Toronto)(http://www.microarrays.ca/)から得られた。スライドは、記述されるようにCy3又はCy5で標識されたcDNAとハイブリダイズされ(Enjalbert他, 2003)、10ミクロンの解像度で
ScanArray 5000(Perkin Elmer、v2.11)を使用してスキャンし、16ビットTIFFファイルがQuantArrayソフトウェア(Perkin Elmer、v3.0)を使用して定量化された。記述されるように、マイクロアレイのデータ正規化及び分析が実行された(Enjalbert他, 2003)。
SQ−RT−PCRのために、3〜5μgの全RNAは、修飾をともなう製造業者のガイドラインに従って、50UのSuperScript II(Invitrogen)を使用して、20μlのファーストストランドRT−PCR反応中で増幅された。サンプルをSuperScript IIの追加前にプレインキュベートし(2分、42℃)、RNaseOUT処理は省略した。サンプルをインキュベートし(90分、42℃)、次に氷上で冷却した。2μlのファーストストランド反応物は、50μlの最終容積中でPCRミックス(2.5UのTaqポリメラーゼ(New England Biolabs)、10μMのフォワード/
リバースプライマー)に添加され、PCR増幅に先立って加熱された(2分、94℃)。ノーザンブロット及びSQ−RT−PCRに使用されたプローブの生成のためのプライマーは、表1において列記される。
35mmのディッシュ中で増殖させたBRI−JM01細胞を、TGF−β1により処理した(24時間)。細胞は熱した2%のSDS中で溶解した。50μgの総タンパク質又は30μlの馴化培地を、還元条件下でSDS−PAGE(10%)によって分離した
。タンパク質はニトロセルロース膜に転写され、膜は5%の脱脂粉乳を含むTBS−T(20mM Tris−HCl(pH 7.6)、137mM NaCl、0.1%のTween20(容積/容積))中で一次抗体(cluβ、cav−1、1/500)によりインキュベートされた(一晩、4℃)。膜をTBS−Tにより洗浄し、TBS−T+5%ミルク(milk)中のHRP結合二次抗体(1/20,000)によりインキュベートし(1時間)、TBS−Tにより洗浄した。免疫反応性のバンドは、増強化学発光(Enhanced
Chemiluminescence)(ECL、Perkin Elmer)を使用して可視化された。
BRI−JM01細胞を、ガラスチャンバースライド(Lab-Tek)に播種し、cluβ
抗体(8μg/ml)又は1D11(100nM)の存在下又は非存在下でプレインキュベートした(30分)精製クラステリン又はTGF−β1で処理した。処理していないBRI−JM01細胞及びTGF−β1処理したBRI−JM01細胞(24時間)から得られた馴化培地を、処理していないBRI−JM01細胞とのインキュベートに先立って、これらの抗体でプレインキュベートした(30分)。24時間の曝露後に、細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定し(10分)、2度すすぎ(PBS)、透過性にし(2分、PBS中の0.2%トリトンX−100)、再びすすぎ、及び非特異的部位をPBS中の10%FBSでブロックした(40分)。細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、次にPBS/10% FBS中の一次抗体(E−cad、1/200、ZO−1、1/100、cluβ、cav−1、1/50)でインキュベートし(1時間)、すすぎ(PBS中で4回)、蛍光的に結合した二次抗体(Molecular Probes)で最終的にインキュベートした。同時にF−アクチンフィラメントを、テキサスレッド標識ファロイジン(1/100)で標識し、核を0.4μg/ml 4,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI、Sigma)で対比染色した。スライドをすすぎ(PBS)、プロロングアンチフェー
ド(Prolong anti-fade)(Molecular Probes)を使用してマウントした。蛍光画像は、Leitzのアリストプラン(Aristoplan)顕微鏡に取り付けたPrinceton InstrumentのクールスナップCCDデジタルカメラを使用して撮影し、エクリプス(Eclipse)(Empix Imaging Inc.)及びフォトショップ(Photoshop)(Adobe)ソフトウェアを使用して分析した
。
BRI−JM01細胞(2.5×104細胞/ウェル)は24ウェルプレート中に播種した。翌日培地を交換し、精製クラステリン、TGF−β1、又は1D11抗体(100nM)若しくはcluβ抗体(8μg/ml)により30分間プレインキュベートしたTGF−β1を細胞に添加した。24時間後に、細胞を0.5μCi/mlの[3H]チミジン(Amersham)によりパルス標識し、すすぎ(PBS、4℃)、トリプシン処理し、[3H]チミジン取り込みを液体シンチレーションカウンタによって評価した。
細胞(2×104細胞/ウェル)を、TGF−β1、TGF−β1+cluβ抗体、又は精製クラステリンの非存在下又は存在下において、Al-Moustafa他(1999)に記載のイン
クをコートした12ウェルプレート中に播種した。画像をLeitzのアリストプラン顕微鏡
に取り付けた株式会社ニコンのクールピクス995(Coolpix 995)デジタルカメラを使
用して24時間後に撮影し、粒子の無い軌跡をImageJフリーウェア(http://rsb.info.nih.gov/ij/)を使用して定量化した。
細胞(2×104細胞/ウェル)を、TGF−β1、TGF−β1+cluβ抗体、又は精製クラステリンの非存在下又は存在下において、Al-Moustafa他(1999)に記載のイン
クをコートした12ウェルプレート中に播種した。画像をLeitzのアリストプラン顕微鏡
に取り付けた株式会社ニコンのクールピクス995デジタルカメラを使用して24時間後に撮影し、粒子の無い軌跡をImageJフリーウェア(http://rsb.info.nih.gov/ij/)
を使用して定量化した。
コンフルエント細胞単層(12ウェルプレート)を2μLピペットチップを使用して「傷つけた」。次に培地を細胞残屑を除去するために交換し、抗クラステリンmAb(4μg/mLの最終濃度)を、100pMのTGF−βの非存在下又は存在下において添加した。創傷の画像は、Leitzのアリストプラン顕微鏡に取り付けた株式会社ニコンのクール
ピクス995デジタルカメラを使用して、インキュベート前に、及び24時間のインキュベート後に撮影された。
ペプチド(クラステリンタンパク質のうちのアミノ酸421〜437)は、カルガリー大学(University of Calgary)(http://peplab.myweb.med.ucalgary.ca/)で産生及び
精製された。表面プラズモン共鳴(SPR、ビアコア(Biacore)(商標)2000)に
よるウサギ抗血清のスクリーニングに使用されたCM−5センサーチップの表面に対する配向結合を容易にするために、余剰のシステインをペプチドのC末端に追加した。ペプチドは、グルタルアルデヒド(Sigma)又は1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピ
ル)カルボジイミドHCL(Pierce)のいずれかを使用して、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH、イムジェクト・マリカルチャー(Imject Mariculture) KLH、Pierce)に結合され、PBSに対して透析された(4℃で一晩)。2つの方法によって結合したペプチド調製物を混合した(1:1)。免疫前血清を2羽のメスのニュージーランドホワイトウサギ(10ml)から採取し、次にKLH結合ペプチド調製物(1脚当たり1.25μgペプチド/0.5mlフロインド不完全アジュバント又はPBS)を注射した。動物は3週ごとに追加免疫し(1脚当たり1.25μgのペプチド/0.5mlフロインド不完全アジュバント又はPBS)、血清を各追加免疫後10日ごとに採取し(6ml/kg)、抗体価が増加しなくなった時点で動物を安楽死させ放血させた。
4匹のBALB/cマウスに、タイターマックス(TiterMax)アジュバント(Pierce)中で乳化した35μgの精製ヒトクラステリンを皮下(s.c.)及び腹腔内(i.p.)に注射した。3週後に動物をi.p.で再注射し、血清力価を10日後に評価した。10週後に、反応の良いマウスは、i.p.注射(50μg精製クラステリン)によって追加免疫し、3日後に犠牲にした。脾臓細胞を採取し、NS0ミエローマ細胞と融合し、直ちに20%FBS、100μMヒポキサンチン、0.4μMアミノプテリン及び16μMチミジン(HAT培地)、マウスIL−6(1ng/ml)、ペニシリン(50U/ml)及びストレプトマイシン(50μg/ml)を添加したイスコフ培地中で平板培養した(96ウェルマイクロプレート中に5×104細胞/ウェル、Costar)。上清(融合後10〜20日)を、酵素免疫測定法(ELISA)によって、固定化した精製クラステリンに対する抗クラステリン活性について検査した。抗体産生細胞をクローニングし、抗クラステリン活性に対して2度再検査した。13個の抗クラステリン抗体を産生するクローンを生成し、凍結されたストックを調製し、大規模抗体産生を開始した。
SPRに基づいたバイオセンサ(Biacore)エピトープマッピング
●ランニングバッファー:
○HBS(20mM Hepes(pH7.4)、150mM NaCl、3.4mM
EDTA、0.005%Tween20)
○実験はすべて5μL/分で実行された。
●抗マウスFc免疫グロブリンの標準的アミンカップリング:
○0.05M NHS及び0.2M EDCの混合物の35μLを注入する。
○適切な量が捕捉されるまで、30μg/mLの濃度で10mM NaAc、pH5.0中で希釈された抗体を注入する。
○35μLの1Mエタノールアミン−HCL、pH8.5を注入する。
●エピトープマッピング:
○25μg/mL又は50μg/mLの濃度でmAb1の25μLを注入する。
○IgG1、IgG2a、IgG2b及びIgG3の混合物の25μLを、25μg/mLの濃度で各々注入する。
○30μg/mLの濃度でヒト組換えクラステリンの25μLを注入する。
○25μg/mL又は50μg/mLの濃度で25μLのmAb2を注入する。
●対照:
○各組の抗体に対し、mAb2の非特異的な結合は、エピトープマッピングの項において記述されている注入すべての繰り返しであるが、クラステリンの代わりにランニングバッファーを注入することによって決定された。
○対照においてmAb2注入の終了20秒後に得られた反応(RU)は、クラステリンの存在下において得られた反応から差引かれた。
●表面の再生:
○各サイクルの終わりで、10μLの20mMグリシンpH1.7、続いて10μLの100mM HClを注入する。
●ランニングバッファー:
○HBS(20mM Hepes(pH7.4)、150mM NaCl、3.4mM
EDTA、0.005%Tween20)
●抗体の標準的アミンカップリング:
○0.05M NHS及び0.2M EDCの混合物の35μLを注入する。
○適切な量が捕捉されるまで、20〜80μg/mLにわたる(raging)濃度で10mM NaAc(pH4.5又はpH5.0)中で希釈された抗体を注入する。
○35μLの1Mエタノールアミン−HCl、pH8.5を注入する。
●対照表面の調製
○0.05MのNHS及び0.2MのEDCの混合物の35μLを注入する。
○35μLの1Mエタノールアミン−HCl、pH8.5を注入する。
●競合
○50nMのヒト組換えクラステリンをPBS(Mg++及びCa++無し)中で250nM又は500nMの抗体と混合する。
○抗体単独のチューブを準備する。
○25μLのクラステリン単独、抗体単独、又は抗体表面及び対照表面の上に抗体とプレインキュベートされたクラステリンを、5μL/分のフローで注入する。
○抗体とプレインキュベートされたクラステリンに対して得られた反応から、同じ抗体単独の溶液に対して得られた反応を引く。
○抗体とプレインキュベートされたクラステリンに対して得られた反応を、クラステリン単独に対して得られた反応で割ることによって、%結合阻害を算出する。
●再生溶液
○各サイクルの終わりで、20μL/分の流量で10mM HClの10μLを注入す
る。
50ng又は100ngの様々なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体調製物(C18)を、20μLのプロテインGスラッシュ(PBS中で1:1)と4℃で一晩インキュベートした。次に500ngのヒト組換えクラステリンを添加し、混合物を4℃でさらに2時間インキュベートした。免疫複合体を、1mLのバッファー(150nM NaCl、50mMトリス(pH 8.0)、0.55%NP−40、50mMフッ化Na)により3回洗浄し、20μLの還元サンプルバッファーを添加した。サンプルを12%SDS−PAGEに載せる前に5分間煮沸した。次に分離されたタンパク質をニトロセルロース膜に転写し、膜は記述されたような抗クラステリン抗体によりプロービングされた(were probed)。
全RNAは12個のハイブリドーマから単離され、ファーストストランドcDNAは逆転写酵素及びIg−3定常領域プライマーにより調製され、その後適切なIg−5’プライマーにより増幅された。KODホットスタートDNAポリメラーゼと併用して使用されるこれらのプライマーセットは、軽鎖及び重鎖cDNAの可変領域を特異的に増幅する。PCR産物は、NovagenのpSTBlue−1のパーフェクトリー・ブラント(Perfectly
Blunt)(商標)クローニングキットにより直接クローニングするか、又はシングルdA(Single dA)(商標)テーリングキットにより処理し、pSTBlue−1 Acce
pTor(商標)ベクターへクローニングすることができる。詳細については、図13を参照。
cDNAマイクロアレイ(15,264配列が確認されたマウスEST、National Institute of AgingのNIAKマウスcDNAクローンセット、National Insitute of Health、米国、http://lgsun.grc.nia.nih.gov/cDNA/15k.html)はトロントの大学ヘルスネットワークマイクロアレイセンター(University Health Network Microarray Center in Toronto)、オンタリオ、カナダ(http://www.microarrays.ca/)から得られた。スライドは、記述されるようにCy3又はCy5で標識されたcDNAとハイブリダイズされ(Enjalbert他,2003)、10ミクロンの解像度でScanArray 5000(Perkin Elmer、v2.11)を使用してスキャンし、16ビットTIFFファイルがQuantArrayソフトウェア(Perkin Elmer、v3.0)を使用して定量化された。記述されるように、マイクロアレイのデータ正規化及び分析が実行された(Enjalbert他,2003)。
細胞(2×104細胞/ウェル)を、TGF−β1、TGF−β1+cluβ抗体、又は精製クラステリンの非存在下又は存在下において、Al−Moustafa他(1999)に記載のインクをコートした12ウェルプレート中に播種した。画像をLeitzのアリストプラン顕微鏡に取り付けた株式会社ニコンのクールピクス995(Coolpix 995)デジタルカメラを使
用して24時間後に撮影し、粒子の無い軌跡をImageJフリーウェア(National Institute for Health、ベセスダ、マリーランド、米国、http://rsb.info.nih.gov/ij/)を使用して定量化した。
細胞(2×104細胞/ウェル)を、TGF−β1、TGF−β1+cluβ抗体、又は精製クラステリンの非存在下又は存在下において、Al−Moustafa他(1999)に記載のインクをコートした12ウェルプレート中に播種した。画像をLeitzのアリストプラン顕微鏡
に取り付けた株式会社ニコンのクールピクス995デジタルカメラを使用して24時間後に撮影し、粒子の無い軌跡をImageJフリーウェア(National Institute for Health、ベセスダ、マリーランド、米国、http://rsb.info.nih.gov/ij/)を使用して定量化した。
ペプチド(クラステリンタンパク質のうちのアミノ酸421〜437)は、カルガリー大学(Integrated Peptide Services,Faculity of Medicine,University of Calgary、カルガリー、アルバータ、カナダ)(http://peplab.myweb.med.ucalgary.ca/)で産生及び精製された。表面プラズモン共鳴(SPR、ビアコア(Biacore)(商標)2000)によるウサギ抗血清のスクリーニングに使用されたCM−5センサーチップの表面に対する配向結合を容易にするために、余剰のシステインをペプチドのC末端に追加した。ペプチドは、グルタルアルデヒド(Sigma)又は1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドHCL(Pierce)のいずれかを使用して、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH、イムジェクト・マリカルチャー(Imject Mariculture) KLH、Pierce)に結合され、PBSに対して透析された(4℃で一晩)。2つの方法によって結合したペプチド調製物を混合した(1:1)。免疫前血清を2羽のメスのニュージーランドホワイトウサギ(10ml)から採取し、次にKLH結合ペプチド調製物(1脚当たり1.25μgペプチド/0.5mlフロインド不完全アジュバント又はPBS)を注射した。動物は3週ごとに追加免疫し(1脚当たり1.25μgのペプチド/0.5mlフロインド不完全アジュバント又はPBS)、血清を各追加免疫後10日ごとに採取し(6ml/kg)、抗体価が増加しなくなった時点で動物を安楽死させ放血させた。
Claims (37)
- クラステリンへの結合親和性を有する薬剤であって、クラステリンへの該薬剤の結合が、癌細胞における上皮間葉転換を阻害する、クラステリンへの結合親和性を有する薬剤。
- 前記薬剤がクラステリンのβ−サブユニットへの結合親和性を有する、請求項1に記載の薬剤。
- 前記薬剤が前記クラステリンβ−サブユニットのC末端部分への結合親和性を有する、請求項2に記載の薬剤。
- 前記クラステリンβ−サブユニットのC末端部分への特異的な結合親和性を有する、請求項3に記載の薬剤。
- 前記薬剤が、前記クラステリンβ−サブユニットのC末端部分のアミノ酸375〜449の部位に結合する、請求項3に記載の薬剤。
- クラステリンへの前記薬剤の結合が、前記クラステリンβ−サブユニットのC末端部分中にコンフォメーション変化をもたらす、請求項1に記載の薬剤。
- 前記薬剤が抗体である、請求項1に記載の薬剤。
- 前記薬剤がモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、請求項7に記載の薬剤。
- 前記抗体が、配列番号6を含むアミノ酸配列を有する、請求項7に記載の薬剤。
- 前記抗体が、配列番号7を含むアミノ酸配列を有する、請求項7に記載の薬剤。
- 前記モノクローナル抗体が、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29及び配列番号30から成る群から選択される少なくとも1つの配列を含む、請求項8に記載の薬剤。
- 前記モノクローナル抗体が、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29又は配列番号30のうちの少なくとも1つの相補性決定領域に対応するアミノ酸配列を含む、請求項8に記載の薬剤。
- 癌細胞の活性を調節する方法であって、クラステリンへの結合親和性を有する薬剤に該細胞を曝露する工程を含む、癌細胞の活性を調節する方法。
- 前記薬剤が、クラステリンの前記β−サブユニットへの結合親和性を有する、請求項13に記載の方法。
- 前記薬剤が、前記クラステリンβ−サブユニットのC末端部分への結合親和性を有する
、請求項14に記載の方法。 - 前記薬剤が、前記クラステリンβ−サブユニットのC末端部分への特異的な結合親和性を有する、請求項15に記載の方法。
- 前記薬剤が、前記クラステリンβ−サブユニットのC末端部分のアミノ酸375〜449間の部位に結合する、請求項16に記載の方法。
- クラステリンへの前記薬剤の結合が、前記クラステリンβ−サブユニットのC末端部分中にコンフォメーション変化をもたらす、請求項13に記載の方法。
- 前記薬剤が、抗体である、請求項13に記載の方法。
- 前記薬剤が、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、請求項19に記載の方法。
- 前記抗体が、配列番号6を含むアミノ酸配列を有する、請求項19に記載の方法。
- 前記抗体が、配列番号7を含むアミノ酸配列を有する、請求項19に記載の方法。
- 前記モノクローナル抗体が、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29及び配列番号30から成る群から選択される少なくとも1つの配列を有する、請求項20に記載の方法。
- 前記モノクローナル抗体が、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29又は配列番号30のうちの少なくとも1つの相補性決定領域に対応するアミノ酸配列を含む、請求項20に記載の方法。
- クラステリンへの結合親和性を有する薬剤の生成におけるアミノ酸配列の使用であって、該配列が、配列番号4又はその一部分を含む、クラステリンへの結合親和性を有する薬剤の生成におけるアミノ酸配列の使用。
- 前記配列が、配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号5を含む、請求項25に記載のアミノ酸配列の使用。
- 前記配列が、配列番号4に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、請求項25に記載のアミノ酸配列の使用。
- 前記配列が、配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号5に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、請求項25に記載のアミノ酸配列の使用。
- 癌細胞における上皮間葉転換に関与するクラステリン又はその一部分及び薬学的に許容される担体を含むワクチン。
- 配列番号4又はその一部分及び薬学的に許容される担体を含む、請求項29に記載のワクチン。
- 癌腫の治療における使用のための、請求項29に記載のワクチン。
- ワクチンの調製におけるアミノ酸配列の使用であって、該配列が、配列番号4又はその一部分を含む、ワクチンの調製におけるアミノ酸配列の使用。
- 前記配列が、配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号5を含む、請求項32に記載のアミノ酸配列の使用。
- 前記配列が、配列番号4に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、請求項32に記載のアミノ酸配列の使用。
- 前記配列が、配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号5に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、請求項32に記載のアミノ酸配列の使用。
- 配列番号1〜配列番号30のうちの少なくとも1つをコードする核酸配列。
- 診断ツールとしてのクラステリンへの結合親和性を有する薬剤の使用であって、クラステリンへの該薬剤の結合が、癌細胞における上皮間葉転換を阻害する、診断ツールとしてのクラステリンへの結合親和性を有する薬剤の使用。
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