MX2007000383A - Metodos y composiciones para la deteccion de enfermedad ovarica. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan metodos y composiciones para identificar cancer de ovarios en una muestra de paciente; los metodos de la invencion comprenden detectar la sobreexpresion de por lo menos un biomarcador en una muestra corporal, en donde el biomarcador se sobreexpresa selectivamente en cancer de ovarios; en modalidades preferidas, la muestra corporal es una muestra de suero; los biomarcadores de la invencion incluyen cualesquiera genes o proteinas que se sobreexpresan selectivamente en cancer de ovarios, incluyendo, por ejemplo, reactivos de fase aguda, lipoproteinas, proteinas implicadas en la regulacion del sistema de complemento, reguladores de apoptosis, proteinas que se unen a hemoglobina, hemo, o hierro, proteinas citoestructurales, enzimas que destoxifican los productos secundarios metabolicos, factores de crecimiento, y transportadores de hormonas; en algunos aspectos de la invencion, la sobreexpresion de un biomarcador de interes se detecta como el nivel de proteina utilizando anticuerpos especificos de biomarcador o al nivel de acido nucleico utilizando tecnicas de hibridacion de acido nucleico; tambien se proporcionan equipos para practicar los metodos de la invencion.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA LA DETECCIÓN DE ENFERMEDAD OVARICA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con métodos y composiciones para la detección de cáncer ovárico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El cáncer de ovario es responsable de morbilidad y mortalidad significativas en poblaciones alrededor del mundo. De acuerdo con los datos de la American Cáncer Society, existe un cálculo de 23,400 casos nuevos de cáncer de ovario al año únicamente en los Estados Unidos. Adicionalmente, existen 13,900 muertes relacionadas con cáncer de ovario al año lo que la convierte en la quinta causa de muerte por cáncer entre las mujeres en los Estados Unidos. Dado que 80% a 90% de las mujeres quienes desarrollan cáncer de ovario no tendrán un antecedente familiar de la enfermedad, los esfuerzos de investigación se han enfocado en desarrollar protocolos de cribado y diagnóstico para detectar cáncer de ovario durante las etapas tempranas de la enfermedad. No obstante, ninguna de las pruebas de cribado desarrolladas hasta ahora ha demostrado reducir la mortalidad por cáncer ovárico.

La clasificación de los cánceres determina el tratamiento apropiado y ayuda a determinar el pronóstico. Los cánceres de ovario se clasifican de acuerdo con su histología (es decir, "gradación") y el grado de enfermedad ("es decir, etapa") utilizando los sistemas reconocidos de gradación y etapas. En el grado I, el tejido tumoral está bien diferenciado. En el grado II, el tejido tumoral está moderadamente bien diferenciado. En el grado III, el tejido tumoral está poco diferenciado. El grado III se relaciona con un pronóstico menos favorable que ya sea el grado I o II. La etapa I generalmente se confina dentro de la cápsula que rodea a uno (etapa 1A) o ambos (etapa 1B) ovarios, aunque en algunos cánceres en etapa I (es decir, etapa 1C), se pueden detectar células malignas en ascitis, en fluido de enjuague peritoneal o sobre la superficie de los ovarios. La etapa II involucra la extensión de metástasis del tumor desde uno o ambos ovarios a otras estructuras pélvicas. En la etapa HA, el tumor se extiende o ha generado metástasis al útero, las trompas de Falopio o ambas estructuras. La etapa IIB involucra metástasis del tumor a la pelvis. La etapa IIC es la etapa IIA o IIB con el requerimiento adicional de que las células malignas se pueden detectar en ascitis, en fluido de enjuague peritoneal o sobre la superficie de los ovarios. En la etapa III, el tumor comprende por lo menos una extensión maligna del intestino delgado o el omento, se han formado implantes peritoneales extrapélvicos de tamaño microscópico (etapa IIIA) o macroscópico (menores de 2 centímetros de diámetro, etapa IIIB; mayores de 2 centímetros de diámetro, etapa INC), o han generado metástasis a un nodulo linfático retroperitoneal o inguinal (un indicador alternativo de la etapa NIC). En la etapa IV se pueden detectar metástasis distantes (es decir, no peritoneales) del tumor. La duración exacta de las diversas etapas de los cánceres de ovario no se conocen pero se considera que son de por lo menos aproximadamente un año cada una (Richart et al., 1969, Am. J. Obstet. Gynecol. 105:386). El pronóstico empeora al aumentar la designación de la etapa. Por ejemplo, las tasas de supervivencia a 5 años para pacientes a quienes se les ha diagnosticado con la etapa I, II, III y IV de cáncer ovárico son de 80%-95%, 57%, 25% y 8%, respectivamente. Actualmente, más de aproximadamente 60% de los cánceres de ovario se diagnostican en la etapa III o la etapa IV, en donde el pronóstico es peor. La alta mortalidad de cáncer ovárico es atribuible a la carencia de síntomas específicos entre pacientes en las etapas tempranas de cáncer de ovario, por lo que vuelve difícil el diagnóstico temprano. Las pacientes afligidas con cáncer de ovario con mucha frecuencia presentan malestares inespecíficos tales como hemorragia vaginal anormal, síntomas gastrointestinales, síntomas en las vías urinarias, dolor en el abdomen inferior y distensión abdominal generalizada. Estas pacientes rara vez se presentan con síntomas paraneoplásicos o con síntomas que indiquen con claridad cáncer de ovario. Debido a la ausencia de signos de advertencia primarios, menos de aproximadamente 40% de pacientes afectadas con cáncer de ovario se presentan en la etapa I o en la etapa II de cáncer. El manejo de cáncer de ovario puede mejorar de manera significativa si la enfermedad se puede detectar en una etapa inicial cuando los tratamientos generalmente son mucho más eficaces. El cáncer de ovario se puede diagnosticar, en parte al hacer una recolección de antecedentes médicos sistemáticos de una paciente y al realizar un examen físico, examen por rayos X y estudios químicos y hematológicos. Las pruebas hematológicas, las cuales pueden ser indicativas de cáncer de ovario, incluyen el análisis de las concentraciones séricas de las proteínas CA125 y DF3 así como las concentraciones en plasma del ácido lisofosfatídico (LPA). La palpación de los ovarios y las técnicas de ultrasonido, particularmente las que incluyen ultrasonido endovaginal y técnicas de ultrasonido de flujo Doppler a color, pueden ayudar en la detección de tumores de ovario y la diferenciación del cáncer de ovario de quistes ováricos benignos. No obstante, un diagnóstico definitivo de cáncer de ovario aún requiere típicamente de realizar una laparotomía exploratoria. El uso anterior de la concentración sérica de CA125 como un marcador de diagnóstico de cáncer ovárico indica que este método presentó especificidad insuficiente para uso como un método de cribado general. El uso de un algoritmo refinado para interpretar las concentraciones de CA125 en muestras en retrospectiva en serie obtenidas de pacientes, mejora la especificidad del método sin desplazar la detección de cáncer ovárico a una etapa anterior (Skakes, 1995, Cáncer 76:2004). El cribado para LPA para detectar cánceres ginecológicos que incluyen al cáncer ovárico muestra una sensibilidad de aproximadamente 96% y una especificidad de aproximadamente 89%, No obstante, los métodos basados en CA125 y los métodos de cribado basados en LPA presentan el inconveniente de la presencia de CA125 y LPA, respectivamente, en el suero de pacientes afligidas con las condiciones diferentes a cáncer de ovario. Por ejemplo, se sabe que las concentraciones séricas de CA125 están relacionadas con menstruación, embarazo, enfermedades gastrointestinales y hepáticas (por ejemplo colitis y cirrosis), pericarditis, renopatias y diversos cánceres malignos no ováricos. Se sabe, por ejemplo, que LPA sérica puede ser alterada por la presencia de cánceres malignos ginecológicos no ováricos. Un método de cribado que tenga una especificidad mayor para cáncer de ovario en comparación con los métodos de cribado actuales para CA125 y LPA puede proporcionar un cribado que abarque a toda la población para determinar etapas tempranas de cáncer de ovario. También se ha demostrado en estudios clínicos la ineficacia de la prueba sonográfica transvaginal como un método confiable de cribado para determinar cáncer de ovario. Por ejemplo, en un estudio que evalúa la eficacia del cribado sonográfico en 14,469 mujeres asintomáticas, se requirieron un promedio de 5200 ultrasonidos para cada caso de cáncer invasivo detectado (Van Nagell, et al., 2000, Gynecol. Oncol. 77:350-356). En otro estudio, Liede et al., utilizaron tanto sonografía transvaginal como CA125 para realizar un cribado en mujeres con un riesgo alto de cáncer de ovario (2002, J. Clin. Oncol. 20:1570-1577). Liede et al., concluyeron que el método de cribado combinado no es eficaz para reducir la morbilidad o mortalidad por cáncer de ovario. En consecuencia, el US Preventive Services Task Forcé ha recomendado excluir el cribado sistemático para cáncer de ovario de los exámenes periódicos (Goff, et al., 2004, JAMA 22:2710). Más recientemente, se ha comparado el ARNm de tumor con ARNm de tejido normal para identificar genes regulados por aumento (es decir, marcadores de cáncer de ovario) en tejido de cáncer utilizando microarreglos de ADNc. La prostatina, osteopontina, HE4 y una diversidad de otros marcadores se han identificado mediante está técnica. No obstante, una limitación del enfoque de microarreglo de ADNc es que la actividad transcripcional en el tumor no necesariamente refleja con precisión la concentración de proteína o la actividad de la proteína en el tejido. Por ejemplo, solo un porcentaje pequeño de genes en tumores de cáncer de pulmón presenta una relación estadísticamente significativa entre las concentraciones de ARNm y sus proteínas correspondientes (Chen, et al., 2002, Clin. Cáncer Res. 8:2290-2305). Adicionalmente, pueden producirse numerosas alteraciones postraduccionales en proteínas que no se reflejan en cambios en la concentración de ARN. Debido al costo y la sensibilidad y especificidad limitada de los métodos conocidos para detectar cáncer de ovario, actualmente no se realiza un cribado que abarque a toda la población. Además, la necesidad de realizar la laparotomía con el fin de diagnosticar cáncer ovárico en pacientes quienes fueron cribados y dieron resultado positivo para indicaciones de cáncer de ovario limita lo deseable de un cribado que abarque a toda la población. Así, existe una necesidad apremiante por desarrollar un cribado y una metodología de diagnóstico más sensible y específica que se base en la expresión de un gen o proteína de marcadores de cáncer de ovario. En resumen la tasa de supervivencia y la calidad de la vida del paciente mejoran si se detecta de manera temprana el cáncer de ovario. Por lo tanto, existe una necesidad apremiante por métodos sensibles y específicos para detectar cáncer de ovario, particularmente ovárico en etapas tempranas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se proporcionan composiciones y métodos para el diagnóstico de cáncer de ovario. Los métodos de la invención comprenden detectar la sobreexpresión de por lo menos un biomarcador en una muestra corporal, en donde la detección de sobreexpresión del biomarcador identifica de manera específica muestras que son indicativas del cáncer de ovario. El presente método distingue muestras que son indicativas de cáncer de ovario de muestras que son indicativas de proliferación benigna. Por lo tanto, el método se basa en la detección de un biomarcador que se sobreexpresa selectivamente en estado de cáncer ovárico pero que no se sobreexpresa en células normales o células que no son indicativas de enfermedad clínica. En modalidades particulares, los métodos de la invención pueden facilitar el diagnóstico de cáncer de ovario en una etapa temprana.

Los biomarcadores de la invención son proteínas y/o genes que se sobreexpresan selectivamente en cáncer de ovario. Son de interés particular los biomarcadores que sobreexpresan en una etapa temprana de cáncer ovárico. Los biomarcadores incluyen, por ejemplo, reactivos en fase aguda (por ejemplo inhibidores de proteasa y proteínas inflamatorias), lipoproteínas, proteínas involucradas en la regulación del sistema de complemento, reguladores de apoptosis, proteínas que unen hemoglobina, hemo o hierro, proteínas citoestructurales, enzimas que destoxifican los productos secundarios metabólicos, factores de crecimiento y transportadores de hormonas. La detección de la sobreexpresión de genes o proteínas biomarcadoras de la invención permite la diferenciación de muestras que son indicativas de enfermedad ovárica con respecto a células normales o células que no son indicativas de enfermedad clínica (por ejemplo proliferación benigna). Se puede determinar la sobreexpresión de biomarcador a nivel tanto de proteína como de ácido nucleico. En algunas modalidades se proporcionan técnicas de inmunoquímica que utilizan anticuerpos para detectar la sobreexpresión de proteínas biomarcadoras en muestras de suero de paciente. En este aspecto de la invención se utiliza por lo menos un anticuerpo dirigido a un biomarcador específico. La sobreexpresión también se puede detectar por técnicas basadas en ácido nucleico que incluyen, por ejemplo, hibridización. Se proporcionan adicionalmente equipos que comprenden reactivos para llevar a la práctica los métodos de la invención.

Los métodos de la invención también se pueden utilizar en combinación con técnicas diagnósticas ginecológicas y hematológicas tales como cribado sonográfico transvaginal y análisis de las concentraciones séricas de CA125. Así, por ejemplo, los métodos de inmunoquímica que se presentan aquí se pueden combinar con el análisis de CA125 y la prueba sonográfica transvaginal de manera que se conserve toda la información de los métodos convencionales. De esta manera, la detección de biomarcadores que se sobreexpresan selectivamente en cáncer de ovario puede reducir las altas tasas de resultados "falsos positivos" y "falsos negativos" que se observan con otros métodos de cribado y puede facilitar un cribado automatizado en grandes proporciones.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona composiciones y métodos para identificar o diagnosticar cáncer de ovario, particularmente cáncer de ovario en etapas tempranas. Los métodos comprenden la detección de la sobreexpresión de biomarcadores específicos que se sobreexpresan selectivamente en cáncer de ovario. Esto es, los biomarcadores de la invención son capaces de distinguir muestras que son indicativas de cáncer de ovario de muestras normales y aquellas no características de enfermedad clínica (por ejemplo, proliferación benigna). Los métodos para diagnosticar cáncer de ovario involucran la detección de la sobreexpresión de por lo menos un biomarcador que es indicativo de cáncer de ovario en una muestra corporal, particularmente una muestra de suero de una paciente. En ciertos aspectos de la invención, los métodos permiten la detección de cáncer de ovario en una etapa temprana. En modalidades particulares se utilizan técnicas de anticuerpos e inmunohistoquímica para detectar la expresión de un biomarcador de interés. Se proporcionan adicionalmente equipos para llevar a la práctica los métodos de la invención. Se pretende que el término "diagnóstico de cáncer de ovario" incluya, por ejemplo, el diagnóstico o detección de la presencia de cáncer de ovario, monitoreo del progreso de la enfermedad e identificación o detección de células o muestras que sean indicativas de cáncer de ovario. Los términos diagnosticar, detectar e identificar cáncer de ovario se utilizan de manera intercambiable en este documento. Mediante el término "cáncer de ovario" se quieren indicar aquellas condiciones clasificadas por laparotomía post-exploratoria como de patología premaligna, patología maligna y cáncer (etapas l-IV FIGO). El término "cáncer de ovario en etapa temprana" se refiere a aquellos estados de enfermedad clasificados como carcinoma en etapa I o en etapa II. La detección temprana de cáncer de ovario incrementan de manera significativa las tasas de supervivencia a 5 años. Como se expone en lo anterior, un porcentaje significativo de pacientes mal diagnosticados por los métodos de diagnóstico tradicionales actualmente presentan cáncer de ovario. Así, los métodos de la presente invención permiten un diagnóstico preciso de cáncer de ovario en todas las poblaciones de pacientes que incluyen estos casos "falsos positivos" y "falsos negativos" y facilitan la detección temprana de cáncer de ovario. La detección de cáncer de ovario en etapas tempranas de la enfermedad mejora el pronóstico del paciente y su calidad de vida. El diagnóstico se puede realizar independiente de la determinación de CA125 y del estado sonográfico transvaginal, aunque los métodos de la invención también se pueden utilizar junto con estas técnicas convencionales de cribado diagnóstico. Los métodos que se describen en la presente proporcionan detección superior de cáncer de ovario en comparación con el análisis de CA125 o cribado sonográfico transvaginal y pueden permitir la detección de cáncer de ovario en una etapa temprana. En aspectos particulares de la invención, la sensibilidad y especificidad de los presentes métodos es igual o mayor que la de la determinación de CA125 o un cribado sonográfico transvaginal. De la manera en que se utiliza en la presente, el término "especificidad" se refiere al nivel en el cual un método de la invención puede identificar con precisión muestras que se han confirmado como no malignas por laparotomía exploratoria (es decir, verdaderos negativos). Es decir, la especificidad es la proporción de negativos a la enfermedad que proporcionan un resultado negativo en la prueba. En un estudio clínico, se calcula la especificidad al dividir el número de verdaderos negativos entre la suma de verdaderos negativos y falsos positivos. Mediante el término "sensibilidad" se indica el nivel en el cual un método de la invención puede identificar con precisión muestras que se han confirmado por laparotomía como positivas de cáncer de ovario (es decir, verdaderos positivos). De esta manera, la sensibilidad es la proporción de positivos de la enfermedad que dan como resultado positivo en la prueba. Se calcula la sensibilidad en un estudio clínico al dividir el número de verdaderos positivos entre la suma de verdaderos positivos y falsos negativos. La sensibilidad de los métodos descritos para la detección de cáncer de ovario es de por lo menos aproximadamente 70%, de manera preferible por lo menos 80%, de manera más preferible por lo menos aproximadamente 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% o mayor. Además, la especificidad de los presentes métodos preferiblemente es de por lo menos aproximadamente 70%, de manera más preferible por lo menos aproximadamente 80%, de manera mucho más preferible por lo menos aproximadamente 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% o mayor. Los biomarcadores de la invención incluyen genes y proteínas. Dichos biomarcadores incluyen ADN que comprende la secuencia completa o parcial de la secuencia de ácido nucleico que codifica para el biomarcador o el complemento de dicha secuencia. Los ácidos nucleicos biomarcadores también incluyen ARN que comprende la secuencia completa o parcial de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de interés. Una proteína biomarcadora es una proteína codificada por, o que corresponde a un biomarcador de ADN de la invención. Una proteína biomarcadora comprende la totalidad de la secuencia parcial de aminoácidos de cualquiera de las proteínas o polipéptidos biomarcadores.

Un "biomarcador" es cualquier gen o proteína cuyo nivel de expresión en un tejido o célula se altera en comparación con el de una célula o tejido normal o sano. Los biomarcadores de la invención son selectivos para cáncer de ovario. Mediante el término "que se sobreexpresan selectivamente en cáncer de ovario" se indica que el biomarcador de interés se sobreexpresa en cáncer de ovario pero no se sobreexpresa en condiciones clasificadas como no malignas, benignas u otras condiciones que no se consideran que sean una enfermedad clínica. De esta manera, la detección de los biomarcadores de la invención permite la diferenciación de muestras indicativas de cáncer de ovario de muestras normales y muestras que son indicativas de proliferación no maligna y benigna. De esta manera, los métodos de la invención permiten la identificación precisa de cáncer de ovario, incluso en casos clasificados erróneamente como normales, no malignos o benignos por métodos de diagnóstico tradicionales (es decir, "falsos negativos") tales como cribado sonográfico transvaginal. Los biomarcadores de la invención incluyen cualquier gen o proteína que se sobreexpresa selectivamente en cáncer de ovario, como se define en la presente en lo anterior. Tales biomarcadores son capaces de identificar genes o proteínas dentro de una muestra de paciente que se asocian con una enfermedad ovárica premaligna, maligna o francamente cancerosa. Aunque en la presente invención se puede utilizar cualquier biomarcador indicativo de cáncer de ovario, en las modalidades preferidas, el biomarcador se selecciona del grupo que consiste de reactivos en fase aguda (por ejemplo inhibidores de proteasa y proteínas inflamatorias), lipoproteínas, proteínas involucradas en la regulación del sistema de complemento, reguladores de apoptosis, proteínas que unen hemoglobina, hemo o hierro, proteínas citoestructurales, enzimas que destoxifican los productos secundarios metabólicos, factores de crecimiento y transportadores de hormona. Además, en modalidades particulares los biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste de a-1 -antitripsina, AMBP, calgranulina B, anidrasa carbónica, clusterina, cofilina (isoforma que no está en músculo), ficolina 2, ficolina 3, gelsolina, haptoglobina y biomarcador relacionado con haptoglobina, hemopexina, inhibidor de inter-a-tripsina, peptidil-prolil-cis-trans isomerasa A, glutation peroxidada plasmática, proteína básica plaquetaria, serotransferrina, proteína A4 amiloide sérica, tetranectina, transtiretina, vitronectina y zinc-a-2-glucoproteína. Son de interés particular los biomarcadores que se sobreexpresan selectivamente en cáncer de ovario en etapa temprana. Mediante el término que se sobreexpresan selectivamente en cáncer de ovario en etapa temprana" se pretende que el biomarcador de interés se sobreexprese en los estados de cáncer de ovario de la etapa I o la etapa II, pero que no se sobreexprese en muestras normales o en condiciones clasificadas como no malignas, benignas y otras condiciones que no se consideran que sea una enfermedad clínica. Una persona experta en la técnica apreciará que los biomarcadores de cáncer de ovario en etapa temprano incluyen aquellos genes y proteínas indicativas de cáncer de ovario que inicialmente se sobreexpresan en la etapa I o la etapa II y cuya sobreexpresión persiste a través de las etapas avanzadas de la enfermedad, así como biomarcadores que únicamente se sobreexpresan en cáncer de ovario en etapa I o etapa II. La detección de biomarcadores que se sobreexpresan selectivamente en cáncer de ovario en etapa temprana pueden permitir la detección más temprana y el diagnóstico de cáncer de ovario y, en consecuencia, mejorar el pronóstico de la paciente. Las proteínas reactivas en fase aguda son biomarcadores de interés e incluyen, por ejemplo, inhibidores de proteasa y proteínas inflamatorias. La a-1 -antitripsina es un inhibidor de proteasa, particularmente un inhibidor de serina proteasa. La deficiencia de esta enzima se relaciona con enfisema y hepatopatía. La a-1 -antitripsina es un inhibidor potente de elastasa y también tiene una afinidad moderada por plasmina y trombina. La proteína es codificada por un gen (Pl) que se localiza en el brazo largo distal del cromosoma 14. AMBP, o precursor de a-1-microglobulina/bicunina es un reactivo en fase aguda y se encuentra en muchos fluidos fisiológicos que incluyen plasma, orina y fluido cerebroespinal. AMBP existe tanto como un monómero libre y también formando complejos con IgA y albúmina. El inhibidor 4 de inter-a-tripsina (glucoproteína sensible a calicreina plasmática) también parece ser un reactivo en fase aguda. Esta proteína pertenece a los inhibidores de proteasa de la familia del tipo Kunitz. A diferencia de otros miembros de esta familia de proteínas (por ejemplo H1 , H2 y H3), el Inhibidor 4 de inter-a-tripsina carece de una cadena bicunina. La calgranulina B se asocia con citocinas inflamatorias y se expresa en monocitos infiltrados y granulocitos. La calgranulina B es un miembro de la familia de proteínas S100. Los genes de S100 que contienen dos motivos de unión de calcio EF-manual y por lo menos 13 miembros de familia se han identificado y se localizan como un grupo en el cromosoma 1q21. La calgranulina B de igual manera funciona en la inhibición de caseína cinasa, una expresión alterada de esta proteína se ha encontrado en fibrosis quística. En modalidades particulares los biomarcadores de la invención comprenden proteínas que están involucradas en la degradación de lípidos, el intercambio o el transporte de proteínas. La apolipoproteína L1 es una llpoproteína de alta densidad secretada que se une a apolipoproteína A-l. Este miembro de la familia de apolipoproteína L puede jugar un papel en el intercambio de lípidos y transporte a través del cuerpo así como en el transporte Inverso de colesterol desde las células periféricas al hígado. Se han identificado por lo menos tres variantes de transcrito que codifican para dos isoformas diferentes de este gen. La zinc-a-2-glucoproteína estimula la degradación de lípidos en adipocitos y provoca pérdidas externas de grasa relacionadas con ciertos cánceres avanzados. La proteína también puede unir ácidos grasos poliinsaturados.

La proteína amiloide A sérica y la proteína A-4 amiloide sérica son los reactivos mayores en fase aguda y las apolipoproteínas del complejo HDL. Ambas proteínas se expresan en el hígado y son secretadas al plasma. También son de interés las proteínas que regulan el sistema de complemento o las vías apoptósicas. El componente de complemento C3 juega un papel central en la activación del sistema de complemento. Se requiere la activación de C3 para las vías de activación de complemento tanto clásica como alternativa. Los pacientes que se presentan con deficiencia en C3 presentan susceptibilidad aumentada a infecciones bacterianas. La proteína 2 relacionada con el factor H de complemento también puede estar involucrada en la regulación del sistema de complemento. La proteína 2 relacionada con el factor H de complemento puede asociarse con lipoproteínas y puede jugar un papel en el metabolismo de lípidos. La familia de proteínas de ficolina activa el sistema de complemento a través de la vía de lectina. La familia de proteínas de ficolina está caracterizada por la presencia de un péptido líder (es decir, un segmento corto en la parte N terminal) seguido por una región similar a colágeno y un dominio similar a fibrinógeno en la parte C terminal. Los dominios similar a colágeno y similar a fibrinógeno de las proteínas de ficolina también se encuentran en otras proteínas tales como, por ejemplo, la proteína C1q de complemento, tenacina y lectina de tipo C conocidas como colectinas. En el suero humano existen dos tipos de ficolinas. La ficolina 2, codificada por FCN2 se expresa de manera predominante en el hígado y se ha demostrado que tiene actividades de unión de carbohidratos y opsónica. Se han descrito cuatro variantes de transcrito de FCN2, que surgen al empalmar de manera alternada y codificar isoformas diferentes de ficolina 2. La que predomina más es la variante de empalme SVO. El transcrito del gen de FCN2 en el hígado codifica para una proteína de 313 aminoácidos y representa la isoforma de ficolina 2 más grande. La ficolina 3 es una ß-2-macroglucoproteína termolábil y es un miembro de la familia de lectina p35 de ficolina/opsonina. La proteína, la cual inicialmente se identificó en base en su reactividad con sueros de pacientes con lupus eritematoso sistémico se ha demostrado que tiene actividad de lectina independiente de calcio. La proteína puede activar la vía de complemento en asociación con los MASP y sMAP, y por lo tanto ayuda en la defensa del hospedador a través de la activación de la vía de lectina. Se produce un empalme alternativo en este locus y se han identificado dos variantes, cada una codifica para una isoforma distinta. No obstante, aún no está clara la función de clusterina, se le ha asociado con muerte celular programada (apoptósis). La clusterina se expresa en una diversidad de tejidos y se puede unir a células, membranas y proteínas hidrofóbicas. Las proteínas biomarcadoras que se unen a hemo, hemoglobina o hierro también son de interés. La haptoglobina se expresa en hígado y se combina con la hemoglobina libre en plasma. La haptoglobina evita la pérdida de hierro a través de los riñones y protege a los riñones de daño por hemoglobina, mientras que también vuelve a la hemoglobina accesible a enzimas degradantes. El precursor de la proteína relacionada con haptoglobina también se sobreexpresa selectivamente en ciertos cánceres de ovario en etapa temprana. La hemopexina es una proteína que se une a hemo que transporta hemo al hígado para su ruptura y recuperación de hierro, después de lo cual la hemopexina libre regresa a la circulación. La hemopexina se expresa por el hígado y es secretada en plasma. La serotransferrina es una glucoproteína unida a hierro que transporta hierro desde el intestino, sistema retículo endotelia, y células parenquimales del hígado a todas las células proliferantes en el cuerpo. Tiene un peso molecular aproximado de 76.5 kDa y posee dominios C y N terminales homólogos, cada uno de los cuales se une a un ion de hierro férrico. Además de su función en el transporte de hierro, la serotransferrina también puede jugar un papel fisiológico como proteína que une granulocitos/polen (GPBP) involucradas en la separación de cierto material orgánico/alérgeno del suero. Las proteínas biomarcadoras que comprenden el citoesqueleto o que están involucradas en mantener, regular o modular la citoestructura de la célula (es decir, proteínas citoestructurales) también se utilizan en la práctica de la invención. Dichas proteínas citoestructurales incluyen, pero no se limitan a proteínas de actina del citoesqueleto, proteínas de matriz no colagenosa y proteínas involucradas en la naturalización adecuada de las proteínas. La cofilina es una proteína moduladora de actina intracelular distribuida ampliamente que une y despolimeriza F-actina filamentosa e inhibe la polimerización de la G-actina monomérica de una manera que depende del pH. La cofilina está involucrada en el desplazamiento del complejo actina-cofilina desde el citoplasma al núcleo. La gelsolina es una proteína moduladora de actina regulada por calcio que se une a los extremos más (o barbados) de los monómeros o filamentos de actina evitando el intercambio de monómeros por bloqueo o rematado. La gelsolina promueve el ensamblado de monómeros en filamentos (nucleación) y también como cortador de filamentos ya formados. La tetranectina y la vitronectina son proteínas de matriz no colagenosas. La tetranectina se une a plasminógeno y al kringle 4 aislado y puede estar involucrada en el empacado de moléculas destinada para exocitosis. La vitronectina se ha encontrado tanto en suero como en tejidos y promueve la adhesión y dispersión celulares, inhibe el efecto de daño a membrana de la vía ciíolítica terminal del complemento y se une a varios inhibidores de serpina serina proteasa. La vitronectina es una proteína secretada y existe ya sea en forma de cadena única o en forma de dos cadenas cortadas que se mantienen juntas por un enlace disulfuro. La peptidil-prolil cis-trans isomerasa A cataliza la isomerización cis-trans de enlaces peptídicos imídicos de prolina en oligopéptidos y acelera la naturalización de las proteínas. Es un miembro de la familia de peptidil-prolil cis-trans ¡somerasa (PPIasa, por sus siglas en inglés). Se han informado múltiples pseudogenes que mapean para cromosomas diferentes. Se han observado tres variantes de transcrito empalmados de manera alternativa que codifican dos ¡soformas distintas. Las enzimas que catalizan la destoxificación de productos secundarios metabólicos también está abarcada por los biomarcadores de la presente Invención. La anhidrasa carbónica I pertenece a una familia grande de metaloenzimas de zinc (es decir, las anhidrasa carbónicas) las CA, por sus siglas en inglés)) que catalizan la hidratación reversible de dióxido de carbono. Las CA participan en una diversidad de procesos biológicos que incluyen respiración, calcificación, equilibrio ácido-base, resorción ósea y formación de humor acuoso, líquido cefalorraquídeo, saliva y ácido gástrico. Las CA muestran una diversidad extensa en distribución de tejido y en su localización subcelular. CA1 está estrechamente relacionada con los genes para CA2 y CA3 en el cromosoma 8, y CA1 codifica para una proteína citosólica que se expresa de manera predominante en eritrocitos. Las variantes de transcrito de CA1 que utilizan sitios poIyA alternativos también han sido descritos. La glutation peroxidasa plasmática cataliza la reducción de peróxido de hidrógeno, hidroperóxido orgánico y peróxidos lipidióos por glutation reducido y función en la protección de células contra el daño oxldativo. Se ha demostrado que la glutation peroxidasa plasmática humana es una enzima que contiene selenio y la expresión parece ser específica de tejido. Los biomarcadores de interés también incluyen factores de crecimiento y proteínas que unen hormona. La proteína básica plaquetaria es factor de crecimiento derivado de plaquetas que pertenece a la familia de quimiocina CXC. Este factor de crecimiento es un potente quimioatrayente y activador de neutrófilos. Se ha demostrado que la proteína básica plaquetaria estimula diversos procesos celulares que incluyen, por ejemplo, síntesis de ADN, mitosis, glucólisis, acumulación intracelular de AMPc, secreción de prostaglandina E2 y síntesis de ácido hialurónico y glucosaminoglucáno sulfatado. También estimula la formación y secreción de activador de plasminógeno por células sinoviales. La transtiretina es una proteína que une hormona, más particularmente una proteína que une hormona tiroidea que probablemente transporta tiroxina desde la corriente sanguínea al cerebro. Aunque se han expuesto con detalle los biomarcadores anteriores, cualquier bíomarcador que se sobreexprese en cáncer de ovario se puede utilizar en la práctica de la invención. En las modalidades particulares, los biomarcadores de interés se sobreexpresan selectivamente en cáncer de ovario en etapa temprana, como se define en la presente en lo anterior. Aunque los métodos de la invención requieren la detección de por lo menos un biomarcador en una muestra de paciente para la detección de cáncer de ovario, se pueden utilizar 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más biomarcadores para llevar a la práctica la presente invención. Se reconoce que la detección de más de un biomarcador en una muestra corporal se puede utilizar para identificar casos de cáncer de ovario. Por lo tanto, en algunas modalidades se utilizan dos o más biomarcadores, de manera más preferible dos o más biomarcadores complementarios. Mediante el término "complementario" se indica que la detección de la combinación de biomarcadores en una muestra corporal resulta en la identificación exitosa de cáncer de ovario en un porcentaje mayor de casos que los que se identificarían si únicamente se utilizaran uno de los biomarcadores. Así, en algunos casos se puede realizar una determinación más precisa de cáncer de ovario mediante la utilización de por lo menos dos biomarcadores. En consecuencia, en donde se utilizan por lo menos dos biomarcadores, por lo menos dos anticuerpos dirigidos a proteínas biomarcadoras distintas se utilizarán para la práctica de los métodos de inmunoquímica que se describen en la presente. Los anticuerpos pueden estar en contacto con la muestra corporal de manera simultánea o concurrente. En modalidades particulares, los métodos de diagnóstico de la invención comprenden recolectar una muestra corporal de un paciente, poner en contacto la muestra con por lo menos un anticuerpo específico para un biomarcador de interés y detectar la unión de anticuerpo. Las muestras que presenten sobreexpresión de un biomarcador de la invención, determinado por la detección de unión de anticuerpo, se consideran positivas para cáncer de ovario. En modalidades preferidas, la muestra corporal es una muestra de suero. En algunos aspectos de la invención, la muestra es una muestra de plasma. Mediante el término "muestra corporal" se pretende cualquier muestreo de células, tejidos o fluidos corporales en los cuales se pueda detectar la expresión de un biomarcador. Los ejemplos de dichas muestras corporales incluyen pero no se limitan a sangre, linfa, orina, fluidos ginecológicos, biopsias y transpiración. Las muestras corporales se pueden obtener de un paciente por una diversidad de técnicas que incluyen, por ejemplo, raspado o frotado de un área mediante la utilización de una aguja para aspirar fluidos corporales. Son bien conocidos en la técnica los métodos para recolectar diversas muestras corporales. En las modalidades preferidas la muestra corporal comprende suero. En una modalidad, se puede utilizar el tubo BD Vacutainer1^ SSTMR para recolectar sangre del paciente para un análisis de suero. El tubo que contiene la sangre se invierte para asegurar un mezclado de aditivo activador de coágulo con la sangre del paciente y el suero resultante se encuentra listo dentro de los siguientes 30 minutos. Cualquiera de los métodos disponibles en la técnica para identificación o detección de los biomarcadores está abarcada en la presente. La sobreexpresión de un biomarcador de la invención se puede detectar a nivel de ácido nucleico o a nivel de proteína. Con el fin de determinar la sobreexpresión, se puede comparar la muestra corporal que se va a examinar con una muestra corporal correspondiente que se origina de una persona sana. Esto es, el nivel de expresión "normal" es el nivel de expresión del biomarcador en una muestra corporal de un sujeto humano o un paciente que no presenta cáncer de ovario. Dicha muestra puede estar presente en forma estandarizada. En algunas modalidades, la determinación de la sobreexpresión del biomarcador no requiere comparación entre la muestra corporal y una muestra corporal correspondiente que se origina de una persona sana. En esta situación, el biomarcador de interés se sobreexpresa en un grado tal que hace innecesaria la comparación con una muestra corporal correspondiente que se origina de una persona sana. Los métodos para detectar biomarcadores de la invención comprenden cualquier método que determine la cantidad o la presencia de los biomarcadores ya sea a nivel de ácido nucleico o de proteína. Tales métodos son bien conocidos en la técnica e incluyen pero no se limitan las pruebas de Western Blot, Northern blot, Southern blot, ensayo inmunosorbente unido a enzima (ELISA, por sus siglas en inglés), inmunoprecipitación, inmunofluorescencia, citometría de flujo, inmunoquímica basada en esferas, inmunoquímica, impresión molecular, aptámeros de ácido nucleico, técnicas de hibridación de ácido nucleico, métodos de transcripción inversa de ácido nucleico y métodos de amplificación de ácido nucleico. En modalidades particulares, la sobreexpresión de un biomarcador se detecta a nivel de proteína utilizando, por ejemplo, anticuerpos que se dirigen contra proteínas biomarcadoras específicas. Estos anticuerpos se pueden utilizar en diversos métodos tales como Western blot, ELISA o técnicas de inmunoprecipitación. En una modalidad los anticuerpos específicos para proteínas biomarcadoras se utilizan para detectar la sobreexpresión de una proteína biomarcadora en una muestra corporal. El método comprende obtener una muestra corporal de un paciente, poner en contacto la muestra corporal con por lo menos un anticuerpo dirigido a un biomarcador que se sobreexpresa selectivamente en cáncer de ovario y detectar la unión de anticuerpo para determinar si el biomarcador se sobreexpresa en una muestra de paciente. Como se indica en lo anterior, se puede obtener en algunos casos un diagnóstico más preciso de cáncer de ovario al detectar más de un biomarcador en una muestra de un paciente. Por lo tanto, en modalidades particulares, se utilizan por lo menos dos anticuerpos dirigidos a dos biomarcadores distintos para detectar cáncer de ovario. Cuando se utiliza más de un anticuerpo, estos anticuerpos se pueden agregar a una muestra única secuencialmente como reactivos de anticuerpo individuales o bien simultáneamente, como una mezcla de anticuerpos. Alternativamente, cada anticuerpo individual se puede agregar a una muestra separada del mismo paciente y los datos resultantes se acumulan. Una persona experta en la técnica reconocerá que los métodos de inmunoquímica descritos en la presente se pueden llevar a cabo manualmente o de una manera automatizada. En un método preferido de inmunoquímica de la invención se utiliza la prueba de ELISA de dos anticuerpos o indirecta ("tipo emparedado") para detectar la sobreexpresión de un biomarcador en una muestra de un paciente. Dichos inmunoensayos "tipo emparedado" o de "dos sitios" son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Current Protocols ¡n Immunology. Indirect Antibody Sandwich ELISA to Detect Soluble Antigens, John Wiley & Sons, 1991. En este aspecto de la invención, se utilizan dos anticuerpos específicos para dos sitios antigénicos distintos en un biomarcador único. Mediante el término "sitio antigénico distinto" se pretende que ios anticuerpos sean específicos para sitios diferentes en la proteína biomarcadora de interés de manera tal que la unión de un anticuerpo no interfiera significativamente con la unión del otro anticuerpo a la proteína biomarcadora. El primer anticuerpo, conocido como el "anticuerpo de captación" se inmoviliza sobre o se une a un soporte sólido. Por ejemplo, un anticuerpo de captación dirigido a un biomarcador de interés se puede unir covalente o no covalentemente a un pozo de una placa de microtitulación, una esfera, una cubeta y otro recipiente de reacción. En una modalidad preferida, el anticuerpo de captación se une a un pozo en una placa de microtitulación. En la técnica se conocen los métodos para unir el anticuerpo a un soporte sólido. La muestra corporal, particularmente una muestra de suero, se pone en contacto con el soporte sólido y se permite que forme un complejo con el anticuerpo de captación unido. Se retira la muestra que no se haya unido y se agrega a la matriz sólida un segundo anticuerpo, conocido como el "anticuerpo de detección". El anticuerpo de detección es específico para un sitio antigénico distintivo en el biomarcador de interés y se acopla o se marca con una sustancia que proporciona una señal detectable. Tales marcas de anticuerpo son bien conocidas en el arte e incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminescentes, materiales bioluminiscentes y materiales radioactivos. Después de la incubación con el anticuerpo de detección, se elimina la muestra que no se haya unido y se determinan los niveles de expresión del biomarcador por cuantificación del anticuerpo de detección marcado unido al soporte sólido. Una persona experta en la técnica reconocerá que los anticuerpos de captación y de detección se pueden poner en contacto con la muestra corporal secuencialmente, como se describe en lo anterior o bien de manera simultánea. Además, el anticuerpo de detección se puede incubar primero con la muestra corporal, antes de poner en contacto a la muestra con el anticuerpo de captación inmovilizado. Son bien conocidas en el arte las técnicas para detectar unión de anticuerpo a través del uso de una marca detectable. Por ejemplo, la unión de anticuerpo se puede detectar mediante el uso de reactivos químicos que generen una señal detectable que corresponda al nivel de unión de anticuerpo y, en consecuencia, con el nivel de expresión de proteína biomarcadora. En algunas modalidades, el anticuerpo de detección se acopla a una enzima particularmente una enzima que cataliza la deposición de un cromógeno en el sitio de unión antígeno-anticuerpo. Las enzimas de interés particular incluyen, pero no se limitan a peroxidasa de rábano (HRP, por sus siglas en inglés) y fosfatasa alcalina (AP, por sus siglas en inglés). También se puede utilizar sistemas de detección de anticuerpo comerciales para llevar a la práctica la invención. Los métodos y formatos de inmunoquímica descritos en lo anterior se pretende que sean ejemplares y no limitantes dado que, en general, se comprenderá que se puede utilizar en la presente invención cualquier método o formato de inmunoquímica.

Los términos "anticuerpos" y "anticuerpos" abarcan de manera general las formas de anticuerpos como se encuentran en la naturaleza así como anticuerpos recombinantes tales como anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos quiméricos y humanizados y anticuerpos multiespecíficos así como fragmentos y derivados de la totalidad de los anteriores, fragmentos y derivados los cuales tienen por lo menos un sitio de unión antigénico. Los derivados de anticuerpo pueden comprender una proteína o una porción química conjugada al anticuerpo. Los "anticuerpos" e "inmunoglobulinas" (las Ig) son glucoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Aunque los anticuerpos presentan especificidad de unión a un antígeno, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos y otras moléculas similares a anticuerpos que carecen de especificidad a antígeno. Los polipéptidos de esta última clase son, por ejemplo, producidos a bajas concentraciones por el sistema linfático y en niveles aumentados por mielomas. El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y abarca anticuerpos completamente ensamblados, fragmentos de anticuerpos que pueden unir antígeno (por ejemplo Fab'. F'(ab)2, Fv, anticuerpos de cadena sencilla, diacuerpos (diabodies)) y péptidos recombinantes que comprenden a los anteriores. El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo que se obtiene de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones que se produzcan de manera natural que puedan estar presentes en cantidades menores. Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, preferiblemente, una región que une antígeno o una región variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmento de anticuerpo incluyen Fab, Fab', F(ab')2 y fragmentos Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10):1057-1062); moléculas de anticuerpo de cadena sencilla y anticuerpos multiespecíficos que se forman a partir de fragmento de anticuerpo. La digestión de los anticuerpos con papaína produce dos fragmentos idénticos que unen antígeno denominados fragmentos "Fab", cada uno con un sitio único que une antígeno, y un fragmento "Fe" residual cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar 35 fácilmente. El tratamiento con pepsina proporciona un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios que combinan antígeno y aún es capaz de reticularse con un antígeno. "Fv" es el fragmento mínimo de anticuerpo que contiene un sitio de reconocimiento de antígeno y de unión completos. En una especie de Fv de dos cadenas, esta región consiste de un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en una asociación estrecha y no covalente. En especies Fv de cadena sencilla, un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera se pueden unir covalentemente por un enlazante peptídico flexible de manera tal que las cadenas ligera y pesada se pueden asociar en una estructura "dimérica" análoga a la que se encuentra en una especie Fv de dos cadenas. Es en esta configuración que los tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio que une antígeno en la superficie del dímero VH-VL. De manera colectiva, los seis CDR confieren al anticuerpo especificidad para su unión a antígeno. No obstante, incluso un dominio variable único (o la mitad de un Fv que comprende a solo tres CDR específicos para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unir antígeno, aunque con una afinidad menor en comparación con el sitio de unión completo. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1 ) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos Fab' por la adición de algunos residuos en la parte carboxi terminal del dominio CH1 de la cadena pesada que incluye una o más cisteínas de la región de bisagra de anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente para Fab' en la cual uno o varios residuos cisteína de los dominios constantes presentan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 originalmente se produjeron como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas de bisagra entre los mismos. Se pueden preparar anticuerpos policlonales al inmunizar a un sujeto adecuado (por ejemplo pollo, conejo, chivo, ratón u otro animal) con un inmunógeno de proteína biomarcadora. El título de anticuerpo en el sujeto inmunizado se puede monitorear con el transcurrir del tiempo mediante técnicas estándar tales como ELISA utilizando proteína marcadora inmovilizada. En algún momento apropiado después de la inmunización, por ejemplo cuando los títulos de anticuerpo son los más altos, se puede obtener del sujeto células productoras de anticuerpo y se pueden utilizar para preparar anticuerpos monoclonales por técnicas estándar, tal como la técnica de hibridoma descrito originalmente por Kohier y Milstein (1975) Nature 256:495-497, la técnica de hibridoma de linfocitos B humano (Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4:72), la técnica de EBV-hibridoma (Colé et al. (1985) en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, ed. Reisfeld and Sell (Alan R. Liss, Inc., New York, NY), pp. 77-96) o técnicas de trioma. Es bien conocida la tecnología para producir hibridomas (véase de manera general Coligan et al., eds. (1994) Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, Inc., New York, NY); Galfre eí al., (1977) Nature 266:55052; Kenneth (1980) en Monoclonal Antibodies: A New Dimensión In Biological Analyses (Plenum Publishing Corp., NY; y Lerner (1981 ) Yale J. Biol. Med., 54:387-402). La alternativa para preparar hibridomas que secreten anticuerpos monoclonales, un anticuerpo monoclonal se puede identificar y aislar por cribado de una biblioteca de inmunoglobulina combinacional recombinante (por ejemplo una biblioteca de presentación de fago de anticuerpo) con una proteína biomarcadora y de esta manera aislar a los miembros de la biblioteca de ¡nmunoglobulina que unan la proteína biomarcadora. Están disponibles comercialmente equipos para generar y cribar bibliotecas de presentación de fago (por ejemplo la Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catálogo Número 27-9400-01 ; y Stratagene SurfZAPT Phage Display Kit, Catálogo número 240612). De manera adicional, los ejemplos de métodos y reactivos particularmente susceptibles para uso en la generación y cribado de una biblioteca de presentación de anticuerpo se pueden encontrar, por ejemplo, en la patente de E.U.A. número 5,223,409; publicaciones PCT números WO 92/18619; WO 91/17271 ; WO 92/20791 ; WO 92/15679; 93/01288; WO 92/01047; 92/09690; y 90/02809; Fuchs et al., (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281 ; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734. Otra alternativa para preparar anticuerpos monoclonales se puede presentar después de que se ha identificado después de técnicas proteómicas una proteína asociada con cáncer de ovario en etapa temprana. Después de la identificación se analiza una base de datos de ADN para determinar información de etiqueta de secuencia expresada para determinar si existen transcritos alternativos de dicha proteína. Se pueden utilizar los métodos de hibridación o amplificación convencionales de ácido nucleico para verificar la presencia del transcrito genético en tejido tumoral. Dado que la proteína ya se ha identificado a través de técnicas proteómicas, es alta la probabilidad de que el transcrito genético esté presente en un tejido tumoral. Una vez que se verifica su presencia, el gen de interés después se puede clonar y expresar en un sistema de expresión celular apropiado y la proteína específica resultante se purifica hasta homogeneidad. Se puede utilizar una secuencia de señal para facilitar la secreción y aislamiento de proteínas biomarcadoras. Las secuencias de señal típicamente se caracterizan por un núcleo de aminoácidos hidrofóbicos los cuales generalmente se separan de la proteína madura durante la secreción en uno o más eventos de separación. En una modalidad, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia de señal se puede unir operablemente a un vector de expresión a una proteína de interés, tal como una proteína biomarcadora o un segmento de la misma. La secuencia de señal dirige la secreción de la proteína, por ejemplo a partir de un hospedador eucariótico en el cual se transforma el vector de expresión y la secuencia de señal se separa de manera subsecuente o concurrente. La proteína puede ser purificada fácilmente del medio extracelular por métodos conocidos en la técnica. De manera alternativa, la secuencia de señal se puede enlazar a la proteína de interés utilizando una secuencia la cual facilita la purificación, por ejemplo con un dominio GST. Como se describe en lo anterior, la detección de unión a anticuerpo se puede facilitar por acoplamiento del anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radioactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa o acetilcolinaesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, ¡sotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína diclorotriazinilamina, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina; y los ejemplos de material radioactivo adecuado incluye 125l, 131l, 35S o 3H. Los anticuerpos utilizados para llevar a la práctica la invención se seleccionan para tener una alta especificidad por las proteínas biomarcadoras de interés. Los métodos para producir anticuerpos y para seleccionar anticuerpos apropiados se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Celis, ed. (en prensa) Cell Biology & Laboratory Handbook, tercera edición (Academic Press, New York), el cual se incorpora en la presente en su totalidad como referencia. En algunas modalidades se pueden utilizar para llevar a la práctica la presente invención anticuerpos comerciales dirigidos a proteínas biomarcadoras específicas. En modalidades preferidas, los anticuerpos se seleccionan con el tipo de muestra de extremo (es decir, preparaciones de suero) en mente, para especificidad de unión. En algunos aspectos de la Invención, los anticuerpos dirigidos a biomarcadores específicos de interés se seleccionan y purifican vía un procedimiento de cribado de etapas múltiples. En modalidades particulares, los polldomas se criban para identificar anticuerpos específicos para biomarcador que posean los rasgos deseados de especificidad y sensibilidad. Como se utiliza en la presente, el término "polidoma" se refiere a hibridomas múltiples. Los polidomas de la invención típicamente se proporcionan en placas de cultivo de tejido de pozos múltiples. En una etapa inicial de cribado de anticuerpo se genera un tejido de tumor en microarreglo que comprende una muestra normal, grado I (bien diferenciada), grado II (moderadamente bien diferenciada), y grado III (poco diferenciada). Se conocen en la técnica métodos y equipos tales como el ChemiconMR Advanced Tissue Arrayer, para generar arreglos de tejidos múltiples en un portaobjetos único. Véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. número 4,820,504. Los sobrenadantes no diluidos de cada pozo que contiene un polidoma se someten a análisis para teñido positivo utilizando técnicas de inmunohistoquímica estándar. En esta etapa de cribado inicial, se ignora esencialmente la unión no específica de fondo. Los polidomas que producen resultados positivos se seleccionan y utilizan en la segunda fase de cribado de anticuerpos. En la segunda etapa de cribado, los polidomas positivos se someten a un procedimiento de dilución limitante. Los anticuerpos no cribados resultantes se ensayan para teñido positivo de muestras grado I, II o III utilizando técnicas estándar de inmunohistoquímica. En esta etapa, el teñido de fondo es pertinente y los polidomas candidatos que tiñen únicamente positivos para células normales (es decir, células cancerosas) se seleccionan para análisis adicional. Para identificar anticuerpos que pueden distinguir muestras normales de aquellas indicativas de cáncer de ovario (es decir, grado I y anteriores), se genera un microarreglo de tejido de panel de enfermedad. Este microarreglo de tejido típicamente comprende muestras normales y de grado I, II y III múltiples. Se utilizan técnicas de ¡nmunohistoquímica estándar para realizar ensayos de los polidomas candidato para teñido positivo específico de muestras indicativo únicamente de enfermedad de cáncer de ovario (es decir, muestras grado I y anteriores). Los polidomas que producen resultados positivos y un teñido mínimo de fondo se seleccionan para análisis adicional. Se preparan cultivos de tinción positiva como clones individuales con el fin de seleccionar anticuerpos monoclonales candidatos individuales. Se conocen bien en la técnica los métodos para aislar clones individuales. El sobrenadante de cada clon que comprende los anticuerpos no purificados se someten a análisis para tinción específica de muestras de grado I, II o III utilizando los microarreglos de tejido de panel de tumor y enfermedad descritos en la presente en lo anterior. Los anticuerpos candidato que muestran tinción positiva de muestras de enfermedad de ovario (es decir, grado I y anterior), tinción mínima de otros tipos de células (es decir, muestras normales) y un fondo pequeño se seleccionan para purificación y análisis adicional. Son bien conocidos en la técnica los métodos para purificar anticuerpos mediante cromatografía de adsorción de afinidad. Con el fin de identificar anticuerpos que presenten tinción específica máxima de muestras de cáncer de ovario, los anticuerpos candidatos aislados y purificados en el proceso de cribado basado en inmunohistoquímica se analizan utilizando las técnicas de inmunoquímica de la presente invención, particularmente la prueba de ELISA "tipo emparedado" descrita en la presente en lo anterior.

De manera específica, los anticuerpos purificados de interés se utilizan para analizar un número estadísticamente significativo de muestras de suero de pacientes que presentan cáncer de ovario en las etapas I, II, III y IV. Las muestras se analizan por métodos de inmunoquímica como se describe en la presente y se clasifican como positivas, negativas o indeterminadas para cáncer de ovario en base en la tinción de anticuerpo positiva para un biomarcador particular. Se calculan la sensibilidad, especificidad, valores de predicción positivos y valores de predicción negativos para cada anticuerpo. Se seleccionan para la presente invención anticuerpos que presentan tinción específica máxima de muestras de suero de cáncer de ovario con un fondo mínimo (es decir, una relación máxima señal a ruido). La identificación de anticuerpos apropiados resulta en un incremento en la relación señal a ruido y un incremento en la utilidad clínica del ensayo. El formato del ensayo y el tipo de muestra que se van a utilizar son factores críticos en la selección de los anticuerpos apropiados. Los anticuerpos biomarcadores que producen una relación máxima de señal a ruido en un formato de inmunohistoquímica pueden no funcionar también en ensayos de inmunoquímica, tales como los ensayos de ELISA. Por ejemplo, las proteínas de biomarcador secretadas pueden no estar presentes en muestras de tejido a concentraciones que reflejen con precisión las concentraciones de la misma proteína en suero. De manera adicional, las muestras de suero comprenden muchas proteínas que pueden interferir con ia unión de anticuerpo a un biomarcador de interés y los problemas potenciales asociados con estas proteínas que interfieren se pueden considerar durante la selección de anticuerpo. De esta manera, la selección de anticuerpo requiere una consideración inicial del formato de ensayo y el tipo de muestra final a ser utilizado. Una persona experta en la técnica reconocerá que la optimización del título de anticuerpo y la química de detección es necesaria para maximizar la relación señal a ruido para un anticuerpo particular. Las concentraciones de anticuerpo que maximizan la unión específica a los biomarcadores de la invención y minimizan la unión no específica (o de "fondo") se determinarán. En modalidades particulares se determinan los títulos de anticuerpo apropiado para uso en preparaciones séricas a partir de pacientes al probar inicialmente diversas diluciones de anticuerpo en muestras de tejido de cáncer normal y de ovario incrustadas en parafina y fijadas con formalina. Las condiciones óptimas de concentraciones de anticuerpo y química de detección se determinan primero para las muestras de tejido de ovario embebidas en parafina y fijadas con formalina. El diseño de los ensayos para optimizar las condiciones óptimas de título de anticuerpo y de detección es estándar y se encuentra dentro de las capacidades comunes de aquellos habitualmente expertos en la técnica. Después de que se determinan las condiciones óptimas para las muestras de tejido fijado, cada anticuerpo se utiliza después en preparaciones de suero bajo las mismas condiciones. Algunos anticuerpos requieren optimización adicional para reducir la tinción de fondo y/o para incrementar la especificidad y sensibilidad de teñido en muestras de suero. Además, una persona experta en la técnica reconocerá que la concentración de un anticuerpo particular utilizado para llevar a la práctica los métodos de la invención variará en factores tales como el tiempo de unión, nivel de especificidad del anticuerpo para la proteína biomarcadora y el tipo de muestra corporal analizada. Además, cuando se utilizan anticuerpos múltiples, la concentración requerida puede ser alterada por el orden en el cual se aplican a la muestra los anticuerpos, es decir, de manera simultánea o como una combinación o secuencialmente, como reactivo de anticuerpo individuales. Además, la química de detección utilizada para visualizar el anticuerpo que se une a un biomarcador de interés también se puede optimizar para producir una relación deseada señal a ruido. En otras modalidades, la expresión de un biomarcador de interés se detecta a nivel de ácido nucleico. Las técnicas basadas en ácido nucleico para determinar la expresión son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, determinar el nivel de ARNm biomarcador en una muestra corporal. Muchos métodos de detección de expresión utilizan ARN aislado. Se puede utilizar cualquier técnica de aislamiento de ARN que no seleccione contra el aislamiento de ARNm, para la purificación de ARN a partir de células de ovario (véase, por ejemplo, Ausubel et al., ed., Current Protocols ¡n Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York 1987-1999). De manera adicional, se pueden procesar grandes cantidades de muestras de tejido utilizando técnicas bien conocidas por aquellos expertos en la técnica tales como, por ejemplo, el procedimiento de aislamiento de ARN en una sola etapa de Chomczynski (1989, patente de E.U.A. número 4,843,155). El término "sonda" se refiere a cualquier molécula que sea capaz de unir selectivamente una biomolécula objetivo diseñada específicamente, por ejemplo un transcrito nucleotídico o una proteína codificada o que corresponde a un biomarcador. Las sondas pueden ser sintetizadas por una persona experto en la técnica o se pueden derivar de preparaciones biológicas apropiadas. Las sondas se pueden diseñar específicamente para ser marcadas. Los ejemplos de moléculas que se pueden utilizar como sondas incluyen, pero no se limitan a ARN, ADN, proteínas, anticuerpos y moléculas orgánicas. El ARN aislado se puede utilizar en ensayos de hibridación o amplificación que incluyen, pero que no se limitan a análisis Southern o Northern, análisis en reacción de cadena de polimerasa y arreglos de sonda. Un método para la detección de las concentraciones de ARNm involucra poner en contacto el ARNm aislado con una molécula (sonda) de ácido nucleico que puede hibridizar con el ARNm codificado por el gen que se va a detectar. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, ADNc de longitud completa o una porción del mismo, tal como un oligonucleótido de por lo menos 7, 15, 30, 50, 100, 250 o 500 nucleótidos de longitud y suficiente para hibridizar específicamente bajo condiciones rigurosas a un ARNm o ADN genómico que codifica para un biomarcador de la presente invención. La hibridación de un ARNm con la sonda indica que se expresa el biomarcador en cuestión. En una modalidad, el ARNm es inmovilizado sobre una superficie sólida y se pone en contacto con una sonda, por ejemplo al correr el ARNm aislado sobre un gel de agarosa y al transferir el ADNm del gel a una membrana, tal como nitrocelulosa. En una modalidad alternativa, una o varias de las sondas son inmovilizadas sobre un superficie sólida y el ARNm se pone en contacto con una o varias sondas, por ejemplo en el arreglo de chip de gel Affymetrix. Una persona experta en la técnica puede adaptar con facilidad los métodos de detección conocidos de ARNm para uso en la detección de la concentración de ARNm codificado por los biomarcadores de la presente invención. Un método alternativo para determinar la concentración de ARNm biomarcador en una muestra involucra el proceso de amplificación de ácido nucleico, por ejemplo por RT-PCR (la modalidad experimental que se establece en Mullís, 1987, patente de E.U.A. número 4,683,202), reacción en cadena de ligasa (Barany, 1001 , Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 88:189-193), replicación de secuencia autosostenida (Guatelli et al., 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 87:1874-1878), sistema de amplificación transcripcional (Kwoh et al., 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 86:1173-1177), Q-Beta Replicasa (Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6:1197), replicación de círculo girando (Lizardi et al., patente de E.U.A. número 5,854,033) o cualquier otro método de amplificación de ácido nucleico, seguido por la detección de las moléculas amplificadas utilizando técnicas bien conocidas por aquellos expertos en el arte. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para la detección de moléculas de ácido nucleico tales moléculas están presentes en cantidades muy bajas. En aspectos particulares de la invención, la expresión del biomarcador se determina por RT-PCR fluorogénica cuantitativa (es decir, el sistema TaqManMR). Los niveles de expresión de biomarcador de ARN se pueden monitorear utilizando transferencia en membrana (tal como la que se utiliza en el análisis de hibridación tal como Northern, Southern, punto y similar) o microporoso, tubos de muestra, geles, esferas o fibras (o cualquier soporte sólido que comprenda ácidos nucleicos unidos). Véanse las patentes de E.U.A. números 5,770,722, 5,874,219, 5,744,305, 5,677,195 y 5,445,934, las cuales se ¡ncorporan en la presente como referencia. La detección de la expresión de un biomarcador también puede comprender la utilización de sondas de ácido nucleico en solución. En una modalidad de la invención, se utilizan microarreglos para detectar expresión de biomarcador. Los microarreglos son particularmente adecuados para este propósito debido a la capacidad de reproducción entre experimentos diferentes. Los microarreglos de ADN proporcionan un método para la medición simultánea de los niveles de expresión de grandes cantidades de genes. Cada arreglo consiste de un patrón reproducible de sondas de captación unida a un soporte sólido. Se hibridiza ARN o ADN marcado con sondas complementarias en el arreglo y después se detectan por exploración láser. Las intensidades de hibridación para cada sonda en el arreglo se determinan y convierten a un valor cuantitativo que representa los niveles de expresión relativa del gen. Véanse las patentes de E.U.A. números 6,040,138, 5,800,992 y 6,020,135, 6,033,860 y 6,344,316, las cuales se incorporan en la presente como referencia. Los arreglos oligonucleotídicos de alta densidad son particularmente útiles para determinar el perfil de expresión de gen para una gran cantidad de ARN en una muestra. Las técnicas para la síntesis de estos arreglos utilizando métodos mecánicos de síntesis se describen, por ejemplo, en la patente de E.U.A. número 5,384,261 incorporada en la presente como referencia en su totalidad para todo propósito. Aunque se prefiere una superficie de arreglo planar, el arreglo se puede fabricar sobre una superficie de virtualmente cualquier forma o incluso una multiplicidad de superficies. Los arreglos pueden ser péptidos o ácidos nucleicos o esferas, geles, superficies poliméricas, fibras tales como fibras ópticas, vidrio o cualquier otro sustrato apropiado, véanse, por ejemplo las patentes de E.U.A. números 5,770,358, 5,789,162, 5,708,153, 6,040,193 y 5,800,992, cada una de las cuales se incorpora en la presente en su totalidad para todo propósito. Los arreglos se pueden empacar de manera tal que permitan el diagnóstico u otra manipulación de un dispositivo que incluye todo. Véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. números 5,856,174 y 5,922,591 , incorporada en la presente como referencia.

En un enfoque, el ARNm total aislado de una muestra se convierte a ARNc marcado y después se hibridiza a un arreglo oligonucleotídico. Cada muestra se hibridiza a un arreglo separado. Se calculan los niveles de transcrito relativo con referencia a controles apropiados presentes en el arreglo y en la muestra. Se proporcionan adicionalmente equipos para llevar a la práctica los métodos de la invención. Mediante el término "equipo" se entiende cualquier manufactura (por ejemplo un empaque o un recipiente) que comprende por lo menos un reactivo, por ejemplo un anticuerpo, una sonda de ácido nucleico, etc., para detectar específicamente la expresión de un biomarcador de la invención. El equipo puede ser promovido, distribuido o vendido como una unidad para realizar los métodos de la presente invención. De manera adicional, los equipos pueden contener un inserto de empaque que describa al equipo y los métodos para su uso. Se puede proporcionar dentro de los recipientes cualquiera o la totalidad de los reactivos del equipo en donde el recipiente los protege del ambiente externo, por ejemplo en recipientes sellados o bolsas. En una modalidad particular, los equipos de inmunocitoquímica de la invención comprenden adicionalmente por lo menos dos reactivos, por ejemplo anticuerpos para detectar específicamente la expresión de por lo menos dos biomarcadores distintos. Cada anticuerpo se puede proporcionar en el equipo como un reactivo individual o, de manera alternativa, como una combinación de anticuerpo que comprende la totalidad de los anticuerpos dirigidos a biomarcadores diferentes de interés. En una modalidad preferida se proporcionan equipos para llevar a la práctica los métodos de inmunoquímica de la invención, particularmente la técnica de ELISA "tipo emparedado". Tales equipos son compatibles tanto con técnicas manuales como automatizadas de inmunoquímica. Estos equipos comprenden por lo menos un anticuerpo de captación primario dirigido a un biomarcador de interés, un anticuerpo de detección secundario marcado que es específico para un sitio antigénico distinto en el biomarcador y sustancias químicas para la detección de la unión de anticuerpo al biomarcador. El anticuerpo de captación primario se puede proporcionar en solución para unión subsecuente a un soporte sólido. De manera alternativa, el anticuerpo de captación se puede proporcionar en un equipo ya unido a un soporte sólido, tal como una esfera o el pozo de una placa de microtitulación. Cualquier sustancia química que detecte la unión antígeno-anticuerpo se puede utilizar en la práctica de la Invención. En algunas modalidades, el anticuerpo de detección secundario se conjuga a una enzima que cataliza la conversión colorimétrica de un sustrato. Tales enzimas y técnicas para utilizarlas en la detección de unión de anticuerpo son bien conocidas en el arte. En una modalidad preferida, el equipo comprende un anticuerpo de detección secundario que se conjuga a HRP. Se pueden proporcionar adicionalmente sustratos, particularmente cromógenos, compatibles con la enzima conjugada (por ejemplo tetrametilbencidina en el caso de un anticuerpo de detección secundario marcado con HRP) y soluciones, tales como ácido sulfúrico, para detener la reacción enzimática. En modalidades particulares, las sustancias químicas para la detección de unión de anticuerpo comprenden reactivos y equipos disponibles comercialmente. En otra modalidad, los equipos de ELISA "tipo emparedado" de la invención comprenden anticuerpos para la detección de por lo menos dos biomarcadores diferentes de interés. Tales equipos comprenden por lo menos dos anticuerpos de captación primarios y dos anticuerpos de detección secundarios dirigidos a biomarcadores distintos. Los anticuerpos de captación se pueden proporcionar como reactivos individuales o, alternativamente, como una mezcla de todos los anticuerpos dirigidos a biomarcadores diferentes de interés. Se pueden incluir en los equipos controles positivos y/o negativos para validar la actividad y el uso correcto de los reactivos utilizados de acuerdo con la invención. Los controles pueden incluir muestras, tales como secciones de tejido, células fijas en portaobjetos de vidrio, etc., que se sabe son positivas o negativas para la presencia del biomarcador de interés. En una modalidad particular, el control positivo es una solución que comprende una proteína biomarcadora de interés. El diseño y uso de los controles es estándar y se encuentra dentro de las capacidades habituales de aquellos habitualmente expertos en la técnica. En otras modalidades se proporcionan adicionalmente equipos para identificar cáncer de ovario que comprende detectar la sobreexpresión de biomarcador a nivel de ácido nucleico. Tales equipos comprenden, por ejemplo, por lo menos una sonda de ácido nucleico que se une específicamente a un ácido nucleico biomarcador o un fragmento del mismo. En modalidades particulares, los equipos comprenden por lo menos dos sondas de ácido nucleico que hibridizan con ácidos nucleicos biomarcadores distintos. Una persona experta en la técnica apreciará que cualquiera o la totalidad de las etapas en los métodos de la invención se pueden ¡mplementar por personal, o alternativamente pueden ser realizadas de una manera automatizada. Así, las etapas de preparación de muestra corporal, teñido de la muestra y detección de la expresión del biomarcador pueden ser automatizadas. En algunas modalidades, los métodos de la invención se pueden utilizar en combinación con técnicas tradicionales de cribado para cáncer de ovario. Por ejemplo, las técnicas de inmunoquímica de la presente invención se pueden combinar con un análisis convencional de CA125 sérico o un cribado sonográfico transvaginal de manera que la totalidad de la información de los métodos convencionales se conserve. De esta manera la detección de biomarcadores puede reducir la alta tasa de resultados falsos positivos en el cribado por CA125, puede reducir la alta tasa de resultados falsos negativos del cribado sonográfico transvaginal y puede facilitar un cribado automatizado en grandes proporciones. Además, los métodos de la invención pueden permitir la detección temprana de cáncer de ovario al proporcionar una prueba de diagnóstico que es conductora para un cribado de rutina en una población amplia. El artículo "un" y "uno", como se utilizan en la presente para referirse a uno o más de uno (es decir, por lo menos uno) de los objetos gramaticales del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa uno o más elementos. En la especificación, las palabras "que comprende" o variaciones tales como "comprendido" o "que comprende" se entenderá que implican la inclusión de un elemento indicado, entero o una etapa o grupo de elementos, enteros o etapas, pero no la exclusión de ningún otro elemento, entero o etapa o grupos de elementos, enteros o etapas. Se ofrecen los siguientes ejemplos a modo de ilustración y no a manera de limitación.

Parte Experimental EJEMPLO 1 Análisis EM SELDI-TOF de Muestra de Suero para la Identificación de Biomarcadores Indicativos de Cáncer de Ovario Materiales y Métodos: El funcionamiento manual de las muestras de suero se lleva a cabo utilizando el equipo Ciphergen Biosystems Protocol and Serum Fractionation, K100-0007, de Ciphergen Biosystems, y las muestras acumuladas consisten de suero humano normal congelado, NHS acumulado 1 y suero de cáncer de ovario, OCS acumulado 2 (véase el cuadro 1 para los datos de muestra de suero individual). Para fraccionar el suero, se recalientan NHS acumulado 1 y OCS acumulado 2, se llevan a temperatura ambiente y se centrifugan (14,000 x RCF) durante 20 min en un cuarto frío (4°C). Se transfieren cuatro alícuotas de 20 µl de cada muestra a 4 pozos de fondo V de una placa de microtitulación Nunc #249952. A cada pozo se transfieren 30 µl de amortiguador U9 (urea 9M, CHAPS 2%, Tris-HCl 50 mM, pH 9) seguido por agitación de la placa durante 20 minutos a 4°C con un mezclador IKA-MTS (ajuste 600). Después de agitar, 50 µl de la muestra tratada se transfieren desde los pozos de placa con fondo en U a un pozo separado en una placa de filtración (placa Nunc, Silent Screen con membrana liprodyne, #255980) con una resina sorbente hidratada Q Ceramic HyperD F. Los pozos de la placa de fondo en U después se lavan rápidamente con 50 µl de amortiguador de lavado 1 (Tris-HCl 50 mM con octilglucopiranósido 0.1 %, pH 9) y se transfieren a los pozos correspondientes de la misma placa de filtración que han recibido los primeros 50 µl de muestras tratadas. La placa de filtración se mezcla durante 30 min a 4°C. Las muestras de la fracción 1 (4 de 100 µl para cada tipo de muestra) después se recolectan en una placa de recolección con la ayuda de un múltiple de vacío. Se agrega amortiguador 1 de lavado fresco (100 µl) a la resina en la placa de filtración y se permite que se mezcle durante 10 minutos a t.a. Cada muestra de lavado de amortiguador 1 después se recolecta al vacío en el mismo pozo de la placa de recolección que ha recibido los primeros 100 µl de amortiguador 1 de lavado. Estas muestras de la fracción 1 representan el flujo pasante combinado y las elusiones a pH 9. Se recolecta la fracción 2 al agregar primero 100 µl de amortiguador 2 de lavado (HEPES 50 mM con OGP 0.1 %, pH 7) a pozos de resina, se mezcla durante 10 min a t.a. y posteriormente se recolecta al vacío en una placa de recolección separada de la utilizada en lo anterior. A los mismos pozos de resina se les agregan nuevamente 100 µl de amortiguador 2 de lavado, seguido por mezclado y recolección bajo vacío en los mismos pozos que han recibido los primeros 100 µl de amortiguador 2 de lavado. Estas muestras de fracción 2 contienen las elusiones a pH 7. El proceso anterior para la fracción 2 se repite con los siguientes amortiguadores: Fracción 3, amortiguador 3 de lavado (acetato de sodio 100 mM con OGP 0.1 %, pH 5); Fracción 4, amortiguador 4 de lavado (acetato de sodio 50 mM con OGP 0.1 %, pH 4); Fracción 5, amortiguador 5 de lavado (citrato de sodio 50 mM con OGP 0.1%, pH 3); Fracción 6, amortiguador 6 de lavado (isopropanol 33.3%/acetonitrilo 16.7%/TFA 0.1%) Las placas de recolección con las fracciones 1-6 se almacenan a -80°C durante la noche antes del análisis de unión.

Análisis de Unión EM SELD1-TOF La unión de las fracciones 1-6 para cada una de las 4 muestras NHS y 4 muestras OCS a CM-10, captación de afinidad de metal inmovilizado (IMAC)-30 y chips H50 (arreglos de 8) se evalúan en un bioprocesador. De esta manera, se utiliza un arreglo único de 8 para cada chip, para cada fracción (es decir, 4 fracciones de NHS y 4 fracciones de OCS). El chip IMAC--30 se activa primero con CuSO 100 mM durante 10 min. seguido por 3 lavados con agua grado CLAR. Los arreglos después se lavan 3 veces con amortiguadores de unión específicos antes de exponerlo a fracciones (es decir, CM-10, acetato de sodio 100 mM, pH 4; IMAC-30, fosfato de sodio 100 mM, pH 7 + NaCI 0.5 M; H50, acetonitrilo 10% (ACN) + ácido trilfuoroacético 0.1% (TFA)). Cada punto de chip recibió 75 µl de su amortiguador de unión respectivo seguido por 25 µl de una fracción específica 1-6 (dilución 1/4). El bioprocesador se coloca en un agitador durante 1 h. Los arreglos se lavan 3 veces con 150 µl de su amortiguador de unión respectivo con agitación durante 10 min en cada etapa de lavado. Finalmente, los arreglos se lavan rápidamente con H2O CLAR y se secan al aire. Se prepara fresco ácido sinapínico en ACN 50% y TFA 0.05% y se colocan puntos de 1.5 µl en cada superficie de chip, se secan y se analizan de inmediato en un instrumento Ciphergen SELDI. Los ajustes del instrumento son como sigue: masa alta hasta 200 kDa; intensidad láser a 200; sensibilidad del detector en 9 con deflector de masa en 10 kDa. Un estándar de proteína (C100-0007) se corre en el modo de autocalibración y se utiliza como referencia para pesos moleculares de muestra.

Resultados Perfilado de Proteína CM-10 (¡ntercambiador de catión débil) Las fracciones 4 y 6 fueron las de mayor interés con respecto a las proteínas unidas a este chip. La fracción 4, en particular tiene dos especies prominentes que aparecen elevadas en OCS con respecto a NHS con pesos moleculares (MW) de 28 kDa y 13.9 kDa (datos no mostrados). Además, las muestras de OCS presentan picos menos prominentes, los cuales también estaban elevados con MW de 17.4 kDa, 15.8 kDa y 15.1 kDa (datos no mostrados). Es de hacerse notar que la masa de 28 kDa está en el intervalo de las proteínas de calicreína. La fracción 6 es notable en la medida en que las diferencias de proteína observadas entre NHS y OCS están todas dentro del intervalo de MW de < 10 kDa (datos no mostrados). De manera adicional, en este perfil, los picos de la muestra de albúmina sérica humana (es decir, especies cargadas sencillas y dobles) a 66 kDa fueron equivalentes de manera general tanto en las muestras NHS como OCS.

Perfilado de la Proteína IMAC-30 La fracción 6 es la más notable con este chip en su presentación diferencial (regulada por aumento en OCS) de proteínas con MW de 56.3 kDa, 28.1-28.3 kDa y 14-14.1 kDa (datos no mostrados). Los MW de aproximadamente 56, 28 y 14 kDa están en el intervalo de tamaño de los marcadores FLJ10546, calicreína y HE4, respectivamente. La albúmina sérica humana, a 66 kDa, se observa en ambas muestras.

Perfilado de Proteína H50 (hidrofóbica) Todas las proteínas presentadas de manera diferencial por esta superficie de chip se encontraban en su mayor parte con un MW bajo (es decir, < 10 kDa) con la excepción de la fracción 4, la cual también presenta picos en 28 kDa y 17.5 kDa (regulados por aumento en OCS) (datos no mostrados). Dos proteínas (7.0 y 7.5 kDa) son reguladas por disminución en OCS, en comparación con NHS mientras que 3 proteínas (6.4, 6.6, 6.8 kDa) son reguladas por aumento en OCS en comparación con NHS. Una proteína a 8.1 kDa aparece estar en los mismos niveles tanto en NHS como en OCS (datos no mostrados).

EJEMPLO 2 Identificación de biomarcadores de cáncer de ovario de muestras de suero utilizando técnicas proteómicas Materiales y Métodos: Se obtienen muestras de suero de personas normales y pacientes con cáncer de ovario de varios vendedores comerciales (Uniglobe, Raseda, CA; Diagnostic Support Service West Yarmouth, MA; Impath-BCP, Franklin, MA; ProMedDx, Norton, MA) y se almacenan a -80°C hasta su utilización. El cuadro 2 resume las fuentes comerciales de las muestras de suero así como la información demográfica de donadores individuales y de la etapa de enfermedad de los pacientes con cáncer. Se preparan acumulados de suero al combinar volúmenes equivalentes de las muestras de suero individuales que comprenden cada acumulado (véase cuadro 1). La reducción de la complejidad de las muestras de suero se obtiene ya sea por supresión de albúmina e IgG utilizando un equipo estándar (ProteoPrep Blue Albumin Depletion Kit, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) o mediante fraccionamiento utilizando esferas Q HyperD F, una resina de intercambio aniónico (equipo de fraccionamiento de suero K-100-0007, Ciphergten Biosystems, Fremont, CA). Las fracciones de intercambio aniónico que mostraron huellas dactilares de masa diferencial entre sueros ováricos y normales (control) por EM SELDI-TOF (Ciphergen Biosystems) se someten adicionalmente a precipitación proteínica utilizando cuatro volúmenes de acetona fría. Se preparan muestras para electroforesis en gel 2-D por reconstitución de sedimentos de proteína precipitados con acetona o por dilución de sueros disminuidos en albúmina/lgG en un amortiguador estándar que contiene urea 8M, CHAPS 2%, ditiotreitol 50 mM, amfloitos 0.2% y azul de bromofenol (BioRad Laboratories, Inc., Hercules, CA). En los casos en donde la urea en el amortiguador se ha diluido de manera significativa se agrega tiourea sólida para llevar la concentración combinada de urea/tiourea de regreso a 8 molar. Como se describe en el ejemplo 1 , se analizan las fracciones de suero por EM SELDI-TOF antes de la electroforesis en gel 2-D utilizando CM-10 (intercamblador catiónico débil), IMAC-30 (quelante metálico; activado con CuSO4) y chips de H50 (superficie hidrofóbica). Después de la unión de las fracciones séricas, los chips se lavan, se secan al aire y después se recubren con ácido sinapínico preparado en ACN 50% y TFA 0.05%. Los chips después de analizan por SELDI-TOF. Una solución que contiene citocromo C, mioglobina, anhidrasa carbónica, enolasa, BSA e IgG bovina se utiliza como un estándar para las determinaciones de los picos de peso molecular. Electroforesis en gel 2-D: Para el enfoque isoeléctrico (IEF), las muestras de suero procesadas se cargan activamente en tiras de enfoque isoeléctrico (tiras con gradiente de pH inmovilizado (IPG), BioRad Laboratories Inc.), durante 12 horas bajo un voltaje de poca intensidad utilizando el equipo Protean IEF Cell (BioRad Laboratories). Las tiras de IPG tienen una longitud de 11 ó 17 cm y presentan intervalos de pH de 3-10 o 4-7. Las tiras de IPG cargadas y rehidratadas después se someten a enfoque isoeléctrico utilizando los programas de incremento paulatino de voltaje lineal actuales. Se utiliza una etapa de retención de 500 voltios para tiras IPG que no fueron manipuladas inmediatamente al final de la etapa de enfoque actual con el fin de evitar difusión de proteínas enfocadas. Las tiras enfocadas se embeben en una capa superior de agarosa 0.5% y después se someten a electroforesis en la segunda dimensión en geles de acrilamida prevaciados pequeños de 40- 20% o 10-20% (geles BioRad "Criterion") o geles de acrilamida 10% prevaciados grandes (geles BioRad Laboratories "Protean II"). La electroforesis se lleva a cabo a temperatura ambiente ya sea bajo un voltaje constante de 200 V durante -45 minutos (geles pequeños) o a corriente constante de 25 mA/gel durante -4.5 horas (geles grandes). Los geles se fijan y se tiñen utilizando el equipo de tinción de planta comercial (Silver Stain Plus, BioRad Laboratories, Inc.). Comparación de imagen de gel 2-D y selección de puntos para corte: Los geles se colocan en una caja de iluminación y se generan imágenes utilizando una cámara digital Olympus Camedia C-4000 ZOOM. Las imágenes digitales se normalizan en términos de tamaño, coloración (rojo para acumulados de suero normal y azul para acumulados de suero de cáncer de ovario) y se imprimen en una película de transparencia de chorro de tinta hp premium utilizando una impresora hp deskjet 6127 (Hewlett-Packard). Las transparencias se recubrieron manualmente en un proyector superior y se inspeccionaron visualmente para determinar variaciones en la distribución y patrones de puntos (proteínas). Los puntos correspondientes que variaron en intensidad o que estaban presentes en una muestra y no en otra se cortaron como tapones de gel, se enviaron a un laboratorio externo (Jan Enghild, University of Aarhus, Dinamarca) y se procesaron como se indica en lo siguiente para identificación de las especies proteínicas. Se colocó énfasis primario en puntos que: 1) estaban presentes en muestras de ovario y ausentes en las muestras normales, o 2) de intensidad claramente mayor en las muestras de ovario. Identificación de proteína en los puntos cortados por MALDI o EM/EM: Los puntos de gel cortados se digieren con tripsina durante la noche a 37°C. Los péptidos se extraen y después se elimina la sal antes de que sean aplicados al objetivo MALDI y se analizan. Los datos de EM MALDI-TOF o EM/EM se adquieren utilizando un instrumento Q-Tof Ultimal Global (Micromass Waters Corp., Manchester, Reino Unido). El espectrómetro de masas se calibra sobre el intervalo m/z 50-3000 utilizando una mezcla de polietilenglicol (1.7 mg/ml de PEG200, PEG400, PEG600, PEG1000 y PEG2000, y 0.28 mg/ml de Nal en acetonitrilo 50% (v/v). Cada espectro se calibra utilizando glu-fibrinopéptido B (MW = 1570.6774) (Sigma) como masa fija. Para la huella dactilar peptídica, se adquieren espectros de masa en el modo de ion positivo sobre el intervalo 800-3000 m/z. La lista de masa de los péptidos se utiliza para investigar las bases de datos de proteínas SwissProt/TrEMBL o NCBInr en un servidor Mascot local utilizando el programa Mascot de motor de búsqueda (Matrix Sciences, London, Reino Unido) (REF_1). Las investigaciones se realizaron con una tolerancia de masa peptídica de 50 ppm, modificación carbamidometilo de residuos cisteína y se permitió la separación de tríptico perdido único. Únicamente los aciertos significativos como se definen por el análisis de probabilidad Mascot y con por lo menos cinco coincidencias de masas peptídicas fueron los que se aceptaron. Habitualmente, la precisión de masa peptídica está dentro de 10 ppm. Se realizó espectrometría de masas en tándem para proteínas no identificadas por la huella dactilar peptídica. Se selecciona un ¡ón precursor EM abundante y se adquiere los datos EM/EM. Se utiliza argón como gas de colisión y la energía de colisión necesaria para fragmentación varía de 50 a 120 voltios, dependiendo de la masa peptídica. Los datos EM/EM se calibran al fijar el ion precursor EM a su m/z que se obtiene a partir de EM. La lista de masa resultante de péptidos fragmentados se utiliza para investigar los datos de proteína utilizando el programa Mascot de motor de búsqueda (Matrix Sciences, London, Reino Unido) (REF_1). Las investigaciones se realizaron con tolerancia de masa peptídica de 2 Da, la tolerancia de masa de ion EM/EM de 0.8 Da, modificación de carbamidometilo de residuos cisteína y hasta una separación perdida. Para todas las identificaciones se utilizan bases de datos de proteína humana.

Resultados Los datos resultantes se dividen en cinco conjuntos diferentes. Esta clasificación se basa en las identidades de los acumulados de suero que se analizan y los métodos de reducción de complejidad de muestra que se utilizan para cada conjunto (cuadro 2). En total se identifican números grandes de proteínas a partir de digeridos trípticos de los puntos de gel cortados. Aunque se representan numerosas clasificaciones funcionales, la gran mayoría de las proteínas identificadas se considera que son típicamente de medio de abundancia en suero humano y plasma. Esto concuerda con lo que se podría esperar del análisis 2-D en suero en el cual las fracciones de albúmina e inmunoglobulina G se han suprimido antes de electroforesis. A partir de la lista de puntos de proteína que se identificaron de manera positiva, aquellos que se consideraron regulados por aumento en cáncer de ovario se incluyen en el cuadro 3. Los puntos de proteína regulados por aumento individuales se visualizan en comparaciones de imágenes de gel 2-D entre muestras normales y de cáncer de ovario de cada conjunto de datos (datos no mostrados).

CUADRO 1 Datos individuales de muestras de suero UNK - desconocido N/A - no aplicable CUADRO 2 Conjuntos de datos de gel AEX - intercambio aniónico util¡33?ftDfg(Í3Pl33s Q Hyper D F Proteínas identificadas como reguladas por aumento en cáncer de ovario por electroforesis en gel 2-D Todas las publicaciones y solicitudes de patentes mencionadas en esta especificación son indicativas del nivel de aquellos expertos en la técnica a la cual pertenece la invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patentes se incorporan en la presente como referencia en la misma medida a si cada publicación individual o solicitud de patente hubiera sido indicada de manera específica e individual para ser incorporada como referencia. Aunque la invención precedente se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad y compresión, será evidente que ciertos cambios y modificaciones se pueden llevar a la práctica dentro del alcance de las modalidades anexas.

Claims (23)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para diagnosticar cáncer ovárico en una paciente, el método está caracterizado porque comprende detectar la sobreexpresión de por lo menos un biomarcador en una muestra corporal, en donde la detección de sobreexpresión del biomarcador identifica de manera específica muestras que son indicativas de cáncer de ovario y en donde el biomarcador se selecciona del grupo que consiste de reactivos en fase aguda, lipoproteínas, proteínas involucradas en la regulación del sistema de complemento, reguladores de apoptosis, proteínas que unen hemoglobina, hemo o hierro, proteínas citoestructurales, enzimas que destoxifican los productos secundarios metabólicos, factores de crecimiento y transportadores de hormona.

2.- El método de conformidad con ia reivindicación 1 , caracterizado además porque el biomarcador se selecciona del grupo que consiste de a-1 -antitripsina, AMBP, calgranulina B, anidrasa carbónica, clusterina, cofilina (¡soforma que no está en músculo), ficolina 2, ficolina 3, gelsolina, haptoglobina, biomarcador relacionado con haptoglobina, hemopexina, inhibidor de inter-a-tripsina, peptidil-prolil-cis-trans isomerasa A, glutation peroxidada plasmática, proteína básica plaquetaria, serotransferrina, proteína A4 amiloide sérica, tetranectina, transtiretina, vitronectina y zinc-a-2-glucoproteína.

3.- Un método para diagnosticar cáncer de ovario en una paciente, el método está caracterizado porque comprende detectar la sobreexpresión de por lo menos dos biomarcadores en una muestra corporal, en donde la detección de sobreexpresión de los biomarcadores identifica de manera específica muestras que son indicativas de cáncer de ovario.

4.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque la detección de sobreexpresión de los biomarcadores distingue muestras que son indicativas de cáncer de ovario de muestras que son indicativas de proliferación benigna.

5.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el método permite la detección de cáncer de ovario en etapa temprana.

6.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque los biomarcadores se sobreexpresan selectivamente en cáncer de ovario en etapa temprana.

7.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque los biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste de reactivos en fase aguda, lipoproteínas, proteínas involucradas en la regulación del sistema de complemento, reguladores de apoptosis, proteínas que unen hemoglobina, hemo o hierro, proteínas citoestructurales, enzimas que destoxifican los productos secundarios metabólicos, factores de crecimiento y transportadores de hormona.

8.- El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque los biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste de a-1 -antitripsina, AMBP, calgranulina B, anidrasa carbónica, clusterina, cofilina (isoforma que no está en músculo), ficolina 2, ficolina 3, gelsolina, haptoglobina, biomarcador relacionado con haptoglobina, hemopexina, inhibidor de inter-a-tripsina, peptidil-prolil-cis-trans isomerasa A, glutation peroxidada plasmática, proteína básica plaquetaria, serotransferrina, proteína A4 amiloide sérica, tetranectina, transtiretina, vitronectina y zinc-a-2-glucoproteína.

9.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque la muestra es una muestra de suero.

10.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque la detección de la sobreexpresión del biomarcador comprende la utilización de un anticuerpo para detectar expresión de proteína biomarcadora.

11.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque la detección de la sobreexpresión del biomarcador comprende hibridación de ácido nucleico.

12.- Un método para diagnosticar cáncer de ovario en una paciente, el método está caracterizado porque comprende: a) poner en contacto una muestra corporal con por lo menos un anticuerpo en donde el anticuerpo se une específicamente a una proteína biomarcadora que se sobreexpresa de manera selectiva en cáncer de ovario, y en donde el biomarcador se selecciona dei grupo que consiste de reactivos en fase aguda, lipoproteínas, proteínas involucradas en la regulación del sistema de complemento, reguladores de apoptosis, proteínas que unen hemoglobina, hemo o hierro, proteínas citoestructurales, enzimas que destoxifican productos secundarios metabólicos, factores de crecimiento y transportadores de hormona; y b) detectar la unión de anticuerpo a la proteína biomarcadora.

13.- El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el biomarcador se selecciona del grupo que consiste de a-1 -antitripsina, AMBP, calgranulina B, anidrasa carbónica, clusterina, cofilina (isoforma que no está en músculo), ficolina 2, ficolina 3, gelsolina, haptoglobina, biomarcador relacionado con haptoglobina, hemopexlna, inhibidor de inter-a-tripsina, peptidil-prolil-cis-trans isomerasa A, glutation peroxidada plasmática, proteína básica plaquetaria, serotransferrina, proteína A4 amiloide sérica, tetranectina, transtiretina, vitronectina y zinc-a-2-glucoproteína.

14.- El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

15.- Un método para diagnosticar cáncer de ovario en una paciente, el método está caracterizado porque comprende: a) poner en contacto una muestra corporal con por lo menos dos anticuerpos en donde cada uno de los anticuerpos se une específicamente a una proteína biomarcadora distinta que se sobreexpresa selectivamente en cáncer de ovario, y b) detectar la unión de los anticuerpos a las proteínas biomarcadoras.

16.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque los biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste de reactivos en fase aguda, lipoproteínas, proteínas involucradas en la regulación del sistema de complemento, reguladores de apoptosis, proteínas que unen hemoglobina, hemo o hierro, proteínas citoestructurales, enzimas que destoxifican los productos secundarios metabólicos, factores de crecimiento y transportadores de hormona.

17.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque los biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste de a-1 -antitripsina, AMBP, calgranulina B, anidrasa carbónica, clusterina, cofilina (isoforma que no está en músculo), ficolina 2, ficolina 3, gelsolina, haptoglobina, biomarcador relacionado con haptoglobina, hemopexina, inhibidor de inter-a-tripsina, peptidil-prolil-cis-trans isomerasa A, glutation peroxidada plasmática, proteína básica plaquetaria, serotransferrina, proteína A4 amiloide sérica, tetranectina, transtiretina, vitronectina y zinc-a-2-glucoproteína.

18.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque los anticuerpos se ponen en contacto con la muestra secuencialmente como reactivos de anticuerpo individual, o simultáneamente como una combinación de anticuerpos.

19.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque se pone en contacto la muestra con por lo menos dos anticuerpos lo que comprende utilizar un primer anticuerpo de captación y un segundo anticuerpo de detección marcado, en donde cada uno del anticuerpo de captación y el anticuerpo de detección se unen específicamente a un sitio antigénico distinto en una proteína biomarcadora que se sobreexpresa selectivamente en cáncer de ovario y en donde el anticuerpo de captación se inmoviliza sobre un soporte sólido.

20.- Un equipo caracterizado porque comprende por lo menos un anticuerpo, en donde el anticuerpo se une específicamente a una proteína biomarcadora que se sobreexpresa selectivamente en cáncer de ovario, y en donde el biomarcador se selecciona del grupo que consiste de reactivos en fase aguda, lipoproteínas, proteínas involucradas en la regulación del sistema de complemento, reguladores de apoptosis, proteínas que unen hemoglobina, hemo o hierro, proteínas citoestructurales, enzimas que destoxifican los productos secundarios metabólicos, factores de crecimiento y transportadores de hormona.

21.- El equipo de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque los biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste de a-1 -antitripsina, AMBP, calgranulina B, anidrasa carbónica, clusterina, cofilina (isoforma que no está en músculo), ficolina 2, ficolina 3, gelsolina, haptogloblna, biomarcador relacionado con haptoglobina, hemopexina, inhibidor de inter-a-tripsina, peptidil-prolil-cis-trans isomerasa A, glutation peroxidada plasmática, proteína básica plaquetaria, serotransferrina, proteína A4 amiloide sérica, tetranectina, transtiretina, vitronectina y zinc-a-2-glucoproteína.

22.- Un equipo caracterizado porque comprende por lo menos dos anticuerpos, caracterizado porque cada uno de los anticuerpos se une específicamente a una proteína biomarcadora distinta que se sobreexpresa selectivamente en cáncer de ovario.

23.- El equipo de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque el equipo comprende un primer anticuerpo de captación y un segundo anticuerpo de detección marcado, en donde cada uno del anticuerpo de captación y el anticuerpo de detección se unen específicamente a un sitio antigénico distinto en una proteína biomarcadora que se sobreexpresa selectivamente en cáncer de ovario.