KR101450138B1 - 다낭성 난소증후군 진단 마커 조성물 및 진단 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다낭성 난소증후군 진단 마커 및 진단 키트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 난포액 내의 특정 단백질 성분을 유효성분으로 하는 다낭성 난소증후군 진단 마커 및 진단 키트에 관한 것이다.
본 발명은 알부민, vitamin D bindning protein, gelsolin, 혈청알부민(serum albumin), complement factor B 중 어느 1종 이상의 단백질을 유효성분으로 포함하는 다낭성 난소증후군 진단 마커를 제공한다.
또한, 본 발명은 바람직하게는 vitamin D bindning protein 및 gelsolin 를 유효성분으로 포함하는 다낭성 난소증후군 진단 마커를 제공한다.

Description

다낭성 난소증후군 진단 마커 조성물 및 진단 키트{Marker and Kit for Diagnosis of Polycystic Ovary syndrom}

본 발명은 다낭성 난소증후군 진단 마커 및 진단 키트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 난포액 내의 특정 단백질 성분을 유효성분으로 하는 다낭성 난소증후군 진단 마커 및 진단 키트에 관한 것이다.

Human reproduction system에서 인간 난포액(human follicular fluid, HFF)은 난소내의 granulosa and thecal cell에서 분비되는 단백질들에 의해 난포 벽의 파열과 난세포의 감수분열을 조절하고 난세포의 핵과 세포질을 성숙시켜서 난자의 수정과 배세포의 분할, 발달에 주요한 영향을 미치는 단백성분들을 함유하고 있다. 난포액(follicular fluid, FF)은 난포 성숙 동안 난자에 필요한 각종 호르몬들의 미세 환경을 제공한다. FF 내에 함유된 단백성분들은 발달단계에 따라 약간의 차이가 있고, 세포의 성장에 필요한 알부민이 주성분으로 조성되어 있으며, 혈청내의 조성성분과 유사하나 몇 가지 구별되는 점에서 약간의 차이는 있다. FF를 구성하는 성분들은 carbohydrates, mucopolysaccharides, lipid, steroids, peptide hormone, growth factors등 다양하며 난포의 성장뿐 아니라 수정과 배 발달, 부화를 결정하는데 가장 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

난포는 시상하부, 뇌하수체, 난소로 이어지는 내분비 조절기능과 난포 내 내분비 환경요인에 의해 성장하여 배란 혹은 퇴화된다. 정상적인 난포성장 과정에서 우성 난포는 감소된 난포자극호르몬(follicle stimulating hormone, FSH) 농도에도 불구하고 에스트로젠-우성 환경(estrogen-dominant environment)을 유지하여 성장을 지속하는 반면, 대다수의 난포들은 안드로젠-우성 환경(androgen-dominant environment)에서 벗어나지 못하여 더 이상 성장하지 못하고 퇴화하게 된다. 이런 우성 난포 선택 과정의 기전으로 우성 난포내의 FSH 수용체와 국소 성장 인자의 역할이 중요하다.

배란이 일어날 때 약간의 FF는 난세포와 함께 난관으로 유입되어 정자의 첨체 반응(acrosome reaction)을 자극하여 수정을 활성화한다. 배양액에 10%성숙 FF를 첨가하여 배세포를 체외에서 배양하였을 때 10%제대혈청을 첨가한 배양액과의 비교에서 배세포 분할이 현저하게 향상되어 상실배와 배포기에 도달하는 비율이 상승하였는데, 이러한 결과는 성숙 FF에는 혈청과 달리 배세포 독성물질이 존재하지 않기 때문이라고 보고하였다. FF가 배아 발달과 세포 분열에 효과를 미치는 생화학적 성분을 알아보기 위해 HFF와 합성혈청(serum substitute supplement, 3S)을 비교하였는데, HFF의 자연적인 구성 요소가 3S와 비교하였을 때 체외에서 배아성숙을 더 향상시킬 수 있었다. HFF와 3S간의 성분과 세포 분열의 속도에서 큰 차이를 나타냈고, 또한 HFF와 관련된 배아 세포 분열의 속도는 3S 매체보다 빠르다고 했다. 그러나 3S와 HFF간 배아발달 사이에는 큰 차이가 없었다고 보고하였다. 미성숙 난자를 체외 배양하는 실험에서 단백질 공급원으로서 HFF와 사람 알부민(human serum albumin, HSA)을 비교했을 때, 배양액에 HFF를 넣은 그룹과 HSA를 넣은 그룹간의 성숙율 및 수정율에서 큰 차이를 보이지 않았다고 보고하였다. FF와 제대혈청(fetal cord serum, FCS)을 넣어 비교한 실험에서는 배양액에 성숙한 FF를 넣은 그룹의 성숙율이 FCS를 넣은 그룹의 35.9% 보다 훨씬 높은 55.8% 이었다. 추가로, 성숙 FF 그룹은 FCS 그룹(31.6% vs 81.0%)보다 훨씬 높은 수정율을 보고하기도 했다.

FF 내 난자성숙 촉진물질이 있어 이것이 난포가 성숙하면서 난자성숙 억제물질을 양적으로 초과하게 되어 배란 시에는 지금까지 억제되어 왔던 난자의 감수분열이 시작된다고 하였다. 난자성숙의 억제는 황체형성호르몬(luteinizing hormone, LH)의 자극을 받지 않은 granulosa cell에서의 분비물에 의해서나, granulosa cell의 사전 배양으로 조성된 배양액에 의해서 억제된다. 난자성숙 억제활성은 human ovaries와 rabbit, sheep, cow, hamster에서 찾을 수 있으며, 난자성숙 억제의 종 특이성은 나타나지 않았다고 보고하였다.

성숙 HFF는 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)이나 FCS와의 비교에서 배반포 핵 수의 증가를 가져오고, 초기 생쥐 배아의 발달에 억제 효과를 갖지 않으며, 오히려 발달을 촉진하는 물질을 갖고 있을 가능성이 있다고 보고하였다.

HFF의 생쥐 난포란의 체외성숙에 미치는 영향을 조사하기 위해 인위적으로 난포란의 핵 성숙을 hypoxanthine이나 adenosine 등의 억제제를 사용하여 억제 시킨 후 HFF 및 사람 제대혈청(human fetal cord serum, HFCS)을 첨가하여 핵 성숙의 유도로 핵성숙 촉진효과를 비교하였다. 이들은 HFF 및 HFCS의 호르몬 함량분석을 실시하여 gonadotropin과 steroids hormone이 HFF에 높은 농도로 함유되어 있으며, 생쥐 난자의 체외성숙, 체외 발달율에 있어서 HFF가 HFCS보다 유용한 단백질원이며 높은 농도로 함유되어 있다는 점을 말하였다. 또한, HFF의 분자량에 따른 실험에서 30,000 Da 이상의 고분자량 단백질을 함유한 HFF에서 배 발달율 및 부화율, 배반포의 세포 수에서 유의하게 높은 결과를 얻었다고 보고하였다. Bovine oocyte의 발달능력과 체외성숙을 위한 배양에서도 FF의 첨가로 blastocyst cell 수가 증가하는 효과가 보고됐고, 인간의 자극되지 않은 난소에서 채취된 미성숙 난자를 배양하는 체외성숙(in vitro maturation, IVM)의 비교 연구에서 성숙한 FF의 첨가는 수정율과 배아의 질을 모두 높일 수 있었다. 말의 난자를 직경 50 mm 이상의 large follicle 유래 FF를 20% 첨가하여 체외 수정한 배양 결과에서 IVM medium에 난자난구세포복합체(expanded-cumulus oocyte complex, COC)에서 유래된 FF를 첨가하였을 때, compact cumulus cell과 small follicles에서 회수된 oocyte의 배양에서 성숙의 증가를 가져왔다.

반면 HFF는 초기 배아발달을 억제하는 물질을 포함하고 있다고 알려져 있고, HFF 성분 중에는 생쥐배아의 발달을 억제하는 물질도 있으며, 이 FF의 억제효과는 퇴행성 난포의 FF는 강한, 그리고 성숙난포의 FF는 약한 억제효과를 갖는다고도 보고하였다.

다낭성 난소(Polycystic ovary, PCO)의 경우 난자 회수 시 미성숙 난자의 비율이 높고, 지속적인 androgen 생성으로 정상 난소와 차이를 보인다. 이런 이유로 PCO환자의 HFF를 첨가하였을 때, 생쥐 난자의 수정 및 배 발달에 영향을 주어 수정율, 배 발달율, 부화율에서 현저히 낮아지는 것으로 보고되었다. Conventional IVF에서 20% FF를 첨가하여 체외 수정한 배양 결과에서도 대조군에 비해 핵의 성숙이 현저히 떨어지고, sperm penetration rates와 수정율, 배세포분할과 배아의 질이 불량하고 세포정지와 할구의 분절이 심하였다고 보고되었다. 또한, 난자세포질내정자미세주입술(intra cytoplasmic sperm injection, ICSI) 숙련도와 미성숙 FF의 사용이 난자에 영향을 줄 수 있다고 언급하였다. 소난관상피세포(bovine oviductal epithelial cells, BOEC)와 배아배양액(embryo culture medium, ECM)의 공배양에서 0 ~ 5%의 저농도 소난포액(bovine follicular fluid, BFF)을 첨가하였을 때 수정율과 배 발달율에 차이가 없었으나, 10% ~ 20%의 고농도에서는 억제되며 수정율, 배 발달율, 부화율이 현저히 떨어졌다.

Mouse 및 human에서 난자의 발달에 유해한 영향을 가져오는 조건을 조사하기 위한 연구에서 HFF의 농도와 sample에 따라 차이가 있는 것으로 보고하기도 하였다. 이들은 10% FF 첨가 배양액은 배 발달에 거의 독성작용을 나타내지 않았으나 40% FF와 순수농도의 FF는 8 ~ 16 세포기 이후에 배세포의 분할을 억제하고 배세포의 질적 정도와 생존율을 현저히 저하시켜 배 발달을 저해하였고, 배의 세포사가 현저히 증가하여 FF는 배세포에 대해 독성이 있다고 보고했다. FF에서 분광 흡광도가 455 nm 이상인 FF들을 분석하였을 때, 단백성분의 농도에서 현저한 차이가 있었으며, 분자량에서도 차이를 나타내어 17,000 Da 이하의 저분자량을 포함하는 FF는 배세포 독성을 나타내어 배세포의 분할을 억제하고 할구세포 분절을 일으켜 배세포가 상실배 또는 배포기에 도달하지 못하였으며, FF가 함유한 여러 단백성분은 배세포의 발달에 대해 albumin보다 유용하지 못하였다. 인간의 성숙 난포와 미성숙 난포의 단백질 발현 패턴 비교에서 단백질 발현 양의 차이를 보였는데, 미성숙 FF가 성숙 FF에 비해 몇 개의 단백질에서 일부 낮거나 혹은 높은 수준으로 발현되었다.

PCO에서는 우성 난포의 선택 과정의 이상으로 다수의 소형 난포들이 과다하게 존재하다가 퇴화된다. 이 질환은 가장 흔한 부인과 내분비 질환 중 하나로 가임기 연령의 여성들 중 약 3 ~ 10%에서 발병하는 것으로 알려져 있고, 무배란, 무월경으로 인한 불임의 원인 중 가장 흔한 질환이다. PCO는 1935년 Stein과 Leventhal에 의해 무월경, 다모증, 비만, 경화성난소의 특성을 보이는 질환으로 처음 보고되었다).

현재, 이 질환을 정의하는 진단기준에는 크게 두 종류가 있다. 1990년 National Institutes of Health (NIH)의 진단기준은 만성 무배란과 임상적 혹은 생화학적 고안드로겐혈증에 의한 다모증, 이 두 가지 모두를 요구하는 기준이 있고, 2003년 제시된 ASRM / ESHRE consensus meeting guideline에서는 만성 무배란, 임상적 혹은 생화학적 고안드로겐혈증, 그리고 초음파상 다낭성 난소의 세 가지 중 두 가지 이상의 기준을 만족할 때로 정의하고 있다.

PCO의 경우 과배란유도 시 미성숙 난자의 회수율이 증가하는 경향을 보이나, HFF와 혈액 내 FSH 농도는 정상적인 배란주기를 가진 여성과 차이가 없다. PCO 환자의 난포는 정상 난소에 비해 충분한 estrogen을 생성할 granulosa cell이 부족하고, 기질세포는 비대화 되어 계속적으로 androgen을 생성하게 된다. 결국 PCO의 HFF에는 고농도의 androgen과 극히 적은 양의 estrogen을 함유하게 되어 난자의 변성을 유발하게 되고, 다모증과 연관된 고안드로겐혈증이 남성호르몬 과다증과도 연관이 있는 것으로 알려져 있다. PCO에서 나타나는 증상으로는 무월경이나 희발월경 등에 의한 불임, 다모증, 초음파상 다양한 크기의 낭포와 stroma의 증식 및 증가된 크기의 난소, 비만 등 다양하다. 내분비학적으로는 성선자극호르몬 이상에 기인한 LH의 증가와 LH 대비 FSH 비의 증가, 고안드로겐혈증, 남성호르몬과다증, 인슐린 저항성 등의 소견을 보이나, 이와 같은 특징을 갖지 않는 PCO도 많이 있다. 오늘날까지도 그 원인이나 병리가 확실히 알려져 있지 않고 하나의 독립적인 질환이라기보다는 복합적이고 다양한 소견을 보이는 질환으로 여겨지고 있다.

PCO의 경우 난포발달 초기단계의 성장은 정상적으로 이루어지나, 우성난포로 선택되는 과정의 이상으로 발달이 정지된다. 초음파상 2 ~ 9 mm 정도의 작은 난포들이 5 ~ 12개 이상 보이는데, 이들 작은 난포들은 실제로는 이미 대부분 진행이 중지되었거나 소멸해가는 난포들이다. 이와 같이 난포발달이 정지되는 기전은 분명치 않으나, 인슐린 유사 성장인자(insulin-like growth factor, IGF) 계열의 관련 가능성이 제시되고 있다. PCO의 생리에 관여할 것으로 추측되는 국소 성장 인자 중 IGF에 대한 연구가 광범위하게 이루어져 왔는데, granulosa cell에서 DNA 합성, 에스트로젠 합성 및 분비를 증가시킴으로써 난포 성장의 중요 조절인자로 작용한다. 그러나 PCO환자군에서 IGF와 androstenedione 농도가 높다거나, 차이가 없어 연관성이 없다는 보고도 있고, 오히려 IGF계의 농도가 감소했다는 보고도 있어, 난포액내 IGF계의 농도와 그 역할에 대해서는 아직 논란이 있다.

PCO의 발생에서 유전적 요인도 관여되어 있음을 알고는 있지만 이를 시사하는 바이오마커나 유전방식, 명확한 후보 유전자가 자세히 연구되어 있지 않다. PCO의 가족력에 대해서는 오래 전부터 인지되어 왔으나, 이들이 불임이거나 생식능력이 현저히 낮아 충분한 연구가 진행되지 못한다는 한계가 있다. 한 연구에 의하면 여드름과 다모증이 있고 희발성 월경을 보이는 경우의 약 80%에서 유전적 소견을 보였다고 한다. PCO와 관련이 있을 것으로 생각되는 유전자군으로는 성호르몬, 인슐린, 대사증후군과 관련된 유전자들이었다.

남성호르몬의 기본적인 작용기전은 안드로젠 수용체(androgen receptor, AR)에 결합하여 유전자 발현을 조절하는 것인데, X 염색체상 남성호르몬 수용체 유전자의 CAG 반복 다형성 길이와 AR 활성 사이에 관련이 있다. PCO환자의 CAG 반복수의 차이는 없으나, 혈중 total testosterone이 정상인 PCO군이 상승된 환자군보다 더 짧은 CAG 반복수를 보였다. 이는 정상 범위의 혈중 남성호르몬 농도이지만 AR 활성의 증가가 PCO의 임상양상을 나타낼 것이라고 하였다.

난소의 기질세포의 비대화로 과도한 안드로겐 합성 및 간에서의 성호르몬 결합 단백질(sex hormone-binding globulin, SHBG) 감소 등의 기전을 통하여 다낭성 난소 증후군 발생에 중요한 원인을 제공하기도 한다. 남성호르몬 수용체 유전자 CAG 반복 다형성과 SHBG 유전자 TAAAA반복 다형성을 분석한 연구 결과, PCO에서 long SHBG-short AR CAG 반복 다형성 조합이 가장 낮은 SHBG 농도와 높은 free testosterone, total testosterone, dehydroepiandrosterone sulphate 농도를 보였다고 한다.

남성호르몬 합성과 대사에 핵심적인 효소인 P450scc (P450 side chain cleavage enzyme)를 코딩하는 CYP11a 유전자는 PCO의 남성호르몬과다증과 관련이 있으며, CYP11a 유전자의 (tttta)n 다형성이 고안드로겐혈증과 연관이 있다고 하였다. 이것은 insulin gene VNTR과 마찬가지로 유전자 발현의 조절에 관여하고 있다. Estrogen 생합성에 관여하는 17a-hydroxylase (CYP17A1) gene과, androgen에서 estrogen을 생성하는데 관여하며 aromatase를 코딩하는 CYP19A1 gene에 대한 연구들도 보고되고 있다.

인슐린 저항성과 관련 질병이 PCO에서 증가한다는 사실을 고려한 연구도 활발히 이루어지고 있다. 대표적인 adipocytokine에는 adiponectin과 leptin이 있는데 이들은 모두 비만, 인슐린 저항성, 만성적인 염증상태와 주요한 연관관계가 있는 것으로 인식되고 있고, 이러한 증상들은 PCO환자들에서 볼 수 있으며, 혈중 adiponectin이 감소하는 것으로 알려져 있다. Calpain-10은 non-lysosomal cysteine proteases의 일종으로 췌장섬세포, 근육, 간 조직 등에서 활성이 상승되어 있고, 인슐린의 분비와 작용, 간에서의 당 생산에 관여하고 있어 PCO와 관련성이 있어 보인다. IL-18 gene은 염증의 강력한 리스크 마커로 간주되고 있는데, IL-18 수준이 PCOS 환자에서 증가하고, 인슐린 저항성, 비만 및 hyperandrogenism와 서로 관련되어 있으며, 또한 -137G 유전자를 가진 사람이 -137C의 유전자를 가진 사람보다 당뇨직전단계인 당불내성이 나타날 위험성이 매우 높아, IL-18-137G 대립유전자가 PCOS가 있는 한국 여성에서 당조절장애 소인으로서의 역할을 할 수 있다고 보고되었다.

PCO 여성에서 보이는 인슐린 저항성은 주로 인슐린 수용체 신호전달 단계의 postbinding 결함에 의한 것으로 보이며, 인슐린 수용체의 tyrosine 잔기의 autophosphorylation 결함이 인슐린 저항성의 주 기전으로 제시되고 있다. 인슐린 수용체 유전자는 19 번 염색체에 22개의 exons으로 이루어져 있는데, exon 17 - 21 지역이 insulin signal transduction에 필수적인 tyrosine kinase를 coding하는 부위로 알려져 있어 이 부위의 변이는 인슐린 저항성과 고인슐린혈증을 야기하는 것으로 보고되었다. 인슐린 수용체 기질단백질(insulin receptor substrate (IRS) protein)에는 IRS-1, IRS-2, IRS-3, IRS-4 등 4 종류가 있는데, 이들은 인슐린 신호전달의 매개체로써의 역할이 잘 알려져 있다. Peroxisome proliferator-activated receptor- (PPAR-)는 nuclear receptor의 일종으로 비만, 당뇨, 인슐린 저항성, 심혈관 질환, 지방 조직 형성과 관련이 있다고 알려져 있다.

비타민 D 수용체(vitamin D receptor, VDR) gene으로 알려져 있는 FotkI, BsmI, ApaI 및 TaqI의 다형성이 PCO 위험성과 관련이 있을 수 있으며, 인슐린 저항 및 PCO가 있는 여성에서 혈청 내 인슐린 수준에 미치는 영향이 조사되었는데, 비타민 D 수용체의 유전자 변형이 PCO가 있는 여성의 PCO발달뿐만 아니라 인슐린 저항에 영향을 미칠 수 있다고 하였다.

PCO는 제 2 형 당뇨나 비만과 마찬가지로 유전적 요인과 환경적 요인이 복합된 질환으로, PCO 자체의 복잡한 유전적 요인 외에도 gene-gene 및 gene environment interaction도 유전학적 연구를 어렵게 하고 있다. 그 외에도 PCO의 정의 및 진단기준이 연구자마다 달라 연구결과 해석에 어려움이 있다. 가족 구성원을 대상으로 연구를 시도하고자 할 경우 본 증후군 여성의 낮은 생식능력으로 인해 큰 규모의 가계도 작성에 어려움이 있다. 또한 남성형 표현형의 부재, 동물 모델의 부재, 나이에 따른 표현형 변화 및 진단기준의 다양성 등이 유전학적 연구의 장애로 작용하고 있다.

프로테옴관련 분석연구에서 단백질 분리 및 동정을 위해서 사용되는 기법들로는 분자량에 따라 분리하는 1차원 전기영동, 등전점에 따른 분리가 이루어지는 등전점 전기영동, 극미량의 단백질 분석에 사용되는 친화성 크로마토그래피 등이 있으나, 이러한 단일 방법의 단백질 분리로는 다양한 단백질이 포함된 HFF를 분석하고자하는 본 연구목적에는 미흡하다. 하지만, 이차원 전기영동은 연구비용이 비싸고, 시간이 오래 걸리며, 재현성의 어려움이 있으나, 풍부한 단백질을 감지할 수 있어 본 연구의 목적과 부합한다.

최근 생명공학의 발달에 따라, 많은 선행 연구자들이 HFF의 단백질 분석을 위해서 민감한 고해상도기법들이 적용된 단백체 기법들을 사용하였다. Nano-liguid chromatography (LC) matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight (MALDI TOF) / TOF-mass spectrometry (MS)로 HFF에서 기존에 보고되지 않았던 inhinbin A와 sex hormone-binding globulin을 찾아내었고, 이 두 단백질이 folliculogenetic 과정 중 호르몬 분비 조절에 관여할 것으로 보고되었다. Transferrin, cerulophasmin, afamin, hemopexin, haptoglobulin, amyloid protein 등이 이차원 전기영동을 통해 HFF에서 분리 보고되었고, 성숙 HFF로부터 이차원 전기영동과 MALDI-TOF-MS 과정을 통해 4개의 스팟에서 3개의 단백질을 보고하였다. Folliculogenesis 동안 특정 기능을 수행할 것으로 제안된 이 세 단백질은 thioredoxin peroxidase 1 (TDPX1), transthyretin (TTR) 및 retinol-binding protein (RBP)로 동정되었다. Revers transcription-PCR기법을 통해 folliculogenesis와 호르몬 분비 조절에 관여할 것으로 예상되는 hormone sensitive lipase (HSL), unnamed protein preduct 1 (UPP1), unnamed protein product 2 (UPP2), apolipoprotein A-IV precursor 등이 발굴되었다.

습관성유산환자(recurrent spontaneous abortion, RSA)의 HFF에서는 complement component C3c chain E, fibrinogen gamma, antithrombin, angiotensinogen, hemopexin precursor 등이 MALDI-TOF와 nano-LC MS / MS 기법으로 동정되었고, 웨스턴블롯 분석을 통해서 응고 인자로서 정상적인 임신을 유지하는데 중요한 역할을 할 것으로 보이는 fibrinogen gamma와 antithrombin의 단백질 발현 수준이 대보군 보다 RSA 환자에서 적다고 보고하였다.

반면, 임신 후 정상 출산군과 비임신군의 HFF 비교분석에서는 Antithrombin, vitamin D binding protein, complement 3 등이 LC MS / MS기법으로 동정되었고, 비임신군에서 증가된 단백질 발현 양상을 보였다. HFF와 serum의 조성을 비교한 결과, 186개의 스팟 중 10여개 스팟에서 상이한 결과를 보고하였다. 이들 중 serum과 HFF의 transthyretin (TTR)과 레티놀 결합 단백질(retinol-binding protein, RBP)이 통계적 유의한 발현양의 차이를 보인다고 보고했다. PCO환자군 serum의 프로테옴 분석에서 대조군에 비해 haptoglobin b-chain과 a2-macroglobulin이 유의하게 감소되었고, transferrin과 k-free light chain은 증가됨을 확인하였다. 염증과 철 대사에 관여하는 이들 단백질을 PCO 진단을 위한 바이오마커로 제시하기도 하였다.

본 연구에서는 무작위 선별로 회수된 성숙 HFF의 전체 단백질 성분을 단백체 기법을 통해 분석하고 동정하여, HFF 단백질들의 다양한 기능적 특성을 밝히고자 하였다. 또한, 과배란유도 후 회수되어진 난자의 개수가 20개 이하인 일반 성숙 HFF를 대조군으로 하고, 회수되어진 난자의 개수가 20개 이상이며 PCO진단을 받거나 의심되는 환자군으로부터 얻어진 HFF의 단백질 발현 차이를 비교하여 관련 질환과의 연관성을 분석하였다.

본 발명은 상기한 바와 같은 문제를 해결하기 위해 제안된 것으로, 본 발명은 PCO 환자와 대조군의 난포액 중 발현양상을 달리하는 일정 단백질 성분을 포함하는 다낭성 난소증후군 진단 마커 및 진단 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 알부민, vitamin D bindning protein, gelsolin, 혈청알부민(serum albumin), complement factor B 중 어느 1종 이상의 단백질 또는 이에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 유효성분으로 포함하는 다낭성 난소증후군 진단 마커를 제공한다.

또한, 본 발명은 vitamin D bindning protein 및 gelsolin 또는 이에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 유효성분으로 포함하는 다낭성 난소증후군 진단 마커를 제공한다.

또한, 본 발명은 알부민, vitamin D bindning protein, gelsolin, 혈청알부민(serum albumin), complement factor B 중 어느 1종 이상의 단백질 또는 이에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 유효성분으로 포함하는 다낭성 난소증후군 진단 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 다낭성 난포증후군(PCO) 진단마커 및 진단키트를 이용하면, 정상적인 성숙 HFF 단백질의 표준 2-D 지도제작에 도움이 될 것으로 생각되며, PCO 관련 단백질 발현 양상 결과에서 대조군과 그 발현 패턴의 차이를 알아보았다. 대조군에 비해 PCO군에서 증가된 발현 양상을 보인 이들 단백질들은 난자의 competence와 PCO 진단 바이오마커 후보군 발굴에 도움이 될 것으로 생각된다.

또한, 이 단백질들은 난소관련 질병을 진단하고 난자 성숙 과정 중 생리적 변화를 효과적으로 연구하는데 유용하게 사용될 수 있을 것이다. 특히, 프로테옴 분석뿐만 아니라 웨스턴 블롯 분석을 통해서, 그 발현 패턴이 검증된 vitamin D binding protein과 gelsolin은 PCO의 특성상 명확한 진단기준을 확립하지 못할 만큼 다양한 질환을 동반하고 있거나, PCO의 전형적인 증상을 보이지 않는 초기 진단에 유용할 것이다.

도 1는 대조군과 PCO 환자의 난모세포 수를 나타낸다.
도 2은 대조군과 PCO 환자의 난모세포 성숙율을 나타낸다.
도 3은 대조군과 PCO 환자의 난모세포의 미성숙율을 나타낸다.
도 4은 대조군의 인간 난포액 단백질의 2차 겔 전기영동을 나타낸다.
도 5는 PCO 환자의 난포액 단백질의 2차 겔 전기영동을 나타낸다.
도 6은 인간 난포액에서 gelsolin의 증가를 나타낸다.
도 7은 인간 난포액에서 vitamin D 결합 단백질의 증가를 나타낸다.
도 8은 인간 난포액에서 알부민의 감소를 나타낸다.
도 9은 인간 난포액에서 불특정 단백질 1의 감소를 나타낸다.
도 10은 인간 난포액에서 불특정 단백질 2의 감소를 나타낸다.
도 11은 인간 난포액에서 혈청 알부민의 증가를 나타낸다.
도 12은 인간 난포액에서 complement factor B의 증가를 나타낸다.
도 13은 vitamin D 결합 단백질과 gelsolin의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸 것으로서, (A)는 웨스턴 블롯 분석에 의해 다르게 발현되는 10 HFF 단백질의 유효성을 나타낸 것이며, (B)는 웨스턴 블롯에서, 밴드 부피가 Image Quant TL로 분석되었고, β-actin으로 정규화되었음을 나타낸다.
도 14은 대조군과 PCO 그룹에서 다르게 발현되는 단백질을 나타낸 표이다.

본 발명은 PCO 환자와 대조군의 난포액 중 발현양상을 달리하는 일정 단백질 성분을 포함하는 다낭성 난소증후군 진단 마커 및 진단 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 하기에 제시된 실시예는 예시적인 것으로 이 분야에서 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위에서 제시된 실시예에 대한 다양한 변형 및 수정 발명을 만들 수 있을 것이다. 이러한 변형 및 수정 발명에 의하여 본 발명의 범위는 제한되지 않는다.

[ 실시예 1 : 난포액 회수]

(1) 과배란 유도

환자들은 생리주기 제 2 ~ 3일에 방문하여 혈중 LH 및 FSH 및 E2를 측정하였으며, 질식 초음파 상 난소 낭종을 포함한 골반 내 이상 유무를 확인하고, 기저 LH 수치가 10 pg/ml, FSH 수치가 10 pg/ml, E2 수치가 50 pg/ml 미만인 경우 과배란유도를 시작하였다. 성선자극호르몬 분비호르몬 유도제(gonadotropin releasing hormone agonist, GnRH-a), (Lorelin [Dongkook])의 장기투여법(long protocol)과 성선자극호르몬 분비호르몬 길항제(gonadotropin releasing hormone antagonist, GnRH-anta), (Cetrotide, Serono, Germany)의 단기투여법(short protocol)을 이용하여 난소를 자극하였다. 성선자극호르몬의 용량은 나이와 각각의 난포의 성장 및 혈중 E2 농도에 따라 조절하였으며, 초음파 검사 상 우성 난포의 직경이 18 mm 이상이 2개 이상일 경우 인융모성 생식선 자극호르몬(human chorionic gonadotropin, hCG), (Pregnyl, Organon, Netherlands), (IVF-C, LG, Korea) 10,000 IU를 근주하였다. hCG 투여 후, 36 ~ 40시간 내에 질식 초음파 유도 하에 난자 채취를 시행하였다. 채취된 난자 중 성숙 난자와 미성숙 난자의 수를 기록하였다.

(2) 난자 채취와 난자 등급 판별

hCG 투여 36 ~ 40시간 내에 질식초음파를 이용하여 난자 채취를 시행하였는데, 환자는 프로포플이나 펜토탈소디움(0.5 g, 중외)으로 정맥마취를 하거나, lidocaine 등으로 자궁경부에 국소마취를 시행하고 난자흡인 주사침(Wallace 17 G, Smiths Medical International Ltd, Australia)으로 난자를 흡인하였다. 난자가 포함되어 있는 HFF는 60 mm dish (#3002, Falcon , USA)에서 확인하여 난자만을 2 ml의 gamete buffer (Cook, Australia) or HEPES buffer (SAGE, USA)가 들어 있는 35 mm dish (#3001, Falcon , USA)에 채집하였다. 채취된 난자의 분류는 Sandow (1983)의 방법에 의해서 난자의 상태를 관찰한 뒤 배란 직전의 난자(pre-ovulatory oocyte)와 미성숙 난자를 미성숙(immature)으로, 성숙과 과성숙(post-mature oocyte)을 성숙(mature)으로 구분하였다. 모든 난자의 성숙도는 난자난구세포 복합체의 특징을 관찰하여 등급을 결정하였다.

[ 실시예 2 : HFF 의 수확과 동결 보존]

난자를 수확하고 남은 HFF는 14 ml cap tube (#2001, Falcon , USA)에 담아 모아 놓았다. 채취된 HFF는 oocytes, cumulus cell, granulosa cell, blood, HFF가 섞여 있으므로, 가급적 혈액이 섞이지 않은 HFF를 회수한 후 순수한 HFF만을 이용하기 위하여 3000 rpm에서 20분간 원심분리(MF80, Hanil, Korea)하였다. 상층액만을 조심스레 취한 후, 10% DMSO를 1 : 1의 비율이 되게 첨가하여 1.8 ㎖ cryo tube (Corning, Mexico)에 1.0 ㎖가 되게 분주하였다. 동결과정 없이 바로 -196 ℃ 액체질소에 침지하여 보관하였다가 연구에 사용하였다.

[ 실시예 3 : 시약]

본 실험에서 사용된 시약은 다음과 같다.

Dithiothreitol, Trizma base, urea, thiourea, CHAPS, glycine, ascorbate, iodoacetamide, ammonium sulfate, phosphoric acid, acetic acid, acrylamide, N',N'-methylenebisacrylamide, APS, TEMED, SDS, glycerol, bromophenol blue 등의 시약은 Sigma Aldrich사에서 구입하여 사용하였으며, Dimethyl sulfoxide (DMSO, D-5879)는 Sigma사의 제품을, Coomassie Blue G-250, protein assay시약은 Bio-rad사의 제품을 사용하였고, ampholyte (pH 4-7)는 Amersham bio sciences사의 제품을 사용하였다. 그리고 IPG stirp (pH 4-7)는 GE Healthcare biosciences사의 제품을 사용하였고, methanol, ethanol등 그 외의 시약은 일급의 제품을 이용하였다.

[ 실시예 4 : 기기와 소모품]

본 실험에서 사용된 기기와 소모품은 다음과 같다.

원심분리기는 Han-il science의 제품을, pipet aid는 Drummond Scientific Co. 제품을, homogenizer는 Sigma사의 제품을, spectrophotometer는 Biochrom사의 제품을, 단백질 전기영동 장치는 Hoefer사의 제품을 사용하였다. 실험에 사용된 소모품은 모두 1회용으로 serological pipet (7521, 7543, 7551)과 culture dish (3002), conical tube (2099), round bottom tube (2001)는 Falcon사의 제품을, 회수된 HFF의 저장은 Corning사의 cryogenic vial (430488) 제품을 사용하였다.

[ 실시예 5 : 2차원 전기영동]

가. 동결 저장된 HFF 의 해동

병원 냉동실의 액체질소저장탱크에 보관되어 있던 HFF를 1.5 L cryo portable tank를 사용하여 신속히 옮겼다. 액체 질소에 보관 되어있는 HFF를 37℃ 항온수조에서 해동하였다. 융해된 HFF를 4℃, 12,000 ~ 13,000 rpm에서 15 ~ 30분간 원심분리하고, 침전된 괴를 버리고 상등액을 취하였다.

나. 단백질 침전

녹인 HFF 50 ㎕에 -20℃에 보관중인 차가운 80% EtOH or 10% trichloroacetic acid (TCA) 1 을 조심스럽게 넣은 후 3차례 천천히 inverting하였다. 그 후에 -80℃ deepfreezer에 하루 동안 두어 단백질이 침전 되도록 하였다. 하루가 지난 후에 13,000 rpm, 4℃에서 30분간 원심분리하고, 상등액을 버린 후 100% EtOH 또는 10% TCA로 pellet을 풀어주며 washing하였다. 다시 13,000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 버리고 100% EtOH or 10% TCA로 washing하였으며 이를 한 번 더 반복하였다. 마지막 washing이 끝난 후 상등액을 버리고 pellet을 말려주었다.

다. 등전점 전기영동

HFF 에서 침전하여 분리된 단백질 500 ㎍을, 300 ㎕의 rehydration 용액(7 M urea, 2 M thiourea, 4% CHAPS, 0.5% ampholyt㎕㎕es, 100 mM DTT, 0.01% bromophenol blue)을 사용하여 단백질을 녹였다. 300㎕의 rehydration 용액에 녹아 있는 각 샘플의 단백질의 양을 bradford법을 이용하여 정량한 후에 최종 부피 250 ㎕에 단백질양이 1 ㎍이 되도록 하였다. 준비된 sample을 IPG holder에 주입하였고, 등전점 전기영동을 위하여 단백질이 가진 pH에 따라 이동할 수 있도록 만들어진 13 cm immobilized dry strip (pH 4-7 L, Amersham Bioscience)을 IPG holder에 넣은 후 12시간 동안 rehydration 시켰다. 성숙 HFF는 0 ~ 500 V에서 1000 V/h, 500 V에서 2000 V/h, 500 ~ 3500 V에서 10000 V/h, final phase 3500 V에서 35000 V/h, 총합 48000 V/h를 사용하였고, PCO HFF은 200 V/200 Vhrs, 500 V/500 Vhrs, 1,000 V/1,000 Vhrs, 8,000 V/38,000 Vhrs 조건에서 단백질이 가진 pH에 따라 전기장에 이동시켰다.

라. 평형화

등전점 전기영동이 끝난 성숙 HFF의 strip은 1차 평형화 완충용액[6 M urea, 50 mM Tris-HCl (pH 6.8), 4% SDS, 3.5 mg/mL DTT, 30% glycerol]에서 각각 15분간 1차 평형화를 실시한 후, 2차 평형화 완충용액[6 M urea, 50 mM Tris-HCl (pH 6.8), 4% SDS, 45 mg/mL iodoacetamide, 30% glycerol]에서 15분간 2차 평형화를 실시하였다.

PCO HFF의 strip은 1차 평형화 완충용액[6 M urea, 0.4 M Tris-HCl (pH 8.8), 2% SDS, 2% DTT, 10% glycerol]에서 각각 15분간 1차 평형화를 실시한 후, 2차 평형화 완충용액[6 M urea, 0.4 M Tris-HCl (pH 8.8), 2% SDS, 2% iodoacetamide, 10% glycerol]에서 15분간 2차 평형화를 실시하였다.

마. 2- Dimensional gel electrophoresis

12.5% acrylamide 겔을 만든 후 등전점 전기이동을 완료한 strip을 겔 위에 얹고, 그 위에 1% agarose gel로 고정시킨 뒤 이차원 전기이동을 실시하였다. 15분 동안 겔 당 30 mA씩 전류를 흐르게 하여 전개시킨 후, 5시간 동안 겔 당 60 mA 씩 전류를 걸어 단백질을 분자량에 따라 이동하게 하였다.

바. 겔 고정과 염색 및 탈색

전개가 끝난 겔을 fixing solution (45.4% MeOH, 4.6% acetic acid)에 담궈 12시간 이상 shaking하며 고정을 시킨 후 Coomassie Blue G-250 염색 용액(34% methanol, 0.1% Coomassie G-250, 17% ammonium sulfate, 3% phosphoric acid)을 사용하여 겔에서 분리된 단백질을 확인할 수 있도록 24시간 이상 shaking을 하며 염색한 후 5% 아세트산을 사용하여 탈색하였다.

사. 겔 이미지 분석

겔 이미지 분석을 위해 UMAZ powerLoook 1100으로 염색한 겔을 스캔한 후 Image Master^TM (2D software, Amersham)으로 이미지 분석을 실시하였다. 정확한 분석을 위하여 한 조건 당 3장의 겔을 분석하였다.

아. MALDI - TOF 분석

단백질 질량분석기는 Ettan MALDI-TOF (Amersham Bioscience)을 사용하였다. Rockfeller 대학에서 제작한 ProFound를 사용하여 분석된 펩타이드 질량 값 들을 데이터베이스를 통해 조사하였고, 그 결과를 바탕으로 분석된 단백질을 동정하였다. 단백질의 질량분석과 단백질 동정은 한국기초과학지원연구원에 의뢰하였다. 분석을 위해 겔에서 스팟을 오려낸 다음 튜브에 담아 30 nM potassium ferricyanide와 100 nM sodium thiosulfate를 1 : 1로 섞어 단백질 스팟이 들어있는 튜브에 첨가하였다. 염색시약이 사라질 때까지 방치하고 증류수를 이용하여 염색시약이 완전히 제거될 때까지 세척하였다. 200 nM ammonium bicarbonate에서 20분 동안 반응시킨 후 증류수로 세척하였다. 겔 조각이 불투명한 희색이 될 때까지 acetonitrile로 탈수시킨 후 진공 원심 분리기에 튜브를 넣고 30분간 겔을 건조하였다. 5-10 ng/의 trypsin과 ammonium bicarbonate를 넣고 37에서 12시간 이상 방치하였다. 이후 5% TCA가 들어있는 H₂O : acetonirtile (50 : 50)용액을 10-20 넣고 펩타이드 절편들을 3회 반복하여 추출하였다. 추출액을 진공 원심분리기에 넣고 2시간 동안 건조시킨 후 MALDI-TOF를 이용하여 분석하였다.

자. 단백질 동정

단백질 스팟으로부터 유래된 peptides는 denovo sequencing program, Pepseq를 사용하여 amino acid sequence 분석을 하였다. MASCOT search program(www.matrixscience.com)과 동정된 단백질은 BLAST를 이용하여 EST databases와 NCBInr로부터 protein sequence 하였다. 스팟의 단백질 동정 후 기능, 관련 질병은 http://www.uniprot.org/, Embl-Ebi(http://www.ebi.ac.uk/)에서 찾았다.

차. Western blot 분석

융해된 액은 원심 분리하여 세포 부산물을 제거한 후 상등액을 취해 단백질 정량을 실시하였다. 그 후 동일양의 각 단백질 시료를 시료용 완충용액[0.05 M Tris-HCl 완충용액(pH 6.8), 2% SDS, 5% β-mercaptoethanol, 10% glycerol, 0.001% bromophenol blue]과 혼합한 후, 100℃에서 5분간 가열하여 단백질을 완전히 변성시켰다. 시료와 표준단백질을 5% acrylamide로 된 stacking 겔과 10% acrylamide로 된 running 겔에서 SDS-PAGE를 실시하여 전기이동으로 분리하였다. 분리된 단백질을 blotting kit에 transfer buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris, 20% methanol)를 채운 상태에서 PVDF membrane으로 1시간 30분 동안 250 mA로 이동시켰다. 5% 탈지용액에 넣어 4℃에서 하루 동안 반응시킨 후 TBST 완충용액으로 씻은 다음 1차 항체인 vitamin D binding protein과 gelsolin을 적당한 비율로 5% 탈지용액에 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. TBST 완충용액으로 10분씩 수 회 세척 후 horseradish peroxidase가 붙어있는 goat anti mouse IgG와 rabbit anti goat IgG를 5% 탈지용액에 1 : 1,000으로 희석한 것을 사용하여 실온에서 50분 동안 반응시켰다. TBST 완충용액으로 10분씩 수 회 세척 후 membrane을 ECL solution (Amersham)에서 3분간 반응시킨 후 X-ray 필름에 노출시켜 시그널을 검출하였다.

동일 membrane 상에 positive control의 검출을 위하여 위에서 실험했던 PVDF membrane을 reprobing buffer [0.1 M glycine (pH 2.5)]에 10분 동안 반응 시킨 후, TBST 완충용액으로 수회 세척하여 5% 탈지용액에 넣어 4℃에서 하루 동안 반응시켰다. 1차 항체 β-actin을 적당한 비율로 5% 탈지용액에 희석한 후 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. TBST 완충용액으로 10분씩 수회 세척 후 horseradish peroxidase가 붙어있는 goat anti mouse IgG를 5% 탈지용액에 1 : 1,000으로 희석한 것을 사용하여 실온에서 50분 동안 반응시켰다. TBST 완충용액으로 10분씩 수회 세척 후 membrane을 ECL solution (Amersham)에서 3분간 반응시킨 후 X-ray 필름에 노출시켜 시그널을 검출하였다.

성숙 HFF 4 종류를 대조군으로 하여 다낭성 HFF 6 종류의 단백질 발현 양상 차이를 비교하였다. 두 군 사이에서 유의적 발현 차이를 보이는 7개의 단백질 스팟을 이차원 전기영동으로 분리하여 단백체 분석을 시행하였다. 대조군은 과배란유도 후 회수되어진 난자의 개수가 20개 이하인 성숙 HFF이었고, 회수되어진 난자의 개수가 20개 이상이며 PCO 진단을 받거나 의심되는 환자군으로부터의 HFF를 PCO군으로 분류하였다.

PCO군과 대조군의 시료에 대한 특성은 아래와 같다.

평균연령에서 대조군은 32.5세 이었고 PCO군은 30.83 세이었으며, 대조군에 비해 PCO군이 연령이 낮은 이유는 가임기 여성의 상당수가 PCO에 의한 불임임을 뜻한다. 난자(혹은 난모세포) 수는 대조군이 11개 이었고 PCO군이 31개로서(도 1), 대조군에 비해 PCO군의 다낭성 난포가 난자회수율 증가에 영향을 주었다. 불임관련 적응증은 대조군이 원인불명인 경우가 가장 많았고, 난관요인, 남성요인 순이며, PCO군은 PCO와 복합된 원인불명, 난관요인, 남성요인 순으로 다낭성소견의 차이를 제외하면 비슷한 양상의 소견을 보였다. 임신여부는 대조군과 PCO군 모두 난포액 채취당시 배아이식에서 임신에 실패하였다.

채취된 난자의 수정과 발달에 대한 특성은 다음과 같다. 채취된 난자 수에 대한 대조군의 성숙난자 비율은 84.16% 이었고, PCO군은 78.02% 이었다(도 2). 미성숙난자의 비율에서 대조군은 15.83% 이었고, PCO군은 21.94% 이었다(도 3). 이 결과는 대조군에 비해 PCO군의 다낭성 양상이 과배란유도 시 난포의 발육에 중요한 영향을 미치고 있음을 보여주고 있다.

이차원 전기영동으로 대조군과 PCO군에서 차별적인 발현을 보이는 단백질 스팟들을 선별하였다. 도 4 ~ 9은 7개 스팟에 대한 대조군과 PCO군의 단백질 발현 양상차이를 보여주는 이차원 전기영동 겔이다. 도 4 ~ 도 12는 대조군에 대한 PCO군에서 개별 스팟의 발현 변화를 나타내고 있다. 도 14에서는 대조군과 PCO군에서 차이를 보이는 7개의 스팟 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7에 대한 동정 및 발현차이를 나타내고 있다. Albumin (스팟 3), uncharacterized protein 1 (스팟 4), uncharacterized protein 2 (스팟 5)에서는 대조군의 발현량이 PCO군 보다 높은 반면, group specific component vitamin D binding protein (스팟 2), gelsolin (스팟 1), serum albumin (스팟 6), complement factor B (스팟 7)은 대조군에 비해 PCO군에서 높은 발현양상을 보이고 있다.

대조군과 PCO군에서 차별적 발현 양상을 보인 단백질 스팟의 기능은 아래와 같다.

스팟 1의 gelsolin은 calcium 조절물질로서, monomer exchange를 막아주는 actin-modulating 단백질이다. 이것은 filaments 절단뿐만 아니라 filament 내 monomers의 합성을 촉진하며, 자궁내막의 섬모형성 역할을 한다고 보고되었다. Phosphoinositide 신호 전달 경로 및 생체내의 이온 채널 기능을 조절하며, apoptosis의 effector이자 regulator로서 작용한다. 세포질 gelsolin는 cytoskeleton의 구조를 재편성하거나 세포표면의 단백질 축적의 역할을 한다. Blood, lymph, bronchial epithelia, synovial fluids, cerebro-spinal fluid등 여러 체액에서 그 존재를 확인할 수 있으며, 자유 thiol 형태로 존재한다. 또한, 플라즈마 gelsolin은 anti-amyloidogenic, anti-oxidant, anti-apoptotic 성질을 가지고 있어서, 알츠하이머 질환 치료제로서의 가능성을 가지고 있다고 보고되었다.

대부분의 동물세포 표면에 존재하며, 동물혈액 내, 배양세포 표면, 조직의 세포외 기질에 존재한다. 간에서 합성하여 혈액에 분비하는 이중합체의 혈장피브로넥틴과 섬유아세포에서 합성, 분비하는 다량체의 세포성 피브로넥틴으로 크게 나뉜다. 콜라겐, 헤파린, 피브린, 인테그린 등의 생체고분자에 결합한다. 세포접착, 세포신장의 촉진, 세포형태 조절, 세포이동, 조직구축, apoptosis 촉진, 세포분화 조절, 조직손상 수식, 암 전이 등 대단히 다양한 생리작용에 관여하는 것으로 알려져 있다.

혈청 및 세포의 칼슘 농도는 비타민 D의 작용에 의해 부분적으로 제어되는데, 최근 연구결과에서 체중, 혈당 내성, 그리고 난소기능의 조절에 칼슘과 비타민 D의 기능이 명확해지고 있다. 과체중 개인의 유제품 섭취량 증가와 혈청 25 hydroxyvitamin D 수준이 인슐린 저항 증후군 및 발병률의 감소가 있다는 연관성이 보고되었다. 비타민 D 수용체는 난소를 포함한 모든 칼슘 규제 조직에서 발현되며, 칼슘과 비타민은 전체 난소기능에 필요한 것으로 보인다.

따라서 에스트로겐 생합성, 포도당 내성, 체중, 뼈의 조절에서 비타민 D와 칼슘이 중요한 역할을 한다. 정자의 첨체 반응과 phospholipase C zeta의 매개로 난자 세포질 내 칼슘이온의 증가가 정자와 난자를 수정케 한다. 아크로좀이 결여된 globozoospermia의 경우 round-head-sperm의 증상을 보이며 정상적인 체외수정을 유도하더라도 zona pellucida를 통과하거나 결합하여 수정을 할 수 없으나, 미세수정(ICSI)함으로써 수정과 임신을 유도 할 수 있다. 하지만 미세수정 함에도 불구하고 낮은 수정율을 보이는데, 이는 첨체 반응(acrosome reaction)을 일으킬 수 없음에 난자 내 free 칼슘의 분비가 이루어지지 않음으로 인한 미수정을 야기하여 임신을 저해한다. 이의 해결을 위해 calcium ionophore solution을 이용한 일정시간 미세수정된 난자를 노출하여 수정을 활성화하고 임신을 유도할 수 있다.

스팟 2은 group specific component vitamin D binding protein으로 동정되었다. 이 단백질은 인간 testis에서 발현되고, spermatozoa의 성숙기능과 생존에 필요하다. 인간 testis에서 vitamin D (VD) metabolizing enzymes와 vitamin D receptor (VDR)의 marked expression을 바탕으로, 사정관과 성숙 정자에서 VD가 인간정자의 성숙과 spermatogenesis을 위해 중요하다고 하였다. Endometriosis의 임상 진단을 위한 잠재적인 마커를 알아보기 위해 endometriosis 환자의 소변에서 분비 단백질을 조사한 연구에서 urinary VDBP 레벨이 endometriosis 환자에서 상승하였다. VDBP mRNA의 단백질 시퀀스의 비교에서 인간 알부민(hALB)과 인간 알파 - 페토 프로테인(hAFP)이 강하고 높은 상동성을 보여, VDBP가 ALB와 AFP의 패밀리 유전자임을 확인하였다. 비타민 D 부족은 갑상선 기능 항진증을 포함한 수많은 자가 면역 질환과 연관되어 있고, 또한 비타민 D 결핍에 기여하는 다른 요인에는 비만도 포함되어 있다. 대조군에 비해 PCO군에 있어서 vitamin D binding protein의 발현이 증가되어 있는 본 연구결과를 통해 PCO군에서 비타민 D 요구량이 증가함을 알 수 있다. 난자의 성숙뿐 아니라 난포발달의 재개와 진행에서 칼슘과 비타민 D의 보충요법이 기능부전부정출혈을 해결하고, 생리주기의 정상화 결과를 보였으며, 일부에선 임신이 되기도 하였는데, 이 결과는 PCO 여성의 억제된 난포발달을 암시하였다.

스팟 7은 complement Factor B로 동정되었다. 이 단백질은 complement activation의 대체경로의 구성 요소로 single chain polypeptide 형태로 혈액에서 순환한다. 대체경로가 활성화되면, noncatalytic chain Ba와 catalytic subunit Bb가 complement factor D에 의해 분해된다. 활성 subunit Bb는 C3b와 관련이 있는 대체경로의 C3 convertase을 형성하는 serine protease이다. Ba 자신의 증식을 억제하면서, Bb는 preactivated된 B lymphocytes의 증식에 관여한다. Complement factor B는 주요 histocompatibility 복합(MHC) 클래스 III에 연결되어 있으며, 면역 반응의 조절에 관여하고 있다. Complement Factor B의 변이는 age-related macular degeneration의 위험 감소와 연관되어있다.

그 외 스팟 4, 5의 uncharacterized protein 1, uncharacterized protein 2 등도 함께 분리 동정되었으며, albumin (스팟 3), serum albumin (스팟 6)의 추가된 알부민 도메인을 발견했다.

도 13은 PCO군에서 더 높은 발현양상을 보인 vitamin D binding protein (VDBP)과 gelsolin을 웨스턴 블롯 분석을 통하여 검증한 결과이다. 동정된 단백질이 vitamin D binding protein 임을 다시 한 번 확인하였고, 프로테옴 분석 결과에서처럼 웨스턴 블롯에서도 대조군에 비해 PCO군에서 높은 발현양을 보이는지 알아보았다. Fig. 17에서 알 수 있듯이 대조군 1, 2, 3, 4에 비해 PCO군 1, 2, 3, 4, 5, 6에서 높은 발현양을 보였으며, 이러한 결과는 프로테옴 분석 결과와 잘 일치하였다. gelsolin을 웨스턴 블롯 분석을 통하여 검증한 결과에서도 동정된 단백질이 gelsolin 임을 다시 한 번 확인하였고, 단백체 결과에서와 같이 대조군 1, 2, 3, 4에 비해 PCO군 1, 2, 3, 4, 5, 6에서 더 높은 발현양을 보였다.

현재 human plasma에 대한 연구 자료에 비해 human follicular fluid (HFF) 내의 단백질에 대한 연구가 미약하다. 이는 HFF 채취의 제한성에 기인한 것이라 생각되는데, HFF에는 granulosa & thecal cell의 단백질 뿐 아니라, 혈청 유래 단백질들도 포함되어 있다. FF 채취 과정 중 순수한 FF만을 취하기는 사실상 불가능하며, 가급적 혈액이 포함되지 않은 FF를 취하는 것이 매우 중요하다. Granulosa & thecal cell이 분비하는 단백질들은 난포형성과정의 시기에 따라 다르며, 난자의 성숙과 발달에 좋은 영향을 주기도 하지만 좋지 않은 영향을 끼치는 것 또한 연구되고 있다. 혈청을 비롯하여 각기 다른 FF의 단백질 발현 패턴은 유사하나, 성숙 FF와 미성숙 FF 단백질의 발현 패턴은 서로 다르다고 보고되었다.

배아생성과정 중 회수되는 HFF를 임상적 특징으로 구분하여, 성숙 난자가 회수된 성숙 HFF와 회수된 난자대비 미성숙난자의 비율이 상대적으로 높은 PCO군의 HFF를 비교분석하여 차별적으로 발현되는 7개의 스팟을 추가로 분석하였다.

PCO군과 대조군의 비교 연구에서 성숙난자 비율은 PCO군에 비해 대조군이 높게 나타났으나, 미성숙난자 비율은 PCO군이 대조군에 비해 높았다(도 3). 대조군과 PCO군의 비교 실험에서 대조군에 비해 PCO군에서 감소된 발현 패턴을 보이는 3개의 단백질과 대조군에 비해 PCO군에서 상승된 발현 패턴을 나타낸 4개의 단백질인 gelsolin, complement factor B, vitamin D binding protein, serum albumin을 발굴하였다.

따라서, 상기 4개의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 진단 마커 및 진단키트를 이용하면, 다낭성 난소증후군 여부를 조기에 진단할 수 있을 것으로 판단되어, 본 발명을 하게 되었다.

이들 중 대조군에 비해 PCO군에서 높은 발현량을 보인 gelsolin은 자궁내막의 섬모형성 역할을 한다고 보고되었다. 대부분의 동물세포 표면에 존재하며, 동물 혈액 내, 배양세포 표면, 조직의 세포외 기질 등에 존재하면서, phosphoinositide 신호 전달 경로 및 생체내의 칼슘이온 같은 이온 채널 기능을 조절한다. 칼슘은 정자와 난자의 수정에서도 중요한 역할을 한다. 또한, 다낭성 난소(PCO)의 신진 대사 이상과 관련된 질환 뿐 만 아니라 자궁 내막 암 발달의 위험을 증가시킨다. gelsolin을 포함한 9개의 단백질이 자궁 내막 암 및 PCO가 있는 여성의 다양한 조직에서 과잉 표현되기도 하였다. gelsolin이 PCO 관련 질환이나 또 다른 질환에도 노출되어 있을 가능성을 암시한다고 볼 수 있는데, 이는 세포접착, 세포신장의 촉진, 세포형태 조절, 세포이동, 조직구축, Apoptosis 촉진, 세포분화 조절, 조직손상 수식, 암 전이 등 대단히 다양한 생리작용에 관여하고 있기 때문이다.

보체 시스템의 complement factor B는 보체 활성의 대체경로의 구성 요소로 면역 반응의 조절에 관여하고 있다고 알려져 있으며, 이는 PCO군의 질환과도 연관되어 있다. complement C4A는 자궁 내막 암이나 PCO가 있는 여성의 조직, 혈청에서 확인되었다. 선천적 또는 후천적 면역에 의해 활성화되는데, 그 경로는 세 가지로서 항원-항체 복합체에 의한 고전경로와 세균표면분자 및 세균산물에 의한 대체경로, 세균 표면의 당과의 결합에 의한 렙틴 경로이다. 이들은 간이나 대식세포 등에서 생산되며, 이들 보체활성화과정의 최종 목적은 membrane attack complex를 만들어 세균 벽을 파괴시키는 것이다. 여기서 PCO환자의 몸의 세포가 인슐린에 저항하게 되는 상태인 인슐린 저항성은 테스토스테론을 생성하고 다시 인슐린 저항성을 가지는 악순환을 형성하게 된다. 한편 인슐린 저항성은 염증과 면역체계 문제를 조장하여 갑상선 기능 항진증 같은 자가면역 질환에 걸리게 한다. 보체 시스템의 활성화는 PCO와 관련된 인슐린 저항성에 의한 자가 면역 질환의 발병 가능성을 암시한다고 할 수 있겠다.

Vitamin D binding receptor는 난소를 포함한 모든 칼슘 조절 조직에서 발현되며, 칼슘과 비타민 D는 전체 난소 기능에 필요하다. 에스트로겐 생합성, 포도당 내성, 체중, 뼈의 조절에서 비타민 D와 칼슘이 중요한 역할을 한다. 비타민 D 부족은 갑상선 기능 항진증을 포함한 수많은 자가 면역 질환과 연관되어 있고, 적절한 양의 비타민 D는 면역균형을 유지시키는데 도움이 된다. 또한 비타민 D 결핍에 기여하는 다른 요인에는 비만도 포함되어 있으며, PCO군과 연관된 이 같은 질환은 몸에 더 많은 양의 비타민 D를 요구하고 있다. 또한, 난자의 성숙뿐 아니라 난포 발달의 재개와 진행에서 칼슘과 비타민의 역할을 언급하고 있다. 칼슘과 비타민 D의 보충 요법이 기능부전부정출혈을 해결하고, 생리주기의 정상화 결과를 보였으며, 일부에선 임신이 되기도 하였다. 이러한 데이터는 PCO 여성의 억제된 난포 발달을 암시한다.

결론적으로, HFF 프로테옴의 임상적 의미를 이해하기 위해서는 프로테옴의 완전한 분석이 필요하다. 본 결과는 정상적인 성숙 HFF 단백질의 표준 2-D 지도제작에 도움이 될 것으로 생각되며, PCO 관련 단백질 발현 양상 결과에서 대조군과 그 발현 패턴의 차이를 알아보았다. 대조군에 비해 PCO군에서 증가된 발현 양상을 보인 이들 단백질들은 난자의 competence와 PCO 진단 바이오마커 후보군 발굴에 도움이 될 것으로 생각된다. 또한, 이 단백질들은 난소관련 질병을 진단하고 난자 성숙 과정 중 생리적 변화를 효과적으로 연구하는데 유용하게 사용될 수 있을 것이다. 특히, 프로테옴 분석뿐만 아니라 웨스턴 블롯 분석을 통해서, 그 발현 패턴이 검증된 vitamin D binding protein과 gelsolin은 PCO의 특성상 명확한 진단기준을 확립하지 못할 만큼 다양한 질환을 동반하고 있거나, PCO의 전형적인 증상을 보이지 않는 초기 진단에 유용할 것으로 생각된다.

Claims (3)

1. Vitamin D bindning protein, gelsolin, 혈청알부민(serum albumin), complement factor B 중 어느 1종 이상의 단백질 또는 이에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 유효성분으로 포함하는 다낭성 난소증후군 진단 마커 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   Vitamin D bindning protein 및 gelsolin 또는 이에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 유효성분으로 포함하는 다낭성 난소증후군 진단 마커 조성물.
3. Vitamin D bindning protein, gelsolin, 혈청알부민(serum albumin), complement factor B 중 어느 1종 이상의 단백질 또는 이에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 유효성분으로 포함하는 다낭성 난소증후군 진단 키트.

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