JP2013095702A - β−１，３−グルカンを含む過敏性腸症候群の下痢抑制剤、腹痛改善剤、及び大腸における痛覚過敏改善剤 - Google Patents
β−１，３−グルカンを含む過敏性腸症候群の下痢抑制剤、腹痛改善剤、及び大腸における痛覚過敏改善剤 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】本発明は、安全かつ効果的な過敏性腸症候群の下痢抑制剤、及び過敏性腸症候群の腹痛改善剤を提供することを課題とする。また、本発明は、安全かつ効果的な大腸における痛覚過敏改善剤を提供することを課題とする。
【解決手段】 β-１,３-グルカンを含む過敏性腸症候群の下痢抑制剤、過敏性腸症候群の腹痛改善剤、及び大腸における痛覚過敏改善剤。
【選択図】図３
【解決手段】 β-１,３-グルカンを含む過敏性腸症候群の下痢抑制剤、過敏性腸症候群の腹痛改善剤、及び大腸における痛覚過敏改善剤。
【選択図】図３
Description
本発明は、過敏性腸症候群の下痢抑制、過敏性腸症候群の腹痛改善、及び大腸における痛覚過敏を抑制するための、β-１，３-グルカンの使用に関する。
過敏性腸症候群（irritable bowel syndrome; ＩＢＳ）とは、大腸組織に器質的な病変が認められないにも関わらず、腹痛・腹部不快感をともなう慢性的な排便異常（便秘あるいは下痢）を生じる機能性消化管疾患である。ＩＢＳは、その症状より、下痢型、便秘型、混合型および分類不明型に分類されている。
先進国において、ＩＢＳの有病率は全人口の約１０〜２０％に達するいわれており、極めて高頻度な消化器疾患であると言われている。また、ＩＢＳの症状は、患者の生活の質や労働生産性を著しく低下させるなど大きな社会問題となっている。
先進国において、ＩＢＳの有病率は全人口の約１０〜２０％に達するいわれており、極めて高頻度な消化器疾患であると言われている。また、ＩＢＳの症状は、患者の生活の質や労働生産性を著しく低下させるなど大きな社会問題となっている。
ＩＢＳの薬物療法として、ポリカルボフィルカルシウムなどの高分子重合体、若しくはマレイン酸トリメブチンなどの消化管運動調節薬を処方して、症状が改善されない場合には、その症状に応じて、乳酸菌製剤、下剤・抗コリン薬などが投与する方法が知られている。しかしながら、これらの方法では、症状の改善が不十分であり、有効性も低かった（非特許文献１）。一方、セロトニン受容体拮抗薬として、アロセトロン等の下痢型ＩＢＳ治療薬が上市されており、比較的高い有効性が報告されているが、重篤な便秘や虚血性大腸炎などの副作用をなすことが報告されている（非特許文献２）。従って、安全かつ効果的な過敏性腸症候群の症状の予防又は改善剤が求められている
一方、β-グルカンは、きのこやカビが産生する細胞壁の成分として古くから知られており、天然物由来の有用な健康食品として利用されてきた。β-グルカンは、免疫賦活活性から抗癌や抗癌転移効果（非特許文献３）や炎症性反応の低減にも効果があることが知られている（非特許文献４）。
また、特許文献１には、抗がん剤の経口投与と共に、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを経口投与することにより、抗癌剤の副作用である小腸粘膜障害、及び下痢が抑制されたことが記載されている。このようにβ-グルカンは、免疫賦活作用を通した炎症反応の低減により、種々の疾病に対して効果を示すことが報告されている。しかしながら、過敏性腸症候群における下痢や腹痛・腹部不快感の症状を改善するとの報告はされていない。また、大腸における痛覚過敏を改善するとの報告もされていない。
また、特許文献１には、抗がん剤の経口投与と共に、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを経口投与することにより、抗癌剤の副作用である小腸粘膜障害、及び下痢が抑制されたことが記載されている。このようにβ-グルカンは、免疫賦活作用を通した炎症反応の低減により、種々の疾病に対して効果を示すことが報告されている。しかしながら、過敏性腸症候群における下痢や腹痛・腹部不快感の症状を改善するとの報告はされていない。また、大腸における痛覚過敏を改善するとの報告もされていない。
心療内科,8,21-27,2004
Ａｍ J Gastroentero,97(11suppl),S7-S26,2002
Immunity,19(3),311-315
Shock 27(4),397-401
本発明は、安全かつ効果的な過敏性腸症候群の下痢抑制剤、及び腹痛改善剤を提供することを課題とする。また、本発明は、安全かつ効果的な大腸における痛覚過敏改善剤を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ね、β-１,３-グルカンが過敏性腸症候群における排便異常を改善、及び腹痛を改善することを見出した。また、β-１,３-グルカンが、大腸における痛覚過敏を低減することを見出した。多糖がこれらの作用を有することは、これまで知られていない。本発明はこれらの知見に基づき完成されたものであり、以下の過敏性腸症候群の下痢抑制剤、腹痛改善剤、及び大腸における痛覚過敏改善剤を提供する。
項１. β-１,３-グルカンを含む過敏性腸症候群の下痢抑制剤。
項２. β-１,３-グルカンがβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンである項１に記載の剤。
項３. β-１,３-１,６-グルカンが、β-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-グルカンである項１又は２に記載の剤。
項４. β-１,３-１,６-グルカンが、オーレオバシジウム属の微生物が産生するβ-１,３-１,６-グルカンである項１〜３に記載の剤。
項５. オーレオバシジウム属の微生物が、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８５）、又はＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８６）である項４に記載の剤。
項６. β-１,３-グルカンを含む過敏性腸症候群の腹痛改善剤。
項７. β-１,３-グルカンがβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンである項６に記載の剤。
項８. β-１,３-１,６-グルカンが、β-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-グルカンである項６又は７に記載の剤。
項９. β-１,３-１,６-グルカンが、オーレオバシジウム属の微生物が産生するβ-１,３-１,６-グルカンである項６〜８に記載の剤。
項１０. オーレオバシジウム属の微生物が、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８５）、又はＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８６）である項９に記載の剤。
項１１. β-１,３-グルカンを含む大腸における痛覚過敏改善剤。
項１２. β-１,３-グルカンがβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンである項１１に記載の剤。
項１３. β-１,３-１,６-グルカンが、β-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-グルカンである項１１又は１２に記載の剤。
項１４. β-１,３-１,６-グルカンが、オーレオバシジウム属の微生物が産生するβ-１,３-１,６-グルカンである項１１〜１３に記載の剤。
項１５. オーレオバシジウム属の微生物が、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８５）、又はＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８６）である項１４に記載の剤。
項２. β-１,３-グルカンがβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンである項１に記載の剤。
項３. β-１,３-１,６-グルカンが、β-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-グルカンである項１又は２に記載の剤。
項４. β-１,３-１,６-グルカンが、オーレオバシジウム属の微生物が産生するβ-１,３-１,６-グルカンである項１〜３に記載の剤。
項５. オーレオバシジウム属の微生物が、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８５）、又はＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８６）である項４に記載の剤。
項６. β-１,３-グルカンを含む過敏性腸症候群の腹痛改善剤。
項７. β-１,３-グルカンがβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンである項６に記載の剤。
項８. β-１,３-１,６-グルカンが、β-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-グルカンである項６又は７に記載の剤。
項９. β-１,３-１,６-グルカンが、オーレオバシジウム属の微生物が産生するβ-１,３-１,６-グルカンである項６〜８に記載の剤。
項１０. オーレオバシジウム属の微生物が、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８５）、又はＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８６）である項９に記載の剤。
項１１. β-１,３-グルカンを含む大腸における痛覚過敏改善剤。
項１２. β-１,３-グルカンがβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンである項１１に記載の剤。
項１３. β-１,３-１,６-グルカンが、β-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-グルカンである項１１又は１２に記載の剤。
項１４. β-１,３-１,６-グルカンが、オーレオバシジウム属の微生物が産生するβ-１,３-１,６-グルカンである項１１〜１３に記載の剤。
項１５. オーレオバシジウム属の微生物が、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８５）、又はＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８６）である項１４に記載の剤。
β-１,３-グルカンは、セロトニン及びアセチルコリン等に起因する排便異常の症状を改善する。即ち、過敏性腸症候群の排便異常、及び腹痛を予防又は改善剤として有用である。また、本発明の剤は、大腸のおける痛覚過敏に対して、効果的に症状を改善することから、腹痛・腹部不快感を伴う慢性的な便通異常を生じる機能性消化管疾患の予防又は改善剤などとして有用である。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の過敏性腸症候群の下痢抑制剤、腹痛改善剤、及び大腸における痛覚過敏改善剤は、β-１,３-グルカンを有効成分として含む。
β-１,３-グルカン
β-１,３-グルカンとしては、β-１,３-Ｄ-グルカン、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン、β-１,３-１,４-Ｄ-グルカンなどが挙げられる。中でも、β-１,３-１，６-Ｄ-グルカンが好ましい。
これらのβ-１,３-グルカンは、酵母、担子菌（キノコ）類、かび類、乳酸菌、その他微生物等の細胞壁に大量に含まれている。また、β-１,３-グルカンを菌体外へ分泌する菌体も知られている。さらに、大麦、カラスムギ等のイネ科植物にも大量に含まれていることも知られている。中でも、オーレオバシジウム属微生物はβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを主に生産するので、オーレオバシジウム属微生物由来のβ-１,３-グルカンが好ましい。
本発明の過敏性腸症候群の下痢抑制剤、腹痛改善剤、及び大腸における痛覚過敏改善剤は、β-１,３-グルカンを有効成分として含む。
β-１,３-グルカン
β-１,３-グルカンとしては、β-１,３-Ｄ-グルカン、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン、β-１,３-１,４-Ｄ-グルカンなどが挙げられる。中でも、β-１,３-１，６-Ｄ-グルカンが好ましい。
これらのβ-１,３-グルカンは、酵母、担子菌（キノコ）類、かび類、乳酸菌、その他微生物等の細胞壁に大量に含まれている。また、β-１,３-グルカンを菌体外へ分泌する菌体も知られている。さらに、大麦、カラスムギ等のイネ科植物にも大量に含まれていることも知られている。中でも、オーレオバシジウム属微生物はβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを主に生産するので、オーレオバシジウム属微生物由来のβ-１,３-グルカンが好ましい。
β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンにおいて、主鎖のβ-１,３結合数に対する側鎖のβ-１，６結合数の比率である分岐度は、通常約５０〜１００％、好ましくは約７５〜１００％、より好ましくは約８５〜１００％であればよい。
β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンが上記分岐度を有することは、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンをエキソ型のβ-１，３-グルカナーゼ（キタラーゼ Ｍ、ケイアイ化成製）で加水分解処理した場合に分解生成物としてグルコースとゲンチオビオースが遊離すること、及びＮＭＲの積算比から確認できる（今中忠行 監修、微生物利用の大展開、1012-1015、エヌ・ティー・エス（2002））。
β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンが上記分岐度を有することは、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンをエキソ型のβ-１，３-グルカナーゼ（キタラーゼ Ｍ、ケイアイ化成製）で加水分解処理した場合に分解生成物としてグルコースとゲンチオビオースが遊離すること、及びＮＭＲの積算比から確認できる（今中忠行 監修、微生物利用の大展開、1012-1015、エヌ・ティー・エス（2002））。
上記の分岐度を有するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が、好ましくは２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下、より好ましくは１００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下、さらに好ましくは５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下のものである。上記粘度の下限値は通常１０ｃＰ（ｍＰａ・s）程度であり得る。
本発明において、粘度は、ＢＭ型回転粘度計を用いて測定した値である。
本発明において、粘度は、ＢＭ型回転粘度計を用いて測定した値である。
(a)オーレオバシジウム属微生物が生産するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン
オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物由来のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１Ｈ ＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有する。ＮＭＲの測定値は条件の微妙な変化によって変化し、また誤差を伴うことは周知のことであることから、「約４．７ｐｐｍ」「約４．５ｐｐｍ」は、通常予測される範囲の測定値の変動幅（例えば±０．２）を含む数値を意味する。
オーレオバシジウム属の微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、菌体外に分泌されるため、キノコ類やパン酵母の細胞壁に含まれるβ-グルカンと比べて、回収が容易であり、また水溶性である点で好ましいものである。オーレオバシジウム属の微生物は、分子量が１００万以上の高分子量のグルカンから分子量が数万程度の低分子のグルカンまでを培養条件に応じて産生することができる。
オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物由来のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１Ｈ ＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有する。ＮＭＲの測定値は条件の微妙な変化によって変化し、また誤差を伴うことは周知のことであることから、「約４．７ｐｐｍ」「約４．５ｐｐｍ」は、通常予測される範囲の測定値の変動幅（例えば±０．２）を含む数値を意味する。
オーレオバシジウム属の微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、菌体外に分泌されるため、キノコ類やパン酵母の細胞壁に含まれるβ-グルカンと比べて、回収が容易であり、また水溶性である点で好ましいものである。オーレオバシジウム属の微生物は、分子量が１００万以上の高分子量のグルカンから分子量が数万程度の低分子のグルカンまでを培養条件に応じて産生することができる。
中でも、培養液が比較的低粘度であること、及びβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを高生産する点で、オーレオバシジウム・プルランス(Aureobasidium pullulans)が生産するものが好ましく、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株、又はＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株（独立行政法人産業技術研究所特許生物寄託センターにそれぞれＦＥＲＭ
Ｐ-１９２８５及びＦＥＲＭ Ｐ-１９２８６として寄託済み）が産生するものが好ましい。ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株及びＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株は、オーレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）Ｋ-１株の変異株である。オーレオバシジウム属Ｋ-１株は、分子量２００万以上と１００万程度の２種類のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを産生することが知られている。
また、オーレオバシジウム属微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、通常、硫黄含有基を有するところ、Ｋ-１株の産生するβ-グルカンはスルホ酢酸基を有することが知られている（Arg.Biol.Chem.,47,1167-1172(1983)）,科学と工業,64,131-135（1990））。ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株、及びＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株が生産するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンもスルホ酢酸基を有すると考えられる。オーレオバシジウム属微生物の中には、リン酸基のようなリン含有基、リンゴ酸基などを含むβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを産生する菌種、菌株も存在する。
ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株及びＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株は、後に実施例において示すようにメインピークが見かけ上５０〜２５０万の高分子量のβ-グルカン（微粒子グルカン）とメインピークが見かけ上２〜３０万の低分子量のβ-グルカンの両方を産生する菌株である。この微粒子状グルカンは、一次粒子径が０．０５〜２μｍ程度である。
Ｐ-１９２８５及びＦＥＲＭ Ｐ-１９２８６として寄託済み）が産生するものが好ましい。ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株及びＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株は、オーレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）Ｋ-１株の変異株である。オーレオバシジウム属Ｋ-１株は、分子量２００万以上と１００万程度の２種類のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを産生することが知られている。
また、オーレオバシジウム属微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、通常、硫黄含有基を有するところ、Ｋ-１株の産生するβ-グルカンはスルホ酢酸基を有することが知られている（Arg.Biol.Chem.,47,1167-1172(1983)）,科学と工業,64,131-135（1990））。ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株、及びＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株が生産するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンもスルホ酢酸基を有すると考えられる。オーレオバシジウム属微生物の中には、リン酸基のようなリン含有基、リンゴ酸基などを含むβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを産生する菌種、菌株も存在する。
ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株及びＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株は、後に実施例において示すようにメインピークが見かけ上５０〜２５０万の高分子量のβ-グルカン（微粒子グルカン）とメインピークが見かけ上２〜３０万の低分子量のβ-グルカンの両方を産生する菌株である。この微粒子状グルカンは、一次粒子径が０．０５〜２μｍ程度である。
β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの溶解度は、ｐＨ及び温度に依存する。このβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、ｐＨ３．５、温度２５℃の条件で２ｍｇ／ｍｌ水溶液を調製しようとすると、その５０重量％以上が一次粒子径０．０５〜２μｍの微粒子を形成し、残部は水に溶解する。本発明において粒子径は、レーザー回折散乱法により測定した値である。
オーレオバシジウム属微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンも、水溶液にしたときの粘度が、オーレオバシジウム属微生物が産生する天然型β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンより低いものが好ましい。この低粘度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が、通常２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、より好ましくは１００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、さらに好ましくは５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、さらにより好ましくは１０ｃＰ以下である。
オーレオバシジウム属微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンも、水溶液にしたときの粘度が、オーレオバシジウム属微生物が産生する天然型β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンより低いものが好ましい。この低粘度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が、通常２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、より好ましくは１００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、さらに好ましくは５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、さらにより好ましくは１０ｃＰ以下である。
この低粘度グルカンは、オーレオバシジウム属微生物が産生する天然型β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンと同様の一次構造を有し得る。具体的には、１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１ＨＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有するものである。ＮＭＲの測定値は条件の微妙な変化によって変化し、また誤差を伴うことは周知のことであることから、「約４．７ｐｐｍ」「約４．５ｐｐｍ」は、通常予測される範囲の測定値の変動幅（例えば±０．２）を含む数値を意味する。
β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、金属イオン濃度が、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの固形分１ｇ当たり０．４ｇ以下であることが好ましく、０．２ｇ以下であることがより好ましく、０．１ｇ以下であることがさらにより好ましい。原料β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンが水溶液状態のものである場合は、金属イオン濃度は、水溶液の１００ｍｌ当たり１２０ｍｇ以下であることが好ましく、５０ｍｇ以下であることがより好ましく、２０ｍｇ以下であることがさらにより好ましい。
β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、金属イオン濃度が、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの固形分１ｇ当たり０．４ｇ以下であることが好ましく、０．２ｇ以下であることがより好ましく、０．１ｇ以下であることがさらにより好ましい。原料β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンが水溶液状態のものである場合は、金属イオン濃度は、水溶液の１００ｍｌ当たり１２０ｍｇ以下であることが好ましく、５０ｍｇ以下であることがより好ましく、２０ｍｇ以下であることがさらにより好ましい。
ここでいう金属イオンには、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、第３〜第５族金属イオン、遷移金属イオンなどが含まれるが、混入する可能性のある金属イオンとしては、代表的には、低粘度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの製造において使用されるアルカリ由来のカリウムイオン、ナトリウムイオンなどが挙げられる。金属イオン濃度は、限外ろ過や透析により調整できる。
金属イオン濃度が上記範囲であれば、水溶液状態で保存する場合や、水溶液状態で加熱滅菌する際に、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンのゲル化、凝集、沈殿が生じ難い。また、固形で使用する場合は、再溶解させる場合に凝集などが生じ難い。
金属イオン濃度が上記範囲であれば、水溶液状態で保存する場合や、水溶液状態で加熱滅菌する際に、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンのゲル化、凝集、沈殿が生じ難い。また、固形で使用する場合は、再溶解させる場合に凝集などが生じ難い。
(b)オーレオバシジウム属微生物によるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの生産方法
分岐度５０〜１００％のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、例えば、これを産生する微生物の培養上清に有機溶媒を添加することにより沈殿物として得ることができる。
また、オーレオバシジウム属の微生物を培養して、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを産生させる方法は種々報告されている。培養培地に使用できる炭素源としては、シュークロース、グルコース、フラクトースなどの炭水化物、ペプトンや酵母エキスなどの有機栄養源等を挙げることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウムや硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの無機窒素源等を挙げることができる。場合によってはβ-グルカンの産生量を上昇させるために適宜、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などの無機塩、更には鉄、銅、マンガンなどの微量金属塩やビタミン類等を添加するのも有効な方法である。
オーレオバシジウム属微生物を、炭素源としてシュークロースを含むツアペック培地にアスコルビン酸を添加した培地で培養した場合、高濃度のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを産生することが報告されている（Arg.Biol.Chem.,47,1167-1172(1983)）；科学と工業,64,131-135（1990）；特開平７−５１０８２号公報）。しかし、培地は、微生物が生育し、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを生産するものであればよく、特に限定されない。必要に応じて酵母エキスやペプトンなどの有機栄養源を添加してもよい。
分岐度５０〜１００％のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、例えば、これを産生する微生物の培養上清に有機溶媒を添加することにより沈殿物として得ることができる。
また、オーレオバシジウム属の微生物を培養して、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを産生させる方法は種々報告されている。培養培地に使用できる炭素源としては、シュークロース、グルコース、フラクトースなどの炭水化物、ペプトンや酵母エキスなどの有機栄養源等を挙げることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウムや硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの無機窒素源等を挙げることができる。場合によってはβ-グルカンの産生量を上昇させるために適宜、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などの無機塩、更には鉄、銅、マンガンなどの微量金属塩やビタミン類等を添加するのも有効な方法である。
オーレオバシジウム属微生物を、炭素源としてシュークロースを含むツアペック培地にアスコルビン酸を添加した培地で培養した場合、高濃度のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを産生することが報告されている（Arg.Biol.Chem.,47,1167-1172(1983)）；科学と工業,64,131-135（1990）；特開平７−５１０８２号公報）。しかし、培地は、微生物が生育し、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを生産するものであればよく、特に限定されない。必要に応じて酵母エキスやペプトンなどの有機栄養源を添加してもよい。
オーレオバシジウム属の微生物を上記培地で好気培養するための条件としては、１０〜４５℃程度、好ましくは２０〜３５℃程度の温度条件、３〜７程度、好ましくは３．５〜５程度のｐＨ条件等が挙げられる。
効果的に培養ｐＨを制御するためにアルカリ、あるいは酸で培養液のｐＨを制御することも可能である。更に培養液の消泡のために適宜、消泡剤を添加してもよい。培養時間は通常１〜１０日間程度、好ましくは１〜４日間程度であり、これによりβ-グルカンを産生することが可能である。なお、β-グルカンの産生量を測定しながら培養時間を決めてもよい。
上記条件下オーレオバシジウム属の微生物を４〜６日間程度通気攪拌培養すると、培養液にはβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを主成分とするβ−グルカン多糖が０．１％(ｗ/ｖ)〜数％（ｗ/ｖ）含有されており、その培養液の粘度はＢＭ型回転粘度計（東機産業社製）により３０℃では数百ｃＰ([ｍＰａ・s])から数千ｃＰ（[ｍＰａ・s]）という非常に高い粘度を有する。この培養を遠心分離して得られる上清に例えば有機溶媒を添加することにより、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを沈殿物として得ることができる。
効果的に培養ｐＨを制御するためにアルカリ、あるいは酸で培養液のｐＨを制御することも可能である。更に培養液の消泡のために適宜、消泡剤を添加してもよい。培養時間は通常１〜１０日間程度、好ましくは１〜４日間程度であり、これによりβ-グルカンを産生することが可能である。なお、β-グルカンの産生量を測定しながら培養時間を決めてもよい。
上記条件下オーレオバシジウム属の微生物を４〜６日間程度通気攪拌培養すると、培養液にはβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを主成分とするβ−グルカン多糖が０．１％(ｗ/ｖ)〜数％（ｗ/ｖ）含有されており、その培養液の粘度はＢＭ型回転粘度計（東機産業社製）により３０℃では数百ｃＰ([ｍＰａ・s])から数千ｃＰ（[ｍＰａ・s]）という非常に高い粘度を有する。この培養を遠心分離して得られる上清に例えば有機溶媒を添加することにより、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを沈殿物として得ることができる。
＜低粘度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの製造方法＞
上記の高粘度のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含む培養液を、常温で攪拌しながら、これにアルカリを添加すると、急激に粘度が低下する。
アルカリは、水溶性で、かつ医薬品や食品添加物として用いることができるものであればよく、特に限定されない。例えば、炭酸カルシウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸アンモニウム水溶液などの炭酸アルカリ水溶液；水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液などの水酸化アルカリ水溶液；あるいはアンモニア水溶液などを使用できる。アルカリは、培養液のｐＨが１２以上、好ましくは１３以上になるように添加してもよい。例えば、水酸化ナトリウムを使用して培養液のｐＨを上げる場合は、水酸化ナトリウムの最終濃度が好ましくは０．５％(ｗ/ｖ)以上、より好ましくは１．２５％(ｗ/ｖ)以上になるように添加すればよい。培養液にアルカリを添加し、良く攪拌すると、瞬時に培養液の粘度が低下する。
上記の高粘度のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含む培養液を、常温で攪拌しながら、これにアルカリを添加すると、急激に粘度が低下する。
アルカリは、水溶性で、かつ医薬品や食品添加物として用いることができるものであればよく、特に限定されない。例えば、炭酸カルシウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸アンモニウム水溶液などの炭酸アルカリ水溶液；水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液などの水酸化アルカリ水溶液；あるいはアンモニア水溶液などを使用できる。アルカリは、培養液のｐＨが１２以上、好ましくは１３以上になるように添加してもよい。例えば、水酸化ナトリウムを使用して培養液のｐＨを上げる場合は、水酸化ナトリウムの最終濃度が好ましくは０．５％(ｗ/ｖ)以上、より好ましくは１．２５％(ｗ/ｖ)以上になるように添加すればよい。培養液にアルカリを添加し、良く攪拌すると、瞬時に培養液の粘度が低下する。
次いで、アルカリ処理後の培養液から菌体などの不溶性物質を分離する。培養液の粘度が低いため、菌体を自然沈降させて上澄みを回収する方法（デカント法）、遠心分離、ろ紙あるいはろ布を利用した全量ろ過、フィルタープレス、更に膜ろ過（ＭＦ膜などの限外ろ過）などの方法で、容易に不溶性物質とグルカンとを分離できる。ろ紙あるいはろ布による全量ろ過の場合は、セライトなどろ過助剤を利用するのも一つの手段である。工業的にはフィルタープレスによる菌体除去が好ましい。また、不溶性物質除去前のβ-Ｄ-グルカン液は必要に応じて水で希釈しても良い。濃度が高すぎると不溶性物質除去が困難であり、低すぎても効率的でない。β-Ｄ-グルカン濃度は、例えば０.１ｍｇ/ｍｌ〜２０ｍｇ/ｍｌ程度、好ましくは０.５ｍｇ/ｍｌ〜１０ｍｇ/ｍｌ程度、さらに好ましくは１ｍｇ/ｍｌ〜５ｍｇ/ｍｌ程度が良い。
次いで、グルカンを含む溶液に酸を添加して中和する。中和は、不溶物の除去前に行ってもよい。酸は、医薬や食品添加物として使用できるものであればよく、特に限定されない。例えば、塩酸、燐酸、硫酸、クエン酸、リンゴ酸などを使用できる。酸の使用量は、溶液又は培養液の液性が中性（ｐＨ５〜８程度）になるような量とすればよい。即ち、中和はｐＨ７に合わせることを必ずしも要さない。
ｐＨ１２以上のアルカリ処理後、中和して得られるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が通常２００ｃＰ以下、場合によっては、１００ｃＰ以下、５０ｃＰ以下、又は１０ｃＰ以下である。粘度は製造方法ないしは精製方法によって変動する。
アルカリ処理された低粘度のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、中和しても粘度が高くなることがない。さらに、常温（１５〜３５℃）では、液性をｐＨが４を下回るような酸性にしても、粘度が高くなることがない。
また、培養上清をアルカリ処理、及び中和した後に、菌体などを除去するのに代えて、培養上清から菌体などを除去した後に、アルカリ処理、及び中和を行うこともできる。
ｐＨ１２以上のアルカリ処理後、中和して得られるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が通常２００ｃＰ以下、場合によっては、１００ｃＰ以下、５０ｃＰ以下、又は１０ｃＰ以下である。粘度は製造方法ないしは精製方法によって変動する。
アルカリ処理された低粘度のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、中和しても粘度が高くなることがない。さらに、常温（１５〜３５℃）では、液性をｐＨが４を下回るような酸性にしても、粘度が高くなることがない。
また、培養上清をアルカリ処理、及び中和した後に、菌体などを除去するのに代えて、培養上清から菌体などを除去した後に、アルカリ処理、及び中和を行うこともできる。
得られるグルカン水溶液からグルカンより低分子量の可溶性夾雑物（例えば塩類など）を除去する場合は、例えば限外ろ過を行えばよい。
また、アルカリ処理、除菌した後、中和せずに、アルカリ性条件下で限外ろ過することもでき、これにより透明性、熱安定性、長期保存性に一層優れる精製β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンが得られる。アルカリ性条件は、ｐＨ１０以上、好ましくは１２以上であり、ｐＨの上限は通常１３．５程度である。
このようにして得られる水溶液に含まれるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、乾燥させて固形製剤にする場合も、また水溶液のまま製剤として使用する場合も、一旦、水溶液から析出させることができる。β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの析出方法は、特に限定されないが、例えば、限外ろ過などにより濃縮してグルカン濃度を１ｗ／ｗ％以上にした水溶液に、エタノールのようなアルコールを、水溶液に対して容積比で等倍以上、好ましくは２倍以上添加することにより、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを析出させることができる。この場合にｐＨをクエン酸などの有機酸によりｐＨを酸性、好ましくはｐＨ４未満、さらに好ましくはｐＨ３-３．７に調製して、エタノールを添加すると高純度のβ-１,３-１,６-グルカンの粉末を得ることができる。
また、アルカリ処理、除菌した後、中和せずに、アルカリ性条件下で限外ろ過することもでき、これにより透明性、熱安定性、長期保存性に一層優れる精製β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンが得られる。アルカリ性条件は、ｐＨ１０以上、好ましくは１２以上であり、ｐＨの上限は通常１３．５程度である。
このようにして得られる水溶液に含まれるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、乾燥させて固形製剤にする場合も、また水溶液のまま製剤として使用する場合も、一旦、水溶液から析出させることができる。β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの析出方法は、特に限定されないが、例えば、限外ろ過などにより濃縮してグルカン濃度を１ｗ／ｗ％以上にした水溶液に、エタノールのようなアルコールを、水溶液に対して容積比で等倍以上、好ましくは２倍以上添加することにより、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを析出させることができる。この場合にｐＨをクエン酸などの有機酸によりｐＨを酸性、好ましくはｐＨ４未満、さらに好ましくはｐＨ３-３．７に調製して、エタノールを添加すると高純度のβ-１,３-１,６-グルカンの粉末を得ることができる。
β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを低粘度化することにより、限外ろ過などによる濃縮を容易に行えることから、アルコール沈殿に使用するアルコール量を少なくすることができる。
固形物として得る場合は、低粘度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン水溶液を直接乾燥させてもよく、析出させたβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを乾燥させてもよい。乾燥は、噴霧乾燥法、凍結乾燥法等公知の方法で行うことができる。
固形物として得る場合は、低粘度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン水溶液を直接乾燥させてもよく、析出させたβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを乾燥させてもよい。乾燥は、噴霧乾燥法、凍結乾燥法等公知の方法で行うことができる。
医薬組成物
本発明の剤は、適当な担体及び添加剤と共に製剤化して医薬組成物とすることができる。医薬組成物の剤型としては、経口投与剤（咽頭用剤を含む）、坐剤などが挙げられる。
＜経口投与剤＞
経口投与剤は、大腸にβ-１,３-グルカンを効果的に送達できる剤型である。
固形経口投与製剤の剤型としては、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、タブレット剤、丸剤、カプセル剤、チュアブル剤などが挙げられ、液体経口投与製剤の剤型としては、乳剤、液剤、シロップ剤などが挙げられる。中でも、摂取が容易である点で、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、チュアブル剤、液剤が好ましく、液剤がより好ましい。経口投与剤は咽頭用剤としても使用できる。
固形製剤は、β-１,３-グルカンに薬学的に許容される担体や添加剤を配合して調製される。例えば、白糖、乳糖、ブドウ糖、でんぷん、マンニットのような賦形剤；アラビアゴム、ゼラチン、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロースのような結合剤；カルメロース、デンプンのような崩壊剤；無水クエン酸、ラウリン酸ナトリウム、グリセロールのような安定剤などが配合される。さらに、ゼラチン、白糖、アラビアゴム、カルナバロウなどでコーティングしたり、カプセル化したりしてもよい。
また、液体製剤は、例えば、β-１,３-グルカンを、水、エタノール、グリセリン、単シロップ、又はこれらの混液などに、溶解又は分散させることにより調製される。これらの製剤には、甘味料、防腐剤、粘滑剤、滑沢剤、希釈剤、緩衝剤、着香剤、着色剤のような添加剤が添加されていてもよい。
本発明の剤は、適当な担体及び添加剤と共に製剤化して医薬組成物とすることができる。医薬組成物の剤型としては、経口投与剤（咽頭用剤を含む）、坐剤などが挙げられる。
＜経口投与剤＞
経口投与剤は、大腸にβ-１,３-グルカンを効果的に送達できる剤型である。
固形経口投与製剤の剤型としては、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、タブレット剤、丸剤、カプセル剤、チュアブル剤などが挙げられ、液体経口投与製剤の剤型としては、乳剤、液剤、シロップ剤などが挙げられる。中でも、摂取が容易である点で、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、チュアブル剤、液剤が好ましく、液剤がより好ましい。経口投与剤は咽頭用剤としても使用できる。
固形製剤は、β-１,３-グルカンに薬学的に許容される担体や添加剤を配合して調製される。例えば、白糖、乳糖、ブドウ糖、でんぷん、マンニットのような賦形剤；アラビアゴム、ゼラチン、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロースのような結合剤；カルメロース、デンプンのような崩壊剤；無水クエン酸、ラウリン酸ナトリウム、グリセロールのような安定剤などが配合される。さらに、ゼラチン、白糖、アラビアゴム、カルナバロウなどでコーティングしたり、カプセル化したりしてもよい。
また、液体製剤は、例えば、β-１,３-グルカンを、水、エタノール、グリセリン、単シロップ、又はこれらの混液などに、溶解又は分散させることにより調製される。これらの製剤には、甘味料、防腐剤、粘滑剤、滑沢剤、希釈剤、緩衝剤、着香剤、着色剤のような添加剤が添加されていてもよい。
固形経口投与剤中のβ-１,３-グルカンの含有量は、乾燥重量に換算して、製剤全体に対して、約０．０１〜９９重量％が好ましく、約０．１〜５０重量％がより好ましい。また、液体経口投与剤中のβ-１,３-グルカンの含有量は、乾燥重量に換算して、製剤全体に対して、約０．０１〜２重量％が好ましく、約０．０５〜０．５重量％がより好ましい。
上記含有量の範囲であれば、無理のない投薬量及び投薬スケジュールで、本発明を効果的に誘導できる。
＜坐剤＞
坐剤は、直腸粘膜にβ-１,３-グルカンを効果的に送達できる剤型である。
坐剤は、β-１,３-グルカンを、カルボポール及びポリカルボフィルのようなアクリル性高分子；ヒドロキシプロピルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなセルロース性高分子；アルギン酸ナトリウム及びキトサンのような天然高分子；脂肪酸ワックスなどの基剤に配合することにより調製できる。また、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、パラベンのような防腐剤；塩酸、クエン酸、水酸化ナトリウムのようなｐＨ調節剤；メチオニンのような安定化剤を配合してもよい。
坐剤中のβ-１,３-グルカンの含有量は、乾燥重量に換算して、製剤全体に対して、約０．０１〜９９重量％が好ましく、約０．１〜５０重量％がより好ましい。上記範囲であれば、通常の投薬量及び投薬スケジュールで、本発明を効果的に誘導できる。
上記含有量の範囲であれば、無理のない投薬量及び投薬スケジュールで、本発明を効果的に誘導できる。
＜坐剤＞
坐剤は、直腸粘膜にβ-１,３-グルカンを効果的に送達できる剤型である。
坐剤は、β-１,３-グルカンを、カルボポール及びポリカルボフィルのようなアクリル性高分子；ヒドロキシプロピルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなセルロース性高分子；アルギン酸ナトリウム及びキトサンのような天然高分子；脂肪酸ワックスなどの基剤に配合することにより調製できる。また、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、パラベンのような防腐剤；塩酸、クエン酸、水酸化ナトリウムのようなｐＨ調節剤；メチオニンのような安定化剤を配合してもよい。
坐剤中のβ-１,３-グルカンの含有量は、乾燥重量に換算して、製剤全体に対して、約０．０１〜９９重量％が好ましく、約０．１〜５０重量％がより好ましい。上記範囲であれば、通常の投薬量及び投薬スケジュールで、本発明を効果的に誘導できる。
食品組成物
本発明の剤は食品組成物とすることもできる。この食品組成物は、健康食品、栄養補助食品（バランス栄養食、サプリメントなどを含む）、保健機能食品（特定保健用食品（疾病リスク低減表示、規格基準型を含む）、条件付き特定保健用食品、栄養機能食品を含む）に好適である。
食品組成物は、食品に通常用いられる賦形剤または添加剤を配合して、錠剤、タブレット剤、丸剤、顆粒剤、散剤、粉剤、カプセル剤、水和剤、乳剤、液剤等の剤型に調製することができる。中でも、摂取が容易である点で、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、チュアブル剤、液剤が好ましく、液剤がより好ましい。
食品に通常用いられる賦形剤としては、シロップ、アラビアゴム、ショ糖、乳糖、粉末還元麦芽糖、セルロース糖、マンニトール、マルチトール、デキストラン、デンプン類、ゼラチン、ソルビット、トラガント、ポリビニルピロリドンのような結合剤；ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、ポリエチレングリコールのような潤沢剤；ジャガイモ澱粉のような崩壊剤；ラウリル硫酸ナトリウムのような湿潤剤等が挙げられる。添加剤としては、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤などが挙げられる。
本発明の剤は食品組成物とすることもできる。この食品組成物は、健康食品、栄養補助食品（バランス栄養食、サプリメントなどを含む）、保健機能食品（特定保健用食品（疾病リスク低減表示、規格基準型を含む）、条件付き特定保健用食品、栄養機能食品を含む）に好適である。
食品組成物は、食品に通常用いられる賦形剤または添加剤を配合して、錠剤、タブレット剤、丸剤、顆粒剤、散剤、粉剤、カプセル剤、水和剤、乳剤、液剤等の剤型に調製することができる。中でも、摂取が容易である点で、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、チュアブル剤、液剤が好ましく、液剤がより好ましい。
食品に通常用いられる賦形剤としては、シロップ、アラビアゴム、ショ糖、乳糖、粉末還元麦芽糖、セルロース糖、マンニトール、マルチトール、デキストラン、デンプン類、ゼラチン、ソルビット、トラガント、ポリビニルピロリドンのような結合剤；ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、ポリエチレングリコールのような潤沢剤；ジャガイモ澱粉のような崩壊剤；ラウリル硫酸ナトリウムのような湿潤剤等が挙げられる。添加剤としては、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤などが挙げられる。
固形食品製剤中のβ-１,３-グルカンの含有量は、乾燥重量に換算して、製剤全体に対して、約０．０１〜９９重量％が好ましく、約０．１〜５０重量％がより好ましい。また、液体食品製剤中のβ-１,３-グルカンの含有量は、乾燥重量に換算して、製剤全体に対して、約０．０１〜２重量％が好ましく、約０．０５〜０．５重量％がより好ましい。
上記範囲であれば、無理のない摂取量及び摂取スケジュールで、本発明を効果的に誘導できる。
上記範囲であれば、無理のない摂取量及び摂取スケジュールで、本発明を効果的に誘導できる。
また、この食品組成物は、飲料（スポーツ飲料、ドリンク剤、乳飲料、乳酸菌飲料、果汁飲料、炭酸飲料、野菜飲料、茶飲料等）、菓子類（クッキー等の焼き菓子、ゼリー、ガム、グミ、飴等）のような一般の飲食品を含むものであってもよい。中でも、摂取が容易である点で、飲料が好ましい。
固形又は半固形の食品組成物中のβ-１,３-グルカンの含有量は、乾燥重量に換算して、製剤全体に対して、約０．０１〜９９重量％が好ましく、約０．１〜５０重量％がより好ましい。また、液体状又は流動状の食品組成物中のβ-１，３-グルカンの含有量は、乾燥重量に換算して、組成物全体に対して、約０．０１〜１０重量％が好ましく、約０．１〜５重量％がより好ましい。
上記範囲であれば、無理なく摂取できる飲食品中に、本発明を効果的に誘導できるだけのβ-１,３-グルカンが含まれることになる。
食品添加剤
本発明の剤は、一つの実施態様として、β-１,３-グルカンを含む食品添加剤であり得る。当業者は、本発明が提供する食品添加剤を食品に配合させることにより、下記で説明する用途、機能または作用を食品に付加することができ、食品の質を改変することができる。
固形又は半固形の食品組成物中のβ-１,３-グルカンの含有量は、乾燥重量に換算して、製剤全体に対して、約０．０１〜９９重量％が好ましく、約０．１〜５０重量％がより好ましい。また、液体状又は流動状の食品組成物中のβ-１，３-グルカンの含有量は、乾燥重量に換算して、組成物全体に対して、約０．０１〜１０重量％が好ましく、約０．１〜５重量％がより好ましい。
上記範囲であれば、無理なく摂取できる飲食品中に、本発明を効果的に誘導できるだけのβ-１,３-グルカンが含まれることになる。
食品添加剤
本発明の剤は、一つの実施態様として、β-１,３-グルカンを含む食品添加剤であり得る。当業者は、本発明が提供する食品添加剤を食品に配合させることにより、下記で説明する用途、機能または作用を食品に付加することができ、食品の質を改変することができる。
使用方法
本発明の剤が経口投与医薬製剤、食品組成物、又は食品添加剤である場合のβ-１,３-グルカンの１日投与量は約０．１〜１０００ｍｇが好ましく、約１〜６００ｍｇがより好ましく、約５〜２００ｍｇがさらに好ましい。
また、本発明の剤が医薬組成物の坐剤である場合のβ-１,３-グルカンの１日投与量は、０．１〜１０００ｍｇが好ましく、約１〜６００ｍｇがより好ましい。
本発明の剤が経口投与医薬製剤、食品組成物、又は食品添加剤である場合のβ-１,３-グルカンの１日投与量は約０．１〜１０００ｍｇが好ましく、約１〜６００ｍｇがより好ましく、約５〜２００ｍｇがさらに好ましい。
また、本発明の剤が医薬組成物の坐剤である場合のβ-１,３-グルカンの１日投与量は、０．１〜１０００ｍｇが好ましく、約１〜６００ｍｇがより好ましい。
用途
本発明の剤は、後述する実施例に示す通り、過敏性腸症候群の排便異常（例えば、下痢、排便亢進など）及び腹痛を改善する。従って、過敏性腸症候群の疾患の予防又は治療剤として有用である。
また、本発明の剤は、大腸痛覚伝達を抑制し、大腸痛覚閾値低下を抑制し得、大腸のおける痛覚過敏に対して、効果的に、症状を改善することから、腹痛・腹部不快感を伴う慢性的な便通異常を生じる機能性消化管疾患の予防又は治療剤などとして有用である。
過敏性腸症候群（irritable bowel syndrome; ＩＢＳ）とは、例えば、診断基準Rome II基準またはRome III基準により定義された疾患である。Rome III基準によれば、過敏性腸症候群は、「最近３ヶ月の内の１ヶ月において、少なくとも３日以上腹痛あるいは腹部不快感が生じ、その腹部症状が１」排便によって改善する、２」排便頻度の変化で始まる、３」便性状の変化で始まる、の３項目中２項目以上にあてはまるもの」と定義されており、排便回数や便性状などの違いから、過敏性腸症候群は下痢型、便秘型、混合型および分類不能型に分類されている（日薬理誌133, 281-291 (2009)）。
本発明の剤は、後述する実施例に示す通り、過敏性腸症候群の排便異常（例えば、下痢、排便亢進など）及び腹痛を改善する。従って、過敏性腸症候群の疾患の予防又は治療剤として有用である。
また、本発明の剤は、大腸痛覚伝達を抑制し、大腸痛覚閾値低下を抑制し得、大腸のおける痛覚過敏に対して、効果的に、症状を改善することから、腹痛・腹部不快感を伴う慢性的な便通異常を生じる機能性消化管疾患の予防又は治療剤などとして有用である。
過敏性腸症候群（irritable bowel syndrome; ＩＢＳ）とは、例えば、診断基準Rome II基準またはRome III基準により定義された疾患である。Rome III基準によれば、過敏性腸症候群は、「最近３ヶ月の内の１ヶ月において、少なくとも３日以上腹痛あるいは腹部不快感が生じ、その腹部症状が１」排便によって改善する、２」排便頻度の変化で始まる、３」便性状の変化で始まる、の３項目中２項目以上にあてはまるもの」と定義されており、排便回数や便性状などの違いから、過敏性腸症候群は下痢型、便秘型、混合型および分類不能型に分類されている（日薬理誌133, 281-291 (2009)）。
対象
本発明の剤を投与または摂取する対象は、過敏性腸症候群に罹患しているヒト、その処置または予防が必要なヒト、その疑いがあるヒトであり得る。ここで、過敏性腸症候群は、下痢型、便秘型、混合型または分類不能型であってもよい。また、ヒトは男性であっても女性であってもよい。よって、本発明は、一つの実施態様として、β-１,３-グルカンを含む下痢型過敏性腸症候群の治療薬または予防薬を提供する。
また、過敏性腸症候群は、ストレスをはじめとする種々の病因によって引き起こされ、腸管神経の過緊張に伴う腸の運動機能亢進によって生ずる疾患であり得る。腸（例えば、大腸）などの消化管の運動に関与する神経伝達物質としては、セロトニン、およびアセチルコリンが挙げられる。本発明の剤は、後述する実施例に示すとおり、セロトニン、またはアセチルコリンが惹起する排便異常を改善する。よって、本発明は、一つの実施態様として、セロトニン、またはアセチルコリンが惹起する排便異常の改善剤、または、一つの実施態様として、腸におけるセロトニン、またはアセチルコリンの作用亢進抑制剤を提供する。腸におけるセロトニン、またはアセチルコリンの作用の亢進の例としては、腸の運動亢進（例えば、大腸における排便能、輸送能または水分輸送能が亢進していること）が挙げられる。また、腸におけるセロトニンの作用の亢進の他の例としては、大腸に投射している外来性求心性一次神経の終末に存在する５-ＨＴ３受容体を活性化することによる大腸で発生した痛覚シグナルの中枢への伝達および痛覚過敏の惹起が挙げられる。このような腸における異常が脳へ伝達されると、さらに、ストレスが発生し便通異常を悪化させるという脳腸相関の異常が惹起される。本発明の剤は、好ましい一つの実施態様として、脳腸相関の異常を改善する。
これまで、下痢型過敏性腸症候群の治療薬として用いられている、５-ＨＴ３受容体アンタゴニストおよび副交感神経を抑制する抗コリン薬には、便秘、尿が出にくい、口の渇き等の副作用が報告されている。β-１,３-グルカンには、そのような副作用は報告されていないことから、この点において、本発明の剤は安全である。
本発明の剤を投与または摂取する対象は、過敏性腸症候群に罹患しているヒト、その処置または予防が必要なヒト、その疑いがあるヒトであり得る。ここで、過敏性腸症候群は、下痢型、便秘型、混合型または分類不能型であってもよい。また、ヒトは男性であっても女性であってもよい。よって、本発明は、一つの実施態様として、β-１,３-グルカンを含む下痢型過敏性腸症候群の治療薬または予防薬を提供する。
また、過敏性腸症候群は、ストレスをはじめとする種々の病因によって引き起こされ、腸管神経の過緊張に伴う腸の運動機能亢進によって生ずる疾患であり得る。腸（例えば、大腸）などの消化管の運動に関与する神経伝達物質としては、セロトニン、およびアセチルコリンが挙げられる。本発明の剤は、後述する実施例に示すとおり、セロトニン、またはアセチルコリンが惹起する排便異常を改善する。よって、本発明は、一つの実施態様として、セロトニン、またはアセチルコリンが惹起する排便異常の改善剤、または、一つの実施態様として、腸におけるセロトニン、またはアセチルコリンの作用亢進抑制剤を提供する。腸におけるセロトニン、またはアセチルコリンの作用の亢進の例としては、腸の運動亢進（例えば、大腸における排便能、輸送能または水分輸送能が亢進していること）が挙げられる。また、腸におけるセロトニンの作用の亢進の他の例としては、大腸に投射している外来性求心性一次神経の終末に存在する５-ＨＴ３受容体を活性化することによる大腸で発生した痛覚シグナルの中枢への伝達および痛覚過敏の惹起が挙げられる。このような腸における異常が脳へ伝達されると、さらに、ストレスが発生し便通異常を悪化させるという脳腸相関の異常が惹起される。本発明の剤は、好ましい一つの実施態様として、脳腸相関の異常を改善する。
これまで、下痢型過敏性腸症候群の治療薬として用いられている、５-ＨＴ３受容体アンタゴニストおよび副交感神経を抑制する抗コリン薬には、便秘、尿が出にくい、口の渇き等の副作用が報告されている。β-１,３-グルカンには、そのような副作用は報告されていないことから、この点において、本発明の剤は安全である。
以下、本発明の実施例を挙げてより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（Ａ）精製β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの製造
（１）低粘度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの調製
（１-１）β-グルカンの培養産生
後掲の表１に示す組成を有する液体培地１００ｍｌを５００ｍｌ容量の肩付きフラスコに入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌を行った後、オーレオバシジウム プルランス（Aureobasidium pullulans）ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８５）を同培地組成のスラントより無菌的に１白金耳植菌し、１３０ｒｐｍの速度で通気攪拌しつつ、３０℃で２４時間培養することにより種培養液を調製した。
次いで、同じ組成の培地２００Ｌを３００Ｌ容量の培養装置（丸菱バイオエンジ製）に入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌し、上記のようにして得られた種培養液２Ｌを無菌的に植菌し、２００ｒｐｍ、２７℃、４０L／ｍｉｎの通気攪拌培養を行った。なお、培地のｐＨは水酸化ナトリウム及び塩酸を用いてｐＨ４．２〜４．５の範囲内に制御した。９６時間後の菌体濁度はＯＤ６６０ｎｍで２３ＯＤで、多糖濃度は０．５％(ｗ/ｖ)で、硫黄含量から計算される置換スルホ酢酸含量は０．０９％であった。
（Ａ）精製β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの製造
（１）低粘度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの調製
（１-１）β-グルカンの培養産生
後掲の表１に示す組成を有する液体培地１００ｍｌを５００ｍｌ容量の肩付きフラスコに入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌を行った後、オーレオバシジウム プルランス（Aureobasidium pullulans）ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８５）を同培地組成のスラントより無菌的に１白金耳植菌し、１３０ｒｐｍの速度で通気攪拌しつつ、３０℃で２４時間培養することにより種培養液を調製した。
次いで、同じ組成の培地２００Ｌを３００Ｌ容量の培養装置（丸菱バイオエンジ製）に入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌し、上記のようにして得られた種培養液２Ｌを無菌的に植菌し、２００ｒｐｍ、２７℃、４０L／ｍｉｎの通気攪拌培養を行った。なお、培地のｐＨは水酸化ナトリウム及び塩酸を用いてｐＨ４．２〜４．５の範囲内に制御した。９６時間後の菌体濁度はＯＤ６６０ｎｍで２３ＯＤで、多糖濃度は０．５％(ｗ/ｖ)で、硫黄含量から計算される置換スルホ酢酸含量は０．０９％であった。
＜多糖濃度測定＞
多糖濃度は、培養液を数ｍｌサンプリングし、菌体を遠心分離除去した後、その上清に最終濃度が６６％(ｖ/ｖ)となるようにエタノールを加えて多糖を沈殿させて回収した後、イオン交換水に溶解し、フェノール硫酸法で定量した。
多糖濃度は、培養液を数ｍｌサンプリングし、菌体を遠心分離除去した後、その上清に最終濃度が６６％(ｖ/ｖ)となるようにエタノールを加えて多糖を沈殿させて回収した後、イオン交換水に溶解し、フェノール硫酸法で定量した。
＜置換スルホ含量測定＞
同様にして菌体を除去した培養上清にエタノールを最終濃度が６６％となるように添加し、β-グルカンを沈殿回収した。その後、再度イオン交換水に溶解し、再度遠心分離後、その上清に最終濃度が０．９％になるように食塩を加えた後、再度６６％エタノールでβ-グルカンを回収した。このβ-グルカン回収精製操作を更に２回繰り返し、得られたβ-グルカン水溶液をイオン交換水で透析後、凍結乾燥によりβ-グルカン粉末を得た。
このβ-グルカン粉末を燃焼管式燃焼吸収後、イオンクロマト法で組成分析した結果、Ｓ含量は２３９ｍｇ／ｋｇであり、この値から計算される置換スルホ酢酸含量は０．０９％であった。
同様にして菌体を除去した培養上清にエタノールを最終濃度が６６％となるように添加し、β-グルカンを沈殿回収した。その後、再度イオン交換水に溶解し、再度遠心分離後、その上清に最終濃度が０．９％になるように食塩を加えた後、再度６６％エタノールでβ-グルカンを回収した。このβ-グルカン回収精製操作を更に２回繰り返し、得られたβ-グルカン水溶液をイオン交換水で透析後、凍結乾燥によりβ-グルカン粉末を得た。
このβ-グルカン粉末を燃焼管式燃焼吸収後、イオンクロマト法で組成分析した結果、Ｓ含量は２３９ｍｇ／ｋｇであり、この値から計算される置換スルホ酢酸含量は０．０９％であった。
（１−２）アルカリ処理
上記のようにして得られた培養液の粘度をＢＭ型回転粘度計（東京計器製）を用いて、３０℃、１２ｒｐｍで測定したところ、１５００ｃＰ（(ｍＰａ・ｓ)）であった。測定に用いるロータは粘度にあわせて適当なものを選択した。
この培養液に水酸化ナトリウム最終濃度が２．４％(ｗ/ｖ)となるように２５％(ｗ/ｗ)水酸化ナトリウムを添加し攪拌したところ（ｐＨ１３．６）、瞬時に粘度が低下した。引き続いて５０％(ｗ/ｖ)クエン酸水溶液でｐＨ５．０となるように中和してから、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度を測定したところ、そのときの粘度（３０℃）は２０ｃＰ([ｍＰａ・s])であった。
次いで、この培養液にろ過助剤としてＫＣフロック（日本製紙社製）を１ｗｔ％添加し、薮田式ろ過圧搾機（薮田機械製）を用いて菌体を除去し、最終的に培養ろ液（約２３０Ｌ）を得た。その多糖濃度は０．５％(ｗ/ｖ)で、ほぼ１００％の回収率であった。
上記のようにして得られた培養液の粘度をＢＭ型回転粘度計（東京計器製）を用いて、３０℃、１２ｒｐｍで測定したところ、１５００ｃＰ（(ｍＰａ・ｓ)）であった。測定に用いるロータは粘度にあわせて適当なものを選択した。
この培養液に水酸化ナトリウム最終濃度が２．４％(ｗ/ｖ)となるように２５％(ｗ/ｗ)水酸化ナトリウムを添加し攪拌したところ（ｐＨ１３．６）、瞬時に粘度が低下した。引き続いて５０％(ｗ/ｖ)クエン酸水溶液でｐＨ５．０となるように中和してから、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度を測定したところ、そのときの粘度（３０℃）は２０ｃＰ([ｍＰａ・s])であった。
次いで、この培養液にろ過助剤としてＫＣフロック（日本製紙社製）を１ｗｔ％添加し、薮田式ろ過圧搾機（薮田機械製）を用いて菌体を除去し、最終的に培養ろ液（約２３０Ｌ）を得た。その多糖濃度は０．５％(ｗ/ｖ)で、ほぼ１００％の回収率であった。
（１−３）β-グルカン水溶液の脱塩
上記のβ-グルカン水溶液（培養ろ液）を０．３％に希釈後、限外ろ過（ＵＦ）膜（分子量カット５万、日東電工社製）を用いて脱塩を行い、最終的にナトリウムイオン濃度を２０ｍｇ／１００ｍｌに落とした後、５０％(ｗ/ｖ)クエン酸水溶液によりｐＨを３．５に調整した。
引き続いて、ホット充填用加熱ユニット（日阪製作所製）を用いて９５℃で、３分間保持することにより殺菌処理を行い、最終製品のβ-グルカン水溶液を得た。この時のβ-グルカンの濃度をフェノール硫酸法により測定したところ０．２２％(ｗ/ｖ)であった。また、培養液からのトータル収率は約７３％であった。
上記のβ-グルカン水溶液（培養ろ液）を０．３％に希釈後、限外ろ過（ＵＦ）膜（分子量カット５万、日東電工社製）を用いて脱塩を行い、最終的にナトリウムイオン濃度を２０ｍｇ／１００ｍｌに落とした後、５０％(ｗ/ｖ)クエン酸水溶液によりｐＨを３．５に調整した。
引き続いて、ホット充填用加熱ユニット（日阪製作所製）を用いて９５℃で、３分間保持することにより殺菌処理を行い、最終製品のβ-グルカン水溶液を得た。この時のβ-グルカンの濃度をフェノール硫酸法により測定したところ０．２２％(ｗ/ｖ)であった。また、培養液からのトータル収率は約７３％であった。
＜硫黄含有量の測定＞
また、得られたβ-グルカン水溶液をイオン交換水で透析後、凍結乾燥によりβ-グルカン粉末を得た。本β-グルカンの組成分析結果からＳ含量は３３０ｍｇ／ｋｇであり、これから計算される置換スルホ酢酸含量は０.１２％であった。
また、得られたβ-グルカン水溶液をイオン交換水で透析後、凍結乾燥によりβ-グルカン粉末を得た。本β-グルカンの組成分析結果からＳ含量は３３０ｍｇ／ｋｇであり、これから計算される置換スルホ酢酸含量は０.１２％であった。
＜結合状態の確認＞
また、脱塩を行った上記培養ろ液について、コンゴーレッド法によって、４８０ｎｍから５２５ｎｍ付近への波長シフトを確認することができたのでβ-１,３結合を含むグルカンを含有していることが証明された（K. Ogawa, Carbohydrate Research, 67,
527-535 (1978)、今中忠行 監修, 微生物利用の大展開, 1012-1015, エヌ・ティー・エス（2002））。そのときの極大値へのシフト差分はΔ0.48/500μｇ多糖であった。
上記培養ろ液１５ｍｌを取り出し、３０ｍｌのエタノールを添加し、４℃、１０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎで遠心して、沈殿する多糖を回収した。６６％エタノールで洗浄し、４℃、１０００ｒｐｍ、１０分間遠心して、沈殿する多糖に２ｍｌのイオン交換水と、１ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加撹拌後、６０℃、１時間保温して沈殿を溶解させた。次に-８０℃にて凍結後、一晩、真空凍結乾燥を行い、乾燥後の粉末を１ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液に溶解させ、２次元ＮＭＲに供した。
２次元ＮＭＲ（１３Ｃ−１Ｈ ＣＯＳＹ ＮＭＲ）１０６ｐｐｍと相関関係を有する１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図１に示す。このスペクトルにおいて４．７ｐｐｍと４．５ｐｐｍ付近との２つのシグナルが得られた。
この結果、本β-グルカンがβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンであることが証明された（今中忠行 監修、微生物利用の大展開、1012-1015、エヌ・ティー・エス（2002））。それぞれの１Ｈ ＮＭＲシグナルの積分比から、β-１,３結合／β-１,６結合の比は１．１５であることが判明した。従って、主鎖のβ-１,３結合に対する側鎖のβ-１,６結合の分岐度は、約８７％である。
また、脱塩を行った上記培養ろ液について、コンゴーレッド法によって、４８０ｎｍから５２５ｎｍ付近への波長シフトを確認することができたのでβ-１,３結合を含むグルカンを含有していることが証明された（K. Ogawa, Carbohydrate Research, 67,
527-535 (1978)、今中忠行 監修, 微生物利用の大展開, 1012-1015, エヌ・ティー・エス（2002））。そのときの極大値へのシフト差分はΔ0.48/500μｇ多糖であった。
上記培養ろ液１５ｍｌを取り出し、３０ｍｌのエタノールを添加し、４℃、１０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎで遠心して、沈殿する多糖を回収した。６６％エタノールで洗浄し、４℃、１０００ｒｐｍ、１０分間遠心して、沈殿する多糖に２ｍｌのイオン交換水と、１ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加撹拌後、６０℃、１時間保温して沈殿を溶解させた。次に-８０℃にて凍結後、一晩、真空凍結乾燥を行い、乾燥後の粉末を１ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液に溶解させ、２次元ＮＭＲに供した。
２次元ＮＭＲ（１３Ｃ−１Ｈ ＣＯＳＹ ＮＭＲ）１０６ｐｐｍと相関関係を有する１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図１に示す。このスペクトルにおいて４．７ｐｐｍと４．５ｐｐｍ付近との２つのシグナルが得られた。
この結果、本β-グルカンがβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンであることが証明された（今中忠行 監修、微生物利用の大展開、1012-1015、エヌ・ティー・エス（2002））。それぞれの１Ｈ ＮＭＲシグナルの積分比から、β-１,３結合／β-１,６結合の比は１．１５であることが判明した。従って、主鎖のβ-１,３結合に対する側鎖のβ-１,６結合の分岐度は、約８７％である。
＜粒度測定＞
次に、レ−ザ回折/散乱式粒度分布測定装置(ＨＯＲＩＢＡ製ＬＡ−９２０)を用いて培養液の粒度を測定したところ、粒子としては０．３μｍと１００μｍ程度の大きさのところにピ−クが見られた。続いて、超音波を照射しながら、粒度測定を行うと、１００μｍのピ−クはみるみるうちに消失し、０．３μｍのピ−クが増え、最終的に０．３μｍのみとなった。超音波照射したときの培養液の粒度分布を図２に示す。
０．３μｍのピークはβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの一次粒子によるピークであり、１００〜２００μｍのピークはβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの一次粒子が凝集した二次粒子によるピークであると考えられる。
また、二次粒子はマグネチックスターラ−による攪拌、軽い振とうでも同じように消失し、容易に砕けて一次粒子になることが確認された。よって、二次粒子は非常に緩い凝集(緩凝集状態)と考えられる。
次に、レ−ザ回折/散乱式粒度分布測定装置(ＨＯＲＩＢＡ製ＬＡ−９２０)を用いて培養液の粒度を測定したところ、粒子としては０．３μｍと１００μｍ程度の大きさのところにピ−クが見られた。続いて、超音波を照射しながら、粒度測定を行うと、１００μｍのピ−クはみるみるうちに消失し、０．３μｍのピ−クが増え、最終的に０．３μｍのみとなった。超音波照射したときの培養液の粒度分布を図２に示す。
０．３μｍのピークはβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの一次粒子によるピークであり、１００〜２００μｍのピークはβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの一次粒子が凝集した二次粒子によるピークであると考えられる。
また、二次粒子はマグネチックスターラ−による攪拌、軽い振とうでも同じように消失し、容易に砕けて一次粒子になることが確認された。よって、二次粒子は非常に緩い凝集(緩凝集状態)と考えられる。
＜分子量測定＞
また、東ソー社製のトーヨーパールＨＷ６５（カラムサイズ７５ｃｍ×φ１ｃｍ、排除分子量２５０万（デキストラン））を用いて、０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を溶離液としてゲルろ過クロマトグラフィーを行い、溶解β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの１次粒子とを含む溶液の分子量を測定したところ、溶解β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンに由来する２〜３０万のピークの低分子画分と、１次粒子に由来する見かけ上５０〜２５０万の高分子画分との二種類が検出された。分子量のマーカーとしてＳｈｏｄｅｘ社製のプルランを用いた。
水溶性β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンと微粒子とを分離するため、上記の微粒子画分と可溶性画分とを含むβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン溶液をアドバンテック社製のフィルター（０．２μｍ）でろ過を行ったところ、５０〜２５０万の高分子画分が消失した。このことから、高分子画分はβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの一次粒子や一次粒子が凝集した二次粒子に相当することが判明した。よって、水溶性β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの分子量は２〜３０万と考えられる。
また、東ソー社製のトーヨーパールＨＷ６５（カラムサイズ７５ｃｍ×φ１ｃｍ、排除分子量２５０万（デキストラン））を用いて、０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を溶離液としてゲルろ過クロマトグラフィーを行い、溶解β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの１次粒子とを含む溶液の分子量を測定したところ、溶解β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンに由来する２〜３０万のピークの低分子画分と、１次粒子に由来する見かけ上５０〜２５０万の高分子画分との二種類が検出された。分子量のマーカーとしてＳｈｏｄｅｘ社製のプルランを用いた。
水溶性β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンと微粒子とを分離するため、上記の微粒子画分と可溶性画分とを含むβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン溶液をアドバンテック社製のフィルター（０．２μｍ）でろ過を行ったところ、５０〜２５０万の高分子画分が消失した。このことから、高分子画分はβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの一次粒子や一次粒子が凝集した二次粒子に相当することが判明した。よって、水溶性β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの分子量は２〜３０万と考えられる。
（２）粉末化β-グルカンの調製
（１−２）において、アルカリ処理および菌体除去処理により調製された微粒子β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含むβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン水溶液に、最終濃度が６６％(ｖ／ｖ)となるようにエタノールを添加して、多糖グルカンを沈殿させ、遠心分離法により回収した。次いで凍結乾燥法によりエタノールと水分を除去し、乾燥β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを得た。そのときの収率はエタノール沈殿前の全糖濃度と比較して９５％以上であった。
次いで、得られた乾燥β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを最終濃度が０．３％（ｗ／ｖ）となるように水に溶解分散後、前述したと同様にして東ソー社製のトーヨーパールＨＷ６５（カラムサイズ ７５ｃｍ×φ１ｃｍ、排除分子量２５０万（デキストラン））により０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を溶離液としてゲルクロマトグラフィーを行い、分子量を測定したところ、得られた多糖の分子量は２〜３０万のピークの低分子画分と見かけ上５０〜２５０万の高分子画分の二種類からなることが判明した。ここで、分子量のマーカーとしてＳｈｏｄｅｘ社製のプルランを用いた。
一方、水溶性β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンと微粒子を分離するため、本法で調製したβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン水溶液（微粒子と可溶化グルカンを含むもの）をアドバンテック社製のフィルター（０．２μｍ）でろ過を行ったところ、５０〜２５０万の高分子画分が消失した。よって、本法により得られたβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを乾燥させても、再溶解させれば乾燥前のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンと同様の物理的挙動を再現することが実証された。
（１−２）において、アルカリ処理および菌体除去処理により調製された微粒子β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含むβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン水溶液に、最終濃度が６６％(ｖ／ｖ)となるようにエタノールを添加して、多糖グルカンを沈殿させ、遠心分離法により回収した。次いで凍結乾燥法によりエタノールと水分を除去し、乾燥β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを得た。そのときの収率はエタノール沈殿前の全糖濃度と比較して９５％以上であった。
次いで、得られた乾燥β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを最終濃度が０．３％（ｗ／ｖ）となるように水に溶解分散後、前述したと同様にして東ソー社製のトーヨーパールＨＷ６５（カラムサイズ ７５ｃｍ×φ１ｃｍ、排除分子量２５０万（デキストラン））により０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を溶離液としてゲルクロマトグラフィーを行い、分子量を測定したところ、得られた多糖の分子量は２〜３０万のピークの低分子画分と見かけ上５０〜２５０万の高分子画分の二種類からなることが判明した。ここで、分子量のマーカーとしてＳｈｏｄｅｘ社製のプルランを用いた。
一方、水溶性β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンと微粒子を分離するため、本法で調製したβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン水溶液（微粒子と可溶化グルカンを含むもの）をアドバンテック社製のフィルター（０．２μｍ）でろ過を行ったところ、５０〜２５０万の高分子画分が消失した。よって、本法により得られたβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを乾燥させても、再溶解させれば乾燥前のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンと同様の物理的挙動を再現することが実証された。
（３）高純度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン粉末の製造
（１）においてアルカリ処理を行い低粘度化した培養液（多糖濃度０．５％（５ｍｇ／ｍｌ））９０Ｌを５０％クエン酸水溶液９ｋｇで中和後、濾過助剤（日本製紙ケミカル製粉末セルロ−スＫＣフロック）を１．８ｋｇプレコートした薮田式濾過圧搾機４０Ｄ-４を通して、菌体を取り除いた。ろ液を限外濾過スパイラルエレメント（日東電工製ＮＴＵ３１５０−Ｓ４）で９Ｌまで濃縮した。本濃縮液を攪拌しながら、ｐＨを３．０-３．５にクエン酸により調整して、エタノール１８Ｌを加え、グルカン／エタノール／水スラリーを得た。スラリーの粘度はＢＭ型粘度計で２２ｍＰａ・ｓ（３０℃）であった。室温で３時間静置し、上澄み液（エタノール／水）約１７Ｌを取り除いた。残ったスラリーの粘度は４５ｍＰａ・ｓ（３０℃）であった。本濃縮スラリー１０Ｌを坂本技研型の噴霧乾燥装置Ｒ-３を用いて噴霧乾燥し、３６０ｇのβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン粉末を得た（回収率８０％）。得られたβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの純度はＮＭＲスペクトルの解析の結果、９０％以上であった。
なお、得られたβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン粉末を１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液に溶解させ、ＮＭＲスペクトルを測定したところ、１Ｈ ＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを得た。また、得られたβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン粉末の濃度０．５（ｗ／ｖ％）の水溶液の粘度は２００ｃＰ以下であった（ｐＨ５．０、３０℃）。
上記記載の方法によって得られた精製β-グルカンを下記の試験に供した。
（１）においてアルカリ処理を行い低粘度化した培養液（多糖濃度０．５％（５ｍｇ／ｍｌ））９０Ｌを５０％クエン酸水溶液９ｋｇで中和後、濾過助剤（日本製紙ケミカル製粉末セルロ−スＫＣフロック）を１．８ｋｇプレコートした薮田式濾過圧搾機４０Ｄ-４を通して、菌体を取り除いた。ろ液を限外濾過スパイラルエレメント（日東電工製ＮＴＵ３１５０−Ｓ４）で９Ｌまで濃縮した。本濃縮液を攪拌しながら、ｐＨを３．０-３．５にクエン酸により調整して、エタノール１８Ｌを加え、グルカン／エタノール／水スラリーを得た。スラリーの粘度はＢＭ型粘度計で２２ｍＰａ・ｓ（３０℃）であった。室温で３時間静置し、上澄み液（エタノール／水）約１７Ｌを取り除いた。残ったスラリーの粘度は４５ｍＰａ・ｓ（３０℃）であった。本濃縮スラリー１０Ｌを坂本技研型の噴霧乾燥装置Ｒ-３を用いて噴霧乾燥し、３６０ｇのβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン粉末を得た（回収率８０％）。得られたβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの純度はＮＭＲスペクトルの解析の結果、９０％以上であった。
なお、得られたβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン粉末を１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液に溶解させ、ＮＭＲスペクトルを測定したところ、１Ｈ ＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを得た。また、得られたβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン粉末の濃度０．５（ｗ／ｖ％）の水溶液の粘度は２００ｃＰ以下であった（ｐＨ５．０、３０℃）。
上記記載の方法によって得られた精製β-グルカンを下記の試験に供した。
（Ｂ）ベタネコール（betanecol）、セロトニン（５-ＨＴ）、及びひまし油（castor
oil）のそれぞれの薬剤投与により誘導した便通異常による過剰排便（下痢症状）に対する低分子β-グルカン経口投与の効果
上記実験例において得た高純度β-１，３-１，６-Ｄ-グルカン粉末（以下「低分子β-グルカンという」）。
アセチルコリン作動薬であるベタネコール（bethanechol）、セロトニン(５-ＨＴ)、及び大腸刺激剤であるひまし油(castor oil)による便通異常（下痢）を誘発し、それぞれの刺激剤により誘発された下痢症状（排便異常）の低減に対する低分子β-グルカンの効果をマウスを用いて検討した。野生型（Ｃ５７／ＢＬ６）マウス（６〜８週齢、体重２０-２５ｇ）に低分子β-グルカン（６００ｍｇ/ｋｇ）を経口投与し、その２時間後にベタネコールとセロトニンは皮下注射（３ｍｇ/ｋｇ）を行い、ひまし油（３００μｌ/匹）は経口投与を行った。各刺激剤投与後ベタネコール、セロトニンは１時間後、ひまし油は２時間後の便排泄量を測定した。なお、比較対照にはＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を用いた。
結果を図３Ａ−Ｃに示す。図３Ａより、低分子β-グルカンが、セロトニンによる大腸の排便異常を低減したことが分る。図３Ｂより、低分子β-グルカンが、ベタネコールによる大腸の排便異常を低減していることが分る。図３Ｃより、低分子β-グルカンが、ひまし油による粘膜刺激による排便異常を低減していることが分る。このことより、低分子β-グルカンの事前投与により便の異常排泄は有意に低減したことが分かる。即ち、低分子β-グルカンには、セロトニンやアセチルコリンのような排便異常を誘発する物質に起因した症状を改善することが分る。
oil）のそれぞれの薬剤投与により誘導した便通異常による過剰排便（下痢症状）に対する低分子β-グルカン経口投与の効果
上記実験例において得た高純度β-１，３-１，６-Ｄ-グルカン粉末（以下「低分子β-グルカンという」）。
アセチルコリン作動薬であるベタネコール（bethanechol）、セロトニン(５-ＨＴ)、及び大腸刺激剤であるひまし油(castor oil)による便通異常（下痢）を誘発し、それぞれの刺激剤により誘発された下痢症状（排便異常）の低減に対する低分子β-グルカンの効果をマウスを用いて検討した。野生型（Ｃ５７／ＢＬ６）マウス（６〜８週齢、体重２０-２５ｇ）に低分子β-グルカン（６００ｍｇ/ｋｇ）を経口投与し、その２時間後にベタネコールとセロトニンは皮下注射（３ｍｇ/ｋｇ）を行い、ひまし油（３００μｌ/匹）は経口投与を行った。各刺激剤投与後ベタネコール、セロトニンは１時間後、ひまし油は２時間後の便排泄量を測定した。なお、比較対照にはＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を用いた。
結果を図３Ａ−Ｃに示す。図３Ａより、低分子β-グルカンが、セロトニンによる大腸の排便異常を低減したことが分る。図３Ｂより、低分子β-グルカンが、ベタネコールによる大腸の排便異常を低減していることが分る。図３Ｃより、低分子β-グルカンが、ひまし油による粘膜刺激による排便異常を低減していることが分る。このことより、低分子β-グルカンの事前投与により便の異常排泄は有意に低減したことが分かる。即ち、低分子β-グルカンには、セロトニンやアセチルコリンのような排便異常を誘発する物質に起因した症状を改善することが分る。
（Ｃ）大腸伸展運動により起こる痛覚刺激と低分子β-グルカン経口投与の効果
ウィスター系ラット（雌、３-４週齢）の肛門からポリエチレン製のバック（２ｃｍの長さ）を大腸（直腸）に挿入した。バックが肛門から１ｃｍの部位まで挿入した。そして、そのバックに空気を入れて一定の圧力になるまで膨らませて(大腸伸展運動 Colorectal distention (ＣＲＤ))、その際に生じる痛みを筋肉の収縮が起こる電位を内臓知覚（visceromotor response (ＶＭＲ））として測定した。ＣＲＤ刺激は８０ｍｍＨｇの圧力で３０秒間維持し、５分間隔で１２回の繰り返しＣＲＤ刺激を行い、その際のＶＭＲの数値推移を測定した。なお、ＣＲＤ刺激は、低分子β-グルカンを１日あたり１００ｍｇ/ｋｇ、および６００ｍｇ/ｋｇの量でラットに７日間継続経口投与し、７日目の投与終了後１２時間後に、繰り返しＣＲＤテストを行った。また、比較対照にはＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を用いた。
結果を図４に示す。この結果より、低分子β-グルカン投与ラット群では、ＣＲＤ刺激における痛覚レベルが明らかに低下した。また、１２回後の繰り返しＣＲＤ刺激終了時点において、低分子β-グルカン６００ｍｇ/ｋｇ投与ラットでは、痛覚レベルの改善傾向が認められた。このことから、低分子β-グルカン投与により、大腸における異常便排出による痛みは低減されたことが分かる。即ち、大腸における腹痛の症状を改善していることが分る。また、低分子β-グルカンは、大腸における痛覚過敏を改善することが分る。
ウィスター系ラット（雌、３-４週齢）の肛門からポリエチレン製のバック（２ｃｍの長さ）を大腸（直腸）に挿入した。バックが肛門から１ｃｍの部位まで挿入した。そして、そのバックに空気を入れて一定の圧力になるまで膨らませて(大腸伸展運動 Colorectal distention (ＣＲＤ))、その際に生じる痛みを筋肉の収縮が起こる電位を内臓知覚（visceromotor response (ＶＭＲ））として測定した。ＣＲＤ刺激は８０ｍｍＨｇの圧力で３０秒間維持し、５分間隔で１２回の繰り返しＣＲＤ刺激を行い、その際のＶＭＲの数値推移を測定した。なお、ＣＲＤ刺激は、低分子β-グルカンを１日あたり１００ｍｇ/ｋｇ、および６００ｍｇ/ｋｇの量でラットに７日間継続経口投与し、７日目の投与終了後１２時間後に、繰り返しＣＲＤテストを行った。また、比較対照にはＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を用いた。
結果を図４に示す。この結果より、低分子β-グルカン投与ラット群では、ＣＲＤ刺激における痛覚レベルが明らかに低下した。また、１２回後の繰り返しＣＲＤ刺激終了時点において、低分子β-グルカン６００ｍｇ/ｋｇ投与ラットでは、痛覚レベルの改善傾向が認められた。このことから、低分子β-グルカン投与により、大腸における異常便排出による痛みは低減されたことが分かる。即ち、大腸における腹痛の症状を改善していることが分る。また、低分子β-グルカンは、大腸における痛覚過敏を改善することが分る。
（Ｄ）酪酸浣腸により誘導した擬似大腸過敏症における大腸伸展運動により起こる痛覚刺激と低分子β-グルカン経口投与の効果
ウィスター系ラット（雌、３-４週齢）を酪酸（Ｂｕｔｙｒａｔｅ）（１１０ｍｇ/ｍｌ、１ｍｌ）による浣腸（肛門から７ｃｍの大腸部へ1日に２回、３日間）を行うことにより、擬似大腸過敏症を誘導した。擬似大腸過敏症の状態下でＣＲＤ刺激を行うことにより、大腸における痛覚刺激への低分子β-グルカン経口投与の効果を検討した。なお、比較対照として、生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）を用いた。
低分子β-グルカン経口投与群は、1日あたり１回６００ｍｇ/ｋｇで７日間与え、その後に酪酸浣腸を行った。酪酸浣腸により擬似大腸過敏症を誘導した上記ラットに、１０-８０ｍｍＨｇで段階的にＣＲＤ刺激レベルを大きくし、それぞれ２０秒間のＣＲＤ刺激を１５０秒間隔で与えて、その際の痛覚レベルをＶＭＲで測定した。
結果を図５に示す。酪酸浣腸のみの場合と低分子β-グルカンを併用した場合では、低分子β-グルカンを与えたラットの方が、大腸伸展運動（ＣＲＤ）刺激に対する痛覚レベルの低減がなされ、痛覚過敏が改善されたことが分かる。
ウィスター系ラット（雌、３-４週齢）を酪酸（Ｂｕｔｙｒａｔｅ）（１１０ｍｇ/ｍｌ、１ｍｌ）による浣腸（肛門から７ｃｍの大腸部へ1日に２回、３日間）を行うことにより、擬似大腸過敏症を誘導した。擬似大腸過敏症の状態下でＣＲＤ刺激を行うことにより、大腸における痛覚刺激への低分子β-グルカン経口投与の効果を検討した。なお、比較対照として、生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）を用いた。
低分子β-グルカン経口投与群は、1日あたり１回６００ｍｇ/ｋｇで７日間与え、その後に酪酸浣腸を行った。酪酸浣腸により擬似大腸過敏症を誘導した上記ラットに、１０-８０ｍｍＨｇで段階的にＣＲＤ刺激レベルを大きくし、それぞれ２０秒間のＣＲＤ刺激を１５０秒間隔で与えて、その際の痛覚レベルをＶＭＲで測定した。
結果を図５に示す。酪酸浣腸のみの場合と低分子β-グルカンを併用した場合では、低分子β-グルカンを与えたラットの方が、大腸伸展運動（ＣＲＤ）刺激に対する痛覚レベルの低減がなされ、痛覚過敏が改善されたことが分かる。
本発明の過敏性腸症候群の下痢抑制剤、腹痛改善剤、及び大腸のおける痛覚過敏改善剤は過敏性腸症候群の症状改善剤として有用であり、腹痛・腹部不快感を伴う慢性的な便通異常（便秘あるいは下痢）を生じる機能性消化管疾患などの疾患の予防又は治療剤として好適に使用できる。
Claims (15)
- β-１,３-グルカンを含む過敏性腸症候群の下痢抑制剤。
- β-１,３-グルカンがβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンである請求項１に記載の剤。
- β-１,３-１,６-グルカンが、β-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-グルカンである請求項１又は２に記載の剤。
- β-１,３-１,６-グルカンが、オーレオバシジウム属の微生物が産生するβ-１,３-１,６-グルカンである請求項１〜３に記載の剤。
- オーレオバシジウム属の微生物が、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８５）、又はＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株（ＦＥＲＭ
Ｐ-１９２８６）である請求項４に記載の剤。 - β-１,３-グルカンを含む過敏性腸症候群の腹痛改善剤。
- β-１,３-グルカンがβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンである請求項６に記載の剤。
- β-１,３-１,６-グルカンが、β-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-グルカンである請求項６又は７に記載の剤。
- β-１,３-１,６-グルカンが、オーレオバシジウム属の微生物が産生するβ-１,３-１,６-グルカンである請求項６〜８に記載の剤。
- オーレオバシジウム属の微生物が、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８５）、又はＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株（ＦＥＲＭ
Ｐ-１９２８６）である請求項９に記載の剤。 - β-１,３-グルカンを含む大腸における痛覚過敏改善剤。
- β-１,３-グルカンがβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンである請求項１１に記載の剤。
- β-１,３-１,６-グルカンが、β-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-グルカンである請求項１１又は１２に記載の剤。
- β-１,３-１,６-グルカンが、オーレオバシジウム属の微生物が産生するβ-１,３-１,６-グルカンである請求項１１〜１３に記載の剤。
- オーレオバシジウム属の微生物が、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８５）、又はＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株（ＦＥＲＭ
Ｐ-１９２８６）である請求項１４に記載の剤。
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