JP2013078346A - 低い数の精子細胞を有する哺乳動物の性特異的受精 - Google Patents
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Abstract
雌雄識別された受精を、より低い投与量で、現実的な商業環境の下で作動する様式において達成すること。
【解決手段】
予め決定された性を有する哺乳動物を産生する方法であって、該方法は以下の工程:
a.哺乳動物の種の雄から精子細胞を収集する工程;
b.複数の該精子細胞の性特徴を決定する工程;
c.該その性特徴の決定に従って、該精子細胞を選別する工程;
d.代表的な未選別の人工受精サンプルと比較して、該精子細胞の数の約10%〜約50%を有する選別された人工受精サンプルを確立する工程;
e.該選別された人工受精サンプルを該哺乳動物の該種の雌に挿入する工程;
f.少なくとも1つの卵を、該代表的な未選別の人工受精投与量に対して統計学的比較可能な成功レベル(p>0.1)で、該哺乳動物の該種の該雌内に受精させる工程;および
g.所望の性の子孫哺乳動物を産生する工程、
を包含する、方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、一般的に、哺乳動物子孫の性選択の分野に関する。本発明は特に、所望の性の子孫を生成するための低用量人工受精の局面および卵生成の増加の局面に関連する。詳細には、本発明は、選別技術、人工受精時および増加した排卵の結果となる技術での性特異的かつ低用量の努力のためにフローサイトメトリーを介して精子を選別するためのシステム、などにかかわらず、低投与量での、雌雄識別した(sexed)人工受精を達成することに関する。
長期間の間、特定の子孫の性を選択することが所望されている。明らかな心理学的局面を超えて、哺乳動物子孫の実際の性選択は、食料生産動物(例えば、畜牛)ならびに有名な優勝動物(例えば、ウマ)などへのその適用を考える場合には、有意な経済的意義を有する。この大きな望みは、性が選択された子孫を達成するための有意な種々の努力となっている。おそらく、所望の結果を達成する可能性が最も高いようであった努力は、受精の前にX精子とY精子との間の選別および選択をする際の努力であった。
従って、本発明は、商業的レベルでの低用量受精および哺乳動物の性を予め決定するために適用されるような結果の達成を請求する。本発明はまた、フローサイトメーター分離技術を通してそれらの性を決定するための、精子細胞の選別のための改善されたシースシステムおよびコレクターシステムを提供する。この分離技術では、フローサイトメーターにおいて代表的に使用されるようなシース液は、精子細胞が選別されるときの精子細胞に対するストレスを最小にする流体で置換される。さらに、収集システムを改良して精子細胞が受ける物理的ストレスおよび化学的ストレスの両方を最小にする。種々の技術および物質が示されるが、当業者が容易に理解するように、種々の組合せおよび置換が、特定のプロセシング適用において関与する種、分離技術、目的、および他のパラメーターに基づく性能に最適化され得る様式で用いられ得る。
a.哺乳動物の種の雄から精子細胞を収集する工程;
b.複数の精子細胞の性特徴を決定する工程;
c.その性特徴の決定に従って、精子細胞を選別する工程;
d.代表的な人工受精投与量と比較して、少ない数の精子細胞を有する受精サンプルを確立する工程;
e.この受精サンプルの少なくとも一部を哺乳動物の種の雌に挿入する工程;
f.哺乳動物の種の雌内の少なくとも1つの卵を、代表的な雌雄識別されていない人工受精投与量に対して統計学的比較可能な成功レベルで受精させる工程;
および
g.所望の性の子孫哺乳動物を産生する工程、
を包含する。
a.選別される細胞を供給する細胞供給源を確立する工程;
b.シース流体を化学的に調整して、細胞のためのシース流体環境を作製する工程であって、シース流体が、選別前細胞流体環境および選別後細胞流体環境の両方で調整される、工程;
c.細胞の特性を感受する工程;
d.所望の性特徴を有する細胞間を識別する工程;および
e.所望の性特徴を有する細胞を収集する工程、
を包含する。
a.選別される細胞を供給する細胞供給源を確立する工程;
b.シース流体を化学的に調整して、細胞のためのシース流体環境を作製する工程であって、シース流体が、選別前細胞流体環境および選別後細胞流体環境の両方で調整される、工程;
c.細胞の特性を感受する工程;
d.所望の性特徴を有する細胞間を識別する工程;および
e.所望の性特徴を有する細胞を収集する工程、
を包含する。
a.選別されるウシ精子細胞を供給する細胞供給源を確立する工程;
b.ウシ精子細胞のための、約2.9%のクエン酸ナトリウムを含むシース流体を確立する工程;
c.細胞の特性を感受する工程;
d.所望の性特徴を有する細胞間を識別する工程;および
e.所望の性特徴を有する細胞を収集する工程、
を包含する。
a.選別されるウマ精子細胞を供給する細胞供給源を確立する工程;
b.ウマ精子細胞のための、ヘペス緩衝化培地を含むシース流体を確立する工程;
c.細胞の特性を感受する工程;
d.所望の性特徴を有する細胞間を識別する工程;および
e.所望の性特徴を有する細胞を収集する工程、
を包含する。
a.選別される細胞を供給する細胞供給源を確立する工程;
b.細胞のためのシース流体を確立する工程;
c.細胞の特性を感受する工程;
d.所望の性特徴を有する細胞間を識別する工程;および
e.所望の性特徴を有する細胞を収集し、一方細胞を収集容器との衝撃から緩衝する工程、
を包含する。
a.選別されるウシ精子細胞を供給する細胞供給源を確立する工程;
b.ウシ精子細胞のためのシース流体を確立する工程;
c.ウシ精子細胞の特性を感受する工程;
d.所望の性特徴を有するウシ精子細胞間を識別する工程;および
e.所望の性特徴を有するウシ精子細胞を、上記収集工程を開始する前に約6%の卵黄を含むクエン酸収集液中で収集する、工程、
を包含する。
a.雄哺乳動物の精子細胞を染色する工程;
b.精子細胞の性に従って、高速フローサイトメトリーの使用によって選別する工程;および
c.選別された精子細胞を濃縮する工程、
さらに包含する。
a.フローサイトメーターによって分析されるべき細胞を供給する細胞供給源;
b.細胞のための、約2.9%のクエン酸ナトリウムを含むシース流体環境を作製する、シース流体供給源;
c.細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル;
d.シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器;
e.細胞に応答する、細胞感受システム;
f.所望の特徴を有する細胞を選別するように作用する、ソーター識別システム;および
g.所望の特徴を有する細胞が内部に配置される、コレクター、
を備える。
a.フローサイトメーターによって分析されるべき細胞を供給する細胞供給源;
b.細胞のための、ヘペス緩衝化培地を含むシース流体環境を作製する、シース流体供給源;
c.細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル;
d.シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器;
e.細胞に応答する、細胞感受システム;
f.所望の特徴を有する細胞を選別するように作用する、ソーター識別システム;および
g.所望の特徴を有する細胞が内部に配置される、コレクター、
を備える。
a.フローサイトメーターによって分析されるべき細胞を供給する細胞供給源;
b.細胞のためのシース流体環境を作製する、シース流体供給源;
c.細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル;
d.シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器;
e.細胞に応答する、細胞感受システム;
f.所望の特徴を有する細胞を選別するように作用する、ソーター識別システム;および
g.所望の特徴を有する細胞が内部に配置され、そして約6%の卵黄を含むクエン酸コレクター流体を含む、コレクター、
を備える。
a.フローサイトメーターによって分析されるべき細胞を供給する細胞供給源
;
b.細胞のためのシース流体環境を作製する、シース流体供給源;
c.細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル;
d.シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器;
e.細胞に応答する、細胞感受システム;
f.所望の特徴を有する細胞を選別するように作用する、ソーター識別システム;および
g.所望の特徴を有する細胞が内部に配置され、そして流動に適合される容器
の物理的特徴を有する試験管を備える、コレクター、
を備える。
a.フローサイトメーターによって分析されるべき細胞を供給する、細胞供給源;
b.選別前および選別後の細胞流体環境の両方で調整されるように選択される、細胞のためのシース流体環境を作製する、化学的に調整されたシース流体供給源;
c.細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル;
d.シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器;
e.細胞に応答する、細胞感受システム;
f.所望の特徴を有する細胞を選別するために作用する、ソーター識別システム;および
g.所望の特徴を有する細胞が内部に配置される、コレクター、
を備える。
a.フローサイトメーターによって分析されるべき細胞を供給する細胞供給源;
b.細胞のための、約2.9%のクエン酸ナトリウムを含む溶液を含むシース流体環境を作製する、シース流体供給源;
c.細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル;
d.シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器;
e.細胞に応答する、細胞感受システム;
f.所望の特徴を有する細胞を選別するように作用する、ソーター識別システム;および
g.所望の特徴を有する細胞が内部に配置される、コレクター、
を備える。
イトメーターシステムが提供され、このシステムは、以下:
a.フローサイトメーターによって分析されるべき細胞を供給する細胞供給源;
b.細胞のための、ヘペス緩衝化培地を含む溶液を含むシース流体環境を作製する、シース流体供給源;
c.細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル;
d.シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器;
e.細胞に応答する、細胞感受システム;
f.所望の特徴を有する細胞を選別するように作用する、ソーター識別システム;および
g.所望の特徴を有する細胞が内部に配置される、コレクター、
を備える。
a.フローサイトメーターによって分析されるべきウシ精子細胞を供給する細胞供給源;
b.細胞のための、約2.9%のクエン酸ナトリウムを含むシース流体環境を作製する、化学的に調整されたシース流体供給源;
c.細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル;
d.シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器;
e.細胞に応答する、細胞感受システム;
f.所望の特徴を有する細胞を選別するように作用する、ソーター識別システム;および
g.所望の特徴を有する細胞が内部に配置され、約6%の卵黄を含むクエン酸収集流体を含み、そして約50万未満の精子の投与量を提供するために使用される、コレクター、
を備え、
ここで、これらのノズル、発振器、細胞感受システム、およびソーター識別システムが、フローサイトメーターシステムの一部であって、このフローサイトメーターシステムが、1秒あたり少なくとも約500を選別する速度で、分析されるべき精子細胞を選別し、そして1平方インチあたり少なくとも約50ポンドの圧力で操作される。
a.フローサイトメーターによって分析されるべきウマ精子細胞を供給する細胞供給源;
b.細胞のための、ヘペス緩衝化培地を含むシース流体環境を作製する、化学的に調整されたシース流体供給源;
c.細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル;
d.シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器;
e.細胞に応答する、細胞感受システム;
f.所望の特徴を有する細胞を選別するように作用する、ソーター識別システム;および
g.所望の特徴を有する細胞が内部に配置され、ヘペス緩衝化培地を含む収集流体を含み、そして約1000万未満の精子の投与量を提供するために使用される、コレクター、
を備え、
ここで、これらのノズル、発振器、細胞感受システム、およびソーター識別システムが、フローサイトメーターシステムの一部であって、このフローサイトメーターシステムが、1秒あたり少なくとも約500を選別する速度で、分析されるべき細胞を選別し、そして1平方インチあたり少なくとも約50ポンドの圧力で操作される。
サイトメーターシステムが提供され、このシステムは、以下:
a.フローサイトメーターによって分析されるべき細胞を供給する、細胞供給源;
b.細胞のためのシース流体環境と、選別前および選別後の細胞流体環境の両方との間の変化を最小化するための手段;
c.細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル;
d.シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器;
e.細胞に応答する、細胞感受システム;
f.所望の特徴を有する細胞を選別するために作用する、ソーター識別システム;および
g.所望の特徴を有する細胞が内部に配置される、コレクター、
を備える。
a.フローサイトメーターによって分析されるべき細胞を供給する細胞供給源;
b.細胞のためのシース流体環境を作製する、シース流体供給源;
c.細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル;
d.シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器;
e.細胞に応答する、細胞感受システム;
f.所望の特徴を有する細胞を選別するように作用する、ソーター識別システム;および
g.所望の特徴を有する細胞が内部に配置され、そして化学的に調整されたコレクター流体シース流体共有源を備える、コレクターであって、このコレクター流体シース流体供給源が、以前の細胞流体環境で調整されるよう選択される、細胞のためのコレクター流体環境を作製する、コレクター、を備える。
a.フローサイトメーターによって分析されるべき細胞を供給する細胞供給源;
b.細胞のためのシース流体環境を作製する、シース流体供給源;
c.細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル;
d.シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器;
e.細胞に応答する、細胞感受システム;
f.所望の特徴を有する細胞を選別するように作用する、ソーター識別システム;および
g.緩衝要素を備えるコレクター、
を備える。
a.フローサイトメーターによって分析されるべき細胞を供給する、細胞供給源;
b.細胞のためのシース流体環境を作製する、シース流体供給源;
c.細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル;
d.シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器;
e.細胞に応答する、細胞感受システム;
f.所望の特徴を有する細胞を選別するように作用する、ソーター識別システム;および
g.細胞とコレクターとの間の衝撃を回避するための手段を備える、コレクター、
を備える。
a.哺乳動物の雄の種から精子細胞を収集する工程;
b.複数の精子細胞の性特徴を決定する工程;
c.その性特徴の決定に従って精子細胞を選別する工程;
d.代表的な人工受精投与量と比較して、少ない数の精子細胞を有する受精サンプルを確立する工程;
e.受精サンプルの少なくとも一部を、哺乳動物の雌種に挿入する工程;
f.哺乳動物の雌種内の少なくとも1つの卵を受精させる工程;ならびに
g.所望の性の子孫哺乳動物を産生する工程、
を包含する。
a.選別されるべき細胞を供給する細胞供給源を確立する工程;
b.選別前細胞流体環境および選別後細胞流体環境の両方で調整される、細胞のためのシース流体環境を作製するために、シース流体を化学的に調整する工程;
c.細胞の特性を感受する工程;
d.所望の性特徴を有する細胞間を識別する工程;ならびに
e.所望の性特徴を有する細胞を収集する工程、
を包含する。
a.選別される細胞を供給する細胞供給源を確立する工程;
b.選別前および選別後の細胞流体環境の両方で調整される、細胞のためのシース流体環境を作製するために、シース流体を化学的に調整する工程;
c.細胞の特性を感受する工程;
d.所望の特徴を有する細胞間を識別する工程;および
e.所望の特徴を有する細胞を収集する工程、
を包含する。
a.選別されるべき細胞を供給する細胞供給源を確立する工程;
b.細胞のためのシース流体環境を作製するために、シース流体を確立する工程;
c.細胞の特性を感受する工程;
d.所望の性特徴を有する細胞間を識別する工程;
e.所望の性特徴を有する細胞をコレクター流体において収集する工程;ならびに
f.選別前流体環境で調整される、細胞のための終了コレクター流体環境を作製するために、このコレクター流体を化学的に調整する工程、
を包含する。
a.選別されるべき細胞を供給する細胞供給源を確立する工程;
b.細胞のためのシース流体環境を作製するために、シース流体を確立する工程;
c.細胞の特性を感受する工程;
d.所望の性特徴を有する細胞間を識別する工程;ならびに
e.所望の性特徴を有する細胞を収集する工程であって、細胞が収集容器と衝突することを緩衝する工程を包含する、工程、
を包含する。
a.複数の卵が産生されるために排卵製剤を使用する工程を包含する、少なくとも2つの卵を作製するために哺乳動物において過剰排卵を作製する工程;
b.雄の哺乳動物の精子細胞の性を決定する工程;
c.精子細胞の性に従って選別する工程;
d.排卵の開始後に、雌の哺乳動物の子宮内に選別された精子細胞の少なくとも一部を挿入する工程;および
e.雌雄識別された胚を複数産生するために、子宮中の複数の卵を受精させる工程、
を包含する。
a.雄の哺乳動物の精子細胞を染色する工程;
b.高速フローサイトメトリーを使用して、精子細胞の性に従って選別する工程;および
c.選別された精子細胞を濃縮する工程、
をさらに包含する。
a.選別されるべき細胞を供給する細胞供給源を確立する工程;
b.選別前の細胞流体環境と選別後の細胞流体環境との両方によって調整される、細胞のためのシース流体環境を作製するために、シース流体を化学的に調整する工程;
c.細胞の特性を感受する工程;
d.所望の性特徴を有する細胞間を識別する工程;および
e.所望の性特徴を有する細胞を収集する工程、
を包含する。
1.1,000mlの容積測定フラスコ中に29.0gのクエン酸ナトリウム2水和物(Na3C6H5O7・2H2O)を置く
a.3/4の水バッチにクエン酸ナトリウムを溶解し、次いで、容積まで水を加える
2.脱イオン化またはNanopure水を加え1,000mlの最終容積にする。
3.ボトルに移し、そして15 lbs圧力(245oF)で少なくとも30分間オートクレーブする。
4.室温で緩徐に冷やす。
5.5℃の低温室で密閉して貯蔵する。
さらに、シース液について、クエン酸ナトリウム溶液を濾過し得る。
6.無菌技術を使用して0.22ミクロンフィルターで濾過する。
I.最終組成:
80% クエン酸ナトリウム溶液(72mM)
20% (容量/容量)卵黄
II.1L用の調製:
A.クエン酸ナトリウム溶液
1.1,000ml容積フラスコ中に29.0gのクエン酸ナトリウム二水和物(Na3C6H5O7・2H2O)を入れる
2.最終容量が1,000mlになるように脱イオン水またはナノピュア(Nanopure)水を添加する
3.瓶に移し、15lbs圧力(245F°)で少なくとも30分間オートクレーブにかける
a.蒸発を最小にするための条件を使用して溶液をオートクレーブにかける(緩くふたをする)
b.水が沸騰して外に漏れないように注意する
4.室温でゆっくり冷却する
5.密栓して5℃の低温室で保存する
B.卵調製物
1.新鮮な鶏卵を優良な商業供給源から得る
2.埃がないように卵を洗浄し(過剰な界面活性剤は使用しない)、そしてすすぐ
3.卵を70%エタノールに2〜5分間浸漬する
4.卵を取り出し、乾燥させ(または拭いて乾燥させ)、そして清潔なタオル上で保存する
C.エキステンダーの調製
1.清潔な滅菌ガラス製品を使用する
2.A−画分(グリセロールなし画分)
a.1,000mlのメスシリンダーに800mlの2.9%クエン酸ナトリウム溶液を入れる
b.エキステンダーのグリセロールなし画分(A画分)についての抗生物質レベルは、以下のとおりであり得る;
i.タイロシン=100μg/ml
ii.ゲンタマイシン=500μg/ml
iii.リンコ−スペクチン=300/600μg/ml
c.200mlの新鮮卵黄を以下に概説するように添加する(D節)
i.徹底的に混合する
d.これは、20%卵黄およびウシ精子に対して非毒性であることが公知の濃度の抗生物質を有する2.9%クエン酸ナトリウムに基づいたA画分エキステンダーを提供する
e.エキステンダーは、一晩5℃で保存され得る。
g.次の日の使用前に37℃に暖める
D.緩衝化溶液に卵黄を添加するために、以下の手順を十分に行う
1.卵を十分に洗浄し、清潔にする(上記Bを参照のこと)
2.卵を割り、卵黄分離器を用いて卵白と卵黄を分離する。あるいは、卵黄を卵の殻に左右交互に2〜3回出し入れする。卵黄膜を破らないこと
3.卵黄を15cmの滅菌濾紙上におく
4.緩衝液を入れたメスシリンダーの上に濾紙を配置し、(卵黄膜を破りながら)卵黄を絞り出し、金で処理した(golded)濾紙からメスシリンダーへ流出させる。代表的には、約12〜15mlの卵黄が1つの卵から得られ得る。
14.5g クエン酸ナトリウム二水和物
2.1g NaHCO3
0.4g KCl
3.0g グルコース
9.37g グリシン
0.87g クエン酸
20%卵黄組成については、上記調製物の800mlおよび約200mlの卵黄を使用し得る。
Angus未経産牛(13〜14月齢(mo)であり、そして中程度の体調)は、12日間の間隔をあけて25mgのプロスタグランジンF−2αを用いて同期化させ、そして直立発情期(standing estrus)が観察された6〜26時間後、受精させた。14〜26月齢の3頭の雄ウシから新鮮に収集した精液を、TALP培地中で1時間、34℃で、75×106精子/mlで、38μM Hoechst 33342中でインキュベートした。精子を、50psiで操作するMoFlo(登録商標)フローサイトメーター/セルソーターを使用して、そしてシース液として、2.9% クエン酸Naを使用して、150mWでの351nmおよび364nmにおけるレーザー励起からの落射蛍光(epifluorescence)に基づいて、性染色体によって選別した。X染色体を有する精子(超音波処理した精子アリコートを回復させることによって確認されたように、約90%の純度)を、約500生精子/秒で、100μl Cornell Universal Extender(CUE)を含む2−ml Eppendorf管に、20%卵黄とともに収集した。収集した精子を、600×gで10分間遠心分離し、そして1.63×106生精子/mlでCUE中に再懸濁した。雌雄選別されていない精液のコントロールについて;Hoechst 33342染色精子を、シース液で、9×105精子/mlに希釈し、そして遠心分離し、そしてCUE中で1.63×106の進行的に運動性の精子/mlに再懸濁した。雌雄選別された精液および液体コントロール精液を5℃に75分間冷却し、そして0.25mlストロー(184ul/ストロー)にロードした。ストローを、受精のために、分取の5〜9時間後に3〜5℃の温度制御飲料冷却機240kmに移した。雌雄選別された精液および液体コントロール精液を、側開口青色シース(side−opening blue sheaths(IMV))を使用して受精し、各々のストローの半分を、各々の子宮角に入れた(3×105生精子/未経産牛)。標準的なコントロールとして、同じ雄ウシ由来の精液を、標準的な手順によって0.5ccストロー中で冷凍し(平均15.6×106の運動性の精子/溶解後用量)、35℃で30秒間溶解し、そして子宮体中に受精させた。処置を、3頭の雄ウシおよび2人の受精者に対して、雌雄選別された精液および2つのコントロールについて3:2:2の受精の比で平均化した。妊娠を、胎仔もまた雌雄選別された場合(盲目的に)、受精の31〜34日後超音波で決定し、そして64〜67日後に確認した。データを表に示す。
(実施例3)
精液を、Atlantic Breeders Cooperativeの雄ウシから収集し、HEPES緩衝化エキステンダー+0.1%BSAで1:4に希釈し、そしてMaryland、Beltsvilleまで160km(約2時間)輸送した。ここで精液を、周囲温度において、以前に記載された方法(Biol Reprod 41:199)を使用して、TEST収量(20%)エキステンダー中にフローサイトメトリーによって選別した。約90%純度において、5〜6時間あたり各性の2×106精子までの選別速度を達成した。精子を、遠心分離(300gで4分間)によって、2×106精子/mlまで濃縮した。いくらかの精子を、相同な精液漿を含むエキステンダー中に選別した(最終濃度5%)。選別した精子を、飛行機でコロラドまで輸送し(約2,600km)、そして周囲温度または5℃のいずれかで保存した(Equitainer(氷を含む仕切りを用いる遮蔽された装置)中で6時間以上輸送の間冷却した)。発情が検出されるよりも11〜36時間早くに、未経産牛または乳の出なくなったウシに、精子選別セッションの終わりの9〜29時間以内に受精させた。精子(0.1ml中に1〜2×105)を、受精の際に超音波によって決定された最も大きい濾胞を有する卵巣に対して同側の子宮角に深く入れた。
この実施例の目的は、未経産牛に理想的な実験条件下で非常に少数の精子を用いて受精させた場合に、妊娠率を決定することであった。3頭のHolstein雄ウシ由来の精液を、Cornell Universal Extenderおよび5%の均質な精液漿中で1×105または2.5×105精子/0.1mlまで広げた;2.5×106全精子/0.25mlをコントロールとして使用した。十分に広げた精液を、0.1または0.25mlの受精用量を送達するために、改変した0.25mlプラスチックフレンチストロー中に詰めた。精液を5℃に冷却し、そして収集の26〜57時間後に使用した。Holstein未経産牛13〜15月齢、体重350〜450kgに、12日間の間隔で、25mg プロスタグランジンF−2α(Lutalyse(登録商標))を注射し、そして発情の検出から24時間後に、胎芽移植ストローガンおよび側開口シースを用いて、1つの子宮角に受精させた。受精は、発情12時間後超音波によって決定された最大の濾胞を有する側に対して同側性であった;排卵の側は、発情7〜9日後超音波によって黄体の検出によって確認した。妊娠は、発情42〜45日後超音波によって胎仔の検出によって決定した。この実験は、4回反復し、そして3人の受精技術者で平均した。排卵の側は、225未経産牛のうち205で正しく決定された(91%);驚くべきことに、妊娠率は、同側および対側の受精でほとんど同一であった。妊娠率は、1×105、2.5×105、および2.5×106精子/受精(P>.1)について、38/93(41%)、45/87(52%)、および25/45(56%)であった。技術者の間で、有意な妊娠率の違い(P<.05)が存在したが、雄ウシの間にはなかった。フローサイトメーターを用いて性によって選別された精子が、商業的な適用を有する記載した方法を用いて、受精あたりの精子の数を十分に減らすことが可能であり得る。
14 収集システム
18 精子細胞
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