UA77641C2 - Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин - Google Patents

Abstract

Винахід стосується систем протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин, особливо пристосованих для сортування сперми за статевими ознаками. Ці системи комбінують з іншими методиками, включаючи методики поліпшеної рідини оболонки та іншими засобами, які зводять до мінімуму стрес сперматозоїдів, і, потенційно, з розчином оболонки, який містить 2,9 відсотка цитрату натрію, для тварин роду бичачих, та середовищем, яке містить бичачі гамети та hepes, для тварин роду конячих.

Description

Опис винаходу

Даний винахід загалом стосується області статевого добору потомства ссавців. Він особливо стосується 2 аспектів штучного осіменіння низькими дозами та підвищення продукування яйцеклітин для одержання потрібної статі потомства. Зокрема, винахід стосується забезпечення штучного осіменіння з контролем статі низькими дозами незалежно від методів сортування, систем сортування сперми за способом проточної цитометрії для штучного осіменіння з контролем статі при низьких дозах та методів підвищення результатів овуляції, або аналогічної тематики. 70 Протягом віків було бажаним обрання статі конкретного потомства. Крім очевидних психологічних аспектів, дійсний контроль статі потомства ссавців має значні економічні наслідки, якщо розглянути його застосування до тварин, що продукують продукти харчування, таких як велика рогата худоба, а також уславлених нагородних тварин, таких як коні і т.п. Це велике бажання викликало різноманітні спроби забезпечення потомства бажаної статі. Можливо, спробами, що здаються найближчими до досягнення бажаних результатів, були спроби 12 сортування та добору сперматозоїдів Х та У перед осіменінням.

Однією з проблем, з якими зіштовхнулися спроби сортування Х та У сперматозоїдів, була велика кількість сперматозоїдів. При натуральному осіменінні у деяких видів продукуються мільярди сперматозоїдів; при штучному осіменінні використовується менша, але все ще значна кількість сперматозоїдів. Наприклад, методи штучного осіменіння звичайно використовують від десяти мільйонів до п'ятисот мільйонів сперматозоїдів (в залежності від виду). Таким чином, навіть за умов штучного осіменіння потрібна значна кількість сперматозоїдів.

Робилися спроби використання багатьох методів для забезпечення розділення сперматозоїдів, які несуть Х- та У-хромосому. Ці методи включали використання різних методик розділення, від магнітних, таких як описані в патенті США Мо4276139, до методик розділення на колонці, як описано в патенті США Мо5514537, гравіметричних методик, як описано в патентах США Мо3894529, повторно опублікованому патенті Мо32350, патентах США МоМо с 4092229, 4067965 та 4155831. Робилися спроби використання електричних властивостей, як описано в патенті Ге)

США Мо4083957, а також комбінації електричних та гравіметричних властивостей, як описано в патентах США

МоМо 4225405, 4698142 та 4749458. Робилися також спроби використання рухомості як описано в патентах США

МоМо 4009260 та 4339434, Хімічні методики, такі як описані в патентах США МоМо 4511661 та 4999283 (з використанням моноклональних антитіл) та патентах США МоМо 5021244, 5346990, 5439362 та 5660997 (з -- використанням мембранних протеїнів), і патентах США МоМо 3687803, 4191749, 4448767 та 4680258 (з «І використанням антитіл), а також додання компонентів сироватки, як описано в патенті США Мо4085205. Хоч кожну з цих методик було описано як таку, що має високу ефективність фактично жодна з цих методик зараз не о забезпечує бажаного рівня попереднього визначення статі. Однак, незалежно від використаної зрештою методики /- розділення, конкуруюче поєднання великої кількості сперматозоїдів за природних умов та підходу до розділення 3о сперматозоїдів, які несуть Х- та У-хромосому, зробило бажаним розробку методів забезпечення осіменіння з в меншою кількістю сперматозоїдів.

На даний час єдиною кількісною методикою, що використовується для забезпечення розділення сперматозоїдів, які несуть Х- та У-хромосоми, є така, що включає індивідуальне розрізнення та розділення « сперматозоїдів методом поточної цитометрії. Ця методика стала можливою завдяки досягненням та відкриттям, пов'язанням з диференційованою абсорбцією барвника сперматозоїдами, що несуть Х- та Х-хромосоми. Вона З с була спочатку описана в патенті США Мо4362246 і значно розширена за допомогою прийомів, описаних І ам/гепсе

І» У9оппзоп в патенті США Мо5135759. Запропонована .доппзоп методика використання поточної цитометрії для розділення сперматозоїдів, що несуть Х-та У-хромосоми, була надзвичайно значним досягненням, яке уперше зробило можливим комерційне розділення таких сперматозоїдів. Залишаючись ще на експериментальній стадії, розділення було значно поліпшено з використанням високошвидкісних поточних цитометрів, таких як поточних і цитометр МоРіоФ, що виробляється Суотаїйоп, Іпс., як описано в різних інших патентах, включаючи патенти -І США МоМо 5150313, 5602039, 5602349 та 5643796, а також у міжнародній патентній публікації РСТ УМО 96/12171.

Хоч використання цитометрів МоБіо(Ф фірми Суїотаййоп дозволило значно підвищити швидкість, і хоч таке б збільшення швидкості є дуже доречним з урахуванням великої кількості сперматозоїдів, що часто ї» 20 використовується, певні проблеми ще залишаються. Всупереч майже десятикратному підвищенню швидкості, яке є можливим при використанні поточного цитометра МоБРіобФ, з кількох причин бажаними є ще коротші часи та сортування. По-перше, було виявлено, що з практичної точки зору сперматозоїди є клітинами, для яких фактор часу є критичним. Чим довше вони залишаються невикористаними, тим більше вони втрачають свою ефективність. По-друге, графік проведення збирання, сортування та осіменіння робить швидкість фактором, який 29 має високе комерційне значення. Отже, залежність властивостей клітин сперматозоїдів та результатів процесу

ГФ) від часу робить швидкість суттєвим елементом у забезпеченні високої ефективності та долі успішних спроб. юю Існують також інші проблеми, від практичних до теоретичних. З практичної точки зору було бажаним одержання зразків сортованої за статевими ознаками сперми з використанням недорогих витратних компонентів та речовин. Також, з урахуванням витрат, було бажаним здійснити сортування (а також збирання та осіменіння) з 60 якомога меншою трудомісткістю. Отже, для комерційного виробництва та успіху за практичних умов будь-які поліпшення, що можуть привести до підвищення ефективності, можуть бути значними. З практичним аспектом витрат пов'язаний практичний аспект делікатності та чутливості усього процесу. У цьому відношенні було б бажаним спростити процес та зробити його процедурно якомога надійнішим, щоб зменшити роль помилки чи кваліфікації оператора. Разом вони також роблять осіменіння низькими дозами ще більш бажаним. бо На додаток до делікатності процесу завжди було відомо, що самі сперматозоїди є надзвичайно ніжними клітинами. Хоч на перший погляд цей фактор здається легко зрозумілим, фактично у повній мірі чутливість клітин ще не було досліджено. Загалом, в контексті поточної цитометрії, більшість сортованих клітин чи частинок часто є сферичними або здатними за іншими фізичними характеристиками протистояти різним шкідливим факторам. У випадку сперматозоїдів це не так. Дійсно, як описано в даному винаході, обробка шляхом використання методики звичайної поточної цитометрії може бути неприйнятною у певних випадках для цитометричного сортування сперматозоїдів. Різні види чутливості, починаючи з чутливості до розрідження та властивої поточній цитометрії необхідності ізолювати та розрізнити кожну клітину індивідуально, а також тиск та інші стреси, притаманні типовій поточній цитометрії, чинили, до даного винаходу, сильний вплив на клітини 7/0 чи інші речовини, що піддавались сортуванню. У випадку сперматозоїдів цей фактор може мати особливе значення, оскільки навіть якщо здається, що сперматозоїди були піддані поточній цитометрії та сортуванню без будь-яких візуально помітних побічних ефектів, в дійсності самі клітини могли зазнати такого стресу, що в процесі осіменіння їх показники будуть нижче оптимальних. Отже, напевно, з точки зору сортування сперматозоїдів та їх кінцевого використання для штучного осіменіння відбувається взаємодія факторів, що /5 приводить до виникнення незвичних проблем.

Іншою проблемою, що залишилась - незважаючи на великі успіхи, яких було досягнуто завдяки патенту

Щоппзоп та спорідненим технологіям - є той факт, що до даного винаходу було надзвичайно важко забезпечити осіменіння меншими дозами виділених за статевими ознаками сперматозоїдів, незалежно від використаної технології розділення. Хоч історично було досягнуто певного успіху в області осіменіння низькими дозами, він стосується переважно теорії чи лабораторних умов, а не тих умов, що можуть ймовірно існувати при комерційному використанні чи бути застосовними до нього. У цьому відношенні існує бажання не просто забезпечити осіменіння низькими дозами, а забезпечити осіменіння низькими дозами з такими показниками запліднюваності, що є порівняними з наявними спробами штучного осіменіння високими дозами без відбору за статевими ознаками.

Таким чином, успіхи, досягнуті авторами даного винаходу, є значними досягненнями, які можуть уперше зробити с

Можливим комерційне застосування.

Іншою проблемою, з якою зустрічаються фахівці в цій області - також незважаючи на великі успіхи, яких о); було досягнуто завдяки патенту Чдоппзоп та спорідненим технологіям - є той факт, що сама проблема, а саме штучне осіменіння з високими показниками запліднюваності, має статистичний характер і пов'язане з взаємодією множини факторів. Отже, запропоновані рішення можуть у певній мірі включати комбінації різних факторів, «- зо необхідність яких окремо чи у поєднанні з іншими факторами буде показана при ретельному статистичному аналізі. Таке визначення додатково ускладнюється тим фактом, що самі результати також відрізняються для « різних видів і їх важко оцінити внаслідок того, що випробування та статистичне вибирання на достатньо великій Ге базі даних навряд чи виправдають зусилля на початкових стадіях. З цих причин винахід може також включати комбінацію факторів, які можуть, окремо чи у поєднанні, забезпечувати відповідне рішення для конкретного ї-

Зв Завдання. Таким чином, цей опис може вважатись досить широким для того, щоб забезпечувати різні комбінації та ї- поєднання описаних методик. Можуть існувати невиявлені синергії з іншими факторами. Такі фактори можуть існувати в діапазоні від факторів, що стосуються стадій сортування чи, можливо, поточної цитометрії, до факторів, що стосуються стадії збирання, а також осіменіння. На даний час дослідження були проведені переважно на тваринах роду бичачих, але вважається, що ці методи не обмежені цими видами, або, у цьому « Відношенні, лише сперматозоїдами. Вважається, що використані методики можуть знайти застосування нелише --- с для сперматозоїдів в областях, пов'язаних з сортуванням чутливих об'єктів або просто із зведенням до мінімуму впливу стресів при поточній цитометрії на об'єкти, що сортуються. )» Цікаво, що в той час, як даний винахід спрямований на зменшення впливу сортування чи стресів на сперматозоїди, інші віддалялися від цього напрямку, збільшуючи тиск та вимоги до швидкості та інших показників продуктивності. По суті, прагнення до осіменіння низькими дозами та високої швидкості обробки -І можуть, окремо чи, можливо, у взаємозв'язаний спосіб, висувати проблеми, що обмежують одна одну. Отже, хоч потреба у високошвидкісному осіменінні низькими дозами з контролем статі відчувалась вже давно, і хоч - потрібні для його втілення способи та елементи були наявними вже давно, до даного винаходу фахівці не

Ге» помічали досягнень чи, можливо, комбінацій досягнень. Можливо, у певній мірі вони не змогли зрозуміти, що ця проблема пов'язана з взаємодією факторів, а також з особливими вимогами до типів клітин (сперматозоїди чи, ве можливо, видоспецифічні сперматозоїди), що використовуються в цій області. Цікаво, що, як показує наведений

Кк вище перелік робіт, були зроблені значні зусилля, але вони, очевидно, не змогли зробити зрозумілою проблему, притаманну такій області, як осіменіння низькими дозами з контролем статі і, можливо, зроблено припущення, що оскільки у природному акті осіменіння беруть участь, можливо, мільярди сперматозоїдів, то можуть існувати 5Б Фізичні обмеження на забезпечення штучного осіменіння з використанням кількостей, що є меншими на чотири порядки величини. Отже, немає нічого несподіваного в тому, що існувала думка, яка відрізнялась від технічного іФ, напряму даного винаходу. Можливо, результати можуть навіть вважатись у певній мірі несподіваними, оскільки ка вони показали, що може бути забезпечене штучне осіменіння низькими дозами з контролем статі при показниках запліднювання, порівнянних з показниками для штучного осіменіння високими дозами без контролю статі. Для бор декого може навіть бути несподіваним, що методики та нові прийоми даного винаходу фактично поєднуються для досягнення описаних значних результатів. В той час як кожна методика окремо може деким вважатись незначною, фактично непомітні зміни, які розглядаються окремо чи у комбінації з іншими непомітними змінами, приводять до суттєвих поліпшень кінцевого результату.

Таким чином, до даного винаходу забезпечення показників запліднювання при штучному осіменінні низькими 65 дозами з контролем статі було неможливим при потрібних техніко-економічних характеристиках чи спрощених процедурах, що можуть виявитись необхідними для комерційного впровадження. Крім осіменіння низькими дозами з контролем статі, як би воно не було досягнуто, даний винахід розкриває також методики, які забезпечують підвищення ефективності, і тим самим сприяють досягненню бажаного кінцевого результату, а саме штучному осіменінню низькими дозами з контролем статі на комерційній основі.

Згідно з вищезгаданим, даний винахід претендує на досягнення, на комерційному рівні, осіменіння низькими дозами та результатів, що стосуються попереднього визначення статі ссавця. Він пропонує також удосконалені оболонку та систему збирання для сортування сперматозоїдів для визначення їх статі з використанням розділення за методом поточної цитометрії. У цій методиці розділення рідину оболонки, яку типово використовують у поточному цитометрі, замінюють на рідину, яка зводить до мінімуму стрес сперматозоїдів при їх сортуванні. 7/0 Крім того, удосконалено систему збирання для зведення до мінімуму фізичного та хімічного стресів, яких зазнають сперматозоїди. Описані різні методики та речовини, але фахівці в цій області легко зрозуміють, що можуть бути використані різні комбінації та зміни таким чином, щоб оптимізувати експлуатаційні показники в залежності від виду тварин, методик розділення, цілей та інших параметрів конкретних умов використання.

Таким чином, об'єктом даного винаходу є просто забезпечення осіменіння з контролем статі нижчими дозами у /5 такий спосіб, який працює за реальних промислових умов. Об'єктом є також забезпечення кращого сортування таких речовин, як сперматозоїди. Спорідненою метою є зведення до мінімуму впливу самої функції сортування на клітини чи інші чутливі речовини, які можуть бути піддані сортуванню. Для сортування методом поточної цитометрії метою є, зокрема, зведення до мінімуму впливу, який рідина оболонки чинить на клітини і, потенційно, впровадження рідини оболонки, яка чинить позитивний вплив, допомагаючи клітинам перенести різні стреси. Паралельною метою є створення методик та речовин, які є особливо придатними для сперматозоїдів загалом, для бичачих сперматозоїдів, для кінських сперматозоїдів, і для розділення таких сперматозоїдів на компоненти, що несуть Х- та У-хромосоми. Аналогічно, метою є зведення до мінімуму впливу, який чинить на клітини стадія збирання (наприклад, після сортування) і зведення до мінімуму фізичного впливу, а також хімічних впливів на такі сортовані за статевою ознакою сперматозоїди. Отже, метою є одержання в результаті сч сортованого матеріалу, ушкодженого якнайменше.

Іншим об'єктом винаходу є забезпечення осіменіння низькими дозами сортованого матеріалу на рівні та з о); показниками запліднення, порівнянними з типовим штучним осіменінням високими дозами без контролю статі.

Згідно з цією метою, пропонується загальна система штучного осіменіння, яка може досягти цієї мети у комерційно практичний спосіб. Отже, важливими є описані вище цілі із зведення до мінімуму стресу чи «- зо потенційного ушкодження сперматозоїдів. Важливою метою є також спосіб сортування, який забезпечує високу швидкість та низький рівень стресів при сортуванні і який є особливо адаптованим для сортування - сперматозоїдів в контексті низької дози. Важливими є також цілі зі створення рідин оболонки та інших, що не Ге чинять негативного впливу на здатність сперми до запліднення і які є сумісними зі штучним осіменінням.

Звичайно, інші об'єкти винаходу є розкритими в інших частинах опису та формулі винаходу. ї-

Фігура 1 є принциповою схемою системи сортування з використанням методики розділення за допомогою ча поточного цитометра за даним винаходом.

Фігура 2 є схемою, що зображує захоплені клітини на ділянці вільного падіння типового поточного цитометра.

Фігура З є принциповою схемою, яка орієнтовно зображує відмінності, що виникають в результаті даного винаходу. «

Фігура 4 є схемою потоку сортованих клітин, що збирається у приймальній ділянці. шв с Як буде видно далі, основні принципи даного винаходу можуть бути скомбіновані та втілені різними шляхами.

Даний винахід включає просто комерційно практичне осіменіння низькими дозами з контролем статі та результати. )» З точки зору методики розділення з використанням способу поточної цитометрії винахід також включає удосконалені системи поточного цитометра, а також системи для створення стать-специфічних зразків сперми, які

Можуть бути використані для штучного осіменіння, та тварин, продукованих з використанням таких методик. -І Винахід включає загальні процеси, завдяки яким високі швидкості є можливими навіть в промислових умовах. Крім того, описані загальні методики, які можуть бути застосовані до конкретних систем та областей застосування

Ш- при розумінні загальних принципів. При описі удосконалень приладів слід розуміти, що ці удосконалення не лише

Ге» забезпечують втілення певних методів, але й можуть також бути змінені та скомбіновані різними способами.

Важливо, що для всього вищесказаного кожну з цих ознак слід розуміти як таку, що є охопленою даним о винаходом. шк Як згадувалось, основною метою є відокремлення сперматозоїдів, що несуть Х-хромосоми, від сперматозоїдів, що несуть У-хромосоми. Це робиться у такий спосіб, при якому виділяються два типи сперматозоїдів, так що кожен з них можна окремо спакувати та використати. На даний час виділення краще здійснюється за допомогою дв поточної цитометрії. Загалом поточна цитометрія є методикою, що є добре зрозумілою. Наприклад, її основні аспекти описані та обговорені у різноманітних патентах Суюотаїйоп, Іпс., таких як патенти США та інші раніше іФ, згадані публікації. Кожен з цих патентів та зроблені в них посилання включені до даного опису шляхом ка посилання; отже, фахівці в даній області легко зрозуміють основні принципи .

По суті, поточна цитометрія включає сортування речовин, таких як клітини, які подаються до інструмента бо поточного цитометра за допомогою якогось джерела клітин. Схематично інструмент зображено на Фігурі 1.

Інструмент поточного цитометра включає джерело клітин (1), яке виробляє чи подає клітини чи якийсь інший тип матеріалу для аналізу за допомогою поточного цитометра. Клітини вводять до патрубка (2) таким чином, щоб вони були оточені рідиною оболонки (3). Рідина оболонки (3) звичайно подається якимсь джерелом рідини оболонки (4) таким чином, щоб при подачі клітин джерелом клітин (1) рідина оболонки (3) подавалась спільно з ними крізь 65 патрубок (2). Таким чином, легко зрозуміти, що рідина оболонки утворює для клітин рідке середовище оболонки.

Оскільки різні рідини подаються до поточного цитометра під тиском, вони залишають патрубок (2) та витікають з нього крізь отвір патрубка (5). За допомогою якогось типу осцилятора (6), який можна дуже точно контролювати пристроєм керування осцилятором (19), можна створити в патрубку (2) хвилі тиску, що передаються до рідин, які виходять з патрубку (2) крізь отвір патрубку (5). Оскільки осцилятор (6) чинить вплив на рідину оболонки (3), потік (7), що виходить з отвору патрубка (5), в результаті регулярно утворює краплини (8). Оскільки клітини оточені рідким середовищем оболонки, краплини (8) можуть містити у собі окремі ізольовані клітини чи інші матеріали.

Оскільки краплини (8) загалом містять ізольовані клітини, поточний цитометр може розрізняти та розділяти краплини на основі того, містить краплина чи ні відповідну клітину чи клітини. Це здійснюється за допомогою 7/0 бистеми виявлення клітин (9). Система виявлення клітин включає принаймні якийсь тип датчика (10), який реагує на клітини, що знаходяться усередині кожної краплини (8), як описано детально у зародковій роботі (без жартів) Іагу доппвоп, а саме, в патенті США Мо5135759. Як пояснено в патенті доппзоп для сперматозоїдів, система виявлення клітин (У) може спричинювати дію в залежності від відносної наявності чи відносної відсутності конкретного барвника, який може бути збуджений якимось стимулюючим засобом, таким як лазерний збудник (11). Хоч барвник забарвлює кожен тип сперматозоїдів, різна довжина Х-хромосоми та У-хромосоми спричинює різні рівні забарвлення. Таким чином, аналізуючи ступінь присутності барвника в сперматозоїдах, можна розрізнити Х-несучі сперматозоїди та У-несучі сперматозоїди за їх різними рівнями емісії.

Для забезпечення кінцевого розділення та ізоляції відповідних клітин за методом розділення з використанням поточної цитометрії, сигнали, одержані датчиком (10), поступають до якогось типу системи поділяючого сортування (12), яка дуже швидко приймає рішення і може диференційовано заряджати кожну краплину (8) на основі її рішення про те, є чи ні усередині цієї краплини (8) потрібна клітина. Таке функціонування системи поділяючого сортування (12) дає змогу пластинам електростатичного відхилення (13) відхиляти краплини (8) за ознакою наявності чи відсутності в них відповідної клітини чи іншого матеріалу. В результаті поточний цитометр виконує функцію сортування клітин, примушуючи їх попадати до одного чи кількох сч збірників (14). Таким чином, аналізуючи якусь властивість клітин чи інших матеріалів, поточний цитометр може розрізняти клітини за якоюсь конкретною характеристикою та поміщати їх до відповідного збірника (14). В о); системі, що зараз використовується для сортування сперматозоїдів, краплини, що містять Х-несучі сперматозоїди, заряджаються позитивно, і тому відхиляються в одному напрямку, краплини, що містять У-несучі сперматозоїди, заряджаються негативно, і тому відхиляються в іншому напряму, а холостий потік (тобто клітини, «- зо що не сортуються) є незарядженим і тому збирається невідхиленим потоком до всмоктуючого патрубка чи подібного пристрою. -

За допомогою Фігури 2 процес можна зрозуміти ще краще. Як зображено на цій фігурі, патрубок (2) емітує Ге потік (7), який завдяки осцилятору (6) (на Фігурі 2 не зображений) утворює краплини (8). Оскільки джерело клітин (1) (на Фігурі 2 не зображене) може подавати сперматозоїди (15), які були забарвлені за методикою ї- д9оппзоп, світлове збудження лазерним збудником (11) диференційно визначається датчиком (10) таким чином, що ї- наявність чи відсутність заряду на кожній краплині (8) при її відокремленні від потоку (7) може контролюватись поточним цитометром. Цей контроль дозволяє розрізняти позитивно заряджені, негативно заряджені та незаряджені краплини (8) за їх вмістом. Як зображено на Фігурі 2, певні краплини показані як відхилені краплини (16). Ці відхилені краплини (16) є тими, що містять сперматозоїди (15) однієї чи іншої « статі. Потім вони осаджуються у відповідному збірнику (14) для подальшого використання. шв с Одним з аспектів поточної цитометрії, що є особливо важливим для її застосування у сортуванні сперми, є висока швидкість роботи поточного цитометра. Особливо удосконаленими є поточні цитометри, що виробляються )» фірмою Суютаїйоп, Іпс. під товарним знаком МоРіоф. Ці поточні цитометри надзвичайно підвищили швидкість сортування і тим самим зробили поточну цитометрію методикою, яка ймовірно може стати придатною до

Застосування у промисловому сортуванні сперми (поряд з іншими варіантами промислового застосування). Вони -І функціонують таким чином, щоб забезпечити високошвидкісне сортування, тобто зі швидкістю, значно вищою, ніж та, що може бути досягнута в інших випадках. Зокрема, поточні цитометри МоБіоФ виробництва Суотаїйоп

Ш- працюють з частотами осциляції вище приблизно п'яти кілогерц, ще точніше, вони можуть працювати в діапазоні

Ге» частот від 10 до З0, або навіть до 50 кілогерц. Таким чином, краплини утворюються на дуже високих частотах, і 5ор Клітини, які знаходяться в середовищі рідкої оболонки, можуть дуже швидко емітуватись з патрубка (2). В о результаті кожен з компонентів, що складають систему поточного цитометра та входять до її складу, таких як ке патрубок (2), осцилятор (6) і т.п., може бути скомпонований чи обраний таким чином, щоб створити високошвидкісний прилад для сортування клітин. При застосуванні приладу для високошвидкісного сортування клітин до сортування сперматозоїдів було досягнуте сортування зі швидкостями більше приблизно 500 ов елементарних подій сортування за секунду. Фактично, при використанні приладів високошвидкісного сортування клітин були вже досягнуті швидкості сортування до тисячі та тисячі двохсот подій. Важливо розуміти, що термін іФ, "висока швидкість" є відносним терміном, так що з новими досягненнями у поточній цитометрії та конкретних ка варіантів її застосування той аспект, що вважається "високим", може змінюватись або залишатись абсолютним. У будь-якому визначенні, загальний принцип полягає в тому, що сортування може відбуватись на швидкості, при бор якій параметри та фізичні характеристики поточного цитометра є суттєвими для самих клітин при сортуванні певних клітин, таких як сперматозоїди.

Одним з аспектів високошвидкісного сортування, який відіграє певну роль при сортуванні сперматозоїдів за методом розділення з використанням поточного цитометра, є тиск та інші стреси, яким піддано сперматозоїди у поточному цитометрі. Наприклад, при експлуатації на високій швидкості (та як альтернативне визначення 65 "високої швидкості") поточні цитометри можуть працювати при тиску в 345кПа (5Офунтів/кв.дюйм) і навіть 414кПа (бофунтів/кв.дюйм). Такий тиск може вважатись високим, оскільки він може чинити вплив на клітини, що піддані сортуванню. Ключовим фактором для цього аспекту даного винаходу є той факт, що визначальним фактором є порогові величини стресу для конкретних клітин. Крім того, з подальшим накопиченням знань може бути показано, що порогові величини стресу є функцією поєднаних ефектів, таких як належність сперми до конкретного виду або

ВИД попередньої чи подальшої обробки клітин. Ключовим фактором у цьому відношенні є те, що стрес, якого зазнають клітини, може фактично змінити їх життєздатність та їх здатність до досягнення бажаного результату.

У випадку тиску можливо, що просте піддавання сперматозоїдів високому тиску в результаті проведення операції на поточному цитометрі при цьому тиску може призвести до зниження показників клітин. В одному з аспектів даний винахід зводить до мінімуму ці стреси і. таким чином, забезпечує підвищення ефективності, а також менші 7/0 дози, як описано далі.

При розгляді в аспекті стресу клітин, даний винахід працює таким чином, щоб звести до мінімуму стреси. Ці стреси можуть бути зменшені на будь-якій стадії всього циклу чи процесу збирання, сортування, або навіть осіменіння тварини. Важливо, що стрес, який створюється при обробці клітин у поточному цитометрі, є суттєвим для цього варіанта застосування. В одному з варіантів втілення винаходу рідину оболонки спеціально обирають /5 таким чином, щоб вона могла використовуватись узгоджено з обома (або з будь-яким) з передсортувального рідкого середовища клітин або післясортувального рідкого середовища клітин. Хоч, звісно, можливо модифікувати будь-яку з передсортувальної та післясортувальної рідин, один з варіантів втілення винаходу модифікує рідину оболонки (3) таким чином, щоб вона спричинювала значно менший стрес клітин, ніж це було досягнуто раніше. У певному відношенні винахід є примітним тим, що він переносить загальний фокус з функціонування поточного цитометра на способи поводження та зняття стресу з самих клітин. Наприклад, хоч було відомим використання рідин з належним показником рН чи осмотичністю, даний винахід визнає, що можуть існувати певні хімічні композиції, у яких клітини можуть мати підвищену чутливість. Ці хімічні композиції, що спричинюють підвищену чутливість, можуть, звісно, змінюватись в залежності від виду клітин чи навіть попередньої обробки клітин. В цьому випадку важливим є те, що для сперматозоїдів виявляйся, що певні метаболічні хімічні композиції, такі сч об як цитрат, попереджають надзвичайно високий рівень стресу клітин. Таким чином, хімічні композиції, що викликають підвищену чутливість, можуть бути визначені як такі, до яких клітини є особливо чутливими в іо) контексті їх функціональності та методик обробки, що існували на той час. У випадку сперматозоїдів виявляється, що дуже важливими можуть бути метаболічні композиції, а саме постійність цитратного складу для бичачих сперматозоїдів та постійність буфера Перез для кінських сперматозоїдів. Таким чином, даний винахід «- зо намагається звести до мінімуму зміни шляхом вибору типу операції або речовин, які можуть діяти як засіб зведення до мінімуму тих змін, яких зазнають клітини. «

За одним з варіантів втілення винаходу, речовина для рідини оболонки обирається таким чином, щоб її можна Ге було з хімічної точки зору узгодити з вимогою мінімальних змін. Таким чином, шляхом добору відповідної рідини оболонки не лише в контексті параметрів поточної цитометрії, а також в контексті параметрів самих клітин, ї- з5 Можна поліпшити зміни, яких зазнають клітини і, над усе, результат сортування. Це зображено схематично на ча

Фігурі 3. Фігура З зображує деякий тип хімічного фактора (такого як цитратний чи інший фактори), який може існувати на різних стадіях процесу. Наприклад, чотири фази, що зображені, можуть для методики розділення з використанням способу поточної цитометрії позначати наступне, але не обмежені цим: фаза | може позначати існування клітин у джерелі клітин (1), фаза І може показувати існування клітин під час їх сортування у « рідкому середовищі оболонки, фаза ІІЇ може показувати клітини під час їх збирання після сортування, і фаза ІМ шв с може зображувати відновлені клітини у середовищі для зберігання після сортування. Ці чотири фази, як зображено для відомого рівня техніки, можуть зазнавати дії дуже різних за хімічними факторами середовищ. )» Однак, як зображено схематично, за даним винаходом клітини можуть зазнавати дуже малих змін, причому найсуттєвішим є те, що занурення чи утворення краплин, яке відбувається між фазами | та ІІ, може бути по суті

Відсутнім. Це є результатом добору відповідної рідини оболонки, як було вказано вище. Таким чином, в -І результаті того, що за даним винаходом клітини піддані дії відповідної рідини оболонки, вони можуть зазнавати значно нижчого рівня стресу.

Ш- Одним з потенційних узагальнень, які можуть виникнути у зв'язку з цим явищем, є той факт, що певні

Ге» хімічні композиції можуть бути хімічними композиціями, які спричинюють більш підвищену чутливість, ніж інші.

Хоч, звичайно, це може змінюватись в залежності від виду сперми, обробки, або навіть типу клітин, яких це о стосується, виявляється, що життєздатність клітин, потрібна для їх призначення (в цьому випадку - штучного

Кк осіменіння) може сильно змінюватись з природних причин чи внаслідок сортування, або з обох причин, так що клітини будуть виявляти підвищену чутливість по відношенню до цієї хімічної композиції. Виявляється, що внаслідок добору певної метаболічної хімічної композиції, найкраще цитратів чи хімікатів, що входять до циклу в лимонної кислоти, можуть бути досягнуті значні поліпшення. Таким чином, для використання з бичачою спермою рідину оболонки (3) обирають та компонують таким чином, щоб вона мала в складі приблизно 2,9 відсотка цитрату іФ, натрію. Зокрема, розчин цитрату натрію з концентрацією 2,9 відсотка може бути одержаний таким чином: ка 1. Поміщають 29,0г дигідрату цитрату натрію (МазСеНьО7.2Н2О) до мірної колби на 1000мл а. Розчиняють цитрат натрію у 3/4 об'єму води, а потім додають воду до потрібної кількості. во 2. Додають деіонізовану воду чи воду, одержану на установці Мапориге, до кінцевого об'єму 1000мл. 3. Переміщають до склянок та автоклавують при тиску 15 фунтів сили (1182 (2452Е)) протягом принаймні 30 хвилин а. Автоклавують розчин за умов, які забезпечують знижене випаровування (вільно прилягаюча кришка) б. Стежать за тим, щоб вода не википіла. 65 4. Повільно охолоджують до кімнатної температури. 5. Зберігають закритою в холодній кімнаті при 526.

Надалі при виготовленні рідини оболонки розчин цитрату натрію може бути профільтрований. 6. Фільтрують на фільтрі 0,22 мікрон за методикою асептичного фільтрування.

Цікаво, що для кінських сперматозоїдів така композиція є придатною в меншій мірі. Замість цього було знайдено, що для кінських сперматозоїдів кращим є середовище з буфером Перез, таке як перез-буферизоване середовище для бичачих гамет, зокрема, НВОМЗ, яке було створено .).).Раїтізй для роботи з бичачими матеріалами. Це середовище |описано у статті "Сарасігайоп ої Воміпе Зрегт Бу Нерагіп", 38, Віоіроду ої

Кергодисііоп, 1171 (1988), яку включено сюди за посиланням). Це є несподіваним не лише тому, що тип речовини відрізняється від того, що використовується для бичачої сперми, але й тому, що сам цей буфер був оригінально 7/0 розроблений для роботи з бичачими матеріалами. Отже, для кінського матеріалу обирається рідина оболонки, яка містить буфер Перез. Цей розчин може мати при кімнатній температурі значення рН приблизно 7,54 (рН при 399

Е 7,4), при такому складі:

Реагент Суха вага (г/БООмл) сась 0,145

КСІ 0115

Масіо-вноо 0,004

МаноРОд-ньО 0,018 масі 2,525

Піруват Ма 0,011

Молочна кислота (6095) 1,в4мл

НЕРЕВ8 4,165 мансоз 0,420

ВЗА (фракція М) 30 с о

Одним з інших аспектів, що можуть відігравати свою роль у даному винаході, є той факт, що клітини, про які йде мова, можуть виявляти незвичайну чутливість. В одному відношенні це може бути спричинено тим фактом, що сперматозоїди належать до класу клітин, які є невідновлюваними клітинами. Тобто, вони не мають здатності відновлювати себе і тому можуть вимагати набагато обережнішого ставлення, ніж звичайні для поточних - цитометрів чи іншого обладнання для обробки. Отже, може виявитись, що це удосконалення є особливо «г застосовним у тих випадках, коли як джерело сперматозоїдів використовується поточний цитометр чи інший пристрій для розділення. Іншим потенційно спорідненим аспектом, що може бути унікальним для такого класу ке, клітин, як сперматозоїди, є той факт, що їх ДНК є нездатним до відновлення, реплікації та транскрипції. ч-

Будь-який з цих факторів може відігравати певну роль, так що вони можуть мати певне значення окремо чи у поєднанні. Отже, може виявитись, що опис даного винаходу стосується всіх гаметних клітин, або навіть вірусів - і т.п., які є клітинами, нездатними до відновлення, трансляції та транскрипції.

Окремим аспектом обробки за допомогою поточного цитометра, що також може бути важливим, є те, що обробка клітин після їх сортування має проводитись належним чином як з хімічної, так і з фізичної точки зору. «

Як зображено на Фігурі 4, коли клітини усередині краплин (8) потрапляють до збірника (14), може бути важливим, щоб контейнер, який є збірником, мав належний розмір, так щоб він забезпечував певні засоби З с запобігання зіткненню між клітинами та самим контейнером. Хоч був відомим прийом поміщення на дно

І» контейнера початкової рідини збірника (17) для збирання клітин таким чином, щоб вони не ударялись у дно контейнера, виявляється, що для поліпшення результату може бути використане просте збільшення ширини контейнера для урахування варіацій форми потоку, а також неминучого розбризкування внаслідок зіткнення клітин з контейнером. В одному відношенні це може виконувати функцію амортизуючого елемента, так щоб забезпечити - відповідне ставлення для клітин, які можуть бути механічно неміцними, тобто можуть бути зруйновані чи -і пошкоджені зіткненням. Таким чином, коли джерелом клітин цитометра для сортування є клітини, які є фізично ніжними клітинами, може бути важливим використання деякого типу амортизуючого елемента, такого як широка

Ме. пробірка для збирання, для якої ширина отвору (18) дозволяє розмістити стінки контейнера таким чином, щоб їз 20 уникнути контакту з клітинами. Отже, бокові стінки пробірки розташовані не настільки близько, щоб існувала будь-яка значна вірогідність контакту між клітинами, які піддано сортуванню, та стінками пробірки. У цьому "З способі може бути бажаним, на додаток до рідини збірника (17), використовувати широку пробірку для збирання матеріалу. Можливо, достатньо буде самого лише використання широкого отвору контейнера, який є частиною збірника (14). Для варіантів використання, які застосовують високу швидкість сортування сперматозоїдів, було 22 знайдено, що достатнім вважається використання контейнера, який має внутрішній діаметр отвору принаймні

ГФ) 15мм. Зокрема, було знайдено, що фізичні пошкодження клітин, пов'язані зі збірником (14), були мінімальними при використанні для цієї мети тестової пробірки Фалкона на 14мл. ді Слід відзначити, що навіть тестова пробірка Фалкона на 14мл може бути не оптимальним варіантом. Зокрема, вважається, що найоптимальнішим варіантом може бути використання контейнера збірника, який відповідає 60 геометрії потоку (тобто, "узгоджений з геометрією потоку контейнер"). Цей узгоджений з геометрією потоку контейнер може мати будь-яку або всі з таких характеристик: відносно широкий отвір, отвір еліптичної форми, меншу величину співвідношення висоти до ширини, ніж це використовується в даний час, навскісну чи іншим чином визначену форму, так щоб вона могла мати бокові стінки, що розташовані паралельно падаючому потоку, і т.п. Може бути також бажаним передбачити елемент кріплення, такий як рухомий елемент чи засіб, типу бо Шшарикопідшипників і т.п., для забезпечення змінної орієнтації пробірки в залежності від форми падаючого потоку, який бажано зібрати. Крім того, фізичні характеристики класу контейнерів, таких як існуюча пробірка (яку названо тестовою пробіркою "типу Фалкона") можуть включати не лише ширину пробірки, але також матеріал (такий як полістирол, до якого клітини не прилипають), з якого вона зроблена і т.п. (Ці можливі матеріали для тестових пробірок Фалкона на 14мл є добре відомими). Таким чином, контейнер та його рідина для збирання можуть також виконувати роль амортизуючого елемента для зведення до мінімуму фізичного пошкодження клітин.

За своїми розмірами він також може сприяти збиранню достатньої кількості сперматозоїдів без суттєвого ефекту розрідження.

Іншим аспектом рідини збірника (17) може бути той факт, що вона також може бути використана для 7/0 Зменшення хімічних стресів клітин. В одному відношенні, оскільки може бути важливим забезпечення живильних речовин для клітин як перед, так і після сортування, рідина збірника (17) може бути обрана таким чином, щоб забезпечити узгоджений рівень живильних речовин, щоб рівні перед та після сортування були збалансованими.

Було знайдено, що для бичачої сперми, в якій як живильна речовина використовується цитрат з двома відсотками яєчного жовтка, добрі результати забезпечує використання цитрату з рівнем яєчного жовтка шість відсотків (тобто цитратного розчину з вмістом яєчного жовтка шість відсотків). Це є наслідком різниці об'ємів перед та після сортування. Рідина збірника може починати (перед сортуванням) з об'єму приблизно 2мл. В результаті сортування може бути доданий приблизно подвійний об'єм (кінцевий об'єм в три рази перевищує початковий) при дуже низькому рівні цитрату з яєчним жовтком у розчині (внаслідок злипання та з урахуванням інших особливостей поточного цитометра). Таким чином, кінцевий результат за показниками кількісного рівня наявного 2о цитрату з яєчним жовтком може бути еквівалентним вихідним даним, тобто вмісту яєчного жовтка в цитратному розчині в два відсотки завдяки використаним об'ємам рідини. Таким чином, рідина збірника (17) може бути обрана таким чином, щоб створити кінцеве рідке середовище збірника, яке є збалансованим з вихідним рівнем живильної речовини чи іншим рідким середовищем. У цей спосіб, вона може бути використана для того, щоб скоротити час дії на клітини композиції із зміненим рівнем компонентів. Звісно, ці рідкі середовища можуть сч ВИикористовуватись в поточному цитометрі або можуть існувати в будь-який інший час у минулому, а важливим є просто зведення до мінімуму стресу, якого зазнають клітини в будь-який період їх життєвого циклу. Крім того, о); оскільки вихідний вміст хімічної речовини може змінюватись (наприклад, вміст яєчного жовтка у відсотках в цитраті може бути змінений в більший чи меншій бік), то і початковий склад рідкого середовища для збирання чи різні об'єми також можуть бути змінені таким чином, щоб кінцевий результат був таким самим. Таким чином, -" де зо перед початком процесу сортування є рідина для збирання з шістьма відсотками яєчного жовтка в цитратному розчині, а після закінчення сортування рідина для збирання - зі стать-специфічною спермою - може мати вміст - яєчного жовтка в цитратному розчині, який дорівнює двом відсоткам, аналогічно до початкового вмісту живильних (ау речовин.

Зверніть увагу на те, що при подальшому використанні ці сперматозоїди можуть бути оброблені цитратною ї- рідиною з вмістом яєчного жовтка до 2095 з інших причин, але вважається, що ці зміни не створюють стресу для М клітин, оскільки вони є лише відомою частиною загального процесу осіменіння. Хоч, звісно, рівні можуть змінюватись, фахівці в цій області легко зрозуміють, що цитратний буфер з 2095 яєчного жовтка може мати такий склад:

Ї. Кінцева композиція: « 8095 розчину цитрату натрію (72мММ) шв с 2090 (об./об.) яєчного жовтка

ІЇ. Рецептура на 1 літр: )» А. Розчин цитрату натрію 1. Поміщають 29,0г дигідрату цитрату натрію (МазСеНьО»7.2Н»20О) до мірної колби на 1000мл 2. Додають деіонізовану воду чи воду, одержану на установці Мапориге, до кінцевого об'єму 1000мл. -І 3. Переносять до склянок та автоклавують при тиску 15 фунтів сили (1182 (2452Р)) протягом принаймні 30 хвилин їв. а. Автоклавують розчин за умов, які забезпечують знижене випаровування (вільно прилягаюча кришка)

Ге») б. Стежать за тим, щоб вода не википіла. 4. Повільно охолоджують до кімнатної температури. те 5. Зберігають закритою в холодній кімнаті при 526. - Б. Приготування яйця 1. Одержують свіжі курячі яйця з надійного комерційного джерела. 2. Відмивають яйця від бруду (не використовуючи забагато миючого засобу) та споліскують. 3. Занурюють яйця до 7095 етанолу на 2-5 хвилин. о 4. Дістають яйця і залишають сохнути (або витирають насухо) і складають на чистий рушник.

В. Приготування розріджувача їмо) 1. Використовують стерильний, чистий скляний посуд. 2. А-фракція (безгліцеринова фракція) 60 а. Поміщають 800Омл 2,995 розчину цитрату натрію до градуйованого циліндра на 1000мл. б. Рівні антибіотиків в безгліцериновій фракції (А-фракції розріджувача) можуть бути такими:

Ї. Тілозин - 100мкг/мл

ІЇ. Гентаміцин - 500мг/мл

ПІ. Лінко-спектин - 300/60Омкг/мл 65 в. Додають 200мл свіжого яєчного жовтка, як описано нижче (Розділ Г).

Ї. Дуже ретельно перемішують.

г. В результаті цього одержують А-фракцію розріджувача на основі 2,995 цитрату натрію з 2095 яєчного жовтка та концентрацією антибіотиків, що напевно є нетоксичною для бичачої сперми. д. Розріджувач може зберігатись протягом ночі при 59С. е. Наступного дня декантують надосадну рідину (верхні 800мл). є. Наступного дня перед використанням підігрівають до 3720.

Г. Для додання яєчного жовтка до буферизованого розчину добре спрацьовує така процедура. 1. Промивають та очищають яйця (дивись Б вище). 2. Розкривають яйце і відокремлюють жовток від альбуміну за допомогою сепаратора для жовтка. 70 За іншим варіантом, переливають жовток вперед-назад між двома половинками шкаралупи. Не пошкоджуйте мембрану навколо жовтка. 3. Поміщають жовток на стерильний шмат фільтрувального паперу розміром 15см. 4. Тримають фільтрувальний папір над градуйованим циліндром з буфером і розчавлюють жовток (розриваючи мембрану), даючи жовтку стекти з фільтрувального паперу до циліндру. Типово з одного яйця може бути 75 одержано приблизно 12-15мл жовтка.

Іншим аспектом, який може відігравати роль у різних факторах даного винаходу, є той, що стосується використання для штучного осіменіння і т.п. низьких доз сперми. Додатковий опис відомого рівня техніки з штучного осіменіння з контролем статі може бути знайдений у |книзі Кирегі Р. Аттап апа Сеогде Е. Зеїаеї, Ог., "Ргозресів Тог Богііпд Маттаїййап бЗрегт", СоІогадо Авзосіаїей Опімегейу Ргезз (1982), яку включено сюди за посиланням). Як згадувалось, при природному осіменінні використовується кількість сперми, яка містить порядку мільярдів сперматозоїдів. Типове штучне осіменіння зараз здійснюється з використанням мільйонів сперматозоїдів для тварин роду бичачих та сотень мільйонів сперматозоїдів для тварин роду коней. Термін "низька доза" позначає, що доза сперми, використаної для проведення осіменіння, становить менш ніж половину, або, краще, навіть менш ніж приблизно 1095 від типової кількості сперматозоїдів, що типово використовується сі для проведення штучного осіменіння. Отже, термін "низька доза" слід розглядати в контексті типових доз для штучного осіменіння або як абсолютну кількість. Для бичачої сперми, де зараз використовується від 1 до 10 о мільйонів сперматозоїдів, процес може вважатись таким з низькою дозою при абсолютній кількості в приблизно 500000 сперматозоїдів, або навіть 300000 сперматозоїдів чи менше. Фактично, завдяки використанню методів даного винаходу, штучне осіменіння з добрими відсотковими показниками запліднювання було проведене при «- кількості сперматозоїдів при осіменінні, що становила 100000 та 250000 сперматозоїдів (відповідні показники запліднювання 4190 та 5095), як описано у |статті "ШХегіпе Ногп Іпзетіпайоп ої Неїйегв Мп Мегу ом Митбегв т ої Моп-їгогеп апа Зехей Зрептайозоа", опублікованій в 48, Тнегіодепоіоду, 1255 (1997), яку включено сюди за (Се) посиланням). Оскільки сперматозоїди, виявляється, проявляють чутливість до розрідження, ці результати можуть відображати особливу взаємозалежність використання вибірок матеріалу з низькими дозами сперматозоїдів з - різними методиками за даним винаходом. Абсолютні величини можуть бути залежними від виду тварини. Для - тварин роду коней процесом з низькою дозою може вважатись процес з менш ніж приблизно двадцятьма п'ятьма, десятьма, п'ятьма, або навіть одним мільйоном сперматозоїдів.

Іншим аспектом, який може бути важливим, є той факт, що в системі штучного осіменіння використовується « сперма, розділена методами даного винаходу за статевими ознаками, або навпаки. Отже, коли, для методики з використанням поточного цитометра, використовується збірник (14) для збирання сперми для штучного - с осіменіння, методики даного винаходу можуть бути особливо доречними. Крім того, можливо, що комбінація використання штучного осіменіння та його проведення з низькою дозою може створити синергічні ефекти, які і» роблять різні методики даного винаходу особливо доречними. Звісно, розділена за статевими ознаками сперма може бути використана не лише в режимі штучного осіменіння, але й іншими способами, такими як запліднювання іп міго і т.п. - І Процес збирання, сортування, і згодом осіменіння тварини з використанням поточної цитометрії, або іншої -1 методики розділення, включає різні стадії. В контексті осіменіння корів, спочатку збирають сім'я бика за допомогою штучної вагіни. При цьому рівні становлять приблизно 1,5 мільярдів сперматозоїдів на мл. Це (є) нерозріджене сім'я можна перевірити за допомогою спектрофотометра для оцінки концентрації і можна проаналізувати мікроскопічно для визначення відповідності стандартам рухомості та життєздатності. Після цього е можуть бути додані антибіотики. В результаті вихідний зразок може мати приблизно від 60 до 70 відсотків - М послідовно рухомих сперматозоїдів в еякуляті. Для проведення обробки може бути використане розрідження за допомогою якогось типу ТАГР (тірод альбумін лактат піруват) для доведення кількості сперматозоїдів до придатного (для поточного аналізу) рівня в приблизно 100 мільйонів на мл. ТАЇР не лише підживлює сперматозоїди, але й підвищує їх активність на стадії забарвлення. Перед забарвленням для деяких видів тварин, таких як коні, може бути проведене центрифугування. Забарвлення здійснюють за протоколом о багатократного чи однократного забарвлювання, причому останній є об'єктом патенту Чдойпвзоп та споріднених ко технологій. Забарвлювання може бути здійснено при одночасній модифікації розріджувача для створення відповідного живильного середовища. Для бичачого матеріалу це може включати додання приблизно 2095 яєчного бо жовтка до цитратного розчину негайно після забарвлення. Крім того, було знайдено, що при забарвлюванні сперматозоїдів можна очікувати досягнення кращих у певному ступеню результатів при використанні більших кількостей барвника. Ці високі концентрації при забарвлюванні можуть включати використання барвника з концентрацією в десятки мкМ (мікромоль), так як описано нижче у прикладах, де було використано барвник

Ноеснзі 33342 з концентрацією ЗамкМ. 65 Після додання барвника може бути використаний інкубаційний період, такий як інкубування протягом однієї години при 342С для прискорення поглинання барвника при концентрації приблизно 100 мільйонів сперматозоїдів на мл. Після цього може бути проведена фільтрація для видалення згустків сперматозоїдів, а потім може бути проведено розріджування чи розведення для одержання бажаної концентрації в приблизно 100 мільйонів сперматозоїдів на мл. Після цього може бути проведене сортування згідно з різними методиками, описаними раніше, при якому сперматозоїди збирають у фазі збірника. Як згадувалось раніше, в результаті збирання можуть бути одержані вибірки матеріалу з концентрацією яєчного жовтка в цитраті приблизно 295 (для бичачого матеріалу). Потім зразок може бути сконцентрований до приблизно 3-5 мільйонів сперматозоїдів на мл шляхом використання центрифугування, після якого рідина оболонки та консервувальна рідина можуть бути видалені.

Після цього може бути проведене кінцеве розріджування з використанням цитрату з 2095 яєчного жовтка або /о розріджувача СогпеїЇ Опімегва! Ехіепдег і т.п. Розріджувач СогпеїЇ ОпімегваІ Ехіепдег може мати таку рецептуру на 100Омл: 14,5г дигідрату цитрату натрію 21г МансСоз

О,4г КСІ

З,Ог глюкози 9,37г гліцину 0,87г лимонної кислоти

Для композиції з 2095 яєчного жовтка може бути використано 800 мл вказаного вище препарату та приблизно 200мл яєчного жовтка.

Після цього останнього розріджування може бути одержана концентрація від З до 5 мільйонів сперматозоїдів на мл (для бичачого матеріалу). Цей зразок може бути охолоджений для уповільнення метаболізму сперматозоїдів та забезпечення можливості використання протягом довших періодів часу. У коней вибірка матеріалу може бути потім використана з використанням яйцепровідного чи інших способів осіменіння, як добре зрозуміло фахівцям в цій області. Для бичачої сперми вибірка матеріалу може бути розведена ще раз до сч бажаного рівня дозування. Було знайдено, що розрідження може вплинути на життєздатність сперми, і тому може бути зручно уникати надто високого рівня розрідження шляхом використання меншої вибірки матеріалу. На даний о); час, незалежно від використаної методики розділення, можуть бути досягнуті низькі дози в 300000 сперматозоїдів на 0,184мл. Крім того, може бути бажаним підтримувати вміст сім'яної плазми на рівні приблизно п'яти відсотків, хоч результати дотримання цієї вимоги на даний час є невизначеними. Потім зразок «- зо сперматозоїдів може бути поміщений до соломини, призначеної для використання при штучному осіменінні і може бути доставлений до корів чи телиць, яких треба осіменити. -

Для забезпечення зручного графіку штучного осіменіння тічка у корів чи телиць може бути синхронізована з Ге використанням відомих методів, таких як застосування простагландину Б2 у згідно з відомими в техніці методами. Остання речовина може бути особливо цінною, оскільки було повідомлено про те, що вона потенційно - забезпечує підвищення здатності телиць до зачаття, як описано у (статті "Рговіадіапаій 2 о - А Репійу Огд зр іп Оаігу СашШе?", 18, Тпегіодепоіоду, 245 (1982), яку включено сюди за посиланням). Хоч останні результати не підтримують це припущення, можливо, що даний винахід демонструє його особливу життєздатність у випадку осіменіння низькими дозами з контролем статі. Для тварин роду бичачих після цього може бути проведене штучне « осіменіння шляхом використання обладнання для перенесення ембріонів з введенням сперматозоїдів в глибину рогів матки. Це може бути здійснено не в піковий момент, який зазвичай використовується при штучному - с осіменінні а в дещо пізніший момент часу, такий як через 12 годин після нього, оскільки існує деяка вірогідність того, що запліднення при штучному осіменінні з контролем статі може відбуватись трохи пізніше. і» Може бути використане обладнання для перенесення ембріону, оскільки може існувати висока чутливість стінки матки до такого осіменіння низькими дозами з контролем статі.

Крім того, ці методики можуть бути поєднані для досягнення вищої ефективності продукування. Зокрема, -І будь-який з винайдених процесів, що дозволяють проведення високошвидкісного сортування та осіменіння -І низькими дозами відібраних за статевими ознаками ембріонів, може бути використаний у тварини з суперовуляцією. Суперовуляція може бути досягнута шляхом використання лікарського засобу для викликання (є) суперовуляції або будь-яким іншим методом. Лікарський препарат для викликання суперовуляції може діяти безпосередньо чи опосередковано, наприклад, через послідовність реакцій, з метою забезпечення підвищеного те порівняно з нормальним продукування яйцеклітин. Комбінація з суперовуляцією є несподіваною, оскільки раніше - М вважалось, що суперовуляція перешкоджає такій комбінації. Транспорт сперми у тварин з суперовуляцією є ризикованим, тому штучне осіменіння тварин часто проводили за кілька разів та/або кількома дозами сім'я. Крім того, відомі процедури розділення сім'я за статевими ознаками були відносно повільними; тому було цікаво визначити показники запліднення після однократного осіменіння худоби, що одержала лікарський засіб для індукування суперовуляції, такий як ЕЗН (фолікулостимулюючий гормон), загальною кількістю в усього лише о 600000 незаморожених відібраних за статевими ознаками сперматозоїдів з використанням цих нових комбінацій ко методів.

Наприклад, у дванадцяти метизованих телиць абердин-ангуської породи викликали суперовуляцію з 60 використанням стандартних методик: з інтервалами в півдня вводили внутрішньом'язово 6, 6, 4, 4, 2,2, 2 та 2Ммг ЕН, починаючи між 9 та 12 днями циклу тічки; з б-ю та 7-ю ін'єкціями ЕН внутрішньом'язовою ін'єкцією вводили 25 та 12,5мг простагландину Е-2 альфа. Сперму від биків з невідомою здатністю до запліднення забарвлювали Ноеспзі 33342, а потім сортували за допомогою поточного цитометра/приладу для сортування клітин МоРіоб), одержуючи 700-800 живих сперматозоїдів кожної статі/сек. Середня чистота сортування становила 65 8996 бажаної статі. Сортовану сперму концентрували до 3,36х109 сперматозоїдів/мл центрифугуванням при 650д протягом 10 хвилин, охолоджували до 52 і зберігали протягом 4год. Потім 184мкл поміщали до пластикових соломинок на 0,25мл; половину кожної дози вводили для осіменіння до кожного рога матки протягом періоду з 20 до 24год. з початку тічки за допомогою автоматичних капсул для перенесення ембріонів з бічним отвором.

Ембріони збирали за стандартними нехірургічними методиками на 7 чи 16 день після тічки. Були одержані аналогічні результати для матеріалу, зібраного на 7 та 16 дні, та для сперми, сортованої за Х- та

У-хромосомами. Були одержані ембріони від 9 телиць. Було 52 ембріони (середнє -4,3--5,3/донора) на нормальних стадіях розвитку, 13 із затримкою розвитку та 31 незапліднена яйцеклітина. Для 46 ембріонів була визначена стать методом РСК з використанням праймерів на специфічну до У-хромосоми ДНК послідовності; з них 43 (9390) мали передбачувану стать. Хоч ці дослідження охоплювали лише кількох тварин, несподівано осіменіння телиць з 70 суперовуляцією загальною кількістю в усього лише 600000 (живих) сортованих за статтю незаморожених сперматозоїдів дало результати, аналогічні до звичайних процедур. Можуть бути здійснені варіації описаної вище процедури, включаючи сортування іншими засобами, ніж поточна цитометрія, інші способи досягнення суперовуляції, інші способи підвищення запліднюваності і т.п., але не обмежуючись ними.

Крім того, поєднання способів сортування сперматозоїдів за статтю на основі вмісту ДНК, високошвидкісних 75 поточних цитометрів/приладів для сортування клітин та процедур осіменіння телиць з використанням загалом менш ніж 500000 сперматозоїдів без погіршення показників запліднюваності призвело до виникнення протягом кількох років ефективної промисловості сортованого за статтю сім'я. Для сперми, сортованою за статтю з точністю 28595 знайдеться множина варіантів застосування. Можливо, найбільш очевидним є осіменіння одного з стад худоби (як молочного, так і м'ясного) для відновлення жіночої частини стада, і осіменіння іншого стада (молочного чи м'ясного) від зовсім інших типів биків для продукування самців на м'ясо. Дуже важливим варіантом вищесказаного є осіменіння телиць сперматозоїдами, що несуть Х-хромосому, для продукування телят жіночої статі, які мають значно нижчі показники дистоції, ніж телята чоловічої статі, в першу чергу через меншій розмір. Крім того, оцінка молодих плідників молочного стада стане набагато ефективнішою з переважанням телиць. Одержання більш ніж 8595 телиць дасть змогу керувати молочними коровами таким чином, су щоб вони мали в середньому протягом життя менш ніж два теляти, що виживають, що є привабливим внаслідок зменшення проблем, асоційованих з вагітністю та пологами. Здійсненними стануть також системи одностатевого і9) продукування яловичини, в яких кожна самка репродукує саму себе і забивається у віці від 2 до З років, завдяки чому значно більший відсоток живильних речовин в системі витрачатиметься на ріст, і меншій відсоток - на підтримку. Сортоване за статтю сім'я буде корисним для запліднення іп міїго та осіменіння корів, підданих «- суперовуляції для перенесення ембріонів. Часто одна із статей телят є значно більш цінною, ніж інша, і хоч існують точні методи добору ембріонів за статтю, вони потребують часу, і половина продукованих ембріонів З належить до менш цінної статі, а тому передбачається, що точно розділене за статевими ознаками сім'я стане Ге) широко використовуватись для штучного осіменіння худоби, якщо надбавка за сортування за статтю буде невеликою, а погіршення показників запліднюваності буде мінімальним. Ймовірно, суттєво зросте доля м'ясної -

Зз5 худоби, що штучно осіменяється сортованим за статтю сім'ям. ї-

Цікаво, що при осіменінні у глибину рога матки можуть бути одержані кращі результати, ніж при осіменінні в тіло матки, як це звичайно робиться при осіменінні. Можливо, несподіваним є також те, що досі досліджені зразки не виявили ніякої різниці між іпсі- та контралатеральним осіменінням при проведенні їх у глибині рога матки. Під глибоким слід розуміти, що введення здійснюють далеко усередину рога матки з використанням « 70 обладнання для перенесення ембріонів. Той факт, що результати при проведенні іпсі- та контралатерального ш

Ган осіменіння суттєво не відрізняються, дав змогу авторам даного винаходу запропонувати використання обох варіантів осіменіння, так що процес ідентифікації відповідного рога матки може бути далі непотрібним. )» Бажаним результатом осіменіння є, звичайно, продукування тварини бажаної статі. Ця тварина може бути продукована з використанням описаних вище систем з використанням вибірок матеріалу сортованої за статтю сперми. Слід також розуміти, що методики за даним винаходом можуть знайти застосування в інших методах, -І таких як лапароскопічне осіменіння, яйцепровідне осіменіння, або подібних методах.

Як приклади, були проведені описані далі експерименти. Хоч не всі з них використовують всі аспекти 7 описаних тут винаходів, вони показують можливі завдяки різним аспектам винаходу поліпшення експлуатаційних

Ге»! показників. Крім того, стислий опис деяких експериментів наведений в |статті "Шегіпе Ногп Іпзетіпайоп ої Неїйегз МУйИ Мегу Гом/ Митреге ої Моп-їтогеп апа Зехей Зрептаїйо2оа", яка згадувалась раніше). Ця стаття е узагальнює деякі дані, що показують ефективність даного винаходу. Що стосується експериментів, один з них був -З проведений з використанням сортованих за статтю незаморожених сперматозоїдів з високими показниками успіху таким чином:

Приклад 1

Телиць абердин-ангуської породи у віці 13-14 місяців, середньої кондиції, синхронізували (узгозджували процеси у часі) за допомогою 25мг простагландину Е-2 альфа з інтервалами в 12 днів і осіменяли через 6-26бгод.

Ф, після появи безперервної тічки. Щойно зібране сім'я від трьох бичків у віці 14-26 місяців інкубували з ЗОМкМ іме) Ноеснві 33342 при 75х105 сперматозоїдів/мл в середовищі ТАЇ Р протягом 1 години при 342С. Сперматозоїди сортували за статевими хромосомами на основі епіфлуоресценції від лазерного збудження на 351 та Зб4інм при 60 потужності 150мВт за допомогою поточного цитометра/приладу для сортування клітин МоРіо Ф, який працював при тиску 345кПа (5Орзі) з використанням як рідини оболонки 2,995 цитрату Ма. Сперматозоїди, що несуть

Х-хромосому (чистота 790906 за результатами перевірки шляхом повторного сортування озвучених аліквот сперми), збирали зі швидкістю 500 живих сперматозоїдів/сек до пробірок Епендорфа на 2мл, які містили 100мкл розріджувача Соптеї! Опімегза! Ехіепдег (СОЕ) з 20965 яєчного жовтка. Зібрані сперматозоїди центрифугували при 65 вОбход протягом 10 хвилин і повторно суспендували в СОЕ з концентрацією 1,63х109 живих сперматозоїдів/мл.

Для контролю використовували рідке сім'я без сортування за статтю; сперму, забарвлену Ноеснпві 33342,

розводили рідиною оболонки до 9х10? сперматозоїдів/мл і центрифугували та повторно суспендували в СОЕ до 1,63х109 стійко рухомих сперматозоїдів/мл. Сортоване за статтю сім'я та рідке контрольне сім'я охолоджували до 59С протягом 75хв. і завантажували до соломинок на 0,25мл (0,184мкл/соломинку). Соломинки транспортували в охолоджувачі для напоїв з регульованою температурою при 3-59 на 240км для осіменіння через 5-9 годин після сортування. Проводили осіменіння сортованим за статтю сім'ям та рідким контрольним сім'ям за допомогою синіх капсул з боковим отвором (ІММ), по половині вмісту кожної соломини до кожного з рогів матки (3Х10? живих сперматозоїдів/телицю). Як стандартний контроль, сім'я від тих самих бичків заморожували у соломинах на 0,5см за стандартними методиками (у середньому 15,6х105 рухомих сперматозоїдів/дозу після відтаювання), то відтаювали при 352С протягом Збсек та проводили осіменіння в тіло матки. Процедури розподіляли між З бичками та 2 запліднювачами у співвідношенні 3:2:2 запліднювань для сортованого за статтю сім'я та двох контролів.

Вагітність визначали ультразвуковими методами через 31-34 дні після осіменіння і підтверджували через 64-67 днів, коли визначали також стать плода (всліпу). Дані наведені в таблиці. і 2. Щ , , 2,

Співвідношення статей для величин з різними індексами відрізняються (Р «0,02).

Хоч показник вагітності для сортованого за статтю сім'я становив всього 8095 від контролів, ця різниця не була статистично значущою (20,1). По одній вагітності було втрачено до дня 64-67 в групах з сортованим за статтю та замороженим контрольним сім'ям; 18 з 19 плодів (9595) в групі з контролем статі були жіночої статі, сч і 20 з 30 (6795) були жіночої статі в контрольних групах. Рідке контрольне сім'я дало по суті ідентичні показники вагітності із замороженим контрольним сім'ям, яке містило більш ніж в 50 разів більше рухомих (Фо) сперматозоїдів (загальна кількість сперматозоїдів вище в більш ніж 120 разів), що демонструє ефективність осіменіння низькими дозами при введенні в ріг матки. Використовуючи технологію поточної цитометрії та штучне осіменіння, автори значно змінили співвідношення статей у худоби. «-

Аналогічно був проведений експеримент з несортованими за статтю незамороженими сперматозоїдами, до якого додається такий звіт: «І

Приклад 2 «со

Метою було визначення показників вагітності при осіменінні телиць з використанням надзвичайно низької кількості замороженої сперми за ідеальних польових умов. Сім'я від трьох биків голштинської породи із і - здатністю до запліднювання вище середньої розводили у гомогенізованому молоці, 7906 гліцериновому чн розріджувачі (С55) плюс 596 гомологічної сім'яної плазми до загальної кількості 2х10 У, 5х10? чи 10х105 (контроль) сперматозоїдів на французьку соломину (Егепсп вігаму) на 0,25мл і заморожували в течії парів рідкого азоту. Сім'я відтаювали у воді при 379 протягом 20сек. Телицям голштинської породи у віці 13-15 місяців вагою 350-450кг робили двічі ін'єкції по 25мг простагландину Е-2 альфа (і цаіузеФ) з інтервалом в 12 « 70 днів та осіменяли за допомогою шприця-соломини для перенесення ембріонів та капсули з бічним отвором, ш

Гані вводячи половину сім'я глибоко до кожного рога матки через 12 чи 24год після виявлення тічки. Експеримент проводили з п'ятьма паралельними дослідами протягом 5 місяців, і розподіляли між двома )» техніками-запліднювачами. Навколишня температура при осіменінні становила часто від -10 до -202С, тому були прийняті міри з утримання обладнання для осіменіння у теплі. Вагітність визначали шляхом виявлення життєздатного плода за допомогою ультразвуку на 40-44 день після тічки і підтверджували на 55-62 день після - І тічки; 4 з 202 зачать було втрачено за цей проміжок часу. Показники вагітності для днів 55-62 становили -1 55/103 (5395), 71/101 (7095) та 72/102 (7195) для 2х10 5, 5Х102 та 10х105 загальної кількості сперматозоїдів/осіменіння (Р «0,1). Показники вагітності були різні (Р«0,05) поміж биків (59, 62 та 7495). але не (о) між техніками (64905 та 6595) чи часом осіменіння після тічки (6595 для 12 год. та 6495 для 24 год., М-153 для їх 50 кожного часу). Для описаних методів показники вагітності у телиць були однаковими при використанні загалом

БХ105 та 10Хх109 сперматозоїдів на осіменіння. "-ь Був також проведений експеримент з сортованими за статтю незамороженими сперматозоїдами, до якого надається такий звіт:

Приклад З 29 Збирали сім'я від биків АМапіїс Вгеедегз Соорегаїїме, розводили 1:4 розріджувачем з буфером НЕРЕЗ ж 0,196

ГФ) ВЗА, і транспортували за 1б0Окм (-2год.) до міста ВеїївмШе, Магуїапа, де його сортували при температурі навколишнього середовища методом поточної цитометрії до розріджувача для збирання сперми ТЕ5Т (2095) з о використанням описаних раніше методів (Віо!. Бергод., 41:199). Були досягнуті швидкості сортування до 2х10 9 сперматозоїдів кожної статі за 5-бгод. при чистоті -9095. Сперматозоїди концентрували центрифугуванням (30049 бо протягом 4хв.) до 2х10 У сперматозоїдів/мл. Деяку частину сперматозоїдів сортували до розріджувача, який містив гомологічну сім'яну плазму (кінцева концентрація 595). Сортовані сперматозоїди транспортували повітрям до Колорадо (-2600км) і зберігали при температурі навколишнього середовища або при 52С (під час перевезення протягом бгод. охолоджували в пристрої Едиїаіпег або в ізольованому пристрої з відділом для льоду). Телиць чи ялових корів, у яких було виявлено тічку протягом періоду від 11 до Збгод. перед цим, осіменяли протягом бо періоду з 9 до 29год. після закінчення сортування сперми. Сперматозоїди (від 1 до 2х10 5 в О,Тмл) вводили глибоко до рога матки іпсілатерально щодо яєчника з найбільшим фолікулом, який було визначено ультразвуком під час осіменіння.

Жодна з 10 самиць не завагітніла після осіменіння сперматозоїдами, які перевозились та зберігались при температурі навколишнього середовища. З 29 самиць, запліднених спермою, охолодженою до 59 під час перевезення. 14 були вагітними на 4-му тижні вагітності, і 12 (4195) на 8-му тижні. Одинадцять з 22, запліднених протягом 1Огод. після закінчення сортування, були вагітними на 8-му тижні, але лише 1 з 7, запліднених протягом 17-24год. після сортування, була вагітною. Додавання сім'яної плазми не давало значного ефекту. Один з 12 плодів не належав до передбачуваної статі, один мав невідому стать, і 10 мали передбачувану 70 стать, як було визначено ультразонографією на 60-70 день вагітності.

Після цього додатково 33 телиць осіменяли з введенням 0,05мл матеріалу (сім'я розріджували, як описано вище) до кожного рога матки без використання ультразонографії; лише З були вагітними Через 4 тижні після осіменіння, і лише 1 залишилась вагітною до 8-го тижня. Однак, були використані різні бики з попередньої групи, і всі осіменіння здійснювались протягом періоду 18-29год. після сортування. Аналогічно були запліднені 75 Ще З8 телиць (-22год. після сортування) за 200км від нашої лабораторії з використанням сортованої сперми від іншого бика; жодна з них не була вагітною через 8 тижнів після осіменіння.

Підсумовуючи, можливо викликати вагітність у худоби шляхом штучного осіменіння з використанням сперми, сортованої за статевими хромосомами методом поточної цитометрії, причому співвідношення статей плодів наближається до показників, передвіщуваних повторним аналізом сортованої сперми на вміст ДНК (9095). Однак, показники запліднюваності сильно змінювались в цих попередніх експериментах, які вимагали транспортування сперми на великі відстані. Запліднюваність різко знижувалась до 17-ї год. після сортування, але при цьому були певні непорозуміння, оскільки в різний час використовували різних биків. Потрібні подальші дослідження для визначення того, чи були спостережувані варіації спричинені відмінностями між биками, методиками осіменіння, періодом часу між сортуванням та осіменінням чи іншими факторами. с

Зрештою, був проведений також експеримент з несортованими за статтю незамороженими сперматозоїдами, до якого додається такий звіт: о

Приклад 4

Метою було визначення показників запліднюваності при осіменінні телиць дуже низькою кількістю сперматозоїдів за ідеальних умов проведення експерименту. Сім'я від трьох биків голштинської породи розводили -с че розріджувачем Согпеії! МОпімегва! Ехіепдег плюс 5905 гомологічної сім'яної плазми до 1х10 5 чи 2,5х105 « сперматозоїдів на 0,їмл; як контроль використовували вибірки із загальною кількістю сперматозоїдів 2,5х105 на

О,25мл. Повністю розріджене сім'я спаковували до модифікованих пластикових французьких соломин (Егепсп (Се) вігамл'в) на 0,25мл для введення запліднювальних доз по 0,1 чи 0,25мл. Сім'я охолоджували до 5 с і їм використовували через 26-57год. після збирання. Телицям голштинської породи у віці 13-15 місяців з вагою

Зо 350-45О0кг робили ін'єкції простагландину Е-2 альфа (І шаїузеФ) з інтервалом в 12 днів і запліднювали за в. допомогою шприця-соломини для перенесення ембріонів та капсули з бічним отвором в один ріг матки через 24год. після виявлення тічки. Осіменіння проводили іпсілатерально до того боку, де знаходився найбільший фолікул, як було визначено ультразвуком через 12год. після початку тічки; бік овуляції перевіряли шляхом « виявлення жовтого тіла ультразвуком на 7-9 день після тічки. Вагітність визначали виявленням плода ультразвуком на 42-45 день після тічки. Експеримент проводили з чотирма паралельними дослідами і розподіляли З с між трьома техніками-запліднювачами. Бік овуляції визначили вірно у 205 з 225 телиць (9195); несподівано, у» показники запліднюваності для іпсілатерального та контралатерального осіменіння були майже ідентичними.

Показники запліднюваності становили 38/93 (41905), 45/87 (5290) та 25/45 (5695) для 1х10 5, 2,5Х109 та 2,5Х105 сперматозоїдів/осіменіння (Р 20,1). Спостерігалась значуща різниця в показниках запліднюваності (Р «0,05) для різних техніків, але не для різних биків. При використанні описаних методів може бути можливим зменшення - кількості сперматозоїдів на осіменіння в достатній мірі для того, щоб сперма, сортована за статтю за -І допомогою поточного цитометра, знайшла промислове застосування.

Як згадувалось і як можна побачити з різних експериментів, ця область техніки має статистичний характер,

Фо а тому можуть бути проведені різноманітні додаткові експерименти для виявлення стратегії створення належних ї» 20 комбінацій та обмежень. Таким чином будуть ідентифіковані синергічні ефекти між різними факторами, як, наприклад, можуть бути досліджений вплив барвника та поєднання впливу барвника та лазерного збудження. ть Включений до даної заявки опис має слугувати основним описом. Читач повинен розуміти, що конкретний опис не може повністю охопити всі можливі варіанти використання; багато альтернатив залишаються домислюваними.

Він не може також повністю розкрити узагальнюючий характер винаходу і не може вичерпно показати, як кожна 22 ознака чи елемент може в дійсності представляти ширшу функцію чи більшу різноманітність альтернативних чи

ГФ) еквівалентних елементів. Вони також безумовно включені до цього опису. Там, де винахід описаний з використанням пристрій-орієнтованої термінології, мається на увазі, що кожен елемент пристрою виконує певну о функцію. Описаного приладу стосуються не лише пункти формули, в яких заявляється апарат, але й пункти формули на спосіб чи процес можуть бути використані для опису функцій, які виконує винахід та кожен елемент. 60 Ні опис, ані термінологія не мають обмежувати обсяг пунктів формули, які можуть бути подані для розгляду.

Слід розуміти, що різноманітні зміни можуть бути зроблені, не відхиляючись від суті винаходу. Такі зміни також безумовно включені до опису. Всі вони входять до обсягу даного винаходу. Даний опис охоплює широкий діапазон, як явним чином описаний варіант(и) втілення, так і різноманітні неявні альтернативні варіанти втілення, а також широкий опис способів та процесів і т.п. бо Крім того, кожен з різних варіантів винаходу та пунктів формули може також бути здійснений різними способами. Цей опис слід розуміти як такий, що охоплює кожну таку варіацію, чи то варіація у будь-якому варіанті втілення апарата, у варіанті втілення способу чи процесу, або просто у варіанті втілення будь-якого їх елемента. Зокрема, слід розуміти, що там, де опис стосується елементів винаходу, терміни, використані для

Кожного елемента, можуть бути виражені еквівалентними термінами, що стосуються апарата чи методу - навіть тоді, коли лише функція чи результат залишаються незмінними. Такі еквівалентні, ширші чи навіть узагальнюючі терміни мають вважатись такими, що є охопленими описом кожного елемента чи функції. Такі терміни можуть бути проставлені там, де є бажаним виразити явним чином узагальнено широкий опис, на який претендує даний винахід. Як всього лише один приклад вкажемо, що слід розуміти, що всі дії можуть бути виражені через засіб /0 для здійснення цієї дії чи через елемент, що спричинює цю дію. Аналогічно, кожен описаний фізичний елемент слід розуміти як такий, що охоплює опис дії, яку здійснює даний фізичний елемент. Один лише приклад цього аспекту - опис "збірника" слід розуміти як такий, що охоплює опис акту "збирання" - описаний він у явній формі чи ні - і, навпаки, якщо наведено лише опис акту "збирання", цей опис слід розуміти як такий, що охоплює опис "збірника". Такі заміни та альтернативні терміни слід розуміти як такі, що включені до опису в явній формі. Крім того, слід розуміти, що на додаток до початково представлених пунктів формули, пункти формули можуть бути змінені для більш широкого охоплення принаймні: ї) розкритих та описаних тут пристроїв; ї) розкритих та описаних тут споріднених способів; ії) аналогічних, еквівалентних, і навіть виражених у неявній формі варіацій кожного з цих пристроїв та способів; ім) тих альтернативних конструкцій, які виконують кожну з розкритих та описаних тут функцій; М) тих альтернативних конструкцій та способів, які виконують кожну

З тих функцій, що є у неявній формі потрібними для здійснення того, що є розкритим та описаним; мі) кожної ознаки, компонента і стадії, які описано як окремі та незалежні винаходи; і мії) різних комбінацій та змін всього вищевказаного.

Різноманітні опубліковані праці можуть бути корисними для допомоги у розумінні винаходу. Вони перелічені нижче і включені сюди за посиланням; однак, в тому ступеню, в якому цей перелік може вважатись несумісним з с г патентуванням цього/цих винаходу (винаходів), ці посилання явним чином мають вважатись такими, що не були зроблені заявником (заявниками). Потенційно корисні посилання включають: патенти Сполучених Штатів Америки о);

МоМо 5660997, 5589457, 5514537, 5439362, 5346990, 5135759, 5021244, 4999283, 4749458, 4698142, 4680258, 4511661, 4448767, 4362246, 4339434, 4276139, 4225405, 4191749, 4155831, 4092229, 4085205, 4083957, 4067965, 4009260, 3894529, 3687806, КЕ32350. Корисні посилання можуть також включати такі публікації: | Іпзетіпайоп «- зо ої Ноївівіп Неїїеге МУУййп Мегу Гом/ Митбреге ої Опітолеп Зрептафогоа", О.Е.бЗеїде!ї, Ог., С.Н.АйПеп, 7.Вгіпк,

У.К.Огайат апа М.В.СацНеї, Соіогадо Зіаїе Опімегейу, Богі СоПШпз, АЙапійс Вгеедеге Соорегаїме, «

І апсазіег, РА, ОО Оіагу, Іомеїапа, СО, Ошу 1995; "Агійісіаї Іпвзептіпайоп МУйи Х- апа МУ-Бреагіпд Боміпе Ге зврегт", О.Е.Зеїдеії, г, Г.АЛоппзоп, С.А.АМеп, сС.МК.МУеісР, М.О.НоМапа, 2.В'пК апа М.В.СацеїЇ, Апітаї

Кергодисіоп апа ВіоїесппоіЇоду І арогаюгу, СоЇогадо Біаїе Опімегейу, Рог Соїпв, СО; Септріазт апа Сатеїйе ї-

Рпузіоїсду Га, АКБ, ОБОА, ВеїївмШе, МО; Айапіїс Вгеедеге Соорегаїїме, І апсазіег, РА; ШО Оіагу, І омеіапа, ї-

СО, ОА дапцагу 1996; "Іпвептіпайоп ої Ппейеге м/ййп мегу Юм/ питбреге ої їогеп зрегтафогоа", О.Е.Зеїдеї, Ог.,

С.Н.АШеп, 2.Вгіпк, М.О.Нойапа апа М.В.Сайцеїї, Соіогадо З(афїе ОМпімегейу, Рог Соїіпз, АйЙапіїс Вгеедеге

Соорегаїїме, І апсазіег, РА, ОО Оіагу, І омеїапа, СО, Ошу 1996; "Ргодисіоп ої Іатре ру Іом/ дозе іпігашіегіпе

Іпзетіпайоп мій ПЙом/ суїотеїгісайу вогпей апа пзопйей зветеп, О.Об.Стап, МУ.А.С.МесКеїмеу, М.Е.Кіпа, «

О.Р.ЮоЇтап, Т..МесЕмосу, Р.).Вгоадрепі апа 9.).Кобріпзоп, Мавіегсаїї, Стгаібвіопе, Вискебрішгп, АБрегдееп, АВ21 шв с ОТМ, ОК, Зсойцізпй Аадгісийига! СоІеде, Стаірвіопе, ВисКебигп, Арегдееп, АВ21 УМА, ШК, ТНегіодепоіоду, р.267; "(ХЖегіпе погп іпзетіпайопе ої Нейеге м/йй мегу м питбреге ої попітолеп апа зехей зрептай(ог2оа", О.Е.Зеїаеї, )» Уг., С.Н.АЙШеп, ГО.А.оппзоп, М.О.НойПапа, 72.ВгіпК, с.К.УУеЇсн, 9У.К.Сгапат апа М.В.СацеїЇ, Апіта! Кергодисіоп апа Віоїесппоіоду І арогаїогу, Соіогадо Зіаїе Опімегейу, АЙМапіїс Вгеедегз Соорегаїме, І апсазіег, РА 17601,

Септріазт апа Сатеїйе РПузіоіоду І арогаїогу АК5, ОБОА, ВеїївмШе, МО 20705, ШО Оіагу, І омеїапа, СО 80538, -І Тпегіодепоіоду, 48: 1255-1264, 1997; "Сарасйцайоп ої Броміпе зрегпт Бу Перагіп", 9.9У.Раїтівй, 9.БизКо-Раїтівй,

М.А.М/іпег апа М..Рігвї, ЮОерагітепі ої Меаї апа Апіта! Зсіепсе, Опімегейу ої МУівсопвіп, Мадізоп, УМ! 53706,

Ш- Віоосду ої Кергодисіоп, 38, 1171-1180 (1988); "Рговіадіапапй Б2а - А Тепйййу агод іп ааігу сашШе?",

Ге» К.С.Мастійап апа А.М.Оау, КиаКига Апіта! Кезеагсп 5іайоп, РгіїмаСе Вад, Натійоп, Мем/ 7еаїапа, 5о Тпегіодепоіоду, Зеріетрег 1982, моЇ.18, Мо.З, рр.245-253; "Ргозресів ог зехіпд таттаїап врегт", Соіогадо ве Аззвосіагє(й Опімегейу Ргевзв, Апіта! Кергодисіоп Іарогаїогу, СоМПеде ої Мейегіпагу Меадісіпе апа Віотедісаї шк Зсіепсез, СоЇогадо біафе Опімегейу, Рог Соїпв, СО 80523, едйей ру Кирегі Р. Аттап апа Сеогде Е. Зеїаеї, г, 1982; "ЕПЧесів оїедд-усікК-суїгабе апа тік ехіепдег оп о сПпготаййп вігисішге апа хміарійу ої сгуоргезегумей Би врегт", 9. Оіагу Зсі., 74:3836, О.5.Кагаріпиз та О.Р.Емепвоп апа М.Т.Каргоїй; "Аззезвтепі дв ої тат апа ороаг зрегтайлоа дигіпуо сей-зопіпо Бу Йому сутену, Кергод. Оот. Апіт., 32:251; "Бирегоуціайоп ої доаїв м/йй ригйей рЕБН зирріетепієй м/йй деїіпедй атоипів ої рі Н", Тпегіо., 43:797,

Ф) М.А.МомузНагі, 9.Е.ВесКегз апа МУ.НойУ; "Сепадег ргезеіесіоп іп таттаіІв: Ап омегміем, Оівсп. (егагаі|. ка Уувспг, 103:285, Г.А .доппзопі.

В усьому цьому описі, якщо з контексту не випливає інше, слово "включати" або його варіанти, такі як бо Включає" чи "такий, що включає", слід розуміти як припущення щодо включення вказаного елемента чи одиниці або групи елементів чи одиниць, але не як виключення будь-якого іншого елемента чи одиниці або групи елементів чи одиниць.

Claims (38)

Формула винаходу б5

1. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин, що включає джерело клітин, яке подає клітини для аналізу вказаним поточним цитометром, джерело рідини оболонки, що створює для вказаних клітин рідке середовище оболонки, яке містить приблизно 2,9 95 цитрату натрію, патрубок, крізь який проходять вказані Клітини під час подачі до них рідинного середовища оболонки, осцилятор, який діє на вказану рідинну оболонку, коли вона проходить крізь вказаний патрубок, систему аналізу клітин, яка реагує на вказані клітини, систему поділяючого сортування, яка здійснює сортування клітин, що мають бажані характеристики, і збірник, до якого поміщаються клітини, що мають бажані характеристики.

2. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за п. 1, яка відрізняється тим, що джерелом /о згаданих клітин є клітини бичачих сперматозоїдів.

3. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за п. 2, яка відрізняється тим, що вказаний патрубок, осцилятор, система аналізу клітин та система поділяючого сортування є частиною системи протокового цитометра, а вказана система протокового цитометра містить поточний цитометр для сортування вказаних сперматозоїдів зі швидкістю принаймні 500 подій сортування за секунду.

4. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за п. 1, яка відрізняється тим, що джерелом вказаних клітин є клітини, які є надчутливими до хімічної композиції в навколишньому рідинному середовищі.

5. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за п. 1, яка відрізняється тим, що вказаний збірник використовують для забезпечення низької дози сперматозоїдів.

6. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за п. 5, яка відрізняється тим, що вказаний 2о патрубок, осцилятор, система аналізу клітин та система поділяючого сортування є частиною системи протокового цитометра, а вказана система протокового цитометра містить протоковий цитометр для сортування вказаних сперматозоїдів зі швидкістю принаймні 500 подій сортування за секунду.

7. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин, яка включає джерело клітин, яке подає клітини для аналізу протоковим цитометром, джерело рідини оболонки, яке створює рідинне середовище с г оболонки для клітин, яке містить пПерез-буферизоване середовище, патрубок, крізь який проходять вказані клітини під час подачі до них рідинного середовища оболонки, осцилятор, який діє на вказану рідинну оболонку, іо) коли вона проходить крізь вказаний патрубок, систему аналізу сперматозоїдів, яка реагує на вказані клітини, систему поділяючого сортування, яка здійснює сортування клітин, що мають бажані характеристики, і збірник, до якого поміщаються клітини, що мають бажані характеристики. «- зо

8. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за п. 7, яка відрізняється тим, що джерелом вказаних клітин є клітини кінських сперматозоїдів. «

9. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за п. 7, яка відрізняється тим, що джерелом Ге вказаних клітин є клітини, які є надчутливими до хімічної композиції в навколишньому рідинному середовищі.

10. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за п. 7, яка відрізняється тим, що вказаний ї- збірник використовують для забезпечення низької дози сперматозоїдів. ї-

11. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за п. 10, яка відрізняється тим, що вказаний патрубок, осцилятор, система аналізу клітин та система поділяючого сортування є частиною системи протокового цитометра, а вказана система протокового цитометра містить протоковий цитометр для сортування вказаних сперматозоїдів зі швидкістю принаймні 500 подій сортування за секунду. «

12. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин, яка включає джерело клітин, яке подає шв с клітини для аналізу протоковим цитометром, джерело рідини оболонки, яке створює рідинне середовище оболонки для вказаних клітин, патрубок, крізь який проходять вказані клітини під час подачі до них рідинного )» середовища оболонки, осцилятор, який діє на вказану рідину оболонки, коли вона проходить крізь вказаний патрубок, систему аналізу клітин, яка реагує на вказані клітини, систему поділяючого сортування, яка здійснює Сортування вказаних сперматозоїдів, що мають бажані характеристики, і збірник, до якого поміщаються клітини, -І що мають бажані характеристики, що включає цитратну рідину для збирання, яка містить приблизно шість відсотків яєчного жовтка. Ш-

13. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за п. 12, яка відрізняється тим, що джерело Ге» рідини оболонки містить розчин приблизно 2,9 95 цитрату натрію.

14. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за будь-яким з пп. 12 або 13, ве яка відрізняється тим, що джерелом вказаних клітин є клітини бичачих сперматозоїдів. -М

15. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за п. 12, яка відрізняється тим, що джерелом вказаних клітин є клітини, які є надчутливими до хімічної композиції в навколишньому рідинному середовищі.

16. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за п. 12, яка відрізняється тим, що вказаний дв Збірник використовують для забезпечення низької дози сперматозоїдів.

17. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за п. 16, яка відрізняється тим, що вказаний іФ) патрубок, осцилятор, система аналізу клітин та система поділяючого сортування є частиною системи протокового ка цитометра, а вказана система протокового цитометра містить протоковий цитометр для сортування вказаних сперматозоїдів зі швидкістю принаймні 500 подій сортування за секунду. 60

18. Система протокового цитометра для ізоляції клітин, яка включає джерело клітин, яке подає клітини для аналізу вказаним протоковим цитометром, джерело хімічно модифікованої рідини оболонки, що створює рідинне середовище оболонки для вказаних клітин, яке вибирають таким чином, щоб воно узгоджувалось з рідинним середовищем клітин як перед, так і після сортування, патрубок, крізь який проходять вказані клітини під час подачі до них рідинного середовища оболонки, осцилятор, який діє на вказану рідину оболонки, коли вона б5 проходить крізь вказаний патрубок, систему аналізу клітин, яка реагує на вказані клітини, систему поділяючого сортування, яка здійснює сортування вказаних видів клітин, що мають бажані характеристики, і збірник, до якого поміщаються клітини, що мають бажані характеристики.

19. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за п. 18, яка відрізняється тим, що вказане рідинне середовище клітин як перед, так і після сортування містить хоча б одну надчутливу хімічну композицію, ДО якої вказані клітини є особливо чутливими і в якій джерело хімічно модифікованої рідини оболонки зводить до мінімуму зміни вказаної надчутливої хімічної композиції.

20. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за п. 19, яка відрізняється тим, що вказана надчутлива хімічна композиція містить метаболічну хімічну композицію.

21. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за п. 19, яка відрізняється тим, що вказана /о надчутлива хімічна композиція містить цитрат.

22. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за п. 21, яка відрізняється тим, що вказане джерело хімічно модифікованої рідини містить розчин приблизно 2,9 9о цитрату натрію.

23. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за п. 22, яка відрізняється тим, що джерелом вказаних клітин є клітини бичачих сперматозоїдів.

24. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за п. 23, яка відрізняється тим, що вказаний збірник застосовують для забезпечення штучного осіменіння сперматозоїдами.

25. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за п. 23, яка відрізняється тим, що вказаний збірник використовують для забезпечення низької дози сперматозоїдів для штучного осіменіння.

26. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за п. 19, яка відрізняється тим, що вказане 2о джерело клітин містить невідновлювані клітини.

27. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за п. 26, яка відрізняється тим, що вказане джерело клітин містить клітини з нездатною до транскрипції ДНК.

28. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за п. 26, яка відрізняється тим, що вказане джерело клітин містить клітини з нездатною до реплікації ДНК. сч

29. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за п. 26, яка відрізняється тим, що джерелом вказаних клітин є клітини сперматозоїдів. іо)

30. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за п. 29, яка відрізняється тим, що вказаний збірник використовують для забезпечення низької дози сперматозоїдів.

З1. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за п. ЗО, яка відрізняється тим, що вказана - пд Зо Низька доза сперматозоїдів містить не більш ніж приблизно десять відсотків від дозування, вибраного з групи, що містить один мільйон бичачих сперматозоїдів, десять мільйонів бичачих сперматозоїдів та сто мільйонів « кінських сперматозоїдів. Ге

32. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за п. ЗО, яка відрізняється тим, що вказані сперматозоїди містять бичачі сперматозоїди, і вказана низька доза сперматозоїдів містить дозу менш ніж в. приблизно п'ятсот тисяч бичачих сперматозоїдів. ї-

33. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за п. ЗО, яка відрізняється тим, що вказані сперматозоїди містять бичачі сперматозоїди, і вказана низька доза сперматозоїдів містить дозу менш ніж приблизно триста тисяч бичачих сперматозоїдів.

34. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за п. ЗО, яка відрізняється тим, що вказані « сперматозоїди містять кінські сперматозоїди, і вказана низька доза сперматозоїдів містить дозу менш ніж шв с приблизно десять мільйонів сперматозоїдів.

35. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за будь-яким з пп. 19 або 31, )» яка відрізняється тим, що вказане джерело клітин містить бичачі сперматозоїди.

36. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за п. 19, яка відрізняється тим, що вказане джерело клітин містить кінські сперматозоїди. -і

37. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за п. 18, яка відрізняється тим, що вказане джерело створює вказане рідинне середовище перед сортуванням клітин та що вказаний приймач створює це. вказане середовище після сортування клітин. Ф

38. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за п. 18, яка відрізняється тим, що вказане 5р джерело клітин містить клітини, які є надчутливими до хімічної композиції в рідині оболонки. щ» - Ф) іме) 60 б5