JP2013059321A - 標的核酸の検出方法及びそれに用いるキット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】前記標的核酸に予め関連付けられた検出用プローブとハイブリダイズするタグ配列を備え、前記標的核酸に由来する増幅産物と、目視で視認可能な標識物質と前記増幅産物の一部とハイブリダイズする標識用配列とを備える標識用プローブと、前記検出用プローブを固相担体上に備えるアレイと、を用い、前記アレイにおける前記増幅産物と前記検出用プローブとをハイブリダイズ可能に接触させる第1のハイブリダイゼーションと、前記標識用プローブと前記増幅産物とをハイブリダイズ可能に接触させる第2のハイブリダイゼーションとを実施するハイブリダイゼーション工程と、前記第1のハイブリダイゼーションと前記第2のハイブリダイゼーションとによるハイブリダイズ産物を前記標識物質で検出する工程と、を備えるようにする。
【選択図】なし
Description
(1)ハイブリダイゼーションの効率化(迅速化)
(2)ラベリング(標識用プローブとのハイブリダイズ)の効率化
(3)検出感度の高度化
(4)工程の簡略化(迅速化)−特に二重鎖を一本鎖とする変性工程の省略による
本明細書に開示される標的核酸の検出方法は、標的核酸に予め関連付けられた検出用プローブとハイブリダイズするタグ配列を備え、標的核酸に由来する増幅産物と、目視で視認可能な標識物質と前記増幅産物の一部とハイブリダイズする標識用配列とを備える標識用プローブと、前記検出用プローブを固相担体上に備えるアレイと、を準備し、用いることができる。なお、本検出方法は、公知の種々のハイブリダイゼーション手法に適用される。例えば、平板状の固相担体にドット状の固定化領域がマトリックス状等に配置されたアレイを標識プローブや増幅産物を含むハイブリダイズ媒体に全体を浸漬して行うハイブリダイゼーション(以下、液中型ハイブリダイゼーションともいう。)に適用される。また、平板状の固相担体にストリーム状(帯状)等各種形態の固定化領域が配置されたアレイの一部に移動相でもあるハイブリダイズ媒体を供給して、アレイに対して所定の方向性で移動相を展開させて行うアフィニティークロマトグラフィーにおけるハイブリダイゼーション(以下、展開型ハイブリダイゼーションともいう。)にも適用される。以下、アレイ、増幅産物及び標識用プローブの順に説明する。
アレイは、標的核酸と予め関連付けられた検出用プローブの複数個の固定化領域を固相担体上に備えている。本アレイの形状やサイズは特に限定されないで、公知の各種形状やサイズとすることができる。アレイは、公知の種々のハイブリダイゼーションに応じた形態とされる。アレイを、液中型ハイブリダイゼーションに適用する場合、アレイは、アレイ一つにつき1ml以下の液中型ハイブリダイゼーション可能な程度の固有の形態を有している。すなわち、本アレイは、こうした固有の形態(サイズ及び形状)の固相担体を備えていることが好ましい。また、展開型ハイブリダイゼーションに適用する場合には、少なくとも、検査や研究用に汎用されているエッペンドルフチューブ(商標)のようなマイクロチューブに供給されるハイブリダイゼーション溶液に対してアレイの端部が浸漬可能なサイズ(幅方向)及び形状を備えていることが好ましい。好ましくは、この種のチューブの底部近傍から上端までに収容可能な部位を備える長尺体である。アレイは、どのように準備されてもよく、商業的に入手してもよいが、本検出方法は、アレイを準備するためのアレイ作製工程を備えていてもよい。
アレイは、固相担体上に標的核酸と予め関連付けられた検出用プローブを保持している。検出用プローブは、検出を容易にするため、通常、所定の形状の固定化領域を形成するように保持されている。検出用プローブは、検出する対象や検出手法、あるいは標的核酸の検出システムに応じて適宜選択される。例えば、感染症等の感染原因菌の菌種(型)判定には、複数の検出用プローブに対するハイブリダイゼーションによって検出する。変異の検出にあたっては、一つの変異に対して1又は複数の検出用プローブの固定化領域を対応させてもよい。
アレイは、固相担体上に、複数の固定化領域の他に検出シグナルによる発色見本領域を別途備えることができる。こうした発色見本領域を備えることで、アレイが小スケール化されていても、また、目視によるシグナル判別によっても、検出精度及び正確性を確保することができる。発色見本領域は、後述するシグナル付与工程で付与するシグナルの発色見本であり、シグナルに応じた色調、明度や彩度をもって、予め付与されている。すなわち、検出方法を通じて維持できるように付与されている。発色見本領域は、インクによって、付与されており、好ましくは、固相担体への定着性や反応性を考慮して顔料インクが用いられる。こうしたインク類は、典型的には、オリゴヌクレオチドプローブを固相担体に付与して固定化領域を形成するときと同様の手法(例えば、ピエゾ素子によるインクジェット手法)で、固相担体に付与されている。そして、発色見本領域は、対比観察上の要請から、固定化領域と同様のサイズと形状で、固相担体上に付与されていることが好ましい。さらに、発色見本領域は、固定化領域におけるシグナルと対比観察がしやすいように、固定化領域に隣接して形成されていることが好ましい。
アレイは、複数個の固定化領域からなる区画の外部にハンドリング部位を備えることができる。ハンドリング部位を有することで、小さいアレイであってもハンドリングを確実にするとともに、一定の方向性でアレイを取り扱うことが可能となり、実験精度ないし検出精度を高め、シグナル検出も容易化することができる。ハンドリング部位としては、典型的には、固相担体上の固定化領域や発色見本領域が形成されていないマージン領域を適用することができる。また、ハンドリング部位をアレイの一部、例えば、方形状シートの一端部(特に一方の短縁部)に設けることで、アレイの取り扱いに便利であるほか、アレイを容易に一定の方向性を維持して各種操作を実施できる。ハンドリング部位には、アレイを個別に識別するための検体識別情報を付与することが可能であり、予めこうした検体識別情報を、インク等に付与されていてもよい。検体識別情報は、数字、記号、文字又は図形、これらの組み合わせであってよい。
増幅産物は、試料中の標的核酸に由来して、核酸増幅反応により取得される産物である。核酸増幅反応としては、公知の各種の反応が利用できる。例えば、各種手法によるPCRのほか、LCR、SDA、ICAN等が挙げられる。増幅産物は、どのように準備されてもよいが、本検出方法は、増幅産物を準備するための増幅工程を備えていてもよい。
第1のプライマーは、標的核酸に予め関連付けられた検出用プローブに相補的なタグ配列と標的核酸中の第1の塩基配列を識別する第1の識別配列とを含んでいる。これらの塩基配列の長さ等は特に限定されず、標的核酸の標的配列の内容に応じて適宜決定される。
第1の識別配列は、核酸増幅により、標的核酸を増幅するための配列であり、標的核酸中の標的配列の一部を構成する第1の塩基配列と特異的にハイブリダイズできる。第1の識別配列は、第1の塩基配列と高い選択性でハイブリダイズ可能な程度に相補的に設定される。好ましくは完全に相補的(特異的)に設定される。
タグ配列は、タグ配列は、増幅断片が検出用プローブとハイブリダイゼーションを可能とするための配列であり、標的核酸を検出するものであるため、標的核酸毎に検出用プローブの検出用配列にハイブリダイズ可能に設定される。典型的には、検出用配列に相補的な塩基配列となっている。したがって、一つの標的核酸は、一つの検出用プローブに対応付けられることになる。タグ配列の塩基長は、既に説明したように、好ましくは検出用プローブの検出用配列の塩基長に一致し、好ましくは、20塩基以上50塩基以下であり、より好ましくは、20塩基以上25塩基以下である。
タグ配列を有するプライマーの一部と第1の識別配列を有するプライマーの他の一部とは直接連結されることはなく、これらの間には連結部位を有している。連結部位は、鋳型鎖に含まれたとき、DNAポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な部位である。DNAポリメラーゼ反応は、鋳型となる核酸(ないし塩基)がないとそれ以上DNA鎖を伸長しないとされている。このため、本発明の連結部位は、DNAポリメラーゼによるDNA伸長時の鋳型となりえない構造を有している。すなわち、本連結部位は、天然塩基又は天然塩基と対合する天然塩基の誘導体(天然塩基等)を含まない。
5’−O−CmH2m−O−3’ 式(1)
(式中、5’は、5’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、3’は、3’側のリン酸ジエステル結合のリン酸原子を表し、mは2以上40以下の整数を表す。)
5’−(OCnH2n)l−v3’ 式(2)
(式中、5’は、5’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、3’は、3’側のリン酸ジエステル結合のリン酸原子を表し、nは2以上4以下の整数を表し、lは、2以上の整数であって、(n+1)×lは40以下となる整数を表す。)
図2に示すように、第2のプライマーは、標的核酸中の第2の塩基配列を識別する第2の識別配列を含んでいる。これらの塩基配列の長さ等は特に限定されず、標的核酸の標的配列の内容に応じて適宜決定される。
第2の識別配列は、核酸増幅により、第1のプライマーとともに標的核酸を増幅するための配列であり、標的核酸中の標的配列の他の一部を構成する第2の塩基配列と特異的にハイブリダイズできる。第2の識別配列は、第2の塩基配列と高い選択性でハイブリダイズ可能な程度に相補的に設定される。好ましくは完全に相補的(特異的)に設定される。
図2に示すように、標識用タグ配列が、標識物質を結合可能に構成されていてもよい。すなわち、所定の塩基配列を有しており、標識物質を有するとともに標識用配列を識別する塩基配列を有する標識プローブが結合可能であってもよい。こうした標識プローブは後述するハイブリダイゼーション工程や検出工程において固相体上の増幅産物に供給されて、これを標識することができる。
標識用タグ配列を備えるとき、標識用タグ配列と第2の識別配列とは、直接連結されていてもよいが、これらの間には連結部位を有していることが好ましい。特に、図2に示すように、標識物質結合領域が標識プローブと相互作用してこれを結合する塩基配列を有しているときにおいて好ましい。連結部位は、既に第1のプライマーにおいて説明したとおりである。
すでに説明したように、たとえば、5’側からタグ配列、連結部位及び第1の識別配列の順でこれらを有する第1のプライマーと、5’側から、標識用タグ配列、連結部位及び第2の識別配列の順でこれらを有する第2のプライマーと、を用いて標的核酸を含む可能性のある試料に対してPCRを実施すると、図2の(a)〜(c)に示すように、DNAポリメラーゼのDNA伸長反応により、第1のプライマー及び第2のプライマーに由来して当該プライマーを含む鋳型鎖が形成される。
標識用プローブは、増幅産物の一部(標識用タグ配列)とハイブリダイズする標識用配列と、標識物質と、を備えることができる。標識用配列は、標識用タグ配列と特異的にハイブリダイズ可能な程度の相補性を有しており、好ましくは完全に相補的である。標識用配列の塩基配列の長さ等は特に限定されず、標的核酸の標的配列の内容やハイブリダイゼーションに関わるそのTm等に応じて適宜決定される。
本件出方法は、アレイにおいて、増幅産物と検出用プローブとをハイブリダイズ可能に接触させる第1のハイブリダイゼーションと、標識用プローブと増幅産物とをハイブリダイズ可能に接触させる第2のハイブリダイゼーションとを実施するハイブリダイゼーション工程を備えることができる。第1のハイブリダイゼーションを実施することで、タグ配列と検出用プローブとのハイブリダイズにより、検出用プローブと増幅産物とのハイブリダイズ産物が得られる。また、第2のハイブリダイゼーションを実施することで、標識用配列と標識タグ配列とのハイブリダイズにより増幅産物と標識用プローブとのハイブリダイズ産物が得られる。これら第1及び第2のハイブリダイゼーションの結果、図3に示すように、固相上に増幅産物と検出用プローブと標識用プローブとのハイブリダイズ産物が得られる。そして、標的核酸が予め関連付けられた検出用プローブの固定化領域に、標識物質が保持されることになるため、このハイブリダイズ産物の存在が目視で視認可能に可視化される。検出用プローブの固定化領域には、検出用プローブが固定化されていない領域に比べて標識物質が集積しあるいは濃縮されるため、目視による視認が容易になっている。
検出工程は、最終的なハイブリダイズ産物を、前記標識物質に基づいて検出する工程である。より具体的には、検出用プローブが固定化された固定化領域の着色及び位置を確認する工程である。本検出方法では、それ自体目視で確認可能な標識物質を用いているために、簡易にかつ迅速に標的核酸の有無を確認できる。
本発明によれば、また、本発明方法に用いるアレイが提供される。上記した各種態様のアレイも本発明に含まれる。さらに、本発明によれば、こうしたアレイをアレイ領域として複数個備えるアレイシートも提供される。すなわち、標的核酸を検出するためのアレイのシートであって、標的核酸と予め関連付けられた検出用プローブの複数個の固定化領域を含むアレイ領域を、このアレイ領域毎に分離可能に複数個備えたアレイシートが提供される。このシートによれば、本発明方法に用いられるアレイを簡単に製造、供給できる。アレイ領域毎に分離可能とするには、例えば、上記した好ましい固相担体を用いれば、一般的に使用されるカッターやはさみ等で切断が可能である。あるいは、切断可能に脆弱な部位をアレイ領域間に設けることで、容易に手操作によって、アレイ領域を分離可能である。
(1)DNAマイクロアレイの作製
(2)標的核酸とプライマーの調製と増幅
(3)ハイブリダイズ
(4)スキャナーを用いた検出
プラスチック板に、3’末端をアミノ基で修飾した合成オリゴDNA(株式会社日本遺伝子研究所製)を溶かした水溶液を検出用プローブとして、日本ガイシ株式会社にてGENESHOT(登録商標である)スポッターを用いてスポットした。使用した合成オリゴDNA配列は、配列番号1〜100から高速ハイブリダイゼーションが可能な以下の33種を選択した。
増幅に使用したゲノムDNAは、ヒト由来とし、ヒトゲノム中の6つの標的核酸((1)〜(6))に特異的な以下の表に示すプライマーP1−1〜P1−6(日本遺伝子研究所製)、P2−1〜P2−6(日本遺伝子研究所製)及びP3−1〜P3−6(日本遺伝子研究所製)を準備した。なお、各系列は以下の構成(5’から3’として表示)とした。なお、P3系のプライマーのプロピレン基部分は、以下の式に示すGlenResearch社のホスホアミダイト試薬であるSpacer PhophoamiditeC3を用いて通常のオリゴヌクレオチド合成方法に準じて合成された。
P2系のプライマー:
F:標識プローブの結合配列(タグ配列)+P1系の各標的核酸に対する塩基配列
R:合成オリゴヌクレオチドプローブの塩基配列と同一の塩基配列からなるタグ配列+P1系の各標的核酸に対する塩基配列
(なお、P2系プライマーを用い場合には、このタグ配列と相補的な塩基配列の相補鎖も増幅されるため、当該相補鎖がプローブとハイブリダイズし、増幅断片を検出できる。)
P3系プライマー:
F:標識プローブの結合配列+連結部位X(プロピレン鎖)+P1系の各標的核酸に対する塩基配列
R:合成オリゴヌクレオチドプローブの塩基配列と相補的な塩基配列からなるタグ配列+連結部位X(プロピレン鎖)+P1系の各標的核酸に対する塩基配列
(試薬調製)
dH2O 4.0μl
2×multiplex PCR master mix 5.0μl
プライマー混合物(各500nM) 0.5μl
ゲノムDNA(50ng/μl) 0.5μl
合計 10.0μl
(2)で得た増幅サンプルをマイクロアレイ上に固定した検出用プローブとハイブリダイズするために、以下のHybri controlとHybri solutionを調製し、これからハイブリダイズ用の試薬を調製した。PrimerMixには、標識用プローブ(蛍光修飾したオリゴヌクレオチドでありP2系及びP3系プライマーのFの5’側に結合する。)(25μM)を含んでいる。なお、Hybri controlに使用したAlexa555−rD1_100は、D1_100の対応する配列に相補な配列の5´末端をAlexa555で標識したものを用いた。
Alexa555−rD1_100(100nM) 10μl
TE(pH8.0) 390μl
合計 400μl
20×SSC 2.0ml
10%SDS 0.8ml
100% Formamide 12.0ml
100mM EDTA 0.8ml
milliQ 24.4ml
合計 40.0ml
Hybri control 1.5μl
Primer Mix 1.0μl
Hybri solution 9.0μl
小計 10.5μl
増幅サンプル 3.0μl
合計 18.0μl
ハイブリダイズ後、以下の組成の洗浄液を満たしたガラス染色バットに、ハイブリダイズ反応終了後のマイクロアレイ基板を浸漬し、5分間上下振とうし、滅菌水を入れたガラス染色バットにマイクロアレイ基板を移し、1分間上下振とうし、2000rpmで1分間遠心乾燥し、マイクロアレイ基板表面に残った水分を除去した。
(洗浄液の組成)
milliQ 188.0ml
20×SSC 10.0ml
10%SDS 2.0ml
合計 200.0ml
Appleied Precision社ArrayWoRxを使用して適宜、露光時間を調節し、蛍光画像を取得した。プラスチック基板についての結果を、図5及び図6に示す。
Hybri control 1.5μl
Primer Mix 3.5μl
Hybri solution 9.0μl
小計 14.0μl
増幅サンプル 4.0μl
合計 18.0μl
(1)メンブレンタイプDNAマイクロアレイの作製
メルクミリポア製Hi-Flow Plus メンブレンシート(60mm x 600mm)に以下の表に示す塩基配列からなる検出用プローブ溶液を、特開2003−75305号公報に記載されている吐出ユニット(インクジェット法)を用いた日本ガイシ株式会社GENESHOT(登録商標)スポッターを用いて、マトリックス状にスポットした。なお、全てのスポットが、前記シートを0.2mlチューブに収まるように3.5mm幅に切断したときに十分当該幅の範囲内にあるようにした。使用した検出用プローブの検出用配列は、文献(Analytical Biochemistry 364(2007)78-85)のSupplementary Table1記載のD1_1からD1_100の100種(配列番号1〜配列番号100)のうち任意の16種を選択し配列の3’末端側をアミノ基で修飾した配列を使用した。
増幅に使用したゲノムDNAは、ヒト由来とし、ヒトゲノム中の4つの標的核酸((1)〜(4))に特異的な以下の表に示すプライマーセットP3−1〜P3−4(日本遺伝子研究所製)を準備した。なお、各プライマーセットは以下の構成(5’から3’として表示)とした。なお、P3系のプライマーのプロピレン基部分は、以下の式に示すGlenResearch社のホスホアミダイト試薬であるSpacer PhophoamiditeC3を用いて通常のオリゴヌクレオチド合成方法に準じて合成された。
F:標識用タグ配列+連結部位X(プロピレン鎖)+各標的核酸に対する塩基配列
R:タグ配列+連結部位X(プロピレン鎖)+各標的核酸に対する塩基配列
dH2O 4.0μl
2×multiplex PCR master mix 5.0μl
プライマー混合物(各500nM) 0.5μl
ゲノムDNA(50ng/μl) 0.5μl
合計 10.0μl
(2)にて増幅したサンプルを用いてメンブレンタイプDNAマイクロアレイへの反応(液中型ハイブリダイゼーション)及びその検出手順は以下の通りとした(図7の上段参照)。アレイに適用するハイブリダイゼーション液は、以下の組成とした。ラテックス液についてはエーエムアール株式会社製を使用した。なお、ラテックス液には青色系の着色剤を含有するポリスチレン系のラテックスビーズにED-1配列に相補な配列のDNAを固定したもの(5’アミノ基修飾のED-1に相補な配列の合成DNAとラテックス表面の官能基がカルボキシル基を有するものとで共有結合を形成させたもの)を任意の濃度となるようにPBSで調製した。
(ハイブリダイゼーション液組成)
Hybri Solution* 140.0μl
(0.5%Tween20−1%BSA−PBS)
ラテックス液* 50.0μl
サンプル 10.0μl
total 200.0μl
(2)にて増幅したサンプルを用いてメンブレンタイプDNAマイクロアレイへの反応(液中型ハイブリダイゼーション)及びその検出手順は以下の通りとした(図7の下段参照)。アレイに適用するハイブリダイゼーション液は、以下の組成とした。
Hybri Solution* 200.0μl
(0.5%Tween20-1%BSA-PBS)
F側プライマーの標識用タグ配列に相補なビオチン標識オリゴDNA(25μM)
4.0μl
サンプル 4.0μl
合計 208.0μl
洗浄を行った。
(3)及び(4)の反応後のアレイの乾燥後の発色の有無を目視で確認した。いずれも、P3プライマーを用いることで、いずれも標的核酸を検出できた。また、図7の上段に示すように、(3)のカラーラテックスを用いた場合では、増幅反応後には、ハイブリダイゼーション工程のみで標的核酸を検出できた。これに対して、図7の下段に示すように、(4)の発色反応による場合では、増幅反応後に、多段階の発色工程が必要であり、作業も繁雑であり結果を迅速に得られないことがわかった。以上の結果から(3)のように直接にそれ自体が目視できるシグナルを呈する標識物質を用いることで、結果を得るまでの工程数を少なくし、かつ作業時間を短くしても、十分な検出が可能であることがわかった。
Claims (18)
- 標的核酸の検出方法であって、
前記標的核酸に予め関連付けられた検出用プローブとハイブリダイズするタグ配列を備え、前記標的核酸に由来する増幅産物と、
目視で視認可能な標識物質と前記増幅産物の一部とハイブリダイズする標識用配列とを備える標識用プローブと、
前記検出用プローブを固相担体上に備えるアレイと、
を用い、
前記アレイにおける前記増幅産物と前記検出用プローブとをハイブリダイズ可能に接触させる第1のハイブリダイゼーションと、前記標識用プローブと前記増幅産物とをハイブリダイズ可能に接触させる第2のハイブリダイゼーションとを実施するハイブリダイゼーション工程と、
前記第1のハイブリダイゼーションと前記第2のハイブリダイゼーションとによるハイブリダイズ産物を前記標識物質で検出する工程と、
を備える、検出方法。 - 前記標識物質は、着色物質を備える粒子である、請求項1に記載の検出方法。
- 前記増幅産物は、前記タグ配列と前記標識用配列にハイブリダイズする標識用タグ配列とを対合するそれぞれの鎖の5’突出末端に備える、請求項1又は2に記載の検出方法。
- 前記ハイブリダイゼーション工程は、前記第1のハイブリダイゼーションと前記第2のハイブリダイゼーションとを同一の前記アレイ上で同時に実施する工程である、請求項3に記載の検出方法。
- 前記ハイブリダイゼーション工程は、前記アレイを用いて、前記アレイ毎に1ml以下の液中で前記第1及び第2のハイブリダイゼーションを実施する工程である、請求項1〜4のいずれかに記載の検出方法。
- 前記ハイブリダイゼーション工程は、前記検出用プローブの固定化領域の大きさは、0.2mm2以上150mm2以下であり、前記固相担体が、平面積が150mm2以下、アスペクト比が1.5以上のシート状体である前記アレイを用いて、ハイブリダイゼーションを実施する工程とする、請求項5に記載の検出方法。
- 前記ハイブリダイゼーション工程は、前記固相担体が、平面積が50mm2以下のシート状体である前記アレイを用いて、前記アレイ毎に0.3ml以下の液中でハイブリダイゼーションを実施する工程とする、請求項5又は6に記載の検出方法。
- 前記アスペクト比が20以下である、請求項5又は6に記載の検出方法。
- 前記アレイは、前記固相担体上に前記標識物質による発色見本領域を別途備える、請求項1〜8のいずれかに記載の検出方法。
- 前記発色見本領域は、顔料系インクにより形成されている、請求項9に記載の検出方法。
- 前記固相担体は、液体の浸透性又は透過性を有する、請求項1〜10のいずれかに記載の検出方法。
- 前記固相担体は、ポリエーテルスルホン、ニトロセルロース、ナイロン、ポリフッ化ビニリデン及びセルロースから選択される、請求項11に記載の検出方法。
- 前記固相担体の厚みは、0.01mm以上0.3mm以下である、請求項1〜12のいずれかに記載の検出方法。
- 前記アレイは、前記複数個の固定化領域の外縁の所定の一部にハンドリング部位を備える、請求項1〜13のいずれかに記載の検出方法。
- 前記ハイブリダイゼーション工程を、前記アレイを所定の方向性で同一のチューブ状容器に投入した状態を維持して実施する、請求項1〜14のいずれかに記載の検出方法。
- 前記ハイブリダイゼーション工程に先立って、前記容器内で遺伝子増幅反応により被験試料を調製する工程を備える、請求項15に記載の検出方法。
- 前記固定化領域は、2個以上200個以下である、請求項1〜16のいずれかに記載の検出方法。
- 前記検出用プローブは、正規直交配列である塩基配列を有するプローブである、請求項1〜17のいずれかに記載の検出方法。
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