JP2012526531A5

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Publication number: JP2012526531A5
Application number: JP2012510276A
Authority: JP
Filing date: 2010-05-11
Publication date: 2015-11-19
Anticipated expiration: 2030-05-11

Description

本発明は、野生型、弱毒化、および／または組み換えオルソポックスウイルスを製造および精製する方法（すなわち方法Ａ）に関し、この方法は以下の工程を含んでなる：
ａ）パッケージング細胞の培養物を用意し、
ｂ）培養パッケージング細胞にオルソポックスウイルスを感染させ、
ｃ）感染させたパッケージング細胞を、子孫オルソポックスウイルスが製造されるまで培養し、
ｄ）１以上のヌクレアーゼの存在下でインキュベートし、
ｅ）培養上清および／またはパッケージング細胞からオルソポックスウイルスを回収し、
ｆ）単数または複数のヌクレアーゼの活性を阻害し、かつ工程ｅ）で回収されたオルソポックスウイルスが工程ｇ）において陰イオン交換吸着剤へ吸着することを避けるのに適切な条件下で、前記オルソポックスウイルスに一価の塩を添加し、
ｇ）核酸の捕捉を可能にするのに適切な条件下で、工程ｆ）で得られた混合物と陰イオン交換吸着剤とを接触させ、
ｈ）細胞片の除去を可能にするのに適切な条件下で、工程ｇ）で得られた混合物を清澄化し、
ｉ）陰イオン交換吸着剤に残るオルソポックスウイルスを、通過画分（ｆｌｏｗｔｈｒｏｕｇｈ）中に回収するのに適切な条件下で、陰イオン交換吸着剤を一価の塩を含んでなる溶液により洗浄し、
ｊ）工程ｈ）で得られた通過画分と工程ｉ）で得られた通過画分を濃縮し、
ｋ）工程ｊ）で得られたオルソポックスウイルスを含んでなる画分を透析濾過(diafiltrating)すること。

陰イオン交換吸着剤を一価の塩を含んでなる溶液で洗浄する工程ｉ）により、残存するオルソポックスウイルスの適切な条件下での通過画分中への回収が可能になる。使用される一価の塩にはＮａＣｌおよびＫＣｌが含まれるが、これらに限定されない。工程ｉ）で用いられる好ましい一価の塩はＮａＣｌである。本発明によれば、工程ｉ）で用いられる一価の塩の濃度は２００ないし３００ｍＭの範囲、好ましくは２５０ｍＭまたは３００ｍＭである。本発明によれば、工程ｉ）は７．０ないし９．０、好ましくは７．５ないし８．５のｐＨ、より好ましくは８．０のｐＨにおいて行われる。本発明の好ましい実施形態によれば、工程ｉ）で用いられる一価の塩を含んでなる溶液は、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５％（ｗ／ｖ）スクロース、１０ｍＭグルタミン酸ナトリウム、および生理的なモル浸透圧濃度（２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ）の５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８．０（すなわちＳＯ８緩衝液）を含んでなる、薬剤的に許容される溶液である。本発明のその他の好ましい実施形態によれば、工程ｉ）で用いられる一価の塩を含んでなる溶液は、例えばＴｒｉｓ緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、またはリン酸緩衝液を含んでなる、薬剤的に許容される溶液である。陰イオン交換吸着剤を一価の塩を含んでなる溶液で洗浄する工程ｉ）は、好ましくは実施例１に記載される条件に従って行われ、ここで洗浄は２５０ｍＭ、好ましくは３００ｍＭのＮａＣｌを含んでなる、薬剤的に許容されるＳＯ８緩衝液により行われる。

陰イオン交換吸着剤に残るオルソポックスウイルスを通過画分中へ回収するため、陰イオン交換吸着剤を適切な条件下で一価の塩を含んでなる溶液により洗浄する工程ｌ’’）については、以前に記載した、陰イオン交換吸着剤に残るオルソポックスウイルスを通過画分中へ回収するため、陰イオン交換吸着剤を適切な条件下で一価の塩を含んでなる溶液により洗浄する工程ｉ）を参照されたい。

工程ｉ）：陰イオン交換吸着剤に残るオルソポックスウイルスを、通過画分中に回収するのに適切な条件下で、陰イオン交換吸着剤を一価の塩を含んでなる溶液により洗浄する
次に、UNOsphere（登録商標）(BioRad)を、ＳＯ８緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ；スクロース５％（ｗ／ｖ）；１０ｍＭグルタミン酸ナトリウム；生理的なモル浸透圧濃度（２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ）の５０ｍＭＮａＣｌ；ｐＨ８．０）中のＮａＣｌ２５０ｍＭまたは３００ｍＭ（ｖ／ｖ）により、蠕動のWatson-Marlowポンプ(参照323ES/4D, 520S; Watson-Marlow)を用いて洗浄した。
次に、工程ｈ）で得られた通過画分と工程ｉ）で得られた通過画分を一晩（すなわち１８時間）５℃にて、最終濃度５０ｇ／Ｌのサッカロース存在下でインキュベートした。

Claims

野生型、弱毒化、および／または組み換えオルソポックスウイルスを製造および精製する方法であって、以下の工程：
ａ）パッケージング細胞の培養物を用意し、
ｂ）培養パッケージング細胞にオルソポックスウイルスを感染させ、
ｃ）感染させたパッケージング細胞を、子孫オルソポックスウイルスが製造されるまで培養し、
ｄ）１以上のヌクレアーゼの存在下でインキュベートし、
ｅ）培養上清および／またはパッケージング細胞からオルソポックスウイルスを回収し、
ｆ）単数または複数のヌクレアーゼの活性を阻害しかつ工程ｇ）においてオルソポックスウイルスが陰イオン交換吸着剤へ吸着することを避けるのに適切な条件下で、工程ｅ）で回収されたオルソポックスウイルスに一価の塩を添加し、
ｇ）核酸の捕捉を可能にするのに適切な条件下で、工程ｆ）で得られた混合物と陰イオン交換吸着剤とを接触させること
を含んでなる、方法。
以下の工程：
ｈ）細胞片の除去を可能にするのに適切な条件下で、工程ｇ）で得られた混合物を清澄化し、
ｊ）工程ｈ）で得られた通過画分を濃縮し、
ｋ）工程ｊ）で得られたオルソポックスウイルスを含んでなる画分を透析濾過することを、さらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
以下の工程：
ｈ）細胞片の除去を可能にするのに適切な条件下で、工程ｇ）で得られた混合物を清澄化し、
ｉ）陰イオン交換吸着剤に残るオルソポックスウイルスを、通過画分中に回収するのに適切な条件下で、陰イオン交換吸着剤を一価の塩を含んでなる溶液により洗浄し、
ｊ）工程ｈ）で得られた通過画分および工程ｉ）で得られた通過画分を濃縮し、
ｋ）工程ｊ）で得られたオルソポックスウイルスを含んでなる画分を透析濾過することを、さらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
パッケージング細胞が、不死化細胞株である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
パッケージング細胞が、不死化鳥類細胞株である、請求項４に記載の方法。
不死化鳥類細胞株が、動物性産物を含まない培地中にて（微小）担体の非存在下で懸濁液中にて増殖可能である、請求項４または５に記載の方法。
不死化鳥類細胞株が、ノバリケン種に属する鳥類細胞から得られる、請求項４または５に記載の方法。
不死化鳥類細胞株が、テロメラーゼ逆転写酵素（telomerase reverse transcriptase：ＴＥＲＴ）をコードする核酸を含んでなる、請求項７に記載の方法。
不死化鳥類細胞株が、
・受託番号０８０６０５０２により欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に寄託されるＴ３−１７４９０もしくはその誘導体、または、
・受託番号０８０６０５０１により欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に寄託されるＴ６−１７４９０もしくはその誘導体である、
請求項８に記載の方法。
不死化鳥類細胞株が、Ｅ１Ａ核酸およびテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードする核酸を含んでなる、請求項７に記載の方法。
パッケージング細胞が、初代または二次的な鳥類細胞である、請求項１〜３のいずれか一項の方法。
パッケージング細胞が、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）である、請求項１１に記載の方法。
ｐＨが７．０ないし９．０である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
ヌクレアーゼがBenzonase（登録商標）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
単数または複数のヌクレアーゼの濃度が、５ないし１００Ｕ／ｍｌの範囲である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
オルソポックスウイルスを回収する工程の前に、
１）パッケージング細胞膜を破壊し、かつ
２）工程１）で得られる混合物を少なくとも１時間インキュベートし、予め添加された単数または複数のヌクレアーゼにより、パッケージング細胞から放出された核酸を分解する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
パッケージング細胞膜を破壊する工程が、高速ホモジナイザーを用いてまたは超音波処理によって行われる、請求項１６に記載の方法。
陰イオン交換吸着剤が、清澄化工程で用いられるフィルターの孔径よりも大きな直径を有するビーズ型基質に存在する、請求項２または請求項３に記載の方法。
陰イオン交換吸着剤が、８μｍよりも大きな直径を有するビーズ型基質に存在する、請求項１８に記載の方法。
陰イオン交換吸着剤の官能基が、ジメチルアミノエチル（ＤＭＡＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、トリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）、およびトリエチルアミノエチル（ＴＥＡＥ）からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
清澄化工程が、深層濾過により行われる、請求項２または請求項３に記載の方法。
深層濾過が、孔径８μｍのフィルターと孔径５μｍのフィルターを組み合わせて行われる、請求項２１に記載の方法。
濃縮工程が、０．０９ないし０．１５μｍの孔径を有するフィルターを用いる精密濾過により行われる、請求項２または請求項３に記載の方法。
透析濾過工程が、０．０９ないし０．１５μｍの孔径を有するフィルターを用いて行われる、請求項２または請求項３に記載の方法。
１．ゲル濾過工程；および
２．透析濾過工程を
さらに含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
工程ｆ）で用いられる一価の塩がＮａＣｌである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
工程ｆ）で用いられる一価の塩の濃度が、５０ないし１５０ｍＭの範囲である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
前記オルソポックスウイルスがワクシニアウイルスまたは改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。