CN117210389A - 一种悬浮mdck细胞系的培养方法 - Google Patents
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Abstract
一种悬浮MDCK细胞系的培养方法，悬浮细胞SUS‑MDCK以特定的无血清培养基连续传代并悬浮培养的方式进行培养，培养条件为：悬浮细胞分别用250mL锥形摇瓶进行培养；在悬浮细胞的密度达到7×105 cells/cm2时候进行传代；培养条件设定为37℃ 5%CO2，设置摇床转速为120~130rpm，回转半径为25mm。悬浮MDCK细胞较贴壁细胞生长更为稳定，且病毒分离培养效率高，连续传代病毒突变率低，在基于细胞培养技术的流感疫苗生产工艺中具备一定的可行性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种悬浮MDCK细胞系的培养方法。
背景技术
流感疫苗的快速高质量生产是一项重要的挑战，多方研究团队在连续细胞系培养的工艺工程和培养基开发方面做出了许多努力，明显提高了生产单克隆抗体、重组蛋白和病毒的潜力。然而，大多数流感疫苗仍然是在鸡胚中生产，为开发强大的基于细胞培养技术的流感疫苗生产工艺，需鉴定和评估多种细胞系作为宿主系统。大多数用于流感疫苗生产的细胞都是贴壁生长的单层细胞，而大规模培养过程主要依赖于含血清的培养基。在疫苗生产中，使用血清存在成本高、病毒、支原体、朊病毒等污染风险，此外血清蛋白成分的存在也会给下游生产纯化带来困难。
目前一些悬浮细胞，如MDCK、PER.C6、AGE.CR、EB14/EB66和CAP已经建立并应用于流感疫苗生产。这些细胞系能够产生高滴度的病毒，大部分流感病毒均能表现出良好的复制。为了应对未来流感大流行的疫苗储备，选择合适的宿主细胞进行病毒培养，其中一个重要的标准就是全球范围内低成本、高效率地产出流感疫苗制备所需的高滴度病毒。因此，在流感疫苗生产中迫切需要开发更有效的MDCK细胞悬浮培养工艺。
此前，一些研究对不同培养模式下的细胞生长和流感病毒产生进行了研究。例如，诺华公司(瑞士制药公司)使用悬浮MDCK细胞系进行流感病毒增殖。有科研团队报道了使用siat7e转染的MDCK悬浮细胞系繁殖流感病毒。这些培养模式获得的流感病毒血凝素滴度较贴壁细胞高。然而，使用不同的细胞培养方式对细胞生长和流感病毒生长的直接比较研究仍然是较少的，这对发展悬浮细胞型流感疫苗生产工艺至关重要。在此之前，我们已经成功建立了使用悬浮MDCK细胞系进行流感病毒增殖，本研究的目的是比较悬浮MDCK细胞与贴壁MDCK细胞在两种不同培养模式下的生长情况，以及流感病毒的产量和突变情况，用以探讨基于细胞培养技术的流感疫苗生产工艺的可行性。
发明内容
本发明目的在于提供一种悬浮MDCK细胞系的培养方法。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种悬浮MDCK细胞系的培养方法，悬浮细胞SUS-MDCK以特定的无血清培养基连续传代并悬浮培养的方式进行培养，培养条件为：悬浮细胞分别用250mL锥形摇瓶进行培养；在悬浮细胞的密度达到7×105cells/cm2时候进行传代；培养条件设定为37℃5％CO2，设置摇床转速为120～130rpm，回转半径为25mm。
优选的技术方案为：每升所述无血清培养基的配方包含8.0g的葡萄糖，6.0g的L-谷氨酰胺、3.0g的Pluronic F-68、2.0g的EGF生长因子和2.0g的PDGF生长因子。
附图说明
图1MDCK细胞在不同条件培养中活细胞密度(VCD)。
图2MDCK细胞在不同条件培养中特定细胞生长速率(SGR)。
图3同时段内MDCK细胞在不同条件培养中特定细胞生长速率(SGR)。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
悬浮细胞的24小时和48小时活细胞密度较贴壁细胞更稳定，在无血清培养基中特定生长速率逐渐增长在第3代次后保持较为稳定的状态，而现有技术的贴壁细胞连续传代6次均未稳定；病毒连续传代培养至第三代时悬浮细胞培养的病毒HA滴度可达1:256以上，而贴壁细胞则无滴度；悬浮细胞培养的H3N2和BV亚型流感病毒第四代和第五代HA基因各发生1个氨基酸位点突变，贴壁细胞两个代次内未发现基因突变，NA基因均未发现基因突变。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
参见图1-3所示，须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
材料和方法
细胞系：贴壁MDCK细胞(国家流感中心惠赠)使用含10％胎牛血清(fetal bovineserum,FBS,Gibco)的DMEM(dulbeccos modified eagle medium，DMEM,Gibco)进行培养。本研究使用的悬浮细胞SUS-MDCK由国家流感中心提供的MDCK细胞，以特定的无血清培养基连续传代并悬浮培养的方式“驯化”而来，该细胞系由芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司(Wuhu Interferon Bio-Products Industry Research Institute Co.,Ltd.)根据本研究需要进行提供。每升所述无血清培养基的配方包含8.0g的葡萄糖，6.0g的L-谷氨酰胺、3.0g的Pluronic F-68、2.0g的EGF生长因子和2.0g的PDGF生长因子。
培养条件：贴壁细胞和悬浮细胞分别用T25细胞瓶(25-cm2 T-flasks,Corning)和250mL锥形摇瓶(250-mL shaker flasks,Corning)进行培养。在贴壁细胞和悬浮细胞的密度达到7×104cells/cm2和7×105cells/cm2时候进行传代。培养条件均设定为37℃5％CO2，悬浮细胞另需设置摇床转速为120～130rpm，回转半径为25mm。
细胞计数：将细胞悬液加入细胞计数板，使用博大博聚JSY-SC-022全自动细胞计数仪用来计算细胞数量、细胞形态、细胞大小和死活。活细胞密度测定(Determination ofviable cell density,VCD)以每24小时进行一次计数，VCD＝(活细胞总数/总细胞数)×100％；细胞特定生长速率(Specific growth rate,SGR)，在贴壁细胞和悬浮细胞生长48小时后进行传代，连续传6代，SGR＝(Ln VCD2-Ln VCD1)/(t2-t1)。传代时MDCK细胞在含10％FBS培养基里起始浓度为7×105cells/ml，无血清培养基悬液里起始浓度为7×105cells/ml，培养48h后进行传代。
细胞感染：进行病毒感染细胞实验时，使用含血清的贴壁细胞，在感染病毒前需使用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)洗两次，而无血清悬浮细胞无需PBS清洗，两个系统感染病毒后均需加入TPCK-胰酶(5mg/L,Sigma-Aldrich)和1％青霉素-链霉素-两性霉素B混合溶液(100×三抗)，使用WHO推荐疫苗株(由国家流感中心提供)进行病毒感染实验，所有病毒以血凝效价1:8开始分离培养。
病毒滴度测定采用HA试验进行流感病毒滴度测定。新鲜的人“O”红细胞来自于健康人群献血，稀释至1％后使用(红细胞计数为2×107cells/mL)。将流感病毒样品和对照病毒按照一定的比例进行稀释，制成不同的浓度，加入1％的红细胞悬液，4℃下存放1小时，使病毒与红细胞结合。观察每个孔的红细胞凝集情况，用最高稀释度的孔数计算病毒滴度。
基因测序将测试病毒连续传代5次，收集每一代病毒，RNA核酸做为模板进行扩增，得到可以测序的片段。按照RNase free water 5.2μl，buffer 2μl，dNTP(10mM)0.4μl，酶混合物0.4μl，正反向引物分别0.5μl和1μlRNA模板。按照One-step RT-PCR试剂盒说明书进行扩增得到测序片段。若PCR产物无非特异性条带，则在每个PCR产物中加入USB HT EXoSAP-IT PCR产物纯化酶(虾碱酶)，37℃加热15分钟后出去过量的引物和核苷酸。再80℃加热15分钟灭活虾碱酶。纯化后PCR产物送上海伯杰医疗科技股份有限公司进行测序。测序后，得到HA和NA片段的基因序列，用DNASTAR软件的SeqMan模块进行拼接，使用BioEdit软件进行差异位点分析。
结果：
悬浮细胞适应性培养：
首先将培养细胞在原培养基中加入无血清培养基，与原培养基按照25:75的比例添加进行适应性培养。当观察到稳定的生长和高活力(>90％)时，将细胞传代到无血清培养基与原始培养基50:50的比例中。逐步增加无血清培养基与原培养基的比例(75:25,90:10)，直至细胞转入100％无血清培养基。
悬浮细胞和贴壁细胞不同培养条件下传代稳定性比较：
为评价悬浮细胞和贴壁细胞传代适应性，采用含血清贴壁培养和无血清悬浮培养两种模式培养MDCK细胞6代进行分析比较。图1显示了连续6次传代，每代次内24小时和48小时的活细胞密度测定(VCD)。悬浮细胞24小时VCD在1.5～2.0*10^6个/ml，48小时VCD在3.5～4.0*10^6个/ml之间；而贴壁细胞24小时VCD在1.5～2.5*10^5个/ml，48小时VCD在4.0～5.5*10^5个/ml之间，贴壁细胞VCD浮动较大，由此可见悬浮细胞的VCD较贴壁细胞更稳定。图2显示了贴壁细胞和悬浮细胞每次传代时细胞特定生长速率(SGR)。悬浮细胞在传代3次后呈稳定趋势，而贴壁细胞传代6次内均未稳定；图3对比了同时段内MDCK细胞在不同培养条件下特定细胞生长速率(SGR)。在同一时间内，贴壁细胞SGR随传代而逐渐增加，并在第4代次后达到高峰而后下降。而悬浮MDCK细胞在无血清培养基中SGR逐渐增长在第3代次后保持较为稳定的状态。在稳定阶段，不同培养模式对生长速度无显著影响。在同一时间内，悬浮细胞SGR相比于贴壁细胞更加稳定，差异较小。因此，无血清培养基中，悬浮MDCK细胞与贴壁培养模式相比具有相当的稳定性并可连续传代。
悬浮细胞和贴壁细胞感染流感病毒效果比对：
首先选择2019-2020年和2020-2021年WHO选用的流感疫苗候选株作为实验毒株，并检测HA滴度。将病毒以血凝效价1:8作为起始浓度进行传代分离培养，5次传代后进行分析比对。如表1所示悬浮细胞培养病毒自第三代起均能升至1:256以上，仅A/Virtoria/2570/2019的第一、二代滴度较低，分别为1:4和1:16，其余毒株自第一代起滴度均能超过1:128；而贴壁细胞收获第一代病毒的血凝效价最高仅为1:8，传至第三代均检测不到滴度。
表1贴壁细胞与悬浮细胞感染流感病毒传代后HA滴度比对
“—”代表未检出
2.4悬浮细胞和贴壁细胞感染病毒连续传代后的基因突变：
将WHO选用的流感疫苗株在贴壁MDCK和悬浮MDCK细胞中连续传代5次，使用一代测序技术，获得HA和NA基因片段信息进行比对分析。悬浮细胞在培养到第四代和第五代的时候，A_Cambodia_e0826360_2020(H3N2)和BV_Washington_02_2019两株毒株的HA基因均发生1个氨基酸位点突变，分别为T203S和N405K，而NA基因均未发生突变。由于贴壁细胞传代2次，便检测不到血凝效价，因此仅测序第一代和第二代病毒产物，其HA和NA均未发生突变。
表2贴壁细胞与悬浮细胞感染流感病毒传代后HA和NA基因突变分析
贴壁细胞仅对第一代和第二代有血凝效价的毒株进行测序，因此仅记录了2代
测序结果。
讨论：
本研究中采用贴壁MDCK细胞和悬浮MDCK细胞两种不同的方式进行细胞培养和流感病毒分离培养。根据本研究结果可以发现在连续传代过程中，悬浮细胞生长情况更稳定，连续出传代5次统计出的24小时和48小时VCD基本无太大差别，0-24小时与24-48小时的SGR也较稳定；贴壁细胞则显出很大的不稳定性，即使部分数值会优于悬浮细胞，但其生长的不稳定也影响了后续病毒分离培养的效率。使用相同的疫苗株进行病毒感染实验，悬浮细胞分离病毒的成功率更高，病毒滴度也在随着传代次数增加而增高，基因突变较少几乎不影响病毒感染力；相反，贴壁细胞生长的不稳定及其操作的复杂性导致在病毒分离中效果不如悬浮细胞。由此可看出悬浮细胞在一定程度上可以替代贴壁细胞在流感病毒分离培养中发挥重要作用，运用在日常工作中。
既往研究表明，在检测方法学、检测成本、敏感性以及病毒分离等方面，MDCK悬浮细胞在流感监测上，与传统的贴壁MDCK细胞法和SPF鸡胚法比较，具有操作简单高效、分离成功率高等优势。另有学者[9]实现了MDCK细胞从含血清培养基到无血清培养基的适应性转变，进一步获得了适于无血清单细胞悬浮培养的悬浮MDCK细胞，该培养方式有着生长快速、细胞密度高等优点，利于后续疫苗的进一步开发。因此可以通过MDCK悬浮细胞培养技术进一步优化流感病毒疫苗的生产。本研究使用的无血清悬浮MDCK细胞培养亦能使细胞稳定生长，证明该方法的可靠性。谭文松等人优化的无血清培养基(MDCK-SFM1和MDCK-SFM2)支持MDCK贴壁和悬浮细胞的稳定传代和生长，而MDCK-SFM2在细胞增殖、减缓细胞死亡等方面，比与含血清培养基中的贴壁细胞有优势，但需要2代才能达到稳定的最大比生长速率。且从HA、TCID50、CTV等数据来看，MDCK-SFM2能高效地生产H1N1流感病毒。本研究也证实了H1pdm09亚型病毒能够稳定的增殖，同时其他亚型病毒也生长良好，仅发生少量氨基酸突变。因此，进一步优化无血清培养基是高效生产流感疫苗的又一新方向。Lohr等人通过培养基交换策略，发现MDCK悬浮细胞的生长特性，确定适合的培养基可用于广泛应用，并验证在细胞增殖与病毒感染方面，MDCK悬浮细胞与MDCK贴壁细胞具有相当的能力，由此可见MDCK悬浮细胞的应用潜能。Pesche等人为了将改善的条件应用到小规模搅拌培养系统，用新鲜培养基进行1：2稀释用于感染。发现相同条件下，甲流病毒A/PR/8在1L搅拌罐生物反应器与摇瓶的感染效果相近，细胞特异性病毒产率也与摇瓶感染相当。这可能表明细胞在悬浮液中生长的适应改变了粘附分子，其信号传导途径与细胞存活有关，并且也与病毒蛋白相互作用。因此，将改进后的培养系统用于本次实验，使悬浮细胞逐步适应改良后的培养环境，并通过悬浮细胞和贴壁细胞不同培养条件下传代的稳定性比较进行了悬浮细胞优势的验证。
综上所述，我们评价了MDCK悬浮细胞生产流感病毒的可行性，MDCK悬浮细胞系在无血清培养基中的生长优于含血清贴壁培养，可显著改善流感病毒的增殖，后期仍可以通过进一步优化培养基成分和操作策略完善悬浮细胞培养系统。因此，无血清悬浮培养方法有望成为一种高效生产流感疫苗的新方法。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (2)
1.一种悬浮MDCK细胞系的培养方法，其特征在于：悬浮细胞SUS-MDCK以特定的无血清培养基连续传代并悬浮培养的方式进行培养，培养条件为：悬浮细胞分别用250mL锥形摇瓶进行培养；在悬浮细胞的密度达到7×105 cells/cm2时候进行传代；培养条件设定为37℃5%CO2，设置摇床转速为120~130rpm，回转半径为25mm。
2.根据权利要求 1所述的悬浮MDCK细胞系的培养方法，其特征在于：每升所述无血清培养基的配方包含8.0g的葡萄糖，6.0g的L-谷氨酰胺、3.0g的Pluronic F-68 、2.0g的EGF生长因子和2.0g的PDGF生长因子。
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