JP2012515168A - 配糖体の２−硫酸化方法 - Google Patents

Abstract

配糖体の選択的２−硫酸化方法
【選択図】図１

Description

（関連出願に関する相互参照）
本出願は、２００９年１月１２日に出願された米国仮出願番号第６１／１４４，０２４号の利益を主張するもので、その全体が参照により本明細書に明白に組み込まれる。

（政府の実施権の記載）
本発明は、国立衛生研究所によって認可された契約番号５Ｒ０１ＤＫ０６７８５９−０９の下で、政府の援助を受けて行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。

ハンター症候群（ムコ多糖症ＩＩ型）の新生児スクリーニングのための新技術の開発は、生後まもなく開始された場合に最も効果的である治療法の開発を理由に、認可されている。このリソソーム蓄積症は、細胞性グリコサミノグリカンの２つの要素であるデルマタン硫酸およびヘパラン硫酸の分解のために必要とされる酵素イズロン酸−２−スルファターゼの不足によって引き起こされる。このスルファターゼのアッセイは、２位に硫酸エステルを有したα−Ｌ−イズロン酸配糖体の使用を必要とする。

イズロン酸−２−スルファターゼを生体外でアッセイするために使用される合成基質は、通常、ヘパリンの亜硝酸分解から得られる二硫酸化二糖である。このような基質は、ハンター症候群の新生児スクリーニングのためのタンデム型質量分析の開発のために役立ってきた。しかしながら、より最近、ヘパリンの亜硝酸分解を使用したスケールアップ合成が、世界中のハンター症候群の新生児スクリーニングをサポートするために必要な物量を得るには非実用的であることが、明白となっている。

１年に何十グラムの規模で使用できる、適切な基質の全合成の新たな方法の必要性が、存在している。

本発明は、２位で配糖体を硫酸化するための方法を提供する。一実施形態においては、方法は、２，４位でシスの関係のヒドロキシル基を有する配糖体をスズ試薬で処理して配糖体である２，４−スタンニレンアセタールを提供すること、および、その２，４−スタンニレンアセタールを硫化剤で処理して２−硫酸化配糖体を提供することを含む。本発明の方法は、配糖体の２位を４位に有利なように選択的に硫酸化する。一実施形態においては、２−硫酸化配糖体は、（４位の硫酸化と比べて）約９０％を超える選択性で２位が硫酸化される。一実施形態においては、２−硫酸化配糖体は、（４位の硫酸化と比べて）約９５％を超える選択性で２位が硫酸化される。

一実施形態においては、配糖体は、イズロン酸配糖体である。一実施形態においては、配糖体は、α−Ｌ−イズロン酸配糖体である。

本発明の方法で有用なスズ試薬としては、スタンニレンアセタールを形成することができるスズ試薬が挙げられる。代表的なスズ試薬としては、酸化ジブチルスズ（ＩＶ）などの、ジアルキルスズ（ＶＩ）酸化物が挙げられる。

本発明の方法で有用な硫化剤としては、トリメチルアミンを有する三酸化硫黄錯体、ピリジン錯体および三酸化硫黄Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどの、三酸化硫黄試薬が挙げられる。

上記の態様および本発明の効果の多くは、それらが添付の図面と併用される際に、以下の詳細な説明に対する参照によってより良好に理解されるようになると、より容易に十分に理解されるものである。
本発明の方法による、代表的なイズロン酸配糖体の選択的な２−硫酸化の概略図である。 本発明の方法による代表的なイズロン酸配糖体の２−硫酸化において有用なイズロン酸配糖体出発物質（α−Ｌ−イズロン酸配糖体メチルエステル）の合成の概略図である。 本発明の方法による、一般化されたイズロン酸配糖体の選択的な２−硫酸化の概略図である。

本発明は、２位で配糖体を硫酸化するための方法を提供する。一実施形態においては、本方法は、２，４位でシスの関係のヒドロキシル基を有する配糖体をスズ試薬で処理して配糖体２，４−スタンニレンアセタールを提供すること、および、その２，４−スタンニレンアセタールを硫化剤で処理して２−硫酸化配糖体を提供することを含む。

本明細書で使用する「配糖体」という用語は、糖基（グリコン）がグリコシド結合によって別の基（アグリコン）にグリコンのアノマー炭素を介して結合される化合物を指す。本発明の方法で利用できる適切な配糖体としては、糖環の２，４位にヒドロキシル基を有し、かつ、シスの関係（すなわち、２−および４−ヒドロキシル基が、スズ試薬によってスタンニレンアセタールを形成できる）を有する単糖（例えば、ピラノースおよびフラノース）である、糖基が挙げられる。一実施形態においては、配糖体は、Ｏ−配糖体（すなわち、グリコンのアノマー炭素、酸素によって、アグリコンに結合されるグリコン）である。グリコシド結合は、αまたはβ配置のいずれを有してもよい。配糖体のアグリコンの性質は、本発明の方法では、重要ではない。適切なグリコンは、本方法の硫酸化を妨げない。代表的なグリコンとしては、芳香族化合物（例えば、クマリンといった、芳香族基で結合されたフェニル含有化合物またはベンゾ含有化合物）、他の炭水化物および多環式化合物（例えば、ステロイド）が挙げられる。

本発明の方法は、配糖体の２位を４位に有利になるように選択的に硫酸化する。一実施形態においては、２−硫酸化配糖体は、（４位の硫酸化と比べて）約９０％を超える選択性で２位が硫酸化される。一実施形態においては、２−硫酸化配糖体は、（４位の硫酸化と比べて）約９５％を超える選択性で２位が硫酸化される。

上記ように、配糖体のアグリコンの性質を、広範に変更することができる。一実施形態においては、配糖体は、イズロン酸配糖体である。一実施形態においては、配糖体は、α−Ｌ−イズロン酸配糖体である。本発明の方法によって形成されるイズロン酸配糖体の硫酸エステルは、ハンター症候群（ムコ多糖症ＩＩ型）の新生児スクリーニングでの酵素イズロン酸−２−スルファターゼのアッセイにおいて有用である。

一実施形態においては、配糖体は、以下の式を有するイズロン酸配糖体である：

式中、エレクトロスプレイイオン化−タンデム型質量分析を受けた場合に配糖体は親イオンを形成し、Ｍは、親イオンから分解して衡突解離でフラグメントイオンを提供する部分であり、Ｌは、Ｍを配糖体部分に共有結合し、そして、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基である。代表的なＭ基としては、ブチルオキシカルボニルが挙げられる（Ｍは、Ｃ_４Ｈ_９ＯＣ（＝Ｏ）−である）。代表的なＬ基としては、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ_２−などの、リンカーが挙げられる。ここでは、ｎは１〜８である。このイズロン酸配糖体の硫酸化は、以下の式を有する２−硫酸化配糖体を提供する。

式中、Ｍ、ＬおよびＲは、上記の通りであり、Ｘは、水素または対イオンである。代表的なＸ基としては、トリメチルアンモニウムイオンなどのアンモニウムイオン、および、ナトリウムイオンなどの金属イオンが挙げられる。この２−硫酸化イズロン酸配糖体の鹸化は、以下の式を有するイズロン酸配糖体を提供する：

式中、Ｍ、ＬおよびＸは、上記の通りである。

別の実施形態においては、配糖体は、以下の式を有するα―Ｌ―イズロン酸配糖体である：

このイズロン酸配糖体の硫酸化は、以下の式を有する２−硫酸化配糖体を提供する：

この２−硫酸化イズロン酸配糖体の鹸化は、以下の式を有するイズロン酸配糖体を提供する：

鹸化された２−硫酸化イズロン酸配糖体は、下で説明するように酵素イズロン酸−２−スルファターゼのアッセイにおいて有用である。

本発明の方法で有益なスズ試薬としては、スタンニレンアセタールを形成できるスズ試薬が挙げられる。代表的なスズ試薬としては、酸化ジブチルスズ（ＩＶ）などの、ジアルキルスズ（ＶＩ）酸化物が挙げられる。

本発明の方法で有用な硫化剤としては、トリメチルアミンを有する三酸化硫黄錯体、ピリジン錯体および三酸化硫黄Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどの、三酸化硫黄試薬が挙げられる。

上記のように、一実施形態においては、本発明は、イズロン酸配糖体を選択的に２−硫酸化するための方法を提供する。ヘパリンおよびヘパラン硫酸フラグメントを調製するために使用された硫酸化糖類素材の合成の、多くの報告があるが、α−Ｌ−イズロン酸配糖体の２位での、硫酸エステルの簡単な組み込みについての報告は全くない。本発明の方法では、イズロン酸配糖体は、４位の硫酸化と比較して９０％を超える選択性で２位が硫酸化される。

２−硫酸化物は、蛍光定量アッセイを使用するかまたはエレクトロスプレイイオン化タンデム型質量分析を介して、イズロン酸−２−スルファターゼをアッセイするために用いることができる。蛍光定量アッセイは、ウンベリフェリル部分が存在することによって、可能となる。この場合、アッセイ混合物には、酵素α−Ｌ−イズロニダーゼが補充され、α−Ｌ−イズロニダーゼは、イズロン酸−２−スルファターゼが２−硫酸基を除去した後のみ、グリコシド結合を切断して蛍光ウンベリフェロンを放出する。タンデム型質量分析アッセイには、α−Ｌ−イズロニダーゼ結合酵素が必要ない。この場合、脱硫酸化されたα−Ｌ−イズロン酸配糖体が、タンデム型質量分析によって直接検出される。断片化がカルバミン酸エステルの切断（１００Ｄａの喪失）によってのみ進行するように、ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）基の存在は親イオンの安定性を導く。

一実施形態においては、本発明は、イズロン酸配糖体（例えば、α−Ｌ−イズロン酸配糖体）のエステルから出発する、２位に硫酸化を導入する３段階工程を提供する。この手順には、ジブチルスタンニレンアセタールとしてのイズロン酸部分の２−および４−ヒドロキシル基の保護、三酸化硫黄−トリメチルアミンによる選択的硫酸化および所望の２−硫酸エステルをもたらすためのエステルの脱保護が含まれる。

本発明の方法による代表的なイズロン酸配糖体（すなわち、α−Ｌ−イズロン酸配糖体）の選択的２−硫酸化の概略図が、実施例２に説明され、図１に示される。図１を参照すると、調製物は、実施例１に説明し図２に概略的に示されるように調製された、α−Ｌ−イズロン酸配糖体メチルエステル９ｂから始まる。還流下の無水メタノール中での１.５当量の酸化ジブチルスズを用いたメチルエステル９ｂの処理は、スタンニレンアセタールとして２−および４−ヒドロキシル基を保護する。アセタールは、更なる浄化なしで使用された。アセタールを、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解して、５５℃で２４時間、１．５当量の三酸化硫黄−トリメチルアミン錯体で処理した。粗生成物は、硫酸エステルのトリメチルアンモニウム塩をナトリウム塩に変換するために、陽イオン交換クロマトグラフィにかけられ、そして、２−硫酸化メチルエステル１０を提供するために、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィによって精製された。２−硫酸化メチルエステル１０を、メタノール／水に溶解して、メチルエステルを鹸化するために漸増量の水酸化ナトリウム水溶液で処理した。粗生成物は、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィによって精製されて、９６％の純度（化合物９ｂから６１％の全収率）の２−硫酸化配糖体１１を提供した。構造は、^１Ｈ−ＮＭＲおよびエレクトロスプレイイオン化質量分析によって確認された。硫酸化の選択性は、^１Ｈ−ＮＭＲ分析によって明らかになり、これは生成物の９６％が２位、４％が４位で硫酸化していることを示した。

４位で硫酸エステルを加水分解できる既知の酵素がないので、極微量の４―硫酸エステルの除去は、ハンター症候群の酵素アッセイの前に必要ではない。本発明の方法は、ハンター症候群のための新生児スクリーニングアッセイに有用なイズロン酸―２―スルファターゼ基質１１を提供する。

以下の例は、本発明を示すために提供されるが、限定するものではない。

（一般的な方法）
反応は、Ｎ_２雰囲気下で、オーブン乾燥したガラス容器の無水溶媒において実施した。薄層クロマトグラフィを、シリカプレート（シリカゲル６０、Ｆ−２５４（０．２５ｍｍ））上で実施した。^１Ｈ−ＮＭＲ化学シフトは、内標準（３.３１ｐｐｍ）としてメタノールピークを使用して、ｐｐｍ（δ）で報告される。エレクトロスプレイイオン化マススペクトルは、ｂｒｕｋｅｒ Ｅｓｑｕｉｒｅ ＬＣ０００６６イオントラップ分光計で獲得した。フラッシュクロマトグラフィは、シリカゲル（４０μｍから６３μｍ）を用いて実施した。

（実施例１）
（α−Ｌ−イズロン酸配糖体メチルエステルの調製）
α−Ｌ−イズロン酸配糖体メチルエステル９ｂの調製を、下に説明し、図２で示す。

メチル（２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルフロリド）ウロネート（２）。メチル１，２，３，４−テトラ−Ｏ−アセチル−α，β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート１（４．９８ｇ、１３．２５ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を、窒素下で、酢酸中３３％臭化水素酸６７ｍＬに０℃で懸濁した。０℃で１５分間攪拌した後、反応混合物を室温まで温め、２時間撹拌した。その後、反応混合物をトルエンで希釈し、真空下で濃縮した。残渣を２５０ｍＬの酢酸エチルで希釈し、１５０ｍＬの冷飽和炭酸水素ナトリウムおよび１５０ｍＬの冷ブラインによって洗浄した。有機物層をＭｇＳＯ_４上で乾燥し、真空下で濃縮して、次の段階において直接使用する粗製の臭化物誘導体を得た。臭化物中間体を、室温で、窒素下で１６７ｍＬの無水アセトニトリルに溶解した。その後、フッ化銀（３．３６ｇ、２６．４９ｍｍｏｌ、２ｅｑ）を添加した。反応混合物を、暗所で合計２１時間、攪拌した。反応混合物を、セライトで濾過し、濾液を真空下で濃縮した。シリカゲル（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、４：１から２：１）上のカラムクロマトグラフィにより、生成物２（３．３ｇ、７４％）を得た。

メチル（５−ブロモ−２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルフロリド）ウロネート（３）。無水四塩化炭素中の２（３．３ｇ、９．８ｍｍｏｌ、１ｅｑ）とＮ−ブロモコハク酸イミド（３．３２ｇ、１８．６５ｍｍｏｌ、１．９ｅｑ）の懸濁液を窒素下で、照射還流の下、合計６時間攪拌した、Ｎ―ブロモコハク酸イミド（３．３２ｇ、１８．６５ｍｍｏｌ、１．９ｅｑ）を２時間および４時間の反応後に添加した。反応混合物を室温に冷却し、ガラスウールで濾過した。溶媒を真空下で除去した。シリカゲル（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、３：１）上のカラムクロマトグラフィにより、生成物３（３．１２ｇ、７７％）を得た。

メチル（２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−イドピラノシルフロリド）ウロネート（４）。臭化物３（３．１６ｇ、７．６１ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を、５０ｍＬの無水ベンゼンに溶解して、窒素下で攪拌した。トリブチルスズヒドリド（３．１ｍＬ、１１．４ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を添加し、そして、反応混合物を４０分間還流した。混合物を室温に冷却し、そして、溶媒を真空下で除去した。シリカゲル（トルエン：ＥｔＯＡｃ、８：１から６：１）上のカラムクロマトグラフィにより、生成物４（１．６７ｇ、６５％）を得た。

（２’，２’，２’−トリクロロエチル）７−アセトキシクマリン−４−アセテート（６ａ）。４７ｍＬの無水ジクロロメタン中の７−アセトキシクマリン−４−酢酸５（９４５ｍｇ、３．６ｍｍｏｌ、１ｅｑ）の懸濁液に、窒素下、室温で２，２，２−トリクロロエタノール（４３１μＬ、４．５ｍｍｏｌ、１．２５ｅｑ）を添加した。１０ｍＬの無水ジクロロメタン中のＮ，Ｎ'―ジシクロヘキシルカルボジイミド（８１８ｍｇ、４ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）溶液を添加した。反応混合物を１５分攪拌し、そして、その後、ジクロロメタンで希釈し、濾過した。濾液を真空下で濃縮した。シリカゲル（ＣＨ_２Ｃｌ_２、それからＣＨ_２Ｃ_ｌ２：ＥｔＯＡｃ、１０：１）上のカラムクロマトグラフィにより、生成物６ａ（１．３７ｇ、９６％）を得た：Ｒ_ｆ ０．７８（ＣＨ_２Ｃ_ｌ２：ＥｔＯＡｃ、５：１）；^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ ７．６１（ｄ、１Ｈ、Ｊ_５，６ ８．７Ｈｚ、Ｈ−５）、７．１５（ｄ、１Ｈ、Ｊ_６，８ ２．１Ｈｚ、Ｈ−８）、７．０７（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ_６，８ ２．３、Ｊ_５，６ ８．７Ｈｚ、Ｈ−６）、６．４２（ｓ、１Ｈ、Ｈ−３）、４．７７（ｓ、２Ｈ、ＣＨ_２ＣＣ_ｌ３）、３．９１（２ｓ、２Η、ＣＨ_２ＣＯ_２）、２．３３（ｓ、３Η、ＯＡｃ）；^１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ １６８．６、１６７．０、１５４．５、１５３．５、１４６．５、１２５．５、１１８．５、１１７．０、１１６．５、１１０．９、７４．６、３７．７、２１．２；ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ３９３［Ｍ＋Ｈ］^＋。

（２’，２’，２’ −トリクロロエチル）７−ヒドロキシクマリン−４−アセテート（６ｂ）。１０８ｍＬの無水テトラヒドロフラン中の６ａ（１．０８ｇ、２．７４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）の溶液を、窒素下、室温で調製した。２−プロパノール（６．８ｍＬ、１３．７ｍｍｏｌ、５ｅｑ）中の２Ｍのアンモニアの溶液を、滴下した。反応混合物を、１８時間、しっかり密封されたフラスコで、室温において攪拌した。反応混合物を、真空下で濃縮した。シリカゲル（ＣＨ_２Ｃｌ_２、その後ＣＨ_２Ｃ_ｌ２：ＥｔＯＡｃ、１０：１から５：１）上のカラムクロマトグラフィによる精製により、生成物６ｂ（７５３ｍｇ、７８％）を得た：Ｒ_ｆ ０．６（ＣＨ_２Ｃｌ_２：Ｅｔ０Ａｃ５：１）；^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ_６−ＤＭＳＯ）：δ ７．５５（ｄ、１Ｈ、Ｊ_５，６ ８．７Ｈｚ、Ｈ−５）、６．７９（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ_６，８ ２．３、Ｊ_５，６ ８．７Ｈｚ、Ｈ−６）、６．７４（ｄ、１Ｈ、Ｊ_６，８ ２．３Ｈｚ、Ｈ−８）、６．３１（ｓ、１Ｈ、Ｈ−３）、４．９４（ｓ、２Ｈ、ＣＨ_２ＣＣｌ_３）、４．１４（２ｓ、２Η、ＣＨ_２ＣＯ_２）；^１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ｄ_６−ＤＭＳＯ）：δ １６８．４、１６１．８、１６０．５、１５５．５、１４９．２、１２７．３、１１３．５、１１２．９、１１１．５、１０２．８、９５．５、７４．０、３６．９;ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ３５１［Ｍ＋Ｈ］^＋。

（２’’，２’’，２’’ −トリクロロエチル）７−Ｏ−（メチル２’，３’，４’ −トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−イドピラノシルロネート）クマリン−４−アセテート（７）。２ｍＬの無水ジクロロメタンの中の６ｂ（７０３ｍｇ、２ｍｍｏｌ、１．２６ｅｑ）およびＬｉＣｌＯ_４／ＳｉＯ_２（２００ｍｇ）の懸濁液を、窒素下にて、室温で攪拌した。１，１，１，３，３，３−ヘキサメチルジシラザン（８３５μＬ、４ｍｍｏｌ、２．５２ｅｑ）を、滴下した。反応混合物を３５分攪拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、濾過した。濾液を回転蒸発によって濃縮し（２’，２’，２’−トリクロロエチル）７−Ｏ−トリメチルシリルクマリン−４−アセテート６ｃを得、それを更なる精製なしで次の段階で使用した。１０ｍＬの無水ジクロロメタン中の、グリコシル供与体４（５３４ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ、１ｅｑ）および前に調製されたグリコシル受容体６ｃの溶液を、窒素下にて、０℃まで冷却した。三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート（１９６μＬ、１．６ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を滴下し、その後、反応混合物を室温まで温めた。反応フラスコをしっかりと密封し、反応混合物を１．５時間攪拌してから、真空下で濃縮した。残渣を酢酸無水物（１０ｍＬ）に溶解し、三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート（８８μＬ）を添加した。２０分間攪拌した後に、反応物を２００ｍＬのジクロロメタンで希釈して、１００ｍＬの水、１００ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウムおよび１００ｍＬのブラインによって、洗浄した。有機物層をＭｇＳＯ４上で乾燥し、トルエンとの追加的な共蒸発によって、真空下で濃縮した。シリカゲル（ＣＨ_２Ｃｌ_２、その後ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＥｔＯＡｃ、１０：１から５：１）上のカラムクロマトグラフィにより、生成物７（９３４ｍｇ、８８％）を得た：［α］_Ｄ−８０°（ｃ １、ＣＨＣｌ_３）；Ｒ_ｆ ０．５（ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＥｔＯＡｃ５：１）；^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ ７．５３（ｄ、１Ｈ、Ｊ_５，６ ８．７Ｈｚ、Ｈ−５）、７．０６（ｄ、１Ｈ、Ｊ_６，８ ２．５Ｈｚ、Ｈ−８）、７．０１（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ_６，８ ２．５、Ｊ_５、６ ８．９Ｈｚ、Ｈ−６）、６．３３（ｓ、１Ｈ、Ｈ−３）、５．８４（ｄ、１Ｈ、Ｊ_１’２’ ２．５Ｈｚ、Ｈ−１’）、５．２０（ｍ、２Ｈ、Ｈ−３’、Ｈ−４’）、５．０５（ｍ、１Ｈ、Ｈ−２’）、４．８９（ｍ、１Ｈ、Ｈ−５’）、４．７７（２ｓ、２Ｈ、ＣＨ_２ＣＣｌ_３）、３．８７（ｓ、２Η、ＣＨ_２ＣＯ_２）、３．７７（ｓ、３Η、ＣＯ_２Ｍｅ）、２．１６〜２．０９（３ｓ、９Η、３ＯＡｃ）；^１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ １６９．５、１６９．４、１６９．０、１６７．９、１６７．２、１６０．２、１５８．９、１５５．３、１４６．７、１２６．０、１１５．７、１１４．１、１１３．２、１０４．９、９５．７、９４．５、７４．６、６７．８、６７．０、６６．８、５２．９、３７．７、２０．９、２０．９、２０．７；ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ６６７［Ｍ＋Ｈ］^＋。

（Ｎ―［４’’ −（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−ブチル］）７−０−（メチル２’，３’，４’ −トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−イドピラノシルロネート）クマリン−４−アセトアミド（９ａ）。配糖体７（８３１ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を、室温で、４１ｍＬの無水テトラヒドロフランに溶解した。溶液を０℃まで冷却し、９０％の水性酢酸（５．５ｍＬ）を添加した。最後に、塩化銅（１６７ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ、１ｅｑ）および亜鉛末（８１３ｍｇ、１２．４ｍｍｏｌ、１０ｅｑ）を、添加した。反応混合物を、合計３９時間、０℃で攪拌し、その間、亜鉛末（８１３ｍｇ、１２．４ｍｍｏｌ、１０ｅｑ）を１５時間および２５時間の反応後に添加した。反応混合物をセライトで濾過し、濾液を真空下で濃縮した。残渣を２００ｍＬのジクロロメタンに溶解し、１５０ｍＬの水（２回）および１５０ｍＬのブラインによって洗浄した。有機物層をＭｇＳＯ_４上で乾燥し、真空下で濃縮した。シリカゲル（ＣＨ_２Ｃｌ_２、その後ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＥｔＯＡｃ、５：１から２：１、１％の酢酸を有するすべての溶媒）上のカラムクロマトグラフィにより、生成物８（６３４ｍｇ、９５％）を得た。２０ｍＬの無水テトラヒドロフラン中の酸８（６２７ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ、１ｅｑ）の溶液を、０℃まで冷却した。Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ'−エチルカルボジイミド塩酸塩（２４５ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１９６ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）を添加し、懸濁液は０℃で３０分攪拌した。２ｍＬの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中のＮ−Ｂｏｃ−１，４−ジアミノブタン（２２３μＬ、１．２ｍｍｏｌ、１ｅｑ）の溶液を、懸濁液にゆっくりと添加した。反応混合物を、室温まで温め、３時間攪拌した。反応混合物を、真空下で濃縮した。残渣を２５０ｍＬの酢酸エチルに入れ、１５０ｍＬの１ＭのＨＣｌ、１５０ｍＬの水および１５０ｍＬのブラインによって洗浄した。有機物層をＭｇＳＯ_４上で乾燥し、真空下で濃縮した。シリカゲル（トルエン：アセトン、３：１から２：１）上のカラムクロマトグラフィにより、生成物９ａ（５２８ｍｇ、６５％）を得た。［α］_Ｄ−７０°（ｃ ０．８５、ＣＨＣｌ_３）；Ｒ_ｆ ０．３８（ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ、９５：５）；^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ７．６７（ｄ、１Ｈ、Ｊ_５，６ ８．７Ｈｚ、Ｈ−５）、７．０３（ｄ、１Ｈ、Ｊ_６，８ ２．３Ｈｚ、Ｈ−８）、６．９９（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ_６，８ ２．５、Ｊ_５，６ ８．７Ｈｚ、Ｈ−６）、６．２９（ｓ、１Ｈ、Ｈ−３）、５．８４（ｄ、１Ｈ、Ｊ_ｖｘ、２．１Ｈｚ、Ｈ−１）、５．２０（ｍ、２Ｈ、Ｈ−３’、Ｈ−４’）、５．０４（ｍ、１Ｈ、Ｈ−２’）、４．８９（ｄ、１Ｈ、Ｊ_{４’．５’}、２．１Ｈｚ、Ｈ−５’）、３．７７（ｓ、３Ｈ、ＣＯ_２Ｍｅ）、３．６５（ｓ、２Ｈ、ＣＨ_２ＣＯＮＨ）、３．２６（ｍ、２Ｈ、ＣＨ_２ＮＨＣＯ）、３．０９（ｍ、２Ｈ、ＣＨ_２ＮＨＣＯ）、２．１７〜２．０９（３ｓ、９Ｈ、３ＯＡｃ）、１．４９（ｍ、４Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ_２）、１．４２（ｓ、９Ｈ、ＣＭｅ_３）；^１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ １６９．４、１６９．４、１６９．０、１６７．８、１６７．６、１６０．７、１５８．８、１５６．４、１５５．２、１４９．７、１２６．７、１１４．５、１１４．５、１１３．２、１０４．５、９５．６、７９．４、６７．７、６６．９、６６．６、５２．８、３９．８、２８．５、２０．８、２０．８、２０．６；ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ７０７［Ｍ＋Ｈ］^＋。

（Ｎ―［４’’ −（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−ブチル］）７−Ｏ−（α−Ｌ−イドピラノシルウロン酸）クマリン−４−アセトアミド（９ｂ）。１６ｍＬのメタノール中の９ａ（９８ｍｇ、０．１６５ｍｍｏｌ、１ｅｑ）の溶液を０℃まで冷却した。メタノール（１４０μＬ、０．０７ｍｍｏｌ、０．４ｅｑ）中の０．５Ｍのナトリウムメトキシドの溶液を、滴下した。反応混合物を１．５時間０℃で攪拌した。反応混合物をアンバーライトＩＲ−１２０（Amberlite IR-120）（Ｈ^＋）によって中和して、濾過した。濾液を、真空下で濃縮した。シリカゲル（ＣＨ_２Ｃｌ_２、それからＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ、９：１）上のカラムクロマトグラフィにより、生成物９ｂ（６９ｍｇ、８６％）を得た：^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ）：δ７．６９（ｄ、１Ｈ、Ｊ_５，６ ９．７Ｈｚ、Ｈ−５）、７．１４（ｄ、１Ｈ、Ｊ_６，８ ２．３Ｈｚ、Ｈ−８）、７．１３（ｄｄ、１Ｈ、Ｈ−６）、６．２８（ｓ、１Ｈ、Ｈ−３）、５．７６（ｄ、１Ｈ、Ｊ_ｖｘ．３．９Ｈｚ、Ｈ−１’）、４．７５（ｄ、１Ｈ、Ｊ_{４’，５’}、３．５Ｈｚ、Ｈ−５’）、３．９７〜３．８９（ｍ、２Ｈ、Ｈ−２’、Ｈ−３’）、３．７７（ｓ、３Ｈ、ＣＯ_２Ｍｅ）、３．７４（ｓ、２Ｈ、ＣＨ_２ＣＯＮＨ）、３．７３（ｍ、１Ｈ、Ｈ−４’）、３．２１（ｍ、２Ｈ、ＣＨ_２ＮＨＣＯ）、３．０３（ｍ、２Ｈ、ＣＨ_２ＮＨＣＯ）、１．４９（ｍ、４Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ_２）、１．４２（ｓ、９Η、ＣＭｅ_３）；ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ５８１［Ｍ＋Η］^＋。

（実施例２）
（２−硫酸化α−Ｌ−イズロン酸配糖体１１の調製）
２−硫酸化α−Ｌ−イズロン酸配糖体１１の調製は、下に説明され、図１に示される。

α−Ｌ−イズロン酸配糖体メチルエステル１０の合成。実施例１で説明したように調製された、出発物質９ｂ（１６４．５ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を、１６ｍＬの無水メタノールに溶解し、ジブチルスズ（ＩＶ）酸化物（１０６ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ、オールドリッチ社製（Aldrich））を添加した。反応混合物を、４０分間、還流下で加熱し、その後、ジブチルスズ酸化物は完全に溶解した。反応混合物を冷却し、真空下で濃縮した。残渣は、微量の水を除去するために、トルエンを使用し、一度共蒸発させた。

残渣を１６ｍＬの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解した。三酸化硫黄−トリメチルアミン錯体（５９．１ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ、オールドリッチ社製（Aldrich））を添加し、反応混合物を５５℃で２４時間加熱した。反応混合物を冷却してから、メタノールで反応停止処理し、その後、真空下で濃縮した。トリメチルアンモニウム塩からナトリウム塩へ生成物を変換するために、残渣を、溶出剤としてメタノールを使用して、陽イオン交換クロマトグラフィ［Ｄｏｗｅｘ ５０ＷＸ８−４００（Ｎａ^＋）、１×４ｃｍ］に供した。ナトリウム塩を、メタノール／クロロホルム／水（５／８／１）を使用して、シリカ上のカラムクロマトグラフィによって精製し、α−Ｌ−イズロン酸配糖体メチルエステル１０を得た。ＴＬＣ（シリカ、メタノール／クロロホルム／水、５／８／１）：Ｒ_ｆ＝０．６。^１Ｈ−ＮＭＲ（３ＯＯ ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ）：１．４３（ｓ、９Ｈ、ｔ−ブチル）；１．５０（ｍ、４Ｈ、ＣＨ_２ＣＨ_２）；３．０４（ｍ、２Ｈ、ＣＨ_２Ｎ）；３．２１（ｔ、２Ｈ、ＣＨ_２Ｎ）；３．７４（ｂｒｓ、２Ｈ、ＣＨ_２ＣＯ）；３．７６（ｓ、３Ｈ、ＣＯ_２Ｍｅ）；３．９９（ｂｒｔ、１Ｈ、Ｈ−４）；４．１９（ｂｒｔ、１Ｈ、Ｈ−３）；４．５０（ｍ、ｌＨ，Ｈ−２）；４．８１（ｄ、１Ｈ、Ｈ−５）；６．００（ｂｒｓ、１Ｈ、Ｈ−Ｉ）；６．２８（ｓ、１Ｈ、クマリン・ビニルＣＨ）；７．１６〜７．１９（ｍ、２Ｈ、クマリンＣＨ）；７．７０（ｄ、１Ｈ、クマリンＣＨ）。

２−硫酸化α−Ｌ−イズロン酸配糖体１１の合成。化合物１０を、室温で、１５．４ｍＬのメタノール／水（１／１）に溶解した。水酸化ナトリウム０．１Ｍの水溶液を、溶液のｐＨが約８に達するまで（ｐＨ紙）、ＮａＯＨ（２８３μＬ、０．０３ｍｍｏｌ）を０．１当量ずつ添加した。ｐＨは、反応の進行に合わせて（１５〜３０分ごと）、０．１ＭのＮａＯＨ溶液を徐々に追加することによって、維持した。反応混合物を、５．５時間（１．３当量のＮａＯＨを添加した）攪拌し、その後、真空下で濃縮してメタノールを除去し、最後に一晩凍結乾燥した。残渣を、メタノール／クロロホルム／水（５／８／１）を使用する、シリカ上のカラムクロマトグラフィによって精製し、２−硫酸化α−Ｌ−イズロン酸配糖体１１（９６％が２−硫酸化、４％が４−硫酸化）を得、化合物９ｂからの全体の収率は６１％であった。ＴＬＣ（シリカ、メタノール／クロロホルム／水、５／８／１）：Ｒ_ｆ＝０．２、^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ）：１．４３（ｓ、９Ｈ、ｔ−ブチル）；１．５０（ｍ、４Ｈ、ＣＨ_２ＣＨ_２）；３．０４（ｔ、２Ｈ、ＣＨ_２Ｎ）；３．２１（ｔ、２Ｈ、ＣＨ_２Ｎ）；４．０７（ｂｒｓ、１Ｈ、Ｈ−４）；４．１７（ｂｒｓ、１Ｈ、Ｈ−３）；４．４８（ｂｒｓ、１Ｈ、Ｈ−２）；Ｈ−５水ピーク未満；６．１４（ｂｒｓ、０１Ｈ、Ｈ−１）；６．１７（ｓ、１Ｈ、クマリン・ビニルＣＨ）；７．０７〜７．１２（ｍ、２Ｈ、クマリンＣＨ）；７．５３（ｄ、１Ｈ、クマリンＣＨ）。エレクトロスプレイイオン化質量分析：（負のモード）（Ｍ−Ｈ）^−１、６４５．２と算定され、６４５．３と観察された。

例示的な実施形態が図示され説明されてきたが、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、さまざまな変更を当該実施形態において行うことができることを十分に理解されたい。

Claims (19)

1. ２位で配糖体を硫酸化するための方法であって、
   （ａ）２位および４位にてシスの関係にあるヒドロキシル基を有する配糖体をスズ試薬で処理して、配糖体である２，４−スタンニレンアセタールを提供することと、
   （ｂ）前記２，４−スタンニレンアセタールを硫化剤で処理して、２−硫酸化配糖体を提供することと、
   を含む方法。
2. 前記２−硫酸化配糖体が、９０％を超える選択性で前記２位にて硫酸化される、請求項１に記載の方法。
3. 前記２−硫酸化配糖体が、９５％を超える選択性で前記２位にて硫酸化される、請求項１に記載の方法。
4. 前記配糖体が、イズロン酸配糖体である、請求項１に記載の方法。
5. 前記配糖体が、α−Ｌ−イズロン酸配糖体である、請求項１に記載の方法。
6. 前記スズ試薬がジアルキルスズ（ＶＩ）酸化物である、請求項１に記載の方法。
7. 前記スズ試薬が酸化ジブチルスズ（ＩＶ）である、請求項１に記載の方法。
8. 前記硫化剤が三酸化硫黄である、請求項１に記載の方法。
9. 前記硫化剤が、三酸化硫黄トリメチルアミン錯体、三酸化硫黄ピリジン錯体、および三酸化硫黄Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド錯体から成る群から選択される三酸化硫黄錯体である、請求項１に記載の方法。
10. 前記配糖体が以下の式；
    

    

    を有する、請求項１に記載の方法。
11. ２−硫酸化配糖体が以下の式；
    

    

    を有する、請求項１に記載の方法。
12. 前記２−硫酸化配糖体メチルエステルを鹸化して、以下の式；
    

    

    を有する２−硫酸化配糖体を提供することを更に含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記配糖体が次の以下を有し、
    

    

    式中、エレクトロスプレイイオン化−タンデム型質量分析を受けた場合に前記配糖体が親イオンを形成し、
    Ｍは、前記親イオンから分解して衡突解離でフラグメントイオンを提供する部分であり、
    Ｌは、Ｍを前記配糖体部分に共有結合し、
    Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基である、
    請求項１に記載の方法。
14. ２−硫酸化配糖体が以下の式を有し、
    

    

    式中、エレクトロスプレイイオン化−タンデム型質量分析を受けた場合に前記硫酸化配糖体が親イオンを形成し、
    Ｍは、前記親イオンから分解して衡突解離でフラグメントイオンを提供する部分であり、
    Ｌは、Ｍを前記配糖体部分に共有結合し、
    Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基であり、
    Ｘは、水素、アンモニウムイオンまたは金属イオンである、
    請求項１に記載の方法。
15. 前記２−硫酸化配糖体メチルエステルを鹸化して、以下の式を有する２−硫酸化配糖体を提供することを更に含み、
    

    

    式中、エレクトロスプレイイオン化−タンデム型質量分析を受けた場合に前記硫酸化配糖体が親イオンを形成し、
    Ｍは、前記親イオンから分解して衡突解離でフラグメントイオンを提供する部分であり、
    Ｌは、Ｍを前記イズロン酸配糖体部分に共有結合し、
    Ｘは、水素、アンモニウムイオンまたは金属イオンである、
    請求項１４に記載の方法。
16. Ｍがブチルオキシカルボニル［Ｃ_４Ｈ_９ＯＣ（＝Ｏ）−］である、請求項１４に記載の方法。
17. Ｌが、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ_２−であり、式中、ｎは１〜８である、請求項１４に記載の方法。
18. 前記アンモニウムイオンがトリメチルアンモニウムである、請求項１４に記載の方法。
19. 前記金属イオンがナトリウムイオンである、請求項１４に記載の方法。

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