JP2012087091A - 化粧料 - Google Patents
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Abstract
【課題】シワ、タルミ等の皮膚老化現象、及びシミ、ソバカス等の色素沈着に対してすぐれた予防、改善効果を発揮して、皮膚を若々しく健全な状態に保持し、又は改善するとともに、皮膚に対する刺激が少なく生体安全性にもすぐれた新規な抗炎症成分を見出し、かかる成分を配合することにより、すぐれた美肌化効果及び美白効果を有すると共に、生体安全性にすぐれた化粧料の提供。
【解決手段】コラーゲンをテンペ菌によって発酵させることで得られ、脱顆粒抑制作用に基づく抗炎症効果を有する発酵物を有効成分とする化粧料。
【選択図】なし
【解決手段】コラーゲンをテンペ菌によって発酵させることで得られ、脱顆粒抑制作用に基づく抗炎症効果を有する発酵物を有効成分とする化粧料。
【選択図】なし
Description
本発明は、すぐれた抗炎症作用に基づく美肌効果及び美白効果を有し、かつ、生体安全性の高い化粧料に関するものである。
我々を取り巻く環境は、ハウスダスト、排気ガス、ダニなどの炎症やアレルギーを惹起する抗原性物質に囲まれている。また、紫外線や排気ガスなどに含まれる窒素酸化物や硫黄酸化物は皮膚に酸化ダメージを与えて、皮膚内の生体成分を変質させて、これにより、皮膚内に炎症やアレルギーを惹起する抗原性物質が生じる。これらの抗原性物質による炎症やアレルギーの発症には、抗原性物質が好塩基球やマスト細胞のＩｇＥ抗体のＦａｂ鎖を架橋することで細胞が刺激を受け、ヒスタミン、セロトニン、好酸球遊走因子などが放出される脱顆粒が関与していることが知られている。
さらに、上述のようにして発生する炎症によって皮膚の老化が加速することも知られている。即ち、皮膚の老化は、加齢に伴う細胞増殖・分化の不活化、ホルモン分泌の低下、細胞外マトリックス成分の量的低下などの内的要因だけではなく、紫外線や活性酸素などで誘発される炎症などによる細胞・組織の損傷などの外的要因が、複雑に絡み合って生ずる現象であり、この外的要因である炎症が皮膚内で過剰に発生すると老化が加速することとなる。
皮膚老化の外的要因である炎症は皮膚細胞に直接傷害を与えるだけでなく、白血球を遊走させたり、炎症性サイトカインの分泌を促進したりする。すなわち、細胞外マトリックス成分のコラーゲンを変性又は架橋させてシワの形成や皮膚の弾力性の低下をもたらし、さらにはメラニン色素の異常沈着を誘発してシミ、ソバカスを生じさせるなど、肌に様々なダメージを与える。
以上のことに鑑みて、従来、紫外線などで惹起される炎症の予防・症状改善を目的として、グリチルリチン酸、アラントインなどの抗炎症剤が提案され、これらを配合した皮膚外用剤が上市されている。
しかしながら、上記抗炎症剤は皮膚外用剤の配合原料として見た場合、必ずしも高い有効性を示すとは言えず、十分な効果を得るためには非常に高濃度なものを配合しなければならない。そのため、それら抗炎症剤を皮膚外用剤に適用した場合、安全性や製剤安定性の面で問題を生ずることがあり、安全性、製剤安定性及び抗炎症効果のすべての面で十分に満足できるものが要求されている。
上記従来技術の問題点に鑑み、本発明者らが鋭意研究を行った結果、天然成分由来のコラーゲンを微生物により発酵せることで得られるコラーゲン発酵物が、抗原によって誘導される好塩基球やマスト細胞の脱顆粒を顕著に抑制する作用を有し、本作用により、外部環境中又は生体内に存在する抗原性物質によってもたらされる皮膚の炎症を顕著に抑制し、炎症に伴い生じる皮膚の老化現象（シワ、タルミ）、及び色素沈着（シミ、ソバカス）を予防・改善する効果を奏することを見出して、本発明を完成させるに至った。
ここで、従来、コラーゲンは保湿剤として化粧品に配合されており、牛、豚、魚類等の様々な天然材料からのコラーゲンの製造方法やその化粧品配合成分としての利用が提案されている（例えば、特許文献１）。さらに、化粧品材料としてのコラーゲンの有効性を高めるために、コラーゲンを加水分解して得られる加水分解コラーゲンの製造方法やその化粧品配合成分としての利用も提案されている（例えば、特許文献２）。
また、従来、コラーゲンペプチドやエラスチンペプチド等を含む健康補助食品又は化粧品において、風味、臭いの改善を目的として、上記コラーゲンペプチドとして加水分解コラーゲンの発酵物を用いることも提案されている（特許文献３）
特開平０９−２７８６３９号
特開２００３−２３８５９８号
特開２００４−２５０３９５号
しかし、特許文献１，２に記載の従来技術は、未発酵のコラーゲン又は加水分解コラーゲンを化粧料用配合剤として利用したものであり、コラーゲンを微生物発酵の資化源として用いて得られる発酵生成物を化粧料配合剤として用いる本発明とは技術的思想を異にしている。従って、当然のことながら、特許文献１，２の記載からは、コラーゲンの発酵物が、好塩基球やマスト細胞の脱顆粒を強く抑制する作用を有し、本作用により、外部環境中又は生体内の抗原性物質によってもたらされる皮膚の炎症を顕著に抑制し、炎症に伴う皮膚の老化現象（シワ、タルミ等）、及び色素沈着（シミ、ソバカス等）を予防・改善する効果を奏することについては、開示も示唆もされていない。
また、特許文献３には健康補助食品又は化粧品の組成物としての加水分解コラーゲンペプチドの発酵物を用いることで風味や臭いを改善することが開示されているに過ぎず、コラーゲンを発酵させることで、皮膚生理活性（抗炎症作用等）が向上することについては、開示も示唆もされていない。
本発明は、コラーゲンをテンペ菌によって発酵させて得られる発酵物を有効成分とすることを特徴とする化粧料である。
また、本発明は、コラーゲンを、テンペ菌と、酵母、乳酸菌、又は麹菌のいずれか１種以上の微生物とを組み合わせて発酵させて得られる発酵物を有効成分とすることを特徴とする化粧料である。
また、本発明においてコラーゲンは魚類由来のものが好ましい。
なお、本発明において、化粧料なる文言は、所謂化粧料のほかに医薬部外品をも含む広義で用いる。
また、本発明は、コラーゲンを、テンペ菌と、酵母、乳酸菌、又は麹菌のいずれか１種以上の微生物とを組み合わせて発酵させて得られる発酵物を有効成分とすることを特徴とする化粧料である。
また、本発明においてコラーゲンは魚類由来のものが好ましい。
なお、本発明において、化粧料なる文言は、所謂化粧料のほかに医薬部外品をも含む広義で用いる。
本発明は、コラーゲンをテンペ菌により発酵させて得られる発酵物、又はコラーゲンを、テンペ菌と、酵母、乳酸菌、又は麹菌のいずれか１種以上の微生物とを組み合わせて発酵させて得られる発酵物を有効成分とする化粧料であり、有効成分として含まれる当該発酵物が示す強い脱顆粒抑制に起因する抗炎症作用により、外部環境中又は生体内の抗原性物質によってもたされる皮膚の炎症を抑制する効果を奏する。これにより、炎症に伴い生じる皮膚の老化現象（シワ、タルミ等）、及び色素沈着（シミ、ソバカス等）を予防・改善することができる。加えて、本発明は、天然物由来のコラーゲンを発酵させて得られる発酵物を有効成分とするものであることから、皮膚に対する刺激が少なく安全性にすぐれている。
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明で発酵に用いるコラーゲの起源、抽出方法又は加工・修飾手段等には特に制限はなく、起源としては、例えば、ハモ、ウナギ、キンメダイ、タイ、フグ、ヒラメ、タラ、マグロ、サメ、サケ等の魚類の皮や鱗；ミズクラゲ、エチゼンクラゲ等のクラゲ類、又はイカなどの海洋生物由来のもの、豚、鶏などの動物由来のもの等、多様なコラーゲンを用いることができる。又、抽出方法、加工・修飾手段についても、酸抽出によって得られる酸可溶化コラーゲン、ペプシン等の酵素処理によってテロペプチドを除去した酵素可溶化（アテロ化）コラーゲン、さらにはアシル化コラーゲンなど常法に従って抽出・加工・修飾を施して得られるコラーゲンのいずれをも使用することができる。それらのうちでも、本発明に於いては魚皮又は魚鱗から得られるコラーゲンの酵素可溶化（アテロ化）コラーゲンが特に好ましい。
本発明で発酵に用いるコラーゲの起源、抽出方法又は加工・修飾手段等には特に制限はなく、起源としては、例えば、ハモ、ウナギ、キンメダイ、タイ、フグ、ヒラメ、タラ、マグロ、サメ、サケ等の魚類の皮や鱗；ミズクラゲ、エチゼンクラゲ等のクラゲ類、又はイカなどの海洋生物由来のもの、豚、鶏などの動物由来のもの等、多様なコラーゲンを用いることができる。又、抽出方法、加工・修飾手段についても、酸抽出によって得られる酸可溶化コラーゲン、ペプシン等の酵素処理によってテロペプチドを除去した酵素可溶化（アテロ化）コラーゲン、さらにはアシル化コラーゲンなど常法に従って抽出・加工・修飾を施して得られるコラーゲンのいずれをも使用することができる。それらのうちでも、本発明に於いては魚皮又は魚鱗から得られるコラーゲンの酵素可溶化（アテロ化）コラーゲンが特に好ましい。
以下に、魚皮や魚鱗から得られるコラーゲンを用いて発酵物を調製する場合を例にとって、本発明の好ましい具体例について説明する。
まず、魚皮や魚鱗を洗浄し、脱脂、脱灰などの処理を行った後、プロテアーゼ溶液（例えば、ペプシン溶液、パパイン溶液等）により抽出処理を行って、コラーゲンの抽出液を得る。次に、この抽出液を塩析、脱水、洗浄などにより精製してコラーゲンペーストを得る。このコラーゲンペーストを０．０５％〜１０％程度の濃度となるよう溶媒に溶解又は懸濁し、コラーゲン溶液又は懸濁液を調製する。ここで、コラーゲンペーストの調製の際の温度は、室温及び液温共に１５℃以下とする。以上のように調製されたコラーゲン溶液又は懸濁液に対して微生物による発酵処理を行う。
まず、魚皮や魚鱗を洗浄し、脱脂、脱灰などの処理を行った後、プロテアーゼ溶液（例えば、ペプシン溶液、パパイン溶液等）により抽出処理を行って、コラーゲンの抽出液を得る。次に、この抽出液を塩析、脱水、洗浄などにより精製してコラーゲンペーストを得る。このコラーゲンペーストを０．０５％〜１０％程度の濃度となるよう溶媒に溶解又は懸濁し、コラーゲン溶液又は懸濁液を調製する。ここで、コラーゲンペーストの調製の際の温度は、室温及び液温共に１５℃以下とする。以上のように調製されたコラーゲン溶液又は懸濁液に対して微生物による発酵処理を行う。
これらの溶液又は懸濁液に対して発酵処理を行う前に、殺菌を行って発酵の障害となる雑菌を除去することが必要であるが、この殺菌方法としては、例えば、発酵素材（コラーゲンペースト）を予め殺菌用エタノール等で洗浄した後、無菌水等の無菌溶媒に懸濁する方法、発酵素材の溶解液又は懸濁液を除菌フィルターで濾過する方法、又は、発酵素材の溶解液又は懸濁液を加熱殺菌する方法が挙げられる。それら殺菌方法のうちでも、作業効率さらには発酵効率の観点から、本発明においては、加熱殺菌方法を用いることが最も好ましい。
加熱殺菌方法としては、懸濁液を１２０〜１３０℃で１０〜２０分間加熱するオートクレーブ殺菌法や、８０〜９０℃に６０〜１２０分間保持することを１日１回、２〜３日間繰り返す間断殺菌法といった一般的な加熱殺菌法を用いることも可能であるが、本発明においては、８０℃〜９０℃で６０〜１２０分間加熱する殺菌方法を用いることが好ましい。この加熱殺菌方法を用いることでコラーゲンの３本鎖が分離・分散状態になり発酵の効率化が向上すること、さらに、発酵後のコラーゲンが十分に脱顆粒抑制効果を奏し得ることからも好ましい。
また、発酵資化源であるコラーゲンと溶媒との重量比は好ましくは１：１０〜１：２０００の範囲であり、より好ましくは、５：１００〜１：５００の範囲である。
発酵素材を溶解または懸濁させるための溶媒としては、水或いは水と低級アルコール類（メタノール、エタノール、イソプロパノールなど）もしくはグリコール類（エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、１，２‐ペンタンジオール、グリセリンなど）との混液等が用いられるが、微生物が最もその作用を発揮しやすい点から、水の使用が最も好ましい。
発酵に用いる上記のコラーゲン溶液又は懸濁液には、グルコース、スクロース、フルクトースなどの糖類を添加することが好ましく、これによって、微生物の増殖、代謝が活発になり、コラーゲンが資化源としてより有効に利用されるため、発酵を一層促すことができる。糖類の添加量はコラーゲン溶液又は懸濁液に対して重量比で、一般には０．０１〜５％、好ましくは０．１〜２．０％の範囲である。
次に、この溶液又は懸濁液を発酵タンクに入れ、これに微生物１０５〜１０６個／ｍＬを植菌して発酵処理を行う。発酵に用いる微生物としては、例えば、テンペ菌、酵母、乳酸菌、又は麹菌のいずれか１種又は２種以上の組み合わせが挙げられるが、それらの中でも脱顆粒抑制効果の点からテンペ菌の使用が好ましい。また、テンペ菌単独でも十分か効果が得られるが、テンペ菌と、酵母、乳酸菌、又は麹菌のいずれかの微生物とを組み合わせることで、不快臭や色の改善効果が同時に得られるので、これらを組み合わせることがより好ましい。さらに、テンペ菌に代えて納豆菌を使用することでも同様の脱顆粒抑制効果を得ることができる。
発酵に用いるテンペ菌として、例えば、リゾプス・オリゼー（Rhizopus oryzae）、リゾプス・オリゴスポラス（Rhizopus
oligosporus）、リゾプス・ストロニファー（Rhizopus stolonifer）、リゾプス・アルフィザス（Rhizopus arrhizus）などのリゾプス属のカビが使用できるが、増殖速度が速く胞子の着生が少ないため取扱いの容易性の点で、リゾプス・オリゴスポラス（Rhizopus oligosporus）が最も好ましい。
oligosporus）、リゾプス・ストロニファー（Rhizopus stolonifer）、リゾプス・アルフィザス（Rhizopus arrhizus）などのリゾプス属のカビが使用できるが、増殖速度が速く胞子の着生が少ないため取扱いの容易性の点で、リゾプス・オリゴスポラス（Rhizopus oligosporus）が最も好ましい。
発酵に用いる酵母としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・アワモリ（Saccharomyces
awamori）、サッカロミセス・チェバリエリ（Saccharomyces chevalieri）、サッカロミセス・カールスバージェンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロミセス・バヨナス（Saccharomyces
bayonus）等のサッカロミセス属の酵母；トルラスポラ・デルブルエキ（Torulaspora delbruekii）、トルラスポラ・ファーメンタチ（Torulaspora fermentati）、トルラスポラ・ロゼィ（Torulaspora
rosei）等のトルラスポラ属の酵母；ジゴサッカロミセス・ローキシ（Zygosaccharomyces
rouxii）、ジゴサッカロミセス・ソーヤ（Zygosaccharomyces soya）、ジゴサッカロミセス・サケ（Zygosaccharomyces sake）、ジゴサッカロミセス・ミソ（Zygosaccharomyces
miso）、ジゴサッカロミセス・ラクティス（Zygosaccharomyces lactis）等のジゴサッカロミセス属の酵母；カンディダ・ベルサチリス（Candida versatilis）、カンディダ・エチェリシィ（Candida
etchellsii）、カンディダ・ケフィール（Candida kefyr）、カンディダ・サケ（Candida sake）、カンディダ・スコッティ（Candida scottii）等のカンディダ属の酵母など、いずれの酵母でも使用可能であるが、中でも食品に最も広く利用され、発酵力が強いといった点で、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）が最も好ましい。
awamori）、サッカロミセス・チェバリエリ（Saccharomyces chevalieri）、サッカロミセス・カールスバージェンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロミセス・バヨナス（Saccharomyces
bayonus）等のサッカロミセス属の酵母；トルラスポラ・デルブルエキ（Torulaspora delbruekii）、トルラスポラ・ファーメンタチ（Torulaspora fermentati）、トルラスポラ・ロゼィ（Torulaspora
rosei）等のトルラスポラ属の酵母；ジゴサッカロミセス・ローキシ（Zygosaccharomyces
rouxii）、ジゴサッカロミセス・ソーヤ（Zygosaccharomyces soya）、ジゴサッカロミセス・サケ（Zygosaccharomyces sake）、ジゴサッカロミセス・ミソ（Zygosaccharomyces
miso）、ジゴサッカロミセス・ラクティス（Zygosaccharomyces lactis）等のジゴサッカロミセス属の酵母；カンディダ・ベルサチリス（Candida versatilis）、カンディダ・エチェリシィ（Candida
etchellsii）、カンディダ・ケフィール（Candida kefyr）、カンディダ・サケ（Candida sake）、カンディダ・スコッティ（Candida scottii）等のカンディダ属の酵母など、いずれの酵母でも使用可能であるが、中でも食品に最も広く利用され、発酵力が強いといった点で、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）が最も好ましい。
また、発酵に用いる乳酸菌としては、例えば、ラクトバシルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバシルス・ブレビス（L.
brevis）、ラクトバシルス・カゼイ（L. casei）等のラクトバシルス（Lactobacillus）属の乳酸菌；カルノバクテリウム・ディバージェンス（Carnobacterium
divergens）、カルノバクテリウム・ピシコーラ（C. piscicola）等のカルノバクテリウム（Carnobacterium）属の乳酸菌；ロイコノストック・メセンテロイズ（Leuconostoc
mesenteroides）、ロイコノストック・シトレウム（L. citreum）等のロイコノストック（Leuconostoc）属の乳酸菌；ストレブトコッカス・フェーカリス（Streptococcus
faecalis）、ストレブトコッカス・ピオジェネス（S. pyogenes）等のストレブトコッカス（Streptococcus）属の乳酸菌；エンテロコッカス・カゼリフラバス（Enterococcus
caseliflavus）、エンテロコッカス・サルフレウス（E. sulfreus）等のエンテロコッカス（Enterococcus）属の乳酸菌；ラクトコッカス・プランタラム（Lactococcus
plantarum）、ラクトコッカス・ラフィノラクティス（L. rafinolactis）等のラクトコッカス（Lactococcus）属の乳酸菌；ヴェイセラ・コンフューザ（Weissella
confusa）、ヴェイセラ・カンドゥレリ（W. kandleri）等のヴェイセラ（Weissella）属の乳酸菌；アトポビウム・ミニュタム（Atopobium
minutum）、アトポビウム・パービュラス（A. parvulus）等のアトポビウム（Atopobium）属の乳酸菌；バゴコッカス・フルビアリス（Vagococcus
fluvialis）、バゴコッカス・サーモニナラム（V. salmoninarum）等のバゴコッカス（Vagococcus）属の乳酸菌；ペディオコッカス・ダムノサス（Pediococcus
damnosus）、ペディオコッカス・ペントサセウス（P. pentosaceus）等のペディオコッカス（Pediococcus）属の乳酸菌等が挙げられるが、中でも食品に最も広く利用され、発酵力が強いといった点で、ラクトバシルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）が最も好ましい。
brevis）、ラクトバシルス・カゼイ（L. casei）等のラクトバシルス（Lactobacillus）属の乳酸菌；カルノバクテリウム・ディバージェンス（Carnobacterium
divergens）、カルノバクテリウム・ピシコーラ（C. piscicola）等のカルノバクテリウム（Carnobacterium）属の乳酸菌；ロイコノストック・メセンテロイズ（Leuconostoc
mesenteroides）、ロイコノストック・シトレウム（L. citreum）等のロイコノストック（Leuconostoc）属の乳酸菌；ストレブトコッカス・フェーカリス（Streptococcus
faecalis）、ストレブトコッカス・ピオジェネス（S. pyogenes）等のストレブトコッカス（Streptococcus）属の乳酸菌；エンテロコッカス・カゼリフラバス（Enterococcus
caseliflavus）、エンテロコッカス・サルフレウス（E. sulfreus）等のエンテロコッカス（Enterococcus）属の乳酸菌；ラクトコッカス・プランタラム（Lactococcus
plantarum）、ラクトコッカス・ラフィノラクティス（L. rafinolactis）等のラクトコッカス（Lactococcus）属の乳酸菌；ヴェイセラ・コンフューザ（Weissella
confusa）、ヴェイセラ・カンドゥレリ（W. kandleri）等のヴェイセラ（Weissella）属の乳酸菌；アトポビウム・ミニュタム（Atopobium
minutum）、アトポビウム・パービュラス（A. parvulus）等のアトポビウム（Atopobium）属の乳酸菌；バゴコッカス・フルビアリス（Vagococcus
fluvialis）、バゴコッカス・サーモニナラム（V. salmoninarum）等のバゴコッカス（Vagococcus）属の乳酸菌；ペディオコッカス・ダムノサス（Pediococcus
damnosus）、ペディオコッカス・ペントサセウス（P. pentosaceus）等のペディオコッカス（Pediococcus）属の乳酸菌等が挙げられるが、中でも食品に最も広く利用され、発酵力が強いといった点で、ラクトバシルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）が最も好ましい。
また、麹菌としては、例えば、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・フラバス（Aspergillus
flavus）アスペルギルス・ポリオキソジェネス（Aspergillus polyoxogenes）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）などの黄麹菌；アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus
awamori）、アスペルギルス・カワウチ（Aspergillus kawauchii）、アスペルギルス・ウサミ（Aspergillus usami）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus
niger）などの黒麹菌；モナスカス・アンカ（Monascus anka）、モナスカス・ピロサス（monascus pilosus）などの紅麹菌が挙げられるが、それらの麹菌の中でも発酵液の色が薄いことや発酵臭が比較的少ないといった点で、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）が最も好ましい。
flavus）アスペルギルス・ポリオキソジェネス（Aspergillus polyoxogenes）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）などの黄麹菌；アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus
awamori）、アスペルギルス・カワウチ（Aspergillus kawauchii）、アスペルギルス・ウサミ（Aspergillus usami）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus
niger）などの黒麹菌；モナスカス・アンカ（Monascus anka）、モナスカス・ピロサス（monascus pilosus）などの紅麹菌が挙げられるが、それらの麹菌の中でも発酵液の色が薄いことや発酵臭が比較的少ないといった点で、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）が最も好ましい。
バシルス・ナットー（Bacillus natto）、バシルス・サブチルス（Bacillus subtilis）、バシルス・サーキュランス（Bacillus
circulans）などのバシルス属の細菌が使用可能であるが、中でも食品に広く使用されており、安全性が高い点で、バシルス・ナットー（Bacillus natto）が最も好ましい。
circulans）などのバシルス属の細菌が使用可能であるが、中でも食品に広く使用されており、安全性が高い点で、バシルス・ナットー（Bacillus natto）が最も好ましい。
発酵温度は一般には５〜５０℃の範囲、好ましくは微生物の生育至適温度である２０〜４０℃の範囲である。発酵期間は、発酵に用いるコラーゲンの種類（資化源、平均分子量、加工・修飾の有無）によって多少の相違はあるが、微生物の生育至適温度に於いて、一般に３時間〜１０日、好ましくは１０時間〜４日の範囲であり、かかる範囲に於いて、得られる発酵物中のペプチドの分子量の中心値が３，０００〜３０，０００の範囲、特に、５，０００〜２０，０００の範囲となる時点を指標として至適期間が定められる。発酵期間が上記の一般的範囲より短くなると発酵が不十分で発酵物の有効性が低下する傾向にあり、一方１０日を超えて長くしても有効性のそれ以上の上昇は認められないだけでなく、着色や発酵臭の増加が生ずることとなっていずれも好ましくない。
なお、上記発酵処理前、又は発酵処理と同時に、コラーゲンを酵素により加水分解処理してもよい。この場合、酵素としては、パパイン、ブロメライン、アクチナーゼ、ペプシン、及びトリプシンなどの蛋白分解酵素から選ばれた１種、又はそれらの酵素群からそれぞれ選ばれた１種又は２種以上の酵素を組み合わせて用いることが好ましい。但し、加水分解処理により、コラーゲンを構成するペプチド鎖の平均分子量が２０，０００未満とならないことが必須条件である。
酵素の添加量は、コラーゲン溶液または懸濁液の固形分に対して、合計で０．０１〜１０重量％の範囲とすることが好ましく、より好ましくは０．１〜２．０重量％の範囲である。温度、時間の処理条件としては、酵素処理を微生物発酵前に行うのであれば、各酵素の至適温度付近で１〜２４時間の処理を行うのがよく、一方微生物発酵と同時に行うのであれば、前記微生物発酵と同条件が適用される。
以上の微生物による発酵処理の終了後、微生物の殺菌と酵素処理を併用した場合であれば酵素の失活を兼ねて、発酵物に対して７０〜１００℃で１０〜１２０分程度の加熱殺菌処理を施した後、これをそのまま、或いは一般且つ好適にはろ過又は遠心分離などの固液分離手段によって液相を分収し、必要ならばｐＨを通常の化粧料のｐＨ領域であるｐＨ６〜８に調整し、さらに必要ならば希釈もしくは濃縮によって適宜の濃度とした上、化粧料の配合原料として供する。
上述のように調製した発酵物は、一般にはｐＨを４〜８に調製した上で、これをそのままの状態で化粧料配合剤として使用しても良く、又減圧濃縮等により所望の濃度として使用しても良い。また、抽出物はスプレードライ法等の常法により乾燥物としても良い。
また、上述のように調製した発酵物は、保存安定性等を高めるために、一定時間冷蔵保存した上で、化粧料配合剤として使用しても良い。
以上のように調製される本発明の発酵物は、後述の試験例に示す通り、顕著な好塩基球やマスト細胞の脱顆粒抑制作用を有すると共に、皮膚に対する刺激性が少なく生体安全性にもすぐれているので、当該発酵物を配合した化粧料は、シワ、たるみ、シミ、ソバカスの発生を予防し又はそれらの症状を改善して、肌を若々しく健全な状態に維持することができる。
本発明に係るコラーゲンの発酵物を含む化粧料としては、例えば乳液、クリーム、ローション、エッセンス、パックなどの基礎化粧料、口紅、ファンデーション、リクイドファンデーション、メイクアッププレスパウダー、ほほ紅、白粉などのメイクアップ化粧料、洗顔料、ボディシャンプー、石けんなどの清浄用化粧料、さらには浴剤等が挙げられるが、勿論これらに限定されるものではない。
本発明の化粧料におけるコラーゲンの発酵物の配合量は、発酵物の固形分として、基礎化粧料の場合は、一般に０．００２〜１．０重量％、好ましくは０．０２〜０．２重量％の範囲、メイクアップ化粧料の場合は、一般に０．００２〜１．０重量％、好ましくは０．０２〜０．２重量％の範囲、又清浄用化粧料の場合は、一般に０．００２〜１０．０重量％、好ましくは０．０２〜７．０重量％の範囲である。
本発明の化粧料には、必須成分のコラーゲンの発酵物のほかに、通常化粧料に用いられる成分、例えば油性成分、界面活性剤（合成系、天然物系）、保湿剤、増粘剤、防腐・殺菌剤、粉体成分、紫外線吸収剤、抗酸化剤、色素、香料等を必要に応じて適宜配合することができる。また、本発明のボタン科ボタン属に属する植物の花部の抽出物の有効性、特長を損なわない限り、他の生理活性成分と組み合わせて化粧料に配合することも何ら差し支えない。
ここで、油性成分としては、例えばオリーブ油、ホホバ油、ヒマシ油、大豆油、米油、米胚芽油、ヤシ油、パーム油、カカオ油、メドウフォーム油、シアーバター、ティーツリー油、アボガド油、マカデミアナッツ油、植物由来スクワランなどの植物由来の油脂類；ミンク油、タートル油などの動物由来の油脂類；ミツロウ、カルナウバロウ、ライスワックス、ラノリンなどのロウ類；流動パラフィン、ワセリン、パラフィンワックス、スクワランなどの炭化水素類；ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、イソステアリン酸、ｃｉｓ−１１−エイコセン酸などの脂肪酸類；ラウリルアルコール、セタノール、ステアリルアルコールなどの高級アルコール類；ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、オレイン酸ブチル、２−エチルヘキシルグリセライド、高級脂肪酸オクチルドデシル（ステアリン酸オクチルドデシル等）などの合成エステル類及び合成トリグリセライド類等が挙げられる。
界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルなどの非イオン界面活性剤；脂肪酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレン脂肪アミン硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル燐酸塩、α−スルホン化脂肪酸アルキルエステル塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル燐酸塩などのアニオン界面活性剤；第四級アンモニウム塩、第一級〜第三級脂肪アミン塩、トリアルキルベンジルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩、２−アルキル−１−アルキル−１−ヒドロキシエチルイミダゾリニウム塩、Ｎ，Ｎ−ジアルキルモルフォルニウム塩、ポリエチレンポリアミン脂肪酸アミド塩などのカチオン界面活性剤；Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−アルキル−Ｎ−カルボキシメチルアンモニオベタイン、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリアルキル−Ｎ−アルキレンアンモニオカルボキシベタイン、Ｎ−アシルアミドプロピル−Ｎ′，Ｎ′−ジメチル−Ｎ′−β−ヒドロキシプロピルアンモニオスルホベタインなどの両性界面活性剤等を使用することができる。
また、乳化剤乃至乳化助剤として、酵素処理ステビアなどのステビア誘導体、レシチン及びその誘導体、乳酸菌醗酵米、乳酸菌醗酵発芽米、乳酸菌醗酵穀類（麦類、豆類、雑穀など）、ジュアゼイロ（zizyphus joazeiro）抽出物等を配合することもできる。
また、乳化剤乃至乳化助剤として、酵素処理ステビアなどのステビア誘導体、レシチン及びその誘導体、乳酸菌醗酵米、乳酸菌醗酵発芽米、乳酸菌醗酵穀類（麦類、豆類、雑穀など）、ジュアゼイロ（zizyphus joazeiro）抽出物等を配合することもできる。
保湿剤としては、例えばグリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビトール、キシリトール、ピロリドンカルボン酸ナトリウム等があり、さらにトレハロース等の糖類、乳酸菌醗酵米、ムコ多糖類（例えば、ヒアルロン酸及びその誘導体、コンドロイチン及びその誘導体、ヘパリン及びその誘導体など）、エラスチン及びその誘導体、コラーゲン及びその誘導体、ＮＭＦ関連物質、乳酸、尿素、高級脂肪酸オクチルドデシル、海藻抽出物、ビャッキュウ抽出物、魚介類由来コラーゲン及びその誘導体、各種アミノ酸及びそれらの誘導体が挙げられる。
増粘剤としては、例えばアルギン酸、寒天、カラギーナン、フコイダン等の褐藻、緑藻又は紅藻由来成分；ビャッキュウ抽出物；ペクチン、ローカストビーンガム、アロエ多糖体等の多糖類；キサンタンガム、トラガントガム、グアーガム等のガム類；カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース等のセルロース誘導体；ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アクリル酸・メタクリル酸共重合体等の合成高分子類；ヒアルロン酸及びその誘導体；ポリグルタミン酸及びその誘導体等が挙げられる。
防腐・殺菌剤としては、例えば尿素；パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチルなどのパラオキシ安息香酸エステル類；フェノキシエタノール、ジクロロフェン、ヘキサクロロフェン、塩酸クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、サリチル酸、エタノール、ウンデシレン酸、フェノール類、ジャマール（イミダゾデイニールウレア）、１，２−ペンタンジオール、各種精油類、樹皮乾留物等がある。
粉体成分としては、例えばセリサイト、酸化チタン、タルク、カオリン、ベントナイト、酸化亜鉛、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、酸化ジルコニウム、硫酸バリウム、無水ケイ酸、雲母、ナイロンパウダー、ポリエチレンパウダー、シルクパウダー、セルロース系パウダー、穀類（米、麦、トウモロコシ、キビなど）のパウダー、豆類（大豆、小豆など）のパウダー等がある。
紫外線吸収剤としては、例えばパラアミノ安息香酸エチル、パラジメチルアミノ安息香酸エチルヘキシル、サリチル酸アミル及びその誘導体、パラメトキシ桂皮酸２−エチルヘキシル、桂皮酸オクチル、オキシベンゾン、２，４−ジヒドロキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン−５−スルホン酸塩、４−ターシャリーブチル−４−メトキシベンゾイルメタン、２−（２−ヒドロキシ−５−メチルフェニル）ベンゾトリアゾール、ウロカニン酸、ウロカニン酸エチル、アロエ抽出物等がある。
抗酸化剤としては、例えばブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、没食子酸プロピル、ビタミンＥ及びその誘導体、ビャッキュウ抽出物、イネ抽出物等がある。
生理活性成分としては、例えば美白成分として、ｔ−シクロアミノ酸誘導体、コウジ酸及びその誘導体、アスコルビン酸及びその誘導体、ハイドロキノン誘導体、エラグ酸及びその誘導体、レゾルシノール誘導体、ソウハクヒ抽出物、ユキノシタ抽出物、米糠抽出物、米糠抽出物加水分解物、乳酸菌醗酵米、乳酸菌醗酵発芽米、乳酸菌醗酵穀類（麦類、豆類、雑穀類）、白芥子加水分解抽出物、ムラサキシキブ抽出物、パンダヌス・アマリリフォリウス(Pandanus amaryllifolius Roxb.)抽出物、アルカンジェリシア・フラバ（Arcangelicia flava Merrilli）抽出物、カミツレ抽出物（商品名：カモミラET)、コンブ等の海藻の抽出物、アマモ等の海草の抽出物、リノール酸及びその誘導体もしくは加工物（例えばリポソーム化リノール酸など）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸誘導体等が、又皮膚老化防止・美肌化成分として、動物又は魚由来のコラーゲン及びその誘導体、エラスチン及びその誘導体、ニコチン酸及びその誘導体、グリチルリチン酸及びその誘導体（ジカリウム塩等）、ｔ−シクロアミノ酸誘導体、ビタミンＡ及びその誘導体、ビタミンＥ及びその誘導体、アラントイン、α−ヒドロキシ酸類、ジイソプロピルアミンジクロロアセテート、γ−アミノ−β−ヒドロキシ酪酸、ゲンチアナエキス、甘草エキス、ハトムギエキス、カミツレエキス、ニンジンエキス、アロエエキスなどの生薬抽出エキス、米抽出物加水分解物、米糠抽出物加水分解物、米醗酵エキス、ミツイシコンブ抽出物、アナアオサ抽出物、アマモ等の海草の抽出物、ソウハクヒエキス、ジョアゼイロ（Zizyphus joazeiro）抽出物等がある。
上記のコウジ酸誘導体としては、例えばコウジ酸モノブチレート、コウジ酸モノカプレート、コウジ酸モノパルミテート、コウジ酸ジブチレートなどのコウジ酸エステル類、コウジ酸エーテル類、コウジ酸グルコシドなどのコウジ酸糖誘導体等が、アスコルビン酸誘導体としては、例えばＬ−アスコルビン酸−２−リン酸エステルナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸エステルマグネシウム、Ｌ−アスコルビン酸−２−硫酸エステルナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸−２−硫酸エステルマグネシウムなどのアスコルビン酸エステル塩類、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド（２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸）、Ｌ−アスコルビン酸−５−グルコシド（５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸）などのアスコルビン酸糖誘導体、それらアスコルビン酸糖誘導体の６位アシル化物（アシル基は、ヘキサノイル基、オクタノイル基、デカノイル基など）、Ｌ−アスコルビン酸テトライソパルミチン酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸テトララウリン酸エステルなどのＬ−アスコルビン酸テトラ脂肪酸エステル類、３−Ｏ−エチルアスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸−６−Ｏ−パルミテートナトリウム等が、ハイドロキノン誘導体としては、アルブチン（ハイドロキノン−β−Ｄ−グルコピラノシド）、α−アルブチン（ハイドロキノン−α−Ｄ−グルコピラノシド）等が、レゾルシノール誘導体としては、例えば４−ｎ−ブチルレゾルシノール、４−イソアミルレゾルシノール等が、２，５−ジヒドロキシ安息香酸誘導体としては、例えば２，５−ジアセトキシ安息香酸、２−アセトキシ−５−ヒドロキシ安息香酸、２−ヒドロキシ−５−プロピオニルオキシ安息香酸等が、ニコチン酸誘導体としては、例えばニコチン酸アミド、ニコチン酸ベンジル等が、ビタミンＥ誘導体としては、例えばビタミンＥニコチネート、ビタミンＥリノレート等が、α−ヒドロキシ酸としては、例えば乳酸、リンゴ酸、コハク酸、クエン酸、α−ヒドロキシオクタン酸等がある。
次に、製造例、実施例(処方例)及び試験例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。なお、以下において、部はすべて重量部を、また％はすべて重量％を意味する。
製造例１．コラーゲンのテンペ菌・酵母発酵液の調製（１）
冷凍されたハモ（Muraenesox cinereus）の皮３０ｇを解凍して１０〜２０ｍｍ角に細断した。この細断物に０．１Ｍ
水酸化ナトリウム水溶液９００ｍＬを加えてジューサーミキサーでホモジナイズし、液相部を捨てる操作を３回繰り返し、魚皮細断物を十分水洗した。次に、水洗した魚皮を十分水切りし、これにペプシン０．０３ｇを含む０．５Ｍ酢酸水溶液９００ｍＬを加え、４〜１０℃で２４時間攪拌してコラーゲンを抽出した。この抽出液を濾過して抽出残渣の魚皮を除いた後、得られた清澄化抽出液に、攪拌下０．７Ｍになるように塩化ナトリウムを添加し、１時間攪拌を続けてコラーゲンを析出させた。析出したコラーゲンを遠心分離により回収し、これを５０ｍＭリン酸水素二ナトリウム９００ｍＬに懸濁して２４時間攪拌した後、再び遠心分離を行ってコラーゲンを回収した。回収されたコラーゲンを精製水１５０ｍＬに懸濁し、懸濁液を攪拌、水洗後、遠心分離する操作を３回繰り返した後、得られた精製コラーゲンを精製水に懸濁して、コラーゲンの懸濁液を得た。さらにグルコース０．７５ｇを添加して溶解し、この得られた懸濁液を８０℃で６０分間加熱殺菌した。この懸濁液にテンペ菌（リゾプス・オリゴスポラス）を１０６個／ｍＬ接種し、３７℃で３日間振とう培養した。培養終了後、培養液を８０℃で６０分間加熱殺菌した。殺菌後、酵母（サッカロミセス・セレビシエ）を１０６個／ｍＬ接種し、３０℃で３日間静置培養した。培養終了後、培養液を８０℃で６０分間加熱殺菌して、ろ過し、さらに、脱臭、脱色処理を行い、コラーゲン発酵液１２０ｇ（固形分濃度２．０％）を得た。
冷凍されたハモ（Muraenesox cinereus）の皮３０ｇを解凍して１０〜２０ｍｍ角に細断した。この細断物に０．１Ｍ
水酸化ナトリウム水溶液９００ｍＬを加えてジューサーミキサーでホモジナイズし、液相部を捨てる操作を３回繰り返し、魚皮細断物を十分水洗した。次に、水洗した魚皮を十分水切りし、これにペプシン０．０３ｇを含む０．５Ｍ酢酸水溶液９００ｍＬを加え、４〜１０℃で２４時間攪拌してコラーゲンを抽出した。この抽出液を濾過して抽出残渣の魚皮を除いた後、得られた清澄化抽出液に、攪拌下０．７Ｍになるように塩化ナトリウムを添加し、１時間攪拌を続けてコラーゲンを析出させた。析出したコラーゲンを遠心分離により回収し、これを５０ｍＭリン酸水素二ナトリウム９００ｍＬに懸濁して２４時間攪拌した後、再び遠心分離を行ってコラーゲンを回収した。回収されたコラーゲンを精製水１５０ｍＬに懸濁し、懸濁液を攪拌、水洗後、遠心分離する操作を３回繰り返した後、得られた精製コラーゲンを精製水に懸濁して、コラーゲンの懸濁液を得た。さらにグルコース０．７５ｇを添加して溶解し、この得られた懸濁液を８０℃で６０分間加熱殺菌した。この懸濁液にテンペ菌（リゾプス・オリゴスポラス）を１０６個／ｍＬ接種し、３７℃で３日間振とう培養した。培養終了後、培養液を８０℃で６０分間加熱殺菌した。殺菌後、酵母（サッカロミセス・セレビシエ）を１０６個／ｍＬ接種し、３０℃で３日間静置培養した。培養終了後、培養液を８０℃で６０分間加熱殺菌して、ろ過し、さらに、脱臭、脱色処理を行い、コラーゲン発酵液１２０ｇ（固形分濃度２．０％）を得た。
製造例２．コラーゲンのテンペ菌・酵母発酵液の調製（２）
酵母としてサッカロミセス・セレビシエに代えてサッカロミセス・アワモリを用いる他は製造例１と同様にして、コラーゲン発酵液１１８ｇ（固形分濃度１．８％）を得た。
酵母としてサッカロミセス・セレビシエに代えてサッカロミセス・アワモリを用いる他は製造例１と同様にして、コラーゲン発酵液１１８ｇ（固形分濃度１．８％）を得た。
製造例３．コラーゲンのテンペ菌・酵母発酵液の調製（３）
酵母としてリゾプス・オリゴスポラスに代えてリゾプス・オリザエを用いる他は製造例１と同様にして、コラーゲン発酵液１１９ｇ（固形分濃度１．９％）を得た。
酵母としてリゾプス・オリゴスポラスに代えてリゾプス・オリザエを用いる他は製造例１と同様にして、コラーゲン発酵液１１９ｇ（固形分濃度１．９％）を得た。
製造例４．コラーゲンのテンペ菌・酵母発酵液の調製（４）
コラーゲンの原料としてハモの皮に代えてキンメダイの皮を用いる他は製造例１と同様にして、コラーゲンの発酵物の水溶液１２１ｇ（固形分濃度２．０％）を得た。
コラーゲンの原料としてハモの皮に代えてキンメダイの皮を用いる他は製造例１と同様にして、コラーゲンの発酵物の水溶液１２１ｇ（固形分濃度２．０％）を得た。
製造例５．コラーゲンのテンペ菌・酵母発酵液の調製（５）
冷凍した１０ｋｇのミズクラゲを解凍し、濾過、清澄化した後、得られた清澄化液のｐＨを乳酸で３．０に調整した。攪拌下１１％となるように塩化ナトリウムを添加し、１時間攪拌を続けてコラーゲンを析出させた。析出したコラーゲンを遠心分離により回収し、これを５０ｍＭリン酸水素二ナトリウム９００ｍＬに懸濁して２４時間攪拌した後、再び遠心分離を行ってコラーゲンを回収した。次に、回収されたコラーゲンを精製水５００ｍＬに懸濁し、懸濁液を攪拌、水洗後、遠心分離する操作を３回繰り返した後、得られた精製コラーゲンを精製水に懸濁して、コラーゲンの懸濁液を得た。さらにスクロース２．５ｇを添加して溶解し、この得られた懸濁液を８０℃で６０分間加熱殺菌した。この懸濁液に酵母（サッカロミセス・セレビシエ）を１０６個／ｍＬ接種し、３０℃で３日間静置培養した。培養終了後、培養液を８０℃で６０分間加熱殺菌した。殺菌後、テンペ菌（リゾプス・オリゴスポラス）を１０６個／ｍＬ接種し、３７℃で３日間振とう培養した。培養終了後、培養液を８０℃で６０分間加熱殺菌して、ろ過し、さらに、脱臭、脱色処理を行い、コラーゲン発酵液４５０ｇ（固形分濃度０．８％）を得た。
冷凍した１０ｋｇのミズクラゲを解凍し、濾過、清澄化した後、得られた清澄化液のｐＨを乳酸で３．０に調整した。攪拌下１１％となるように塩化ナトリウムを添加し、１時間攪拌を続けてコラーゲンを析出させた。析出したコラーゲンを遠心分離により回収し、これを５０ｍＭリン酸水素二ナトリウム９００ｍＬに懸濁して２４時間攪拌した後、再び遠心分離を行ってコラーゲンを回収した。次に、回収されたコラーゲンを精製水５００ｍＬに懸濁し、懸濁液を攪拌、水洗後、遠心分離する操作を３回繰り返した後、得られた精製コラーゲンを精製水に懸濁して、コラーゲンの懸濁液を得た。さらにスクロース２．５ｇを添加して溶解し、この得られた懸濁液を８０℃で６０分間加熱殺菌した。この懸濁液に酵母（サッカロミセス・セレビシエ）を１０６個／ｍＬ接種し、３０℃で３日間静置培養した。培養終了後、培養液を８０℃で６０分間加熱殺菌した。殺菌後、テンペ菌（リゾプス・オリゴスポラス）を１０６個／ｍＬ接種し、３７℃で３日間振とう培養した。培養終了後、培養液を８０℃で６０分間加熱殺菌して、ろ過し、さらに、脱臭、脱色処理を行い、コラーゲン発酵液４５０ｇ（固形分濃度０．８％）を得た。
製造例６．コラーゲンのテンペ菌・酵母発酵液の調製（６）
製造例１と同様にして回収したコラーゲンを精製水１５０ｍＬに懸濁し、懸濁液を攪拌、水洗後、遠心分離する操作を３回繰り返した後、得られた精製コラーゲンを精製水に懸濁して、コラーゲンの懸濁液を得た。さらにグルコース０．７５ｇを添加して溶解し、得られた懸濁液を８０℃で６０分間加熱殺菌した。この懸濁液に酵母（サッカロミセス・セレビシエ）を１０６個／ｍＬ接種し、３０℃で３日間静置培養した。培養終了後、８０℃で１時間加熱殺菌し、テンペ菌（リゾプス・オリゴスポラス）を１０６個／ｍＬ接種し、３７℃で３日間振とう培養した。培養終了後、培養液を８０℃６０分間加熱殺菌して、ろ過し、さらに、脱臭、脱色処理を行い、コラーゲン発酵液１２０ｇ（固形分濃度１．８％）を得た。
製造例１と同様にして回収したコラーゲンを精製水１５０ｍＬに懸濁し、懸濁液を攪拌、水洗後、遠心分離する操作を３回繰り返した後、得られた精製コラーゲンを精製水に懸濁して、コラーゲンの懸濁液を得た。さらにグルコース０．７５ｇを添加して溶解し、得られた懸濁液を８０℃で６０分間加熱殺菌した。この懸濁液に酵母（サッカロミセス・セレビシエ）を１０６個／ｍＬ接種し、３０℃で３日間静置培養した。培養終了後、８０℃で１時間加熱殺菌し、テンペ菌（リゾプス・オリゴスポラス）を１０６個／ｍＬ接種し、３７℃で３日間振とう培養した。培養終了後、培養液を８０℃６０分間加熱殺菌して、ろ過し、さらに、脱臭、脱色処理を行い、コラーゲン発酵液１２０ｇ（固形分濃度１．８％）を得た。
製造例７．コラーゲンのテンペ菌・酵母発酵液の調製（７）
製造例１と同様にして回収したコラーゲンを精製水１５０ｍＬに懸濁し、懸濁液を攪拌、水洗後、遠心分離する操作を３回繰り返した後、得られた精製コラーゲンを精製水に懸濁して、コラーゲンの懸濁液を得た。さらにスクロース１．０ｇを添加し懸濁し、この得られた懸濁液を８０℃で６０分間加熱殺菌した。この懸濁液に酵母（サッカロミセス・セレビシエ）とテンペ菌（リゾプス・オリゴスポラス）とをそれぞれ１０６個／ｍＬ接種し、３７℃で３日間振とう培養した。培養終了後、培養液を８０℃で６０分間加熱殺菌して、ろ過し、さらに、脱臭、脱色処理を行い、コラーゲン発酵液１２０ｇ（固形分濃度１．７％）を得た。
製造例１と同様にして回収したコラーゲンを精製水１５０ｍＬに懸濁し、懸濁液を攪拌、水洗後、遠心分離する操作を３回繰り返した後、得られた精製コラーゲンを精製水に懸濁して、コラーゲンの懸濁液を得た。さらにスクロース１．０ｇを添加し懸濁し、この得られた懸濁液を８０℃で６０分間加熱殺菌した。この懸濁液に酵母（サッカロミセス・セレビシエ）とテンペ菌（リゾプス・オリゴスポラス）とをそれぞれ１０６個／ｍＬ接種し、３７℃で３日間振とう培養した。培養終了後、培養液を８０℃で６０分間加熱殺菌して、ろ過し、さらに、脱臭、脱色処理を行い、コラーゲン発酵液１２０ｇ（固形分濃度１．７％）を得た。
製造例８．コラーゲンのテンペ菌発酵液の調製（８）
製造例１と同様にして回収したコラーゲンを精製水１５０ｍＬに懸濁し、懸濁液を攪拌、水洗後、遠心分離する操作を３回繰り返した後、得られた精製コラーゲンを精製水に懸濁して、コラーゲンの懸濁液を得た。これに、さらに、グルコース０．７５ｇを添加して溶解し、この得られた懸濁液を８０℃で６０分間加熱殺菌した。この懸濁液にテンペ菌（リゾプス・オリゴスポラス）を１０６個／ｍＬ接種し、３７℃で３日間振とう培養した。培養終了後、培養液を８０℃で６０分間加熱殺菌して、ろ過し、さらに、脱臭、脱色処理を行い、コラーゲン発酵液１２１ｇ（固形分濃度２．１％）を得た。
製造例１と同様にして回収したコラーゲンを精製水１５０ｍＬに懸濁し、懸濁液を攪拌、水洗後、遠心分離する操作を３回繰り返した後、得られた精製コラーゲンを精製水に懸濁して、コラーゲンの懸濁液を得た。これに、さらに、グルコース０．７５ｇを添加して溶解し、この得られた懸濁液を８０℃で６０分間加熱殺菌した。この懸濁液にテンペ菌（リゾプス・オリゴスポラス）を１０６個／ｍＬ接種し、３７℃で３日間振とう培養した。培養終了後、培養液を８０℃で６０分間加熱殺菌して、ろ過し、さらに、脱臭、脱色処理を行い、コラーゲン発酵液１２１ｇ（固形分濃度２．１％）を得た。
比較例１．コラーゲン液の調製
冷凍されたハモ（Muraenesox cinereus）の皮３０ｇを解凍して１０〜２０ｍｍ角に細断した。この細断物に０．１Ｍ
水酸化ナトリウム水溶液９００ｍＬを加えてジューサーミキサーでホモジナイズし、液相部を捨てる操作を３回繰り返し、魚皮細断物を十分水洗した。次に、水洗した魚皮を十分水切りし、これにペプシン０．０３ｇを含む０．５Ｍ酢酸水溶液９００ｍＬを加え、４〜１０℃で２４時間攪拌してコラーゲンを抽出した。この抽出液を濾過して抽出残渣の魚皮を除いた後、得られた清澄化抽出液に、攪拌下０．７Ｍになるように塩化ナトリウムを添加し、１時間攪拌を続けてコラーゲンを析出させた。析出したコラーゲンを遠心分離により回収し、これを５０ｍＭリン酸水素二ナトリウム９００ｍＬに懸濁して２４時間攪拌した後、再び遠心分離を行ってコラーゲンを回収した。回収されたコラーゲンを精製水１５０ｍＬに懸濁し、懸濁液を攪拌、水洗後、遠心分離する操作を３回繰り返した後、得られた精製コラーゲンを精製水に懸濁して、コラーゲンの懸濁液７００ｇ（固形分濃度０．３％）を得た。
冷凍されたハモ（Muraenesox cinereus）の皮３０ｇを解凍して１０〜２０ｍｍ角に細断した。この細断物に０．１Ｍ
水酸化ナトリウム水溶液９００ｍＬを加えてジューサーミキサーでホモジナイズし、液相部を捨てる操作を３回繰り返し、魚皮細断物を十分水洗した。次に、水洗した魚皮を十分水切りし、これにペプシン０．０３ｇを含む０．５Ｍ酢酸水溶液９００ｍＬを加え、４〜１０℃で２４時間攪拌してコラーゲンを抽出した。この抽出液を濾過して抽出残渣の魚皮を除いた後、得られた清澄化抽出液に、攪拌下０．７Ｍになるように塩化ナトリウムを添加し、１時間攪拌を続けてコラーゲンを析出させた。析出したコラーゲンを遠心分離により回収し、これを５０ｍＭリン酸水素二ナトリウム９００ｍＬに懸濁して２４時間攪拌した後、再び遠心分離を行ってコラーゲンを回収した。回収されたコラーゲンを精製水１５０ｍＬに懸濁し、懸濁液を攪拌、水洗後、遠心分離する操作を３回繰り返した後、得られた精製コラーゲンを精製水に懸濁して、コラーゲンの懸濁液７００ｇ（固形分濃度０．３％）を得た。
比較例２．加水分解コラーゲン液の調製
比較例１と同様にして回収したコラーゲンを精製水に分散させて固形分濃度１．０重量％のコラーゲン懸濁液３００gを調製し、コラゲナーゼを固形分濃度に対して１％添加し、４０℃で２時間加水分解処理を行った。その後、８０℃で３０分間加熱し、酵素を失活させた。この液に対してろ過、脱臭処理を行い、加水分解コラーゲン溶液を２５０ｇ（固形分濃度１．０％）得た。
比較例１と同様にして回収したコラーゲンを精製水に分散させて固形分濃度１．０重量％のコラーゲン懸濁液３００gを調製し、コラゲナーゼを固形分濃度に対して１％添加し、４０℃で２時間加水分解処理を行った。その後、８０℃で３０分間加熱し、酵素を失活させた。この液に対してろ過、脱臭処理を行い、加水分解コラーゲン溶液を２５０ｇ（固形分濃度１．０％）得た。
実施例１．クリーム
［Ａ成分］ 部
流動パラフィン ５．０
ヘキサラン （注１） ４．０
パラフィン ５．０
グリセリルモノステアレート ２．０
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート ６．０
ブチルパラベン ０．１
（注１）株式会社テクノーブル製 トリオクタン酸グリセリル
［Ｂ成分］
製造例１の発酵液 ５．０
グリセリン ５．０
カルボキシメチルモノステアレート ０．１
モイストン・Ｃ （注２） １．０
精製水 全量が１００部となる量
（注２）株式会社テクノーブル製 ＮＭＦ成分
［Ｃ成分］
香料 適量
上記のＡ成分とＢ成分をそれぞれ８０℃以上に加熱した後、攪拌混合した。これを５０℃まで冷却した後、Ｃ成分を加えてさらに攪拌混合してクリームを得た。
［Ａ成分］ 部
流動パラフィン ５．０
ヘキサラン （注１） ４．０
パラフィン ５．０
グリセリルモノステアレート ２．０
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート ６．０
ブチルパラベン ０．１
（注１）株式会社テクノーブル製 トリオクタン酸グリセリル
［Ｂ成分］
製造例１の発酵液 ５．０
グリセリン ５．０
カルボキシメチルモノステアレート ０．１
モイストン・Ｃ （注２） １．０
精製水 全量が１００部となる量
（注２）株式会社テクノーブル製 ＮＭＦ成分
［Ｃ成分］
香料 適量
上記のＡ成分とＢ成分をそれぞれ８０℃以上に加熱した後、攪拌混合した。これを５０℃まで冷却した後、Ｃ成分を加えてさらに攪拌混合してクリームを得た。
実施例２．乳液
［Ａ成分］ 部
流動パラフィン ６．０
ヘキサラン ４．０
ホホバ油 １．０
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート ２．０
大豆レシチン １．５
メチルパラベン ０．１５
エチルパラベン ０．０３
［Ｂ成分］
製造例１の発酵液 ５．０
グリセリン ３．０
１，３−ブチレングリコール ２．０
カルボキシメチルセルロース ０．３
ヒアルロン酸ナトリウム ０．０１
精製水 全量が１００部となる量
［Ｃ成分］
香料 適量
上記のＡ成分とＢ成分をそれぞれ８０℃以上に加熱した後、攪拌混合した。これを５０℃まで冷却した後、Ｃ成分を加えてさらに攪拌混合して乳液を得た。
［Ａ成分］ 部
流動パラフィン ６．０
ヘキサラン ４．０
ホホバ油 １．０
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート ２．０
大豆レシチン １．５
メチルパラベン ０．１５
エチルパラベン ０．０３
［Ｂ成分］
製造例１の発酵液 ５．０
グリセリン ３．０
１，３−ブチレングリコール ２．０
カルボキシメチルセルロース ０．３
ヒアルロン酸ナトリウム ０．０１
精製水 全量が１００部となる量
［Ｃ成分］
香料 適量
上記のＡ成分とＢ成分をそれぞれ８０℃以上に加熱した後、攪拌混合した。これを５０℃まで冷却した後、Ｃ成分を加えてさらに攪拌混合して乳液を得た。
実施例３．ローション
［Ａ成分］ 部
製造例１の発酵液 ５．０
エタノール １０．０
グリセリン ３．０
１，３−ブチレングリコール ２．０
メチルパラベン ０．２
クエン酸 ０．１
クエン酸ナトリウム ０．３
カルボキシビニルポリマー ０．１
香料 適量
水酸化カリウム 適量
精製水 全量が１００部となる量
上記の成分を混合してローションを得た。
［Ａ成分］ 部
製造例１の発酵液 ５．０
エタノール １０．０
グリセリン ３．０
１，３−ブチレングリコール ２．０
メチルパラベン ０．２
クエン酸 ０．１
クエン酸ナトリウム ０．３
カルボキシビニルポリマー ０．１
香料 適量
水酸化カリウム 適量
精製水 全量が１００部となる量
上記の成分を混合してローションを得た。
実施例４．化粧水
［Ａ成分］ 部
オリーブ油 １．０
ポリオキシエチレン（５．５）セチルアルコール ５．０
ブチルパラベン ０．１
［Ｂ成分］
製造例１の発酵液 ５．０
エタノール ５．０
グリセリン ５．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
メチルパラベン ０．１
水酸化カリウム 適量
精製水 全量が１００部となる量
［Ｃ成分］
香料
適量
Ａ成分及びＢ成分をそれぞれ８０℃以上に加温後、Ａ成分にＢ成分を加えて攪拌し、さらにヒスコトロン（５０００ｒｐｍ）で２分間ホモジナイズを行った。これを５０℃まで冷却した後、Ｃ成分を加えて攪拌混合し、さらに３０℃以下まで冷却して化粧水を得た。
［Ａ成分］ 部
オリーブ油 １．０
ポリオキシエチレン（５．５）セチルアルコール ５．０
ブチルパラベン ０．１
［Ｂ成分］
製造例１の発酵液 ５．０
エタノール ５．０
グリセリン ５．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
メチルパラベン ０．１
水酸化カリウム 適量
精製水 全量が１００部となる量
［Ｃ成分］
香料
適量
Ａ成分及びＢ成分をそれぞれ８０℃以上に加温後、Ａ成分にＢ成分を加えて攪拌し、さらにヒスコトロン（５０００ｒｐｍ）で２分間ホモジナイズを行った。これを５０℃まで冷却した後、Ｃ成分を加えて攪拌混合し、さらに３０℃以下まで冷却して化粧水を得た。
実施例５．乳液
［Ａ成分］ 部
流動パラフィン ６．０
ヘキサラン ４．０
ホホバ油 １．０
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート ２．０
大豆レシチン １．５
メチルパラベン ０．１５
エチルパラベン ０．０３
［Ｂ成分］
製造例１の発酵液 ５．０
Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド ２．０
水酸化カリウム ０．５
グリセリン ３．０
１，３−ブチレングリコール ２．０
カルボキシメチルセルロース ０．３
ヒアルロン酸ナトリウム ０．０１
精製水 全量が１００部となる量
［Ｃ成分］
香料 適量
上記のＡ成分とＢ成分をそれぞれ８０℃以上に加熱した後、攪拌混合した。これを５０℃まで冷却した後、Ｃ成分を加えてさらに攪拌混合して乳液を得た。
［Ａ成分］ 部
流動パラフィン ６．０
ヘキサラン ４．０
ホホバ油 １．０
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート ２．０
大豆レシチン １．５
メチルパラベン ０．１５
エチルパラベン ０．０３
［Ｂ成分］
製造例１の発酵液 ５．０
Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド ２．０
水酸化カリウム ０．５
グリセリン ３．０
１，３−ブチレングリコール ２．０
カルボキシメチルセルロース ０．３
ヒアルロン酸ナトリウム ０．０１
精製水 全量が１００部となる量
［Ｃ成分］
香料 適量
上記のＡ成分とＢ成分をそれぞれ８０℃以上に加熱した後、攪拌混合した。これを５０℃まで冷却した後、Ｃ成分を加えてさらに攪拌混合して乳液を得た。
実施例６．乳液
実施例５のＢ成分中、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド２．０部及び水酸化カリウム０．５部に代えてＬ−アスコルビン酸−２−リン酸エステルマグネシウム２．０部を用いるほかは実施例５と同様にして乳液を得た。
実施例５のＢ成分中、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド２．０部及び水酸化カリウム０．５部に代えてＬ−アスコルビン酸−２−リン酸エステルマグネシウム２．０部を用いるほかは実施例５と同様にして乳液を得た。
実施例７．乳液
実施例５のＢ成分中、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド２．０部及び水酸化カリウム０．５部に代えてＬ−アスコルビン酸−２−リン酸エステルナトリウム２．０部を用いるほかは実施例５と同様にして乳液を得た。
実施例５のＢ成分中、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド２．０部及び水酸化カリウム０．５部に代えてＬ−アスコルビン酸−２−リン酸エステルナトリウム２．０部を用いるほかは実施例５と同様にして乳液を得た。
実施例８．乳液
実施例５のＢ成分中、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド２．０部及び水酸化カリウム０．５部に代えてアルブチン２．０部を用いるほかは実施例５と同様にして乳液を得た。
実施例５のＢ成分中、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド２．０部及び水酸化カリウム０．５部に代えてアルブチン２．０部を用いるほかは実施例５と同様にして乳液を得た。
実施例９．乳液
実施例５のＢ成分中、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド２．０部及び水酸化カリウム０．５部に代えて米糠抽出物加水分解物（株式会社テクノーブル製、商品名「グレイスノウ＊雪＊ＨＰ」、固形分濃度3.5％）５．０部を用いるほかは実施例５と同様にして乳液を得た。
実施例５のＢ成分中、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド２．０部及び水酸化カリウム０．５部に代えて米糠抽出物加水分解物（株式会社テクノーブル製、商品名「グレイスノウ＊雪＊ＨＰ」、固形分濃度3.5％）５．０部を用いるほかは実施例５と同様にして乳液を得た。
実施例１０．乳液
実施例５のＢ成分中、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド２．０部及び水酸化カリウム０．５部に代えて白芥子抽出物（株式会社テクノーブル製、商品名「シナブランカ−ＷＨ」、固形分濃度1.0％）５．０部を用いるほかは実施例５と同様にして乳液を得た。
実施例５のＢ成分中、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド２．０部及び水酸化カリウム０．５部に代えて白芥子抽出物（株式会社テクノーブル製、商品名「シナブランカ−ＷＨ」、固形分濃度1.0％）５．０部を用いるほかは実施例５と同様にして乳液を得た。
実施例１１．乳液
実施例５のＢ成分中、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド２．０部及び水酸化カリウム０．５部に代えてγ−アミノ−β−ヒドロキシ酪酸１．０部を用いるほかは実施例５と同様にして乳液を得た。
実施例５のＢ成分中、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド２．０部及び水酸化カリウム０．５部に代えてγ−アミノ−β−ヒドロキシ酪酸１．０部を用いるほかは実施例５と同様にして乳液を得た。
実施例１２．リクイドファンデーション
［Ａ成分］ 部
ステアリン酸 ２．４
モノステアリン酸プロピレングリコール ２．０
セトステアリルアルコール ０．２
液状ラノリン ２．０
流動パラフィン ３．０
ミリスチン酸イソプロピル ８．５
プロピルパラベン ０．０５
［Ｂ成分］
製造例１の発酵液 ５．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム ０．２
ベントナイト ０．５
プロピレングリコール ４．０
トリエタノールアミン １．１
メチルパラベン ０．１
精製水 全量が１００部となる量
［Ｃ成分］
酸化チタン ８．０
タルク ４．０
着色顔料 適量
上記のＡ成分とＢ成分をそれぞれ加温した後混合攪拌した。これを再加温し、上記のＣ成分を添加して型に流し込み、室温になるまで攪拌してリクイドファンデーションを得た。
［Ａ成分］ 部
ステアリン酸 ２．４
モノステアリン酸プロピレングリコール ２．０
セトステアリルアルコール ０．２
液状ラノリン ２．０
流動パラフィン ３．０
ミリスチン酸イソプロピル ８．５
プロピルパラベン ０．０５
［Ｂ成分］
製造例１の発酵液 ５．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム ０．２
ベントナイト ０．５
プロピレングリコール ４．０
トリエタノールアミン １．１
メチルパラベン ０．１
精製水 全量が１００部となる量
［Ｃ成分］
酸化チタン ８．０
タルク ４．０
着色顔料 適量
上記のＡ成分とＢ成分をそれぞれ加温した後混合攪拌した。これを再加温し、上記のＣ成分を添加して型に流し込み、室温になるまで攪拌してリクイドファンデーションを得た。
実施例１３．クリームファンデーション
［Ａ成分］ 部
ステアリン酸 ５．０
セタノール ２．０
モノステアリン酸グリセリル ３．０
流動パラフィン ５．０
スクワラン ３．０
ミリスチン酸イソプロピル ８．０
ポリオキシエチレン（２０）モノステアリン酸グリセリル ２．０
プロピルパラベン ０．１
［Ｂ成分］
製造例１の発酵液 ５．０
ソルビトール ３．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
トリエタノールアミン １．５
メチルパラベン ０．１
精製水 全量が１００部となる量
［Ｃ成分］
酸化チタン ８．０
タルク ２．０
カオリン ５．０
ベントナイト １．０
着色顔料 適 量
［Ｄ成分］
香料 ０．３
Ｃ成分を混合し、粉砕機で粉砕した。Ｂ成分を混合し、これに粉砕したＣ成分を加え、コロイドミルで均一分散させた。Ａ成分及び均一分散させたＢ、Ｃ成分をそれぞれ８０℃に加温後、Ｂ、Ｃ成分にＡ成分を攪拌しながら加え、さらにヒスコトロン（５０００ｒｐｍ）で２分間ホモジナイズを行った。これを５０℃まで冷却した後、Ｄ成分を加えて攪拌混合し、さらに攪拌しながら３０℃以下まで冷却してクリームファンデーションを得た。
［Ａ成分］ 部
ステアリン酸 ５．０
セタノール ２．０
モノステアリン酸グリセリル ３．０
流動パラフィン ５．０
スクワラン ３．０
ミリスチン酸イソプロピル ８．０
ポリオキシエチレン（２０）モノステアリン酸グリセリル ２．０
プロピルパラベン ０．１
［Ｂ成分］
製造例１の発酵液 ５．０
ソルビトール ３．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
トリエタノールアミン １．５
メチルパラベン ０．１
精製水 全量が１００部となる量
［Ｃ成分］
酸化チタン ８．０
タルク ２．０
カオリン ５．０
ベントナイト １．０
着色顔料 適 量
［Ｄ成分］
香料 ０．３
Ｃ成分を混合し、粉砕機で粉砕した。Ｂ成分を混合し、これに粉砕したＣ成分を加え、コロイドミルで均一分散させた。Ａ成分及び均一分散させたＢ、Ｃ成分をそれぞれ８０℃に加温後、Ｂ、Ｃ成分にＡ成分を攪拌しながら加え、さらにヒスコトロン（５０００ｒｐｍ）で２分間ホモジナイズを行った。これを５０℃まで冷却した後、Ｄ成分を加えて攪拌混合し、さらに攪拌しながら３０℃以下まで冷却してクリームファンデーションを得た。
実施例１５．ボディシャンプー
［Ａ成分］ 部
Ｎ−ラウロイルメチルアラニンナトリウム ２５．０
ヤシ油脂肪酸カリウム液（４０％） ２６．０
ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド ３．０
メチルパラベン ０．１
［Ｂ成分］
製造例１の発酵液 ５．０
１，３−ブチレングリコール ２．０
精製水 全量が１００部となる量
Ａ成分及びＢ成分をそれぞれ８０℃に加温して均一に溶解した後、Ａ成分にＢ成分を加え、攪拌を続けて室温まで冷却してボディシャンプーを得た。
［Ａ成分］ 部
Ｎ−ラウロイルメチルアラニンナトリウム ２５．０
ヤシ油脂肪酸カリウム液（４０％） ２６．０
ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド ３．０
メチルパラベン ０．１
［Ｂ成分］
製造例１の発酵液 ５．０
１，３−ブチレングリコール ２．０
精製水 全量が１００部となる量
Ａ成分及びＢ成分をそれぞれ８０℃に加温して均一に溶解した後、Ａ成分にＢ成分を加え、攪拌を続けて室温まで冷却してボディシャンプーを得た。
試験例１．脱顆粒抑制試験
製造例１で得られたコラーゲン発酵液について、好塩基球における脱顆粒抑制作用を調べた。
［試験方法］
（１）細胞培養上清への脱顆粒誘導
ラット好塩基球白血病細胞（ＲＢＬ-２Ｈ３：Ｌｏｔ．１００８２３（６））を、１０％（ＮＣＳ）含有イーグル最少必須培地に懸濁して９６穴プレートに１×１０５個ずつ播種し、３７℃で２４時間培養した。コンフルエントになった細胞をリリーシング緩衝液（releasing buffer） ［１１７ｍＭ ＮａＣｌ，５．４ｍＭ ＫＣｌ，２．０ｍＭ ＣａＣｌ２，０．８ｍＭ
ＭｇＳＯ４，５．６ｍＭ Ｄ-グルコース，２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルフォン酸），１ｍｇ／ｍＬ
ＢＳＡ／ｐＨ７．７］２００μＬ／ウェル（ｗｅｌｌ）で洗浄した後、リリーシング緩衝液に製造例１のコラーゲン発酵液、比較例１のコラーゲン液、比較例２の加水分解コラーゲン液をそれぞれ１．０％又は２．０％の濃度（溶液として）となるように混和した液をそれぞれウェルに添加し、さらに脱顆粒を誘導するため、２００μｇ／ｍＬの化合物４８／８０（ｃｏｍｐｏｕｎｄ４８／８０）／リリーシング緩衝液１００μＬを添加して、３７℃で１時間インキュベートした。
また比較のため、製造例１のコラーゲン発酵液を含むリリーシング緩衝液に代えて当該緩衝液のみを添加した試験区を二つ設け、一方の試験区（ブランク）にはリリーシング緩衝液のみを、他方の試験区（コントロール）には上記と同様の脱顆粒用の化合物４８／８０／リリーシング緩衝液溶液をそれぞれ２００μＬ添加して、同じく３７℃で１時間インキュベートした。
さらに、脱顆粒抑制効果を有することが公知の甜茶エキス（溶液として５％の濃度）を陽性対照とした。
（２）β−ヘキソサミニダーゼ（β-Hexosaminidase）活性測定による脱顆粒率の判定
脱顆粒誘導後、細胞外に遊離したβ−ヘキソサミニダーゼの酵素活性を測定するために細胞上清５０μＬを別の９６穴マイクロプレートに分取した。β−ヘキソサミニダーゼ活性の測定は次のように行った。すなわち、別プレートに取った各細胞上清５０μＬに基質として５ｍＭ
ｐ−ニトロフェニル−２−アセタミド−２−デオキシ−β−グルコピラノシド（ｐ-Nitrophenyl-2-acetamide-2-deoxy-β-D-glucopyranoside）を５０μＬ加え、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で３０分間反応させた。その後１００μＬの０．２Ｍグリシン緩衝液（glycine buffer）（ｐＨ１０．７）を加えて反応を停止し、吸光プレートリーダーで４１５ｎｍの吸光度を測定し、β−ヘキソサミニダーゼ活性の指標とした。
製造例１で得られたコラーゲン発酵液について、好塩基球における脱顆粒抑制作用を調べた。
［試験方法］
（１）細胞培養上清への脱顆粒誘導
ラット好塩基球白血病細胞（ＲＢＬ-２Ｈ３：Ｌｏｔ．１００８２３（６））を、１０％（ＮＣＳ）含有イーグル最少必須培地に懸濁して９６穴プレートに１×１０５個ずつ播種し、３７℃で２４時間培養した。コンフルエントになった細胞をリリーシング緩衝液（releasing buffer） ［１１７ｍＭ ＮａＣｌ，５．４ｍＭ ＫＣｌ，２．０ｍＭ ＣａＣｌ２，０．８ｍＭ
ＭｇＳＯ４，５．６ｍＭ Ｄ-グルコース，２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルフォン酸），１ｍｇ／ｍＬ
ＢＳＡ／ｐＨ７．７］２００μＬ／ウェル（ｗｅｌｌ）で洗浄した後、リリーシング緩衝液に製造例１のコラーゲン発酵液、比較例１のコラーゲン液、比較例２の加水分解コラーゲン液をそれぞれ１．０％又は２．０％の濃度（溶液として）となるように混和した液をそれぞれウェルに添加し、さらに脱顆粒を誘導するため、２００μｇ／ｍＬの化合物４８／８０（ｃｏｍｐｏｕｎｄ４８／８０）／リリーシング緩衝液１００μＬを添加して、３７℃で１時間インキュベートした。
また比較のため、製造例１のコラーゲン発酵液を含むリリーシング緩衝液に代えて当該緩衝液のみを添加した試験区を二つ設け、一方の試験区（ブランク）にはリリーシング緩衝液のみを、他方の試験区（コントロール）には上記と同様の脱顆粒用の化合物４８／８０／リリーシング緩衝液溶液をそれぞれ２００μＬ添加して、同じく３７℃で１時間インキュベートした。
さらに、脱顆粒抑制効果を有することが公知の甜茶エキス（溶液として５％の濃度）を陽性対照とした。
（２）β−ヘキソサミニダーゼ（β-Hexosaminidase）活性測定による脱顆粒率の判定
脱顆粒誘導後、細胞外に遊離したβ−ヘキソサミニダーゼの酵素活性を測定するために細胞上清５０μＬを別の９６穴マイクロプレートに分取した。β−ヘキソサミニダーゼ活性の測定は次のように行った。すなわち、別プレートに取った各細胞上清５０μＬに基質として５ｍＭ
ｐ−ニトロフェニル−２−アセタミド−２−デオキシ−β−グルコピラノシド（ｐ-Nitrophenyl-2-acetamide-2-deoxy-β-D-glucopyranoside）を５０μＬ加え、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で３０分間反応させた。その後１００μＬの０．２Ｍグリシン緩衝液（glycine buffer）（ｐＨ１０．７）を加えて反応を停止し、吸光プレートリーダーで４１５ｎｍの吸光度を測定し、β−ヘキソサミニダーゼ活性の指標とした。
脱顆粒率の判定結果を以下の表１に示す。
［表１］
［表１］
表１に示す通り、比較例１のコラーゲン液、及び比較例２の加水分解コラーゲン液には好塩基球からのケミカルメディエーターの遊離（脱顆粒）の抑制効果が全く認められなかったのに対して、製造例１のコラーゲン発酵液は格段にすぐれた脱顆粒抑制効果が認められた。すなわち、未発酵のコラーゲン液又は加水分解コラーゲン液には全く認められなかった脱顆粒抑制効果が、コラーゲンを発酵させることにより新たに創出されたことが明らかになった。なお、陽性対照として用いた甜茶エキスについても脱顆粒抑制効果が認められたことから、本試験系が正常であることも確認された。
また、テンペ菌のみを用いて得られる製造例８のコラーゲン発酵物でも、１．０％、２．０％の溶液濃度で、製造例１のコラーゲン発酵液と同等の脱顆粒抑制効果を奏することも確認された。さらに、テンペ菌と酵母、乳酸菌、又は麹菌のいずれか１種以上の微生物を組み合わせて用いることで、発酵生成物の不快臭の軽減、又は化粧品配合剤としての色の改善効果が得られるので、それらの菌を組み合わせて用いることがより好ましいことも明らかになった。
また、テンペ菌に代えて納豆菌を用いることでも、同様に格段にすぐれた脱顆粒抑制効果を有するコラーゲン発酵液が得られた。
また、未発酵のコラーゲン及び加水分解コラーゲンが有している保湿効果、抗酸化効果についても試験をしたところ、コラーゲン発酵液も同様に、それらの効果を有していることが確認された。従って、コラーゲン発酵液は、未発酵のものが有する保湿効果、抗酸化効果を保持したまま、格段にすぐれた脱顆粒抑制効果も奏し得ることが明らかとなった。
Claims (6)
- コラーゲンをテンペ菌によって発酵させて得られる発酵物を有効成分とすることを特徴とする化粧料。
- コラーゲンを、テンペ菌と、酵母、乳酸菌、又は麹菌のいずれか１種以上の微生物とを組み合わせて発酵させて得られる発酵物を有効成分とすることを特徴とする化粧料。
- 発酵がテンペ菌と酵母の組み合わせによって行われることを特徴とする請求項２に記載の化粧料。
- コラーゲンが魚類から得られることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の化粧料。
- コラーゲンを発酵する時に、糖類を用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の化粧料。
- 糖類がグルコース、スクロース、又はフルクトースであることを特徴とする請求項５に記載の化粧料。
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|---|---|---|---|
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