JP2012017341A - 腫瘍治療のための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

【課題】
チロシンキナーゼ活性を欠き且つｅｒｂＢファミリーの受容体メンバーとダイマー形成する蛋白質；そのような蛋白質をコードする核酸分子；該核酸分子の細胞への移送を促進する送達媒体と化合された、そのような核酸分子を含む薬剤組成物；およびそのような薬剤組成物を投与することにより腫瘍を予防し且つ腫瘍を有する個体を治療する方法を提供する。
【解決手段】
ｅｒｂＢ蛋白質に特異的な抗体の、ｅｒｂＢ蛋白質媒介性腫瘍を有する個体の組み合わされた治療のための医薬の製造における使用であって、上記組み合わされた治療は、上記医薬を抗癌照射と共に個体に投与することを含み、上記のｅｒｂＢ蛋白質に特異的な抗体は、ｅｒｂＢ蛋白質に結合することにより腫瘍細胞中で上昇したチロシンキナーゼ活性を生じるｅｒｂＢ蛋白質ダイマーの形成を阻害し、上記阻害が腫瘍細胞に対して増殖抑制作用を有し、そして抗癌照射が抗体の投与の後に施される、上記使用が提供される。また、上記抗体を含む医薬組成物も提供される。さらに、上記抗体をコードする核酸を含む医薬組成物も提供される。
【選択図】 なし

Description

政府の権利の承認
本発明は、米国陸軍からのグラントＤＡＭＤ１７−９６−６０２９および国立衛生研究所からのグラント５Ｒ０１ ＥＹ０９３３３を含む米国政府からのグラントの元になされた。
関連出願のクロスリファレンス
本出願は、引用により編入される、１９９８年３月４日出願の米国仮出願６０／０７６，７８８に対する優先権を主張する。本出願は、許可された、１９９５年５月５日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０５６１４の米国国内段階の出願である、１９９７年２月１１日出願の米国シリアルナンバー０８／７３７，２６９、および放棄された、１９９４年５月５日出願の米国シリアルナンバー０８／２３９，２０２に関連し、これら各々は引用により編入される。発明の分野
本発明は、チロシンキナーゼ活性を欠き且つｅｒｂＢファミリーの受容体メンバーとダイマー形成する蛋白質；そのような蛋白質をコードする核酸分子；該核酸分子の細胞への移送を促進する送達媒体と化合された、そのような核酸分子を含む薬剤組成物；およびそのような薬剤組成物を投与することにより腫瘍を予防し且つ腫瘍を有する個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ）を治療する方法に関する。本発明は、照射−誘導性および／または化学物質−誘導性の細胞死に耐性の腫瘍細胞を、照射感受性細胞に変換するのに有用な組成物に関する。本発明は、照射および／または化学治療と組み合わせてそのような組成物を投与することにより腫瘍を有する個体を治療する方法に関する。

ｅｒｂＢファミリーの受容体は、ｅｒｂＢ１（ＥＧＦＲ）、ｅｒｂＢ２（ｐ１８５）およびｅｒｂＢ４を含む。引用により編入されるＵｌｌｒｉｃｈら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３０９，４１８−４２５は、ＥＧＦＲを記載する。引用により編入されるＳｃｈｅｃｈｔｅｒ，Ａ．Ｌ．ら、（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１２，５１３−５１６およびＹａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．ら、（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３１９，２３０−２３４は、ｐ１８５ｎｅｕ／ｅｒｂＢ２を記載する。引用により編入されるＫｒａｕｓ，Ｍ．Ｈ．ら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，９１９３−９１９７は、ｅｒｂＢ３を記載する。引用により編入されるＰｌｏｗｍａｎ，Ｇ．Ｄ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，１７４６−１７５０は、ｅｒｂＢ４を記載する。

ラット細胞性プロトオンコジーンｃ−ｎｅｕおよびそのヒト対応物ｃ−ｅｒｂＢ２は、ｐ１８５と称される１８５ｋＤの膜貫通糖蛋白質をコードする。チロシンキナーゼ（ｔｋ）活性は、オンコジーンｐ１８５の形質転換表現型の発現にリンクされてきた（Ｂａｒｇｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８８，８５，５３９４；およびＳｔｅｒｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９８８，８，３９６９、各々は引用により編入される）。オンコジーン性のｎｅｕは最初にラットの神経膠芽腫（ｎｅｕｒｏｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）において同定され（引用により編入されるＳｃｈｅｃｈｔｅｒら、（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１２，５１３）、そして形質転換蛋白質の膜貫通領域において６６４におけるＶａｌからＧｌｕへの単一のアミノ酸置換を生じるカルシノジェン誘発性点変異により活性化されることが見いだされた（引用により編入されるＢａｒｇｍａｎｎら、Ｃｅｌｌ，１９８６，４５，６４９）。この変化は、その内在性キナーゼの構成的活性並びに細胞の悪性腫瘍形質転換をもたらす（引用により編入されるＢａｒｇｍａｎｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．，１９８８，７，２０４３）。ｐ１８５蛋白質チロシンキナーゼの活性化はモノマーからダイマー形態への分子平衡におけるシフトに関連するらしい（引用により編入されるＷｅｉｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３３９，２３０）。

ｃ−ｎｅｕまたはｃ−ｅｒｂＢ２の正常より１００倍高いレベルへの過剰発現（即ち、＞１０６受容体／細胞）も、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の形質転換をもたらす（Ｃｈａｚｉｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９２，７，１８５９；ＤｉＦｉｏｒｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７，２３７，１７８；およびＤｉＭａｒｃｏら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９０，１０，３２４７、各々は引用により編入される）。しかしながら、１０５受容体／細胞のレベルで細胞性ｐ１８５を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞またはＮＲ６細胞は形質転換されないが（Ｈｕｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，２５４５；およびＫｏｋａｉら、Ｃｅｌｌ，１９８９，５８，２８７、各々は引用により編入される）、表皮細胞成長因子（ＥＧＦＲ）、相同なチロシンキナーゼと同時発現しない場合に限る（Ｋｏｋａｉら、Ｃｅｌｌ，１９８９，５８，２８７、引用により編入される）。即ち、細胞性ｐ１８５およびオンコジーン性ｐ１８５は共に細胞の形質転換をもたらすかもしれない。

細胞性ｐ１８５は、ＥＧＦＲと相同性が高い（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，１９８４，３１２，５１３；およびＹａｍａｍｏｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ，１９８６，３１９，２３０、各々は引用により編入される）が、それでもなお異なる。莫大な研究が示したことは、ＥＧＦＲと細胞性ｐ１８５が相互作用できることである（Ｓｔｅｒｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９８８，８，３９６９；Ｋｉｎｇら、ＥＭＢＯ Ｊ．，１９８８，７，１６４７；Ｋｏｋａｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８８，８５，５３８９；およびＤｏｕｇａｌｌら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９３，５３，６１、各々は引用により編入される）。ＥＧＦＲとｐ１８５の分子間対合はアップ制御のＥＧＦＲ機能であるらしい（引用により編入されるＷａｄａら、Ｃｅｌｌ，１９９０，６１，１３３９）。さらに、インビボにおいてもインビトロにおいても活性なチロシンキナーゼ複合体を形成するヘテロダイマーが検出できる（引用により編入される、Ｑｉａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，８９，１３３０）。

同様に、他のｅｒｂＢファミリーのメンバーとのｐ１８５の相互作用が報告された（Ｃａｒｒａｗａｙら、Ｃｅｌｌ １９９４，７８，５−８；Ａｌｒｏｙら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９７，４１０，８３−８６；Ｒｉｅｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９５，１５，５７７０−５７７６；Ｔｚａｈａｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．１９９７，１６，４９３８−４９５０；Ｓｕｒｄｅｎら、Ｎｅｕｒｏｎ １９９７，１８，８４７−８５５；Ｐｉｎｋａｓ−Ｋｒａｍａｒｓｋｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９９７，１５，２８０３−２８１５；各々は引用により編入される）。ヒトｐ１８５は、主に心筋および神経系、特に発生において生理学条件下でｅｒｂＢ３またはｅｒｂＢ４の何れかとヘテロダイマーを形成する。

細胞性ｐ１８５蛋白質は、肺、唾液腺、乳房、膵臓、卵巣、胃腸管、および皮膚の成人分泌上皮細胞に見いだされる（Ｋｏｋａｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８７，８４，８４９８；Ｍｏｒｉら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９８９，６１，９３；およびＰｒｅｓｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９０，５，９５３；各々は引用により編入される）。最近の研究は、ｃ−ｅｒｂＢ２の増幅が高頻度で多くのヒトアデノカルシノーマ、例えば胃腸（引用により編入される、Ａｋｉｙａｍａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８６，２３２，１６４４）、肺（引用により編入される、Ｋｅｒｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９９０，５０，５１８４）および膵臓アデノカルシノーマ（引用により編入される、Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｐａｔｈｏｂｉｏｌ．，１９９１，５９，４６）において生じることを見いだした。乳房および卵巣のカルシノーマのサブセットにおけるｃ−ｅｒｂＢ２の増加した発現はほとんど楽観できない臨床上の予後にリンクすることも報告された（Ｓｌａｍｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７，２３５，１７７；およびＳｌａｍｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９，２４４，７０７、各々は引用により編入される）。ＥＧＦＲとｐ１８５のヘテロダイマー対合は、ヒト乳癌細胞系、例えばＳＫ−Ｂｒ−３（引用により編入される、Ｇｏｌｄｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９０，２９，１１０２４）、およびトランスフェクトされた細胞（引用により編入される、Ｓｐｉｖａｋ−Ｋｒｏｉｚｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，２６７，８０５６）においても検出された。さらに、乳房および前立腺の癌におけるｅｒｂＢ２とＥＧＦＲの同時発現のケースが複数報告された。さらに、ｐ１８５とｅｒｂＢ３のヘテロダイマー対合並びにｐ１８５とｅｒｂＢ４のヘテロダイマー対合もヒトの癌において報告された。ｅｒｂＢ２とｅｒｂＢ３の同時発現がヒト乳癌において観察された。ＥＧＦＲ，ｅｒｂＢ２、およびｅｒｂＢ３の同時発現が前立腺カルシノーマにおいてみられた。

ＥＧＦｒ遺伝子の増幅および／または変更が膠腫瘍の進行において（Ｓｕｇａｗａら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：８６０２−８６０６；Ｅｋｓｔｒａｎｄら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：４３０９−４３１３）、特に膠芽腫、ほとんどの悪性膠腫瘍（Ｌｉｂｅｒｍａｎｎら、前記；Ｗｏｎｇら、前記；Ｊａｍｅｓら、（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：５５４６−５５５１；Ｃａｖｅｎｅｅ，Ｗ．Ｋ．（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ ７０：１７８８−９３；Ｎｉｓｈｉｋａｗａら、（１９９４） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：７７２７−７７３１；Ｓｃｈｌｅｇｅｌら、（１９９４）Ｉｎｔ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５６：７２−７７）において頻繁に観察された。これらの腫瘍の顕著な比率は遺伝子の変更のあるなしに拘わらずＥＧＦｒ増幅を示し（Ｅｋｓｔｒａｎｄら、前記；Ｌｉｂｅｒｍａｎｎら、前記；Ｗｏｎｇら、（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６８９９−６９０３）、そしてこれは疾患の再発に対する短い間隔および低い生存に相関してきた（Ｓｃｌｅｇｅｌら、前記）。

ＥＧＦｒの増幅は、正常のＥＧＦｒ転写物と共に異常なＥＧＦｒ転写物に関係しうる（Ｓｕｇａｗａら、前記）。頻繁な増幅および続く構造上の変化は、ＥＧＦｒが悪性神経膠腫の表現型の保持に重用かもしれないことを示唆する。頻繁に観察されたＥＧＦｒ変異体はヒト膠芽腫のサブセットにおいて同定され、そして該受容体の細胞外ドメイン内の８０１ｂｐ（エクソン２−７に相当）のインフレームの切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）によりもたらされ（Ｓｕｇａｗａら、前記；Ｅｋｓｔｒａｎｄら、前記；Ｍａｌｄｅｎら、（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：２７１１−２７１４；Ｈｕｍｐｈｒｅｙら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：２９６５−２９６９）、構成的なキナーゼの活性をもたらすと考えられており、該分子のリガンド結合特性にも影響するかもしれない（Ｎｉｓｈｉｋａｗａら、前記；Ｃａｌｌａｇｈａｎら、（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：２９３９−２９４８）。

ヒトの上皮悪性腫瘍において観察されたＥＧＦｒの変異は、増幅があってもなくても過剰発現からなり、そしてコード配列の変更からなる可能性は低い。ＥＧＦｒの変異体により引き起こされるオンコジーン性形質転換は組織特異性らしく、そして赤血球症、繊維肉腫、血管肉腫、黒色腫、並びに膠芽腫において報告された（Ｃａｒｔｅｒら、（１９９４）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ ５：３８９−４２８）。正常なＥＧＦｒの過剰発現は特定の場合、おそらくはＥＧＦ−依存性様式においてオンコジーン性形質転換を引き起こすらしい（Ｃａｒｔｅｒら、前記；Ｈａｌｅｙら、（１９８９）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ４：２７３−２８３）。多量の野生型ＥＧＦｒのＮＩＨ３Ｔ３細胞へのトランスフェクションはリガンド依存性であるが不完全な形質転換をもたらす（Ｙａｍａｚａｋｉら、（１９９０）Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８１：７７３−７７９）。過剰発現はＥＧＦｒキナーゼの変更された細胞周期制御を引き起こすかもしれず、そしてオンコジーン性ｐ１８５ｎｅｕに関して観察されたとおり形質転換に寄与する（Ｋｉｙｏｋａｗａら、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２：１０９２−１０９６）。

ｅｒｂＢ−媒介腫瘍を有することがわかった個体を治療するための治療用組成物に関する要求が存在する。ｅｒｂＢ−媒介腫瘍を発症する疑いのある個体のための予防用組成物を開発する要求が存在する。ｅｒｂＢ−媒介腫瘍を有することがわかった個体を治療する方法に関する要求が存在する。ｅｒｂＢ−媒介腫瘍を発症する疑いのある個体がそのような腫瘍を発症することを予防する方法に関する要求が存在する。

Ｕｌｌｒｉｃｈら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３０９，４１８−４２５ Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ，Ａ．Ｌ．ら、（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１２，５１３−５１６ Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．ら、（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３１９，２３０−２３４ Ｋｒａｕｓ，Ｍ．Ｈ．ら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，９１９３−９１９７ Ｐｌｏｗｍａｎ，Ｇ．Ｄ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，１７４６−１７５０ Ｂａｒｇｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８８，８５，５３９４ Ｓｔｅｒｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９８８，８，３９６９ Ｂａｒｇｍａｎｎら、Ｃｅｌｌ，１９８６，４５，６４９ Ｂａｒｇｍａｎｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．，１９８８，７，２０４３ Ｗｅｉｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３３９，２３０ Ｃｈａｚｉｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９２，７，１８５９ ＤｉＦｉｏｒｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７，２３７，１７８ ＤｉＭａｒｃｏら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９０，１０，３２４７ Ｈｕｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，２５４５ Ｋｏｋａｉら、Ｃｅｌｌ，１９８９，５８，２８７ Ｋｉｎｇら、ＥＭＢＯ Ｊ．，１９８８，７，１６４７ Ｋｏｋａｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８８，８５，５３８９ Ｄｏｕｇａｌｌら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９３，５３，６１ Ｗａｄａら、Ｃｅｌｌ，１９９０，６１，１３３９ Ｑｉａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，８９，１３３０ Ｃａｒｒａｗａｙら、Ｃｅｌｌ １９９４，７８，５−８ Ａｌｒｏｙら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９７，４１０，８３−８６ Ｒｉｅｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９５，１５，５７７０−５７７６ Ｔｚａｈａｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．１９９７，１６，４９３８−４９５０ Ｓｕｒｄｅｎら、Ｎｅｕｒｏｎ １９９７，１８，８４７−８５５ Ｐｉｎｋａｓ−Ｋｒａｍａｒｓｋｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９９７，１５，２８０３−２８１５ Ｋｏｋａｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８７，８４，８４９８ Ｍｏｒｉら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９８９，６１，９３ Ｐｒｅｓｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９０，５，９５３ Ａｋｉｙａｍａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８６，２３２，１６４４ Ｋｅｒｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９９０，５０，５１８４ Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｐａｔｈｏｂｉｏｌ．，１９９１，５９，４６ Ｓｌａｍｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７，２３５，１７７ Ｓｌａｍｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９，２４４，７０７ Ｇｏｌｄｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９０，２９，１１０２４ Ｓｐｉｖａｋ−Ｋｒｏｉｚｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，２６７，８０５６ Ｓｕｇａｗａら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：８６０２−８６０６ Ｅｋｓｔｒａｎｄら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：４３０９−４３１３ Ｊａｍｅｓら、（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：５５４６−５５５１ Ｃａｖｅｎｅｅ，Ｗ．Ｋ．（１９９２） Ｃａｎｃｅｒ ７０：１７８８−９３ Ｎｉｓｈｉｋａｗａら、（１９９４） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：７７２７−７７３１ Ｓｃｈｌｅｇｅｌら、（１９９４）Ｉｎｔ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５６：７２−７７ Ｗｏｎｇら、（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６８９９−６９０３ Ｍａｌｄｅｎら、（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：２７１１−２７１４ Ｈｕｍｐｈｒｅｙら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：２９６５−２９６９ Ｃａｌｌａｇｈａｎら、（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：２９３９−２９４８ Ｃａｒｔｅｒら、（１９９４）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ ５：３８９−４２８ Ｈａｌｅｙら、（１９８９）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ４：２７３−２８３ Ｙａｍａｚａｋｉら、（１９９０）Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８１：７７３−７７９ Ｋｉｙｏｋａｗａら、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２：１０９２−１０９６

本発明は、チロシンキナーゼ活性を欠き且つｅｒｂＢファミリーの受容体メンバー、例えばｅｒｂＢ１（ＥＧＦＲ）、ｅｒｂＢ２（ｐ１８５）およびｅｒｂＢ３および／またはｅｒｂＢ４とダイマー形成する蛋白質をコードする核酸配列を含む核酸分子に関する。

本発明は、チロシンキナーゼ活性を欠き且つヒトＥＧＦＲとヒトｐ１８５とダイマー形成する蛋白質をコードする核酸配列を含む核酸分子に関する。

本発明は、送達成分と化合された、チロシンキナーゼ活性を欠き且つｅｒｂＢファミリーの受容体メンバー、例えばｅｒｂＢ１（ＥＧＦＲ）、ｅｒｂＢ２（ｐ１８５）およびｅｒｂＢ３および／またはｅｒｂＢ４とダイマー形成する蛋白質をコードする核酸配列を含む核酸分子に関する。

本発明は、送達成分と化合された、チロシンキナーゼ活性を欠き且つヒトＥＧＦＲおよびヒトｐ１８５とダイマー形成する蛋白質をコードする核酸配列を含む核酸分子に関する。

本発明は、チロシンキナーゼ活性を欠き且つｅｒｂＢファミリーの受容体メンバー、例えばｅｒｂＢ１（ＥＧＦＲ）、ｅｒｂＢ２（ｐ１８５）およびｅｒｂＢ３および／またはｅｒｂＢ４とダイマー形成する蛋白質をコードする核酸配列を含む核酸分子を含む組換えウイルスベクターに関する。

本発明は、チロシンキナーゼ活性を欠き且つヒトＥＧＦＲおよびヒトｐ１８５とダイマー形成する蛋白質をコードする核酸配列を含む核酸分子を含む組換えウイルスベクターに関する。

本発明は、送達成分と化合された、核酸分子を含む薬剤組成物に関する。該核酸分子の核酸配列は、チロシンキナーゼ活性を欠き且つｅｒｂＢファミリーの受容体メンバー、例えばｅｒｂＢ１（ＥＧＦＲ）、ｅｒｂＢ２（ｐ１８５）およびｅｒｂＢ３および／またはｅｒｂＢ４とダイマー形成する蛋白質、および好ましくはチロシンキナーゼ活性を欠き且つヒトＥＧＦＲおよびヒトｐ１８５とダイマー形成する蛋白質をコードする。

本発明は、ｅｒｂＢ−媒介細胞性形質転換を受けたことがわかった個体を治療する方法に関する。該治療は、細胞性形質転換を逆転する（ｒｅｖｅｒｓｅ）のに十分な量で、送達成分と化合した核酸分子を含む薬剤組成物を上記個体に投与することを含む。該核酸配列は、チロシンキナーゼ活性を欠き且つｅｒｂＢファミリーの受容体メンバー、例えばｅｒｂＢ１（ＥＧＦＲ）、ｅｒｂＢ２（ｐ１８５）およびｅｒｂＢ３および／またはｅｒｂＢ４とダイマー形成する蛋白質をコードする。送達成分はウイルス粒子であってよく、そして核酸分子はウイルスゲノムであってよい。

本発明は、ｐ１８５−媒介細胞性形質転換を受けたことがわかった個体を治療する方法に関する。該治療は、細胞性形質転換を逆転する（ｒｅｖｅｒｓｅ）のに十分な量で、送達成分と化合した核酸分子を含む薬剤組成物を上記個体に投与することを含む。該核酸配列は、チロシンキナーゼ活性を欠き且つヒトＥＧＦＲおよびヒトｐ１８５とダイマー形成する蛋白質をコードする。送達成分はウイルス粒子であってよく、そして核酸分子はウイルスゲノムであってよい。

本発明は、ｅｒｂＢ−媒介細胞性形質転換の疑いのあることがわかった個体におけるｅｒｂＢ−媒介細胞性形質転換を予防する方法に関する。該方法は、細胞性形質転換を予防するのに十分な量で、送達成分と化合した核酸分子を含む薬剤組成物を上記個体に投与することを含む。該核酸配列は、チロシンキナーゼ活性を欠き且つｅｒｂＢファミリーの受容体メンバー、例えばｅｒｂＢ１（ＥＧＦＲ）、ｅｒｂＢ２（ｐ１８５）およびｅｒｂＢ３および／またはｅｒｂＢ４とダイマー形成する蛋白質をコードする。送達成分はウイルス粒子であってよく、そして核酸分子はウイルスゲノムであってよい。

本発明は、ｐ１８５−媒介細胞性形質転換の疑いのあることがわかった個体におけるｐ１８５−媒介形質転換を予防する方法に関する。該方法は、細胞性形質転換を予防するのに十分な量で、送達成分と化合した核酸分子を含む薬剤組成物を上記個体に投与することを含む。該核酸配列は、チロシンキナーゼ活性を欠き且つヒトＥＧＦＲおよびヒトｐ１８５とダイマー形成する蛋白質をコードする。送達成分はウイルス粒子であってよく、そして核酸分子はウイルスゲノムであってよい。

本発明は、ｅｒｂＢ蛋白質とダイマー形成し且つチロシンキナーゼ活性を欠損する蛋白質をコードする核酸分子を個体に投与し、そして治療上有効な量の抗癌照射に個体を暴露し、および／または治療上有効な量の抗癌化学治療剤に投与する工程からなる、ｅｒｂＢ蛋白質媒介腫瘍を有する個体を治療する方法に関する。

本発明は、腫瘍細胞内で上昇したチロシンキナーゼ活性を生じるｅｒｂＢ蛋白質ダイマーの形成を阻害する組成物を個体に投与し、次に、治療上有効な量の抗癌照射に個体を暴露する工程からなる、ｅｒｂＢ蛋白質媒介腫瘍を有する個体を治療する方法に関する。

本発明は、形質転換された表現型に関連したキナーゼ活性を提供するマルチマー受容体集合物（ｅｎｓｅｍｂｌｅｓ）を有する腫瘍細胞により特徴付けされる腫瘍を有する個体を治療する方法に関する。該方法は、マルチマー受容体集合物に関連したキナーゼ活性を破壊する組成物を上記個体に投与し；そして治療上有効な量のガンマ照射に上記個体を暴露する工程からなる。

本発明は、形質転換された表現型に関連したキナーゼ活性を提供するマルチマー受容体集合物（ｅｎｓｅｍｂｌｅｓ）を有する腫瘍細胞により特徴付けされる腫瘍を有する個体を治療する方法に関する。該方法は、抗体ではない活性因子、例えばペプチド、非蛋白質様化合物またはマルチマー受容体集合物に関連したキナーゼ活性を破壊する蛋白質をコードする核酸分子を上記個体に投与し；そして治療上有効な量のガンマ照射に上記個体を暴露し、および／または治療上有効な量の細胞障害性化学治療剤を上記個体に投与する工程からなる。

本発明は、ＥＧＦＲ種、例えば野生型または変異体ＥＧＦＲを含む腫瘍細胞により特徴付けされる腫瘍を有する個体を治療する方法に関する。該方法は、ＥＧＦＲ種により媒介されるキナーゼ活性を破壊する組成物を上記個体に投与し；そして治療上有効な量のガンマ照射に上記個体を暴露し、および／または治療上有効な量の細胞障害性化学治療剤を上記個体に投与する工程からなる。

本発明は、ｅｒｂＢ蛋白質とダイマーを形成し且つチロシンキナーゼ活性を欠損する蛋白質をコードする核酸分子を個体に投与し、そして治療上有効な量の抗癌照射に個体を暴露し、および／または治療上有効な量の抗癌化学治療剤を個体に投与する工程からなる、ｅｒｂＢ蛋白質媒介腫瘍を有する個体を治療する方法に関する。いくつかの態様において、上記ｅｒｂＢ−蛋白質媒介腫瘍はｐ１８５−媒介腫瘍である。いくつかの態様おいて、ｅｒｂＢ媒介腫瘍はＥＧＦＲ−媒介腫瘍である。いくつかの態様において、ｅｒｂＢ−蛋白質媒介腫瘍は膠の腫瘍である。いくつかの態様において、ｅｒｂＢ−蛋白質媒介腫瘍は膠芽腫である。いくつかの態様において、核酸分子の投与は腫瘍内投与による。いくつかの態様において、個体は核酸投与前に外科手術を受ける。いくつかの態様において、蛋白質はｐ１８５エクトドメインである。いくつかの態様において、蛋白質はアミノ酸６６４においてｖａｌからｇｌｕへの変異を有するラットｎｅｕ膜貫通領域を含む。いくつかの態様において、核酸分子は組換えアデノウイルスのウイルスゲノムである。いくつかの態様において、核酸分子は個体の細胞内の翻訳のための制御要素に作動可能に連結したコーディング配列を含み、該コーディング配列は、アミノ酸６９１において停止コドンを有する切断されたラットｎｅｕ遺伝子；アミノ酸６９１において停止コドンを有し且つアミノ酸６６４においてｖａｌからｇｌｕへの変異を有する切断されたラットｎｅｕ遺伝子；アミノ酸６９１において停止コドンを有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトｐ１８５ｃ−ｅｒｂＢ２エクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子；アミノ酸６９１において停止コドンを有し且つアミノ酸６６４においてｖａｌからｇｌｕへの変異を有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトｐ１８５ｃ−ｅｒｂＢ２エクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子；アミノ酸６９１において停止コドンを有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトＥＧＦＲエクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子；アミノ酸６９１において停止コドンを有し且つアミノ酸６６４においてｖａｌからｇｌｕへの変異を有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトＥＧＦＲエクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子；アミノ酸６９１において停止コドンを有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトｅｒｂＢ３エクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子；アミノ酸６９１において停止コドンを有し且つアミノ酸６６４においてｖａｌからｇｌｕへの変異を有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトｅｒｂＢ３エクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子；アミノ酸６９１において停止コドンを有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトｅｒｂＢ４エクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子；またはアミノ酸６９１において停止コドンを有し且つアミノ酸６６４においてｖａｌからｇｌｕへの変異を有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトｅｒｂＢ４エクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子を含む。いくつかの態様において、個体は治療上有効な量の抗癌照射に暴露される。いくつかの態様において、個体は治療上有効な量の抗癌化学治療剤を投与される。

本発明は、ｅｒｂＢ蛋白質とダイマーを形成し且つチロシンキナーゼ活性を欠損する蛋白質をコードする核酸分子を個体に投与する工程からなる、ｅｒｂＢ蛋白質媒介脳腫瘍を有する個体を治療する方法に関する。いくつかの態様において、蛋白質はｐ１８５エクトドメインである。いくつかの態様において、核酸分子はアミノ酸６６４においてｖａｌからｇｌｕへの変異を有するラットｎｅｕ膜貫通領域を含む。いくつかの態様において、ｅｒｂＢ蛋白質媒介腫瘍はＥＧＦＲ−媒介腫瘍である。いくつかの態様において、ｅｒｂＢ−蛋白質媒介腫瘍は変異体ＥＧＦＲ−媒介腫瘍である。いくつかの態様において、ｅｒｂＢ−蛋白質媒介腫瘍は膠芽腫である。いくつかの態様において、個体は治療上有効な量の抗癌照射に暴露され、および／または治療上有効な量の抗癌化学治療剤を投与される。いくつかの態様において、核酸分子の投与は直接の腫瘍への注射による。いくつかの態様において、核酸分子の投与は、定位的外科手術法を用いた、直接の腫瘍への注射による。いくつかの態様において、個体は核酸分子投与前に大部分の腫瘍を除去する外科手術を受ける。いくつかの態様において、核酸分子は組換えアデノウイルスの組換えゲノムである。いくつかの態様において、核酸分子は個体の細胞内の翻訳のための制御要素に作動可能に連結したコーディング配列を含み、該コーディング配列は、アミノ酸６９１において停止コドンを有する切断されたラットｎｅｕ遺伝子（Ｎ６９１停止構築物）；アミノ酸６９１において停止コドンを有し且つアミノ酸６６４においてｖａｌからｇｌｕへの変異を有する切断されたラットｎｅｕ遺伝子；アミノ酸６９１において停止コドンを有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトｐ１８５ｃ−ｅｒｂＢ２エクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子；アミノ酸６９１において停止コドンを有し且つアミノ酸６６４においてｖａｌからｇｌｕへの変異を有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトｐ１８５ｃ−ｅｒｂＢ２エクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子；アミノ酸６９１において停止コドンを有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトＥＧＦＲエクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子；アミノ酸６９１において停止コドンを有し且つアミノ酸６６４においてｖａｌからｇｌｕへの変異を有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトＥＧＦＲエクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子；アミノ酸６９１において停止コドンを有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトｅｒｂＢ３エクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子；アミノ酸６９１において停止コドンを有し且つアミノ酸６６４においてｖａｌからｇｌｕへの変異を有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトｅｒｂＢ３エクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子；アミノ酸６９１において停止コドンを有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトｅｒｂＢ４エクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子；またはアミノ酸６９１において停止コドンを有し且つアミノ酸６６４においてｖａｌからｇｌｕへの変異を有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトｅｒｂＢ４エクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子を含む。

本発明は、変異体ＥＧＦＲとダイマーを形成し且つチロシンキナーゼ活性を欠損する蛋白質をコードする核酸分子を細胞に送達する工程からなる、変異体ＥＧＦＲ−媒介腫瘍細胞の増殖を阻害する方法に関する。いくつかの態様において、蛋白質はｐ１８５エクトドメインを含む。いくつかの態様において、蛋白質はアミノ酸６６４においてｖａｌからｇｌｕへの変異を有するラットｎｅｕ膜貫通領を含む。いくつかの態様において、変異体ＥＧＦＲ−媒介腫瘍細胞は膠芽腫細胞である。

本発明は、腫瘍細胞において上昇したチロシンキナーゼ活性を生じるｅｒｂＢ蛋白質ダイマーの形成を阻害する組成物を個体に投与し、そして治療上有効な量の抗癌照射に個体を暴露する工程からなる、ｅｒｂＢ蛋白質媒介腫瘍を有する個体を治療する方法に関する。いくつかの態様において、ｅｒｂＢ−蛋白質媒介腫瘍はｐ１８５−媒介腫瘍である。いくつかの態様において、ｅｒｂＢ−媒介腫瘍はＥＧＦＲ−媒介腫瘍である。いくつかの態様において、ｅｒｂＢ−媒介腫瘍は膠の腫瘍である。いくつかの態様において、ｅｒｂＢ−媒介腫瘍は膠芽腫である。いくつかの態様において、組成物の投与は腫瘍内投与による。いくつかの態様において、個体は組成物投与の前に外科手術を受ける。いくつかの態様において、個体に投与される組成物は、腫瘍細胞内のｅｒｂＢ蛋白質と相互作用して、他のｅｒｂＢ蛋白質とダイマー形成するためにその低下した性質をもたらすのに十分なようにｅｒｂＢ蛋白質を改変する化合物を含む。いくつかの態様において、腫瘍細胞内のｅｒｂＢ蛋白質と相互作用して、他のｅｒｂＢ蛋白質とダイマー形成するためにその低下した性質をもたらすのに十分なようにｅｒｂＢ蛋白質を改変する化合物は、抗体である。いくつかの態様において、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの態様において、個体に投与される組成物は、腫瘍細胞内のｅｒｂＢ蛋白質と競合して相互作用することにより、他のｅｒｂＢ蛋白質とのダイマー形成を競合して阻害し、且つ上昇したチロシンキナーゼ活性を防ぐ化合物を含む。いくつかの態様において、腫瘍細胞内のｅｒｂＢ蛋白質と競合して相互作用することにより、他のｅｒｂＢ蛋白質とのダイマー形成を競合して阻害する化合物はペプチドである。いくつかの態様において、腫瘍細胞内のｅｒｂＢ蛋白質と競合して相互作用することにより、他のｅｒｂＢ蛋白質とのダイマー形成を競合して阻害する化合物は抗体である。いくつかの態様において、腫瘍細胞に投与される組成物は、腫瘍細胞内のｅｒｂＢ蛋白質に競合して相互作用することにより、他のｅｒｂＢ蛋白質とのダイマー形成を競合して阻害する蛋白質をコードする核酸分子である。いくつかの態様において、該蛋白質は変異体または切断されたキナーゼ欠損ｅｒｂＢ蛋白質である。いくつかの態様において、該蛋白質は変異体または切断されたキナーゼ欠損ｐ１８５蛋白質である。いくつかの態様において、該蛋白質はひとつのｅｒｂＢ蛋白質の膜貫通領域と相互作用する。いくつかの態様において、該蛋白質はアミノ酸６６４においてｖａｌからｇｌｕへの変異を有するラットｎｅｕ膜貫通領域を含む。いくつかの態様において、該蛋白質はひとつのｅｒｂＢ蛋白質のエクトドメインと相互作用する。いくつかの態様において、該蛋白質はｐ１８５エクトドメインを含む。いくつかの態様において、上記核酸は腫瘍内投与により投与される。いくつかの態様において、上記個体は核酸分子の投与前に外科手術を受ける。いくつかの態様において、上記核酸分子は組換えアデノウイルスのウイルスゲノムである。いくつかの態様において、上記核酸分子は、個体の細胞内の翻訳のための制御要素に作動可能に連結したコーディング配列を含み、該コーディング配列は、アミノ酸６９１において停止コドンを有する切断されたラットｎｅｕ遺伝子；アミノ酸６９１において停止コドンを有し且つアミノ酸６６４においてｖａｌからｇｌｕへの変異を有する切断されたラットｎｅｕ遺伝子；アミノ酸６９１において停止コドンを有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトｐ１８５ｃ−ｅｒｂＢ２エクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子；アミノ酸６９１において停止コドンを有し且つアミノ酸６６４においてｖａｌからｇｌｕへの変異を有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトｐ１８５ｃ−ｅｒｂＢ２エクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子；アミノ酸６９１において停止コドンを有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトＥＧＦＲエクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子；アミノ酸６９１において停止コドンを有し且つアミノ酸６６４においてｖａｌからｇｌｕへの変異を有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトＥＧＦＲエクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子；アミノ酸６９１において停止コドンを有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトｅｒｂＢ３エクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子；アミノ酸６９１において停止コドンを有し且つアミノ酸６６４においてｖａｌからｇｌｕへの変異を有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトｅｒｂＢ３エクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子；アミノ酸６９１において停止コドンを有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトｅｒｂＢ４エクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子；またはアミノ酸６９１において停止コドンを有し且つアミノ酸６６４においてｖａｌからｇｌｕへの変異を有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトｅｒｂＢ４エクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子を含む。

本発明は、形質転換された表現型に関連したキナーゼ活性を提供するマルチマー受容体集合物を有する腫瘍細胞により特徴付けされる腫瘍を有する個体を治療する方法に関する。該方法は、マルチマー受容体集合物に関連したキナーゼ活性を破壊する組成物を個体に投与し；そして治療上有効な量のガンマ照射に個体を暴露する工程からなる。いくつかの態様において、該腫瘍は、ｅｒｂＢホモダイマー、ｅｒｂＢヘテロダイマー、および血小板由来の成長因子受容体のマルチマーからなる群から選択されるマルチマー受容体集合物を有する腫瘍細胞により特徴付けられる。いくつかの態様において、該腫瘍は変異ＥＧＦＲホモダイマーまたはｐ１８５ホモダイマーであるｅｒｂＢホモダイマーを有する腫瘍細胞により特徴付けられる。いくつかの態様において、該腫瘍は、ｐ１８５／ＥＧＦＲヘテロダイマー、ｐ１８５／変異体ＥＧＦＲヘテロダイマー、ｐ１８５／ｅｒｂＢ３ヘテロダイマー；ｐ１８５／ｅｒｂＢ４ヘテロダイマーまたはＥＧＦＲ／変異体ＥＧＦＲヘテロダイマーであるｅｒｂＢヘテロダイマーを有する腫瘍細胞により特徴付けられる。いくつかの態様において、マルチマー受容体集合物に関連したキナーゼ活性を破壊する組成物は、抗体、ペプチド、および非蛋白質様キナーゼ阻害剤からなる群から選択される活性因子を含む。いくつかの態様において、マルチマー受容体集合物に関連したキナーゼ活性を破壊する組成物は、集合物のモノマー成分と相互作用することにより該モノマー成分が集合物の第２のモノマー成分と相互作用することを防ぐ蛋白質またはペプチドをコードする核酸分子である活性因子を含む。

本発明は、形質転換された表現型に関連したキナーゼ活性を提供するマルチマー受容体集合物を有する腫瘍細胞により特徴付けされる腫瘍を有する個体を治療する方法に関する。該方法は、小ペプチド、非蛋白質様化合物またはマルチマー受容体集合物に関連したキナーゼ活性を破壊する非抗体蛋白質またはペプチドをコードする核酸分子を個体に投与し；そして治療量のガンマ照射に個体を暴露し、および／または治療量の細胞障害性化学治療剤を個体に投与する工程からなる。いくつかの態様において、該腫瘍は、ｅｒｂＢホモダイマー、ｅｒｂＢヘテロダイマー、および血小板由来の成長因子受容体のマルチマーからなる群から選択されるマルチマー受容体集合物を有する腫瘍細胞により特徴付けられる。いくつかの態様において、該腫瘍は変異ＥＧＦＲホモダイマーまたはｐ１８５ホモダイマーであるｅｒｂＢホモダイマーを有する腫瘍細胞により特徴付けられる。いくつかの態様において、該腫瘍は、ｐ１８５／ＥＧＦＲヘテロダイマー、ｐ１８５／変異体ＥＧＦＲヘテロダイマー、ｐ１８５／ｅｒｂＢ３ヘテロダイマー；ｐ１８５／ｅｒｂＢ４ヘテロダイマーまたはＥＧＦＲ／変異体ＥＧＦＲヘテロダイマーであるｅｒｂＢヘテロダイマーを有する腫瘍細胞により特徴付けられる。いくつかの態様において、マルチマー受容体集合物に関連したキナーゼ活性を破壊する組成物は、ペプチド、および非蛋白質様キナーゼ阻害剤からなる群から選択される活性因子を含む。いくつかの態様において、マルチマー受容体集合物に関連したキナーゼ活性を破壊する組成物は、集合物のモノマー成分と相互作用することにより該モノマー成分が集合物の第２のモノマー成分と相互作用することを防ぐ蛋白質またはペプチドをコードする核酸分子である活性因子を含む。

本発明は、ＥＧＦＲ種を含む腫瘍細胞を有する個体を治療する方法に関する。該方法は、ＥＧＦＲ種により媒介されるキナーゼ活性を破壊する組成物を上記個体に投与し；そして治療量のガンマ照射に上記個体を暴露し、および／または治療量の細胞障害性化学治療剤を上記個体に投与する工程からなる。いくつかの態様において、ＥＧＦＲ種は変異体ＥＧＦＲである。いくつかの態様において、ＥＧＦＲ種により媒介されるキナーゼ活性を破壊する組成物は、抗体、ペプチド、および非蛋白質様キナーゼ阻害剤からなる群から選択される活性因子を含む。いくつかの態様において、ＥＧＦＲ種により媒介されるキナーゼ活性を破壊する組成物は、ＥＧＦＲ種の分子と相互作用することにより該モノマーが第２のモノマー成分とキナーゼ活性上昇性マルチマー集合物を形成することを防ぐ蛋白質またはペプチドをコードする核酸分子である活性因子を含む。

図１Ａ，１Ｂ，１Ｃおよび１Ｄは、照射治療した場合としない場合のヒト膠芽腫の細胞周期破壊に関するデータを示す。細胞は６０ｍｍの皿に入れ、ガンマ照射（１０Ｇｙ）（図１Ｂおよび１Ｄ）またはモック照射（図１Ａおよび１Ｃ）前に付着させた。７２時間後、ＰＩ染色後にフローサイトメトリーにより分析した。ＤＮＡ含有量による細胞の分散は各パネルに示す。代表的な実験を４つの異るときに実施した。 図２Ａおよび２Ｂは、ヒト膠芽腫細胞のガンマ照射後のアポトーシスおよびクローン原性生存の測定に関するデータを示す。図２Ａにおいては、１０％血清または血清不含培地中で、ガンマ照射（１０Ｇｙ）前に、細胞をプレートし、そして付着させた。７２時間後、２人の別の観察者によりアポトーシスの定量を実施した。アポトーシスのインデックスは、ＤＡＰＩによる核の染色により測定されたアポトーシスの形態学上の外観によるアポトーシス細胞のパーセンテージである。提示した結果は、４つの別個の実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．であり、そして平均を括弧内に示す。Ｕ８７ＭＧ細胞は１０％血清または血清不含培地で生育させ、そしてＵ８７／Ｔ６９１細胞は１０％血清または血清不含培地で生育させた。図２Ｂにおいては、Ｕ８７ＭＧおよびＵ３７３ＭＧヒト膠細胞および誘導体をＤＡＰＩにより染色して、ガンマ照射７２時間後にアポトーシス形態に関して分析した。平均を括弧内に示し、そしてこの代表実験に示すインデックスは平均±Ｓ．Ｄ．である。これらの結果は２人の追加の観察者により確認された。アポトーシスインデックスは過小評価に感じられたが、浮遊細胞がこの技術によりアッセイできなかったからである。 図３は、照射後のクローン原性生存を示す。細胞をプレートし、そして照射量を変えながらガンマ照射し、次に３７℃において５％ＣＯ２と共に７−１０日間インキュベーションした。次に、コロニーを染色して、５０細胞より多いコロニーを解剖顕微鏡により計数した。形成されたコロニーの数とプレートされた細胞の数の比率を計算して、その後平板効率を修正することにより、生存率の対数を測定した。同様な実験を３回実施した。 図４は、組換えアデノウイルスＨ５．００１ＣＢＬａｃＺのマップの描写である。 図５は、ヒト腫瘍細胞を発現するｐ１８５ｃ−ｅｒｂＢ−２の細胞増殖の阻害を示す。５，０００細胞／ウエルを示された量の模倣性ＣＤＲ４Ｄ５または抗−ｐ１８５ｃ−ｅｒｂＢ−２Ａｂ（ネオマーカー社、ＣＡ）と共にプレートし、そして３７度において２４時間インキュベートした。１００μｇのＭＴＴ（２００μｌ中）を各ウエルに４時間加え、そして１００μｌの溶解バッファーを加えた。１２−２４時間後に、５７０ｎｍ ＥＬＩＳＡリーダーにてＯ．Ｄ．を読んだ。パーセント増殖は、対照細胞（模倣性ＣＤＲ４Ｄ５または抗−ｐ１８５ｃ−ｅｒｂＢ−２Ａｂ抗体処理なし）に対する増殖の程度を示す。 図６Ａおよび６Ｂは、抗−ｐ１８５ｃ−ｅｒｂＢ−２模倣性ＣＤＲ４Ｄ５が抗体ヒト腫瘍細胞をガンマ照射誘発アポトーシスに敏感にすることを示す。ｕ３，ｕ３ｔ，ＳおよびＭはそれぞれＵ３７３ＭＧおよびＵ３７３／Ｔ６９１，ＳＫＢＲ３およびＭＣＦ７細胞系を示す。ｍおよびｉｒ ｍは、模倣性４Ｄ５および無関係の模倣性ＣＤ４−セリンを示す。

好ましい態様の説明
本明細書にて用いられるとおり、用語「ｅｒｂＢ−関連癌」および「ｅｒｂＢ−関連腫瘍」は、ｅｒｂＢ遺伝子ファミリーを発現し、その発現がｅｒｂＢ−媒介形質転換をもたらす腫瘍細胞および新生物に関連することを意味する。ｎｅｕ−関連腫瘍およびＥＧＦＲ−関連腫瘍はｅｒｂＢ−関連腫瘍の例である。

本明細書にて用いられるとおり、用語「ｎｅｕ−関連癌」、「ｎｅｕ−関連腫瘍」および「ｐ１８５−関連腫瘍」は、ｎｅｕ遺伝子を発現させてｐ１８５を生成する腫瘍細胞および新生物に関連することを意味する。ｎｅｕ−関連癌は、細胞性形質転換がチロシンキナーゼ活性関連ｐ１８５により媒介されるｅｒｂＢ−関連癌である。

本明細書にて用いられるとおり、用語「ＥＧＦＲ−関連癌」は、ＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞および新生物に関連することを意味する。ＥＧＦＲ−関連癌は、細胞性形質転換がチロシンキナーゼ活性関連ＥＧＦＲにより媒介されるｅｒｂＢ−関連癌である。

本明細書にて用いられるとおり、用語「変異体ＥＧＦＲ−関連癌」および「変異体ＥＧＦＲ−関連腫瘍」は、ＥＧＦＲの変異形態を発現する腫瘍細胞および新生物に関連することを意味する。変異体ＥＧＦＲ−関連癌は、細胞性形質転換がチロシンキナーゼ活性関連変異体ＥＧＦＲにより媒介される、ＥＧＦＲ−関連癌である。構造上の変化の結果としての受容体の変化はシグナルの増幅をもたらす、受容体のオリゴマー化に結び付けてよい。変異体ＥＧＦＲはヒト膠腫瘍に共通に観察される、構成的活性化細胞外−欠失変異体ＥＧＦＲ形態（ΔＥＧＦＲ）であってよい。ヒト膠新生物および他のヒト上皮悪性腫瘍に共通に観察されるΔＥＧＦＲ（ΔＥＧＦＲまたはΔＥＧＦＲｖＩＩＩ）は、切断されて構成的にリン酸化された１４０−１５５ｋＤａのΔＥＧＦＲの発現をもたらす分子の細胞外領域をコードする遺伝子内のエクソン２から７を含むインフレームの切断（アミノ酸６から２７３）によりもたらされる。ΔＥＧＦＲは、自発的にはダイマーの形態で存在し、そしてリガンド非依存性様式において齧歯類繊維芽細胞の構成的シグナリングとオンコジーン形質転換を媒介することが観察されてきたが、過剰発現されたｐ１７０ホロ−ＥＧＦＲ類はＥＧＦ存在下においてほんのわずかしか形質転換しない。ΔＥＧＦＲ癌蛋白質はヒト膠芽腫細胞およびマウス繊維芽細胞中においてインビボにて劇的な成長上の長所を付与する。最近の報告は、ΔＥＧＦＲが細胞表面上に存在し、そしてリガンド−刺激性ホロ−ＥＧＦＲよりもゆっくりと内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅ）し、ΔＥＧＦＲ癌蛋白質の形質転換活性を増加させるかもしれないことを示す。細胞外ドメインをＲＴＫポリペプチドの膜貫通領域および細胞質領域から機能上分離する他の変異が、自発的ダイマー化および形質転換能力の獲得を導くことも観察されてきたことから、一部の細胞外ドメインが、リガンド結合または質量作用によりたぶん除去されるダイマー形成上の構造上の束縛を課することを示唆する。ΔＥＧＦＲまたは鳥類のｖ−ｅｒｂＢオンコジーンにおいて観察された細胞外欠失はたぶん、リガンド結合によりもたらされるコンフォメーションの変化を模倣することによるダイマー形成を促進する。ＥＧＦＲの可溶性細胞外ドメインはオリゴマー化することが観察され、そしてエクトドメイン内の構造変化は細胞外ドメイン、細胞質ドメイン、または両者の自発的なオリゴマー化を誘導することが可能である。ＥＧＦＲ内の細胞外欠失はＥＧＦＲのサブドメインＩおよびＩＩを含むアミノ酸の大部分を除去するが、該受容体の細胞外領域内の２つのシステイン富裕配列の第１の方（よりアミノ末端）の大部分を含む。サブドメインＩＩＩはリガンド結合特性をＥＧＦＲに付与することが報告されており、ＥＧＦＲ癌蛋白質では保存されているが、ＥＧＦＲはＮＩＨ３Ｔ３細胞内のリガンドには結合しないらしい。ホロＥＧＦＲとΔＥＧＦＲの同時発現がヒト膠芽腫および他の腫瘍サンプルにおいて観察されてきたことから、ΔＥＧＦＲ／ＥＧＦＲ同時発現細胞がヒトの疾患の密接な相関であるらしいことが示唆される。

本明細書にて用いられるとおり、用語「ＥＧＦＲ種」は、ＥＧＦＲの野生型および変異形態に関連することを意味する。

本明細書にて用いられるとおり、用語「ｅｒｂＢ−媒介細胞性形質転換」は、ｅｒｂＢ−関連腫瘍細胞および新生物が受ける細胞性形質転換に関連することを意味する。細胞は、ｅｒｂＢファミリーの受容体のメンバーによる上昇レベルのチロシンキナーゼ活性に関連したｅｒｂＢ−媒介形質転換を受ける。ｅｒｂＢ−媒介形質転換細胞の形質転換表現型は、ｅｒｂＢファミリーの受容体のメンバーとダイマー形成するチロシンキナーゼ欠損蛋白質の発現により停止するかおよび／または逆転しうる。

本明細書にて用いられるとおり、用語「ｐ１８５−媒介細胞性形質転換」は、ｐ１８５−関連腫瘍細胞および新生物が受ける細胞形質転換であり且つその形質転換された表現型がｐ１８５とダイマー形成するチロシンキナーゼ欠損蛋白質の発現により停止するかおよび／または逆転しうる細胞性形質転換に関連することを意味する。

本明細書にて用いられるとおり、用語「ＥＧＦＲ−媒介細胞性形質転換」は、ＥＧＦＲ−関連腫瘍細胞および新生物が受ける細胞形質転換であり且つその形質転換された表現型がＥＧＦＲとダイマー形成するチロシンキナーゼ欠損蛋白質の発現により停止するかおよび／または逆転しうる細胞性形質転換に関連することを意味する。ＥＧＦＲ−媒介細胞性形質転換はｅｒｂ−媒介細胞性形質転換である。

本明細書にて用いられるとおり、用語「変異体ＥＧＦＲ−媒介細胞性形質転換」は、変異体ＥＧＦＲ−関連腫瘍細胞および新生物が受ける細胞形質転換であり且つその形質転換された表現型が変異体ＥＧＦＲとダイマー形成するチロシンキナーゼ欠損蛋白質の発現により停止するかおよび／または逆転しうる細胞性形質転換に関連することを意味する。変異体ＥＧＦＲ−媒介細胞性形質転換はｅｒｂ−媒介細胞性形質転換である。

本明細書にて用いられるとおり、「送達成分」は、核酸分子を個体の細胞に送達する媒体に関連することを意味する。送達成分は、遺伝子治療ベクターのウイルス粒子のようなウイルス粒子、並びに他の媒体、キャリアー、複合体、核酸分子を細胞に送達するのに有用な実在物および構造体を含むことを意味する。

本明細書にて用いられるとおり、用語「ハイリスクな個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」は、除去されているかまたは寛解し始めたｅｒｂＢ−関連腫瘍、例えばｎｅｕ−関連腫瘍を有する個体、および、よって再発（ｒｅｌａｐｓｅ）または回帰（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）の疑いのある個体を意味する。ハイリスクな個体の治療の養生法の一部として、該個体が有していると診断された腫瘍に対して予防的に該個体を処置することにより再発と格闘することができる。即ち、個体がｅｒｂＢ−関連癌を有していたことが分かった場合、本発明により該個体を治療して、正常細胞が腫瘍細胞に形質転換することを予防することができる。

本発明は、ｅｒｂＢ−関連収容、例えばｎｅｕ−関連腫瘍を罹患したことがわかった個体を治療処置することにより腫瘍細胞の形質転換された表現型を復帰させるのに有用である。本発明は、ｅｒｂＢ−関連腫瘍を発症しやすい個体または再発またはｅｒｂＢ−関連腫瘍を有していた個体であり、よって回帰の疑いのある人を予防上処置するのに有用である。

ｎｅｕオンコジーンの翻訳産物はｐ１８５であり、膜貫通糖蛋白質であって、チロシンキナーゼ活性を有し且つ該糖蛋白質上に電気泳動を実施し、そして公知分子量のマーカー蛋白質と移動度を比較することにより決定された約１８，５００ドルトンの分子量を有する。実験は、ｐ１８５が他のｐ１８５分子または表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）とダイマー形成すること、およびこれらのダイマーがそのようなダイマーを有する細胞において形質転換された表現型を生じる上昇チロシンキナーゼ活性を呈することを示した。

ｐ１８５ｎｅｕ変異体は活性化されたｐ１８５ｎｅｕホモダイマーを干渉する（Ｑｉａｎ，Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ．Ｚｈａｏ，Ｇｒｅｅｎｅ：Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １３：２１４９−２１５７，１９９６）。ｐ１８５ｎｅｕ変異体は、繊維芽細胞中および初期ヒト癌細胞中の正常ＥＧＦＲホモダイマー、変異体ＥＧＦＲ並びに活性化ＥＧＦＲホモダイマーも干渉する。他のｐ１８５分子またはＥＧＦＲとダイマー形成することはできる蛋白質をコードするがそのダイマーが上昇したチロシンキナーゼ活性を呈さない核酸分子の投与は、ｐ１８５媒介腫瘍に罹患した集団内のｎｅｕ−関連腫瘍の形質転換された表現型を排除する。さらに、そのような核酸分子の投与は、ｎｅｕ形質転換された腫瘍を発症する疑いのある動物における新生物の発症を阻害する。

上記議論されたとおり、他のｅｒｂＢファミリーメンバーとのｐ１８５−ｅｒｂＢ２相互作用が報告された（Ｃａｒｒａｗａｙら、前記；Ａｌｒｏｙら、前記；Ｒｉｅｓｅら、前記；Ｔｚａｈａｒら、前記；およびＳｕｒｄｅｎら、前記；Ｐｉｎｋａｓ−Ｋｒａｍａｒｓｋｉら、前記）。従って、ＥＧＦＲ，ｅｒｂＢ３，およびｅｒｂＢ４とヘテロダイマーを形成する能力を保持したｐ１８５ｎｅｕ／ｅｒｂＢ２のキナーゼ欠損変異体（ヒト相同物）を用いることにより、ｅｒｂＢ３およびｅｒｂＢ４とダイマー形成し、そしてヒト腫瘍細胞中のシグナリングを変調してよい。即ち、本発明は、さらに、ｅｒｂＢ３およびｅｒｂＢ４とダイマーを形成できるが該ダイマーは上昇したチロシンキナーゼ活性を呈さずそのような腫瘍を罹患した集団において腫瘍の形質転換された表現型を排除する、蛋白質をコードする核酸分子の投与に関する。さらに、そのような核酸の投与は腫瘍を発症する疑いのある動物における新生物の発症を阻害する。

ｐ１８５変異体がｅｒｂＢ−媒介細胞性形質転換を干渉するのに加えて、他の変異体ｅｒｂＢメンバーは野生型ｅｒｂＢ蛋白質とダイマー形成して野生型ホモダイマーおよびヘテロダイマーに関連した上昇チロシンキナーゼ活性を阻害するのに有用であるかもしれない。

本発明は、チロシンキナーゼ活性を欠き且つｅｒｂＢファミリーの受容体メンバーとダイマー形成する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子を提供する。該蛋白質は、ＥＧＦＲ，ｐ１８５，ｅｒｂＢ３およびｅｒｂＢ４からなる群から選択されるｅｒｂＢ蛋白質、好ましくはＥＧＦＲ，ｐ１８５，ｅｒｂＢ３およびｅｒｂＢ４からなる群から選択されるｅｒｂＢファミリーの少なくとも２つのメンバー、より好ましくはＥＧＦＲ，ｐ１８５，ｅｒｂＢ３およびｅｒｂＢ４からなる群から選択されるｅｒｂＢファミリーの少なくとも３つのメンバーとダイマー形成し、そしてより好ましくは該蛋白質はＥＧＦＲ，ｐ１８５，ｅｒｂＢ３およびｅｒｂＢ４の各々とダイマー形成する。好ましくは、該蛋白質は、ｅｒｂＢファミリーのメンバーの蛋白質を変異させるかまたは切断した形態であるか、または異なる種に由来するｅｒｂＢファミリーのメンバーからの配列を含むキメラ蛋白質である。いくつかの好ましい態様において、本発明は、チロシンキナーゼ活性を欠き且つヒトＥＧＦＲまたはヒトｐ１８５とダイマー形成する蛋白質をコードする核酸配列を有する核酸分子を提供する。該核酸分子は、送達成分と化合して提供され、化合したものを投与する際に該核酸分子が個体の細胞に送達されるようにする。薬剤組成物として提供される場合、上記化合したものは、ｅｒｂＢ−媒介細胞性形質転換、例えばｐ１８５−媒介細胞性形質転換およびＥＧＦＲ−媒介細胞性形質転換を罹患した個体の治療に有用である。そのような薬剤組成物は、ｅｒｂＢ−媒介細胞性形質転換の予防、特にそのような形質転換の疑いのある個体における予防において有用であるかもしれない。本発明の核酸分子は、のちに単離され且つ様々なイムノアッセイにおいて使用されて、様々な体液に存在するそのようなｅｒｂＢ蛋白質に特異的な抗体の存在を検出するコンピテント細胞中の特定のｅｒｂＢ蛋白質種を生成するのにも有用かもしれない。

ＡＴＰ結合のためのコンセンサス配列Ｎ７５７における単一のアミノ酸置換、あるいは細胞質性ドメイン欠失Ｎ６９１停止の何れかによるキナーゼ活性の細胞性ラットｐ１８５の欠損は、生存細胞においてＥＧＦＲとのＥＧＦ−誘動性形質転換を受けることができた。ＥＧＦは、ＥＧＦＲを通してＮ７５７のトランスリン酸化を刺激することもできた。しかしながら、ＥＧＦＲとある切断ｐ１８５蛋白質からなるヘテロダイマーはキナーゼ不活性であった（引用により編入される、Ｑｉａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９４，９１，１５００を参照）。類似の結果は、切断されたｐ１８５蛋白質の膜貫通領域がアミノ酸配列中の単一の変化、Ｔ６９１停止を含んだ、さらに修飾された構築物を用いて観察された。受容体中の構造上の変化は、野生型（ｗｔ）受容体、例えばインスリン受容体（引用により編入される、Ｃｈｏｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８７，２６２，１８４２）またはＥＧＦＲ（各々が引用により編入される、Ｈｏｎｅｇｇｅｒら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９０，１１０，１５４１；およびＫａｓｈｌｅｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９１，１１，１４５４）の機能を抑圧することができる優性の負の変異として作用することが示された。

本発明は、ｅｒｂＢチロシンキナーゼファミリーの活性化癌原蛋白質を標的とする成長阻害の、受容体に基づく戦略を提供する。多くの全身性上皮癌はｅｒｂＢ受容体のオンコジーン性形態を発現し、過剰発現、変異または他のｅｒｂＢファミリーメンバーとの同時発現の何れかにより腫瘍性能力を付与するかもしれない。ｅｒｂＢ受容体の酵素的キナーゼ機能はダイマー化またはオリゴマー化により活性化されるから、本発明は、キナーゼ欠損受容体複合体の形成を通して表面に基づく受容体を触媒活性を阻害し、それによりｅｒｂＢ翻訳産物の腫瘍性効果を減じる。

本発明は、チロシンキナーゼ活性を欠き且つｅｒｂＢファミリーの受容体のメンバー、例えばｅｒｂＢ１（ＥＧＦＲ），ｅｒｂＢ２（ｐ１８５），ｅｒｂＢ３およびまたはｅｒｂＢ４とダイマー形成する蛋白質をコードする核酸配列を含む核酸分子に関する。該核酸配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡの何れかであってよい。該核酸配列は、好ましくは、ｅｒｂＢ蛋白質とダイマー形成してよく且つチロシンキナーゼ活性も欠くラットまたはヒトのｅｒｂ蛋白質をコードする。本発明の側面に従えば、該核酸分子は、チロシンキナーゼ活性を欠き且つヒトＥＧＦＲまたはヒトｐ１８５とダイマー形成する蛋白質をコードする核酸配列を含む。該核酸配列はＤＮＡまたはＲＮＡの何れかであってよい。該核酸配列は、ヒトＥＧＦＲおよび／またはｐ１８５とダイマー形成し且つチロシンキナーゼ活性を欠くあらゆるｅｒｂ蛋白質をコードしてよい。該核酸配列は、好ましくは、ヒトｐ１８５またはヒトＥＧＦＲとダイマー形成してよく且つチロシンキナーゼ活性も欠くラットまたはヒトのｐ１８５種をコードする。

ｅｒｂＢ翻訳産物とダイマー形成することができる蛋白質をコードするが、該ダイマーは上昇したチロシンキナーゼ活性を呈さない、核酸分子の投与は、ｅｒｂＢ−媒介腫瘍を罹患する集団内のｅｒｂＢ−関連腫瘍の形質転換表現型を排除する。さらに、そのような核酸分子の投与は、ｅｒｂＢ−関連腫瘍を発症する疑いのある動物内の新生物の発生を阻害する。例えば、実験が示したことは、ｐ１８５がｅｒｂＢ翻訳産物例えば他のｐ１８５分子または表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）とダイマー形成すること、およびこれらのダイマーがそのようなダイマーを有する細胞内の形質転換された表現型を引き起こす上昇チロシンキナーゼ活性を呈することであった。ｅｒｂＢ翻訳産物、例えば他のｐ１８５分子またはＥＧＦＲとダイマー形成できる蛋白質をコードするが該ダイマーが上昇したチロシンキナーゼ活性を呈さない核酸分子の投与は、ｐ１８４媒介腫瘍を罹患した集団内のｎｅｕ−関連腫瘍の形質転換された表現型を排除する。さらに、そのような核酸分子の投与はｎｅｕ形質転換腫瘍を発症する疑いのある動物における新生物発生を阻害する。

それらの表面上にてｅｒｂＢ遺伝子ファミリーのメンバーの翻訳産物を発現し、そしてそれによりｅｒｂＢ−媒介細胞性形質転換を受けてきた哺乳類腫瘍細胞の発生（ｏｃｃｕｒｅｎｃｅ）は、ｅｒｂＢ遺伝子の翻訳産物とダイマー形成するがチロシンキナーゼ活性を有さない蛋白質をコードする配列を含む核酸分子の投与により回復または予防することができる。本発明によれば、そのような核酸分子は送達用成分、即ち送達用媒体と化合して提供され、それにより動物の細胞へのそのような核酸分子の取り込みを促進する。そのような化合したものの有効量を、ｅｒｂＢ−関連腫瘍を罹患した個体またはｅｒｂＢ−関連腫瘍の疑いのある個体に投与する。

本発明は、チロシンキナーゼ活性を欠き且つｅｒｂＢ遺伝子ファミリーのメンバーの翻訳産物とダイマー形成する蛋白質をコードする核酸配列を有する核酸分子を提供する。該核酸分子は、送達用成分と化合して提供され、化合したものを投与した際に上記核酸分子が個体の細胞に送達されるようにする。薬剤組成物として提供される場合、上記化合したものはｅｒｂＢ−媒介細胞性形質転換に罹患した個体を治療するのに有用である。そのような薬剤組成物は、ｅｒｂＢ−媒介細胞性形質転換の、特にそのような形質転換の疑いのある個体における、予防のために有用であるかもしれない。本発明の核酸分子は、のちに単離され且つ様々なイムノアッセイにおいて使用されて、様々な体液に存在する翻訳産物に特異的な抗体の存在を検出するコンピテント細胞中のｅｒｂＢ遺伝子ファミリーのメンバーの特定の翻訳産物を生成するのにも有用かもしれない。

本発明の核酸分子は、様々な送達用成分、例えば組換えウイルス発現ベクターまたは他の適当な送達手段と化合して使用され、適合可能な宿主細胞内へのそれらの導入および発現を動かす（ａｆｆｅｃｔ）。通常、ウイルスベクターはＤＮＡウイルス、例えば組換え体アデノウイルスおよび組換え体ワクシニアウイルスまたはＲＮＡウイルス、例えば組換え体レトロウイルスであってよい。他の組換え体ベクターは、細胞に感染して組換え遺伝子を発現することができる組換え原核細胞生物を含む。組換えベクターに加えて、他の送達成分も意図され、例えばリポソーム、リポフェクチン−媒介トランスフェクション、トランスフェリン−媒介トランスフェクションおよび他の受容体−媒介手段である。本発明は、均等な機能を作用させ、且つ後に当業界において公知になる発現ベクターおよび他の適当な送達手段のそのような他の形態を含むように意図される。

本発明の好ましい態様において、ＤＮＡはアデノウイルスによりコンピテント宿主細胞に送達される。当業者は、そのような手段による宿主細胞へのＤＮＡの送達のこの技術を容易に理解する。本発明はアデノウイルスを含むことが好ましいが、本発明は均等な機能を作用させる他のウイルスを含むことを意図する。組換えアデノウイルスベクターの例は、Ｅ１ａ領域の欠失を含みおよびＥ２ａ内に温度感受性変異を有するものである（引用により編入される、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５：１２１７−１２２９，１９９４）。本発明の核酸配列を送達するのに有用な組換えアデノウイルスベクターの他の例は、引用により編入される、米国特許第５，７５６，２８３号および米国特許第５，７０７，６１８号に記載されている。

本発明の好ましい態様において、ＲＮＡはレトロウイルス手段によりコンピテント宿主細胞に送達される。当業者は、そのような手段による宿主細胞へのＲＮＡの送達のこの技術を容易に理解する。ＲＮＡによりコードされる蛋白質を発現するように作用するあらゆるレトロウイルスが本発明に包含されることが意図される。

本発明の他の好ましい態様において、核酸は葉酸受容体手段を通して送達される。宿主細胞に送達される核酸配列はポリリジンに連結され、そして該複合体は葉酸受容体手段により腫瘍細胞に送達される。引用により編入される、Ｌｏｗらに対して１９９２年４月２８日に発行された米国特許第５，１０８，９２１号は、そのような送達成分を記載する。

本発明の好ましい態様において、核酸はリポフェクチン−媒介ＤＮＡ移入（ｔｒａｎｓｆｅｒ）の使用を通して送達される。リポフェクトアミン（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ）（登録商標）リポソーム試薬（ライフテクノロジーズ、ガイセルスベルグＭＤ）は、製造者の指示書に従い細胞を封入するために使用できる市販のリポソーム封入試薬である。リポフェクトアミン（登録商標）リポソーム試薬で封入された核酸分子は、リポソーム製剤投与方法を使用して宿主細胞に送達される。

本発明の好ましい態様において、核酸はカチオン脂質−媒介ＤＮＡ移入の使用を通して送達され、引用により編入される米国特許第５，７０３，０５５号に記載されたようなものである。

本発明の好ましい態様において、核酸はリポソーム−媒介ＤＮＡ移入の使用を通して送達され、引用により編入される米国特許第４，２３５，８７１号、米国特許第４，２４１，０４６号および米国特許第４，３９４，４４８号に記載されたようなものである。

本発明による薬剤組成物は、薬学上受容可能なキャリアーまたは媒体、例えば塩水をさらに含む核酸分子と化合された送達成分を含む。核酸の首尾良い送達を可能にするあらゆる媒体を使用してよい。当業者は、本発明に用いてよい薬学上受容可能な媒体多数を容易に認識するはずである。

薬剤組成物は、投与の選択された様式に依存して選択された組成物と共に当業者により製剤化されてよい。適当な薬学上のキャリアーは、この分野の標準の引用テキストであり、引用により編入される、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａ．Ｏｓｏｌに記載される。

本発明の薬剤組成物は、活性試薬を哺乳類の体内の試薬作用部位に到達させるのを可能にするあらゆる手段により投与されよい。薬剤組成物は、非経口、即ち腫瘍内、静脈内、皮下、筋肉内に投与されてよい。静脈内および腫瘍内投与が好ましい経路である。

投薬量は公知の因子、例えば特定の試薬の薬力学上の特性、およびその様式、投与経路；受容者の年齢、健康状態、および体重；兆候の性質および範囲、併存処置の種類、処置の頻度、および所望の効果に依存して変わる。

いくつかの態様において、本発明は、ｅｒｂＢ−関連癌であるヒトアデノカルシノーマ例えば胃、肺および膵臓のアデノカルシノーマおよびヒト胸部および卵巣のカルシノーマ並びにｅｒｂＢ−関連癌であるヒト胸部および前立腺の癌を罹患した患者を治療する方法に関する。いくつかの態様において、本発明は、ハイリスクの個体におけるこれらのｅｒｂＢ−関連癌を予防する方法に関する。いくつかの態様において、本発明は、膠腫瘍の進行、特に膠芽腫、ほとんどの悪性膠腫瘍を罹患する患者を治療する方法に関する。いくつかの態様において、本発明は、ハイリスクの個体内のこれらｅｒｂＢ−関連癌を予防する方法に関する。

本発明のいくつかの態様によれば、上記薬剤組成物は腫瘍部位に局所投与される。いくつかの態様において、上記薬剤組成物は腫瘍細胞および該腫瘍のすぐ隣の組織に直接投与される。いくつかの態様において、上記薬剤組成物は脳腫瘍、例えば膠芽腫に送達される。いくつかの態様において、上記薬剤組成物は腫瘍の外科手術による切除術の一部として脳腫瘍内に送達される。いくつかの態様において、上記薬剤組成物は定位外科手術技術を用いることにより脳腫瘍内に送達される。

本発明のいくつかの態様によれば、患者は本発明に従い薬剤組成物の投与と共に照射または他の化学治療で処置される。化学治療のアプローチは、細胞障害性およびまたは細胞増殖抑制性薬剤の投与を含む。ｅｒｂＢ−関連腫瘍における本発明によるヌクレオチド分子の発現は、腫瘍を放射線感受性にする。即ち、本発明による薬剤組成物で患者を処置する場合、放射線治療の間の照射による破壊に対して腫瘍がより受攻性（ｖｕｌｎｅｒａｂｌｅ）になる。複数の治療アプローチの使用は広範囲に基づいた介入を患者に提供する。いくつかの好ましい態様において、本発明による薬剤組成物を用いた治療は外科手術の介入により先導される。好ましい態様において、放射線治療が本発明による薬剤組成物の投与の次にくる。好ましい態様において、ガンマ照射を用いた放射線治療を組成物の投与後に提供し、放射線耐性腫瘍を放射線感受性に変換する。当業者は、適切な放射線治療養生法を容易に公式化することができる。引用により編入される、Ｃａｒｌｏｓ Ａ Ｐｅｒｅｚ ＆ Ｌｕｔｈｅｒ Ｗ Ｂｒａｄｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、第２版、Ｅｄ．ＪＢ Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ，Ｐｈｉｌａ．，１９９２は、本発明に使用できる放射線治療プロトコルおよびパラメーターを記載する。ＧＢＭｓ（膠芽腫、殆どの悪性膠脳腫瘍）に関しては、引用により編入される、Ｓｉｍｐｓｏｎ Ｗ．Ｊ．ら：Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｌｏｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｔ ｏｆ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｓ：Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ Ｒａｄｉａｉｔｏｎ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ （ＲＴＯＧ）ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｏｎｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｈｙｓ ２６：２３９−２４４，１９９３が、本発明の方法において有用な臨床プロトコルを記載する。同様に、引用により編入される、Ｂｏｒｇｅｌｔら、Ｔｈｅ ｐａｌｌｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ：Ｆｉｎａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｔｗｏ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ．Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｏｎｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｈｙｓ ６：１−９，１９８０は、本発明の方法において有用な臨床プロトコルを記載する。

いくつかの態様によれば、ｐ１８５ｎｅｕ／ｅｒｂＢ−２受容体の変更物を用いるが、この受容体がｅｒｂＢ１／表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ），ｅｒｂＢ３，およびｅｒｂＢ４を含む全てのｅｒｂＢファミリーのキナーゼのためのヘテロダイマー集合物のための好ましいパートナーであることがわかったからである。本発明の好ましい態様によれば、ｅｒｂＢ−発現ヒト腫瘍において使用するための好ましい形態のキナーゼ欠損ｐ１８５ｎｅｕを、進行した塊の疾患よりはむしろ後遺症、局所疾患治療のための遺伝子治療として組換えアデノウイルス粒子により送達する。外科手術技術の応用は、固体の腫瘍の塊の疾患の特性における局所投与および整復（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）の両方のために用いられることとなる。ｅｒｂＢ受容体の組み合わせを発現する複数のヒト癌は、成長阻害のこの受容体に基づく戦略のための標的となるかもしれない。

変異体ｐ１８５ｎｅｕ受容体の導入により媒介される阻害は、慣用の細胞障害性試薬例えばガンマ照射と組み合わされた場合に相乗の成長阻害を引き起こす。本発明は、上皮の固形腫瘍を処置する方法を提供するが、本発明の方法は既に確立された処置の属性の使用を補完するからである。

ｐ１８５ｎｅｕのキナーゼ欠損Ｔ６９１停止形態は、上昇レベルのＥＧＦＲを発現するヒト脳腫瘍細胞内のＮ６９１停止形態のｐ１８５ｎｅｕよりも、より効果的に細胞成長阻害および形質転換を達成する。Ｔ６９１停止ｎｅｕは悪性ヒト膠腫を含む多くの上皮腫瘍において特異的に発現する変異体ＥＧＦＲからの構成的シグナリングも阻害し、そして初期哺乳類癌細胞においてオンコジーン性の完全長のｐ１８５ｎｅｕのキナーゼ活性を低下させることが示された。Ｔ６９１停止ｎｅｕは、アミノ酸６６４位においてバリンからグルタミンへ変化するラットｎｅｕ膜貫通添変異を含むことから、ダイマーおよびオリゴマー複合体を形成するこの受容体の傾向において変化がもたらされる。

Ｔ６９１停止ｎｅｕ変異体ｃＤＮＡを組換えアデノウイルス構築物内にサブクローン化した。一つのベクターのバックボーンは、欠失したＥ１ａ領域を有し、そしてＥ２ａ内に温度感受性変異を有する（引用により編入される、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：１２１７−１２２９，１９９４）。組換え体の誘導は２段階で達成された。最初に、我々は、ウイルス組換え体生産のために必要なアデノウイルス配列を含む発現プラスミド（ｐＡｄ．ＣＭＶ．リンク、実施例６のとおり）にＴ６９１停止ｎｅｕをサブクローン化して、ｐＡｄ．ＣＭＶ．Ｔ６９１停止を生成した。Ｔ６９１停止ｎｅｕを発現するプラーク精製された組換え体アデノウイルス粒子を生成した。我々の実験室は、フローサイトメトリー分析によるアデノウイルス組換え粒子によるヒト癌細胞の感染後にＴ６９１停止変異体ｎｅｕ蛋白質の機能的発現を確認した。即ち、ヒト癌細胞内で高いレベルのＴ６９１停止ｎｅｕを発現する組換え体純粋アデノウイルス組換え体を単離して、抗癌剤として用いてよい。ウイルス組換え体投与をヒトへの適用のためにより適したものとするウイルスバックボーン内の変化を伴うＴ６９１停止ｎｅｕ−発現アデノウイルス組換え体をデザインした。特定すれば、Ｅ４領域の付加的な欠失を伴うＥ１ａ欠失を含むアデノウイルス組換え体を作成した（実施例７を参照）。

いくつかの好ましい態様によれば、本発明は、後遺症、局所疾患に対する抗癌遺伝子治療処置を前から存在する処置と組み合わせて治療アジュバントとして提供する。送達は、外科手術時、全ての全身疾患の切除後にはほとんど局所である。初期悪性脳腫瘍に関しては、腫瘍切除の時に遺伝子治療を施し、または特定の場合には、定位的移植、正確且つ標準の局所送達または切除の方法による。Ｔ６９１停止ｎｅｕの発現は非分割細胞に対して細胞破壊性または細胞障害性でない。しかしながら、Ｔ６９１停止ｎｅｕ変異体受容体によるｅｒｂＢ受容体シグナリングの阻害は、分割する腫瘍細胞集団を、照射により誘発されたアポトーシス細胞死に対してより感受性とさせる。Ｔ６９１停止ｎｅｕ形態もガンマ照射で処理した腫瘍細胞内の成長阻止の高いフラクションを含む。成長因子−媒介シグナリングの阻害は、多くの系において標準の抗癌試薬に対する増加した感受性に相関してきた。

後遺症、局所疾患は、ｅｒｂＢファミリー腫瘍蛋白質を通してシグナリングを無能にする、成長阻害の受容体に基づく戦略を用いて、本発明により治療される。この遺伝子治療戦略は、直接の（受容体シグナリング阻害）機構および間接の（即ち、癌細胞を、前から存在する試薬を用いた同時処置に対してより感受性とすることによる）機構による成長阻害の相乗を達成するための、組み合わされた治療養生法の一部である。

多くの腫瘍は、ＥＧＦＲ（ｅｒｂＢ１），ｐ１８５ｎｅｕ／ｅｒｂＢ２，ｅｒｂＢ３，および／またはｅｒｂＢ４を含むｅｒｂＢ受容体の過剰発現および／または変異の何れかに関して注目に値する。多くの場合、ｅｒｂＢファミリーメンバーの同時発現は相乗シグナリングをもたらして細胞形質転換に貢献する。ｐ１８５ｎｅｕ／ｅｒｂＢ２過剰発現に関して注目に値する腫瘍は、胸部、卵巣、肺、および膵臓の癌を含む。ＥＧＦＲ過剰発現に関して注目に値する腫瘍は、初期膠脳腫瘍および前立腺癌を含む。切断されたｐ１８５ｎｅｕ形態、即ちＴ６９１停止ｎｅｕのｃＤＮＡまたは蛋白質の遺伝子送達は、これらのヒト癌における後遺症、局所疾患の処置のための道理にかなった戦略を提供する。

本発明は、膠脳腫瘍、即ち膠芽腫により特徴付けされる腫瘍を有する患者を治療するのに特に有用である。そのような細胞は腫瘍原性に典型的に関連したＥＧＦＲの変異体形態を発現する。本発明はそのような患者を治療するのに特に有用であることが発見された。

いくつかの態様において、様々なラットｐ１８５種をコードする核酸配列は実施例で示される手法に従い、ｃ−ｎｅｕのｃＤＮＡから構築される。野生型の切断され、且つ変異したラットｐ１８５種をコードする核酸配列を、即ち、調製する。調製されたｐ１８５構築物の核酸配列をＤＮＡ配列決定により確認した。当業者は、そのような核酸配列を構築する方法を容易に認識するはずである。

そのような構築物の調製の後に、それらを発現する適切な宿主細胞にトランスフェクトする。当業者は、使用するための適当な多数の宿主細胞を容易に理解するはずである。これらの適切な宿主細胞の範囲内で、調製されたヌクレオチド構築物から生成されるｐ１８５種がｐ１８５またはＥＧＦＲの何れかとダイマー形成する能力を試験した。そのような試験は、イムノブロッティング、フローサイトメトリー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、並びに当業者にはよく知られている他の技術を含んでよい。さらに、様々な技術によりチロシンキナーゼ活性を評価することも当業者の範囲内である。

ｐ１８５種のｔｋ−表現型の欠如が確立され、そしてＥＧＦＲまたはｐ１８５の何れかとダイマー形成する能力が確立されたならば、ｐ１８５種をコードする核酸配列を、ヒト細胞内のトランスフェクションに適切なベクターにサブクローン化する。別法として、該核酸配列は上記された他の送達手段と組み合わせて使用してよい。

本発明の一つの側面に従えば、上記核酸はチロシンキナーゼ活性を欠き且つヒトＥＧＦＲまたはヒトｐ１８５とダイマー形成する蛋白質をコードする核酸配列を含む。該核酸配列はＤＮＡまたはＲＮＡの何れかであってよい。該核酸配列は、ヒトＥＧＦＲおよび／またはｐ１８５とダイマー形成し且つチロシンキナーゼ活性を欠くあらゆる蛋白質をコードしてよい。該核酸配列は、好ましくは、ヒトｐ１８５またはヒトＥＧＦＲとダイマー形成してよく且つチロシンキナーゼ活性も欠くラットまたはヒトのｐ１８５種をコードする。いくつかの好ましい態様において、該核酸配列はラットまたはヒトのｐ１８５種のエクトドメイン領域を含む蛋白質をコードする。そのような蛋白質は、ｅｒｂＢ蛋白質例えばヒトｐ１８５またはヒトＥＧＦＲとダイマー形成し、そしてチロシンキナーゼ活性も欠く。

いくつかの好ましい態様において、構築物は、ラットｎｅｕ膜貫通領域を含む。いくつかの好ましい態様において、該ラットｎｅｕ膜貫通領域はアミノ酸６６４位においてｖａｌ＞ｇｌｕの変異を含む。アミノ酸６６４位において変異をもたないラットｎｅｕ膜貫通領域は「Ｎ」形態と称され、そしてアミノ酸６６４位において変異をもつラットｎｅｕ膜貫通領域は「Ｔ」形態と称される。

本発明のいくつかの好ましい態様において、核酸はラットｐ１８５の切断された種をコードする。本発明は、ヒトｐ１８５またはヒトＥＧＦＲの何れかとダイマー形成し且つチロシンキナーゼ活性を欠くＮ−末端またはＣ−末端の何れかの欠失を含むラットｐ１８５のあらゆる切断された種を含む。さらに、置換されたアミノ酸を含む切断種も効果的かもしれない。しかしながら、切断種はヒトｐ１８５またはヒトＥＧＦＲとダイマー形成することが可能でなければならない。即ち、ヒトｐ１８５またはヒトＥＧＦＲの何れかとダイマー形成することが可能であるがｔｋ−表現型も有するｐ１８５のあらゆる部分をその中に包含する。好ましくは、上記核酸配列は約１−６９０から約１−７４０のラットｐ１８５のアミノ酸残基からなる蛋白質をコードする。いくつかの好ましい態様において、膜貫通領域のＮ形態を含むが、他方はＴ形態が存在する。

本発明の他の好ましい態様において、上記核酸は、アミノ酸の部分的置換または欠失によりチロシンキナーゼ活性を欠くラットｐ１８５の種をコードするが、特に、チロシンキナーゼ活性に必須の分子の領域内の部分である。本発明は、ラットｐ１８５のあらゆるｔｋ−種を含み、ｔｋ活性に必須のアミノ酸の置換または欠失の何れかを含み、該種はヒトｐ１８５またはヒトＥＧＦＲとダイマー形成もする。さらに、ｔｋ−関連配列の外の置換アミノ酸を含むそのような種も効果的である。いくつかの好ましい態様において、膜貫通領域のＮ形態を含み、他方Ｔ形態が存在する。

ラットｐ１８５の７５３−７５８位は、チロシンキナーゼ反応におけるリン酸ドナーであるＡＴＰ分子を直接結合する決定的なリジン残基を含む（引用により編入される、Ｍｏｌｌｅｒら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９８５，１８６，１；およびＳｔｅｒｎｂｅｒｇら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９８４，１７５，３８７）。Ｌｙｓ７５７は、キナーゼ活性を欠くヌクレオチド結合蛋白質内にも見いだされる保存されたモチーフの１５アミノ酸残基下流である（引用により編入される、Ｗｉｅｒｅｎｇａら、Ｎａｔｕｒｅ，１９８３，３０２，８４２）。該グリシン残基は、ＡＴＰ分子を直接結合する上記の決定的なリジン残基の回りに疎水性ポケットを形成すると信じられる（引用により編入される、Ｍｏｌｌｅｒら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９８５，１８６，１；およびＳｔｅｒｎｂｅｒｇら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９８４，１７５，３８７）。即ち、該ＡＴＰ結合ドメインまたは周辺領域内の破壊を含み、ＡＴＰがもはや上記決定的Ｌｙｓ残基に結合しない、あらゆるｐ１８５種は本発明に含まれる。しかしながら、これらの種は、ヒトｐ１８５またはヒトＥＧＦＲとダイマー形成もしなければならない。好ましくは、上記核酸配列はラットｐ１８５のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードし、引用により編入されるＧＥＮＥＢＡＮＫ加盟番号Ｘ０３３６２およびそれぞれ引用により編入されるＢａｒｇｍａｎｎら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３１９，２２６−２３０，ＭＥＤＬＩＮＥ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：８６１１８６６２；およびＬｏｆｔｓら（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８，２８１３−２８２０；に示され、このアミノ酸配列はおよそ７５３位からおよそ７５８までの置換または欠失あるいはその組み合わせを含み、上記置換はリジン残基を含まない。いくつかの好ましい態様において、膜貫通領域のＮ形態を含み、他方Ｔ形態が存在する。

本発明のいくつかの好ましい態様において、上記核酸は、ヒトｐ１８５の切断された種をコードする。本発明は、ヒトｐ１８５またはヒトＥＧＦＲの何れかとダイマー形成し且つチロシンキナーゼ活性を欠く、Ｎ−末端またはＣ−末端の何れかに欠失を含むヒトｐ１８５の切断された種をコードする。さらに、置換されたアミノ酸を含む切断種も効果的であるかもしれない。しかしながら、切断種はヒトｐ１８５またはヒトＥＧＦＲとダイマー形成できなければならない。即ち、ヒトｐ１８５またはヒトＥＧＦＲとダイマー形成することができるがｔｋ−表現型も有するヒトｐ１８５のあらゆる部分が本発明に含まれる。好ましくは、上記核酸配列はヒトｐ１８５のアミノ酸残基、およそ１−６４６からおよそ１−７０４までからなる蛋白質をコードする。いくつかの態様において、上記核酸配列はヒトｐ１８５のアミノ酸残基およそ１−６５３からなる蛋白質をコードする。

本発明のいくつかの好ましい態様において、上記核酸は、アミノ酸の部分的置換または欠失によりチロシンキナーゼ活性を欠くヒトｐ１８５の種をコードするが、特に、チロシンキナーゼ活性に必須の分子の領域内の部分である。本発明は、ヒトｐ１８５のあらゆるｔｋ−種を含み、ｔｋ活性に必須のアミノ酸の置換または欠失の何れかを含み、該種はヒトｐ１８５またはヒトＥＧＦＲとダイマー形成もする。さらに、ｔｋ−関連配列の外の置換アミノ酸を含むそのような種も効果的である。

ヒトｐ１８５の７４９−７５４位は、チロシンキナーゼ反応におけるリン酸ドナーであるＡＴＰ分子を直接結合する決定的なリジン残基を含む。該ＡＴＰ結合ドメインまたは周辺領域内の破壊を含み、ＡＴＰがもはや上記決定的Ｌｙｓ残基に結合しない、あらゆるｐ１８５種は本発明に含まれる。しかしながら、これらの種は、ヒトｐ１８５とダイマー形成もしなければならない。好ましくは、上記核酸配列はヒトｐ１８５のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードし、引用により編入されるＧＥＮＥＢＡＮＫ加盟番号Ｘ０３３６３およびそれぞれ引用により編入されるＹａｍａｍｏｔｏら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３１９，２３０−２３４，ＭＥＤＬＩＮＥ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：８６１１８６６３；およびＰａｐｅｗａｌｌｓら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９，５４５２−５４５２，ＭＥＤＬＩＮＥ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：９２０２０２６５；に示され、このアミノ酸配列はおよそ７４９位からおよそ７５４までの置換または欠失あるいはその組み合わせを含み、上記置換はリジン残基を含まない。

本発明のいくつかの好ましい態様において、上記核酸配列は、アミノ酸配列が７５３位において置換または欠失を含むヒトｐ１８５をコードする。この置換または欠失は、この位置において決定的なＬｙｓ残基を特異的に除去する。即ち、ＡＴＰはこの分子にもはや結合せず、ｔｋ−表現型をもたらす。

いくつかの態様において、上記核酸は、ヒトＥＧＦＲ蛋白質、ヒトｐ１８５蛋白質、ヒトｅｒｂＢ３−誘導蛋白質またはヒトｅｒｂＢ４−誘導蛋白質をコードする。いくつかの態様において、上記核酸は融合蛋白質をコードする。該融合蛋白質は、ヒトおよび非ヒトの配列、特にラット由来のキメラ配列によりコードされる。

いくつかの態様において、上記核酸は、
アミノ酸６９１において停止コドンを有する切断されたラットｎｅｕ遺伝子（Ｎ６９１停止構築物）；
アミノ酸６９１において停止コドンを有し且つアミノ酸６６４においてｖａｌからｇｌｕへの変異を有する切断されたラットｎｅｕ遺伝子（Ｔ６９１停止構築物）；
アミノ酸６９１において停止コドンを有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトｐ１８５ｃ−ｅｒｂＢ２エクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子（Ｎ６９１停止構築物）；
アミノ酸６９１において停止コドンを有し且つアミノ酸６６４においてｖａｌからｇｌｕへの変異を有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトｐ１８５ｃ−ｅｒｂＢ２エクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子（Ｔ６９１停止構築物）；
アミノ酸６９１において停止コドンを有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトＥＧＦＲエクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子（Ｎ６９１停止構築物）；
アミノ酸６９１において停止コドンを有し且つアミノ酸６６４においてｖａｌからｇｌｕへの変異を有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトＥＧＦＲエクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子（Ｔ６９１停止構築物）；
アミノ酸６９１において停止コドンを有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトｅｒｂＢ３エクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子（Ｎ６９１停止構築物）；
アミノ酸６９１において停止コドンを有し且つアミノ酸６６４においてｖａｌからｇｌｕへの変異を有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトｅｒｂＢ３エクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子（Ｔ６９１停止構築物）；
アミノ酸６９１において停止コドンを有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトｅｒｂＢ４エクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子（Ｎ６９１停止構築物）；および
アミノ酸６９１において停止コドンを有し且つアミノ酸６６４においてｖａｌからｇｌｕへの変異を有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトｅｒｂＢ４エクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子（Ｔ６９１停止構築物）
からなる群から選択される。

治療用照射に暴露されることにより殺傷できる非形質転換複製細胞とは異なり、腫瘍細胞は、照射による細胞死の誘導に耐性である。腫瘍細胞の形質転換された表現型に関連した上昇チロシンキナーゼ活性を生じるマルチマーの集合物を破壊することにより、照射により誘導した細胞死に対して通常は耐性の腫瘍細胞は照射に感受性になることが、今発見された。従って、本発明の一つの側面は、照射耐性腫瘍細胞を照射感受性にする方法を提供する。本発明は、形質転換された表現型に関連したキナーゼ活性を提供するマルチマー受容体集合物を有する腫瘍細胞を有する個体を治療する方法に関する。該方法は、最初に、上記マルチマー受容体集合物に関連したキナーゼ活性を破壊する組成物を患者に投与する。患者は次にガンマ照射により処置される。

形質転換された表現型に関連した上昇キナーゼ活性を腫瘍細胞内で示すいくつかの公知の受容体集合物がある。ｅｒｂＢファミリーの受容体のメンバーは、腫瘍細胞内で上昇したチロシンキナーゼ活性をもたらすマルチマー集合物を形成することが知られている。ｅｒｂＢファミリーを含むマルチマー集合物は、ｅｒｂＢヘテロダイマー並びにｅｒｂＢファミリーメンバーとは異なるモノマー成分を含むｅｒｂＢヘテロダイマーを含む。血小板由来の成長因子（ＰＤＧＦＲ）のマルチマー受容体集合物も、形質転換された表現型に関連した上昇キナーゼ活性を示す。

本発明の一つの側面によれば、ｅｒｂＢ媒介腫瘍細胞内でのｅｒｂＢ蛋白質のダイマー形成は、そのような細胞を細胞破壊に関してより敏感にするように、照射を用いて破壊される。従って、組み合わせの治療が提供され、最初にｅｒｂＢダイマー化の干渉をもたらす活性剤を含む組成物を個体に投与し、次に、該患者を治療量の照射に暴露することからなる。本発明のこれらの側面によれば、ｅｒｂＢ蛋白質媒介腫瘍を有する個体を治療する方法が提供される。該方法は、腫瘍細胞内においてｅｒｂＢ蛋白質のダイマー形成からもたらされる上昇チロシンキナーゼ活性を阻害する組成物を個体に投与し、次に、上記腫瘍細胞からのｅｒｂＢ蛋白質のダイマー形成に関連したチロシンキナーゼ活性を阻害する組成物に十分な時間の後に、治療有効量の抗癌照射に該個体を暴露する工程からなる。

００９６
いくつかの腫瘍細胞において、ｃ−ｅｒｂＢ２遺伝子のｐ１８５翻訳産物が過剰発現されて他のｅｒｂＢファミリーメンバーとホモダイマーおよびヘテロダイマーを形成する。過剰発現されたｐ１８５のそのようなダイマー化は、形質転換された表現型に関連した上昇チロシンキナーゼ活性を導く。例えばモノマー成分間のダイマー形成を阻害することによるチロシンキナーゼ活性の破壊は、腫瘍細胞上への細胞増殖抑制性の作用をもたらす。上記破壊が、以前は照射耐性であった腫瘍細胞を照射感受性にすることも、今発見された。

同様に、いくつかの腫瘍細胞においては、変異形態のＥＧＦＲ（ΔＥＧＦＲ）はリガンド非依存性発現される。ΔＥＧＦＲのそのようなダイマー形成は、形質転換された表現型に関連した上昇チロシンキナーゼ活性を導く。例えばモノマー成分間のダイマー形成を阻害することによるチロシンキナーゼ活性の破壊は、腫瘍細胞上への細胞増殖抑制性の作用をもたらす。上記破壊が、以前は照射耐性であった腫瘍細胞を照射感受性にすることも、今発見された。

いくつかの態様において、ｅｒｂＢ−蛋白質媒介腫瘍は脳の癌腫瘍である。いくつかの好ましい態様において、ｅｒｂＢ−媒介腫瘍は膠の腫瘍である。いくつかの好ましい態様において、ｅｒｂＢ−媒介腫瘍は膠芽腫である。いくつかの態様において、ｅｒｂＢ−媒介腫瘍は卵巣癌腫瘍である。いくつかの態様において、ｅｒｂＢ−媒介腫瘍は前立腺癌腫瘍である。

いくつかの態様において、マルチマー受容体集合物に関連したキナーゼ活性は、集合物のモノマー成分に相互作用し、そしてそうすることにおいてモノマーを物理的に変化させることによりダイマー形成を妨害して、その結果集合物を形成するためにほとんど熱力学的に消費されない活性剤を含む組成物を、個体に投与することにより破壊される。そのような物理的変化は、例えば、該モノマーをダイマー形成にふさわしくない条件にする、コンフォメーションの変化、立体の変化および／または静電変化であってよい。モノマーを物理的に変化させる活性剤の例は、抗体、蛋白質、ペプチドおよび非蛋白質様分子を含む。

本明細書にて用いるとおり、用語「抗体」は、抗体並びに抗体断片例えばＦＡｂおよびＦ（Ａｂ）２断片を称することを意味する。抗体は、いくつかの好ましい態様において、モノクローナル抗体またはヒト化抗体であってよい。ｐ１８５に対する抗体は、引用により編入される１９９７年１０月１４日発行の米国特許第５，６７７，１７１号および引用により編入される１９９８年１月６日発行の米国特許第５，７０５，１５７号に記載され、ＥＧＦＲに対する抗体も記載する。引用により編入される１９９５年１１月２８日発行の米国特許第５，４７０，５７１号もＥＧＦＲに対する抗体を記載する。

いくつかの態様において、抗体を模倣するペプチドが提供され、マルチマー集合物形成を阻害してそのような形成と関連した上昇キナーゼ活性を阻害するように提供される。例えば、抗体からのＣＤＲ領域に相当する配列を有するペプチドがデザインされる。そのようなペプチドを作成する方法も、引用により編入される、１９９４年６月１０日出願のシリアル番号第０８／２５７，７８３号１９９５年６月６日出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７１５７に記載される。ｐ１８５に対する抗体のペプチド模倣は、引用により編入される１９９７年９月２日発行の米国特許第５，６６３，１４４号に記載される。

本発明のいくつかの態様によれば、マルチマー受容体集合物に関連したキナーゼ活性を破壊するために個体に投与される組成物は、上記集合物の他の成分に相互作用することを妨害するために上記集合物のモノマー成分と相互作用するキナーゼ欠損蛋白質またはペプチドをコードする核酸分子である活性剤を含む。即ち、上記核酸分子は、細胞の内因性蛋白質と競合することによりマルチマー複合体を形成するキナーゼ欠損蛋白質をコードする。キナーゼ欠損蛋白質と細胞の内因性蛋白質の間に形成される複合体は上昇したキナーゼ活性を提供しない。即ち、キナーゼ欠損蛋白質は囮（ｄｅｃｏｙｓ）として作用することにより内因性蛋白質を妨害して、それによりキナーゼ活性マルチマー複合体の形成を妨害する。そのような核酸分子の例は、引用により編入される、１９９７年２月１１日出願のシリアル番号第０８／７３７，２６９号および本開示に記載される。

いくつかの方法によれば、腫瘍細胞内のｅｒｂＢ蛋白質と競合して相互作用することにより他のｅｒｂＢ蛋白質殿ダイマー形成を競合して阻害してｅｒｂＢ蛋白質のダイマー形成を阻害する化合物を含む、患者に投与される組成物は、蛋白質を含む核酸分子である。該蛋白質は、ｅｒｂＢ蛋白質と競合して相互作用することによりダイマー形成をブロックする。いくつかの態様において、該蛋白質は上記一つのｅｒｂＢ蛋白質の膜貫通領域と相互作用する。いくつかのそのような態様において、一つのｅｒｂＢ蛋白質の膜貫通領域と相互作用する蛋白質は、アミノ酸６６４においてｖａｌからｇｌｕへの変異を有するラットｎｅｕ膜貫通領域を含む。いくつかの態様において、該蛋白質は一つのｅｒｂＢ蛋白質のエクトドメイン領域と相互作用する。いくつかのそのような態様において、一つのｅｒｂＢ蛋白質のエクトドメイン領域と相互作用する蛋白質はｐ１８５エクトドメインを含む。いくつかの好ましい態様において、上記蛋白質をコードする核酸分子はウイルスゲノムである。いくつかの好ましい態様において、それは組換えアデノウイルスのゲノムである。いくつかの態様によれば、該核酸分子は個体の細胞内の翻訳のための制御要素に作動可能に連結したコーディング配列を含む。いくつかの態様において、該コーディング配列は、アミノ酸６９１において停止コドンを有する切断されたラットｎｅｕ遺伝子；アミノ酸６９１において停止コドンを有し且つアミノ酸６６４においてｖａｌからｇｌｕへの変異を有する切断されたラットｎｅｕ遺伝子；アミノ酸６９１において停止コドンを有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトｐ１８５ｃ−ｅｒｂＢ２エクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子；アミノ酸６９１において停止コドンを有し且つアミノ酸６６４においてｖａｌからｇｌｕへの変異を有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトｐ１８５ｃ−ｅｒｂＢ２エクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子；アミノ酸６９１において停止コドンを有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトＥＧＦＲエクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子；アミノ酸６９１において停止コドンを有し且つアミノ酸６６４においてｖａｌからｇｌｕへの変異を有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトＥＧＦＲエクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子；アミノ酸６９１において停止コドンを有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトｅｒｂＢ３エクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子；アミノ酸６９１において停止コドンを有し且つアミノ酸６６４においてｖａｌからｇｌｕへの変異を有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトｅｒｂＢ３エクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子；アミノ酸６９１において停止コドンを有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトｅｒｂＢ４エクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子；およびアミノ酸６９１において停止コドンを有し且つアミノ酸６６４においてｖａｌからｇｌｕへの変異を有するラットｎｅｕ膜貫通に連結したヒトｅｒｂＢ４エクトドメインを含むキメラｐ１８５遺伝子からなる群から選択される配列を含む。

いくつかの態様において、核酸分子は、ｅｒｂＢ蛋白質の膜貫通領域に相互作用し、そして即ちｅｒｂＢ蛋白質のダイマー形成を阻害するペプチドをコードする。そのような核酸分子の例は、引用により編入される、Ｌｏｆｔｓら、１９９３ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：２８１３−２８２０に開示される。

いくつかの好ましい態様において、マルチマー受容体集合物に関連したキナーゼ活性の破壊を引き起こす活性剤を含む組成物は、該剤を腫瘍に送達することが可能なあらゆる投与経路により投与される、いくつかの態様において、該組成物は、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、非経口、または腫瘍内に投与されてよい。いくつかの好ましい態様によれば、該組成物の投与前に、個体は塊の腫瘍集合体を除去する外科手術を受けておく。

本発明の側面によれば、マルチマー受容体集合物に関連したキナーゼ活性の破壊を引き起こす活性剤を含む組成物を投与した後に；該個体は次に治療量のガンマ照射に暴露される。照射治療は、マルチマー受容体集合物に関連したキナーゼ活性の破壊を引き起こすために活性剤に関して十分な量の時間が過ぎ去った後に初めてよい。一般に、個体は、いくつかの場合活性剤投与から１−１０分後に、いくつかの場合１−１０時間後に、そしていくつかの場合２４−７２時間後までに照射に暴露される。いくつかの場合、照射は単一用量で提供されるが、いくつかの態様において、複数用量を数時間、数日および／または数週かけて投与する。即ち、活性剤が一度キナーゼ活性を阻害したなら、照射に対する暴露は他の人のするとおりにしてよい。ガンマ照射は、標準放射線治療プロトコルに従い標準用量および養生法を使用して送達される。活性剤の投与は、腫瘍細胞を根絶することにおいて、照射をより効果的にする。

本発明の側面によれば、マルチマー受容体集合物に関連したキナーゼ活性の破壊を引き起こす活性剤を含む組成物を投与した後に；該個体は次に治療量のガンマ照射への暴露に加えてかまたは代わりに、細胞障害性価額治療剤を投与される。放射線治療におけるように、化学治療は、マルチマー受容体集合物に関連したキナーゼ活性の破壊を引き起こすために活性剤に関して十分な量の時間が過ぎ去った後にいつでも初めてよい。一般に、個体は、いくつかの場合活性剤投与から１−１０分後に、いくつかの場合１−１０時間後に、そしていくつかの場合２４−７２時間後までに化学治療剤を投与される。いくつかの場合、化学治療は単一用量で提供されるが、いくつかの態様において、複数用量を数時間、数日および／または数週かけて投与する。活性剤は腫瘍細胞を、細胞障害剤に対してより感受性にする。即ち、活性剤が一度キナーゼ活性を阻害したなら、化学治療剤の投与は他の人のするとおりにしてよい。化学治療剤は、標準放射線治療プロトコルに従い標準試薬、用量および養生法を使用して送達される。いくつかの態様において、化学治療剤は、シスプラチン、ドキシルビシン、ダヌルビシン、タモキシフェン、タクソール、およびメトトレキセートからなる群から選択される。いくつかの態様において、化学治療および照射の処置は、共に、活性剤の投与の後に用いられる。そのような態様において、２つの治療条件の標準的な組み合わせは、キナーゼ阻害性活性剤の投与と共に使用する。

本発明は、あらゆる原理に限定されることを意図しない。本発明は、以下の実施例によりさらに例証されるが、あらゆる意味において限定することを意図しない。

実施例１：変異体、発現ベクターの構築および細胞系の創製
変異体ｐ１８５種、発現ベクターおよび細胞系の構築のための詳細な方法は以前に記載された（それぞれ引用により編入される、Ｑｉａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９４，９１，１５００；およびＷｅｉｎｅｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９８９，４，１１７５）。
変異体Ｎ７５７の構築
ＡＴＰ結合変異体Ｎｎｅｕ Ｋ７５７Ｍ（Ｎ７５７）はサブクローニング技術によりｐＳＶ２ＴｎｅｕＫ７５７Ｍ（引用により編入されるＷｅｉｎｅｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９８９，４，１１７５）から誘導した。この構築物は、部位特異的変異導入によりＬｙｓ７５７をＭｅｔで置換して製造した。当業者は、部位特異的変異導入によるそのような変異体の製造を容易に理解するはずである。簡単に言えば、公表されたヌクレオチド配列の可能なＡＴＰ結合部位をまたぐ１．２ｋｂのバンドに対応するｐＳＶ２ｎｅｕＴのＸｂａＩ断片をＭ１３Ｍｐ１８にクローニングして、大腸菌株ＣＪ２３６（ｄｏｔ−，ｕｎｇ−）ｐＵ１３にトランスフェクトして、その結果ポリリンカーのＨｉｎｄＩＩＩ部位が挿入された配列の５’末端に落ちた。変異導入は、ＬｙｓをコードするコドンＡＡＧをＭｅｔのコドンに相当するＡＵＧに置換えるプライマーを利用して記載されるとおりに実施した（引用により編入される、Ｂａｒｇｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，１９８６，３１９，２２６）。そうして創製された点変異はＤＮＡ配列決定により確認された。新規な変異を有するこのプラスミドをＸｂａＩで切断してオリジナルの断片を遊離した。この断片を当業者には公知の標準技術により単離してｐＳＶ２−ｎｅｕに戻して連結することにより、オンコジーンｐ１８５ｎｅｕ発現ベクターを再生したが、該ベクターはアミノ酸７５７においてＬｙｓに代えてＭｅｔの置換を含んだ（クローンＭ７５７）。
変異体Ｎ６９１停止の構築
カルボキシル末端５９１のアミノ酸の欠失した変異体Ｎ６９１停止は、ｐＳＶ２Ｎｅｕ（引用により編入される、Ｂａｒｇｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，１９８６，３１９，２２６）から、部位特異的変異導入により通常のコドンＴｈｒ６９１を停止コドンに置換することにより誘導した。
Ｎｄｘの構築
カルボキシル末端５４１アミノ酸を欠失した変異体Ｎｄｘは、ｃ−ｎｅｕ ｃＤＮＡから、部位特異的変異導入を用いて、ＸｂａＩ断片の欠失と７４１位の正常なコドンに代えた停止コドンの挿入により誘導した。
発現ベクターの構築
発現ベクターに関しては、ｐＳＶ２ＤＨＦＲからのマウスジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）ｃＤＮＡおよびｐＳＶ２ＮＥＯからのバクテリアネオマイシンホスホトランスフェラーゼ耐性遺伝子（ｎｅｏｒ）を含む断片（引用により編入される、Ｓｏｕｒｔｈｅｒｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１９８２，１，３２７）をｐＳＶ２Ｎｎｅｕにサブクローン化して、１４．８ｋｄ ＤＨＦＲ，ｎｅｏｒ，およびＮｎｅｕ ｃＤＮＡを組み合わせたベクターを生成した。野生型および変異ｎｅｕの断片を単離してｐＳＶ２ｎｅｏｒ／ｄｈｆｒ／Ｎｎｅｕ発現ベクターに戻して連結した。これらのｃＤＮＡの全てはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）遺伝子の初期プロモーター制御下にあった。ヘルペスシンプレックスウイルスチミジンキナーゼプロモーター制御下のバクテリアハイグロマイシン耐性（Ｈｙｇｒ）遺伝子をコードする遺伝子ユニットをｐＨｙｇから単離して、ｐＥＧＦＲ１（引用により編入される、Ｇｏｒｍａｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８８，１２Ａ．Ｓｕｐｐｌ．，Ｃ２１９）内のｎｅｏｒ遺伝子断片を置換することにより、他の組み合わせ発現ベクターｐＥＧＦＲ／Ｈｙｇｒを生成した。ヒトＥＧＦＲ ｃＤＮＡはＳＲαの制御下であり、ＳＶ４０の初期プロモーターを含む効率的転写制御要素およびヒトＴ細胞白血病ウイルスタイプ１のロングターミナルリピートのＲ−Ｕ５セグメントであった（引用により編入される、Ｔａｋｅｂｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８８，８，４６６）。
細胞系のトランスフェクションおよび保持
構築物ｐＥＧＦＲ／Ｈｙｇｒを最初にリン酸カルシウム沈殿法によりＮＲ６細胞（引用により編入される、Ｐｒｕｓｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９７７，７４，３９１８）にトランスフェクトした。ハイグロマイシン選択（３５μｇ／ｍｌ）の３週間後、その結果のコロニーのＥＧＦＲ発現を抗−ＥＧＦＲイムノブロッティングにより同定した。ＥＧＦＲを発現した細胞は、ｃＤＮＡ発現ベクターを用いた第２ラウンドのトランスフェクション前に、限定希釈法によりさらにクローン化した。ＮＥ９１と称されるＥＧＦＲ−発現細胞をＮＲ６と共に、野生型または変異体ｎｅｕ蛋白質をコードするｐＳＶ２ｎｅｏｒ／ｄｈｆｒ／ｎｅｕによりトランスフェクトして、Ｇ４１８で選択した。ＮＲ６細胞およびＮＥ９１細胞内のＮｅｕ−発現クローンを抗−ｎｅｕモノクローナル抗体７．１６．４染色を用いてフローサイトメトリーアッセイによりスクリーンし（引用により編入される、Ｄｒｅｂｉｎら、Ｃｅｌｌ，１９８５，４１，６９５）、そしてそれぞれＮＲ６ ＮｅｕおよびＮＥ Ｎｅｕと名付けた。これらのＤＨＦＲ−含有単一（Ｎｅｕのみを発現）または二重（ＮｅｕとＥＧＦＲを発現）トランスフェクトクローンは、５％胎児ウシ血清、Ｇ４１８（０．３ｍｇ／ｍｌ）、およびハイグロマイシン（１５μｇ／ｍｌ）を含むダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に保持した。Ｎｅｕの増幅は、数カ月かけて段階的な増加投薬量（０．３−１．０μＭ）のメトトレキセートにより達成して、受容体発現レベルを上昇させた。
フローサイトメトリー
細胞は、バッファー化ＥＤＴＡを用いて組織培養皿から取り出し（Ｖｅｒｓｅｎｅ，Ｍ．Ａ．Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）、そしてＦＡＣＳ培地中で２回洗浄した（２％胎児ウシ血清。０．２％アジ化ナトリウム、および１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを追加したハンクスバランス化塩溶液（ギブコ））。１Ｘ１０６の細胞を０．１ｍｌのＦＡＣＳ培地中で７．１６．４抗ｎｅｕモノクローナル抗体（引用により編入される、Ｄｒｅｂｉｎら、Ｃｅｌｌ，１９８５，４１，６９５）またはアイソタイプ適合の無関係な対照抗体と共に１時間４℃においてインキュベートした。細胞を２回２．５ｍｌのＦＡＣＳ培地で洗浄した。細胞沈殿物を懸濁して、細胞を、ＦＡＣＳ培地中で１：５０希釈した０．１ｍｌのＦＩＴＣ−配合ヤギウサギ抗−マウスＩｇＧ（抗体の重鎖および軽鎖と反応性、Ｔａｇｏ）と１時間４℃においてインキュベートした。細胞を２回洗浄して、ＦＡＣＳ ＩＶベクトンディッキンソン上で分析した。
実施例２：チロシンキナーゼ活性
膜精製
引用により編入されるＧａｕｌｔｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９８６，７，２４７０に記載されたとおりに、スナップ凍結−解凍およびドウンスホモジェナイゼーションの組み合わせにより細胞を溶解した。核画分を２０００Ｘｇ、５分間の遠心分離により除去した。２０００Ｘｇ上清画分は次に２５０００Ｘｇ、３０分間、４℃において遠心分離し、そして２５０００Ｘｇ上清を細胞質画分として保存した。沈殿物は１．５ｍｌの膜バッファー（４０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．８），２ｍＭ ＰＭＳＦおよび５ｍＭ Ｎａピロリン酸）中に再度溶解して、次に膜バッファー上の（２０％−３７％）蔗糖溶液上に重層して、ベックマンＳＷ５０．１ローターを用いて２２０００ｒｐｍ、１８時間２℃にて遠心分離した。膜富裕境界を１ｍｌの全体積にて取り出し、１０ｍｌの膜バッファーで希釈し、そしてＳＷ４０．１ローターを用いることにより４００００ｒｐｍ、６０分間遠心分離したが、引用により編入されるＺｉｃｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８４，１１９，６に記載されるとおりである。精製された膜画分を含むその結果の沈殿物を１０７オリジナル細胞あたり１００μｌのキナーゼバッファー（以下参照）に再度溶解した。膜蛋白質はバイオラッドプロテインアッセイキットを用いて定量して、アッセイまで−８０℃にて保存した。
膜中のチロシンキナーゼ活性
膜濃度は、引用により編入されるＧａｕｌｔｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９８６，７，２４７０に記載されたとおり、Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法により測定した。チロシンリン酸化の特異的インディケーターとしてチロシンを含む合成ポリペプチドの存在または不在下で、膜の希釈物を４重にインキュベートした。キナーゼ反応バッファー（５０μｌの０．１Ｍ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．３，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，５ｍＭ ＭｎＣｌ２，５０μＭ Ｎａ３ＶＯ４）をＡＴＰ（１μＣｉのガンマ［３２Ｐ］ＡＴＰ；アマシャム）存在下で室温において５分間インキュベートした。５ｍＭ ＥＤＴＡ（最終濃度）を加えて直後にグラスファイバーフィルター（ワットマンＧＦ／Ｃ）上にＴＣＡ免疫沈殿することにより、反応を停止した。フィルターは、ＴＣＡにより広範囲に洗浄し、次にエーテルで洗浄し、空気乾燥し、シンチレーションカクテル（Ｂｉｏｆｌｕｏｒ）に浸し、そしてベータ放射を測定した。チロシン含有基質の不在下でアッセイされた４重のウエルをチロシン基質含有ウエルから差し引いた。

引用により編入される、Ｚｉｃｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８４，１１９，６に記載されるとおり膜蛋白質をグルタミン酸−チロシン（４：１）ポリｇｌｕ：ｔｙｒ，ＰＧＴのランダムポリマーをチロシンリン酸化の基質としてインキュベートした。簡単に言えば、膜蛋白質を、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１００μＭ Ｎａ３ＶＯ４および１５０μＭ（１０μＣｉ）［３２Ｐ］ＡＴＰを含む５０μｌの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２中で１５分間室温において２．５ｍｇ／ｍｌのポリｇｌｕ：ｔｙｒ基質存在（特異的）または不在（バックグラウンド）下でインキュベートした。ＥＤＴＡを５０ｍＭ最終濃度まで添加してコールドの過剰ＡＴＰを添加することにより反応を停止して、サンプルをワットマングラスファイバーフィルターペーパー上にスポットした。フィルターは１０ｍＭのピロリン酸および１ｍＭ ＡＴＰを含む氷冷１０％ＴＣＡで３回洗浄して、次にアセテートで洗浄した。次に、サンプルを乾燥してＢｉｏＦｌｕｏｒ（ＮＥＮ）中で計数した。リン酸化チロシン含有膜蛋白質の免疫沈殿のため、５０μｇの精製蛋白質を上記のとおりキナーゼバッファーと１５分間インキュベートした。標識後、サンプルを５ｍＭ ＥＤＴＡ追加溶解バッファー中に溶解して、プレクリアーし、そしてＭＡ−２Ｇ８Ａ６からの２μｌの腹水＋プロテインＡアガロースで免疫沈殿した。引用により編入される、Ｄａｎｉｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８５，８２，２０８４に記載されたとおり、ＭＡ−２Ｇ８抗体はリン酸化チロシン標識ポリペプチドを特異的に沈殿させる。
実施例３：ｐ１８５またはＥＧＦＲとのダイマー形成
ＥＧＦＲおよびｐ１８５ヘテロダイマーは、ＥＧＦおよび化学物質架橋リンカー処理後に、抗受容体特異的抗体免疫沈殿およびイムノブロッティングにより検出する。ＥＧＦＲとキナーゼ欠損ｐ１８５蛋白質の物理的対合をこの様式において試験した。
化学物質架橋連結アッセイ
細胞を、一晩１０ｃｍペトリ皿中で培養し、ＥＧＦ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）存在または不在にて３７℃において１０−１５分間インキュベートし、そして冷やしたリン酸バッファー塩（ＰＢＳ）で２回洗浄した。２ｍＭビス（スルフォサクシニミジル）スベレート（ＢＳ３）または３，３’−ジチオビス（スルフォサクシニミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ）（ピアス）含む３ｍｌのＰＢＳを加えて、プレートの時おりの揺り動かしを伴い、１８℃において３０分間インキュベートした。クエンチング後に、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．９％ＮａＣｌ、および０．１Ｍグリシンを含むバッファーと共に架橋反応混合物を２回冷やしたＰＢＳで洗浄して、ＰＩ／ＲＩＰＡバッファーで可溶化した（引用により編入される、Ｗａｄａら、Ｃｅｌｌ，１９９０，６１，１３３９）。
標識と免疫沈殿
全ての試薬は他に示す以外はシグマ社から得た。［３２Ｐ］−標識に関しては１Ｘ１０６細胞をプレートして２４時間培養し、そして５％ ＦＣＳ／リン酸−不含ＲＰＭＩ中で０．５ｍＣｉ／ｍｌにて無機［３２Ｐ］（アマシャム）と６時間インキュベートした。標識後、細胞を、４００μＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭフッ化ナトリウム、１０ｍＭピロリン酸ナトリウムおよび４００μＭオルトバナジン酸ナトリウムを含む冷却したリン酸バッファー塩で洗浄し、そして溶解バッファー（１％ ＮＰ４０，０．１％デオキシコレート、０．１％ ＳＤＳ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．４，１％トラジロール，１ｍＭ ＰＭＳＦ，２ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ フッ化ナトリウム、１０ｍＭ ピロリン酸ナトリウム、４００μＭ Ｎａ３ＶＯ４，１０ｍＭ ヨードアセトアミドおよび１ｍＭ ＡＴＰ）中で３０分間溶解した。プレクリアされた上清を、モノクローナル抗体７．１６．４またはヒトおよびラットのｎｅｕ蛋白質ＤＢＷ−２を認識するウサギ抗血清で免疫沈殿した（引用により編入される、Ｋｏｋａｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８８，８４，８４９８）。免疫沈殿物はレムリサンプルバッファー中でボイルし、そして８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析した（引用により編入される、Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ，１９７０，２２７，６８０）。乾燥したゲルを、予めかぶらせたフィルムに−７０℃において暴露した。ゲルのデンシトメーターによるトレーシングはＨｏｅｆｅｒ ＧＳ３００スキャニングデンシトメーター上で実施した。相対的な密度は、平行実験において関係のあるスキャンされたピークを切り出して分析用秤でそれらを秤量することにより測定した。プロトオンコジーンおよびオンコジーン性ｐ１８５ｎｅｕの取り込みを次に直接比較した。
病巣形成および腫瘍原性アッセイ
細胞（１０４）をペトリ皿にプレートして、２％を含むＤＭＥＭ中で培養した。培地を３−４日毎に変えた。培養３週間後に細胞を１０％ホルマリンで固定してヘマトキシリンで染色することにより、形態的に形質転換された病巣を観察した。無胸腺ヌードマウス中の腫瘍細胞を分析するため、各系の細胞（１０６）を０．１ｍｌのＰＢＳに懸濁してＮＣＲヌードマウスの背中の真ん中に皮内注射した。ＰＢＳのみも対照として注射した。腫瘍の成長は４−５日から１０−１２週毎に監視した。
結果
ＮＥ９１はＮＲ６細胞内でＥＧＦＲを発現するトランスフェクト細胞（引用により編入される、Ｐｒｕｓｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，１９７７，７４，３９１８）であり、内因性ＥＧＦＲを欠くマウス繊維芽細胞系である。野生型（ＷＴ）細胞性ｐ１８５（Ｎｎｅｕ）またはキナーゼ欠損Ｎｅｕ（即ちＮ７５７およびＮ６９１停止、それぞれＡＴＰ−結合ドメインにて点変異Ｋ７５７Ｍを、および細胞質性ドメイン欠損を有する）はＮＲ６およびＮＥ９１細胞の両方で発現された。その結果のトランスフェクトクローンを、それぞれＮＲ６ ＮｅｕまたはＮＥ Ｎｅｕと名付けた。
細胞形質転換におけるＥＧＦＲ機能を抑圧され且つＥＧＦＲとの形質転換相乗を廃止されたキナーゼ欠損変異体ｎｅｕ蛋白質
我々は、以前に、Ｍ１細胞系において証明したように、ＥＧＦＲと細胞性ｐ１８５の増加したレベルのの同時発現はマウス繊維芽細胞を完全に形質転換したことを示した（引用により編入される、Ｋｏｋａｉら、Ｃｅｌｌ，１９８９，５８，２８７）。本研究においては、ＥＧＦ存在または不在下でＷＴまたはキナーゼ欠損Ｎｅｕ蛋白質を発現するこれらのトランスフェクト細胞の形質転換された表現型を分析した。

ＥＧＦＲのみを発現するＮＥ９１細胞はＥＧＦ不在下で単層を形成し、ＥＧＦ存在下で病巣を形成した。観察された不完全な形質転換（即ち、ＥＧＦ−依存性様式）は以前の報告と一致する（各々引用により編入される、ＤｉＦｉｏｒｅら、Ｃｅｌｌ，１９８７，５１，１０６３；Ｄｏｂａｓｈｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９１，８８，８５８２）。しかしながら、Ｍ１細胞と類似の様式において、ＮＥ ＮｎｅｕＢ２細胞におけるＷＴ細胞性ｐ１８５とＥＧＦＲの同時発現は完全な形質転換をもたらし、即ち、病巣形成はＥＧＦ−依存性であった。いずれかの形態のキナーゼ欠損ＮｅｕとＥＧＦＲを同時発現する細胞系（ＮＥ Ｎ７５７およびＮＥ Ｎ６９１停止細胞）はＥＧＦ存在下においても病巣を形成しなかった。同様な結果はソフトアガー中での足場（ａｎｃｈｏｒａｇｅ）−非依存性コロニー成長をアッセイした時に観察された。

ヌードマウスにおける腫瘍成長はインビボにおける完全形質転換の基準として用いられた。オンコジーンｐ１８５を発現するＢ１０４−１−１細胞は陽性対照として用いて、それらの細胞により引き起こされる腫瘍は見かけ上素早かった（５日の潜伏期を伴って）。均等なレベルのＥＧＦＲ（ＮＥ９１）または細胞性ｐ１８５（ＮＲ６ Ｎｎｅｕ）を発現する細胞のみは腫瘍は成長しなかった。しかしながら、ＥＧＦＲと細胞性ｐ１８５を共に発現する細胞の注射（Ｍ１およびＮＥ ＮｎｅｕＢ２）は腫瘍を引き起こさなかった（２−３週間の潜伏期）。結果は以前の結果と一致した（引用により編入される、Ｋｏｋａｉら、Ｃｅｌｌ，１９８９，５８，２８７）。

しかしながら、キナーゼ欠損Ｎｅｕのみを発現する細胞系またはＥＧＦＲと同時発現する細胞系の注射後は、腫瘍は観察されなかった（＞１０週）。これらのデータは、正常な細胞性ｐ１８５キナーゼ活性とＥＧＦＲ機能は相乗形質転換と腫瘍形成に必要であったことを示唆した。キナーゼ欠損Ｎｅｕ蛋白質のＥＧＦＲとの同時発現はこの種の相乗を廃止したのみならず、ＥＧＦＲのＥＧＦ−依存性形質転換能力を抑圧した。よって、リガンド刺激により媒介されるＥＧＦ受容体機能をさらに以下の研究において分析した。
ＥＧＦ−誘導受容体ダウン制御はｎｅｕキナーゼ欠損変異体細胞においてほとんど有効でなかった
我々は、次に、正常な受容体のダウン制御がキナーゼ欠損Ｎｅｕとの同時発現により影響されたか否かを試験した。抗−ｎｅｕ ｍＡｂ ７．１６．４または抗−ＥＧＦＲ ｍＡｂ ４２５を用いた細胞表面染色、続くＦＩＴＣコンジュゲート抗−マウス−ＩｇＧを用いた染色前に、細胞を様々な時間ＥＧＦとインキュベートした。何れかの受容体の細胞表面発現はフローサイトメトリーを用いて分析した。ＮＥ９１細胞内のＥＧＦＲの細胞表面発現はＥＧＦ処置から１５分後に低下し、６０％を超える受容体が処置１時間後に細胞表面から消えた。Ｍ１細胞（ＷＴ ＮｅｕとＥＧＦＲを同時に発現する）内のＥＧＦＲダウン制御の効率は、ＮＥ９１細胞において観察されたのと同様であった。約２０％の細胞性ｐ１８５がＭ１細胞においてＥＧＦＲと共にダウン制御した。同様な結果はＮＥ Ｎｎｅｕ Ｂ２細胞において観察された。しかしながら、細胞性ｐ１８５を発現する細胞系のみはＥＧＦに応答しなかった。ＥＧＦＲがキナーゼ欠損変異体Ｎｅｕ蛋白質と共に発現された細胞系においては、ＥＧＦＲのダウン制御がほとんど非効率であった（最大低下は約２０−２５％）。さらに、何れかの変異体Ｎｅｕ蛋白質の表面発現はＥＧＦ処理に際してこれらの細胞中で顕著に変化しなかった。
キナーゼ欠損変異体ｎｅｕ同時発現細胞中で観察された受容体の増大した半減期
細胞表面からダウン制御された受容体が分解を受けたか否かを決定するため、受容体蛋白質のパルス−チェース標識を方法と材料に記載されるとおりに実施し、免疫沈殿したＮｅｕとＥＧＦＲ蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＥＧＦ処理はＮＥ９１細胞（ＥＧＦＲのみを発現する）においてＥＧＦＲの迅速な分解を引き起こした。同様なＥＧＦＲ分解速度はＥＧＦ処理の際にＭ１細胞において観察された。しかしながら、ＥＧＦ−誘導されたＥＧＦＲ分解は、ＥＧＦとＮｅｕキナーゼ欠損変異体の何れかの形態（ＮＥ Ｎ７５７またはＮＥ Ｎ６９２停止）を同時発現する細胞においては遅かった。

ＥＧＦ処理に応答したＷＴまたは変異体Ｎｅｕ蛋白質の分解パターンも調査した。Ｍ１細胞およびＮＥ ＮｎｅｕＢ２細胞の両方における標識ＷＴ細胞性ｐ１８５はＥＧＦ処理された時間に正比例して消失したことから、ＷＴ細胞性ｐ１８５はＥＧＦＲと共に効率よく分解されることが示唆される。ＥＧＦ処理から６時間まで、Ｎ７５７蛋白質レベルの僅かな低下のみがあり、そして切断されたＮ６９１停止蛋白質の豊富さにおける識別可能な変化はなかった。哺乳類の上皮細胞におけるヒトｃ−ｅｒｂＢ２の示唆された正常な半減期は１１−１３時間である（引用により編入される、Ｋｏｒｍｉｌｏｖａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９２，７，５１１）。我々のオートラジオグラムのデンシトメーターの分析は、ＷＴ細胞性ｐ１８５の半減期がＥＧＦ処理の３−４時間後は低下し、一方変異体Ｎｅｕレベルは試験された時間の間、顕著な変化がなかったことを確認した。
ｗｔまたは変異体ｎｅｕ蛋白質発現細胞中のＥＧＦ結合親和性
我々の実験は、キナーゼ欠損Ｎｅｕ変異体がＥＧＦ機能、例えばキナーゼ活性（引用により編入される、Ｑｉａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９４，９１，１５００）、ＥＧＦ−媒介形質転換、受容体ダウン制御および分解を抑圧することを証明した。これらの効果は、一部、変化させたＥＧＦ結合親和性により妨害可能であったため、我々は、スキャッチャード分析により［１２５Ｉ］−ＥＧＦ結合パラメーターを分析した。

これらの細胞系に対する［１２５Ｉ］−ＥＧＦ結合の平均解離定数（Ｋｄ）は、３つの別個の実験から測定した。ＮＥ９１細胞中のＥＧＦＲは、高い（７．５ｘ１０−１１Ｍ）および低い（４．４ｘ１０−９Ｍ）レベルの結合親和性を表す２つの結合成分を表し、そして高い親和性の受容体の画分は全受容体の５．４％であった。ＥＧＦＲとＷＴ ＮｅｕのＮＥ ＮｎｅｕＢ２細胞における同時発現は、高い親和性および低い親和性サブクラスに関して、それぞれＥＧＦ結合親和性における僅かな増加をもたらし（３．２ｘ１０−１１Ｍ）および（２．０ｘ１０−９Ｍ）、そして高い親和性受容体の画分は５．７％であった。Ｍ１細胞に関する増加した親和性は再現可能であり、そしてＫｄ値（１．３ｘ１０−１１Ｍおよび１．８ｘ１０−９Ｍ）は我々の以前の報告（各々引用により編入される、Ｋｏｋａｉら、Ｃｅｌｌ，１９８９，５８，２８７；およびＷａｄａら、Ｃｅｌｌ，１９９０，６１，１３３９）と一致した。しかしながら、キナーゼ欠損Ｎｅｕ同時発現細胞におけるＥＧＦＲは低親和性ＥＧＦ結合を支配的に表し、ＮＥ Ｎ６９１およびＮＥ Ｎ７５７細胞においてそれぞれ４．９ｘ１０−９Ｍおよび５．２ｘ１０−９Ｍであったが、稀な高親和性サブクラスのＥＧＦＲが時々検出可能であり、即ち、ＮＥ Ｎ６９１停止細胞において７．２ｘ１０−１１Ｍ（０．５％）およびＮＥ Ｎ７５７細胞において６．６ｘ１０−１１Ｍ（≦１％）であった。これらの稀な種は、キナーゼ不活性化Ｎｅｕ蛋白質と同時発現される場合にまだ観察されるＥＧＦＲホモダイマーのセットを表すのかもしれない（引用により編入される、Ｑｉａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９４，９１，１５００）。スキャッチャード分析から明らかなことは、キナーゼ活性ＷＴ Ｎｅｕを同時発現する細胞におけるＥＧＦＲが正常なパーセンテージの高親和性ＥＧＦ受容体を表すことであり、ＮＥ６９１細胞と比較した場合にＥＧＦに関する僅かに増加した親和性を伴う。しかしながら、キナーゼ欠損Ｎｅｕ蛋白質の同時発現は、低下したヘテロダイマーキナーゼ活性に相関してＥＧＦ−結合親和性を大きく低下させた。
考察
本研究においては、ＥＧＦＲとＷＴまたは変異体Ｎｅｕ蛋白質を同時発現する、安定にトランスフェクトされた細胞を用いることにより、細胞系受容体機能と細胞表現型を分析した。ＷＴ Ｎｅｕとは異なり、キナーゼ欠損ＮｅｕはＥＧＦＲと協同することにより細胞形質転換を媒介しなかった；さらに、我々は、変異体ＮｅｕとＥＧＦＲの相互作用によりもたらされる支配的な負の受容体機能の新規な側面を示した。

ＥＧＦＲとＷＴ（引用により編入される、Ｑｉａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，８９，１３３０）または変異体Ｎｅｕ蛋白質（引用により編入される、Ｑｉａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９４，９１，１５００）の間の分子間の対合およびその結果のチロシンキナーゼ活性化を十分に特徴決定した；我々の研究は、ＥＧＦＲとｃ−ｎｅｕの生成物のヘテロダイマー化がＥＧＦ不在下でさえも検出可能であり、そしていずれかのホモダイマーを越えて好まれる。しかしながら、ＷＴ ＥＧＦＲと細胞質ドメイン欠失ＥＧＦＲのホモダイマー化および同時ダイマー化は等しく効率的でありそしてＥＧＦ−依存性であった（引用により編入される、Ｋａｓｈｌｅｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９１，１１，１４５４）。ヘテロダイマーの優位性はその結果の細胞表現型、およびＥＧＦＲ抑圧に対するキナーゼ欠損の誘導可能な支配的負作用を説明する助けとなるかもしれず、ＥＧＦＲと変異体Ｎｅｕ生成物の比が１：１の場合でさえも顕著に起こった。

チロシンキナーゼの結果的な活性化を伴う受容体の相互作用は分子間機構により起こり、そして迅速なトランスリン酸化事象にしばしば続き、ｐｐ６０ｃ−ｓｒｃ（引用により編入される、Ｃｏｏｐｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８８，８５，４２３２）、インスリン受容体（引用により編入される、Ｂｏｎｉ−Ｓｃｈｎｅｔｚｌｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８８，２６３，６８２２）およびＥＧＦＲ（引用により編入される、Ｈｏｎｅｇｇｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，１０，４０３５）において観察されたとおりの。トランスリン酸化もヘテロ−受容体種、ＥＧＦＲおよびＮｅｕ／ｃ−ｅｒｂＢ２の間に起こる（各々引用により編入される、Ｃｏｎｎｅｌｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０，８７，６０５４；Ｓｐｉｖａｋ−Ｋｒｏｉｚｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，２６７，８０５６；およびＱｉａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９４，９１，１５００）。ＥＧＦＲとＮｅｕ受容体の選択的なヘテロダイマー化（引用により編入される、Ｑｉａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９４，９１，１５００）は、ＥＧＦＲによるＮ７５７のトランスリン酸化を促進するかもしれない。現在、ＥＧＦＲおよびＮｅｕキナーゼの特異的な基質は十分に特徴決定されていない。インビトロの結合アッセイが示したことは、リン酸化されたキナーゼ欠損Ｎ７５７が、ＥＧＦ−処理に際して、まだ組換えＳＨ２−含有蛋白質と対合できたことであった。しかしながら、Ｍ１およびＮＥ ＮｎｅｕＢ２細胞中の活性ヘテロダイマーとは異なり、ＮＥ Ｎ７５７細胞の変異体ヘテロダイマーのＮｅｕキナーゼ活性は特定の細胞基質のリン酸化を阻害するかもしれない。さらに、ＥＧＦＲによるＮ７５７の優勢なトランスリン酸化並びに非機能性Ｎ７５７における細胞基質の占有はＥＧＦＲ機能における定性的および定量的低下を導く細胞シグナリング分子に関してＥＧＦＲと競合するかもしれない。よって、該欠損ヘテロダイマーは、競合活性ヘテロダイマーおよびＥＧＦＲホモダイマーのように効果的にシグナルを伝達しないかもしれず、即ち、Ｍ１およびＮＥ ＮｎｅｕＢ２細胞において観察される細胞形質転換をもちびく相乗性シグナリングを減じてＥＧＦＲ機能を阻害する。細胞質ドメイン欠失Ｎ６９１停止とＥＧＦＲのヘテロダイマー化の研究は、細胞質ドメイン間の蛋白質−蛋白質相互作用の失敗のため、該ヘテロダイマーの形成が不活性であったことを示し、よって、Ｎｅｕ／ｃ−ｅｒｂＢ２はＥＧＦＲの単純な基質ではないがＥＧＦＲに関しても同じくトランスアクチベーターであることを示す（引用により編入される、Ｑｉａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９４，９１，１５００）。即ち、低下した量の正常ＥＧＦＲホモダイマー形態および非生産性ヘテロダイマーの優勢は、正常なＥＧＦＲ機能の抑圧およびその結果の支配的な負の表現型をもたらした。上記観察は、ＷＴ ＥＧＦＲと細胞質性ドメイン欠失ＥＧＦＲの間に形成されるダイマーの作用に匹敵する（引用により編入される、Ｋａｓｈｌｅｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９１，１１，１４５４）。

キナーゼ活性受容体はリガンド結合に際しての分解のためのリソソームを標的とすることが報告された（引用により編入される、Ｃｈｅｎら、Ｃｅｌｌ，１９８９，５９，３３；Ｆｅｌｄｅｒら、Ｃｅｌｌ，１９９０，６１，６２３）。キナーゼ欠失インスリン受容体を用いた以前の研究（各々引用により編入される、ＭｃＣｌａｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８７，２６２，１４６６３；およびＲｕｓｓｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８７，２６２，１１８３３）は、活性キナーゼドメインが正常なリソソーム−誘導受容体伝達（ｒｏｕｔｉｎｇ）に必須であることを示唆する。我々は、如何にして受容体キナーゼ複合体の活性が受容体エンドサイトーシスおよび破壊と相関するのかを研究するためにＥＧＦ−処理した細胞系を使用した。我々の仕事は、ＥＧＦＲがＷＴ Ｎｅｕ同時発現細胞（Ｍ１またはＮＥ ＮｎｅｕＢ２）であり、ＥＧＦ刺激に際して迅速なダウン制御および分解を受けることを証明する。このプロセスは、ＥＧＦＲのみを発現するＮＥ９１細胞に比して変異体細胞において顕著に遅延した。キナーゼ欠損変異体Ｎｅｕ蛋白質ではなく、ＷＴ細胞性ｐ１８５のみが、ＥＧＦＲと同時ダウン制御され且つ同時に分解された。同様に、ヒト哺乳類細胞系ＨＣ１１細胞のＥＧＦ−処理はｃ−ｅｒｂＢ２蛋白質表面発現および蛋白質代謝回転に影響した：リソソームｃ−ｅｒｂＢ２蛋白質において３−４倍の増加、そしてｃ−ｅｒｂＢ２蛋白質の半減期は１１時間（未処理）から３．５時間（ＥＧＦ−処理）に低下した（引用により編入される、Ｋｏｒｎｉｌｏｖａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９２，７，５１１）。我々の観察と共に、これらの結果は、ＷＴ Ｎｅｕ／ｃ−ｅｒｂＢ２（しかしキナーゼ欠失Ｎｅｕではない）がＥＧＦおよび活性受容体チロシンキナーゼの複合体と対合して正常な受容体伝達を受けることを示唆した。

結論として、我々の結果は、ＥＧＦＲとキナーゼ欠失Ｎｅｕ蛋白質の欠損または不活性ヘテロダイマーが相乗的ヘテロ受容体シグナリングを減じ、正常なＥＧＦＲの機能を抑圧し、そして生存細胞において形質転換された表現型を廃するとの実験的証拠を提供する。我々の実験モデルは、ヘテロダイマーキナーゼと、臨床上の含蓄を有するかもしれない細胞の悪性度との、病原性の関係を示唆する。最近の報告は、ｐ１８５ｃ−ｅｒｂＢ２受容体を過剰に発現するヒトカルシノーマ細胞の別のＲＮＡプロセシングにより生成されるｃ−ｅｒｂＢ２蛋白質の切断されたエクトドメインが、抗−ｃ−ｅｒｂＢ２モノクローナル抗体の成長阻害作用に対する耐性をもたらす（引用により編入される、Ｓｃｏｔｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９３，１３，２２４７）。ホモ−またはヘテロ−受容体相互作用により、変異体Ｎｅｕ蛋白質が正常ＥＧＦＲまたはｃ−ｅｒｂＢ２受容体の何れかの機能を抑圧するかもしれないとおり、キナーゼ欠損ＮｅｕのｃＤＮＡの、ＥＧＦＲおよびＮｅｕ／ｃ−ｅｒｂＢ２を過剰発現する腫瘍細胞系への直接の遺伝子移入が、悪性腫瘍性表現型を軽減するかもしれないと仮定される。
実施例４：Ｐ１８５エクトドメインによる天然ＥＧＦＲ癌蛋白質の阻害：受容体集合へのサブドメインの貢献の暗示
序論
ｅｒｂＢファミリーの受容体活性化は、ホモダイマーおよびヘテロダイマーの集合物形成の両方を含む。多くの場合、ｅｒｂＢファミリーメンバーの間のヘテロダイマーの形成は、リガンド結合親和性を増大させて、細胞表現型に影響するより活性なシグナリング複合体の形成をもたらす。ｐ１８５ｎｅｕおよびＥＧＦ受容体変異体を用いて、これらのｅｒｂＢ受容体のエクトドメインのみが、熱力学上好ましいヘテロダイマーの物理的対合を許容するのに十分であることが示され、そしてその結果のダイマー中の細胞質性接触がリガンド親和性、シグナリングおよび表現型に影響することを示した。ｐ１８５ｎｅｕとＥＧＦＲの生化学分析は、細胞外ドメインのみの間のダイマー形成の結果がエクトドメインダイマー形成からもたらされるシグナリングと異なることを示唆する。ｐ１８５ｎｅｕエクトドメイン由来の変異体は、マウス繊維芽細胞および初期に形質転換されたＥＧＦＲ過剰発現ヒト細胞の両者におけるＥＧＦ受容体シグナリングの特異的なトランス−阻害からのシグナリング結果とは異なる。Ｎｅｕ分化因子（Ｎｅｕ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ）のための活性受容体複合体（ＮＤＦ／ヘレグリン）は、ｅｒｂＢ２−ｅｒｂＢ３またはｅｒｂＢ２−ｅｒｂＢ４ヘテロダイマーの何れかであるらしく、ｐ１８５ｎｅｕ／ｅｒｂＢ２が、一部には、他のｅｒｂＢファミリー受容体キナーゼのトランスレギュレーターとして機能することを示唆する。

ｅｒｂＢファミリー内の細胞外ドメインにより媒介されるトランス制御相互作用に必須の受容体サブドメインをさらに試験するため、形質転換細胞におけるＥＧＦとｐ１８５／ｃ−ｅｒｂＢ２の間の相互作用を分析した。ヒト膠新生物および他のヒト上皮悪性腫瘍において共通に観察されるＥＧＦ癌蛋白質（ΔＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩ）は、１４０−１５５ｋＤａの切断され、構成的にリン酸化されたΔＥＧＦＲの発現をもたらす分子の細胞外領域をコードする遺伝子内のエクソン２から７（アミノ酸６から２７３）を含むインフレームの切断によりもたらされる。ΔＥＧＦ受容体はダイマー形態で自発的に存在し、そしてリガンド非依存性様式において齧歯類の繊維芽細胞の構成的シグナリングおよびオンコジーン性形質転換を媒介することが観察され、一方、過剰発現されたｐ１７０ホロ−ＥＧＦＲはＥＧＦ存在下においてほんの弱く形質転換する。ΔＥＧＦＲ癌蛋白質はヒト膠芽腫細胞およびマウス繊維芽細胞においてインビボにて劇的な成長上の利点を付与する。

最近の報告は、ΔＥＧＦ受容体が細胞表面上に存在し、そしてリガンド刺激されたホロ−ＥＧＦＲよりもゆっくりと内在化し、ΔＥＧＦＲ癌蛋白質の形質転換効率を増加させるかもしれないことを示す。ＲＴＫポリペプチドの細胞外ドメインを膜貫通領域および細胞質領域から機能上分離する他の変異は、自発性ダイマー化および形質転換能力の獲得を導くことも観察され、該細胞外ドメインの一部が、リガンド結合および質量作用によりおそらくは除去されるダイマー形成に構造上の束縛を課することを示唆する。ΔＥＧＦＲまたは鳥類のｖ−ｅｒｂＢオンコジーンにおいて観察される細胞外欠失は、おそらく、リガンド結合によりもたらされるコンフォメーション変化を模倣することによりダイマー形成を促進する。ＥＧＦＲの可溶性細胞外ドメインはオリゴマー化することが観察され、そしてエクトドメイン内の構造上の変化が細胞外ドメイン、細胞質ドメインまたは両方の自発的オリゴマー化を誘導できる。

ΔＥＧＦＲ内の細胞外欠失はＥＧＦＲのサブドメインＩおよびＩＩを含むアミノ酸の大多数を除去し、該受容体の細胞外ドメイン内の２つのシステイン富裕配列の第１の大きな部分（よりアミノ末端）を含む。サブドメインＩＩＩは、ＥＧＦＲにリガンド結合特性を授けることが報告され、ΔＥＧＦＲ癌蛋白質において保存されているが、ΔＥＧＦＲはＮＩＨ３Ｔ３細胞内のリガンドに結合しないらしい。ホロ−ＥＧＦＲとΔＥＧＦＲの同時発現はヒト膠芽腫および他の腫瘍サンプルにおいて観察されたことから、ＥＧＦＲ／ΔＥＧＦＲ同時発現細胞はヒトの疾患の密接な相関であるかもしれないことを示唆する。

ｐ１８５ｎｅｕオンコジーンのエクトドメイン由来のカルボキシル末端欠失変異体（６９１停止ｎｅｕ）は、完全なキナーゼドメインおよびカルボキシル末端自己リン酸化部位を欠くが、ｐ１８５ｎｅｕエクトドメインが切断されてエクトドメインを欠損させたΔＥＧＦＲと対合してΔＥＧＦＲ媒介シグナリングを変調することができるか否かを試験するため、完全長のＥＧＦＲおよびΔＥＧＦＲを同時発現するヒト膠芽腫において発現させた。
結果
ヒト膠芽腫細胞内のＥＧＦＲおよびｐ１８５ｎｅｕ変異形態の発現
Ｕ８７ＭＧヒト膠芽腫細胞は、上昇レベルの（１０５受容体／細胞）内因性野生型ＥＧＦＲを発現する。親のＵ８７ＭＧヒト膠芽腫細胞の３つのクローン誘導体をこれらの研究に利用した：Ｕ８７／Ｔ６９１−１細胞はＵ８７ＭＧバックグラウンドにおいてＴ６９１停止ｎｅｕを含む；Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞は親Ｕ８７ＭＧ細胞において上昇レベルの（１０６受容体／細胞）ヒトＥＧＦＲ蛋白質を発現する；そして二重にトランスフェクトされたＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ／Ｔ６９１ｓ細胞は内因性ＥＧＦＲ、ΔＥＧＦＲおよびＴ６９１停止変異体ｎｅｕ蛋白質を含む。代謝標識後のＵ８７ＭＧ由来のヒト膠芽腫細胞におけるＥＧＦＲおよび切断されたｎｅｕ蛋白質の発現レベルを比較した。ΔＥＧＦＲおよび／またはＴ６９１停止ｎｅｕ変異体受容体の発現に関して注目に値する親Ｕ８７ＭＧヒト膠芽腫細胞に由来するサブクローンを３５Ｓ−システインで１５時間標識し、そして細胞溶解物を，ＥＧＦＲとΔＥＧＦＲの両方に反応性の抗−ＥＧＦＲ ｍＡｂ ５２８またはｐ１８５ｎｅｕエクトドメインを認識する抗−ｎｅｕ ｍＡｂ７．１６．４の何れかと免疫沈殿させた。免疫複合体を溶解して、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ＥＧＦＲ、ΔＥＧＦＲ（１４０−１５５ｋＤａ）、および切断されたＴ６９１停止ｎｅｕ蛋白質（１１５ｋＤａ）を表す蛋白質シグナルが観察された。Ｕ８７ＭＧ細胞は内因性の完全長のＥＧＦＲのみを発現する；Ｕ８７／Ｔ６９１−１細胞は内因性ＥＧＦＲおよびＴ６９１停止ｎｅｕ蛋白質を発現する；Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞は内因性ＥＧＦＲおよびトランスフェクトされたΔＥＧＦＲを発現する；そしてＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ／Ｔ６９１ｓ細胞はＥＧＦＲ、ΔＥＧＦＲおよびＴ６９１停止ｎｅｕ蛋白質を発現する。全てのシグナルがオートラジオグラフィー後に観察された（２４時間暴露）。ＥＧＦＲおよびΔＥＧＦＲと反応性のｍＡｂ ５２８（オンコジーンサイエンス）の免疫沈殿は、Ｕ８７ＭＧ由来の細胞系において発現された全てのＥＧＦＲ形態を証明した。ＥＧＦＲはＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲおよびＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ／Ｔ６９１ｓ細胞のみにおいて同定された。代謝標識およびｐ１８５ｎｅｕエクトドメインと反応性のｍＡｂ７．１６．４を用いた免疫沈殿は、Ｕ８７／Ｔ６９１−１細胞内およびＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ／Ｔ６９１ｓ細胞内における１１５ｋＤａのＴ６９１致死変異体ｎｅｕ受容体の同定を可能にした。ｍＡｂ７．１６．４を用いたＵ８７／Ｔ６９１−１およびＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ／Ｔ６９１ｓサブクローンのフローサイトメトリー分析は、Ｔ６９１停止ｎｅｕ蛋白質の細胞表面局在を確証した。フローサイトメトリー分析は、Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲおよびＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ／Ｔ６９１ｓサブクローンの両者の上でのΔＥＧＦＲの細胞表面局在も確証した。Ｕ８７ＭＧ膠芽腫細胞は無視できるレベルのｅｒｂＢ−２またはｅｒｂＢ−３を含む。

Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞の免疫沈殿および免疫ブロッティングは、内因性ＥＧＦＲ（１７０ｋＤａ）およびＭｒ１４０ｋＤａおよび１５５ｋＤａの二重種として移動する切断されたΔＥＧＦＲの存在を明らかにした。Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞の溶解物を、ΔＥＧＦＲのみと反応性のｍＡｂΔ１２４またはＥＧＦＲおよびΔＥＧＦＲの両方の細胞外ドメインと反応性のｍＡｂ５２８の何れかと免疫沈殿させた。バイオラッドプロテインアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄラボラトリーズ）により測定された等量の蛋白質を免疫沈殿させ、そして免疫複合体をＳＤＳ／８％ＰＡＧＥにより還元条件下で検出した。免疫沈殿されたＥＧＦＲは、ヒトＥＧＦＲに対するポリクローナル抗体Ａｂ−４を用いた免疫沈殿により検出した。Δ１２４抗体は、１４０−１５５ｋＤａの２種のΔＥＧＦＲを沈殿させた。ｍＡｂ５２８は内因性ＥＧＦＲ（Ｍｒ＝１７０ｋＤａ）並びにΔＥＧＦＲ（１４０−１５５ｋＤａ）を沈殿させた。Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ内のΔＥＧＦＲの２種は、ｍＡｂΔ１２４によりさらに明瞭に分析した。全ての蛋白質シグナルは増強されたケミルミネッセンス（ＥＣＬ）系（アマシャム）により可視化した。ｍＡｂΔ１２４で免疫沈殿したΔＥＧＦ受容体のスキャニングデンシトメトリーは、１４０ｋＤａのΔＥＧＦＲ形態に対する１５５ｋＤａの比がＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞内で２．３であったことを明らかにした。さらに、ｍＡｂ５２８免疫複合体のスキャニングデンシトメトリー分析は、Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞内においてΔＥＧＦＲ／ＥＧＦＲの比がやく１０：１であったことを示した。このパターンは、Ｕ８７ＭＧ．ΔＥ／Ｔ６９１ｓ二重トランスフェクタントに関しても証明された。スキャニングデンシトメトリーを用いることにより、ＥＧＦＲおよびΔＥＧＦＲの細胞外ドメインと反応性のｍＡｂ５２８を用いて細胞溶解物を免疫沈殿させ、次にＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞およびＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ／Ｔ６９１ｓ細胞の両方においてＥＧＦＲと反応性のポリクローナル抗血清を用いた免疫ブロッティングにより、１０：１のΔＥＧＦＲ：ＥＧＦＲの化学量論的比率を確認した。

Ｔ６９１停止ｎｅｕエクトドメインは、膜透過性クロスリンカーＤＴＳＳＰ（３，３’−ジチオビス（スルフォサクシニミジルプロピオネート））を用いて、親Ｕ８７ＭＧ細胞の表面上および齧歯類内において完全長の野生型ＥＧＦＲとヘテロダイマーを効率的に形成することが証明された。ｐ１８５ｎｅｕエクトドメインは、免疫沈殿により決定されたところ、Ｕ８７ＭＧ由来の細胞内で内因性ＥＧＦＲのＥＧＦ−誘導されたダウン制御を阻害した。フローサイトメトリー分析は、細胞表面において生じた受容体対合が、エンドサイトーシスおよび分解よりむしろＥＧＦＲの阻害を媒介することを示した。特に、内因性ＥＧＦＲと切断されたｎｅｕ受容体間のインビボの対合およびＴ６９１停止ｎｅｕ受容体を発現する膠細胞におけるＥＧＦＲのＥＧＦ−誘導ダウン制御の阻害を示す実験を実施した。Ｕ８７ＭＧ親細胞およびＵ８７／Ｔ６９１−１細胞（Ｔ６９１停止ｎｅｕを発現するＵ８７ＭＧ細胞）を、ＤＴＳＳＰ（３，３’−ジチオビス（スルフォサクシニミジルプロピオネート））（２ｍＭ）（ピアス）による架橋後に、ＥＧＦ処理あり（１００ｎｇ／ｍｌ、３７℃、１０−１５分間）または無しで、抗−ＥＧＦＲ ｍＡｂ５２８（オンコジーンサイエンス）または抗−ｎｅｕ ｍＡｂ７．１６．４で免疫沈殿させた。免疫複合体は、還元条件下でＳＤＳ／８％ＰＡＧＥにより分析した。ＥＧＦＲ（Ｍｒ＝１７０ｋＤａ）は、ヒトＥＧＦＲに対するポリクローナル抗体Ａｂ−４（オンコジーンサイエンス）を用いた免疫沈殿により検出した。同時沈殿されたＥＧＦＲ蛋白質が、抗−ｎｅｕ ｍＡｂ７．１６．４を用いて免疫沈殿されたＵ８７／Ｔ６９１−１細胞において検出された。ＥＧＦ処理は、Ｕ８７／Ｔ６９１−１細胞におけるよりもＵ８７ＭＧ細胞においてＥＧＦＲのより効率的なダウン制御をもたらした。これらのデータは、齧歯類繊維芽細胞において実施した以前の研究と一致する。Ｔ６９１停止ｎｅｕエクトドメインは、Ｕ８７ＭＧ−由来の細胞において野生型内因性ＥＧＦＲのＥＧＦ−誘導リン酸化を阻害した。ΔＥＧＦＲはＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞において構成的にリン酸化されるが、ｐ１７０ ＥＧＦＲはＥＧＦ添加の際にのみＵ８７ＭＧ親細胞およびＵ８７ＭＧ．ＥＧＦＲにおいてリン酸化される。抗リン酸チロシン抗体を用いたブロッティングは、低分子量種の（ｐ１４０）のΔＥＧＦＲは、Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞においてｐ１５５種に比して低度にリン酸化される。Ｕ８７ＭＧ由来のヒト膠芽腫細胞におけるＥＧＦＲのリガンド依存性活性化は、以下のとおりに測定された。Ｕ８７ＭＧ細胞、Ｕ８７／Ｔ６９１−１細胞（内因性完全長ＥＧＦＲおよびＴ６９１停止変異体ｎｅｕを含む）およびＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞（内因性ＥＧＦＲおよびΔＥＧＦＲを含む）における抗−ＥＧＦＲ免疫複合体のリン酸チロシンの含有量を測定した。等しい数の細胞をプレートして１０ｃｍ皿への付着後に２４時間血清不含培地中で栄養不良にした。細胞を±ＥＧＦ（３７℃、１０−１５分間において１００ｎｇ／ｍｌ）で処理し、冷やしたＰＢＳで２回洗浄し、そしてＰＩ／ＲＩＰＡバッファーで可溶化した。バイオラッドプロテインアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄラボラトリーズ）により測定された等量の蛋白質濃度の溶解物を抗−ＥＧＦＲ ｍＡｂ５２８で免疫沈殿させて、免疫複合体を還元条件下でＳＤＳ／８％ＰＡＧＥにより分析した。リン酸化されたＥＧＦＲが親Ｕ８７ＭＧおよびＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞において検出されたが、Ｕ８７／Ｔ６９１−１細胞においては検出されなかった。内因性の完全長ＥＧＦＲ（１７０ｋＤａ）のリン酸化はＵ８７ＭＧ細胞およびＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞中においてはＥＧＦ−依存性であった。しかしながら、ΔＥＧＦＲのリン酸化はＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞においてＥＧＦ処理依存性ではなかった。ブロットをストリップ化して、ポリクローナル抗−ＥＧＦＲ抗体、Ａｂ−４で再プローブした。全てのＥＧＦＲの存在が、上記のとおりに処理した細胞種において確認された。ＥＧＦＲ蛋白質は１４０−１５５ｋＤａに二重の物（ｄｏｕｂｌｅｔ）として現れ、より顕著にリン酸化された高分子量の種を伴う。全ての蛋白質シグナルは増強されたケミルミネッセンス（ＥＣＬ）系（アマシャム）により可視化した。
Ｔ６９１停止ｎｅｕ変異体によるΔＥＧＦＲ−媒介細胞成長および形質転換の変調
Ｕ８７ＭＧ−由来のヒト膠芽腫細胞系の細胞増殖および形質転換効率をインビボおよびインビトロにおいて評価することにより、エクトドメイン由来のｐ１８５ｎｅｕ変異体蛋白質によるΔＥＧＦ受容体シグナリングの変調を測定した。完全または減じられた血清条件における細胞成長の阻害を以下の実験において研究した。各細胞系の２ｘ１０４の細胞を６ウエルプレート中にプレートして、完全成長培地内で付着することを可能にした。次の日、細胞は、完全成長培地（１０％−ＦＢＳ）内で保持するか、または２％−ＦＢＳ血清に移し替えた。細胞を４日間成長させ、次にトリプシン処理して計数した。親のＵ８７ＭＧ細胞を平均化に使用した（成長比＝全ての実験に関して１．０）。全ての誘導細胞系の成長を、比較のために、親細胞系の函数として表した。Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞は内因性ＥＧＦＲおよびΔＥＧＦＲを発現し、Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ／Ｔ６９１ｓ細胞はＥＧＦＲ、ΔＥＧＦＲおよびＴ６９１停止ｎｅｕを発現し、そしてＵ８７／Ｔ６９１−１細胞は内因性ＥＧＦＲおよびＴ６９１停止ｎｅｕ蛋白質を発現する。ΔＥＧＦＲ発現（Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞）は、親Ｕ８７ＭＧ細胞を超えて、還元血清条件下で細胞増殖を増大させ、ΔＥＧＦＲのリガンド非依存性活性化と一致する。Ｔ６９１停止変異体蛋白質の発現は、還元血清中および注目すべきは完全成長培地中においてＥＧＦＲ／ΔＥＧＦＲ過剰発現膠芽腫細胞においておよびＥＧＦＲのみを含む親Ｕ８７ＭＧ細胞で細胞成長を阻害した。注目すべきは、Ｕ８７Ｍ．ΔＥＧＦＲ／Ｔ６９１サブクローンが完全成長培地中および、ある低度は、還元された血清条件下の両方で、ＥＧＦＲを欠く親Ｕ８７ＭＧ細胞よりも低下した細胞増殖を呈した。

ΔＥＧＦＲは親Ｕ８７ＭＧ細胞を超えて足場（ａｎｃｈｏｒａｇｅ）−非依存性成長アッセイにおいてインビトロにての形質転換効率を増加させなかった。足場−非依存性成長を以下の実験において研究した。１０００−３０００の各細胞系をソフトアガー皿に植え、２１−２８日培養した。次に、コロニーを染色後に可視化して計数した。Ｕ８７ＭＧ細胞は複数の体細胞の遺伝子変化を含む初期に形質転換されたヒト細胞であり、ｐ１６の欠失および仮想蛋白質チロシンリン酸化酵素遺伝子ＰＴＥＮ内の欠失を含む。Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ／Ｔ６９１ｓ細胞のソフトアガー成長は、親のＵ８７ＭＧおよびＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞に比してそれぞれ４１．３％および４５％低下した。Ｔ６９１停止ｎｅｕ蛋白質により達成された足場−非依存性成長の阻害は、ΔＥＧＦＲを欠くＵ８７ＭＧ親細胞においてより顕著であった（３つの個別の実験において親Ｕ８７ＭＧ細胞に比して平均７５．２％の阻害）。

ΔＥＧＦ受容体はＵ８７ＭＧ細胞バックグラウンドにおいてインビボにて選択的な成長の利点を授けるが、多くの研究はｐ１８５ｎｅｕ受容体が同時発現される限定条件を除いて、ホロ−ＥＧＦＲがインビボにて非形質転換性であることを示す。Ｕ８７ＭＧ細胞におけるＴ６９１停止変異体ｎｅｕエクトドメインの発現は、プロトオンコジーン膜貫通領域を含むことによりＴ６９１停止とは異なる切断ｐ１８５ｎｅｕ（Ｎ６９１停止）の形態と比較した場合に、Ｕ８７ＭＧオンコジーン性表現型を選択的に阻害したことが示された。Ｕ８７ＭＧ−由来の細胞系の間での胸腺欠損マウス内の腫瘍成長の比較を以下のとおりに行った。各細胞系の１０６の細胞を０日目に皮内注射して、腫瘍の体積を１−２ｘ／週記録した。Ｕ８７ＭＧ細胞は、片方の側面上に注射し、そしてトランスフェクトされた細胞は動物の反対側の側面内に注射した。Ｔ６９１停止ｎｅｕ蛋白質発現は、Ｕ８７ＭＧ細胞においてΔＥＧＦＲにより媒介される選択的なインビボ成長の利点を廃した。この結果は、３つの追加のＵ８７ＭＧΔＥＧＦＲ／Ｔ６９１ｓサブクローンの分析により確認された。Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ／Ｔ６９１ｓサブクローンは、親のＵ８７ＭＧ細胞と類似の成長キネティックスを呈したが、インビボにおいてはＵ８７ＭＧ細胞よりも阻害されたようであった。全てのＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ／Ｔ６９１ｓサブクローンに関してインビボにて観察された阻害は、Ｔ６９１停止変異体ｎｅｕ発現の化学量論に直接関連する。
Ｔ６９１停止ｎｅｕ変異体はインビボにてΔＥＧＦＲとヘテロダイマーを形成する
Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲトランスフェクタントおよびＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ／Ｔ６９１ｓを二重トランスフェクトされたサブクローンの遺伝子の複雑性のため、勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において同様な分子量で移動するヘテロダイマー複合体のため、チオ分割可能な膜不透過性クロスリンカーＤＴＳＳＰを用いることにより、仮想表面局在ヘテロマー複合体の個々の成分を試験した。ｍＡｂ５２８を利用することにより、変異ｎｅｕ蛋白質とヘテロマーを形成するかもしれない全てのＥＧＦＲ（野生型およびΔＥＧＦＲ）を免疫沈殿した。抗−ｎｅｕ免疫複合体からの共沈殿ΔＥＧＦＲモノマーはＤＴＳＳＰを使用したインビボクロスリンク実験により検出された。Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ／Ｔ６９１ｓ細胞のクロスリンクと還元条件下のＳＤＳ／６−８％ＰＡＧＥによる免疫複合体の分離は、Ｔ６９１停止ｎｅｕと、ｐ１４０ΔＥＧＦＲ、ｐ１５５ΔＥＧＦＲ、およびｐ１７０ＥＧＦＲ形態の間のヘテロダイマー形成の証拠を明らかにした。ほとんどのＴ６９１停止ｎｅｕ変異体受容体あこれらの方法を用いてｐ１４０ΔＥＧＦＲ形態と対合したが、ヘテロダイマー化されたｐ１５５ΔＥＧＦＲおよびｐ１７０ＥＧＦＲ蛋白質を同定する弱いバンドが繰り返し観察された。Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲとＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ／ｔ６９１ｓ二重トランスフェクタントの細胞表面上のΔＥＧＦＲ蛋白質のフローサイトメトリーによる同定は、膜不透過性クロスリンカーにより作成された観察を支持する。インビボクロスリンクによる抗−ｎｅｕ免疫複合体からの共沈殿されたΔＥＧＦＲの検出のための実験は以下のとおりに実施した。Ｕ８７ＭＧ親細胞（レーン１、２）、Ｕ８７ＭＧ．ＥＧＦＲ、およびＵ８７ＭＧ．ＥＧＦＲ／Ｔ６９１ｓ細胞の１ｍｇ溶解物を、ＤＴＳＳＰ（３，３’−ジチオビス（スルフォサクシニミジルプロピオネート））（２ｍＭ）（ピアス）でクロスリンクし、次にＥＧＦ処理（３７℃１５分間）した後、抗−ｍＡｂ５２８または抗−ｎｅｕ ｍＡｂ７．１６．４で免疫沈殿させた。免疫複合体を還元条件下でＳＤＳ／８％ＰＡＧＥにより分析して、ナイロン膜をヒトＥＧＦＲに対するポリクローナルＡｂであるＡｂ−４でブロットした。ＥＧＦＲは、Ｕ８７ＭＧ細胞（内因性ＥＧＦＲのみ、Ｍｒ＝１７０ｋＤａ）；Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞（内因性ＥＧＦＲおよびΔＥＧＦＲ、Ｍｒ１４０−１５５ｋＤａ）；およびＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ／Ｔ６９１ｓ細胞（内因性ＥＧＦＲおよびΔＥＧＦＲ，Ｍｒ １４０−１５５ｋＤａ）において同定された。共沈殿したＥＧＦＲ蛋白質は、抗−ｎｅｕ ｍＡｂ７．１６．４で免疫沈殿したＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ／Ｔ６９１ｓ細胞において検出された。Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ／Ｔ６９１ｓにおいては、Ｔ６９１停止ｎｅｕが、低分子量形態のΔＥＧＦＲ（１４０ｋＤａ，もっとも強いシグナル）、低移動度形態のΔＥＧＦＲ（ｐ１５５）および内因性ホロ−ＥＧＦＲ（ｐ１７０）と共沈殿したことがわかった。ＥＧＦは免疫複合体モノマーの良好な可視化をもたらしたが、共沈殿したＥＧＦＲはＥＧＦ処理無しにＵ８７ＭＧ−誘導細胞系からの抗−ｎｅｕ免疫複合体を同定できた。

Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ／Ｔ６９１ｓ細胞における免疫沈殿ＥＧＦＲのリン酸含有量を上記ブロットを使用して測定した。ブロットをストリップにして、抗リン酸チロシン抗体ｍＡｂ ＰＹ−２０（サンタクルズバイオテクノロジー、サンタクルズ、ＣＡ）を用いて再プローブした。抗−ｎｅｕ免疫複合体中に検出されたＥＧＦＲ蛋白質は、Ｕ８７ＭＧ親細胞、およびＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲおよびＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ／ｔ６９１ｓ細胞における抗−ＥＧＦＲ免疫複合体に比較した場合、Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ／Ｔ６９１ｓ細胞におけるＥＧＦ処理後のリン酸チロシン含有量は無視できた。Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲおよびＵ８７ＭＧ．ＥＧＦＲ／Ｔ６９１ｓ細胞における抗−免疫複合体のリン酸チロシンの含有量はこれらの蛋白質溶解物濃度において感知しうるほどは異ならなかった。抗リン酸チロシン抗体を用いたブロッティングは、Ｔ６９１停止ｎｅｕに関連した両ΔＥＧＦＲ種が低度にリン酸化されることを確証した。Ｔ６９１停止ｎｅｕ受容体に対して免疫複合されたＥＧＦＲモノマーに関する無視できるリン酸チロシンの含有量は全ての実験において一貫して証明された。ＥＧＦはｐ１７０ＥＧＦとｎｅｕエクトドメインの間のヘテロダイマー形成の効率を増大させることが観察されたが、この対合はリガンド非依存性である。ＥＧＦはＥＧＦＲ−ｐ１８５ｎｅｕエクトドメイン免疫複合体の形成を最小に増大させたことから、ＥＧＦはＥＧＦＲホモダイマー形成がなければヘテロ形成を安定化させるかもしれないことが示唆される。
Ｔ６９１停止ｎｅｕ同時発現によるインビボのＥＧＦＲモノマーのリン酸チロシン含有量の低下
Ｔ６９１停止ｎｅｕ受容体に免疫複合したΔＥＧＦＲモノマーのリン酸チロシン含有量は全ての実験において無視できた。結果は、低分子量形態のΔＥＧＦＲ（１４０ｋＤａ）がＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞およびＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ／Ｔ６９１ｓ二重トランスフェクタントの両者においてｐ１５５ΔＥＧＦＲに比較して相対的に低度にリン酸化されたことも明らかにした。

Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞およびＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ／Ｔ６９１ｓの間の０１Ｅモノマーのリン酸チロシン含有量の差は、全てのＥＧＦＲ形態に反応するｍＡｂ５２８を用いた、より大きな細胞溶解物の免疫沈殿において、インビボクロスリンク実験に関して観察されなかった。よって、Ｔ６９１停止ｎｅｕ−発現細胞においてΔＥＧＦＲのインビボのリン酸チロシン含有量を特定して試験するために、ΔＥＧＦＲのみと反応性の抗体を用いることにより、ヘテロダイマー複合体を検出するのに必要なものから減じられた蛋白質濃度を含む細胞溶解物よりΔＥＧＦＲを沈殿させた。Ｔ６９１停止変異体ｎｅｕ同時発現を用いるかまたは用いずに、Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞におけるΔＥＧＦＲのインビボのリン酸チロシン含有量を以下のとおりに試験した。Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞およびＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ／Ｔ６９１ｓの溶解物（２００μｇ）を、ΔＥＧＦＲのみと反応性のｍＡｂ Δ１２４と免疫沈殿させ、そして抗−リン酸チロシンｍＡｂ ＰＹ−２０または抗−ＥＧＦＲポリクローナル抗体Ａｂ−４の何れかとブロットさせた。ΔＥＧＦＲのみと反応性のｍＡｂ Δ１２４との免疫沈殿後のＰＹ−２０とのブロッティングは、Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞およびＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ／Ｔ６９１ｓ 中のいくらかのリン酸化蛋白質を明らかにした。ゆっくりと移動する形態のΔＥＧＦＲ（１５５ｋＤａ）は検出されたが、早く移動する形態のΔＥＧＦＲ（１４０ｋＤａ）はＰＹ−２０により検出されなかったことから、ｐ１５５ｋＤａより相対的に低いリン酸チロシン含有量が示唆される。膜をストリップにして全てのＥＧＦＲと反応性のＡｂ−４を用いて再プローブした後、両形態のΔＥＧＦＲをＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞およびＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ／Ｔ６９１ｓ 二重トランスフェクタントの両者において可視化した。これらの細胞系において免疫沈殿させたｐ１５５ΔＥＧＦＲモノマーのリン酸含有量のスキャニングデンシトメーターの分析は、完全成長条件下では、Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞に比較した場合に、Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ／Ｔ６９１ｓ細胞における３３．７％の低下を明らかにした。ΔＥＧＦＲリン酸チロシン含有量における観察された構成的差異は、よって、血清含有因子により打ち勝つことができなかった。Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞におけるＰＴｙｒ／ΔＥＧＦＲの比は１．５７であった；Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ／Ｔ６９１ｓ細胞におけるこの比はスキャニングデンシトメーターより測定されたところによると１．０４であることがわかった。この差異は２つの追加の実験において観察された。

Ｔ６９１停止ｎｅｕ蛋白質に対して免疫複合したΔＥＧＦＲモノマーのみではなく、全部の免疫沈殿したΔＥＧＦＲモノマーの生存細胞におけるリン酸チロシン含有量を分析した。Ｔ６９１停止ｎｅｕ変異体受容体に免疫複合するΔＥＧＦＲは無視できるリン酸チロシン含有量を有するとの発見に加えて、これらのデータは、Ｔ６９１停止ｎｅｕ表面発現のみがトランスにおいてΔＥＧＦＲモノマーリン酸チロシン含有量を低下させるのに十分であることを示す。Ｔ６９１停止ｎｅｕ−含有細胞において、免疫沈殿させたΔＥＧＦＲモノマーのリン酸チロシンにおける観察された３３．７％の低下は活性化されたΔＥＧＦ受容体複合体のシグナリングを減じるかもしれないが、このシグナリング複合体は高いオーダーのマルチマーであり、且つΔＥＧＦＲはＥＧＦ−刺激された野生型ＥＧＦＲよりも低い化学量論敵リン酸チロシン含有量を有することが報告されているからである。ΔＥＧＦＲ受容体キナーゼの基質結合および／または触媒活性は、モノマーΔＥＧＦＲリン酸チロシン含有量の低下により変化し得た。リガンド−刺激された野生型ＥＧＦＲに対する低レベルのΔＥＧＦＲの構成的リン酸チロシン含有量は、ΔＥＧＦＲの末端の自己リン部位における個々の点変異のインビボ成長の挙動に対する無能力化作用を説明するかもしれない。０１ＥダイマーとＴ６９１停止ｎｅｕダイマーの間の対合により形成されたヘテロオリゴマーはΔＥＧＦＲリン酸チロシン含有量の低下およびＴ６９１停止ｎｅｕ発現および表面局在化によりもたらされる表現型阻害の一つの機構かもしれない。
Ｔ６９１停止ｎｅｕ発現によるΔＥＧＦＲのインビボキナーゼ活性の低下
モノマーΔＥＧＦＲリン酸チロシン含有量の低下がＴ６９１停止ｎｅｕ変異体受容体を発現する細胞において観察されたから、ＥＧＦＲ受容体キナーゼの触媒活性がＴ６９１停止ｎｅｕ蛋白質発現により変化し得るのか否かを調査した。クロスリンクしたＴ６９１停止ｎｅｕ−対合ヘテロダイマーにおけるΔＥＧＦＲの存在を確認した条件と同一の条件を用いて、ｔ６９１停止ｎｅｕ発現によるＥＧＦＲインビトロキナーゼ活性の低下を研究する実験を実施した。２００μｇの溶解物を、膜透過性クロスリンカーＤＴＳＳＰ（２ｍＭ）の前処理をするかしないかして、Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲおよびＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ／Ｔ６９１ｓ細胞から得た。これらの細胞からの抗−ＥＧＦＲ（ｍＡｂ Δ１２４）免疫複合体を室温において３０分間、０．２ｍＣｉ［３２Ｐ］−γ−ＡＴＰ含有キナーゼ反応バッファー５０μｌに懸濁した。蛋白質サンプルは１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離してオートラジオグラフィーにより分析した。抗−ＥＧＦＲ免疫複合体は膜透過性クロスリンカー（ＤＴＳＳＰ）で前処理したＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞において増大したインビトロキナーゼ活性を有することが示されたが、Ｔ６９１停止ｎｅｕ変異体受容体を発現する二重トランスフェクト細胞においては有さなかった。Ｔ６９１停止ｎｅｕ発現はΔＥＧＦＲのゆっくりと移動する形態（１５５ｋＤａ）のトランスリン酸化の著しい阻害をもたらし、ＤＴＳＳＰを用いて確認されたヘテロダイマー形成によった。これらの結果は３つの個別の場合において確認された。１５５ｋＤａのΔＥＧＦＲはＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲおよびＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ／Ｔ６９１ｓ細胞の両者において極めて豊富であるから、ΔＥＧＦ受容体キナーゼの触媒活性のＴ６９１停止ｎｅｕ−媒介の低下は、二重にトランスフェクトされたヒト膠芽腫細胞において観察された表現型阻害を説明するかもしれない。これらのインビトロ実験において、ｐ１４０ΔＥＧＦ形態のリン酸化において顕著な違いは観察されなかった；しかしながら、この種はインビトロにおいてリン酸化されなかったため、画分はインビボにおいてリン酸化されないかもしれない。ΔＥＧＦ受容体触媒活性の阻害は受容体トランス−リン酸化に関して一貫して観察された。インビトロキナーゼ実験において用いられた低蛋白質濃度において、全ての抗−ＥＧＦＲ免疫複合体内の内因性ヒストンＩＩＩ基質の最小のリン酸化が存在した。

ヒト膠芽腫細胞におけるＴ６９１停止ｎｅｕ変異体受容体により媒介されるΔＥＧＦＲシグナリングの表現型阻害は、即ち、（１）ｐ１４０ΔＥＧＦＲとの増大したヘテロダイマー形成は観察されたが、Ｔ６９１停止ｎｅｕ蛋白質と両形態のΔＥＧＦＲの間のヘテロダイマー形成；（２）Ｔ６９１停止ｎｅｕ発現による１５５ΔＥＧＦＲモノマーリン酸チロシンの含有量のトランス阻害；および（３）Ｔ６９１停止ｎｅｕ発現とヘテロダイマー形成の結果としてのｐ１５５ΔＥＧＦＲキナーゼのトランスリン酸化の阻害によりもたらされるらしい。
考察
構成的な活性ΔＥＧＦ受容体が内因性ＥＧＦＲと同時発現されるＵ８７ＭＧ細胞は、ヒト膠芽腫の特定のアグレッシブなサブセットの近接の接近を表し、ｐ１６の欠失、染色体１０ｑ上の対立遺伝子損失およびＥＧＦＲ活性化含有量生じるがｐ５３は変異していないそれらの腫瘍である。内因性ＥＧＦＲを発現するＵ８７ＭＧ−由来のヒト膠芽腫細胞、上昇した量のΔＥＧＦＲ癌蛋白質、およびＴ６９１停止キナーゼ−欠失ｎｅｕ変異体受容体（Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ．／Ｔ６９１ｓ二重トランスフェクトされたサブクローン）は、親Ｕ８７ＭＧ細胞よりも全てのインビトロおよびインビボアッセイにおいて阻害された。これは、Ｕ８７ＭＧバックグラウンド（Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞）、特にインビボにおいてΔＥＧＦＲ癌蛋白質のみの発現と共に観察された表現型における顕著な低下を表した。野生型ＥＧＦＲの過剰発現のみがインビボにおいて非オンコジーン性であり、ΔＥＧＦＲ−ｎｅｕエクトドメインヘテロダイマーの観察された形成であり、そしてこれらの細胞中のΔＥＧＦＲ：ＥＧＦＲ蛋白質比である場合、Ｔ６９１停止ｎｅｕにより授けられてＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ／Ｔ６９１ｓ細胞により呈された、観察された成長阻害は、内因性ｐ１７０ ＥＧＦＲよりもΔＥＧＦ受容体を通してシグナリングを無能力化することにより媒介されたらしい。

Ｔ６９１停止ｎｅｕ変異体受容体がΔＥＧＦＲ：ＥＧＦＲヘテロダイマー複合体を無能力化することは可能であるが、ΔＥＧＦＲ：ＥＧＦＲの化学量論比はＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞およびＵ８７ＭＧ．ＥＧＦＲ／Ｔ６９１ｓ細胞中において約１０：１であった。内因性野生型ＥＧＦＲとは異なり、膠細胞中でΔＥＧＦ受容体ダイマー形成および自己リン酸化はリガンドとは独立して起こり、そしてΔＥＧＦＲ−発現ＮＩＨ３Ｔ３細胞はリガンド非依存性成長および形質転換特性を呈することから、オンコジーンシグナリングは構成的リン酸化ΔＥＧＦＲダイマーからもたらされることが示唆される。他は、Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞においてＥＧＦＲ−ΔＥＧＦＲヘテロダイマーを同定していない。さらに、Ｕ８７ＭＧ細胞中で発現されたΔＥＧＦＲのキナーゼ欠損変異体のチロシンのリン酸化はリガンド処理により野生型ＥＧＦＲを活性化することにより回復できることから、ＥＧＦＲとΔＥＧＦＲの間の実質上のトランスリン酸化の欠如が示唆される。ＥＧＦＲおよび他のｅｒｂＢ受容体とヘテロダイマー形成するｐ１８５ｎｅｕ／ｅｒｂＢ２蛋白質の熱力学上の選択性が与えられれば、ΔＥＧＦＲは、ホロ−ＥＧＦＲとよりも容易にｐ１８５ｎｅｕエクトドメイン由来の蛋白質とダイマー形成するかもしれない。

Ｔ６９停止はＵ８７ＭＧ細胞においてｐ１７０ＥＧＦＲのリン酸化を阻害し、そしてＴ６９１停止ｎｅｕと免疫複合するＥＧＦＲおよびΔＥＧＦＲモノマーは無視できるリン酸チロシン含有量を有する。Ｔ６９１停止とΔＥＧＦＲの間の対合の証明がｐ１７０ＥＧＦＲを超える選択的な対合を必ずしも示さないのは、ΔＥＧＦＲとＥＧＦＲがこれらの細胞において比較できるレベルで発現しないからである。Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲおよびＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ／Ｔ６９１ｓを発現するクローン内の全てのＥＧＦＲのフローサイトメトリー分析は、ｐ１８５ｎｅｕエクトドメインの発現が全ＥＧＦＲ、野生型ＥＧＦＲ、またはΔＥＧＦＲ細胞表面集団を、内因性ＥＧＦＲのみ含有のＵ８７ＭＧ細胞またはＥＧＦＲおよびΔＥＧＦＲ含有のＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲトランスフェクタントの何れかにおいて変化させなかったことを示した。これは、ΔＥＧＦ受容体内在化およびダウン制御を誘導することよりもむしろ、細胞表面上に局在する欠損ヘテロマーまたはオリゴマーの受容体の形成を通して、ｐ１８５ｎｅｕエクトドメインがＥＧＦシグナリングを無能力化するとの観察と一致する。

ＥＧＦ受容体上のチロシンキナーゼの自己リン酸化はシグナリング分子のための結合部位を活性化し、そしてＥＧＦ受容体の触媒活性も制御するかもしれない。インビボのΔＥＧＦＲモノマーの構成的リン酸チロシン含有量およびインビボのΔＥＧＦＲのキナーゼ活性はＴ６９１停止ｎｅｕ発現の結果としてトランスにおいて低下する。ΔＥＧＦＲのみを発現するＵ８７ＭＧ細胞（Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞）に比してのΔＥＧＦＲおよびＴ６９１停止ｎｅｕ蛋白質を同時発現するＵ８７ＭＧ細胞（Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ／Ｔ６９１ｓ細胞）においてインビトロとインビボにおいて観察された表現型の阻害は、一部には、Ｔ６９１停止ｎｅｕとヘテロダイマーを形成する結果としてのシグナリング分子のためのＥＧＦＲ上の減少した結合部位による。さらに、ΔＥＧＦ受容体または他の基質のトランスリン酸化に関するキナーゼ活性も、Ｔ６９１停止ｎｅｕ変異体受容体と対合することにより誘導されたコンフォメーション変化により低下するかもしれない。上記データは、受容体トランスリン酸化に関するキナーゼ活性の減少が形質転換の低下に寄与することを支持する。内因性ヒストン基質に関するインビトロキナーゼ活性は受容体トランスリン酸化に関するよりもはるかに低いことが観察され、そしてＴ６９１停止ｎｅｕ発現により感知できるほどに変化しなかった。内因性基質に関するΔＥＧＦＲのインビトロキナーゼ活性は、カルボキシル末端の自己リン酸化部位の置換によりほんの最小に変更される；ΔＥＧＦＲ内のカルボキシル末端の点変異の結果としてのインビボリン酸チロシン含有量の低下はより信頼性高く表現型阻害と相関するらしかった。Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞中で発現されるＴ６９１停止ｎｅｕ変異体によりインビボで達成される阻害レベルは、ΔＥＧＦＲ内のＡＴＰ結合部位の点変異によるか、またはチロシン１０６８、１１４８、および１１７３の置換を有するΔＥＧＦＲ変異体により呈されるのと類似のレベルであった。

トランス優性ｐ１８５ｎｅｕ変異体を用いた研究は、ｐ１８５ｎｅｕおよびＥＧＦＲのエクトドメインが物理的な対合に十分であること、およびＥＧＦＲシグナリングがこれらのキナーゼ陰性ｐ１８５ｎｅｕ変異体により変調できることを示した。細胞質ドメイン中の受容体相互作用は、ｐ１８５ｎｅｕとＥＧＦ受容体の両方に関する生産性シグナリングを決定する。ｐ１８５ｎｅｕおよびＥＧＦＲの細胞外領域に関する結晶構造解析データの不在下で、これらの受容体間のエクトドメイン相互作用の構造上の特徴は、まだ定義されていない。ΔＥＧＦ受容体はリガンド不在下でダイマー形態で存在することが観察された。ＥＧＦの可溶性細胞外領域はクロスリンク後にＥＧＦに応答してオリゴマー化することが観察されたが、サブドメインＩＩＩのみに由来する蛋白質分解断片はオリゴマー化しなかったことから、他のサブドメインがダイマー形成に寄与することが示唆される。サブドメインＩＩＩはリガンド結合特性をＥＧＦに授けることが報告された。活性化された鳥類のｅｒｂＢオンコジーンはサブドメインＩＶ（第２システイン富裕ドメイン）の一部以外の完全細胞外領域の欠損を伴うリガンドの不在下ではホモダイマーを形成する。しかしながら、この観察されたホモダイマー形成の物理的重要性は明らかでなく、これがこれらの変異体の組織特異的形質転換特性に相関しなかったからである。

物理的対合は、ＥＧＦ受容体の細胞外領域中の２つの別個のサブドメイン（Ｉ，ＩＩ）の殆どを含む欠損に拘わらず、形質転換細胞中のｐ１８５ｎｅｕとＥＧＦ細胞外領域の間で起こることが可能である。サブドメインＩまたはＩＩの何れかを欠くｐ１８５ｎｅｕ変異体の細胞外変異体は完全長のＥＧＦとヘテロダイマーを形成する能力をまだ保持することから、これらの配列はｐ１８５ｎｅｕ／ＥＧＦヘテロダイマーの物理的対合に必須でないことを確証する。Ｔ６９１停止ｎｅｕ蛋白質によるＥＧＦ癌蛋白質の表現型阻害は、サブドメインＩＩＩおよびＩＶにより第１に統治される物理的対合がシグナリングを変調するのに十分であるとの議論を支持する。野生型ヒトＥＧＦＲおよびｐ１８５ｎｅｕの細胞外サブドメイン欠損変異体を発現する繊維芽細胞の形質転換効率の分析に基づくと、ｐ１８５ｎｅｕ中のサブドメインＩＩＩは、形質転換ｐ１８５ｎｅｕ／ＥＧＦＲヘテロダイマーシグナリング複合体の形成のためにもっとも関連性が低い細胞外ドメインらしく、サブドメインＩＶ−媒介相互作用はホモダイマーおよびヘテロダイマー受容体複合体のイニシエーションおよび／または安定化にもっとも重要であるかもしれないことが示唆される。

ｐ１８５ｎｅｕおよびＥＧＦＲのサブドメインＩＩおよびＩＶ中の２つの細胞外システイン富裕ドメインの各々は、「ＥＧＦフォールド」または「システインノット」として知られるユニークなフォールドを所有するかもしれない。該モチーフは、６つのシステイン残基の繰り返しおよび少なくとも２つの鎖内部のジスルフィド結合により特徴付けされる。同様なモチーフは他の蛋白質において観察されたが、その存在はサイトカインおよび膜貫通受容体において高度に保存されており、構造上解析された腫瘍ネクローシス因子（ＴＮＦ）受容体を含む。いくつかのチロシンキナーゼ受容体はこれらのシステイン富裕ドメインを含み得ることが示され、そしてそれらはＴＮＦ受容体のそれと類似のコンフォメーションを採用することが仮定される。腫瘍ネクローシス因子（ＴＮＦ）受容体は未複合形態の結晶構造においてダイマーとして観察された。この形態において、最後の細胞外システイン富裕ドメインは主要なダイマーコンタクトを形成する。これらの研究において、膜に近接したドメインは、おそらく、このドメインを安定状態に維持する膜貫通領域の欠如により不全になる。即ち、全体の受容体において、膜貫通配列のまさにアミノ末端の最後のシステイン富裕ドメインは、膜貫通配列により安定化されて、機能性ダイマーの形成におそらくは関与することが仮定される。ｐ１８５ｎｅｕとＥＧＦの第２システインドメイン（サブドメインＩＶ）とＴＮＦ受容体内でフォールドされたシステインノットの間の高度の配列相同性が同定された。ＴＮＦとｐ１８５ｎｅｕ受容体の膜貫通近接ドメイン内の配列の単純な比較は、６システインの少なくとも４つが保存されていることを示す。

トランス−受容体相互作用による制御は全てのｅｒｂＢファミリーメンバーに関して観察され、その多くは、ヒト上皮悪性腫瘍において変更された発現および制御を呈する。この受容体ファミリーがヘテロマー対合を形成する生理学的傾向は、ｐ１８５ｎｅｕエクトドメイン内の特定のサブドメインを模倣する構造または薬剤を用いたヒトｅｒｂＢ癌蛋白質の標的化が特定のヒト悪性腫瘍において達成可能であるかもしれないことを示唆する。あるいは、ｐ１８５ｎｅｕエクトドメインのｃＤＮＡは、ヒト新生物に対する遺伝子治療のアプローチにおいてｅｒｂＢ受容体−陽性腫瘍細胞に送達できた。ΔＥＧＦＲ癌蛋白質は多くのヒト上皮新生物において異なって発現され、そして腫瘍特異的標的を代表するかもしれないが、しかしながら、これらの受容体はリガンド結合により制御されず、構成的にリン酸化され、そして内在化が貧困である。これらの特徴は、ヒト腫瘍においてΔＥＧＦ受容体からのシグナリングを阻害する努力を制限するかもしれない。リガンド不在下のｅｒｂＢヘテロダイマー形成に関する好ましい熱力学の傾向は、上記ｐ１８５ｎｅｕエクトドメイン、新規な薬剤、またはダイマー形成に関連のあるペプチド模倣物を用いたｅｒｂＢ癌蛋白質の標的化が、モノクローナル抗体またはリガンド結合アンタゴニストを伴うリガンド誘導活性化を阻害するよりも、より効率よく成長阻害を達成するはずである。
方法と材料
ベクター構築
欠失変異体Ｔ６９１停止ｎｅｕは、膜貫通領域において単一の点変異を含むラットオンコジーンｎｅｕのｃＤＮＡ、ｐＳＶ２Ｔｎｅｕに由来した。部位特異的変異導入を使用することにより、上記エクトドメイン内のＴｈｒ−６９１位に停止コドンを導入した。キナーゼ触媒ドメインおよびカルボキシル末端自己リン酸化部位を欠く、この細胞質欠損形態のｐ１８５ｎｅｕを、次に、哺乳類発現ベクターに挿入した。ｐＨＹＧからのハイグロマイシンｒ遺伝子を含む断片を、マロニー白血病ウイルスプロモーターおよびＬＴＲ（ＭｕＬＶＬＴＲ）の制御下で、ＡＰｔａｇ−１アルカリホスファターゼ（ＡＯ）発現ベクターにサブクローン化した。該ＡＰ遺伝子を次に変異体Ｔ６９１停止ｎｅｕのｃＤＮＡで置換えた。即ち、Ｔ６９１停止がｐＭｕＬＶＬＴＲ／Ｔ６９１停止／Ｈｙｇｒ発現ベクター内で発現された。
細胞のメンテナンスおよび安定にトランスフェクトされた細胞系の開発
Ｕ８７ＭＧ親ヒト膠芽腫細胞系およびヒトΔＥＧＦ受容体を含む以前に報告されたＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲヒト膠芽腫サブクローン（Ｎｉｓｈｉｋａｗａら、１９９４）は、Ｗｅｂｓｔｅｒ Ｃａｖｅｎｅｅ博士（Ｌｕｄｗｉｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，サンディエゴ、カリフォルニア）から得た。安定な細胞トランスフェクションのためには、１０マイクログラムのｐＭｕＬＶＬＴＲ／Ｔ６９１停止／Ｈｙｇｒ構築物を、リポフェクチン試薬により（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，ガイセルスベルグ、ＭＤ）、ｐＣＭＶ−β（バクテリアのβ−ガラクトシダーゼ）（クロンテック）リポーター構築物を用いたトランスフェクションにより決定された条件下で、Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞にトランスフェクトした。最高のトランスフェクション効率は、ルミノメーターにより検出されたとおりにケミルミネッセンスにより測定した。全ての細胞を、１０％ウシ胎児血清（ハイクローン、オグデン、ＵＴ）、１００Ｕペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および２ｍＭ Ｌ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を含むダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ，バイオ−ホワイタッカー、ウオーカースビル、ＭＤ）中で培養した。培養された細胞は３７℃において９５％空気／５％ＣＯ２にて保持した。Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞に、ΔＥＧＦＲトランス遺伝子発現のメンテナンスのため、．４ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８（ジェネティシン、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を添加した。

ΔＥＧＦＲおよびＴ６９１停止ｎｅｕ蛋白質を発現するＵ８７ＭＧ由来の二重トランスフェクタントの開発のため、Ｇ４１８硫酸とハイグロマイシンＢを培地に加えた。７０ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（ベーリンガーマンハイム）および．４ｍｇ／ｍｌのＧ４１８硫酸（ジェネティシン、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を含む選択培地中で２−３週間後、Ｔ６９１停止ｎｅｕを発現する確立されたＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲクローン（Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ／Ｔ６９１ｓ細胞と名付けた）を単離し、ｎｅｕエクトドメインに対するｍＡｂ７．１６．４を用いたフローサイトメトリー分析によりスクリーンした。安定にトランスフェクトされたサブクローンのための培地は、トランス遺伝子発現のために．４ｍｇ／ｍｌのＧ４１８硫酸おとび３５−７０ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを追加した。安定にトランスフェクトされた細胞系はｍＡｂ７．１６．４によるフローサイトメトリー分析により定期的にチェックすることにより、Ｔ６９１停止ｎｅｕトランス遺伝子発現の安定なレベルを証明した。
細胞の代謝標識と続く免疫沈殿
半コンフルエントな細胞（１ｘ１０６）を一晩１０ｃｍ皿上で完全培地（１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ）中に植える。次の日、細胞をシステイン不含ＤＭＥＭ中で１時間飢餓状態にして、次に３５Ｓ−システイン（５０μＣｉ／ｍｌ）（アマシャム）で１５時間３％透析ＦＢＳ／システイン不含ＤＭＥＭ中でパルスする。ＰＩ／ＲＩＰＡバッファーを用いてＰＢＳ中で２回洗浄したあとに溶解物を回収する。免疫沈殿は氷の上で６０分間実施し、そして８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離前にプロテインＡ−セファロースに結合し、乾燥し、そしてフィルムに露出することにより、複合体を分離する。ｐ１８５ｎｅｕエクトドメインに対するモノクローナル抗体は米国特許第５，６７７，１７１号に記載される。ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲの両方の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体５２８はオンコジーンサイエンスから得た。５μｇの抗体を、１０ｃｍ皿から回収した溶解物からの免疫沈殿蛋白質のために利用した。
クロスリンク研究、免疫沈殿、およびウエスタンブロッティング
等しい数の細胞をプレートして１０ｃｍ皿中で一晩培養した。細胞は２４時間血清不含培地中で飢餓状態にして、ＥＧＦ処理して（１００ｎｇ／ｍｌ，３７℃、１０−１５分間）、次に冷したリン酸緩衝塩（ＰＢＳ）で２回洗浄した。クロスリンクのため、２ｍＭ ＤＴＳＳＰ（３，３’−ヂチオビス（スルフォサクシニミジルプロピオネート））（ピアス）を含むＰＢＳを次に加えて、細胞を２３℃において３０分間インキュベートし、プレートを時々揺り動かした。クロスリンク反応は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，０．９％ ＮａＣｌ，および０．１Ｍグリシンを含むバッファーを用いて停止した。次に、細胞を２回冷したＰＢＳで洗浄し、そしてＰＩ／ＲＩＰＡバッファーに溶解した。細胞溶解物を、抗−ｎｅｕ ｍＡｂ７．１６．４、抗−ＥＧＦＲ ｍＡｂ５２８、または抗−ΔＥＧＦＲ ｍＡｂΔ１２４の何れかを用いた免疫沈殿に供した。ｎｅｕ蛋白質またはＥＧＦＲの免疫複合体を次に溶解して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（６−８％）により分離し、そして、ポリクローナル抗−ＥＧＦＲ抗体、Ａｂ−４（オンコジーンサイエンス）または抗−リン酸チロシンｍＡｂ ＰＹ−２０（サンタクルズバイオテクノロジー、サンタクルズ、ＣＡ）の何れかとの免疫沈殿前に、ニトロセルロースフィルターに移した。
インビトロキナーゼアッセイ
細胞を１００ｍｍ培養皿にプレートして、次の日に２回氷冷ＰＢＳで洗浄し、そして１ｍｌの溶解バッファー（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，３％ Ｂｒｉｊ−３５，２ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０２ｍｇ／ｍｌアプロチニン、１０％グリセロール、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で溶解した。細胞溶解物を２０，０００ｇにて１５分間遠心分離した。細胞溶解物の蛋白質濃度はＤｃプロテインアッセイ（バイオラッド）を用いて測定した。４０マイクロリットルの５０％（体積／体積）プロテインＡ−セファロースを用いることにより、免疫複合体を回収し、それを継ぎに３回洗浄バッファー（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ Ｂｒｉｊ−３５，２ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０１ｍｇ／ｍｌアプロチニン、０．０３ｍＭ Ｎａ３Ｖｏ４）で洗浄した。沈殿物を，５ｕＣｉの３２Ｐ−γ−ＡＴＰ含有の２０マイクロリットルの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４，５ｍＭ ＭｎＣｌ２，０．１％ Ｂｒｉｊ−３５，０．０３ｍＭ Ｎａ３Ｖｏ４，０．０２ｍｇ／ｍｌアプロチニン）に懸濁して、室温にて３０分間インキュベートした。反応は、２ｍＭ ＡＴＰを含む３ｘの電気泳動サンプルバッファーの添加により停止した。１００℃にて３分間インキュベーション後にサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供した。
インビトロおよびインビボ腫瘍原性アッセイ
完全または減少血清条件における細胞成長は以下の通りに評価した：各細胞系の２ｘ１０４細胞を６ウエルプレート中にプレートして、完全成長培地への付着を可能にした。次の日、細胞を、完全成長培地（１０％−ＦＢＳ）中で保持するか、または２％−ＦＢＳ血清に変えた。細胞は、４日間成長を許容して、次にトリプシン処理して計数した。

足場非依存性成長は、ソフトアガーに懸濁した細胞のコロニー形成効率を評価することにより測定した。１−３ｘ１０３細胞を、１０％ＦＢＳおよび２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）を追加したＤＭＥＭ中の０．２５％アガロースからなる３ｍｌ細胞不含フィーダー層中の６ｃｍ培養皿中の１ｍｌのトップアガー（０．１８％アガロース／１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ）に懸濁した。ｐ−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット（１ｍｇ／ｍｌ）で染色後に、コロニー（＞０．３ｍｍ）を可視化して２１−２８日目に計数した。各細胞系は３通りに３つの異なる実験に関して試験した。

６−８週齢のＮＣｒ同型接合ヌードマウスを国立癌研究所から購入した。細胞（１ｘ１０６）を０．１ｍｌのＰＢＳに懸濁して、各動物の背中中部に皮内注射した。親のＵ８７ＭＧ細胞を個々の動物の片方の側面に注射して、安定にトランスフェクトされた細胞系を対側に注射することにより、各動物の成長の直接の比較を行った。追加の対照として、ＰＢＳのみを各動物に注射した。動物は、ペンシルバニア大学の動物委員会のガイドラインおよび実験室動物資源の研究所の実験室動物のケアと使用の委員会のガイドラインに従い飼育した。腫瘍の成長は１０−１２週間にわたり週２回監視する。腫瘍のサイズは腫瘍の体積を測定することにより計算した（長さｘ幅ｘ厚さ）。
抗体
ｐ１８５ｎｅｕのエクトドメインに反応性のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）７．１６．４は以前に記載した。抗リン酸チロシン抗体、ｍＡｂ ＰＹ−２０は、（サンタクルズバイオテクノロジー、サンタクルズ、ＣＡ）から得た。ＥＧＦＲおよびΔＥＧＦＲの細胞外ドメインに反応性のｍＡｂ５２８（Ａｂ−１）はオンコジーンサイエンス（ユニオンデール、ＮＹ）から購入した。ΔＥＧＦＲのみと反応性のｍＡｂΔ１２４はＷｅｂｓｔｅｒ Ｋ．Ｃａｖｅｎｅｅ博士，ルドビッヒ癌研究所、サンディエゴ、ＣＡから得た。ＥＧＦＲと反応性であり免疫ブロッティングに利用したポリクローナル抗体Ａｂ−４はオンコジーンサイエンス（ユニオンデール、ＮＹ）から購入した。
実施例５ ヒト癌細胞内のＥＲＢＢ受容体シグナリングを無能力化することによる放射線耐性表現型のより感受性な表現型への変換
序論
放射線または化学治療剤により誘導されるＤＮＡ損傷に対して細胞が如何にして多かれ少なかれ感受性になるのかを決定する分子パラメーターはよく理解されていない。細胞周期チェックポイントシグナリング経路の状態は、ＤＮＡ損傷に対する応答の重要な決定因子であることが論じられ、そしてチェックポイント成分における変異がヒト癌において優勢である。最近導入された模範（ｐａｒａｄｉｇｍ）は、腫瘍細胞がチェックポイント経路の機能状態に依存して細胞障害性治療に応答して成長停止やアポトーシスを呈すること、および放射線誘発されたアポトーシスは傷つけられた成長停止経路によりもたらされるかもしれない事を示唆する。同様に、非形質転換細胞を用いた他のシステムにおいては、チェックポイント相の遅延の間に起こるＤＮＡ修復の不完全な機構がアポトーシスを増大させる傾向にある。

ヒト膠芽腫は、表皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）をコードする遺伝子の増幅および／または変異を含む多くの遺伝子上の変化を呈し、いくつかの場合は構成的に活性化されたＥＧＦ受容体キナーゼの発現をもたらす。

ｐ１８５ｎｅｕオンコジーン（６９１停止ＮＥＵ）のエクトドメイン由来のＥＧＦＲのトランス受容体阻害剤の発現は、完全長のＥＧＦＲおよびヒト膠腫瘍、特に高い病原性の腫瘍において共通に観察される構成的活性化細胞外欠損変異対ＥＧＦＲ形態の両者とヘテロダイマー形成する。細胞成長およびＥＧＦＲ−陽性またはＥＧＦＲ／ΔＥＧＦＲ共発現ヒト膠芽腫細胞の形質転換は、ｐ１８５ｎｅｕのキナーゼ欠損欠失変異体により阻害される。表面局在Ｔ６９１停止ｎｅｕ変異体／ＥＧＦＲヘテロダイマー受容体複合体は、完全長ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲホモダイマー複合体に比して、ＥＧＦリガンドに対する減じられた親和性、減少した内在化キネティックス、低下したリン酸チロシン含有量、および減じられた酵素キナーゼ活性を有する。

ＥＧＦＲ−陽性形質転換ヒト細胞内でオンコジーン性形質転換を媒介する特定の経路は完全に特徴決定されていない。天然に生じるΔＥＧＦＲ癌蛋白質は、Ｇｒｂ２／Ｓｈｃ／Ｒａｓ経路およびシグナリングの構成的活性を、ホスファチジルイノシトール−３（ｐｉ−３）キナーゼを通して増加させるかもしれず、おそらくは、別のアダプター蛋白質への結合による。特定の有糸分裂蛋白質（ｍａｐ）キナーゼ、例えばｃ−ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）ファミリーは、リガンド非依存性オンコジーン性ΔＥＧＦ受容体により構成的に活性化されるかもしれない。ホロ−ＥＧＦＲは繊維芽細胞において高いレベルの受容体発現似てリガンド非依存性ようしきのみにおいて弱く形質転換することが見いだされたが、多くのヒト腫瘍は上昇レベルのＥＧＦＲを呈し、これは形質転換細胞において非制御のキナーゼ活性に寄与するかもしれない。

放射線耐性ヒト膠芽腫において過剰発現されたＥＧＦＲを通してシグナリングの特異阻害がこれらの細胞の生理的応答をゲノム損傷の誘導に変えるか否かに接近するための実験がデザインされた。ｅｒｂＢ受容体阻害と組み合わされたガンマ照射は低度の高い商社誘導成長阻止およびイオン化照射に通常は耐性の細胞内のアポトーシスをもたらした。増大したアポトーシスは野生型または変異したｐ５３蛋白質の何れかを含む形質転換ヒト膠腫細胞内に生じ、そしてｐ５３−依存性およびｐ５３−非依存性機構がこの生理的結果を媒介したことが示唆された。Ｔ６９１停止変異体ｎｅｕ蛋白質とＥＧＦ受容体の間の特定の阻害的相互作用と遠位の経路はゲノムの損傷に対する腫瘍の必要性を決定し、そしてこれらの経路は近位の受容体対合により媒介されうる。特定の阻害経路は細胞膜のレベルで開始し、そして成長阻止と関連し、そして／あるいは、アポトーシスはＤＮＡ損傷に応答して次のチェックポイント結果を変調するかもしれない。これらの結果は、細胞障害性治療に対して細胞を感受性にすることが可能な受容体−特異的因子のデザインに関して示唆を含み、そして細胞障害性処理と組み合わされたｅｒｂＢ受容体−特異的阻害が抗癌剤に対する応答を改良するかもしれないことを示唆する。
材料と方法
ベクター構築
Ｔ６９１停止ｎｅｕ変異体受容体構築物の誘導は前に詳細に説明される。
細胞のメンテナンスと安定にトランスフェクトした細胞系の開発
Ｕ８７ＭＧヒト膠芽腫細胞系は、Ｗｅｂｓｔｅｒ Ｋ．Ｃａｖｅｎｅｅ博士，ルドビッヒ癌研究所、サンディエゴ、ＣＡから得た。ヒト未分化神経膠星状細胞から最初に得た、Ｕ３７３ＭＧヒト膠腫細胞は、アメリカンタイプティッシュコレクション（ＡＴＣＣ）（ロックビル、ＭＤ）から得た。
細胞周期の分配のフローサイトメトリー分析
細胞は０．００３％トリプシン、０．０５％トリプシン阻害剤、０．０１％のＲＮａｓｅＡ溶液、そして次に０．０４１６％ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）および５ｍＭスペルミンテトラクロリド溶液の連続処理によりフローサイトメトリーのために染色した。各処理は、室温における連続撹拌で１０分間実施した。全ての試薬はシグマに注文した。細胞周期分析はベクトンディッキンソンＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター上の２時間以内の染色で実施した。１万の事象を各サンプルに関して回収し、そしてデータはＭｏｄＦＩＴ細胞周期分析プログラム（ベクトンディッキンソン、バージョン２．０）を用いて分析した。
アポトーシスの核染色および形態学分析
細胞を照射前に少なくとも１２時間カバースリップ上にプレーとした。照射はコロニー形成アッセイと同一の条件で実施した。カバースリップは次に示された時間にＰＢＳで洗浄し、そして氷冷メタノール／アセトンの５０：５０ミックス中で１０分間固定した。次に、カバースリップは４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロクロリド水和物（ＤＡＰＩ）（シグマ、セントルイス、ＭＯ）をＰＢＳ中０．１μｇ／ｍｌの濃度にて染色した。アポトーシスのカウントの観察者間の一致は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ−媒介ｄＵＴＰニックおよび標識（ＴＵＮＥＬ）−染色を用い、そして３人の個別の観察者により確認した。

細胞のカウントは染色の３０分間以内に実施され、そしてツアイスアクシオプランエピフルオレッセンス顕微鏡上で写真を撮った。１００細胞の少なくとも３つの個別の視野を各サンプルに関して計数した。
コロニー形成アッセイ
照射後の細胞の生存はコロニー形成アッセイにより評価した。プレートされる細胞の数は、各照射量において皿あたり２０から２００のコロニーと計算され、そして１０ｃｍ培養皿中にプレートされた（フィッシャーサイエンティフィック、ピッツバーグ、ＰＡ）。均一な照射を保証するため、回転するプラットフォーム上に細胞を１２．８Ｇｙ／分で送達する、Ｊ．Ｌ．シェファードモデル３０マークＩセシウム−１３７照射機を用いて細胞を照射した。照射後、細胞は３７℃において５％ＣＯ２と７−１０日間インキュベートし、次に、クリスタルバイオレットで染色した。５０細胞より多いコロニーは解剖顕微鏡下で計数した。生存画分は、プレートされた細胞の数に対する、形成されたコロニーの数の比であり、そして平板効率に関して修正された。少なくとも３つの細胞濃度を各照射量に用いた。
ウエスタンブロッティング
各時間点に関して、６ｃｍプレートあたり１０５細胞を４００μｌのサンプルバッファー（１０％グリセロール、２％ＳＤＳ，１００ｍＭ ＤＴＴ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ６．８）中の溶解により回収した。各溶解物３０μｌを各レーンあたり負荷して、１５５ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動して分離して、ニトロセルロースフィルター膜（バイオラッド、ヘラクレス、ＣＡ）上に転写した。膜は、マウス抗−ヒトｐ５３モノクローナル抗体（ネオマーカーズ、フェモント、ＣＡ）で、次いでホースラディッシュパーオキシダーゼにカップリングしたヤギ抗−マウス二次抗体（アマシャム、アーリントンハイツ、ＩＬ）によりプローブした。バックグラウンド抗体結合を減じるため、ＰＢＳ中の２．５％粉末ミルク中の二次抗体とのインキュベーションを実施した。検出は、ケミルミネッセンス（ＥＣＬ，アマシャム、アーリントンハイツ、ＩＬ）により実施した。ｐ５３発現の相対レベルはスキャニングデンシトメーター（モリキュラーダイナミックス）を用いたブロットをスキャニングすることにより測定した。
抗体
ｐ１８５ｎｅｕエクトドメインに反応性のモノクローナル抗体７．１６．４は前に記載した。抗−ＥＫおよび抗−ＪＮＫ抗体はサンタクルズバイオテクノロジー（サンタクルズ、ＣＡ）から得た。ｐ５３およびｐ２１と反応性のポリクローナル抗体はネオマーカーズ（フレモント、ＣＡ）から得た。ｂｃｌ−２，ｂａｘ，およびｂｃｌ−ｘＬと反応性の抗体はオンコジーンサイエンス（ユニオンデール、Ｎ．Ｙ．）から得た。
結果
ガンマ照射処理した循環ヒト膠芽腫の細胞周期分配：成長阻止に対するｅｒｂＢシグナリング無能力化の効果
Ｕ８７ＭＧおよびＵ８７／Ｔ６９１細胞の両者に関して、持続された血清飢餓のみ（７２−１００時間）がＧ０／Ｇ１での細胞の蓄積の増加を導き、Ｓ期とＧ２／Ｍ期両方の集団の適度の低下を伴う。Ｕ８７／Ｔ６９１細胞は血清存在下または持続された血清欠乏後の何れかにおいて親のＵ８７ＭＧ細胞よりも高いＧ０／Ｇ１画分を呈したことから、Ｔ６９１停止ｎｅｕ変異体受容体の発現により誘導される相対的に増加した成長阻止は完全血清中の成長により打破されなかったことを示す。

同調せずに循環する形質転換ヒト膠細胞集団のガンマ照射への暴露による成長阻止の誘導は、持続された血清欠乏のみにより誘導されたのよりも高かった。Ｕ８７ＭＧおよびＵ８７／Ｔ６９１細胞の両方において、完全血清成長条件下で成長した細胞の照射は、ＤＮＡ含有量のためのフローサイトメトリー染色により測定されたとおり、Ｇ０／Ｇ１期およびＧ２／Ｍ期における強い増加並びにＳ相における細胞のパーセンテージの減少を引き起こした（図１Ｂおよび１Ｄ）。Ｓ相画分の減少およびＧ２期の細胞の蓄積は、ＤＮＡ損傷を持続する細胞の特徴である。図１Ａ，１Ｂ，１Ｃおよび１Ｄのデータは、ガンマ照射７２時間後に分析した細胞の代表的実験を描写する。初期の時間点は同様の傾向を示すが、照射７２時間後の分析が次の実験との一致であるとして選択された。３つの個別の実験の分析は、細胞周期分散における以下の変化を明らかにした（細胞の平均パーセント±ＳＥＭ；±照射処理［ＲＴ］）：
１．）Ｕ８７ＭＧ親細胞：
Ｇ０／Ｇ１：２６±２．８，＋ＲＴ ５１．５±２．１；
Ｓ：６６±４．２，＋ＲＴ ２１±２．８；
Ｇ２／Ｍ：８±１．４，＋ＲＴ ２８．５±０．７；
２．）Ｕ８７／Ｔ６９１細胞：
Ｇ０／Ｇ１：３４．５±４．９，＋ＲＴ ７１±７．１；
Ｓ：５７．５±４．９，＋ＲＴ １６±４．２；
Ｇ２／Ｍ：７．５±０．７，＋ＲＴ １２．５±３．５。
Ｕ８７／Ｔ６９１細胞は高いＧ０／Ｇ１画分を呈し、そして照射処理があってもなくても培養において同調せずに成長させた場合に、親膠芽腫細胞と比較した場合、減少したＳおよびＧ２／Ｍ集団を呈し、そしてもっとも大きな差異はＧ０／Ｇ１集団においてであった。Ｇ２／Ｍ画分の照射誘導による増加はＵ８７ＭＧおよびＵ８７／Ｔ６９１細胞の両方においてみられたが、親Ｕ８７ＭＧ細胞においてはより程度が大きかった。これらの細胞集団における血清欠乏と照射処理の組み合わせは付加的でなく、そして完全血清中で照射処理を用いて観察されるものからの何れかの細胞系における細胞周期分散を感知できるほど変化させなかった。即ち、ＥＧＦＲ−媒介シグナリングの無能力化は持続された血清欠乏により観察されたのとは異なる機構による成長阻止を誘導するらしい。
トランス−受容体阻害はヒト膠芽腫細胞を照射誘導アポトーシスに対して感受性にする
ヒト膠芽腫細胞は実験上および臨床上の両方において照射治療に対して本質的に耐性となることが示された。ＥＧＦＲの過剰発現および／または変異は特に攻撃的なヒト膠腫瘍に相関されてきており、そして癌原性はインビトロおよびインビボにおいて低下したアポトーシスのためであることが示唆された。Ｔ６９１停止ｎｅｕによるヒト膠芽腫のＥＧＦＲ媒介シグナリングの阻害が、アポトーシス細胞死に対して細胞を感受性にできるか否かを試験した。

持続された血清欠乏により、たった０．１％のアポトーシスが、４’−６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）染色またはＴＵＮＥＬ染色の何れかを用いてＵ８７ＭＧ親細胞において観察され、他の研究において観察されたよりも低かった。Ｕ８７ＭＧ由来の細胞はアポトーシスを引き起こす条件下でのＰＩ染色後のフローサイトメトリー分析によりサブＧ０ピークを呈さないことがわかり、他の研究と一致した。Ｕ８７ＭＧ細胞におけるＴ６９１停止ｎｅｕ阻害剤の発現は、アポトーシス核のＤＡＰＩによる免疫組織化学の同定により測定されたとおり、持続された血清欠乏によりたった０−２％のみをもたらした。

アポトーシスは繰り返しの研究において７２時間で細大であり、そしてこの時間点はさらなる全ての実験において選択された。Ｕ８７ＭＧ細胞バックグラウンドにおけるＴ６９１停止ｎｅｕ蛋白質の発現は照射誘導アポトーシスのレベルを、４つの個別の実験において完全成長培地中で７２時間で２３±７．９％（平均±ＳＥＭ）まで増加させた（図２Ａ）。照射と組み合わせた持続血清欠乏はＵ８７／Ｔ６９１細胞において３３±１０．６％のアポトーシスを、そして親Ｕ８７ＭＧ細胞において１１±１．５％をもたらし、両方の集団において完全成長培地中の細胞の照射により観察されたのを上回る同等な増加であった。ガンマ照射後のヒト膠腫細胞中のアポトーシスの形態学的評価を含む実験を実施した。ガンマ照射の暴露後に、全ての細胞をＤＡＰＩにより染色した。アポトーシス性形態を呈する核を観察した。核の水泡化（ｂｒｅｂｂｉｎｇ）およびアポトーシスの断片特性が、ＤＡＰＩ染色したＵ８７ＭＧ由来の培養細胞の免疫組織化学分析により示される。アポトーシス指数はＵ８７／Ｔ６９１細胞内の照射後の全細胞死の表示不足を表すが、我々が免疫組織化学的に浮遊細胞を試験できなかったためである。
照射されたヒト膠芽腫細胞のクローン原性生存。我々は、放射性感受性を測定するのに共通に用いられたアッセイで成長の阻止または死を逃れてコロニーを形成し始めることが可能な細胞の数を測定した。特定の場合において、クローン原性成長アッセイは照射または化学治療に対する感受性と相関しなかったが、おそらくは死んだかまたは安定に阻止された細胞の運命がこのアッセイにおいて測定されないためである。図３に示すとおり、Ｕ８７／Ｔ６９１細胞は照射濃度（２−１０Ｇｙ）の範囲を超えて照射に対する増加した感受性を呈した。Ｕ８７／Ｔ６９１細胞は試験された全ての照射量においてそれらの未トランスフェクト親対照物よりも照射に対して約１．５ ｌｏｇより感受性であった。これらの結果は追加のＴ６９１停止ｎｅｕ−発現サブクローンにより確認された。Ｕ８７ＭＧ細胞およびそれらの誘導体は野生型ｐ５３およびｐ２１蛋白質を含む。
ヒト膠芽腫細胞の照射感受性のｐ５３状態に対する関係
ｐ５３状態は形質転換された細胞種および形質転換されていない細胞種の多くにおいてイオン化照射に対する応答に影響することが示された。ガンマ照射後のヒト膠芽腫細胞なあのｐ５３誘導の分析を行った。野生型ｐ５３遺伝子産物を含む１０５のＵ８７ＭＧおよびＵ８７／Ｔ６９１細胞をプレートして、一晩の付着後にガンマ照射した（１０Ｇｙ）。照射後示された時間において溶解物を取り出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、そしてｐ５３に反応性の抗体で免疫ブロットを行った。対照細胞は免疫反応性のｐ５３蛋白質を含むＭＣＦ−７胸部癌細胞であった。Ｕ８７／Ｔ６９１サブクローン中のガンマ照射後１２時間におけるｐ５３蛋白質のより強い誘導が構成的に観察された。照射処理後異なる時間点において得られた細胞溶解物のウエスタン分析は、Ｕ８７ＭＧとそれらのＴ６９１停止ｎｅｕトランスフェクト誘導体の両方において、照射後６−７２時間の間の全ての時間点において検出されたｐ５３蛋白質レベルの永続的増加を示した。ゼロタイム点は、ガンマ照射されて分析のために直後に溶解した細胞を示す。ｐ５３密度はこの時間においてモック照射循環細胞に匹敵する。Ｕ８７／Ｔ６９１細胞における照射１２時間後のｐ５３密度の１０倍の増加は、試験した他の全ての時間点においてＵ８７ＭＧ細胞およびＵ８７／Ｔ６９１細胞の両方におけるほんの１．５−３倍の増加に匹敵することが観察された。この傾向は変わらずに観察され（４つの実験）、そしていくつかの実験において照射６時間よりも早くにＵ８７／Ｔ６９１細胞において観察され、そしてゲノムの損傷の存在下でＥＧＦＲを無能力化することにより、ｐ５３依存性シグナリング経路がより効率的に活性化されるかもしれないことを示唆する。ｐ５３チェックポイント蛋白質における変化はガンマ照射によるゲノムの損傷後１２時間に観察された。ｅｒｂＢ受容体の連結後の胸部癌細胞の成長阻害および分化は、ｐ５３依存性経路の活性化と関連していた。

ｐ２１は照射後のＵ８７ＭＧおよびＵ８７／Ｔ６９１細胞の両方において誘導され、最高レベルは両細胞系において照射暴露の２４時間後に観察された。Ｕ８７ＭＧ細胞およびＵ８７／Ｔ６９１細胞の両方において、照射２４時間後のｐ２１蛋白質のレベルは同等であった。他者はｂｃｌ−ｘＬのアップ制御がヒト膠腫細胞における低下と関連することを示唆したが、我々は、Ｕ８７ＭＧまたはＵ８７／Ｔ６９１細胞の何れかにおいて照射後のｂｃｌ−ｘＬ蛋白質発現における変化を検出しなかった。構成的なｂｃｌ−ｘＬおよび照射誘導されたｂｃｌ−ｘＬ両方のレベルはＵ８７ＭＧおよびＵ８７／Ｔ６９１細胞において均等であった。ｂａｘおよびｂｃｌ−２蛋白質レベルの試験は膠芽腫細胞とそれらの阻害されたクローンの間の差異を明らかにしなかった。
ｐ５３−変異ヒト膠芽腫細胞中のアポトーシス
Ｕ３７３ＭＧヒト膠腫細胞は変異したｐ５３遺伝子産物を含み、ｐ２１発現を欠損し、そしてフローサイトメトリー分析により表面ＥＧＦＲの同等な上昇をＵ８７ＭＧ細胞に対して示す。これらの細胞を用いることにより、ＥＧＦＲ媒介シグナリングの阻害およびガンマ照射後に観察されたアポトーシスが野生型ｐ５３蛋白質に依存したか否かを測定した。Ｕ３７３ＭＧ細胞はガンマ照射後の変異ｐ５３蛋白質のレベルの増加を呈したが、ｐ２１を構成的または照射処理後に発現しなかった。

Ｔ６９１停止ｎｅｕ変異体受容体はＵ３７３ＭＧ膠腫瘍細胞において発現され、そして代謝標識およびフローサイトメトリー分析により４つのＵ３７３／Ｔ６９１サブクローンにおいてＵ８７／Ｔ６９１細胞に匹敵する発現を確認した。フローサイトメトリーは、Ｔ６９１停止変異体ｎｅｕ受容体の表面レベルがＵ８７／Ｔ６９１，Ｕ３７３／Ｔ６９１ ｃｌ １およびＵ３７３／Ｔ６９１ ｃｌ １２サブクローン、および２つの追加のＴ６９１停止ｎｅｕ−発現Ｕ３７３ＭＧ誘導体において均等であったことを示した。Ｔ６９１停止ｎｅｕ変異体受容体を発現するＵ３７３ＭＧ誘導体は低血清において成長阻止が可能であり、そしてインビトロにおいて形態学的に形質転換された病巣無しにコンフルエント細胞の阻止された芝生を表したことから、ｐ５２およびｐ２１野生型蛋白質は、ｅｒｂＢシグナリングが無能力化された膠腫瘍細胞の成長を阻止するのにも形質転換を阻害するのにも必要なかったことが示される。Ｕ３７３／Ｔ６９１ ｃｌ １およびＵ３７３／Ｔ６９１ ｃｌ １２サブクローンは、次に、Ｕ３７３ＭＧ細胞と共に照射されて、それらの親対照物を超える増加したレベルのアポトーシスを呈した（図２Ｂ）。示された代表的実験において、２つのＵ３７３／Ｔ６９１サブクローンはガンマ照射７２時間後にそれぞれ３２％および５９％のアポトーシスを呈したが、親Ｕ３７３ＭＧ細胞における２％アポトーシスおよびＵ８７／Ｔ６９１細胞における２０％アポトーシス指数に匹敵した。ｐ５３およびｐ２１状態において差異を含む２つの異なるヒト膠芽腫細胞系中のＴ６９１停止ｎｅｕの発現によるＥＧＦＲシグナリングを無能力にすることは、増加した照射誘導アポトーシスをもたらした。ゲノム損傷に対するヒト膠芽腫細胞の感受性は、即ち、野生型ｐ５３およびｐ２１蛋白質不在下で起こり得る。考慮すると、これらのデータは、ｐ５３依存性およびｐ５３非依存性の両経路がトランス受容体阻害およびゲノム損傷の組み合わせにより誘導された細胞死への感受性を媒介するかもしれないことを示唆する。注目すべきは、ＥＧＦＲシグナリングが無能力化されるヒト膠芽腫は、親細胞に比して、持続された血清欠乏または腫瘍壊死因子α−媒介細胞死の何れかに対してより感受性ではないらしい。
考察
細胞成長および形質転換を阻害するＥＧＦＲシグナリングの特異的阻害も、放射線耐性ヒト膠芽腫細胞を照射誘導ゲノム損傷に敏感にした。トランス優勢ｐ１８５ｎｅｕ由来の変異体受容体を発現する膠芽腫細胞は、それらの親対照物に比して、高いＧ１期阻止および高いレベルのアポトーシスを照射後に呈した。哺乳類繊維芽細胞および特別の神経細胞において、血清または成長因子欠乏は特定の条件下でアポトーシスを導くことができる。持続された血清欠乏のみは、これらの研究でヒト膠芽腫においてアポトーシスを誘導しなかった。ｅｒｂＢ受容体シグナリングまたは血清欠乏の何れかと組み合わせたＤＮＡ損傷が、アポトーシスを誘導するのに必要であった。ＥＧＦＲが無能力化された２３％のＵ８７ＭＧ誘導体および３２−５９％のＵ３７３ＭＧ−由来サブクローンにおいて（親細胞においてはほんの１−２％に匹敵）、照射により完全成長培地中でアポトーシスが誘導されたことから、トランス受容体阻害によるＥＧＦＲシグナリングの阻害は血清中の成長により克服できなかったことを示す。照射による損傷と組み合わせた血清剥奪は、親Ｕ８７ＭＧ細胞およびＴ６９１停止ｎｅｕ発現ヒト膠芽腫誘導体の両方において、観察されたレベルのアポトーシスを同じ程度に増加させた。注目すべきは、ＤＮＡ損傷後、細胞表面においてｅｒｂＢ受容体シグナリングを無能力化することにより観察されたアポトーシスは血清欠乏を用いて観察されたよりも大きかった。

監視システム、またはチェックポイントは、ゲノムまたは有糸分裂紡錘体への損傷が起こった場合に細胞周期を停止させるように発展してきた。ＤＮＡ損傷チェックポイントは細胞周期の別々の段階では異なって操作し、そして成長阻止、ＤＮＡ修復、転写活性化、およびアポトーシスに関与する複数の多面的遺伝子産物の調整された作用を必要とする。ＤＮＡ損傷チェックポイントは、損傷されたＤＮＡから細胞周期成分までの情報を伝達するシグナルトランスダクション経路を構成する。これらの研究において提示されたデータは、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）媒介シグナリング事象がＤＮＡ損傷チェックポイントシグナリング経路に影響しうることを示す。特に、悪性ヒト膠腫瘍細胞中のＥＧＦＲの阻害はＸ線により引き起こされたＤＮＡ損傷後に観察された成長阻止およびアポトーシスの程度を増加させることができる。

ガンマ照射細胞の耐性は異なるオンコジーンの機能状態により影響される。オンコジーンＲａｓまたはＲａｆの発現はＮＩＨ３Ｔ３細胞中の放射線感受性を減じ、そしてＲａｓＨプラスｃ−またはｖ−ｍｙｃオンコジーン何れかの発現はガンマ照射に暴露されたラット胚繊維芽細胞に耐性を付与した。低血清または抗癌剤への暴露に際して様々なオンコジーンの発現が細胞をアポトーシスに敏感にさせ得ることも真実である。細胞周期のＧ１およびＧ２期の両方において起こる分割の遅延は支配的癌蛋白質、例えばＨ−ｒａｓの発現により影響される。野生型ｐ５３蛋白質の発現はガンマ照射後の低下した生存に関連したが、変異したｐ５３蛋白質を含む細胞を超えたアポトーシスの高いフラクションの誘導のためである。しかしながら、変異したｐ５３蛋白質を含む腫瘍細胞およびｐ５３−／−マウス由来の増殖性リンパ球様細胞は照射後にアポトーシスを受けることが示されたため、ゲノム損傷後の細胞死のｐ５３非依存性機構が示唆される。

特定の細胞種においてＤＮＡ損傷後に観察される成長阻止対アポトーシスの程度を媒介する因子は同定されておらず、そしてＤＮＡ損傷検出、細胞回収、およびアポトーシスへの決定に影響する細胞特異的因子は完全に理解されていない。ｐ５３依存性機構は比較上の成長阻止および／またはアポトーシスを受けるための阻害された膠腫瘍細胞の応答に影響するかもしれない。Ｕ３７３ＭＧ−由来の細胞における結果も、ＥＧＦＲシグナリングが阻害される形質転ヒト細胞中でゲノム損傷後に起こるアポトーシス細胞死はｐ５３およびｐ２１蛋白質のとは異なる機構を含むことを示す。ｐ２１−／−マウスは正常に発生し、そして正常な器官の発生に要求されるプログラムされた細胞死の欠損を有さないらしいことから、ｐ２１はアポトーシスに必要ないらしいことが示される。ｐ５３−／−マウスは遺伝子不安定性を示し上昇したｃ−ｍｙｃレベルを含む。これらのマウスはインビボにおいて顕著なレベルのアポトーシスを受けることから、アポトーシスのｐ５３非依存性機構が正常組織および形質転換相棒の両方で機能することを示す。

興味を引くのは、同系適合結腸直腸カルシノーマ細胞内のｐ２１の不在が同じ細胞系のｐ２１陽性誘導体と比較した場合に、低下した成長阻止をもたらし、そしてこれがインビボにおいてより阻害された腫瘍成長に相関したことを最近の仕事が証明する。これらの観察はｐ２１媒介チェックポイント成長阻止における欠損により増加したアポトーシス帰したが、ｐ２１−／−細胞によりアポトーシス化する増加傾向はこの仕事において直接は示されなかった。アポトーシスの誘導はインビボにおいて抗癌剤治療における成長阻止に好ましいことが示唆された。我々の研究においては、Ｗａｌｄｍａｎｎら（１９９７）の研究と異なり、照射後のアポトーシス、増加した成長阻止およびクローン原性生存の低下の間に相関が存在した。

特定の環境、特に癌細胞において、成長阻止を媒介する経路において欠損が存在するなら、アポトーシスはゲノム損傷後に好遇されるかもしれない。さらに、細胞が成長阻止およびアポトーシスの両方を受けることができるとしても、ＥＧＦＲシグナリングが無能力化されたｐ２１欠損Ｕ３７３ＭＧヒト細胞におけるとおり、細胞は特定のシグナル、例えば照射後にアポトーシスを誘導するかもしれず、おそらくは別の経路を活性化することによる。我々のデータは、ゲノム損傷により誘導された成長阻止またはアポトーシスの相対比がｅｒｂＢシグナリング経路中の特定のチェックポイントの保全および変化の両方に影響されることを示す。注目すべきは、ＲＴＫシグナリング経路を変調することが形質転換細胞中でのＤＮＡ損傷後のチェックポイント出力に影響するかもしれないことである。他者は、胸部癌細胞中のｅｒｂＢシグナリング経路の活性化が放射線耐性に寄与することを示したことから、ｅｒｂＢファミリーシグナリング経路は多くの腫瘍種においてＤＮＡ損傷に対する応答に影響することを示唆する。シグナリングの生物学上の阻害を、チロシンキナーゼファミリーの受容体癌蛋白質を特異的に阻害することができる因子と組み合わせることにより、我々は、標準の細胞障害性因子に対する腫瘍細胞の応答のキネティックスに影響することが可能かもしれない。細胞障害性治療の投与のタイミングはそのような組み合わせ治療において最適化してよく、これらのデータは、複数のチェックポイントシグナルトランスダクション経路中の変化を含む進行したヒト悪性腫瘍の治療においてさえ、現存の利用可能な抗癌養生法の選択的抗腫瘍効果が改良できることを示唆する。
実施例６：組換えアデノウイルス
本発明のいくつかの態様による組換えアデノウイルスはＥｌａおよびＥｌｂを欠失させることにより無能力化し、他のウイルス遺伝子の発現を活性化するのに通常要求される。これらの組換えアデノウイルスは、ヒトＡｄ５に基づき、アデノウイルス蛋白質の明らかな細胞変性作用または発現無しにヒト肝細胞へ極めて効率よく遺伝子を形質導入できる。本発明における使用のために適合されうる組換えアデノウイルスの構築は、引用により編入されるＫｏｚａｒｓｋｙら、１９９３ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９（５）：４４９−４５８に記載される。該文献は、ｌａｃＺ挿入物を伴う組換えアデノウイルスを教示する。ｌａｃＺ挿入物は本発明に従いチロシンキナーゼ欠失ｅｒｂＢダイマー形成蛋白質をコードする配列で置換してよい。本発明の遺伝子構築物はｌａｃＺ挿入物を部位においてリンカー配列中に挿入される。
方法と材料
組換えアデノウイルス。組換え体Ｅ１−欠失アデノウイルスＡｄ．ｃｂｌａｃＺおよびＡｄ．ＣＢｈＬＤＬＲを生じさせるために使用されたプラスミドは以下のとおりに構築された。プラスミドＣＭＶβＡｌａｃＺ（１０）をＳｎａＢ１およびＮｈｅＩで消化して、ｇａｇβＡｈＬＤＬＲ（１６）をＮｈｅＩで消化して、次にＸｈｏＩで部分消化することにより、β−アクチンプロモーターおよびｌａｃＺ遺伝子またはヒトＬＤＬ受容体ｃＤＮＡの何れかを含む断片を単離した。これらの断片はクレノーにより平滑末端化した。プラスミドｐＡｄＣＭＶ−ｌａｃＺ（１７）はＳｎａＢＩおよびＮｏｔＩで消化することにより、ＣＭＶプロモーターおよびｌａｃＺ遺伝子を除去し（ＣＭＶエンハンサーは残す）、クレノーで平滑末端にして、ｌａｃＺまたはＬＤＬＲ遺伝子の何れかに融合したβ−アクチンプロモーターを含む挿入物を連結した。その結果のベクターを、それぞれ、ｐＡｄＣＢｌａｃＺおよびｐＡｄ−ＣＢｈＬＤＬＲと名付けた。

プラスミドをＮｈｅＩで直鎖状にし、そして５’ＩＴＲを除去するためにＸｂａＩとＣｌａＩで消化した野生型アデノウイルスＤＮＡ（部分的Ｅ３欠失を含む株サブ３６０（１８））と同時トランスフェクトした。組換えアデノウイルスはトランスフェクション後に単離し（１９）、２ラウンドのプラーク精製に供し、そして塩化セシウム遠心分離により溶解物を精製した（２０）。ウイルスストックは２９３細胞上の限定希釈プラークアッセイにより力価に関して評価し、そして１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＣＬ，ｐＨ８．１，１００ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ウシ血清アルブミン、および５０％グリセロールで４倍希釈後に２０℃で保存した。グリセロールストックの力価は：Ａｄ．ＣＢｌａｃＺ，２．４ｘ１０９プラーク形成ユニット（ＰＦＵ）／ｍｌ；ＣｖｈＬＤＬＲ，４ｘ１０９ＰＦＵ／ｍｌ；野生型Ａｄ，８ｘ１０９ＰＦＵ／ｍｌであった。

本発明による遺伝子構築物はｌａｃＺ配列に代えてプラーク中のリンカー配列内に挿入される。
実施例７：組換えアデノウイルス
本発明のいくつかの態様による組換えアデノウイルスはＥｌおよびＥ４を欠失させることにより無能力化し、他のウイルス遺伝子の発現を活性化するのに通常要求される。これらの組換えアデノウイルスは、ヒトＡｄ５に基づき、アデノウイルス蛋白質の明らかな細胞変性作用または発現無しにヒト肝細胞へ極めて効率よく遺伝子を形質導入できる。本発明における使用のために適合されうる組換えアデノウイルスの構築は、引用により編入されるＰＣＴ出願連続番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／１００２４５に記載される。該文献は、ｌａｃＺ挿入物を伴う組換えアデノウイルスを教示する。ｌａｃＺ挿入物は本発明に従いチロシンキナーゼ欠失ｅｒｂＢダイマー形成蛋白質をコードする配列で置換してよい。本発明の遺伝子構築物はｌａｃＺ挿入物を部位においてリンカー配列中に挿入される。

図４は、組換えアデノウイルスＨ５．００１ＣＢＬａｃＺの概要マップであり、制限エンドヌクレアーゼ控訴部位を示す。縞の棒はＣＢＬａｃＺミニジーンを表し；黒い棒はＡｄ５ウイルスバックボーンを表し；クロスハッチの棒はＡｄ Ｅ４セクションを表す。

新規のパッケージング細胞系はＥ１およびＥ４の両遺遺伝子において機能上欠失した組換えアデノウイルスの生産を可能にする。

アデノウイルス血清型５の初期領域４（Ｅ４）は、ウイルスＤＮＡ複製、宿主細胞シャットオフ、および後期ｍＲＮＡ蓄積に関与すると信じられる７つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦｓ）からなる。Ｅ４において欠失させた組換えアデノウイルス（Ａｄ）を生成するためには、Ｅ４領域の機能はヘルパーウイルスまたはパッケージング細胞系により組換えウイルスに供給されなければならない。

この問題を回避するため、パッケージング細胞系はＡｄ５ Ｅ１遺伝子およびＡｄ５ Ｅ４遺伝子のＯＲＦ６のみを含む。Ｅ４のＯＲＦ６のみがウイルスのライフサイクルにおいてＥ４に関する要求を提供することができる。ＯＲＦ６は誘導可能なプロモーター、例えば亜鉛によい誘導可能なヒツジメタロチオニンプロモーター、またはグルココルチコイド、特にデキサメタゾンにより誘導可能なマウス哺乳類腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターの転写制御下であることがさらに好ましい。

アデノウイルス配列を含む所望のシャトルベクターが細胞系にトランスフェクトされた後で、Ｅ４ ＯＲＦ６の発現は適切なインデューサーにより誘導することができる。

好ましい形態において、パッケージング細胞系は、誘導可能なプロモーター制御下でＥ４ ＯＲＦ６配列が導入されたヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｅ１発現細胞である。そのグルココルチコイドインデューサーを伴うＭＭＴＶプロモーターは存在するのが好ましいが、ＭＴプロモーターの硫酸亜鉛インデューサーはそれ自身が細胞に有毒だからである。

Ａｄ５ Ｅ４領域のＯＲＦ６のみまたは機能比較のための完全なＥ４を含むパッケージング細胞系の構築の特別の教示は以下に記載される。簡単に記載すれば、Ａｄ Ｅ４遺伝子の完全なＥ４領域とＯＲＦ６配列は公知の技術により得る（例えば、すべて引用により編入される、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．”，第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク（１９８９）および本明細書で引用した全ての文献）。ＯＲＦ６領域を単離するため、アンカーされたポリメラーゼチェイン反応技術を用いることにより、ＯＲＦ６配列をその最初のコドンからその最後のコドンまで増幅した。ＯＲＦ６の公表された配列から選択されたプライマーを用いることにより、該ＯＲＦ配列および該配列の末端上の挿入物制限部位を増幅する。Ｅ４ ＯＲＦ６配列を含む完全Ｅ４遺伝子配列はＡｄ５のＧｅｎｂａｎｋ配列にて公表される（Ｇｅｎｂａｎｋ加盟番号Ｍ７３２６０）。

ミニジーンは選択されたプロモーターの制御下にＯＲＦ６配列を置くように構築される。該ＯＲＦ６配列遺伝子はその転写を可能にする様式において制御成分に操作可能なように連結される。そのような成分は、慣用的な制御要素、例えばＯＲＦ６発現を推進するプロモーターを含む。一つの誘導可能なプロモーターはＺｎ＋２誘導可能ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター（Ｍ．Ｇ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７４：４１７−４２４（１９８８））。第２のプロモーターはデキサメタゾン−誘導可能なマウス哺乳類腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターである。

ＭＭＴＶ−ＯＲＦ６ミニジーン内で使用されるポリＡ配列は成長ホルモン遺伝子ターミネーターおよびＳＶ４０複製オリジンにより供給される。

ＯＲＦ６−含有ミニジーンはネオマイシン耐性遺伝子を含んだｐＢＲ３２２シャトルプラスミドにサブクローン化して、シャトルベクターをもたらした。

Ｅ１／Ｅ４ ＯＲＦ６発現パッケージング細胞系は組換えＥ１／Ｅ４欠失アデノウイルスの生成において有用である。
組換えアデノウイルス
新規のＥ１／Ｅ４発現細胞系は任意の選択されたトランス遺伝子を含むＥ１／Ｅ４欠失組換えアデノウイルスをさらに構築するのに有用である。該組換えアデノウイルスは哺乳類細胞および組織に適当な遺伝子を送達することができる。これらの組換えアデノウイルスは少なくともＥ１ａ，Ｅ１ｂおよびＥ４ Ａｄ遺伝子領域において機能上欠失している。用語「機能上の欠失」は、十分な量の遺伝子領域が除去されるかまたはさもなくば例えば変異または修飾により損傷することで該遺伝子領域がもはや遺伝子発現の産物を生成できないことを意味する。所望であれば、完全遺伝子領域を除いてよい。

同様に、ベクター内で有用なウイルス配列の選択、「ミニジーン」のクローニングおよび構築、および所望のウイルスシャトルベクターへのその挿入および組換え感染性ウイルスの生成の方法は、本明細書に提供された教示を与えられた当業者の範囲内である。
「ミニジーン」を含むトランス遺伝子の構築
このコンテクストの中のミニジーンは条規の通りに定義されるが、このミニジーンの成分はインビボにおいて遺伝子産物を発現するようにデザインされることが例外である。そのような成分は、組換えウイルスでトランスフェクトされた細胞中のトランス遺伝子の発現を推進するために必要な慣用的制御要素を含む。このミニジーンのために、選択されたプロモーターをトランス遺伝子に操作可能なように連結し、そして他の制御要素と共に組換えベクターの選択されたウイルス配列内に位置させる。プロモーターの選択は日常的な事柄であり本発明においては制限されない。有用なプロモーターは構成的プロモーターまたは制御（誘導可能な）プロモーターであってよく、発現されるトランス遺伝子の量の制御を可能にする。例えば、所望のプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）極初期プロモーター／エンハンサーのそれである（ｔａｔｏｅｂａＢｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）を参照されたい）。

他の所望のプロモーターは、ラウスサルコーマウイルスＬＴＲプロモーター／エンハンサーを含む。さらに別のプロモーター／エンハンサー配列は、チキン細胞質性β−アクチン（ＣＢ）プロモーターである（Ｔ．Ａ．Ｋｏｓｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１（２３）：８２８７（１９８３））。他の適切なプロモーターは当業者により選択されてよい。
組換えアデノウイルスの生産
本発明において有用なアデノウイルス配列は多数のアデノウイルス種のＤＮＡ配列を含んでよく、Ｇｅｎｂａｎｋから利用可能であり、Ａｄ５型（Ｇｅｎｂａｎｋ加盟番号Ｍ７３２６０）である。該アデノウイルス配列はあらゆる公知のアデノウイルス種、例えば血清型２、３、４、７、１２および４０から得てよく、さらに現在同定されている４１のヒトタイプの何れをも含む。

他の動物に感染することが公知の同様なアデノウイルスも、本発明のベクター構築物内で用いてよい。アデノウイルス種の選択は以下の発明を制限するとは理解されない。様々なアデノウイルス株がアメリカンタイプカルチャーコレクション、ロックビル、メリーランドから入手可能であるか、また様々な商業ソースまたは研究所ソースの請求により入手可能である。以下の例示の態様においては、便利性のためアデノウイルスタイプ５（Ａｄ５）を用いた。

本発明のアデノウイルスはアデノウイルス極初期遺伝子Ｅ１ａ（ｍｕ１．３から４．５のスパン）および後期遺伝子Ｅ１ｂ（ｍｕ４．６から１１．２のスパン）の機能上の欠失を含んだ。同様に、該アデノウイルスはＥ４領域（ｍｕ９２ｋａｒａ９７．２のスパン）またはＥ４領域の少なくともＯＲＦ６の機能上の欠失を有する。

本発明の使用のための例示の組換えアデノウイルスは、例えば、様々な組換えアデノウイルスからの所望の断片の相同組換えにより得てよく、遺伝子治療用途のために他の組換えアデノウイルスを生成するのに共通に採用される技術である。組換えアデノウイルス、Ｈ５．００１ＣＢＬａｃＺは、アデノウイルスｄｌ１００４（またはＨ５ｄｌ１００４）ウイルスバックボーンとｐＡｄＣＢＬａｃＺミニジーンＤＮＡの間の相同組換えにより構築する。Ｈ５ｄｌ１００４はマップユニット９２．１からマップユニット９８までの、即ち実質的に完全なＥ４遺伝子のＡｄ５ウイルス欠失である。ｄｌ１００４ウイルスは引用により編入される、Ｂｒｉｄｇｅ ａｎｄ Ｋｅｔｎｅｒ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３２（２）：６３１−６３８（１９８９年２月）に記載される。

ｐＡｄＣＢＬａｃＺベクターはチキンβ−アクチンプロモーター制御下にバクテリアのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子に挿入されたＥ１欠失であるＡｄ ｍ．ｕ．０−１を含むｃＤＮＡプラスミドであり、以下に記載されるとおり他の制御要素を伴い、そしてＡｄ ｍ．ｕ．９−１６およびプラスミド配列を周辺に有する。
パッケージング細胞系を発現する新規なＥ１ａ／Ｅ１ｂおよびＥ４
Ｅ４ ＯＲＦ６発現プラスミドの構築
ｐＭＴＥ４ＯＲＦ６
本発明のパッケージング細胞系の構築のために有用な一つの例示プラスミドはｐＭＴＥ４ＯＲＦ６であり、ヒトＥ４ ＯＲＦ６遺伝子配列の転写制御下のヒツジメタロチオニンプロモーター（ＭＴプロモーター）、成長ホルモンターミネーター（ＧＨ）、ＳＶ４０複製オリジン、ｐＢＲ３２２に基づくプラスミドからのプラスミド配列であり、ネオマイシン耐性遺伝子、ＳＶ４０ポリアデニル化部位およびアンピシリン耐性遺伝子を含む。

このプラスミドの様々な機能断片は他の慣用上用いられる配列で容易に置換えてよく、プラスミドのデザインに必須ではない。
ｐＭＭＴＶＥ４ＯＲＦ６
本発明のパッケージング細胞系の構築のために有用な他の例示プラスミドはｐＭＭＴＶＥ４ＯＲＦ６であり、ヒトＥ４ ＯＲＦ６遺伝子配列の転写制御下のマウス哺乳類腫瘍ウイルスプロモーター（ＭＭＴＶ）、成長ホルモンターミネーター（ＧＨ）、ＳＶ４０複製オリジン、ｐＢＲ３２２に基づくプラスミドからのプラスミド配列であり、ネオマイシン耐性遺伝子、ＳＶ４０ポリアデニル化部位およびアンピシリン耐性遺伝子を含む。このプラスミドの様々な機能断片は他の慣用上用いられる配列で容易に置換えてよく、プラスミドのデザインに必須ではない。
ｐＬＴＲ．Ｅ４（−）内因性Ｅ４プロモーター
本発明のパッケージング細胞系の構築のための対照として用いられるプラスミドはｐＬＴＲ．Ｅ４（−）である。このプラスミドは内因性Ｅ４プロモーターおよびＥ４ ＯＲＦ１の一部が失われたことを除いて、構成的レトロウイルスＭＬＶ ＬＴＲおよびＡｄ Ｅ４遺伝子領域の殆どを含む。他のプラスミド配列は条規と同じままである。
ｐＬＴＲ．Ｅ４（＋）内因性Ｅ４プロモーター
さらに別のプラスミドはｐＬＴＲ．Ｅ４であり、ＭＬＶ ＬＴＲおよび内因性Ｅ４プロモーターおよび完全なＥ４遺伝子を含む。別のプラスミド配列は上記のとおりそのままである。
トランスフェクションおよびクローンの選択
上記プラスミドの各々は、リン酸カルシウム沈殿技術により、アデノウイルスＥ１遺伝子の産物を発現するヒト胚腎臓細胞系２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３）中にトランスフェクトし、１００ｍｍプレート上で成長を促した（１０μｇプラスミド／プレート）。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を回収して様々な希釈において（１：１０−１：１００）１００ｍｍプレート中で約１０日間成長を促した。成長促進（ｓｅｅｄｉｎｇ）培地はＧ４１８（ジェネティシン、ＢＲＬ）を１ｍｇ／ｍｌにて含む。発生した耐性コロニーは以下のアッセイを使用して選択して増殖させた。クローンの予備分析は、以下のとおり、組換えアデノ関連ウイルスＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺの増強されたトランスダクション効率およびＡｄ Ｅｒ蛋白質の免疫蛍光局在に基づいた。
ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺトランスダクション増強アッセイ
Ｅ１およびＥ４ Ａｄ遺伝子産物は組換えアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）機能に必要である。この初期アッセイは、９６ウエルの３５ｍｍ培養プレート中で実施例１のパッケージング細胞系の成長を促し（２ｘ１０６細胞／ウエル）、そして精製されて熱処理したＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺを１０００ウイルス粒子／細胞のＭＯＩで上記細胞に感染させることを含む。
ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺの製造
組換えＡＡＶウイルスはこの実験の目的のための慣用の遺伝子工学技術により製造される。組換えＡＡＶはヘルパーアデノウイルスの存在下でプラスミドトランスフェクションにより生成される（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２−３８２８（１９８９））。シス作用性プラスミドｐＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺはｐｓｕｂ２０１に由来し（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１（１９８７））、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子に代えて大腸菌βガラクトシダーゼミニジーンを含む。組換えＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺゲノム（４．９ｋｂ）の５’から３’への配置は、
（ａ）５’ＡＡＶ ＩＴＲ（１−１７３ｂｐ）はＰＣＲによりｐＡＶ２を用いて鋳型として得られた（Ｃ．Ａ．Ｌａｕｇｈｌｉｎら、Ｇｅｎｅ，２３：６５−７３（１９８３））；
（ｂ）ＣＭＢ極初期エンハンサー／プロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５））；
（ｃ）ＳＶ４０イントロン；
（ｄ）大腸菌ベータ−ガラクトシダーゼｃＤＮＡ；
（ｅ）ＳＶ４０ポリアデニレーションシグナル（初期転写ユニットおよび後期転写ユニットの両方からの分割／ポリ−Ａシグナルを含む２３７ＢａｎＨＩ−ＢｃｌＩＩ制限断片；および）
（ｆ）ｐＡＶ２からＳｎａＢＩ−ＢｇｌＩＩ断片として得られた３’ＡＡＶ ＩＴＲ
を含む。
ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子はトランス作用性プラスミドｐＡＡＶ／Ａｄにより提供される。

９０％コンフルエンシーまで１５０ｍｍ培養皿中で生育させた２９３細胞の単層（５ｘ１０７細胞／プレート）に、Ｈ５．ＣＢＡＬＰを１０のＭＯＩにて感染させる。Ｈ５．ＣＢＡＬＰ（Ｈ５．０１０ＡＬＰとも呼ぶ）はアデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１ｂ遺伝子配列（ＧｅｎｂａｎｋのＡｄ５配列のマップユニット１−９．２（加盟番号Ｍ７３２６０））に代えてアルカリホスファターゼミニジーンを含む組換えアデノウイルスである。アルカリホスファターゼｃＤＮＡはこのウイルスのＣＭＶ−増強β−アクチンプロモーターの転写制御下である。このヘルパーウイルスはＧｏｌｄｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，６：８３９−８５１（１９９５年７月）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，５：１２１７−１２２９（１９９４年１０月）；および本明細書にて引用した文献に記載される。

２％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を２０ｍｌ培地／１５０ｍｍプレートにて添加したダルベッコイーグル培地（ＤＭＥＭ）中で感染を行う。感染から２時間後、２．５ｍｌのトランスフェクションカクテル中の５０μｇのプラスミドＤＮＡ（３７．５μｇトランス作用性および１２．５μｇシス作用性）を各プレートに加えて等しく分配した。トランスフェクションは上記のとおりリン酸カルシウムに基づく（Ｂ．Ｃｕｌｌｅｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５２：６８４−７０４（１９８７））。細胞はこの条件において１０−１４時間放置し、その後、感染／トランスフェクション培地を２０ｍｌの新鮮なＤＭＥＭ／２％ＦＢＳで置換える。トランスフェクションから４０−５０時間後に、細胞を回収し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）バッファーに懸濁し（０．５ｍｌ／１５０ｍｍプレート）、そして音波処理により溶解物を調製する。溶解物は１０ｍＭ塩化マグネシウムにし、その後、ウシ膵臓ＤｎａｓｅＩ（２０，０００ユニット）およびＲｎａｓｅ（０．２ｍｇ／ｍｌ最終濃度）を加え、そして反応物を３７℃において３０分間インキュベートした。デオキシコレートナトリウムを最終濃度１％で加え、そして３７℃においてさらに１０分間インキュベートする。

処理した溶解物は氷上で１０分間冷して、固形ＣｓＣｌを最終密度１．３ｇ／ｍｌまで加えた。溶解物は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）中の１．３ｇ／ｍｌ ＣｓＣｌ溶液をもちいて最終体積６０ｍｌにし、そして３つの等しいアリコートに分割する。各２０ｍｌサンプルを密度１．４５ｇ／ｍｌおよび１．６０ｇ／ｍｌの２つの９．０ｍｌ層からなるＣｓＣｌ段階勾配上に重層する。

遠心分離はベックマンＳＷ−２８ローター中で２５，０００ｒｐｍにて２４時間４℃において実施する。

機能性ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺウイルスのピークの力価を含む画分を混合してＣｓＣｌ中の平衡沈降の３連続ラウンドに供する。ローターの選択は、ベックマンＮＶＴ−９０（８０，０００ｒｐｍで４時間）およびＳＷ−４１（３５，０００ｒｐｍで２０時間）を含む。平衡化に際して、ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺは１．４０−１．４１ｇ／ｍｌ ＣｓＣｌにおいて乳光のバンドとして出現する。密度は屈折率測定から計算する。精製されたベクターを透析により１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ＨＢＳ）含有２０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．８）に交換して１０％グリセロール存在下で−８０℃に凍結保存するかまたはＨＢＳ／４０％グリセロール中２０℃において液体保存する。

精製されたウイルスは混在するＨ５．ＣＢＡＬＰヘルパーウイルスに関しておよびＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ力価に関して試験する。ヘルパーウイルスは受容体アルカリホスファターゼ活性に関する組織化学染色により監視する。１．０％の最終産物を表す精製ウイルスのサンプルを６０ｍｍプレート中にて生育させた２９３細胞の成長単層に加える。４８時間後、細胞を０．５％グルタルアルデヒド／ホスフェート緩衝塩（ＰＢＳ）中で室温にて１０分間固定し、ＰＢＳで洗浄し（３ｘ１０分）、そして６５℃において４０分間インキュベートすることにより、内因性アルカリホスファターゼ活性を失活する。単層を室温において冷し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ９．５）／１００ｍ ＮａＣｌ／５ｍＭ ＮｇＣｌ２中で簡単に一度リンスし、そして０．３３ｍｇ／ｍｌのニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）および０．１６５ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリホスフェートｐ−トルリジン塩（ＢＣＩＰ）を含む同じバッファー中で３７℃において３０分間インキュベートする。発色は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）／５ｍＭ ＥＤＴＡ中の単層を洗浄することにより停止する。日常的には、上記の精製スキムは３ラウンドの浮遊密度超遠心分離により全ての検出可能なＨ５．ＣＢＡＬＰヘルパーウイルスを除去する。

ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ力価はゲノムコピー数（ウイルス粒子／ｍｌ）、２６０ｎｍの吸光度（Ａ２６０粒子／ｍｌ）において、そしてＬａｃＺ形成ユニット（ＬＦＵ／ｍｌ）に従い測定する。ウイルス粒子濃度はサザンブロッティングに基づく。簡単にいえば、精製されたＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺのサンプルをキャプシッド消化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ８．０／１．０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０／０．５％ ＳＤＳ／プロテイナーゼＫ １．０ｍｇ／ｍｌ）中で５０℃において１時間処理することにより、ウイルスＤＮＡを放出させる。反応物は室温において冷し、負荷バッファーを加えて、１．２％アガロースゲルを通して電気泳動する。ｄｓ ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺゲノムの標準量はゲル上においても解析する。

ＤＮＡをナイロン膜上に電気ブロットし、３２Ｐランダムプライマー標識制限断片とハイブリダイズさせ、そしてその結果のブロットをホスホルイメージャー４４５ＳＩ（モリキュラーダイナミックス）上でスキャンする。標準曲線を二重形態から生じさせて、サンプル中のウイルスゲノムの数を推測するのに使用する。ＬＦＵ力価はウイルスサンプルを限定希釈してインディケーター細胞を感染させることにより生じさせる。インディケーター細胞はヒーラおよび２９３を含む。２４時間後、細胞をグルタルアルデヒド中で固定し、そして細胞を大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）活性に関して組織化学染色したが、Ｊ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：３０１４−３０１８（１９８８）に記載されるとおりである。一ＬＦＵは１細胞中で感染２４時間後に可視検出可能なβ−ガラクトシダーゼ発現を引き起こすのに十分なウイルス量として記載される。
ＯＲＦ６発現の誘導
１０μＭデキサメタゾンまたは１５０μＭ硫酸亜鉛（陰性対照のため、インデューサー不使用）を用いたＯＲＦ６発現の誘導は、ウイルス添加の２時間前に開始し、実験期間を通して継続する。ウイルスの添加から２４時間後、細胞を回収し、音波処理により溶解物を生成させ、そしてβ−ガラクトシダーゼ発現に関して（即ち、β−ガラクトシダーゼ活性）およびウイルスＤＮＡに関して上記のとおり分析した。細胞抽出物からの低分子量ＤＮＡのため、ハート抽出物を調製する。ハート抽出物の調製およびサザンハイブリダイゼーションによる次の分析は、当業者に公知の慣用手法を借りて実施する。

インデューサー不在下で、パッケージング細胞系はｒＡＡＶ感染細胞中で低レベルのβ−ガラクトシダーゼを生じる。インデューサーであるデキサメタゾンを用いたＯＲＦ６の発現の誘導は、ＡＶ．ＡＭＶＬａｃＺ細胞形質導入における親２９３よりも高いレベルへの付随的上昇をもたらす。Ｅ１のみの発現では、ｒＡＡＶ形質導入のアデノウイルス媒介による増加において効果を有するのには不十分である。
Ａｄ５後期蛋白質の免疫蛍光局在
該アッセイからの陽性のクローンは組換えＥ４欠失アデノウイルスＨ５Ｄｌ１００４を感染して、後期遺伝子発現に関して免疫蛍光アッセイを用いてＥ４相補に関してスクリーンする。Ｈ５ｌ１００４ウイルスはジョンホプキンス大学のＫｅｔｎｅｒ博士から得たが、引用により編入されるＢｒｉｄｇｅ ａｎｄ Ｋｅｔｎｅｒ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３２（２）：６３１−６３８（１９８９年２月）に記載されるとおりである。Ｅ４のＯＲＦ６は後期Ａｄ遺伝子の発現、特にアデノウイルスのヘキソンおよびペントン繊維の形成において相補するため、ＯＲＦ６を含む細胞系はこれらの蛋白質に対する抗体を結合することができる。

各細胞系はＭＯＩ０．１においてＥ４欠失ウイルスＨ５ｄ１ｌ１００４を感染させる。細胞はヘキソンまたはペントン繊維のいずれかに対するマウス抗−アデノウイルスＦＩＴＣ−標識モノクローナル抗体で１：１０希釈において処理する（ケミコンインターナショナル社、テムクラ、ＣＡ）。陽性クローンを上記抗体との反応により同定する。
相対的プラーク効率
強い相補可能性を示す細胞系は、Ｗ１６２細胞（Ｅ１を発現しないＥ４−相補ベロ細胞系）と比した、Ｈ５ｄｌ１００４の相対プラーク効率に関してスクリーンする（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｋｅｔｎｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８０（１７）：５３８３−５３８６）。ＲＰＥ％、即ち試験細胞系上のＨ５ｄｌ１００４力価／Ｗ１６２細胞上のＨ５ｄｌ１００４力価を表す相対プラーク効率を測定する。例えば、２９３細胞のＲＰＥは０である。

全ての基準から選択される陽性細胞を以下の表１に、アッセイ結果と共に示す。

Ｈ５．００１ＣＢＬａｃＺの構築と精製
プラスミドｐＡｄ．ＣＢＬａｃＺを、引用により編入される、Ｋ．Ｋｏｚａｒｓｋｙら、Ｓｏｍ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１９（５）：４４９−４５８（１９３）に詳細に記載されたとおりに構築する。このプラスミドは５’フランキングＮｈｅＩ制限部位、続くＡｄ５配列ｍ．ｕ．０−１、続くＣＭＶエンハンサー／チキンβ−アクチンプロモーター配列を挿入されたＥ１欠失を含むミニジーンを含み（Ｔ．Ａ．Ｋｏｓｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１（２３）：８２８７（１９８３））、バクテリアβ−ガラクトシダーゼ後にあって、ポリＡを従えて３’周囲にＡｄ ｍ．ｕ．９−１６を有し別のＮｈｅＩを有する転写物を制御する。このプラスミド中で、ミニジーンは両サイドを薬剤耐性マーカー含有プラスミド配列ではさまれる。

プラスミドｐＡｄ．ＣＢＬａｃＺはＮｈｅＩにより直鎖状にされ、リン酸カルシウム同時トランスフェクション法により新規パッケージング細胞系へＣｌａＩ消化Ｈ５ｄｌ１００４（ほぼマップユニット９２．１からマップユニット９８を欠くＡｄ５配列であり、完全Ｅ４遺伝子に実質上相当する）と共に同時トランスフェクトする。

相同組換えはこれらの２つのウイルス構築物のＡｄマップユニット９−１６の間でおこり、Ｈ５．００１ＣＢＬａｃＺと呼ぶ組換えアデノウイルスをもたらす。この組換えアデノウイルスはｐＡｄ．ＣＢＬａｃＺからのおよそヌクレオチド１からおよそ４６２８までおよびＨ５ｄｌ１００４からのＡｄマップユニット９−９．２１および９．７３から１００までの配列を含む。この組換えウイルスはよって、Ａｄ Ｅ１およびＥ４から機能上欠損しており、そして実質上構造的に欠損している。

ウイルスのプラークをβ−ガラクトシダーゼアッセイにより選択およびスクリーンし、そして３ラウンドのプラーク精製によりＨ５．００１ＣＢＬａｃＺを単離した。該精製ウイルスは塩化セシウム密度勾配遠心分離および大スケール生産にも供される。以下のマウス実験に関しては、カラム精製後のウイルスを使用して、グリセロールを最終濃度１０％（ｖ／ｖ）まで加える。ウイルスは−７０℃において使用まで保存する。
パッケージング細胞系中のＨ５．００１ＣＢＬａｃＺの成長キネティックス
上記細胞系に組換えＨ５．００１ＣＢＬａｃＺを５のＭＯＩにて感染させる。生じた最大ウイルスは以下の表２にＬＦＵ／ｍｌとして報告される。

２９３−２７−１８細胞中で成長させた場合（デキサメタゾンにより誘導されたＭＭＴＶプロモーターを用いたＥ４ ＯＲＦ６細胞系）、このウイルスの最大収量は２．９ｘ１０１０ＬＦＵ／ｍｌである。いくつかの細胞系は５分と２０分の間に通過し、そして通過物のウイルス成算は安定したままであった。しかしながら、ＲＰＥは細胞の繰り返しの通過後に落ちた。

本発明による遺伝子構築物はｌａｃＺ配列に代わってプラスミド中のリンカー配列中に挿入される。
実施例８
バックグラウンド：
抗−ｐ１８５ｎｅｕモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）はインビトロおよびインビボにおいて投薬量依存性様式においてｐ１８５ｎｅｕ発現腫瘍の成長を阻害することがわかった。別のエピトープドメインと反応性の抗−ｐ１８５ｎｅｕｍＡｂｓの組み合わせは、インビボにおける腫瘍のｎｅｕ−過剰発現に対して相乗阻害効果を明らかにした。これらの研究はｍＡｂ−に基づく癌蛋白質特異的治療の可能性を証明した。

抗原−抗体の３次元構造は、結合部位が６つの高可変性相補決定領域（ＣＤＲｓ）ループ構造により規定されるが（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｅ，１９９４）、相互作用の特異性はＣＤＲ３ループにより付与されることを明らかにした。ＣＤＲループのコンフォメーションおよび構造の必要条件は、抗−受容体抗体の配列および構造が公知の場合に小さなペプチドにより模倣できる。

細胞成長および形質転換の阻害は形質転換膠細胞においてｅｒｂＢ受容体のシグナリングを変調することにより達成できる。我々の最近の研究は、アポトーシスの誘導がヒトの癌の首尾良い治療の基礎となるかもしれないことを示す。ｅｒｂＢ需要体シグナリングが切断ｎｅｕ Ｔ６９１のトランスフェクションにより阻害された放射線耐性ヒト膠芽腫細胞はＤＮＡ損傷に応答して増大した成長阻止およびアポトーシスを呈した。ｅｒｂＢシグナリングの阻害はアポトーシスの誘導のための有力な刺激である。ｅｒｂＢ受容体メンバー間の近位の受容体相互作用は、即ち、ＤＮＡ損傷に応答して活性化される細胞周期チェックポイント経路に影響する。よって、ｅｒｂＢ受容体の無能力化はガンマ照射および他の細胞障害性治療に対する応答を改良するかもしれない。

データは、完全なｅｒｂＢシグナリング経路を必要とする放射線耐性ヒト腫瘍細胞が放射線感受性であり、且つアポトーシス経路においてｅｒｂＢシグナリング経路の阻害によるあらゆるＤＮＡ損傷に対するように変わることができることを示唆する。

抗−ｐ１８５ｃ−ｅｒｂＢ−２模倣物、ＣＤＲ４Ｄ５をデザインし、開発し、そして、抗−ｐ１８５ｃ−ｅｒｂＢ−２Ａｂ由来の模倣物ＣＤＲ４Ｄ５がヒトの腫瘍細胞の増殖を阻害してガンマ照射後にアポトーシスを増強することが可能か否かを調査するために使用した。実施した実験は以下のとおりである。
１．ペプチド模倣デザイン
抗−ｅｒｂＢ２抗体、４Ｄ５はｅｒｂＢ２受容体のダウン変調において効果的であることがわかった。ヒト化抗体の結晶構造（１ＦＶＤ）を分析する。４Ｄ５のＣＤＲ３を鋳型として用いた。環状ペプチドのいくつかの類似体を生成した。用いてよいペプチドは以下を含む。

２．細胞系
可変レベルのｐ１８５ｃ−ｅｒｂＢ−２受容体を発現する以下のヒト腫瘍細胞系を用いた：ａ）Ｕ８７ＭＧ（検出不可能なｐ１８５ｃ−ｅｒｂＢ−２）、ｂ）低い変調ｐ１８５ｃ−ｅｒｂＢ−２を発現する親Ｕ３７３ＭＧおよびＴ６９１トランスフェクトされたＵ３７３／Ｔ６９１、ｃ）変調ｐ１８５ｃ−ｅｒｂＢ−２を発現するＭＣＦ７、およびＳＫＢＲ３（高いレベルのｐ１８５ｃ−ｅｒｂＢ−２）。
３．表面ｃ−ｅｒｂＢ−２受容体発現のフローサイトメトリー分析
準コンフルエントな細胞をトリプシンを用いて瞬間処理（＜３分）により回収して、氷上に保存した。細胞を洗浄して、約２ｘ１０６細胞／ｍｌ濃度においてＦＡＣＳバッファー（０．５％ ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）中に懸濁し、そして一次試薬（抗体ｐ１８５ｃ−ｅｒｂＢ−２Ａｂ）および二次（抗−ＩｇＧ−ＦＩＴＣ）試薬と共に３０分間各々４℃においてインキュベートし、各工程定間で２回洗浄した。染色後、細胞をＦＡＣＳバッファー中に懸濁して、直後に分析した。フローサイトメトリー分析はベクトンディッキンソンＦＡＣＳＳｃａｎ上で実施した。陽性ｐ１８５ｃ−ｅｒｂＢ−２細胞系は抗−受容体抗体で染色した細胞系と二次（抗−ＩｇＧ−ＦＩＴＣ）試薬のみで染色した対応細胞系の間の平均チャンネル蛍光の差異により測定した。ｐ１８５ｃ−ｅｒｂＢ−２陽性クローンの均質性は、その軸の周囲の陽性染色細胞集団のピークにより測定した。ＦＡＣＳヒストグラム上では、バックグラウンドピークからかけはなれた陽性ピークの右へのシフトにより、増大した蛍光が示される。高い表面受容体発現はシフトの程度に相関した。各細胞種上の相対的受容体数は平均蛍光強度を公知の受容体コピー数を有する細胞の強度と比較することにより評価される。
４．細胞増殖アッセイ
ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチオアゾール−２−イル）−２，５−ヂフェニルテトラゾリウムブロミド］取り込みにより測定された増殖アッセイ。細胞系を９６ウエルプレート（５，０００細胞／ウエル）中に１０％のＤＭＥＭ中で、示された量の模倣ＣＤＲ４Ｄ５と共にプレートし、そして４８時間インキュベートした。ＭＴＴを４時間細胞に与えた。細胞を５０％ＳＤＳ／２０％ジメチルスルフォキシド中で溶解して、３７℃において一晩放置した。増殖は、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて５７０ｎｍにおいて光学密度をとることにより評価した。このアッセイにおいて使用した細胞の数はこの細胞種の直線範囲内であることが決定された。
５．アポトーシスの形態学分析により決定されたとおりの抗−ｐ１８５ｃ−ｅｒｂＢ−２模倣ＣＤＲ４Ｄ５の放射線感受性化効果
３０，０００細胞を一晩６ウエルのプレート中でカバースリップ上に付着させた。細胞を照射前に５０μｇ／ｍｌの模倣ＣＤＲ４Ｄ５と４８時間インキュベートした。１０Ｇｙの照射を与えて、細胞を３７℃においてインキュベートした。核の形態は以下の時間点：照射後１２、２４、４８および７２時間において評価した。カバースリップは示された時間において２回ＰＢＳで洗浄し、そして５０：５０ミックスの氷冷メタノール／アセトン中で１分間固定した。固定した細胞は、次に、ＰＢＳ中０．２５ｎｇ／ｍｌの濃度の４’，６’−ジアミディノ−２−フェニルインドールジヒドロクロリド水和物（ＤＡＰＩ）（シグマ、セントルイス、ＭＯ）で染色し、そして直接の計数を用いてアポトーシス核の形態学上の評価を決定した。アポトーシス計数の観察者間の一致は、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ−媒介ｄＵＴＰ末端標識（ＴＵＮＥＬ）−染色を用いて、且つ３つの個別の観察者の分析により確認した。

細胞の計数は染色の３０分以内に実施して、ツアイスアクシオプランエピフルオレッセンス顕微鏡上で写真を撮った。１００細胞の少なくとも３つの個別の視野を各サンプルに関して計数した。
結果
１．表面ｃ−ｅｒｂＢ−２受容体の発現
フローサイトメトリー分析を用いることにより、ヒト腫瘍細胞上の表面ｐ１８５ｃ−ｅｒｂＢ−２受容体発現を測定した。表面ｃ−ｅｒｂＢ２受容体の発現はＳｋＢＲ３において最高であり、ＭＣＦ７において中度であり、Ｕ３７３ＭＧにおいて低い中度であり、そしてＵ８７ＭＧにおいて検出されなかった。ＳＫＢＲ３の平均蛍光は対照の５０倍であり、ＭＣＦ７，Ｕ３７３ＭＧ，およびＵ８７ＭＧのそれは、対照のそれぞれ６．５、２及び１倍であった。
２．増殖の阻害
ＣＤＲ４Ｄ５処理は、投薬量依存性様式および表面ｐ１８５ｃ−ｅｒｂＢ−２受容体密度逆依存性様式において腫瘍細胞増殖を阻害した。ＣＤＲ４Ｄ５はｃ−ｅｒｂＢ２非発現Ｕ３７３ＭＧ親細胞の増殖を阻害せず、そしてＵ３７３／Ｔ６９１は１μｇの模倣ＣＤＲ４Ｄ５で６２％阻害された。ＭＣＦ７およびＳＫＢＲ３細胞の増殖は投薬量依存性養成期においてそれぞれ４３％−５３％、および３９％−４９％阻害された。
３．抗ｐ１８５ｃ−ｅｒｂＢ−２模倣物ＣＤＲ４Ｄ５の放射線感受性化効果
全ての細胞においてアポトーシスは照射後７２時間であった。Ｕ３７３ＭＧ細胞上の模倣ＣＤＲ４Ｄ５処理は照射４８時間後および７２時間後に非処理のＵ３７３ＭＧよりも２０−２８％多いアポトーシスをもたらした。Ｕ３７３ＭＧ細胞内のアポトーシスに対するＣＦＲ４Ｄ５の効果は、ｅｒｂＢシグナリングを無能力化して照射に応答したアポトーシスを誘導する阻害性受容体変異体である切断したｎｅｕを用いて得られた結果に匹敵した。ＣＤＲ４Ｄ５の顕著な放射線感受性化効果はＭＣＦ７およびＳＫＢＲ３細胞系において照射から７２時間後に同じく観察された（図６Ｂ）。表面ｐ１８５ｃ−ｅｒｂＢ−２受容体レベルとアポトーシス性細胞死に対する感受性が逆に相関したので、表面ｃ−ｅｒｂＢ２受容体発現の量に従ってＣＤＲ４Ｄ５の量を増加させることが上記効果を改良するべきである。

この４Ｄ５模倣物は約１．５ＫＤのサイズの小ささであり、プロテアーゼ耐性ペプチドであり、ヒト表面ｐ１８５ｃ−ｅｒｂＢ−２受容体に特異的であり、完全長の抗体よりも低い抗原性である。該４Ｄ５模倣物は、癌の診断および治療における抗受容体模倣物の使用を例示し、ガンマ照射のような細胞障害性治療と組み合わせて相乗効果を生じるはずである。

Claims (1)

1. ｅｒｂＢ蛋白質に特異的な抗体の、ｅｒｂＢ蛋白質媒介性腫瘍を有する個体の組み合わされた治療のための医薬の製造における使用であって、上記組み合わされた治療は、上記医薬を抗癌照射と共に個体に投与することを含み、上記のｅｒｂＢ蛋白質に特異的な抗体は、ｅｒｂＢ蛋白質に結合することにより腫瘍細胞中で上昇したチロシンキナーゼ活性を生じるｅｒｂＢ蛋白質ダイマーの形成を阻害し、上記阻害が腫瘍細胞に対して増殖抑制作用を有し、そして抗癌照射が抗体の投与の後に施される、上記使用。

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