JP2011529467A - グリオーマの治療のためのｃｄｋ阻害剤の使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、悪性グリオーマ、特にグリオブラストーマの治療に使用するための、血液脳関門を通過可能な低分子量ＡＴＰ競合的ＣＤＫ阻害剤を提供する。この化合物は、細胞毒性または細胞分裂阻害性剤および電離放射線から成る群から選択される１つ以上の薬剤と共に投与できる。

Description

本発明は、血液脳関門を通過可能な低分子量ＡＴＰ競合的ＣＤＫ（サイクリン依存性キナーゼ）阻害剤の使用によるグリオーマ患者の治療に関する。

悪性グリオーマは、高度に浸潤性であり、神経学的に破壊性の腫瘍であり、この最も高悪性度の症状はグリオブラストーマである。「グリオーマ」という用語は、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、乏突起星状細胞腫、および上衣腫を含む癌のグループを包含する。グリオーマの分類およびグレード付けのために最も汎用されているスキームは、Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎにおけるものであり、ここでグリオーマは、星状、乏突起または上衣細胞の特徴を示すかどうかという、仮定された分化系列に従って分類される。これらは、悪性度の程度に従ってＩからＩＶのスケールでグレード付けされる。グリオブラストーマ（ＧＢＭ）は、グレードＩＶの未分化星状細胞腫として分類される。

グリオブラストーマは、成人における最も一般的な原発性脳腫瘍である。毎年米国において悪性原発性脳腫瘍と診断された１８，０００人の患者のうち半数以上がＧＢＭを有する。ＧＢＭは、高い増殖指数、微小血管増殖および限局的壊死を伴う未分化の細胞密度の高い腫瘍である。兆候および症状は、幾つかの因子（大きさ、成長速度、脳内における腫瘍の限局化）に依存し、主に頭痛、発作、神経障害、精神状態の変化によって現れる。ＧＢＭ予後には憂鬱が残る。大多数の患者の生存期間は、２年未満である。カルノフスキー・パフォーマンス・ステータス（ＫＰＳ）は、最も重要な予後因子の１つである：ＫＰＳ＞７０の患者は、１８カ月目での生存が、ＫＰＳスコアがより低い患者で１３％であるのに対しておよそ１８％である。原発性ＧＢＭは、グリア細胞から新たに発達し、通常６カ月未満の臨床歴を有し、老齢の患者により一般的であり、小さい細胞組織像を示す。続発性ＧＢＭは、既存の低いグレードの星状細胞腫から数カ月または数年にわたって発症し、若年層に優位に影響し、巨大な細胞組織像を示す。

グリオーマの分子生物学は、この疾患の発症に関して新しい洞察を提供し、分子標的治療による細胞シグナル経路における調節障害を制御することは、新しい最先端治療である。

複数の遺伝的変化が原発性および続発性ＧＢＭの発症に関与し、同じ遺伝的経路が原発性および続発性腫瘍の両方において破壊される。

ＧＢＭの病変形成に関与する主要な経路は２つある［Ｒｉｃｈ ＪＮ，Ｂｉｇｎｅｒ ＤＤ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ２００４；３（５）：４３０−４６］。第１は、チロシンキナーゼ成長因子受容体によって媒介されるシグナル伝達経路である：ｒａｓ−ＭＡＰキナーゼシグナル伝達カスケードはほぼすべてのＧＢＭにおいて活性化され、ＡｋｔはＧＢＭの約７０％にて活性化される。実際、多くのチロシンキナーゼ受容体の増幅も報告されている［Ｐｕｐｕｔｔｉ Ｍ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００６；４（１２）：９２７−９３４］。

この病理学、ならびに多くの他のヒトの癌において頻繁に破壊される第２の経路は、ＲＢ−ＣＤＫ−ＣＤＫＩ（サイクリン依存性キナーゼ阻害剤）調節回路である：ＩＮＫ４Ａ（ｐ１６としても知られる。）の欠損はＧＢＭの４０から５７％で検出され、腫瘍抑制因子網膜芽細胞腫（ＲＢ）の欠損はＧＢＭの１４から３３％にて確認されている。全体として、ＩＮＫ４Ａ／ＣＤＫ２／ＲＢにおける変異は、ＧＢＭの８０％超過および未分化星状細胞腫の５０％で検出されている［Ｚｈｕ Ｙ ａｎｄ Ｐａｒａｄａ ＬＦ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ２００２；２：６１６−６２６］。

ＧＢＭに対する現在の治療上の選択肢としては、手術、放射線治療および化学療法が挙げられる。最も汎用されている薬物は、カルムスチン、ロムスタチン、ビンクリスチン、プロカルバジン、カルボプラチン、エトポシドおよびイリノテカンである。これらの薬物を用いるネオアジュバントまたはアジュバント療法は、無病生存率を延ばすが、全生存率延ばすのではないことがわかった。

現在、テモゾロミド（ＴＭＺ）および放射線治療（ＲＴ）の併用が新たにＧＢＭと診断された患者のための新しい標準ケアとなっており、それによりＲＴ単独の場合と比較して生存率において臨床的に有意義な改善が見られる（中間生存期間がＲＴ単独で処置された患者に関しては１２カ月であるのに対してＴＭＺ／ＲＴで治療された患者に関しては１５カ月；２年生存率はＲＴ群では１０％であるのに対してＴＭＡ／ＲＴ群に関しては２６％）。

Ｒｉｃｈ ＪＮ，Ｂｉｇｎｅｒ ＤＤ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ２００４；３（５）：４３０−４６ Ｐｕｐｕｔｔｉ Ｍ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００６；４（１２）：９２７−９３４ Ｚｈｕ Ｙ ａｎｄ Ｐａｒａｄａ ＬＦ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ２００２；２：６１６−６２６

ＴＭＺの導入が成功しているにもかかわらず、臨床医は、グリオーマに対して有効な新規薬剤の開発のためにさらなる研究を是認することで一致している。実際、グリオーマの治療のための新規で強力な薬剤に対する医学的必要性は依然として満たされないままである。本発明はこの問題に対処する。

本発明は、ＣＤＫの阻害およびチロシンキナーゼ成長因子受容体が媒介するシグナル伝達経路の阻害により、グリオーマ病変形成が関与する主要な２つの経路を阻害でき、グリオーマ増殖を阻害するのに有効な、血液脳関門を通過できる低分子量化合物を提供する。

所望の活性を示す本発明の化合物は、プロテインキナーゼのＡＴＰポケットを標的にするように設計されたピラゾロキナゾリンである。この化合物は、ＣＤＫの強力なＡＴＰ競合的阻害剤であることがかわった。予期せぬことに、この化合物は、ＴＲＫＡ（トロポミオシン受容体キナーゼＡ）に対して顕著な阻害能を示すことを見出した。さらに、この化合物は多量で脳に進入できることがわかった。

この生物学的活性の観点において、本発明の化合物は、グリオーマを患う患者集団のための治療の開発に新しい方針を提供する。

第１の態様において、本発明は、悪性グリオーマをの治療方法に使用するための、式（Ｉ）の化合物、またはこれらの医薬的に許容される塩に関する。

本明細書で用いられる「悪性グリオーマ」または「グリオーマ」という用語は、星状細胞腫（特に、グリオブラストーマ）、乏突起神経膠腫、乏突起星状細胞腫、上衣腫、ならびに混合性膠細胞神経細胞腫瘍（神経細胞ならびに膠細胞成分を示す腫瘍、例えば神経節膠腫、胚芽異形成性神経上皮腫瘍（ｄｙｓｅｍｂｒｙｏｐｌａｓｔｉｃ ｎｅｕｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｔｕｍｏｒ））および神経細胞を起源とする腫瘍（例えば、神経節細胞腫、中枢性神経節細胞腫（ｃｅｎｔｒａｌ ｇａｎｇｌｉｏｃｙｔｏｍａ））を含む。

本発明の好ましい実施形態において、上記で定義された式（Ｉ）の化合物は、グリオブラストーマ（ＧＢＭ）の治療方法に使用される。

式（Ｉ）の化合物は、化学名８−［４−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−１，４，４−トリメチル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｈ］キナゾリン−３−カルボン酸メチルアミドを有する。これは、ＷＯ２００４１０４００７に記載されているように調製でき、プロテインキナーゼ阻害活性が賦与され、従って抗腫瘍剤として治療に有用である。特に、式（Ｉ）の化合物の好ましい調製は、上述の国際特許出願の実施例５８に記載されているものである。

式（Ｉ）の化合物の医薬的に許容される塩としては、無機または有機酸、例えば、硝酸、塩酸、臭化水素酸、硫酸、過塩素酸、リン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、イセチオン酸、サリチル酸などとの酸付加塩が挙げられる。

式（Ｉ）の化合物の、可能な異性体およびこれらの混合物のすべて、ならびに代謝産物および医薬的に許容されるバイオ前駆体（プロドラッグと称されることもある。）の使用は、特許請求された発明の範囲内である。プロドラッグは、式（Ｉ）に従う活性な親薬物をインビボで放出するいずれかの共有結合化合物である。

式（Ｉ）に従う化合物の治療的に有効な量を、疾患または望ましくない状態を有している被験者に関して、この化合物による治療によって利益を受けるであろうと判定される場合に、この被験者に投与できる。医療または臨床関係者は、被験者における疾患または状態の診断の一部として判定を行うことができる。化合物はまたこうした状態の予防にも使用でき、これは１つ以上の状態を有する被験者の確立を低減すると見なすことができる。

本明細書で使用される「治療的に有効な量の」化合物とは、意図する目的を達成するのに十分な量を指す。有効量の決定は、所望の作用の達成に基づいて十分当業者の能力の範囲内である。有効な量は、これらに限定されないが、被験者の大きさおよび／または被験者が患う疾患または所望でない状態が進行した程度を含む因子に依る。有効な量は、化合物が、単一投与にてまたは経時的に周期的に被験者に投与されるかどうかにも依る。

本発明の式（Ｉ）の化合物は、被験者の治療を目的とする。本明細書で使用される「被験者」という用語は、哺乳類および非哺乳類を包含する。哺乳類の例としては、哺乳類に分類されるメンバーのいずれか；ヒト、非ヒト霊長類、例えばチンパンジー、および他の類人猿およびサル種；家畜、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ；ペット、例えばウサギ、イヌおよびネコ；げっ歯類を含む実験動物、例えばラット、マウスおよびモルモットなどが挙げられるが、これらに限定されない。非哺乳類の例としては、トリ、魚などが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「治療する」という用語は、治療的な利益を達成することを含む。治療的な利益とは、治療される基礎障害の根絶または寛解を意味する。例えば、癌患者において、治療的利益は、基礎の癌の根絶または寛解を含む。また、治療的利益は、基礎障害と関連する１つ以上の生理学的症状を根絶または寛解して達成され、患者が基礎障害によってなおも苦しめられ得るという事実にもかかわらず、それにより患者に改善が見られる。

本発明の別の目的は、悪性グリオーマの治療方法に使用するための、上記で定義された式（Ｉ）の化合物と、（ｂ）細胞毒性または細胞分裂阻害性の化学剤および電離放射線から成る群から選択される１つ以上の抗悪性腫瘍剤を含む治療用の組み合わせである。

代表的な細胞分裂阻害または細胞毒性化学剤としては、抗菌タイプの薬剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗微小管剤、ホルモン剤、免疫剤、インターフェロンタイプの薬剤、サイクロオキシゲナーゼ阻害剤（例えばＣＯＸ−２阻害剤）、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、テロメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗成長因子受容体剤、抗ＨＥＲ剤、抗ＥＧＦＲ剤、血管新生抑制剤（例えば、血管新生阻害剤）、フェルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ｒａｓ−ｒａｆシグナル伝達経路阻害剤、細胞周期阻害剤、他のｃｄｋｓ阻害剤、チューブリン結合剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤などが挙げられる。

本発明の特に好ましい実施形態において、細胞毒性または細胞分裂阻害性化学剤はテモゾロミドである。

放射線治療とも称される電離放射線は、癌治療の治療分野において従来から採用されているものであり、結合のイオン化のために十分なエネルギーを有する光子、例えば放射性核からのα−、β−、およびγ−線ならびにＸ線が挙げられる。

本発明はまた、悪性グリオーマの治療に使用するための、医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と混合された上記で定義された式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物に関する。

さらなる実施形態において、本発明に従う医薬組成物は、細胞毒性または細胞分裂阻害性の化学剤および電離放射線から成る群から選択される１つ以上の抗悪性腫瘍剤をさらに含む。特に好ましい実施形態において、化学剤はテモゾロミドである。

本発明の化合物を含有する医薬組成物は、従来の方法に従って通常調製され、好適な医薬品形態において投与される。

例えば、固体の経口形態は、活性化合物と共に、希釈剤、例えばラクトース、デキストロース、サッカロース、スクロース、セルロース、コーンスターチまたはポテトスターチ；潤滑剤、例えばシリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウムおよび／またはポリエチレングリコール；結合剤、例えばスターチ、アラビアガム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはポリビニルピロリドン；崩壊剤、例えばスターチ、アルギン酸、アルギナートまたはスターチグリコール酸ナトリウム；泡立ち混合物；染料；甘味剤；湿潤剤、例えばレシチン、ポリソルバート、ラウリルスルファート；および医薬製剤に使用される一般に非毒性および薬理学的に不活性な物質を含有できる。これらの医薬調製物は、既知の方法、例えば混合、顆粒化、造粒、糖衣またはフィルムコーティングプロセスによって製造できる。

経口投与のための液体分散液は、例えばシロップ、エマルションまたは懸濁剤であってもよい。

例として、シロップは、担体として、サッカロースまたはグリセリンおよび／またはマンニトールおよびソルビトールを伴うサッカロースを含有してもよい。

懸濁剤およびエマルションは、担体の例として、天然ガム、アガー、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはポリビニルアルコールを含有してもよい。

治療用の使用において、式（Ｉ）の化合物は、体表面積で１日あたり約１０ｍｇ／ｍ^２から約６００ｍｇ／ｍ^２の投与レベルで被験者に投与される。約２０ｍｇ／ｍ^２から２００ｍｇ／ｍ^２の投与レベルは、特に好適な範囲を構成する。成人のヒト被験者に対して、１から２８日の連続した日数では、１回用量につき約２０ｍｇから約１０００ｍｇ、より好ましくは１回用量につき約６０ｍｇから約４００ｍｇの投与量が、非限定例として使用されてもよい。投与スケジュールの他の例は：２週間のサイクルの１から７日目においては毎日；４週間のサイクルの連続する３週のうちそれぞれの１から４日目においては毎日；３週間のサイクルの１から１４日目においては毎日：４週間のサイクルの１から７日目および１５から２１日目においては毎日である。

本明細書に開示された用量よりも低いまたは高い用量を必要により使用してもよい。しかし、こうした投与量は、使用される化合物の活性、治療されるべき状態、投与方法、治療計画、個々の被験者の要件、治療される状態の重症度、開業医の判断に限定されないが、これらの多数の変数に依って変更できる。前述の範囲は、個々の治療計画に関する変数の数が大きい場合は単に示唆的なものであり、これらの推奨された値から大きく外れた値もまれではない。

本発明を良好に例示するために、これを限定することなく、ここで次の実施例を示す。

未治療細胞（Ｃ）および式（Ｉ）の化合物の２つの用量（１および３μＭ）で治療された細胞（Ｔ）におけるタンパク質発現を示す。細胞周期進行（ｃｄｃ６；サイクリンＡおよびサイクリンＢ）の制御ならびにＣＤＫ２の直接基質のリン酸化に関与するタンパク質（ＲＢタンパク質）を分析した。 未治療細胞（Ｃ）および３μＭの式（Ｉ）の化合物で治療された細胞（Ｔ）におけるタンパク質発現を示す。リン酸化ＴＲＫＡ、総ＴＲＫＡタンパク質、リン酸化ｐ４４／４２ＭＡＰＫおよびＡＫＴおよび総ｐ４４／４２ＭＡＰＫの量を示した。 脳内に移植されたグリオーマ株化細胞を保持するマウスの生存率を示す：未治療のマウス（黒線）、式（Ｉ）の化合物で治療されたマウス（破線）。

（実施例）

キナーゼに関するシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）フォーマット
このアッセイにより、試験化合物を用いて得られた特定酵素のキナーゼ活性の阻害を測定できる。異なるキナーゼを並行して試験できる。

ビオチン標識された基質を、γ３３−ＡＴＰトレーサーを含むＡＴＰの存在下で特定のキナーゼによってトランスリン酸化する。次いで、反応の終わりに、リン酸化された基質をストレプトアビジンコーティングされたＳＰＡビーズを用いて捕捉する。高密度５Ｍ ＣｓＣｌ溶液を添加し、この混合物を４時間温置する。これによりＳＰＡビーズは、取り込まれていない放射標識されたＡＴＰを含有するＣｓＣｌ溶液の上部に浮遊する。リン酸化の程度はβ−カウンターを用いて測定する。

これらのアッセイにおいて、式（Ｉ）の化合物は、ＣＤＫ２／サイクリンＡ複合体に対して強力な阻害活性を示し（ＩＣ_５０＝４５ｎＭ）、密接に関連するＣＤＫ、即ちＣＤＫ１、ＣＤＫ４、およびＣＤＫ５に対しても活性を示しただけでなく（それぞれＩＣ_５Ｏ＝３９８、１６０および２６５ｎＭ）、トロポミオシン受容体キナーゼＡ（ＴＲＫＡ）に対しても示した（ＩＣ５０＝５３ｎＭ）。

脳内の式（Ｉ）の化合物レベル
Ｈａｎ Ｗｉｓｔａｒラットを、式（Ｉ）の化合物を６０ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与することにより連続６日間治療した。６日目の投与の２時間および６時間後に動物を屠殺した。脳および血漿を屠殺時に採取した。血液をヘパリン処理したプラスチック管に入れ、氷水浴に保持し、次いで遠心分離した（１０分間、４℃で１２００ｇ）。脳および血漿サンプルを分析時まで−８０℃のフリーザーに保存した。式（Ｉ）の化合物のレベルをＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析した。

式（Ｉ）の化合物の脳レベルは、投与の２および６時間後において、平均で、組織の８８．９および６９．４ナノモル／グラムという結果になった。血漿中の対応するレベルは、それぞれ９．８および８．４ナノモル／ｍＬであった。密度を１に等しいと想定すると、式（Ｉ）の化合物の脳レベルは血漿レベルよりも６．１から９．６倍高い。

式（Ｉ）の［１４Ｃ］標識された化合物のスプラーグ・ドーリー・ラットへの投与後のオートラジオルミノグラフィーによる脳内の放射能分布の決定
式（Ｉ）の［１４Ｃ］標識された化合物（５μＣｉ／ｍｇの比活性、室内で調製された。）を、６匹のオスの白色種ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｉｔａｌｙからのスプラーグ・ドーリー・ラット；投与時の体重２５９から２７３ｇ）への単一の経口投与（マレイン酸塩として２０ｍｇ／ｋｇ、約３．７ＭＢｑ／ｋｇ、放射能線量として１００ｍＣｉ／ｋｇ）により投与した。

動物を投与から２、６および２４時間後に屠殺し（それぞれの選択された時間にて２匹の動物）、化合物に関連する物質の放射能分布を切除後に無処置の脳にて評価した。オートラジオルミノグラフィー方法を使用して、脳内の定量的な放射能分布を評価した。

放射能分布についても、屠殺後の動物から採取した血液および血漿中にて評価した。血液および血漿中の放射能レベルは、液体シンチレーション計数機（ＬＳＣ）によって決定した。

表１は、ラット中の単一経口投与（２０ｍｇ／ｋｇ）後の式（Ｉ）の１４Ｃ標識された化合物の分布を示す。

インビトロでのグリオーマ細胞における式（Ｉ）の化合物の作用
ＳＦ−２６８、ＳＦ−２９５、ＳＦ−５３９およびＵ２５１株化細胞を１０％ＦＣＳおよび２ｍＭグルタミンを添加したＲＰＭＩ１６４０にて培養し、Ｕ−８７ＭＧ株化細胞を１０％ＦＣＳ、２ｎＭグルタミンおよび１％ＮＥＡＡを添加したＥＭＥＭにて培養した。すべての実験に関して、前述の期間において化合物で治療した翌日に、細胞を１×１０^４／ｃｍ^２の密度にて播種し、次いで報告された時間にて回収した。

細胞増殖の阻害
治療の７２時間後に細胞を洗浄し計数した。細胞増殖を、細胞アデノシン三リン酸モニタリングシステムによって決定した。細胞増殖は、コントロール細胞と比較した。５０％まで細胞増殖を阻害する濃度（ＩＣ_５０）を計算した。

ＢｒｄＵ導入分析
ＢｒｄＵ（５−ブロモ−２’デオキシウリジン）を２４時間の治療の最後に最終濃度３０μＭで細胞培地に添加した。細胞をＰＢＳで洗浄し、７０％エタノールで固定して、−２０℃で保存した。分析時に細胞を遠心分離し、ＰＢＳ中１％ＦＣＳで洗浄し、ＨＣｌ ２Ｎにより２０分間ＤＮＡ変性した。Ｎａ_２Ｂ_４Ｏ_７ ０．１Ｍ ｐＨ８．５中での洗浄後、細胞をＰＢＳ＋１％ＦＣＳ中の０．５％Ｔｗｅｅｎ２０の溶液で１５分間温置し、次いで遠心分離した。ペレットを１：１０で希釈された非抱合型アンチＢｒｄＵモノクローナル抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）１５０μｌ中に再懸濁し、室温で１時間温置した。ＰＢＳ中での洗浄後、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０での温置を繰り返した；次いで二次抗体を添加した（１：５０で希釈されたＦＩＴＣ抱合型ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ．））。室温で１時間後、細胞を再びすすぎ、ヨウ化プロピジウムで一晩対比染色し（２μｇ／ｍｌ＋１２．５μｇ／ｍｌＤＮＡｓｅ−遊離ＲＮＡｓｅ）、次いでＦＡＣＳで分析した。

オートファジーを評価するためのアクリジンオレンジ染色
温置の最終１５分の間、アクリジンオレンジ（１μｇ／ｍｌ）を細胞に添加し、次いでこれを回収し、ＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳによってこれらの蛍光発光について分析した。アクリジンオレンジは、生体膜を自由に横断するが、細胞質および核小体にあるときは明緑色および暗赤色の蛍光を発する；オートファジーによって生じる酸性空胞は明赤色に見える。

これらのアッセイすべての結果を表１に報告する。式（Ｉ）の化合物は、試験されたグリオーマ細胞（第１欄）のすべてにおいて活性である：ＩＣ_５０が１．４から５．４μＭの範囲で増殖を阻害できる（第２欄）、３９から９２％の範囲のＢｒｄＵの組み込み阻害として測定されるＤＮＡ合成における作用を有し（第３欄）、細胞の３６から７０％においてオートファジーを誘導できる（第４欄）。この種の腫瘍は、アポトーシスの代わりに化学療法およびγ放射線に応答してオートファジーを優位に行うことが報告されている。

ウエスタンブロット分析による式（Ｉ）の化合物の作用モードの評価
治療された細胞を、ＳＤＳサンプル緩衝液（０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ６．８、５％ＳＤＳ）を添加することによって溶解した。サンプルを９５℃に５分間加熱し、次いでＵｌｔｒａｓｏｎｉｃ ２０００ ＡＲＴＥＫを用いて超音波処理した。溶解した細胞を１３，０００ＲＰＭで１０分間遠心分離した。タンパク質の定量は、ＢＣＡ緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）およびＢＳＡ標準曲線を用いて測定した。ウエルあたり２０μｇのタンパク質抽出物を充填し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル７．５から１０％（ＰＡＧＥ−ＰＬＵＳ ４０％ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ＡＭＲＥＳＣＯ）によって分離した。ゲルを、２５ｍＭのＴｒｉｓＨＣＩ ｐＨ８．３、１９２ｍＭのグリセリンおよび２０％のメタノールを含有する緩衝液中、ニトロセルロースフィルタ（Ｈｙｂｏｎｄ Ａｍｅｒｓｈａｍ）上にブロットした。フィルタを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳ−Ｔ）を含有するＴＢＳ中の５％低脂肪乳中に室温で２時間飽和させ、次いで一次モノクローナルに関して４℃で一晩温置し、続いてＴＢＳ−Ｔ中で洗浄し、二次抗マウス抗体を用いて温置した。結合を、「Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ」Ｐｉｅｒｃｅを用いて視覚化した。

試験された株化細胞すべてにおいて得られた結果は、式（Ｉ）の化合物が、グリオーマ病変形成に関与する主要経路の両方を妨げることができることを示した。事実、Ｒｂ経路の状態から独立したすべてのグリオーマ株化細胞において、細胞周期に関連する標識の減少が認められた。例として図１は、２４時間処理されたＵ２５１細胞中の式（Ｉ）の化合物の２つの用量に関して得られた結果を示す。Ｒｂリン酸化の阻害並びにｃｄｃ６、サイクリンＡおよびＢ１発現の強い阻害は明白である。

チロシンキナーゼ成長因子受容体によって媒介される経路も阻害できる式（Ｉ）の化合物の能力も評価された。ＭＡＰＫおよびＡＫＴ経路の両方において、ＴＲＫＡ受容体のリン酸化および下流タンパク質のリン酸化の阻害が、６時間処理されたＳＦ−５３９細胞中で図２に示されている。

ヒトグリオーマの異種移植モデルにおけるインビボ抗腫瘍効能でのグリオーマ細胞中の式（Ｉ）の化合物の作用
Ｈａｒｌａｎ（イタリア）製のＢａｌｂ，Ｎｕ／Ｎｕのオスのマウスを、紙フィルターカバー、餌、滅菌された床および酸性化水を備えたケージ中に維持した。２．５×１０^６Ｕ２５１ヒトグリオーマ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ製）を胸腺欠損マウスに皮下注射した。式（Ｉ）の化合物は、連続した１０日間の間１日２回（ＢＩＤ）４０ｍｇ／ｋｇの用量にて、１０ｍｌ／ｋｇの容量で経口経路によって投与した。腫瘍成長および体重を３日毎に測定した。腫瘍成長をノギスによって評価した。２つの直径を記録し、腫瘍重量を次の式に従って計算した：長さ（ｍｍ）×幅^２／２。毒性は体重減少を基準にして評価した。

表２に報告される結果は、式（Ｉ）の化合物がヒトグリオーマ異種形成モデルＵ２５１において明らかな抗腫瘍作用を生じたをことを示す。

脳内に移植されたグリオーマ腫瘍モデルにおける有効性
外科手術を受けた動物を、上述のプロトコルの１つに従って麻酔する、即ちケタミン８０から１００ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．＋Ｘｉｌａｚｉｎ：１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．；イソフルオラン：１．５から２％。６から８週齢の胸腺欠損のオスのヌードマウスを麻酔し、定位固定装置に置き、イヤーバーを用い、ヘッドホルダーに優しく固定した。頭部の皮膚を縦方向（耳に対して平行）に切断し、マウスの頭蓋骨を見出す。装置のＸおよびＹ軸コントローラを用いて、ブレグマ（大脳核に注射を行うための正中矢状と前側冠状縫合との交叉点）およびラムダ（小脳に注射を行うための正中矢状縫合と後側冠状縫合との交叉点）をポイント０として同定した。次の座標を装置に設定し、注射ポイントを同定した。ミクロドリルを用いて小さい穴を所望のポイントにあけた。注射直前にハミルトン注射器（通常２から５ｍｌ）を用いて細胞を吸引した（吸引の前に細胞のショートミックスを行い細胞の沈降を回避した。）。穴にポイントを付けることによって、Ｚ軸を０に固定し、注射器を右座標（−３．０ｍｍの深さ）に到達するまで脳内に優しく挿入した。Ｕ２５１細胞を毎分１μｌの速度で注射した。注射器をさらに５分間穴に放置した後、細胞吸引を避けるために取り除いた。ボーンワックスを用いて穴を塞ぎ、創傷を無菌のオートクリップで閉じた。手術の終了後、完全に目覚めるまでの回復に関してマウスをモニターした。

図３に報告された結果は、式（Ｉ）の化合物を４０ｍｇ／ｋｇ ｂｉｄ ＯＳの用量で治療された脳内移植ヒトグリオーマモデルを保持するマウスは、ビヒクル処理されたコントロールマウスに比べて生存時間が３０％増大することを示している。

Claims (8)

1. 悪性グリオーマを治療するための方法に使用するための、式（Ｉ）
   

   

   の化合物、またはこれらの医薬的に許容される塩。
2. 悪性グリオーマがグリオブラストーマである、請求項１に記載の化合物。
3. 悪性グリオーマを治療するための方法に使用するための、請求項１に定義される式（Ｉ）の化合物および（ｂ）細胞毒性または細胞分裂阻害性の化学剤および電離放射線から成る群から選択される１またはこれ以上の抗悪性腫瘍剤とを含む治療の組み合わせ。
4. 化学剤がテモゾロミドである、請求項３に記載の治療の組み合わせ。
5. 悪性グリオーマがグリオブラストーマである、請求項３および４のいずれか一項に記載の治療の組み合わせ。
6. 悪性グリオーマの治療に使用するための、医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と混合されて請求項１に定義される式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物。
7. 悪性グリオーマを治療するための方法に使用するための、細胞毒性または細胞分裂阻害性の化学剤および電離放射線から成る群から選択される１またはこれ以上の抗悪性腫瘍剤をさらに含む、請求項６に記載の医薬組成物。
8. 化学剤がテモゾロミドである、請求項７に記載の医薬組成物。