JP2011527429A - 結腸直腸癌のインビトロ診断のためのプロテインジスルフィドイソメラーゼ・アッセイ方法 - Google Patents
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Abstract
Description
・このテストの主な欠点は、あまり良くない感受性であり、それは最もアデノーマ(前癌の形成異常病変)で顕著であり、そのサイズが大きい場合は、10のうち1の場合で癌の進行に結果としてなる。
・また、このテストはあまり特異的でない。糞便中の血液の出現は、潰瘍性大腸炎、痔核、瘻などの非腫瘍症状に関連する可能性がある。この場合、結腸鏡検査法による検査を行わなければならないが、以下に記載されている欠点を伴う。
・最後に、Hemoccult(登録商標)テストは解釈するのが困難である;従って、それらは資格のある適格なスタッフによって、専門施設で調べられなければならない。
CEAはフォローアップのために使われている。それは、感受性と特異性が不十分であるので、結腸直腸癌のスクリーニングに、又は早期診断のために使用できない。これは、このマーカーが他の種類の癌によって及び良性病変において発現されるためである。いろいろあるけれども、CEAと他の腫瘍マーカー(例えばCA19-9またはCA72-4)を組合わせることによって、特異性を失うことなしに感受性を増すことが可能である。
・Colopath(登録商標)/ColorectAlertMD(Ambriliaによって市販されている)は、CRCのための迅速で、比較的非侵襲的スクリーニングテストである。Colopath(登録商標)は結腸直腸の病的状態をもつ個体の直腸の粘液のプラスマローゲン(リン脂質の部分である複合脂質のクラス)を検出し、ColorectAlertMDは直腸の粘液のT抗原、複合糖類を検出する。Colopath(登録商標)/ColorectAlertMDテストは試験片に直腸の粘液の塗布することを含み、陽性または陰性の結果はシッフ反応に基づく。Ambriliaは1787個体を研究して、Colopath(登録商標)/ColorectAlertMDは早期ステージ結腸直腸癌の54%のケース及び全ステージを合わせて49%を検出することを証明した。
・COLARIS(Myriad Geneticsによって市販されている)は、血液で、遺伝性非腺腫性大腸癌(HNPCC症候群)をスクリーニングするためにMLH1及びMSH2遺伝子の突然変異を検出するテストである。試験の結果は3週で入手できる。Myriadは現在利用可能な最も感受性があり及び最も特異的なシークエンシング技術を使用する。当該テストは、高価である。
・DR-70(登録商標)(AMDLによって市販されている)は、様々な種類の癌(肺、結腸、胸部、肝臓、胃、その他)を検査するテストである。従って、CRCに特異的でない。当該テストの原理は、二重サンドイッチELISA技術(DR-70抗原の分析)に基づく。検出は、酵素反応(ビオチンとストレプトアビジンに結合する抗体)によって実施される。着色した反応は、癌の存在を示す。
また、本発明は、結腸直腸癌に関する早期診断、スクリーニング、フォローアップ治療、予後診断、及び再発診断の両方のための当該方法の使用に関する。
「エピトープ」なる用語は、配列番号1から3の配列によって定義された配列を少なくとも有するペプチドであって、配列の両端に、均一に又は不均一に、あるいは一方の端だけに分布する多くとも10、8、6又は4の付加アミノ酸及びそのアナログ及びホモログを意味することを目的とする。
通常は、「アナログ」なる用語は、修飾が抗原反応性を破壊しない限り、天然分子に比較して、1又は複数のアミノ酸付加、(一般に自然には保守的な)置換および/または欠失を示す天然ポリペプチド構造及び配列を有するペプチドに関する。特に好まれるアナログは、本来は保守的な置換、すなわちアミノ酸ファミリーで起こる置換を含む。特に、アミノ酸は4系統、すなわち(1)アスパラギン酸及びグルタミン酸のような酸性アミノ酸、(2)リジン、アルギニン及びヒスチジンのような塩基性アミノ酸、(3)アラニン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン及びトリプトファンのような無極性アミノ酸、及び(4)グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン及びチロシンのような非電荷極性アミノ酸に、一般に分割される。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、時には芳香族アミノ酸に分類される。例えば、ロイシンをイソロイシンと又はバリンと、アスパラギン酸をグルタミン酸とあるいはスレオニンをセリンとそれぞれ置換すること、またはあるアミノ酸を構造的に関連がある別のアミノ酸と類似した保守的な置換をすることは、生物学的活性におおきな影響を及ぼさないことが合理的に予測されうる。当業者は、当該分野で周知のHopp/WoodsおよびKyte−Doolittleプロットを参照することにより、変化を許容し得る、目的の分子の領域を容易に決定し得る。
「PDIの三次元構造において近い芳香族アミノ酸を伴う、配列番号2の配列を有するエピトープ」なる表現は、エピトープが由来するタンパク質の2つの別個の部分、すなわち配列番号2の配列及びタンパク質の三次元構造において近い(1つの)芳香族アミノ酸から構成されるエピトープを意味することを目的とする。抗体はこれらの2つの部分を有するエピトープを認識する。
「結腸腫瘍による放出」なる表現は、機構を問わず、腫瘍細胞自身による、又は腫瘍の進行から生じている細胞表現型の病変または変化に続く隣接非腫瘍細胞による腫瘍マーカーの能動的または受動的な分泌、放出を意味することを目的とする。
− グループA:白血球エラスターゼ・インヒビター、エズリン、アミノアシラーゼ1、肝臓脂肪酸結合タンパク質、腸脂肪酸結合タンパク質、アポリポタンパク質AI、アポリポタンパク質AII及びI−プラスチン、これらのマーカーのいくつかは新規マーカーであることが本出願人によって同定されている、
− グループB:付加的な診断の興味を有するマーカー、すなわち:β2-ミクログロブリン、プロテアソーム20S、ガレクチン-3、L-乳酸脱水素酵素B鎖、カルレティキュリン、再生膵島由来タンパク質3α、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー1、II型ケラチンCytoskeletal8、I型ケラチンCytoskeletal18、I型ケラチンCytoskeletal19、上皮カドヘリン、CEA、ビリン、CA19-9、CA242、CA50、CA72-2、テストステロン、TIMP-1、Cripto-1、インテレクチン-1、サイトケラチン20、翻訳的に制御された腫瘍タンパク質、(プロ)デフェンシン-A5、メチル化プロフィールについて特異的な修正を有する血液のDNA断片の検出、例えばAXL4遺伝子のメチル化DNA(aristaless様ホメオボックス4遺伝子メチル化)またはセプチン-9遺伝子のメチル化DNA、糞便DNA断片の特異的な修正の検出、例えば糞便DNAの特異的な変異、糞便DNAのメチル化プロフィールの特異的な修正、ヒト糞便のヘモグロビンの決定。
I-プラスチンマーカー(Swiss Prot No.Q14651、別名腸特異的プラスチン又はプラスチン1)は、3つの代表例、I-プラスチン、L-プラスチン及びT-プラスチンが知られているヒトのプラスチンのファミリーに属する。一部の研究者はプラスチン類を「フィンブリン」と呼ぶが、他の研究者はフィンブリンの名をI-プラスチンのために残している。プラスチンは、アクチンに結合し、それにより細胞骨格(細胞の骨格)を形成するタンパク質である。それらは、真核生物進化の全体にわたって比較的よく保存されている70kDaのタンパク質である。それらは強い組織特異性を呈し、一度に一つのイソフォームのみが正常組織に存在する(文献30)。癌に関するプラスチンの使用は特許US-A-5360715にすでに記載されており、細胞が造血性または潰瘍性、すなわち癌性であるかどうかを決定する方法を提案する。この方法は、細胞レベルのL-プラスチン及びT-プラスチンのアッセイ、より具体的にはそのmRNAのアッセイを請求する。しかしながら、これらの特性にもかかわらず、従来の研究には、血清または糞便試料を使用した結腸直腸癌の診断に関してプラスチンの重要性を評価することを実施するものはなかった。さらにまた、I-プラスチンは、潜在的癌マーカーとしてこれまで想定さえされなかった(文献31)。一方で、出願人は、驚くべきことに、このタンパク質が結腸直腸癌を有する患者から採取される生物試料であって、腫瘍から離れているか又は離れていない前記試料において、優良なマーカーであることを示した。
もちろん、本発明の方法は、また、同じアッセイにおいて、PDI、グループBから選択される少なくとも1つの腫瘍マーカー、及びループAから選択される少なくとも1つの腫瘍マーカーの検出を実施することができる。
ビリンは、特許出願FR2581456において、結腸直腸癌の診断のための血液マーカーとして記載された。
正常な患者で決定される基準値と比較して、グループBから選択される腫瘍マーカーの濃度は、考慮されるマーカーに応じて、本発明の方法が実施される生物試料において増減される。
好ましくは、グループBの腫瘍マーカーは、マーカー:β2-ミクログロブリン、プロテアソーム20S、ガレクチン-3、L-乳酸脱水素酵素B鎖、カルレティキュリン、再生膵島由来タンパク質3α、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー1、上皮カドヘリン、CEA、CA19-9、テストステロン、TIMP-1、インテレクチン-1、サイトケラチン20、翻訳的に制御された腫瘍タンパク質、(プロ)デフェンシン-A5、及びヒト糞便のヘモグロビンの検出から選択される。
常にタンパク質の形態で検出できるPDIとは対照的に、PDI以外の興味がある腫瘍マーカーは、タンパク質の形態で、またはメッセンジャーRNAの形態で、または対応するDNAの修正(突然変異またはメチル化の修飾)によって検出される。
生物試料において、興味がある「タンパク質」腫瘍マーカーの存在の決定は、当業者に知られている試料におけるタンパク質の存在を決定する任意の方法、例えばイムノアッセイを含む生化学検査によって、または質量分析法によって行われることができる。
生化学検査は、分子相互作用、すなわち前記腫瘍マーカーと前記腫瘍マーカーに特異的あるいは非特異的な一つ以上の結合性パートナーとの間の反応を含む当該分野の当業者に知られている任意のテストであってもよい。
好ましくは、生化学検査は、当業者に知られているイムノアッセイであり、腫瘍マーカー間の免疫反応を含み、それは抗原と一つ以上の特異的な結合性パートナー、すなわち、この抗原に向かう抗体である。
次に、このように得られる細胞の異種混合物を使用して、特定の抗体を産生し、際限なく増殖することができる細胞の選抜を実施する。各々のハイブリドーマは、クローンの形で繁殖し、例えばELISAによって、一次元あるいは二次元のウエスタンブロットによって、免疫蛍光法によって、またはバイオセンサーによって、前記腫瘍マーカーに関する認識特性が試験されてもよいモノクローナル抗体の産生に結果としてなる。特に、上で記載されているアフィニティークロマトグラフィ技術によれば、このように選択されたモノクローナル抗体は続いて精製される。
また、モノクローナル抗体は、当業者によく知られている技術によって、遺伝子工学によって得られた組換え抗体であってもよい。
抗白血球エラスターゼ・インヒビター抗体の例は知られおり、特にAbcamカタログのウサギ抗-LEIポリクローナル抗体(Cat.No.Ab47731)が入手できる。抗-LEIモノクローナル抗体(クローンELA-1)は、R.Yasumatsu等(文献61)の論文に記載されている。
抗-エズリン抗体の例は知られており、特にAbcamカタログの抗-エズリン・モノクローナル抗体のクローン3C12(Cat.No.Ab4069)及びウサギ抗-エズリン・ポリクローナル抗体(Cat.No.Ab47418)が入手できる。
抗-アミノアシラーゼ1抗体の例は知られており、特にAbnovaカタログの抗-アミノアシラーゼ1モノクローナル抗体のクローン4F1-B7(Cat.No.H00000095-M01)及びAbcamカタログのチキン抗-アミノアシラーゼ1ポリクローナル抗体(Cat.No.Ab26173)が入手できる。
抗-肝臓脂肪酸結合タンパク質抗体の例は知られており、特にAbcamカタログの抗-L-FABPモノクローナル抗体のクローン6B6(Cat.No.Ab10059)及びウサギ抗-L-FABPポリクローナル抗体(Cat.No.Ab7807)が入手できる。
抗-腸脂肪酸結合タンパク質抗体の例は知られており、特にR&Dシステムカタログの抗-I-FABPモノクローナル抗体のクローン323701(Cat.No.MAB3078)及びAbcamカタログのウサギ抗-I-FABPポリクローナル抗体(Cat.No.Ab7805)が入手できる。
抗-アポリポタンパク質AI抗体の例は知られており、特にBiodesign Meridian Life Sciencesカタログの抗-Apo AIモノクローナル抗体のクローン4A90(Cat.No.H45402M)及びヤギ抗-Apo AIポリクローナル抗体(Cat.No.K45252P)が入手できる。
抗-アポリポタンパクAII抗体の例は知られており、特にUS Biologicalカタログの抗-Apo AIIモノクローナル抗体のクローン1402(Cat.No.A2299-31C)及び特にBiodesign Meridian Life Sciencesカタログのヤギ抗-Apo AIIポリクローナル抗体(Cat.No.K74001P)が入手できる。
抗I-プラスチン・ポリクローナル抗体の例は知られており、特にサンタクルスバイオテクノロジーカタログにおいて入手できる。ウサギ・ポリクローナル抗体H 300(Cat.No.sc-28531)はI-、L-及びT-プラスチンと反応する。本出願人はI-プラスチンに対するモノクローナル抗体を開発した。
抗-β2ミクログロブリン抗体、抗-CEA抗体、抗-CA19-9抗体及び抗テストステロン抗体の例が知られており、特に出願人のアッセイキット、それぞれVidas(登録商標)β2-ミクログロブリン、Vidas(登録商標)CEA、Vidas(登録商標)CA19-9TM及びVidas(登録商標)テストステロンが使用される。
抗プロテアソーム20Sの抗体の例は知られており、親和性研究用製品カタログにおいて特に入手できる。
抗-ガレクチン-3抗体、抗-L-乳酸脱水素酵素B鎖抗体、抗-カルレティキュリン抗体、抗腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー1抗体、抗-II型ケラチンCytoskeletal8抗体、抗-I型ケラチンCytoskeletal18抗体、抗-I型ケラチンCytoskeletal19抗体、抗-上皮カドヘリン抗体、抗-ビリン抗体及び抗-TIMP-1抗体は知られており、特にAbcamカタログにおいて入手できる。
抗-再生膵島由来タンパク質3α抗体の例は知られており、特にDynabioアッセイキット(La Gaude、フランス)が使われる。
抗-CA242抗体、抗-CA50抗体及び抗-CA72-4抗体の例が知られており、特にFujirebioカタログにおいて入手できる。
抗-インテレクチン-1抗体の例は知られており、アレクシス・バイオケミカルズ・カタログの抗-インテレクチン-1モノクローナル抗体のクローンSaly-1(Cat.No.ALX-804-850-C100)及びウサギ抗-インテレクチン-1ポリクローナル抗体(Cat.No.ALX-210-941)が入手できる。
抗プロテインジスルフィドイソメラーゼ抗体の例は知られており、特にAbcamカタログの抗-PDIモノクローナル抗体のクローンRL77(Cat.No.Ab5484)及びウサギ抗-PDIポリクローナル抗体(Cat.No.Ab3672)が入手できる。
抗-サイトケラチン20抗体の例は知られており、特にAbcamカタログにおいて、抗-サイトケラチン20モノクローナル抗体のクローンKs20.8(Cat.No.Ab962)及びウサギ抗-サイトケラチン20ポリクローナル抗体(Cat.No.Ab36756)が入手できる。
抗-TCTP抗体の例は知られており、特にAbnovaカタログにおいて、抗-TCTPモノクローナル抗体のクローン3C7(No.157H00007178-M01)及び抗-TCTPポリクローナル抗体(Cat.No.157H00007178-A01)が入手できる。
抗-デフェンシン-A5抗体の例は知られており、特にサンタクルス生物工学カタログにおいて、抗-デフェンシン-A5モノクローナル抗体のクローン8C8(Cat.No.sc-53997)及びAlpha Diagnosis International 社カタログのウサギ抗-デフェンシン-A5ポリクローナル抗体(Cat.No.HDEFA51-A)が入手できる。
免疫反応、すなわち腫瘍マーカー/結合性パートナー結合の視覚化は、検出(例えば直接的または間接的な方法)の任意の方法によって実施されてもよい。
直接的検出、すなわち標識の包含なしの場合、免疫反応は、例えば表面プラスモン共鳴によって、または導電性ポリマーを有する電極上のサイクリックボルタンメトリーによって観察される。
間接的検出は、関心のある腫瘍マーカー自身の又は「検出試薬」結合パートナーのどちらかの標識によって実施される。後者の場合は、これは競合方法として記載されている。
「標識化」なる表現は、直接的または間接的に検出可能なシグナルを生じることができる標識試薬の付加を意味することを目的とする。
・比色法、蛍光または発光によって検出可能なシグナルを生じる酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β‐ガラクトシダーゼまたはグルコース‐6‐リン酸デヒドロゲナーゼ;
・蛍光または発光化合物、染料のような発色団;
・32P、35Sまたは125Iのような放射性分子、及び
・アレクサまたはフィコシアニンのような蛍光分子
を含む。
これらの間接的な検出システムは、特定の条件下でシグナルの増幅を生じることができる。このシグナル増幅技術は当業者にとって周知であり、本出願人により先の特許出願FR98/10084またはWO-A-95/08000又はChevalier等(文献62)の論文を参照することができる。
使用する標識の種類に応じて、当業者は、標識を視覚化することを可能にする試薬を添加する。
また、質量分析法が、体液において、本発明の方法で求められる腫瘍マーカーを検出するために使用されてもよい。スペクトロメトリーの原理は、当業者に広く知られており、例えばPatterson,S(文献63)に記載されている。
これを行うため、生物試料(前処理されていても、いなくでもよい)は質量分析計に通され、得られたスペクトルは本発明の方法で求められる腫瘍マーカーのそれと比較される。試料の前処理の例は、それを本発明の方法で求められる腫瘍マーカーのための結合パートナーのうちの一つ、例えば本発明の方法で求められる腫瘍マーカーに向かう抗体、を含む免疫捕捉支持体の上に通すことを含む。試料の前処理の他の例は、試料のタンパク質類を互いに分離するための、生物試料の前分画であってもよい。当業者によく知られている技術において、試料中の優勢なタンパク質は、例えば、まず第一に除去されてもよい。
本発明の実施態様によれば、本発明の方法は、2つのモノクローナル抗体を使用し、好ましくは、配列番号3の配列のエピトープに対する少なくとも一つの抗PDIモノクローナル抗体、並びに配列番号1及びPDIの三次元構造において近い1つの芳香族アミノ酸を伴う配列番号2の配列のエピトープから選択されるPDIエピトープに対する少なくとも1つの別のモノクローナル抗体を使用する。より好ましくは、本発明の方法は、配列番号1の配列のエピトープに対する少なくとも一つの抗PDI抗体及び配列番号3の配列のエピトープに対する少なくとも一つの別の抗体を使用する。
生物試料のmRNAの直接的検出は、例えば好ましくはPCRまたはNASBA技術によって増幅後、mRNAに特異的な結合パートナーとのハイブリダイゼーションによって、当業者に知られている任意手段によって実施されてもよい。
「ハイブリダイゼーション」なる表現は、適切な条件下で、2つのヌクレオチド断片が安定且つ特異的な水素結合により互いに結合し、それにより二本鎖複合体を形成することを意図する。これらの水素結合は、相補的塩基アデニン(A)とチミン(T)(またはウラシル(U))(A−T結合と呼ばれる)との間に、または相補的塩基グアニン(G)とシトシン(C)(G−C結合と呼ばれる)との間に形成される。2つのヌクレオチド断片のハイブリダイゼーションは、完全なものでもよい(従って、リファレンスは相補的ヌクレオチド断片または配列である)、すなわちこのハイブリダイゼーションで得られた二本鎖複合体はA−T結合とC−G結合のみを含む。このハイブリダイゼーションは部分的あってもよく(従って、リファレンスは十分に相補的ヌクレオチド断片または配列である)、すなわち、得られた二本鎖複合体は、二本鎖複合体の形成を可能にするA−T結合とC−G結合だけでなく、相補的な塩基に結合しない塩基もまた含む。2つのヌクレオチド断片間のハイブリダイゼーションは、使用する操作条件、特にストリンジェンシーに依存する。ストリンジェンシーは、2つのヌクレオチド断片の塩基組成の観点から、加えて2つのヌクレオチド断片間のミスマッチの程度によって、特に定められる。また、ストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション溶液中に存在するイオン種の濃度及び種類、変性剤の性質と濃度及び/又はハイブリダイゼーション温度のような反応パラメーターに依存する。全てのこれらのデータは知られており、当業者は適切な条件を決定することができる。一般に、ハイブリダイゼーション温度は、ハイブリダイズすることが求められるヌクレオチド断片の長さに応じて、約0.5から1Mの濃度の食塩水中で、約20と70℃との間、特に35と65℃との間にある。mRNAに特異的であるかまたは特異的でない結合パートナーは、このmRNAに結合できる任意のパートナーである。例えば、核酸プローブ、増幅プライマー及びこのmRNAに結合できる他の任意の分子を挙げることが出来る。
この増幅反応は当業者にとって周知であり、以下の技術を特に挙げることができる:
−US特許第4683195号、US4683202、及びUS4800159に記載されている、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)
−特許出願WO91/02818の、NASBA(核酸配列に基づいた増幅)、及び
−US特許第5399491号の、TMA(転写媒介増幅)。
適切な標識は上記の通りある。本発明の目的では、ハイブリダイゼーションプローブは、いわゆる「検出」プローブであってもよい。この場合、いわゆる「検出」プローブは、上記の標識で標識される。この標識の存在のおかげで、所与の検出プローブと検出される転写産物との間のハイブリダイゼーション反応の存在が検出できる。
特に、多数のプローブを固定することができるバイオチップを、支持体として使用してもよい。支持体へのプローブの固定もまた当業者に知られており、直接移動、マイクロ蒸着、インサイツ合成及びフォトリソグラフィーによるプローブの配置を挙げることができる。
生物試料において、興味がある腫瘍マーカーをコードする遺伝子における、DNA修飾又は変異の証明は、試料中におけるDNA修正を決定する任意の方法、すなわち突然変異の直接的検出、又は興味のある遺伝子座のメチル化プロフィールの修正の証明、又は試料中のDNA修正を決定するための、当業者に知られている他の任意の方法によって実施されてもよい。
突然変異を証明するためのストラテジーは、分子生物学的技術に基づいており、DNA抽出、PCR又は他の増幅技術による増幅、ハイブリダイゼーションおよび/またはシークエンシング工程を含む。結腸直腸癌の場合、以下の方法は、糞便DNAの突然変異を検出するために成功裏に使用される:沈殿によるDNA濃縮、磁気ビーズ上の捕捉オリゴヌクレオチドを使用した標的の濃縮、興味がある遺伝子のPCR増幅、点突然変異を同定するための固相シークエンシング(文献66)。欠失は、予想される基準断片と変異した断片のサイズの違いに関して同定された。Imperiale等(文献66)は、K-ras、APCとp53遺伝子に位置する21突然変異のパネルを記載しており、それは浸潤性の癌の16/31を検出することを可能にする。
前述のように、DNA修正は、また、興味がある腫瘍マーカーに対応する遺伝子のメチル化プロフィールの修飾に相当してもよい。メチル化プロフィールの修飾は、低メチル化(メチル化の数が減少する)にまたはハイパー・メチル化(メチル化の数が増加する)に相当してもよい。修正された部分は、興味のある腫瘍マーカーの遺伝子のコード部分に、又は転写プロモーター領域又は転写終止領域のような5’及び3’非コード部分に位置していてもよい。
本発明の方法において、少なくとも2つのマーカーを検出する場合、それらは、例えば異なるイムノアッセイ測定を使用して別々に、あるいはマルチプレックスアッセイにおいて同時に証明されてもよい。
本発明の方法において、異なる性質の2つのマーカー、例えばタンパク質マーカー及びmRNAマーカーが検出される場合、上記の方法から選択される2つの異なる検出方法が使用されてもよい。特許出願WO03/104490に記載したように、それらは同じ検出媒質で、同じ反応条件下で、同時に検出されてもよい。この特許出願に記載されている検出方法の工程は、少なくとも1つの核酸および少なくとも1つの異なる性質の他のリガンドからなる標的分析物を含む試料中のハイブリダイゼーションと免疫反応を同時に検出することを含んでなり:
(i)反応バッファーで希釈された試料の既知の体積量を、前記標的分析物についての捕捉パートナーであって、少なくとも一つの核酸プローブ及び少なくとも1つの抗リガンドを含む前記捕捉パートナーでプレコートした捕捉表面上に置くこと、
(ii)15℃と60℃との間の温度で反応させること、および
(iii)このようにして得られたハイブリダイゼーションと免疫反応を明視化することを含む。
生物試料は、特別な処理を必要としてもよい。なぜなら、それは、本発明の方法で求められる腫瘍マーカーを含んでいるか、あるいは本発明の方法で求められるマーカーを含む循環腫瘍細胞および/または本発明の方法で求められるマーカーを分泌することができる循環腫瘍細胞を含んでいる可能性があるためである。
したがって、本発明のある実施形態によれば、生物試料は、前記液体に含まれる循環腫瘍細胞を分離するために前処理される。
「循環腫瘍細胞を分離する」なる表現は、循環腫瘍細胞が濃縮された細胞分画を得ることを意味することを目的とする。
循環腫瘍細胞を分離するための生物試料の処理は、フロー・サイトメーターの細胞選別によって、フィコール上の濃縮によって、特異的抗体で覆われた磁気ビーズによる濃縮によって、または当業者に知られている特異的な濃縮法の任意の方法によって実行されうる。
本発明の方法で求められる腫瘍マーカーの検出は、次にサイトスピンによってスライド上に循環腫瘍細胞を付着させた後に、例えば本発明の方法で求められる腫瘍マーカーに対する抗体により、これらの細胞の免疫細胞化学的な標識化することによって、生物試料から分離される循環腫瘍細胞を使用して直接的に行うことができる。本発明の方法で求められる腫瘍マーカーの検出は、また、Metezeau等(文献71)に記載されているフローサイトメトリー法を使用して、循環腫瘍細胞において、直接的に実施されてもよい。
これらの条件下では、前記循環細胞は、本発明の方法で求められる腫瘍マーカーを前記細胞内部で遮断することを可能にする条件で処理されることができる。このような処理は、Mathieu等(文献72)によって記載されている。
本発明の方法で求められる腫瘍マーカーの検出は、本発明の方法で求められるマーカーのための結合パートナー特異的な侵入を可能にするために細胞膜を透過可能にようにした後に行われる。
(i)前記細胞の量を前記腫瘍マーカーに特異的な少なくとも一つの結合性パートナーが取り付けられた培養表面の底に置くこと、
(ii)前記腫瘍マーカーが放出又は分泌されるような条件下で前記細胞を培養し、培養表面の底に免疫的に捕捉すること、
(iii)洗浄によって細胞を取り除くこと、
(iv)前記腫瘍マーカーに特異的な少なくとも一つの標識されたコンジュゲートを加えること、および
(v)このように得られた標識を明視化すること
を含む。
腫瘍マーカーの放出または発現のための培養条件は、37℃、湿潤雰囲気下及び5%CO2のような通常の条件である。
また、生物試料が固体試料である場合、腫瘍マーカーの存在は、腫瘍のインビボ、インサイツで証明されてもよい。
インビボの腫瘍において腫瘍マーカーの存在を示すために、当業者に知られている任意のイメージング方法が使用されてもよい。このために、前記腫瘍マーカーの結合パートナーは、イメージング・トレーサーに結合されてもよい。
「結合パートナーをイメージング・トレーサーに結合させる」なる用語は、当業者に知られている任意のイメージング方法によって検出され、直接的または間接的に検出可能なシグナルを生じることができるトレーサーの付加を意味することを目的とする。したがって、トレーサーは、テクネチウム-99のような放射性トレーサーであってもよい。この場合、原発癌または転移癌を有する器官は、腫瘍マーカーとそのトレーサーを結合する。器官によって放出される放射線は、特別なカメラ(例えばガンマ線カメラ)で撮影されうる。計測器は、放射性物質によって生成されるシンチレーションを収集して、これにより器官を視覚化することを可能にする。
本発明の他の方法において、トレーサーは、ポジトロンを放出する放射性物質(フッ素18)を含んでもよい。画像は、それからポジトロンエミッショントモグラフィーシステムによって得られる。
インビボで腫瘍マーカーの検出を可能にする本発明の方法によって、腫瘍マーカー、癌、特に結腸直腸癌を生じている腫瘍マーカーに結合パートナーの結合があった体の部位、更にはそれらの遠隔転移癌と関連しているリンパ節の局在は、視覚化されることができる。
癌細胞だけがPDIを分泌し、この産生は癌の悪性度に依存するので、本発明の方法が早期診断のためと、結腸直腸癌に関するスクリーニング、フォローアップ治療、予後診断及び再発診断のための両方に用いられることができる。それは本発明の別の課題を構成する。
更には、配列番号1、配列番号2及び配列番号3の配列を有する本願に記載のエピトープは新規であり、本発明の別の主題となるものである。
1. cDNA増幅とクローニング
FCS(ウシ胎仔血清)なしに、Caco-2結腸直腸癌株を、2mMのL-グルタミンを含むDMEM培地中で培養した(全てギブコ)。
LEI、L-FABP及びGal-3遺伝子のクローニングの場合、メッセンジャーRNAを、インビトロゲンFastTrack2.0キット(Cat.No.45-0019)を使用して、108のCaco-2細胞のペレットから、製造業者によって供給されたプロトコルに従って抽出した。逆転写とPCR工程は、プラチナTaq DNAポリメラーゼ酵素を使用しているスーパースクリプトIII ワンステップRT-PCRシステム・キット(インビトロゲン Cat.No.12574-018)で、製造業者によって供給されるプロトコルに従って、450ngのCaco-2 mRNAを使用する一工程で実施した。遺伝子増幅のために使用するPCRプライマーを、表1に示す。
表1
得られたDNA断片は、Bsm BI及びXbaIで消化後、TAクローニング・キット(インビトロゲンCat.No.K4520-01)のベクターpCR2.1 TOPO(LEI及びGal-3)又はOrigene社のベクターpCMV6-XL4(L-FABP)にクローニングした。プラスミドは、cDNAが実際に期待される配列に合うことを確認するために配列決定された。
アミノアシラーゼ1をコードする遺伝子のクローニングの場合は、キアゲンのRNA Easy Miniキットを使用して、製造業者によって供給されるプロトコルに従って、108のCaco-2細胞のペレットから抽出した。逆転写は、スーパースクリプトII酵素(インビトロゲン)で、製造業者によって供給されるプロトコルに従って、10ngのCaco-2 RNAを使用して実施した。逆転写プライマーは、オリゴ(dT)である。
この反応由来のcDNAは、AccuPrime Pfxキット(インビトロゲン Cat.No.12344-024)を使用して、製造業者によって供給されたプロトコルに従って、PCR反応のテンプレートとして使用した。PCRプライマーは、次の通りであるACY-1 Fwd2(配列番号10:5’−GCGAATTCTTTAAGAAGGAGATATACATATGACGAGCAAAGGTCCGGAAGAGGAGCACCCATCG−3’)および、ACY-1 Rev(配列番号11:5’−GCAAGCTTCAGCTGTCACTGGGCAGGGC−3’)。
これらの条件下では、Zero Blunt TOPO PCRクローニング・キット・タイプのクローニングベクターにクローニングされた1.3kbの断片を増幅することが可能である(インビトロゲン Cat.No.K2820-20)。このプラスミドは、cDNAが実際に期待される配列にあっていることを確認するために配列決定された。
I-FABP翻訳領域を含む以下のDNA断片(配列番号12)を、Geneart社によって実施された化学合成によって得た。
配列番号12:
GGTACCGAATTCCGCGTTTGACAGCACTTGGAAGGTAGACCGGAGTGAAAACTATGACAAGTTCATGGAAAAAATGGGTGTTAATATAGTGAAAAGGAAGCTTGCAGCTCATGACAATTTGAAGCTGACAATTACACAAGAAGGAAATAAATTCACAGTCAAAGAATCAAGCGCTTTTCGAAACATTGAAGTTGTTTTTGAACTTGGTGTCACCTTTAATTACAACCTAGCAGACGGAACTGAACTCAGGGGGACCTGGAGCCTTGAGGGAAATAAACTTATTGGAAAATTCAAACGGACAGACAATGGAAACGAACTGAATACTGTCCGAGAAATTATAGGTGATGAACTAGTCCAGACTTATGTGTATGAAGGAGTAGAAGCCAAAAGGATCTTTAAAAAGGATTCTAGAGTCGACGAGCTC.
LEIおよびガレクチン-3をコードする遺伝子は原核生物の発現ベクターpMR78(文献73)にサブクローニングし、L-FABP遺伝子はベクターpET3d(New England Biolabs)にクローニングした。クローニングのために必要な制限サイトは、テンプレートとして、プラスミドpCR2.1 TOPO-LEI、pCR2.1 TOPO-Gal-3およびpCMV6-LFABPを使用して導入された。PCR酵素はプロメガPfu DNAポリメラーゼであり、PCR反応は製造業者の指示により、表2に示されるプライマーで実施した。
表2
LEIまたはガレクチン-3をコードする翻訳領域を含むPCR産物は、EcoRIおよびHindIII制限酵素で消化した。断片は、同じ酵素(プラスミドpMR-LEIおよびpMR-Gal-3)によって制限されたベクターpMR78に導入された。ベクターpMR78はタンパク質が発現されるフレームで6-ヒスチジン配列を含み、それは金属キレート・アフィニティークロマトグラフィーによって精製されることができる。L-FABP PCR産物は、ベクターpET3dに、NcoIおよびBamHI制限サイトで、クローニングした。
アミノアシラーゼ1の場合、TOPOクローニングベクターはacy1翻訳領域を含む1.3kb断片をつくるためにEcoRIおよびHindIIIによって直接消化され、ベクターpStaby1(Eurogentec)に導入された。組換えプラスミドは、pStaby1-ACYと呼ばれている。
I-FABPの場合、Geneart社によって提供されるクローニングベクターはコード配列を含むほぼ400bpの断片を生成するためにEcoRIおよびSalI制限酵素によって消化され、それはベクターpMRCH79(ビオメリューのベクターpMR78に由来する)に導入された。組換えプラスミドは、pMRCH-IFABPと呼ばれている。
GST(グルタチオンSトランスフェラーゼ)と融合されたエズリンおよびI-プラスチンをそれぞれ発現することができるプラスミドpGEX-エズリンおよびpGEX-I-プラスチンはキュリー研究所から提供された。
PDI A3及びA6のタンパク質をコードするcDNAは、それぞれInvitrogen及びOrigeneから得た。これらのベクターから開始し、遺伝子は(ビオメリューのpMR78に由来する)ベクターpMRCH79にサブクローニングした。組換えプラスミドはpMRCH-PDI A3及びpMRCH-PDI A6と呼ぶ。
プラスミドpGEX-エズリン及びpGEX-プラスチン-Iは、GST(グルタチオンSトランスフェラーゼ)に融合したエズリン及びI-プラスチンをそれぞれ発現可能であり、それらはキュリー研究所から提供された。
組換え腫瘍マーカーを産生するための発現プラスミドは、大腸菌BL21バクテリアと派生株(ストラタジーン)に導入される。培養は、振盪により周囲温度で実行される。各々のタンパク質のための正確な培養条件を表3に示す。IPTGは、イソプロピル-β-D-1-チオガラクトシダーゼである。
バクテリアのペレットは、2×PBS(リン酸緩衝生理食塩水)バッファーに溶解され、1.5kbarで、細胞分離器にかけた(コンスタントシステム)。溶菌液は、3000g、4℃で30分間遠心分離される。上澄は可溶性タンパク質を含む。ペレットは、封入体を含む。封入体を可溶化するためのバッファーは、タンパク質によって決まる。
LEIの場合、精製は、5mLのNi-NTA-セファロース樹脂(キアゲン)を含むカラムにより、可溶性分画を使用して実行され、タンパク質は450mMのイミダゾール(pH7.5)を含む2×PBSによって溶出した。
ガレクチン-3の場合、封入体は1Mの尿素を含むPBSの2×バッファーに溶解されて、5mLのNi-NTA-セファロース樹脂(キアゲン)に通され、Gal-3タンパク質は450mMのイミダゾールと1Mの尿素を含む2×PBS(pH7.5)によって溶出した。
L-FABP、PDI A3及びPDI A6の場合、精製は、Macherey-NagelのNi IDAキットで、可溶性分画を使用して実行される。
表3
GST-エズリンの場合、精製は、GSTアフィニティークロマトグラフィーによって、8Mの尿素と10mMのDTTを含む100mMのトリスバッファーに溶解された封入体を使用して実行される。5mlのグルタチオン・セファロース4ファストフローゲル(アマシャム)を含むカラムが用いられる。平衡化と洗浄バッファーは、0.05%トゥイーン20含有2xPBSである。溶出バッファーは、20mMの還元グルタチオン(pH8)を含む50mMのTris-HClである。
アミノアシラーゼ1の場合、培養の可溶性分画はアマシャムHiTrap Q FFカラムに通され、ACY-1タンパク質は0.3MのNaCl(pH7.5)によって溶出した。いくつかの他のタンパク質がこれらの条件下で共に溶出されたので、疎水性相互作用カラム(HIC Phenyl HP、アマシャム)における精製を行った。ACY-1タンパク質は、0.5MのNaCl(pH7)によって溶出した。
組換えGST-I-プラスチン・タンパク質は、精製された形態でキュリー研究所によって提供された。組換えカルレティキュリン及びプロテイン・ジスルフィド・イソメラーゼ・タンパク質は、工業用プロテウスサービス社(ディジョン、フランス)から提供された。コード配列は、化学合成によって得られた。
1. 動物モデル
免疫化実験は、最初の免疫化時に6〜8週であった雌のBALB/c(H-2d)マウスで行った。
2. 免疫原および免疫化
マウスで得られた免疫反応を増強して、モノクローナル抗体を生成することを可能にするために、腫瘍マーカーは実施例1に記載されている手順に従って、組換えタンパク質の形態で産生された。LDHタンパク質は、SciPac社(Cat.No.103-133)から得られた。これらのタンパク質は、良好な免疫原性の能力を有することが知られている油中水型乳剤の形で調製されたフロイントアジュバント(シグマ)と、同体積により混合された。3匹のマウスは、各々の腫瘍マーカーで免疫化された。マウスは、10μgの免疫原を、0、2および4週に3回連続して投与された。全ての注射は、皮下に行われた。最初の注射は完全フロイントアジュバントとの混合物として与えられ、次の2回は不完全フロインドアジュバントとの混合物として与えられる。最初の注射後D50とD70との間に、100μgの組換えタンパク質の静注によって、体液性応答は再刺激された。
抗体の出現を監視するために、血液サンプルは定期的にマウスから採取される。抗腫瘍マーカー抗体の存在は、ELISAを使用して試験される。興味があるタンパク質が、捕捉(1μg/ウェル)のために用いられる;飽和の後に、抗原は、テスト血清のさまざまな希釈物と反応させられる(37℃で1時間のインキュベーション)。血清に存在する特異的抗体は、アルカリホスファターゼ(H+L、ジャクソンイムノリサーチ、Cat no.115-055-146)にコンジュゲートされており、求める抗体と結合するAffiniPureヤギ抗マウスIgG抗体によって検出される(0.1μg/ウェル)。
最後の注射の3日後に、各腫瘍マーカーごとに、免疫マウスのうちの1匹を解剖した。血液および脾臓が取り出された。KohlerおよびMilstein(文献74、75)によって記載されたプロトコルに従って、脾臓から得られた脾細胞は、バラバラにされ、不死化するために、Sp2/0-Ag14ミエローマ細胞によって培養された。
12−14日のインキュベーション期間の後に、得られたハイブリドーマの上澄は、この実施例のポイント3に記載されたELISAアッセイを使用して、抗-腫瘍マーカー抗体の存在を決定するためにスクリーニングされた。免疫原としてGST融合タンパクが使われた場合、GSTに向かうクローンは、捕捉のために、連結していないGSTを有するELISAスクリーニングを実行することによって除去される。陽性のハイブリドーマ・コロニーは、当業者にとって周知である限界希釈法技術に従って、二回サブクローンをつくった。
さまざまな腫瘍マーカーに対して得られたモノクローナル抗体のリストを表4に示す。これらのモノクローナル抗体は、ウェスタン・ブロット法によって分析された。
表4
Caco-2およびHT-29株の細胞培養抽出物は、8.3Mの尿素と2Mのチオ尿素と4%の3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホナート (CHAPS)と100mMのDTTと2%のセルバライト 4-9(Serva、ハイデルベルク、ドイツ)と0.1g/lのオレンジGの水溶液の600μlで直接溶解し、次にNuPAGE Novexゲル試料調整プロトコル(インビトロゲン)に従って処理した。
組織の抽出物を得るために、患者GHBD001、GHBD004およびCLSP109の腫瘍と粘膜生検をメスで切り出し、次に2.5mMのEDTAとプロテアーゼインヒビター(錠剤、ロシュ)を含む1mlのPBSバッファーで50-μm Mediconsを使用するMedimachineシステム(ベクトン・ディキンソン)において、10サイクルの抽出にかけた。これらの細胞懸濁液の10mlをプールし、25mlにし、次に600gで15分間遠心分離した。上澄が、NuPAGE Novexゲル試料調整プロトコルに従って処理された組織抽出物に該当する。最終全タンパク質濃度0.4mg/mlに濃縮された試料が使用される。デポジット体積は、MOPS泳動バッファーのNuPAGE Novexビス‐トリス4−12%ゲル上にウェルごとに20μlである。泳動(200V、1時間)およびPVDF膜(400mA、45分間)上への移動後、移動の質はアミドブラックによる染色法によって評価される。
膜は、1時間の周囲温度で、TNT(15mMのトリス、0.14MのNaCl、0.5%トゥイーン20、pH8)の溶液において5%脱脂乳(Regilait)で飽和する。飽和後、膜は、飽和溶液で10μg/mlに希釈されたさまざまなテスト抗体で1時間インキュベートされる。TNTでリンスした後、膜は、飽和溶液で1:5000まで希釈された抗-マウス-西洋わさびペルオキシダーゼ(Cat No.115-035-062,ジャクソンイムノリサーチ)のコンジュゲートと共に、周囲温度で1時間インキュベートされる。リンス後、発現は、Substrate Supersignal West Dura Extendedキット(Cat No.34076,Pierce)により、使用に推奨された情報に従って実施する。
膜上の化学発光シグナルは、Biorad社のVersaDocイメージングシステムによって測定された。ウエスタンブロットのイメージに基づいて、さまざまな腫瘍マーカーに該当するバンドの体積は、QuantityOneソフトウェア(バイオラド)によって数値を求められた。体積は、バンドの表面積によって増大する化学発光シグナルの強度に該当する。
ウェスタンブロッティング結果は表5に示す。それは、試験されるさまざまな試料に関して、ウェスタン・ブロット解析における、興味がある腫瘍マーカーに対応するバンドの体積を与える。これらの結果は、試験される腫瘍マーカーがCaco-2およびHT-29大腸癌株で実際に発現していること、および患者から得られた腫瘍および粘膜の抽出物で示されるように組織においても実際に発現していることを示す。試料上の抗体によって得られたシグナルの強度は、他の試料および同じ抗体によって得られたシグナルと比較することができる。使用する技術は、組織(非遠隔試料)中のマーカーの有無、およびマーカーについての抗体の特異性を確認することを可能にする。この技術は、遠隔試料のこの実施例においては使用されなかった。
遠隔試料中の腫瘍マーカーの有無に関して結論を出すことができず、また前記腫瘍マーカーの濃度が前記試料において増減するかどうかについても決定できないためである。さらに、使用する実験スキームは、1つの抗体の反応性をもう一方と比較することを可能にするものではない。
表5
患者GHBD004において、8C8C5抗体は、I-プラスチンに相当するバンドを光らせないか、又は非常に弱く光らせた。これらの試料のI-プラスチンの存在は、例えば、ブロッティングのI-プラスチンに対してより良い親和性を有する8G2D2抗体を使用して証明されてもよい。
I-プラスチンが70%以上の相同性を有する2つの他のイソフォーム(L-プラスチンとT-プラスチン)を含むタンパク質のファミリーのメンバーであるので、GST-プラスチン-LとGST-プラスチン-Tタンパク質(キュリー研究所によって提供された)に関するそれらの反応性について、得られたモノクローナル抗体の全てのクローンを試験した。このスクリーニング終了後、ファミリーの他のメンバーと交差反応性を何ら呈しないクローン3D11D10、8C8C5、3A3H2および8G2D2を選択した。これらの抗体は、I-プラスチン・イソフォームに実際に特異的である。
6.1.方法論
FrankとDoring(文献76)に従って使用するSpotscan技術は、セルロース膜に取り付けられた多数のペプチドを同時に合成可能にする。これらのペプチド、1から4つの残基が重なっている8から12アミノ酸のペプチドの形態で標的抗原の配列を再現する。次に、ブロット型の比色テストにおいて、これらのペプチドは研究される抗体と接触させられて、免疫反応性ペプチドの同定は抗体エピトープの最小の配列を導き出して、それを抗原に正確にデポジットすることを可能にする。
合成は、鎖のエンドにNH2官能基を持たない、長さの8〜10単位のポリエチレングリコール(PEG)のアームを一様に担持している。それが、ペプチドのC末端エンドからN末端エンドまで起こる。アミノ酸のアミノ官能基はFmoc(9フルオレニルメチルオキシカルボニル)基によって保護されており、更に前記アミノ酸の合成の間に反応することができる側鎖は、トリチル、t−ブチルまたはtブチルエーテル基によって保護されている。アミノ酸原液は、0.5MのHOBt(ヒドロキシベンゾトリアゾール)を含むNMP(N−メチルピロリドン)に0.33Mの濃度で調製される。アミノ酸は、AutoSpot XLソフトウェアによって制御されるASP 222自動装置(Abimed、Langenfeld、ドイツ)を使用してデポジットされる。この自動装置の使用は、96スポットを有する4枚までの膜(すなわち384ペプチド)を同時に産生することを可能にする。
1つのアミノ酸を結合させるサイクルの間、自動装置は、膜上に即座に活性化されたアミノ酸の溶液(アミノ酸原液の3倍量に対し、NMPに希釈された1.1Mのジイソプロピルカルボジイミド溶液の1倍量)の0.7μlをデポジットする。このデポジットは2回繰り返され、次に膜はDMF(N,N−ジメチルホルムアミド)によってすすがれる。反応しなかったNH2基は、次に、不成功又は短縮されたペプチドの出現を予防するために、10%無水酢酸のDMF溶液中10分間の4〜6のインキュベーションによってアセチル化される。DMFで2分間3回洗ったあと、アミノ酸のアミノ官能基を保護しているFmoc基は20%ピペリジンのDMF溶液中で5分間インキュベーションすることによって切断される。DMFで4回洗ったあと、スポットは1%ブロムフェノールブルーのDMF溶液を使用して着色し、次に膜はメタノールで3回すすがれて、次の結合サイクルの前に空気中において乾燥される。
プロトコルは、各々の新規なアミノ酸の付加のために繰り返される。最終的なアミノ酸を結合させた後に、ペプチドは全てのフリーのNH2基を遮断できるようにアセチル化されるので、別のアミノ酸の付加は妨げられる。全てのペプチドの側鎖は、次に1時間のトリフルオロ酢酸/ジクロロメタン/トリイソブチルシラン(5:5:0.3)溶液バット中で膜のインキュベーションによって、脱保護される。膜は、ジクロロメタンで4回、DMFで3回及びメタノールで3回リンスし、その後空気中で乾燥させ、免疫暴露まで−20℃で保存する。
モノクローナル抗体でスポットを免疫暴露するために、膜は最初メタノールですすがれて、次にTBS(50mMのトリス−HCl、pH8.0、140mMのNaCl、3mMのKCl)で洗浄され、飽和溶液(TBS−0.05%トゥイーン20(TBS−T)に希釈されて5%のショ糖を含む10X濃度のカゼインベース溶液(ウェスタンブロッキング試薬、ロシュ))中で周囲温度で一晩インキュベートされた。TBS−Tで10分間の洗浄後に、膜は、飽和溶液に20μg/mlに希釈されたモノクローナル抗体で、37℃で1時間30分インキュベートされる。。膜は3回、TBS−Tで連続して洗浄されて、次に、飽和溶液に1/2000に希釈されたアルカリホスファターゼを結合する抗マウスコンジュゲート(ジャクソン・イムノリサーチ)によってインキュベートされる。TBS−Tで10分間2回洗浄後、次にCBS(10mMのクエン酸、pH7、140mMのNaCl、3mMのKCl)で2回洗浄し、即時に調製された検出剤(600μM、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドイル・ホスフェート、720μMのチアゾリル・ブルーテトラゾリウム・ブロミド、及び5mMのMgCl2のCBS溶液)を、30〜45分間、膜と接触させる。免疫反応性ペプチドは、ブルーバイオレット色に見える。蒸留水による3回のすすぎの後、膜はスキャンされて、次に再生まで水中で保存される。
再生はペプチド結合した抗体とコンジュゲートを除去することができる。したがって、別の抗体について免疫反応性の更なるテストを実施することができる。膜は、各々10分間の一連の洗浄を受ける:蒸留水による1回の洗浄、DMFによる6回の洗浄、再生バッファーA(8Mの尿素、35mMのSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)、0.1%のβメルカプトエタノール)による3回の洗浄、再生バッファーB(4:5:1の精製水/エタノール/酢酸)、更にメタノールによる2回の洗浄。次に膜は、空気中で乾燥させて、−20℃で保存する。
ファージディスプレイ・ペプチド・ライブラリー・スクリーニングによるエピトープの特徴づけは、ニューイングランド・バイオラボの市販されているPhD12ファージディスプレイ・ペプチド・ライブラリ・キット(Cat.No.E#8110S)を使用して、キットとともに提供されている指示書(2007年11月のプロトコル・バージョン2.7)に従って実施した。
表6は、研究した3つの抗体に認識されるエピトープを示す。
表6
かっこ内の数字はPDIアミノ酸配列上のエピトープの位置に対応する。番号付けは始めのメチオニンから始まる。
3つの抗−PDIモノクローナル抗体は、タンパク質の3つのエピトープを認識する。それは表6で1から3の番号をつけられた。抗体12H3B6のエピトープはSpotscan技術を使用して決定さできず、それはそれが線形でないことを示す。ペプチド・ライブラリー・スクリーニングにより、抗体と反応する4つの配列、DRAFFESMLW、DRALAESGLW、DVAWHESRKW及びPRAMAESLRWを選択することをができた。これらの4つの配列のアラインメントとPDIの配列の調査により、抗体の結合性にとって不可欠な下線を施されたアミノ酸の領域DGAAAESL(142−149)を同定することができた。最後のトリプトファン(W)は調べた各モティーフに存在しており、そのエピトープに抗体が結合するためには、そこに芳香族アミノ酸(F、W、Y)が必要であることを示す。タンパク質の三次元構造において近い任意の芳香族アミノ酸は、この役割を演ずることができる。利用可能な3Dモデルによれば、関与するアミノ酸は、位置209のフェニルアラニン、位置206のフェニルアラニンまたは位置195のチロシンである可能性がある。
7.1. 方法論
PDIは、サンドイッチ・イムノアッセイによって検出された。これを行うために、96ウェルプレートは、捕捉抗体(3B5C12または12H3B6、ビオメリュー)として、ウェルにつき1μgの試験される抗−PDIモノクローナル抗体でコートされた。PBS−0.05%トゥイーン20(PBS−T)によって3回洗浄した後、PBS−T中の10%ミルクにより、37℃で1時間飽和させた。
プレートはPBS−Tで更に3回洗浄され、PBS−T 1% BSAに希釈された組換えPDIタンパク質の0.1μg/ウェルがプレート上へデポジットされ、そのプレートは37℃で2時間インキュベートされた。
PBS−Tによる3回の洗浄後、ビオチン化検出抗体16D9F6(濃度=1.16mg/ml、ビオメリュー)をさまざまな濃度で加えて、そのプレートを37℃で2時間インキュベートした。
西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン(ジャクソンイムノリサーチ Cat.No.016−030−084,PBS−T3%BSA中に希釈 1/20000、100μl/ウェルを加えるまえに、更にPBS−Tによる洗浄を3回実施した。37℃で1時間のインキュベーション及びPBS−Tによる3回の洗浄の後、基質OPT EIA (BD) を100μl/ウェル加えた。20分後に、色が発現したときに、反応は5Nの硫酸で停止し、450nmの吸光度は測定した。結果は、バックグラウンド・ノイズ(PDI抗原なしアッセイ)の減算後、そのままの値の形式で得られた。
表7は、組換えPDIのウェルにつき0.1μgにおける抗体のさまざまな組合せの反応性を示す。エピトープ番号1と3または2と3の組合せを使用して、PDIを検出することが可能である。エピトープ番号1と3の組合せは、ELISAによって最も高い信号を得ることができる。
表7
8.1.方法論
組換えPDI(別名PDI A1)、組換えPDI A3または組換えPDI A6を10、2.5、0.6、0.1及び0ng/ウェルで、プレートにデポジットしたこと及び3B5C12抗体だけが捕捉抗体として用いられたことを除いて、上記ポイント7.1に示す手順が繰り返された。
PDI A3とPDI A6アッセイの結果は、PDI A1アッセイと比較して、図1に示す。
図1の結果は、高いPDI A3とPDI A6濃度でさえ、PDI A3又はPDI A6について交差反応性が観察されないことを示す。
本発明のアッセイ方法及び使用する抗体は、従って、PDI(A1)に非常に特異的にある。
1. 患者および標本
血液サンプルは、2つのHuriet法規約の背景において、フランスに分布する8つの臨床センターのネットワークから収集される。血清を得るために、血液サンプルは、乾燥管に採取される。血漿を得るために、血液サンプルは、EDTA管に採取される。凝固の後、管は1000gで10分間遠心分離され、血清が除去され、等分されて、−80℃で保存される。血漿の管は、1000gで10分間直接遠心分離され、血漿は除去され、等分され、−80℃で保存される。試料は、患者の病歴について完全に文書化される。
実施例2のパラグラフ7.1に記載されているプロトコルに従って、PDIマーカーは、マイクロプレート・サンドイッチELISAを使用して検定された。抗−PDI捕捉抗体3B5C12(ビオメリュー)が、ウェルにつき1μg使用された。飽和剤は、3%のFCSを追加的に含んでいた。組換えPDIタンパク質を、PBS−T、3%のBSA(1.56−100ng/ml)に希釈することによって、標準範囲は調製された。血清試料は、この同じバッファーに1/2に希釈された。ビオチン化された検出抗体16D9F6(ビオメリュー)は、ウェルにつき0.1μg使用された。結果は、バックグラウンド・ノイズ(PDI抗原なしのアッセイ)の減算後のそのままの値の形式で得られた。較正曲線は、x軸に腫瘍マーカーの濃度を、y軸にシグナルの読取りを吸光指数単位(OD、光学濃度)で、プロットされた。アッセイされた体液(血液、血清、血漿、大便)に存在する腫瘍マーカーの濃度は、ELISAによって読みとられるODに対応する濃度を記録することによって算出された。
サンドイッチELISAによる患者の血清PDIのためのアッセイの結果は、表8に示す。
表8
表8のつづき
分析した患者で得られた量を、図2に報告する。この図において、ステージIIの結腸直腸癌を有する患者由来の1つの血清とステージIIIの結腸直腸癌を有する患者由来の2つの血清は、それらの血清PDIの量が明確に増加したことを示すことは注目すべきである。
LEIタンパク質は、実施例2に記載された抗体およびVidas(登録商標)自動化装置(ビオメリュー)を使用するELISAアッセイを使用して分析された。これを行うために、ELISAアッセイは、Vidas(登録商標)HBs Agウルトラ・キットの試薬を使用して構成された(ビオメリュー、Cat.No.30315)。試薬は、付随の情報シートの記載(ref.11728D-FR-2005/05)に従い、以下の変更を加えて使用した:
1.コーンは、10μg/mlの濃度で、捕捉抗体10E1H1と感作させた。
2.HBs Agウルトラ・カートリッジの第2ウェルの内容物を、Vidas(登録商標)HBs Agウルトラキットの第2ウェルのバッファー(ヤギ血清及び1g/lのアジ化ナトリウムのバッファー)で1μg/mlにまで希釈された、ビオチン結合検出用抗体21B10A5の300μlに置き換えた。
3.血清、血漿または糞便試料(50μl)は、HBs Agウルトラキットの第2ウェルのバッファー(ヤギ血清及び1g/lのアジ化ナトリウムのバッファー)に1/20まで前もって希釈した後に、あるいはそのまま、Vidas(登録商標)HBs Agウルトラ・カートリッジの第2ウェルのバッファーに直接希釈された。
4.ELISA反応は、Vidas(登録商標)自動化装置及びHBs Agウルトラ・キットのプロトコルを使用して実施された。
5.結果は、バックグラウンド・ノイズ(反応前の基質の読取値)の減算の後、粗分析の値の形で得られた。
分析された患者で得られた量は、図3に報告される。この図において、ステージIVの結腸大腸癌を有する患者の3つの血清及びステージIIIの結腸大腸癌を有する患者の1つの血清は、血清LEIの量においてはっきりした増加を示す。
エズリン・タンパク質は、実施例2に記載された抗体及びVidas(登録商標)自動化装置(ビオメリュー)を使用したELISAアッセイを使用して分析した。これを行うため、ELISAアッセイは、Vidas(登録商標)HBs Agウルトラ・キットの試薬を使用して構築された(ビオメリュー、Cat.No.30315)。試薬は、付随の情報シートに記載(ref.11728D-FR-2005/05)に従い、以下の変更を加えて使用した:
1.コーンは、30μg/mlの濃度で、捕捉抗体4A9H5と反応させた。
2.HBs Agウルトラ・カートリッジの第2ウェルの内容物を、ビオチンに結合した、Vidas(登録商標)HBs Agウルトラキットの第2ウェルのバッファー(ヤギ血清及び1g/lのアジ化ナトリウムのバッファー)で1μg/mlにまで希釈された300μlの検出用抗体4A7A6C1に置き換えた。
3.血清、血漿または糞便試料(50μl)は、HBs Agウルトラ・カートリッジの第2ウェルのバッファーに直接希釈された。
4.ELISA反応は、試料を捕獲及び検出抗体とインキュベートする工程を100サイクル行うVidas自動化装置及びVidas(登録商標)HBs Agウルトラ・キットのプロトコルを使用して実施された。
5.結果は、バックグラウンド・ノイズ(反応の前の基質の読取値)の減算の後、粗分析の値の形で得られた。
分析された患者で得られた量は、図4に報告されている。この図において、ステージIVの結腸大腸癌を有する患者の3つの血清は、血清エズリンの量においてはっきりした増加を示すことに注目されたい。
アミノアシラーゼ1タンパク質は、実施例2に記載されている抗体及びVidas(登録商標)自動化装置(ビオメリュー)を使用したELISAアッセイを使用して分析された。これを行うため、ELISAアッセイは、Vidas(登録商標)HBs Agウルトラ・キットの試薬を使用して構築された(ビオメリュー、Cat.No.30315)。試薬は、付随の情報シートに記載(ref.11728D-FR-2005/05)に従い、以下の修飾を加えて使用した:
1.コーンは、20μg/mlの濃度で、捕捉抗体2A7F6と反応させた。
2.HBs Agウルトラ・カートリッジの第2ウェルの内容物を、ビオチンに結合した、HBs Agウルトラキットの第2ウェルのバッファー(ヤギ血清及び1g/lのアジ化ナトリウムのバッファー)で1μg/mlにまで希釈された300μlの検出用抗体11H7D9に置き換えた。
3.血清、血漿または糞便試料(100μl)は、HBs Agウルトラ・カートリッジの第2ウェルのバッファーに直接希釈された。
4. ELISA反応は、試料を捕獲及び検出抗体とインキュベートする工程を100サイクル行うVidas自動化装置及びVidas(登録商標)HBs Agウルトラ・キットのプロトコルを使用して実施された。
5.結果は、バックグラウンド・ノイズ(反応の前の基質の読取値)の減算の後、粗分析の値の形で得られた。
分析された患者で得られた値は、図5に報告する。この図において、ステージIIの結腸大腸癌を有する患者の1つの血清、ステージIIIの結腸大腸癌を有する患者の1つの血清、及びステージIVの結腸大腸癌を有する患者の2つの結成は血清アミノアシラーゼ1の量がはっきりと増加していることに注目されたい。
我々は、ヒトL-FABPタンパク質を分析するために、Hycult Biotechnology社から市販されているELISAキット(Cat.No.HK404)を使用した。このキットは、肝臓の病変の存在を決定するために、細胞培養上清のまたは血清、血漿または尿のL-FABPタンパク質を定量化することを可能にする。我々は、製造業者によって推奨される手順に従ったが、2つの変更を加えた:インキュベーションは周囲温度でなく、37℃で実施し、血清は分析の前に1/10に希釈した。L-FABPタンパク質の分析は、当業者に周知の代替技術によって実施されてもよい。
図6に、この分析の結果を示す。我々が試験した血清パネルにおいて、結腸直腸癌を有する141人中の41人の患者は17ng/mlを超える血清L-FABP濃度を有するが、対照群ではこの値を上回る個体はなかった。これらの41人の患者は、ステージIの結腸直腸癌をもつ8人、ステージIIの結腸直腸癌を有する8人、ステージIIIの結腸直腸癌を有する13人およびステージIVの結腸直腸癌を有する12人の患者である。141人の結腸直腸癌患者で観察される平均血清L-FABP濃度は、16.6±1.3ng/mlであった。112人の正常な個体(ネガティブ・コントロール)の平均値は、6.6±0.2ng/mlである。この違いは、統計学的に有意である(P<0.0001、不等分散のためのウェルチの修正による片側t検定)。
我々は、ヒトI-FABPタンパク質を分析するために、Hycult Biotechnology社から市販されているELISAキット(Cat.No.HK406)を使用した。このキットは、小腸の虚血性の病変の存在を決定するために、細胞培養上清のまたは血清、血漿または尿のI-FABPタンパク質を定量化することを可能にする。製造業者によって推奨される手順に従った。I-FABPタンパク質の分析は、当業者に周知の代替技術によって実施されてもよい。
図7に、この分析の結果を示す。我々が試験した血清パネルにおいて、結腸直腸癌を有する40人中の15人の患者は40pg/mlを超える血清I-FABP濃度を有するが、対照群ではこの値を上回たのは24個体中2個体だけだった。より明らかには、ステージIの結腸直腸癌を有する患者の3つの血清、ステージIIIの結腸直腸癌を有する患者の2つの血清およびステージIVの結腸直腸癌を有する患者の1つの血清が、100pg/mlを超える血清I-FABP濃度を有する。この値より上の濃度は、CRC−対照群では見られなかった。
血清アポリポタンパクAIの分析は、2つの異なるイムノアッセイ技術によって実施された。まず、マイクロプレート・サンドイッチELISAを使用した。96ウェル・プレートは、抗-Apo AIモノクローナル抗体のクローン1404(Biodesign Cat.No.H45404)により、ウェルにつき1μgで被覆された。PBS-0.05%トゥイーン20(PBS−T)によって3回洗浄した後、PBS−T中の10%ミルクにより、37℃で1時間飽和させた。プレートはPBS−Tで更に3回洗浄され、試験血清試料の1/100000希釈液の100μl又は基準範囲の希釈の100μlがプレート上へ置かれて、そのプレートは37℃で2時間インキュベートされた。基準範囲は、Apo AIタンパク質(Biodesign Cat.No.A50620H)をPBS−T(BSA1%)(1.6〜100ng/ml)に希釈することによって調製された。PBS−Tによる3回の洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(Biodesign Cat.No.K45452P)に結合するポリクローナル検出抗体をウェルにつき0.1μg加えて、そのプレートを37℃で2時間インキュベートした。更に3回のPBS−Tによる洗浄後、OptEIA基質(BD)を100μl/ウェルで加えた。20分後に、発色が起こった時に、反応を2Nの硫酸で停止して、450nMの吸光度を測定した。
図8Bは、この分析の結果を示す。CRCを有する患者のApo AIの血清濃度の減少は、この第2の技術によって確認される。ステージIからIVのCRCを有する34個体のApo AIの平均濃度は768±30μg/mlであるが、正常な17個体においてはこれより非常に高い:1194±51μg/ml。この違いは、統計学的に非常に有意である(P<0.0001、片側t検定)。
血清アポリポタンパクAIIの分析は、Lincoマルチプレックス・キットにより実施した。図7は、この分析の結果を示す。我々は、結腸直腸癌を有する個体のApo AIIの血清濃度の減少を証明した。ステージIからIVのCRCを有する34個体におけるApo AIIの平均濃度は170±11μg/mlであるが、正常な17個体(対照)ではこれより非常に高い277±16μg/ml。この相違は、統計学的に非常に有意である(P<0.0001、片側t検定)。
I-プラスチン・タンパク質は、実施例2に記載の抗体およびVidas(登録商標)自動化装置(ビオメリュー)を使用して分析された。これを行うために、ELISA分析は、Vidas(登録商標)HBs Agウルトラ・キットの試薬を使用して構成された(ビオメリュー、Cat.No.30315)。試薬は、付随の情報シートの記載(ref.11728D-FR-2005/05)に従い、以下の修飾を加えて使用した:
1.コーンは、15μg/mlの濃度で、捕捉抗体3D11D10と感作させた。
2.HBs Agウルトラ・カートリッジの第2ウェルの内容物を、Vidas(登録商標)HBs Agウルトラキットの第2ウェルのバッファー(ヤギ血清及び1g/lのアジ化ナトリウムのバッファー)で1μg/mlにまで希釈されたビオチン結合した検出用抗体8C8C5の300μlに置き換えた。
3.血清、血漿または糞便試料(100μl)は、HBs Agウルトラ・カートリッジの第2ウェルのバッファーに直接希釈された。
4.ELISA反応は、Vidas(登録商標)自動化装置及びHBs Agウルトラ・キットのプロトコルを使用して実施された。
5.結果は、バックグラウンド・ノイズ(反応前の基質の読取値)の減算の後、粗分析の値の形で得られた。
β2-ミクログロブリン、CEA、CA19-9およびテストステロン腫瘍マーカーを、出願人のアッセイキット、それぞれVidas(登録商標)β2-ミクログロブリン, Vidas(登録商標)CEA, Vidas(登録商標)CA19-9TMおよびVidas(登録商標)テストステロンを使用して、各々のキットに特有の手順に従って分析した。
E-カドヘリン・タンパク質は、キットの手順に従ってE-カドヘリンEIAキット(タカラ・バイオケミカルズ、東京、日本)を使用して分析された。
再生膵島由来タンパク質3αタンパク質、別名膵臓炎関連タンパク質(PAP1)は、PANCREPAP ELISAキット(DynaBio、マルセーユ、フランス)を使用して、キットの手順に従って分析した。
1.コーンは、5から30μg/mlの間の濃度で、捕捉抗体と感作させた。
2.HBs Agウルトラ・カートリッジの第2ウェルの内容物を、ヤギ血清と1g/lのアジ化ナトリウムのバッファーに1μg/mlにまで希釈された、ビオチンに結合した300μlの検出用抗体に置き換えた。
3.血清、血漿または糞便試料は、HBs Agウルトラ・カートリッジの第2ウェルのバッファーに直接希釈された。
4. ELISA反応は、Vidas(登録商標)自動化装置及びHBs Agウルトラ・キットのプロトコルを使用して実施された。捕捉および検出抗体と共に試料をインキュベートする工程は、14と100サイクルとの間である。
5.結果は、バックグラウンド・ノイズ(反応前の基質の読取値)の減算の後、粗分析の値の形で得られた。
分析される体液(血液、血清、血漿、糞便)に存在する腫瘍マーカーの濃度は、LEIを分析することに関してパラグラフ2に記載されている手順に従って算出された。さまざまな腫瘍マーカーのためのアッセイ条件を表7に記載する。
表9
結腸直腸癌を有する患者の3つの血清は、血清β2-ミクログロブリンの量の増加を示す。結腸直腸癌を有する患者の10の血清は、血清CEAの量の増加を示す。より明確には、ステージIIIの結腸直腸癌を有する患者の1つの血清およびステージIVの結腸直腸癌を有する患者の7つの血清が、血清CEA量の相当な増加を示す。
結腸直腸癌を有する患者の9つの血清は、血清CA19-9の量の増加を示す。より明確には、ステージIIIの結腸直腸癌を有する患者の1つの血清およびステージIVの結腸直腸癌を有する患者の7つの血清が、血清CA19-9量の相当な増加を示す。
結腸直腸癌を有する患者の10の血清は、血清テストステロンの量の減少を示す。より明らかには、ステージIIの結腸直腸癌を有する患者の1つの血清、ステージIIIの結腸直腸癌を有する患者の1つの血清およびステージIVの結腸直腸癌を有する患者の2つの血清が、血清テストステロン量の下落を示す。
結腸直腸癌を有する患者の2つの血清は、血清再生膵島由来タンパク質3αの量の増加を示す。
ステージIVの結腸直腸癌を有する患者の4つの血清、ステージIIIの結腸直腸癌を有する患者の2つの血清およびステージIIの結腸直腸癌を有する患者の1つの血清は、血清ガレクチン-3の量の明確な増加を示す。
出願人は、結腸直腸癌を有する特定の患者の血流において、腫瘍マーカーの異常に上昇した量または異常に減少した量が観察されことを実施例3で示した。驚くべきことに、血液において、2つの所与のマーカー量の増加または減少は、同じ患者において体系的に観察されない。その結果、いくつかの腫瘍マーカーの組合せは、結腸直腸癌を有すると同定される患者数を増加させることが可能である。したがって、患者Aは一つ以上の腫瘍マーカー(グループX)の減少又は増加を示すが、患者BではグループXの前記マーカーで正常である場合がある;この同じ患者Bで、一つ以上の他の腫瘍マーカー(グループY)は、上昇または減少する場合があり、患者AではグループYの前記マーカーで正常である場合がある。出願人によって分析されるさまざまな腫瘍マーカーは、したがって、当業者によく知られているさまざまな数学的アルゴリズムによって結合されることができる。網羅的な例ではないが、具体的には、以下の方法が実施された:
1.各々の腫瘍マーカーについて、限界値が設定された。
2.結腸直腸癌のケースで血液中の腫瘍マーカーの量が増加した場合、所与の患者で得られた血液の量はその限界値によって分割された。結腸直腸癌のケースで血液中の腫瘍マーカーの量が減少した場合、所与の患者で得られた血液の量は逆数にされて、その限界値をかけた。
3.「限界値によって分割された血液中の量」の比率が1より大きい場合、比率は係数(例えば10)をかけられた。したがって得られる値は、研究される患者について、考慮中の腫瘍マーカーのための「スコア」と呼ばれた。
4.さまざまな腫瘍マーカーで得られたスコアは、各々のマーカーに特異的な係数によって重み付けされて加えられた。下記の実施例の場合、全ての重み付けの係数は1にセットした。
5.スコアの合計は加えられるスコアの総数によって分割され、こうして得られる値に「トータルスコア」という名前をつけた。
6.彼または彼女のトータルスコアが限界値スコアに比例して増加している場合、患者は結腸直腸癌を有すると診断される。
PDIを含む3、4、5および9つのマーカーの選択のトータルスコアを表10に示す。
PDI、エズリン及びGal−3の腫瘍マーカーの組合せは、30人の患者の同じ群について、結腸直腸癌を有する16人の患者で増加したトータルスコア「3」をえられる一方で、PDI、エズリン又はGal−3単独の分析ではそれぞれ3人、4人および12人の患者のみでの増加が示された。
PDI、CEA、エズリン及びGal−3腫瘍マーカーの組合せは、30人の患者の同じ群について、結腸直腸癌を有する25人の患者でトータルスコア「4b」をえられる一方で、PDI、CEA、エズリン又はGal−3単独の分析ではそれぞれ3人、19人、4人および12人の患者のみでの増加が示された。
PDI、CA19−9、E−カドヘリン及びLEI腫瘍マーカーの組合せは、30人の患者の同じ群について、結腸直腸癌を有する18人の患者で増加したトータルスコア「4c」をえられる一方で、PDI、CA19−9、E−カドヘリン又はLEI単独の分析ではそれぞれ3人、12人、3人及び7人の患者のみでの増加が示された。
PDI、L−FABP、プロテアーゼ20S及びビリン腫瘍マーカーの組合せは、30人の患者の同じ群について、結腸直腸癌を有する25人の患者で増加したトータルスコア「4d」をえられる一方で、PDI、L−FABP、プロテアーゼ20S又はビリン単独の分析ではそれぞれ3人、18人、12人及び4人の患者のみでの増加が示された。
PDI、L−FABP、プロテアーゼ20S、ビリン及びGal−3腫瘍マーカーの組合せは、30人の患者の同じ群について、結腸直腸癌を有する26人の患者で増加したトータルスコア「5」をえられる一方で、PDI、L−FABP、プロテアーゼ20S、ビリン又はGal−3単独の分析ではそれぞれ3人、18人、12人、4人及び12人の患者のみでの増加が示された。
PDI、CA19−9、ACY、L−FABP、エズリン、LEI、プロテアーゼ20S、ビリン及びGal−3腫瘍マーカーの組合せは、30人の患者の同じ群について、結腸直腸癌を有する28人の患者で増加したトータルスコア「9f」をえられる一方で、PDI、CA19−9、ACY、L−FABP、エズリン、LEI、プロテアーゼ20S、ビリン又はGal−3単独の分析ではそれぞれ3人、12人、4人、18人、4人、7人、12人、4人及び12人の患者のみでの増加が示された。
PDI、CEA、CA19−9、ACY、L−FABP、エズリン、LEI、プロテアーゼ20S及びビリン腫瘍マーカーの組合せは、30人の患者の同じ群について、結腸直腸癌を有する28人の患者で増加したトータルスコア「9g」をえられる一方で、PDI、CEA、CA19−9、ACY、L−FABP、エズリン、LEI、プロテアーゼ20S又はビリン単独の分析ではそれぞれ3人、19人、12人、4人、18人、4人、7人、12人及び4人の患者のみでの増加が示された。
表10
表10のつづき
表10のつづき
表10のつづき
糞便は重さ約1gの破片を使用して抽出され、それは1g/lアジ化合物を含む100mMのリン酸ナトリウム・バッファー(pH7.2)の10mlに加えられる。混合物は、1分間のボルテックスで均質にされる。次に、試料を氷上で7秒間4サイクルの超音波にかける。不溶性分画は4℃で10分間、2000gで遠心分離により取り除かれる。上澄は分析されるまで−30℃で保存される。実施例3に記載のELISAアッセイが、必要に応じて、HBs Agウルトラ・カートリッジの第1ウェルのバッファーに糞便を適切に希釈した後に糞便の腫瘍マーカーを分析するために使用された。
アミノアシラーゼ1、ガレクチン-3およびプロテアソーム20Sによる試験の分析定量は、それぞれ図20から22に表わされる。アミノアシラーゼ1、ガレクチン-3およびプロテアソーム20Sの量の増加が、それぞれ結腸直腸癌を有する患者の10、14、および8つの糞便で観察された。
1. 細胞培養
LnCAP前立腺癌株は、2mMのL-グルタミンと10mMのHEPESと1mMピルビン酸ナトリウムと10%FCSを添加したRPMI1640培地で培養される(全てギブコ)。細胞はネガティブコントロールとして使用される。
Caco-2結腸大腸癌株は、FCSを含まず2mMのL-グルタミンを含むDMEM培地で培養される(全てギブコ)。
HT-29結腸直腸癌株は、10%FCSおよび2mMのL-グルタミンを含むDMEM培地で培養される(全てギブコ)。
HT-29/B6結腸直腸癌株は、FCSを含まず4mMのL-グルタミンを含むDMEM培地で培養される(全てギブコ)。
細胞は、5%のCO2を有するインキュベーターで37℃に保たれる。
この手順は、タンパク質を分泌している細胞数を決定することを可能にする。PVDF膜(マルチスクリーンIP、ミリポア)を有する96ウェルELISPOTプレートは、10μg/mlでマウス抗-腫瘍マーカー・モノクローナル抗体(捕捉抗体、ELISPOTで使用した抗体を示す下の表9を参照されたい)で、ウェルにつき100μlで、滅菌PBS中で、+4℃で一晩、被覆する。次にプレートはPBSによって洗われて、10%FCSを含む培地で飽和する。平行して、細胞は、トリプシン処理され、計数されて、次に105細胞/mlまで希釈した。この保存溶液のカスケード希釈として、この細胞懸濁液の200μlはウェルに分配された。次に、プレートは5%CO2の湿性雰囲気において37℃で20時間インキュベートされ、次に0.05%のTween-20含有PBSによって洗浄した。次に残りの細胞は10分間の氷冷水による処理によって溶解され、次にプレートは再び洗われる。検出抗体(分析される腫瘍マーカーに向かうビオチン化モノクローナル(表9))は、0.1μg/ウェルで加えられる(周囲温度で2時間インキュベート)。スポットは、extravidin-アルカリホスファターゼ(シグマ)と基質5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル・ホスフェート/ニトロ・ブルーテトラゾリウム(BCIP/NBT、Biorad)を加えることによって検出される。バックグラウンド・ノイズは、LnCapウェルで測定されるスポット数に相当し、使用した読み取り条件下では0から8スポットの間で変化する。非特異的なスポットの平均数は、特異的なシグナルから減算された。
表11
インキュベートされた細胞100万に対する、興味がある腫瘍マーカーを分泌しているCaco-2、HT-29およびHT-29/B6細胞の数を、図23に示す。ELISPOT技術は、大腸癌株による腫瘍マーカーの放出または分泌を確認することを可能にする。出願人による特許出願WO03/076942の方法に従い、この技術を使用して患者の循環腫瘍細胞について調査を実施することが可能であろう。
1. 方法論
第1に、組織マイクロアレイ・スライドは、脱パラフィンされる。このために、それらは次の溶液バットにおいて、10分間、連続的にインキュベートされる:メチルシクロヘキサン(2回)、100%エタノール、95%エタノール、70%エタノールおよび水。次にスライドは、0.1%のトゥイーン20を含むTBSで、10分間、撹拌しながら、リンスした。抗原は、10mMのクエン酸バッファー中で、40分間、90℃まで加熱することによって再活性化し、次に30分間、周囲温度まで冷却させた。内因性ペルオキシダーゼは3%のH2O2を含むTBS−T中でのインキュベートによって阻害される。次に、スライドは37℃で1時間、湿潤なチャンバーにおいて、3%BSAのTBS−Tで飽和する。
次に、スライドは、3%BSA含有TBS−Tに10μg/mlに希釈した抗-白血球エラスターゼ・インヒビター(クローン3D9C2)または抗-I-プラスチン(クローン8D6A3)一次抗体と共に2時間インキュベートする。TBS−T中で10分間3回洗浄後、スライドは、飽和溶液で1/400に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼと結合させた抗-マウス二次抗体(Cat.No.115-035-003 Jackson Immunoresearch)と共に、湿潤チャンバーにおいて、37℃で2時間インキュベートする。スライドは、TBS−T中で10分間3回洗浄され、次にPBS中で10分間3回洗浄する。スライドは、シグマFast substrate(Cat.No.D-4168,シグマアルドリッチ)によって5分間、発現させる。染色は、PBSでの洗浄によって停止させる。ハリス・ヘマトキシリン(Cat.No.MHS16、シグマアルドリッチ)による対比染色は、30秒間実施する。水およびPBSによる洗浄後、スライドは顕微鏡下に観察のために置かれる。
免疫組織化学の標識化のために使用する抗体は、特に本出願のために、ELISAでの又はウエスタンブロッティングでのそれらの反応性に独立に選択された。
組織マイクロアレイスライドは、多数の試料をスクリーニングするために用いた。これらの試料は、スライド上へ配置される結腸組織である。患者の特徴(結腸直腸癌の組織マイクロアレイに存在する結腸組織スポットの特徴)、更には抗-白血球エラスターゼ・インヒビター抗体による免疫標識の結果を、表12に示す。
表12
表の結果は正常な結腸粘膜生検において、標識化されたものがないことを示す(10の陰性)。標識は、また、腺腫においても陰性である(1/1)。標識は、結腸腺癌の上皮細胞において陽性である(8/11の患者で+)。間質では標識されたものがない。
組織マイクロアレイ・スライドを、多数の試料をスクリーニングするために用いた。これらの試料は、スライド上へ配置された結腸と直腸の組織である。患者の特徴(結腸直腸癌の組織マイクロアレイに存在する結腸組織スポットの特徴)、更には抗-I-プラスチン抗体による免疫標識の結果を、表13に示す。
表13
表13のつづき
表の結果は:
正常な結腸粘膜生検において、8試料(+)において標識は弱く、2試料は++である。また、標識は結腸腺腫(1/1)において弱い(+)。標識は、結腸腺癌の上皮細胞において強い陽性++である(結腸コロイド腺癌を含めて、6/9の患者で++であり、3人の患者で弱い+)。間質では標識されたものがない;
正常な直腸粘膜生検において、標識は、非特異的に表面上皮に(3/4)および1試料で++レベルで存在する。標識は、直腸腺腫で強い陽性++(5/9)または弱い+(4/9)である。さらに、標識は、直腸腺癌の上皮細胞で強い++である(3/4患者において++、1患者で弱い+)。間質では標識されたものがない;
ことを示す。
1: J.D. Potter, 1999, J Natl Cancer Inst, 91, 916-32
2: J. Faivre, 2001, Epidemiologie et depistage du cancer colorectal, Ed. Springer
3: B.K. Shin et al., 2003, J Biol Chem, 7607-7616
4: T. Tomonaga et al., 2004, Clin Canc Res, 2007-2014
5: R. Stierum et al., 2003, Biochimica et Biophysica Acta, 73-91
6: E. Remold-O’Donnell et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA, 89, 563-5639
7: J. Cooley et al., 2001, Biochemistry, 15762-15770
8: M. Algrain et al., 1993, J Cell Biol, 120, 129-139
9: W.G. Jiang and S. Hiscox, 1996, Anticancer Res, 16, 861-865
10: S. Hiscox and W.G. Jiang, 1999, J Cell Sci, 112, 3081-3090
11: T. Xiao et al, 2005, Mol Cell Proteomics, 4, 1480-1486
12: M. Anders and W. Dekant, 1994, Advances in Pharmacology, 431-448
13: K. Lorentz et al., 1975, Clinica Chimica Acta, 263-269
14: K. Lorentz and B. Flatter, 1975, Clinica Chimica Acta, 271-274
15: R.M. Cook et al., 1993, J Biol Chem, 17010-17017
16: Y.E. Miller et al., 1989, J Clin Invest, 2120-2124
17: S. Balabanov et al., 2001, Eur J Biochem, 5977-5980
18: E. Chan et al., 1985, J Biol Chem, 260, 2629-2632
19: R. Das et al., 2001, Clin Cancer Res, 7, 1706-1715
20: J. Stulik et al., 2001, Electrophoresis, 22, 3019-3025
21: T. Yamazaki et al., 1999, J Surg Oncol, 72, 83-87
22: D.A. Sweetser et al., 1987, J Biol Chem, 266, 16060-16071
23: M. Pelsers et al., 2003, Clin Biochem, 36, 529-535
24: R. Xiao, et al., 2005, Molecular Cancer, 4, 1-17
25: E.E. Niederkofler et al., 2003, J Lipid Res, 44, 630-639
26: G.L. Hortin, 2006, Clinical Chemistry, 52(7), 1223-1237
27: J.Y. Engwegen et al., 2006, World J Gastroenterol, 12(10), 1536-1544
28: Z. Zhang et al., 2004, Cancer Research, 64, 5882-5890
29: H. Hachem et al., 1986, J Chem Clin Biochem, 24, 161-166
30: C.S. Lin, et al., 1993, J Biol Chem, 268, 2781-92
31: V. Delanote et al., 2005, Acta Pharama Sinica, 769-779
32: A.P. Arrigo et al., 1988, Nature, 331, 192-194
33: T. Lavabre-Bertrand et al., 2001, Cancer, 92, 2493-2500
34: S. Nakahara et al., 2005, Apoptosis, 10, 267-275
35: I. Iurisci et al., 2000, Clin Can Res, 6, 1389-1393
36: M.K. Schwartz, 2006, Clin Chim Acta, 1992, 77-82
37: D.J. McCool et al., 1999, Biochem J, 593-600
38: J.L. Iovanna et al., 1994, Gastroenterology, 106, 728-734
39: Y. Motoo et al., 1999, Dig Dis Sci, 44, 1142-1147
40: M. Herlyn et al., 1979, Proc Natl Acad Sci USA, 76, 1438-1442
41: A. Armstrong and S. Eck, 2003, Cancer Biol Ther, 2, 320-325
42: D. Herlyn et al., 1982, Proc Natl Acad Sci USA, 79, 4761-4765
43: H Abe et al., 2002, J Immunol Methods, 270, 227-233
44: V. Barak et al., 2004, Clin Biochem, 37, 529-540
45: H. Kim et al., 2006, Ann Clin Lab Sci, 36, 294-298
46: F. Roca et al., 2006, J Surg Oncol, 151-160
47: C.H. Damsky et al., 1983, Cell, 455-466
48: M. Katayama et al., 1994, Br J Cancer, 580-585
49: C. Willmanns et al., 2004, Clin Exp Metastasis, 75-78
50: P. Gold and S. Freedman, 1965, J Exp Med, 467-481
51: M. Duffy, 2001, Clin Chem, 624-630
52: Y. Kim et al., 2003, Ann Clin Lab Sci, 32-38
53: J.L. Magnani et al., 1983, Cancer Research, 43, 5489-5492
54: J. Holmgren et al., 1984, Br Med J (Clin. Re. Ed.), 288, 1479-1482
55: T.L. Klug et al., 1986, Int J Cancer, 38, 6661-669
56: P. Kuusela et al., 1991, Br J Cancer, 63, 636-640
57: M. Holland et al., 1993, Medicina (B. Aires), 53(2), 117-23
58: F. Model et al., July 2006, World Congress on Gastrointestinal Cancer, “Detection of Methylated DNA in Plasma from Colorectal Cancer Patients and Controls by Real-Time PCR Analysis of Septin 9”
59: M.P. Ebert et al., 2006, Gastroentrology, 131(5), 1418-1430
60: C. Bianco et al., 2006, Clin Cancer Res, 12, 5158-5164
61: R. Yasumatsu et al., 2006, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 291, L619-L627
62: J. Chevalier et al., 1997, J Histochem Cytochem, 45, 481-491
63: S. Patterson, 2000, Physiological Genomics, 2, 59-65
64: L.J. Kricka et al., 1999, Clinical Chemistry, 45(4), 453-458
65: S. Tyagi and F.R. Kramer, 1996, Nature Biotech, 14, 303-308
66: T. F. Imperiale et al., 2004, N Engl J Med, 351(26), 2704-2714
67: D.A. Ahlquist et al., 2000, Gastroenterology, 119, 1219-1227
68: I. H. Wong, 2006, Methods Mol Biol, 336, 33-46
69: M. P. Ebert et al., 2005, Neoplasia, 7(8), 771-778
70: C. Lofton-Day et al., 2007, AACR Annual Meeting 2007, Los Angeles, U.S.A., Poster no LB-165, Clinical case-control study in plasma shows that the DNA methylation biomarker, Septin-9, detects 70% of stage I-III colorectal cancer patients
71: P. Metezeau et al., La cytometrie en flux pour l’etude de la cellule normale ou pathologique (Tome I), Eds Medsi-MacGrawhill
72: Mathieu J. et al. 2006. Fonctions cellulaires et metabolisme. In: (coordinators: Ronot X.et al.). La cytometrie en flux. Tec & Doc, 255-298. ISBN 978-2-7430-0898-7
73: V. Cheynet et al., 1993, Protein Expr Purif, 4(5), 367-372
74: G. Kohler and C. Milstein, 1975, Nature, 256, 495-497
75: G. Kohler and C. Milstein, 1976, Eur J Immunol, 6, 511-519
76: R. Frank and R. Dohring, 1988, Tetrahedron, 44, 6031-6040
Claims (9)
- 結腸直腸癌を有することが疑われる患者から得られた生物学的試料のプロテイン・ジスルフィド・イソメラーゼ(PDI)の存在を決定することによる結腸直腸癌のインビトロ診断方法であって、配列番号1、PDIの3次元構造において近い1つの芳香族アミノ酸を伴う配列番号2及び配列番号3の配列を有するエピトープから選択されたPDIエピトープに対する少なくとも一つの抗PDIモノクローナル抗体を使用する方法。
- 生物学的試料が腫瘍から離れた試料であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 配列番号3の配列を有するエピトープに対する少なくとも一つの抗-PDIモノクローナル抗体並びに配列番号1及びPDIの3次元構造において近い1つの芳香族アミノ酸を伴う配列番号2の配列を有するエピトープから選択されるPDIエピトープに対する少なくとも一つの別のモノクローナル抗体を使用することを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
- 配列番号1の配列を有するエピトープに対する少なくとも一つの抗-PDIモノクローナル抗体及び配列番号3の配列を有するエピトープに対する少なくとも一つの別の抗体を使用することを特徴とする、請求項3に記載の方法。
- 白血球エラスターゼインヒビター、エズリン、アミノアシラーゼ1、肝臓脂肪酸結合タンパク質、腸脂肪酸結合タンパク質、アポリポタンパク質AI、アポリポタンパク質AIIおよびI-プラスチンマーカーから選択される少なくとも一つの他の腫瘍マーカーの存在の決定を更に含むことを特徴とする請求項1から4の何れか一項に記載の方法。
- β2-ミクログロブリン、プロテアソーム20S、ガレクチン-3、L-乳酸脱水素酵素B鎖、カルレティキュリン、再生膵島由来タンパク質3α、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー1、II型ケラチンCytoskeletal8、I型ケラチンCytoskeletal18、I型ケラチンCytoskeletal19、上皮カドヘリン、CEA、ビリン、CA19-9、CA242、CA50、CA72-2、テストステロン、TIMP-1、Cripto-1、インテレクチン-1、サイトケラチン20、翻訳的に制御された腫瘍タンパク質、(プロ)デフェンシン-A5、好ましくはAXL4遺伝子のメチル化DNAまたはセプチン-9遺伝子のメチル化DNAのような血液中のメチル化DNAの検出、糞便DNAの特異的な変異又は糞便DNAのメチル化プロフィールの特異的な修正のような糞便DNA断片の特異的な修正の検出、及びヒト糞便のヘモグロビンの検出から選択される少なくとも一つの他の腫瘍マーカーの存在の決定を更に含むことを特徴とする、請求項1から5の何れか一項に記載の方法。
- 結腸直腸癌に関する早期診断、スクリーニング、フォローアップ治療、予後診断及び再発診断のための、請求項1から6の何れか一項に記載の方法の使用。
- 配列番号1、配列番号2又は配列番号3の配列のエピトープ。
- 請求項8に記載のエピトープと特異的に結合する抗-PDI抗体。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016512325A (ja) * | 2013-03-13 | 2016-04-25 | ユニバーシティ オブ リーズ | Acy−1の虚血/再灌流、移植片機能発現遅延及び移植片バイアビリティーのマーカーとしての使用及びその方法 |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009019368A2 (fr) * | 2007-07-19 | 2009-02-12 | bioMérieux | Procede de dosage de la liver fatty acid-binding protein, de l'ace et du ca19-9 pour le diagnostic in vitro du cancer colorectal |
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FR2919064B1 (fr) * | 2007-07-19 | 2009-10-02 | Biomerieux Sa | Procede de dosage de l'apolipoproteine all pour le diagnostic in vitro du cancer colorectal |
US9382330B2 (en) * | 2010-05-10 | 2016-07-05 | Academia Sinica | Pdia4, target of cytopiloyne derivatives, for tumor diagnosis and treatment |
FR3001806B1 (fr) | 2013-02-01 | 2016-05-20 | Biomerieux Sa | Procede de detection d'une lesion colorectale |
FR3001805B1 (fr) | 2013-02-01 | 2015-02-20 | Biomerieux Sa | Procede de detection d'un cancer colorectal |
US10866239B2 (en) | 2014-09-08 | 2020-12-15 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Methods for colon hyperproliferative disorder detection, prognosis, and diagnosis |
KR101994702B1 (ko) * | 2015-04-10 | 2019-07-01 | 서울대학교 산학협력단 | 신규 간암 환자의 소라페닙 저항성 예측 마커 |
FR3067814A1 (fr) * | 2017-06-20 | 2018-12-21 | Biomerieux | Procede d'application, sur un support solide, d'au moins un partenaire de liaison a une molecule |
CN109613254B (zh) * | 2018-11-06 | 2022-04-05 | 上海市公共卫生临床中心 | 一种用于肿瘤治疗和诊断的靶点标志物pdia2 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6001632A (en) * | 1996-05-15 | 1999-12-14 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Human protein disulfide isomerase |
WO2002020731A2 (en) * | 2000-09-08 | 2002-03-14 | Bayer Aktiengesellschaft | Regulation of human protein disulfide isomerase-like enzyme |
JP2004198419A (ja) * | 2002-12-13 | 2004-07-15 | Bayer Healthcare Llc | Timp1を用いた検出方法 |
WO2007071366A1 (en) * | 2005-12-21 | 2007-06-28 | Roche Diagnostics Gmbh | Method of assessing colorectal cancer by measuring hemoglobin and m2-pk in a stool sample |
JP2008508538A (ja) * | 2004-08-02 | 2008-03-21 | チルドレンズ・メディカル・センター・コーポレイション | 癌についての血小板生物マーカー |
JP2008545634A (ja) * | 2005-05-21 | 2008-12-18 | プロテオジス アクチェンゲゼルシャフト | 癌危険度評価用アネキシン |
US20100111973A1 (en) * | 2006-09-22 | 2010-05-06 | Glenn Dranoff | Methods for treating mica-related disorders |
Family Cites Families (50)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4529931A (en) | 1983-04-07 | 1985-07-16 | Ford Motor Company | Single-coil current measuring circuit |
FR2581456B1 (fr) | 1985-05-02 | 1987-07-17 | Pasteur Institut | Villine humaine, en tant que marqueur de cellules malignes primaires originaires du tube digestif, et moyens, en particulier anticorps diriges contre la villine humaine, pour la detection desdites cellules malignes |
US5360715A (en) | 1988-06-07 | 1994-11-01 | California Institute Of Technology | Plastin isoforms and their uses |
US5002870A (en) | 1988-06-07 | 1991-03-26 | California Institute For Medical Research | Plastin isoforms and their use |
CA2054149A1 (en) | 1990-10-29 | 1992-04-30 | Eric Pringault | Villin gene promoter sequence and its use in vectors, transformed mammalian cell lines, transgenic animals, and cell lines derived from the animals |
US6291205B1 (en) * | 1992-06-12 | 2001-09-18 | Merck & Co., Inc. | Method of increasing production of disulfide bonded recombinant proteins by saccharomyces cerevisiae |
DE69329202T2 (de) * | 1992-10-02 | 2001-03-29 | Res Corp Technologies Inc | Methoden der erhöhung der sekretion von überexpremierten proteinen |
DK76893D0 (ja) * | 1993-06-28 | 1993-06-28 | Novo Nordisk As | |
US6518411B1 (en) | 1996-11-22 | 2003-02-11 | University Of Iowa | RGS compositions and therapeutic and diagnostic uses therefor |
WO2000022100A2 (en) * | 1998-10-15 | 2000-04-20 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Arthropod protein disulfide isomerases |
DE69934139D1 (de) | 1998-12-01 | 2007-01-04 | Wrair Walter Reed Army Inst Of | Diagnose von krebsstadium oder aggressivität |
JP2002536995A (ja) | 1999-02-22 | 2002-11-05 | インサイト・ファーマスーティカルズ・インコーポレイテッド | 結腸の疾患に関連する遺伝子 |
NZ515311A (en) | 1999-04-09 | 2002-11-26 | Rigshospitalet | Mass screening and highly specific early identification of colorectal or metastatic breast cancer by measuring TIMP-1 tissue inhibitor |
JP2001066971A (ja) | 1999-08-31 | 2001-03-16 | Canon Inc | 画像形成装置 |
AU7721500A (en) | 1999-09-29 | 2001-04-30 | Human Genome Sciences, Inc. | Colon and colon cancer associated polynucleotides and polypeptides |
ES2539951T3 (es) * | 1999-10-29 | 2015-07-07 | Novartis Vaccines And Diagnositics S.R.L. | Péptidos antigénicos de Neisseria |
AU2001240909A1 (en) | 2000-03-20 | 2001-10-03 | Oxford Glycosciences (Uk) Limited | Proteins, genes and their use for diagnosis and treatment of breast cancer |
JP2004528810A (ja) | 2000-10-02 | 2004-09-24 | バイエル コーポレーション | 癌組織でディファレンシャルに発現される核酸配列 |
US20020160382A1 (en) | 2000-10-11 | 2002-10-31 | Lasek Amy W. | Genes expressed in colon cancer |
WO2002036624A2 (en) | 2000-10-30 | 2002-05-10 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods, compositions and therapeutic applications relating to fortilin (= translationally controlled tumor protein, tctp) and modulators thereof |
US20030082533A1 (en) | 2001-01-26 | 2003-05-01 | Henry Yue | Intelectin |
WO2002074156A2 (en) | 2001-02-02 | 2002-09-26 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of colon cancer |
US20040018973A1 (en) | 2002-01-25 | 2004-01-29 | University Of Pittsburgh | Nuclear matrix protein alterations associated with colon cancer and colon metastasis to the liver, and uses thereof |
GB0208331D0 (en) | 2002-04-11 | 2002-05-22 | Oxford Glycosciences Uk Ltd | Proteins |
CN1396182A (zh) | 2002-07-31 | 2003-02-12 | 陕西超英生物医学研究开发有限公司 | 人内皮生长因子受体2蛋白全人单克隆抗体及其制备方法 |
KR100595364B1 (ko) | 2003-02-20 | 2006-07-03 | 재단법인 목암생명공학연구소 | Lk8 단백질을 유효성분으로 포함하는 항암제 |
US7191068B2 (en) | 2003-03-25 | 2007-03-13 | Proteogenix, Inc. | Proteomic analysis of biological fluids |
US20040191782A1 (en) | 2003-03-31 | 2004-09-30 | Yixin Wang | Colorectal cancer prognostics |
WO2005015218A1 (en) | 2003-07-21 | 2005-02-17 | Roche Diagnostics Gmbh | Use of proteins proteinase 3 (prn3) and leukocyte elastase inhibitor (ileu) as a marker for colorectal cancer |
ATE412182T1 (de) | 2003-07-21 | 2008-11-15 | Hoffmann La Roche | Verwendung der proteine proteinase 3 (prn3) und leukozyten elastatse inhibitor (ileu) als marker für kolorektale karzinome |
EP1664787A1 (en) | 2003-08-08 | 2006-06-07 | Roche Diagnostics GmbH | Use of protein t-plastin (plst) as a marker for colorectal cancer |
US20050187147A1 (en) | 2003-09-22 | 2005-08-25 | Newman Michael J. | Compositions and methods for increasing drug efficiency |
AU2004294526A1 (en) | 2003-12-03 | 2005-06-16 | Glycominds, Ltd | Method for diagnosing diseases based on levels of anti-glycan antibodies |
WO2005060996A2 (en) | 2003-12-23 | 2005-07-07 | Lauras As | Method of altering the pka type i signalling pathway |
US20050181398A1 (en) | 2004-01-16 | 2005-08-18 | Fung Eric T. | Specific detection of host response protein clusters |
EP2336779B1 (en) | 2004-02-19 | 2013-07-31 | Yale University | Kit for the identification of ovarian cancer protein biomarkers using proteomic techniques |
CA2569079A1 (en) | 2004-06-03 | 2005-12-15 | The Johns Hopkins University | Methods of screening for cell proliferation or neoplastic disorders |
US20090297523A1 (en) | 2004-07-27 | 2009-12-03 | Yale University | Erm family binding agents and their use in diagnosis and treatment of proliferative conditions |
AT500719B1 (de) * | 2004-09-08 | 2010-06-15 | Red Bull Gmbh | Chaperone als tumormarker |
JP2008527351A (ja) | 2005-01-06 | 2008-07-24 | イースタン バージニア メディカル スクール | 前立腺癌のバイオマーカーとしてのアポリポタンパク質a−iiアイソフォーム |
US20080286834A1 (en) * | 2005-01-27 | 2008-11-20 | Robert Forgan Halenbeck | Leader Sequences For Directing Secretion of Polypeptides and Methods For Production Thereof |
JP2008547028A (ja) | 2005-06-24 | 2008-12-25 | サイファージェン バイオシステムズ, インコーポレイテッド | 卵巣癌用のバイオマーカー |
EP1861716A2 (en) | 2005-08-18 | 2007-12-05 | Zadec Aps | Protein markers for diagnosing if colorectal cancer and use of said markers as drug targets for the treatment of said cance type |
EP1775590A1 (en) | 2005-10-11 | 2007-04-18 | Laboratorios S.A.L.V.A.T., S.A. | Non-invasive in vitro method to detect transitional cell carcinoma of the bladder |
US8043833B2 (en) * | 2005-10-31 | 2011-10-25 | Novo Nordisk A/S | Expression of soluble therapeutic proteins |
CN1967246A (zh) | 2005-11-18 | 2007-05-23 | 上海中科新生命生物科技有限公司 | 酰化氨基酸水解酶1及其抗体检测肝癌的应用 |
CA2633255A1 (en) | 2005-12-16 | 2007-06-21 | Electrophoretics Limited | Diagnosis and prognosis of colorectal cancer |
WO2007140352A2 (en) * | 2006-05-26 | 2007-12-06 | Invitrogen Corporation | Plasma membrane and secreted cancer biomarkers |
EP2057465A4 (en) * | 2006-08-09 | 2010-04-21 | Homestead Clinical Corp | SPECIFIC ORGAN PROTEINS AND METHODS OF USE |
EP2084531B1 (en) * | 2006-09-08 | 2013-11-06 | Institut Gustave Roussy | Compounds regulating calreticulin or kdel receptor cell surface exposure and uses thereof to evaluate the efficiency of a cancer treatment |
-
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2014
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-
2015
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Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6001632A (en) * | 1996-05-15 | 1999-12-14 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Human protein disulfide isomerase |
WO2002020731A2 (en) * | 2000-09-08 | 2002-03-14 | Bayer Aktiengesellschaft | Regulation of human protein disulfide isomerase-like enzyme |
JP2004198419A (ja) * | 2002-12-13 | 2004-07-15 | Bayer Healthcare Llc | Timp1を用いた検出方法 |
JP2008508538A (ja) * | 2004-08-02 | 2008-03-21 | チルドレンズ・メディカル・センター・コーポレイション | 癌についての血小板生物マーカー |
JP2008545634A (ja) * | 2005-05-21 | 2008-12-18 | プロテオジス アクチェンゲゼルシャフト | 癌危険度評価用アネキシン |
WO2007071366A1 (en) * | 2005-12-21 | 2007-06-28 | Roche Diagnostics Gmbh | Method of assessing colorectal cancer by measuring hemoglobin and m2-pk in a stool sample |
US20100111973A1 (en) * | 2006-09-22 | 2010-05-06 | Glenn Dranoff | Methods for treating mica-related disorders |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN5011009827; STIERUM R: 'PROTEOME ANALYSIS REVEALS NOVEL PROTEINS ASSOCIATED WITH PROLIFERATION AND DIFFERENTIATION OF THE CO' BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA V1650 N1-2, 20030821, P73-91, ELSEVIER * |
JPN5011009827; STIERUM R: 'PROTEOME ANALYSIS REVEALS NOVEL PROTEINS ASSOCIATED WITH PROLIFERATION 以下備考' BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA V1650 N1-2, 20030821, P73-91, ELSEVIER * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016512325A (ja) * | 2013-03-13 | 2016-04-25 | ユニバーシティ オブ リーズ | Acy−1の虚血/再灌流、移植片機能発現遅延及び移植片バイアビリティーのマーカーとしての使用及びその方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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