CN102089663B

CN102089663B - 体外诊断结直肠癌的蛋白质二硫化物异构酶测定方法

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Publication number: CN102089663B
Application number: CN200980126924.3A
Authority: CN
Inventors: Y·阿塔曼-厄纳尔; C·博利厄; S·比瑟雷特; J-P·沙里耶; G·肖凯-卡斯蒂勒夫斯基; D·罗兰
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 2008-07-10
Filing date: 2009-07-09
Publication date: 2014-09-03
Anticipated expiration: 2029-07-09
Also published as: JP2015096509A; JP2016040258A; US20110104701A1; CA2732676C; FR2933773A1; FR2933773B1; EP2294421B1; AU2009267844B2; US8367806B2; JP5856844B2; JP2011527429A; US20140039154A1; WO2010004214A1; CA2732676A1; JP6125588B2; AU2009267844A1; ES2579238T3; EP2294421A1; CN102089663A; US9388404B2

Abstract

本发明涉及体外诊断结直肠癌的方法，特征在于使用针对PDI表位的至少一种抗PDI单克隆抗体确定取自怀疑患有结直肠癌的患者的生物样品中蛋白质二硫化物异构酶肿瘤标记物的存在，所述PDI表位选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和在PDI的三维结构中与之接近的芳族氨基酸、以及SEQ ID No.3所示的表位。所述方法可用于对结直肠癌进行早期诊断、筛查、治疗随诊和预后，以及与结直肠癌相关的复发诊断。

Description

体外诊断结直肠癌的蛋白质二硫化物异构酶测定方法

本发明涉及癌学领域。更特别地，本发明的主题是体外诊断人类患者中结直肠癌的方法，通过确定取自这个患者的生物样品中蛋白质二硫化物异构酶的存在进行诊断，所述方法可以用于结直肠癌相关的早期诊断、筛查、治疗随诊和预后以及用于复发诊断。

结直肠癌(CRC)是主要的公众健康问题。在1996年估计全世界有875,000例新发病例¹。考虑到男女两种性别，这是在西方国家最常见的癌症，其通常被分类为是由于癌症所致死亡的前3名最常见疾病。所有阶段都考虑在内，5年存活率在60％的范围。

唯有早期诊断可以帮助治疗。然而目前还没有早期血清学筛查检测或者特异性诊断检测。

目前在欧洲进行的结直肠癌筛查是用两种不同方法进行：首先，使用亚临床(paraclinical)检测，其包括查找粪便中血液的存在(便潜血检测，FOBT，例如以Hemoccult名称销售)。这种技术已经证实其临床有效性。当在年龄为50-74岁的个体中每两年使用时，其可以使结直肠癌所致死亡率降低15-20％²。为此，需要一半以上的人群定期进行筛查以及对阳性检测结果的个体进行结肠镜检，任选随后进行适当治疗。

然而，这种筛查技术具有某些不利之处：

·这种检测的主要缺点是其灵敏性一般，特别是对于腺瘤(癌前异常病变)，如果其较大，通常导致1/10病例发生癌症。

·这种检测也不是非常特异性的。粪便中出现血液也许与非肿瘤病变相关：溃疡性结肠炎、痔疮、瘘管等。在这种情况中，必须进行结肠镜检查，其缺点在后文描述。

·最后，Hemoccult检测难以解释，其必须在专业中心由专业人士解读。

也已经描述了特异于人血红蛋白的免疫学检测(Feca EIAHemeSelect等)。与Hemoccult相比其可能取得进展，但其基本上还存在相同的问题。因此，由Enterix公司销售的InSure^TM可以检测87％的患有CRC的患者以及47％的具有癌前息肉的那些患者。这是在粪便中检测人血红蛋白的一种检测方法，更特别是检测这个分子的球蛋白部分。

另一种筛查方法是在50岁以后系统进行结肠镜检，这样在理论上可以降低结直肠癌所致死亡率。然而，在健康个体中使用内窥镜筛查以降低死亡率的这种检验的可接受性太低(在设立这种筛查策略的欧洲国家的结肠镜检查的依从水平为大约2％)。不仅存在一定的结肠穿孔和出血的危险(0.1‰)和死亡危险(1/10000)，而且对于公共卫生事业是非常昂贵的。此外，结肠镜检查需要非常限制性的提前结肠准备，这在很大程度上造成依从性不佳。

很久以来关于结直肠癌已经描述了可以通过免疫测定法测定的肿瘤标记物。这些标记物特别是癌胚抗原(CEA)和CA19-9。

使用CEA用于随诊。其不可以用于筛查或者早期诊断结直肠癌，因为其灵敏性和特异性不足。这是因为这种标记物也由其它类型癌症表达，在良性病变中也表达。尽管如此，通过将CEA与另一肿瘤标记物如CA19-9或者CA72-4组合可以增加灵敏性而不丧失特异性。

导致CA19-9发生生理变异的因素较罕见，但是其它良性病变(肝胆病变、胰腺病变)或者恶性病变可诱导CA19-9增加。单独的这种标记物因此对于诊断也是无意义的。尽管如此，因为其血清浓度与肿瘤的大小和转移癌的存在相关，因此其可用于治疗随诊或者早期证实复发。

此外，已经提出一些可商购的检测方法，如

由Ambrilia销售，这是针对CRC的一种快速且相对非侵入性筛查检测。Colopath检测具有结直肠病变的个体直肠粘液中缩醛磷脂(复合脂质，是磷脂的一部分)，而ColorectAlert^MD检测T-抗原，这是在直肠粘液中的一种复合糖。Colopath/ColorectAlert^MD检测包括将直肠粘液用于试纸条，基于Schiff反应获得阳性或者阴性结果。Ambrilia研究了1787名个体，证实Colopath/ColorectAlert^MD检测出54％的早期结直肠癌病例以及49％的所有阶段病例。

COLARIS，由Myriad Genetics销售，这是检测血液中MLH1和MSH2基因突变的一种检测方法，用以筛查遗传性非息肉型结肠癌(HNPCC综合征)。这个检测的结果在3周内获得。Myriad使用目前可用的最灵敏及最具有特异性的测序技术。这种检测方法很昂贵。

由AMDL销售，这是筛查不同类型癌症(肺癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌、胃癌等)的一种检测方法。因此其对于CRC是非特异性的。所述检测方法的原理基于双夹心ELISA技术(测定DR-70抗原)。通过酶反应揭示(抗体与生物素或者与链霉抗生物素蛋白结合)。显色反应表示存在癌症。

蛋白质二硫化物异构酶标记物(Swiss Prot No.P07237，也称作EC5.3.4.1，PDI，脯氨酰4-羟化酶亚基β，细胞甲状腺激素结合蛋白，PDI A1或者p55)是一种多功能蛋白质，其催化分子内二硫键的形成、破坏和重排。在细胞表面，其发挥还原酶作用并裂解附着于细胞的蛋白质的二硫键。在细胞内部，其是位于内质网腔内的可溶的分子，在此其形成并重排新合成的蛋白质的二硫键。其包含具有特征性CXXC基序的硫氧还蛋白(thioredoxin)类型的2个催化结构域。在高浓度，PDI作为伴侣蛋白，其抑制不正确折叠的蛋白质的聚集。在低浓度，其具有拮抗作用并促进所述聚集。PDI还形成不同酶的结构亚基，如脯氨酰羟化酶，其催化前胶原proα链的脯氨酸残基的羟化。已经发现PDI在癌细胞表面特别富集³。Tomonaga等⁴在结肠癌病例中观测到翻译后修饰。Stierum等⁵示出Caco-2结肠癌细胞系的分化伴随PDI的细胞浓度增加。在专利申请EP1724586中，PDI被描述为作为某些癌症的诊断标记物，如结肠癌。然而，仅举例说明了前列腺癌，由此目前为止还没有使用PDI作为标记物诊断结直肠癌的灵敏性和特异性诊断方法。最后，专利申请AT 500 719A示出与PDI A3不同，PDI不是结肠癌的标记物。

本申请人现在令人惊奇地证实结肠肿瘤不仅特异性分泌PDI，而且特别从癌组织中释放，正如后文更详细证实的那样，对其实施本发明方法的生物样品中的PDI浓度与在健康个体中确定的参考值相比是增加的，且使用特殊的抗-PDI单克隆抗体可以提供诊断结直肠癌的、灵敏且特异性的方法。

因此，本发明的第一个主题是体外诊断结直肠癌的方法，特征在于使用针对PDI表位的至少一种抗-PDI单克隆抗体确定取自怀疑患有结直肠癌的患者的生物样品、优选远离肿瘤的生物样品中蛋白质二硫化物异构酶的存在，所述表位选自序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和在PDI的三维结构中与之接近的芳族氨基酸、以及SEQ ID No.3所示的表位。

本发明还涉及这种方法在结直肠癌的早期诊断、筛查、治疗随诊和预后以及在结直肠癌复发诊断中的应用。

本发明的方法因此可以通过一种简便检测方法特异性和早期诊断结直肠癌，所述检测方法包括在取自患者的生物样品、优选远离可能的肿瘤的生物样品中搜索PDI的存在。

确定可能远离或者未远离肿瘤的生物样品中PDI的存在可以推断查找的病变。本发明方法的一个优势也在于使用远离潜在肿瘤的样品作为诊断样品，从而可以简便且非侵入性地诊断，而组织诊断需要侵入性的活组织检查。事实上，例如组织切片上组织标记物的研究(免疫组织化学)感兴趣的是预后，但是对于筛查或者诊断结直肠癌无意义。

短语“确定肿瘤标记物的存在”是指使用PDI表位的至少一种抗-PDI单克隆抗体确定所述蛋白质的存在，所述表位选自序列SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2和在PDI的三维结构中与之接近的芳族氨基酸、以及SEQ ID No.3所示的表位。

术语“表位”是指至少具有SEQ ID No.1-3所示序列的肽，且至多有10、8、6或者4个额外氨基酸均匀或者不均匀地分布在该序列的任一侧，或者仅在一侧，以及所述肽的类似物和同系物。

通常地，术语“类似物”是指这样的肽，与天然分子相比，其具有的序列呈现出一或多个氨基酸添加、取代(通常为保守取代)和/或缺失，并具有天然多肽的结构，条件是上述修饰不破坏抗原反应性。

特别优选的类似物包括保守取代，即在氨基酸家族中发生的取代。特别地，氨基酸通常被分为4个家族，即(1)酸性氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸，(2)碱性氨基酸如赖氨酸、精氨酸和组氨酸，(3)非极性氨基酸如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸，以及(4)无电荷极性氨基酸如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时也分类为芳族氨基酸。例如，可以适度地预测单独地用异亮氨酸或者用缬氨酸置换亮氨酸、用谷氨酸置换天冬氨酸或者用丝氨酸置换苏氨酸，或者用结构相关的另一氨基酸置换氨基酸的相似的保守置换，对于生物活性无明显影响。本领域技术人员可容易地确定感兴趣的肽分子可以耐受关于本领域熟知的Hopp/Woods和Kyte-Doolittle图的变化的区域。

术语“同源”是指两个肽分子之间的相同性百分比。当两个肽分子的氨基酸序列在一指定长度上呈现出至少60％、优选至少75％、更优选至少80-85％、更优选至少90％及更优选至少95-98％或者更高的序列相同性时，这两个氨基酸序列彼此是“基本同源的”。

短语“SEQ ID No.2和在PDI的三维结构中与之接近的芳族氨基酸所示的表位”是指这样的表位，其由从中衍生出该表位的蛋白质的两个不同部分组成，即SEQ ID No.2以及在蛋白质的三维结构中与之接近的芳族氨基酸所示的表位，识别这个表位的抗体需要识别这两部分。

短语“在蛋白质的三维结构中接近的芳族氨基酸”是指任何这样的芳族氨基酸，如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，其由于PDI的三维结构而变得与SEQ ID No.2接近。举例而言，这种合适的芳族氨基酸可以是在第209位的苯丙氨酸、在第206位的苯丙氨酸或者在第195位的酪氨酸。

短语“由结肠肿瘤释放”是指由肿瘤细胞自身或者由邻近的非肿瘤细胞在由于肿瘤发生导致细胞表型损伤或者修饰之后主动或者被动分泌或者释放肿瘤标记物，无论机制如何。

短语“对其实施本发明方法的生物样品”是指可含有感兴趣的肿瘤标记物的任何生物样品。举例而言，非远离肿瘤的生物样品是固体样品，如源自病人的肿瘤、这个肿瘤的活检组织、淋巴结或者转移癌的组织，或者纯化自这些固体样品的细胞。举例而言，远离肿瘤的生物样品是生物学液体如全血或者其衍生物，例如血清或者血浆、尿液、唾液和渗出液，骨髓和粪便，以及纯化自这些液体样品的细胞。优选血液或者其衍生物以及粪便、渗出物和纯化自这些液体样品的细胞。

本发明的方法可以通过检测除了PDI之外的至少一种其它肿瘤标记物而改良，优选所述其它肿瘤标记物也是由结肠肿瘤释放至癌组织之外。因此，组合至少两种标记物可以改良诊断结直肠癌的检验的特异性和灵敏性。

因此，本发明另一主题还包括确定选自如下两组标记物的至少一种其它肿瘤标记物的存在，所述标记物是单独或者组合的：

-A组：白细胞弹性蛋白酶抑制剂、埃兹蛋白(ezrin)、酰化氨基酸水解酶1、肝脂肪酸结合蛋白、肠脂肪酸结合蛋白、载脂蛋白AI、载脂蛋白AII和I-丝束蛋白，一些这些标记物是由本申请人鉴别的新标记物，

-B组：具有额外的诊断意义的标记物，即β2-微球蛋白、蛋白酶体20S、半乳凝集素-3、L-乳酸脱氢酶B链、钙网蛋白、再生胰岛衍生蛋白3α、肿瘤相关的钙信号转导蛋白1、角蛋白类型II细胞骨架8、角蛋白类型I细胞骨架18、角蛋白类型I细胞骨架19、上皮钙粘蛋白、CEA、绒毛蛋白、CA19-9、CA 242、CA 50、CA 72-2、睾酮、TIMP-1、Cripto-1、Intelectin-1、细胞角蛋白20、翻译控制的肿瘤蛋白、(前)防御素-A5；检测血液中那些甲基化模式具有特异性改变的DNA片段，例如AXL4基因的甲基化DNA(aristaless-like homeobox-4gene methylation)或者Septin-9基因的甲基化DNA；检测粪便DNA片段中特异性改变，如粪便DNA的特异性突变或者粪便DNA的甲基化模式的特异性改变；检测人粪便血红蛋白。

本发明的方法因此可通过检测至少两个标记物而改良，一个是PDI，另一个是选自A组的的肿瘤标记物，即白细胞弹性蛋白酶抑制剂、埃兹蛋白、酰化氨基酸水解酶1、肝脂肪酸结合蛋白、肠脂肪酸结合蛋白、载脂蛋白AI、载脂蛋白AII和I-丝束蛋白。

“新描述的肿瘤标记物”是指蛋白质或者信使RNA或者相应基因的特异性修饰，如突变或者甲基化。

白细胞弹性蛋白酶抑制剂肿瘤标记物(Swiss Prot No.P30740，也称作LEI、serpin B1、单核细胞/嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂、M/NEI或者EI)在1992年测序⁶。LEI通过形成在SDS作用下可以不解离的复合物而特异性抑制具有弹性蛋白酶类型或者糜蛋白酶性质的蛋白酶⁷。LEI因此抑制由嗜中性粒细胞产生的三种主要的蛋白酶：白细胞弹性蛋白酶、蛋白酶-3以及组织蛋白酶G。这些蛋白酶使免疫系统通过细胞外或者吞噬的底物蛋白酶解从而防御生物体。然而，当这些蛋白酶过量存在时，其导致炎症反应。LEI因此可具有调节和限制细胞蛋白酶诱导的炎症反应的作用。本申请人令人惊奇地部分揭示了这种蛋白质在取自患有结直肠癌的患者的生物样品中是良好的标记物，所述样品可能远离肿瘤。

所述埃兹蛋白标记物(Swiss Prot No.P15311，也称作p81、cytovillin或者绒毛蛋白-2)是这样的蛋白质，其提供细胞膜与细胞骨架的肌丝、特别是肠上皮细胞的微绒毛之间的结合⁸。W.G.Jiang和S.Hiscox⁹已经揭示了白细胞介素IL-2、IL-8、IL-10等可以抑制埃兹蛋白在HT29人结直肠癌细胞系中表达。该作者¹⁰揭示了抑制埃兹蛋白在HT115和HRT18结直肠癌细胞系中的表达降低细胞之间的粘附并增加细胞的活动及侵入行为。已经断定埃兹蛋白通过与细胞粘附分子E-钙粘蛋白和β-连环蛋白的相互作用而调节细胞/细胞及细胞/基质粘附。推测埃兹蛋白在控制癌细胞的侵入潜力中起重要作用。此外，T.Xiao等¹¹使用ELISA量化患有肺癌的患者的血浆埃兹蛋白。然而，与对照个体相比未观测到任何差异。本申请人令人惊奇地示出这种蛋白质在得自患有结直肠癌患者的生物样品中是良好的标记物，所述样品可以远离所述肿瘤。

酰化氨基酸水解酶1标记物(Swiss Prot No.Q03154，也称作EC3.5.1.14，N-酰基-L-氨基酸酰胺水解酶或者ACY-1)是酰化氨基酸水解酶家族的一部分。它们是催化酰化氨基酸水解的酶，以提供脂肪酸和氨基酸¹²。酰化氨基酸水解酶酶活性的免疫化学测定由K.Lorentz等在早如1975年揭示¹³，并用于测定不同的组织和血清¹⁴。研究表明酰化氨基酸水解酶是在肝病变而不是在结肠癌中活性增加。此外，已经在染色体3p21.1上鉴别酰化氨基酸水解酶1基因¹⁵。在小细胞肺癌中，3p21.1区域降低至纯合性，在这种情况中酰化氨基酸水解酶表达被抑制或者不可检测¹⁶。相似地，S.Balabanov等¹⁷揭示了酰化氨基酸水解酶表达在肾癌中被抑制。本申请人令人惊奇地揭示了这种蛋白质在取自结直肠癌患者的生物样品中是良好的标记物，所述样品可以远离所述肿瘤。

肝脂肪酸结合蛋白标记物(Swiss Prot No.P07148，也称作L-FABP、FABP1、FABPL、Z-蛋白质或者甾醇转运蛋白)属于FABP家族，该家族包含9个同种型。每个同种型根据首先在其中检测到该同种型的组织命名。这些特征性具有共有的功能和相似的三维结构，但是其序列同源性不高。L-FABP在1985年被测序¹⁸。其是15kDa的小蛋白质，在细胞溶质中富集且具有结合游离脂肪酸以及胆红素的能力。一些近来的研究似乎表明L-FABP蛋白质表达的削弱可诱导肿瘤发生过程。对于前列腺癌，L-FABP在肿瘤活检组织中的表达水平比在正常组织中的表达水平高10倍¹⁹。对于结肠癌，一些研究小组已经鉴别了L-FABP蛋白质在肿瘤组织中表达与在正常结肠粘膜中的表达相比降低，使用二维电泳技术进行²⁰。这个结果也已经通过免疫组织化学技术证实。此外，L-FABP蛋白质在结直肠癌转移至肝的患者中是预测肝切除的标记物²¹。本申请人令人惊奇地揭示了这个蛋白质在取自患有结直肠癌的患者的生物样品中是良好的标记物，所述样品远离所述肿瘤。

肠脂肪酸结合蛋白标记物(Swiss Prot No.P12104，也称作I-FABP、FABP-2或者FABPI)在1987年被测序²²。这是15kDa的小蛋白质，在细胞溶质中富集，且具有结合游离脂肪酸及结合胆红素的能力。I-FABP蛋白质在小肠肠道细胞中表达，且占这种细胞类型的蛋白质含量的2％。在组织水平，十二指肠和空肠与结肠相比含有显著较多量的I-FABP(空肠：4.8μg/g；结肠0.25μg/g)²³。I-FABP在健康个体的血浆样品中可以检测不到。另一方面，在某些病理状况如肠缺血、Crohn’s病或者原发性胆汁性肝硬化中，在某些个体中可以证实血浆I-FABP浓度增加²³。对于前列腺癌，已经示出I-FABP mRNA在肿瘤活检组织中的表达水平比在正常组织中高7倍¹⁹。在用azoxymethane诱导结直肠肿瘤的大鼠模型中，当该大鼠食用降低癌症发生的饮食(大豆蛋白或者乳清蛋白水解产物)时，I-FABP mRNA的表达水平降低2.92-3.97倍²⁴。本申请人令人惊奇地揭示了这个蛋白质在取自患有结直肠癌的患者的生物样品中是良好的标记物，所述样品可以远离所述肿瘤。

载脂蛋白是由极性氨基酸组成的蛋白质家族，其通过称作脂蛋白的亲水性大分子复合物的形成而可以在血液中转运脂质。对于每种人血浆载脂蛋白，存在衍生自遗传多态性和/或翻译后修饰的同种型，其在血液中的存在可以与某些病变相关²⁵。载脂蛋白的血浆浓度不是不明显，为1mg/ml²⁶。

载脂蛋白AI标记物(NCBI No.490098，也称作Apo A-I、Apo AI和ApoA1)是具有243个氨基酸的28kDa蛋白质。其基本上由肝和肠合成。这种蛋白质已经示出与在健康个体中相比其在患有结直肠癌患者血清中不够富集，通过SELDI-TOF测定²⁷。然而，本文指出通过组合Apo AI与其它蛋白质标记物可以区分患有CRC的患者与健康个体。此外，本文指出通过由另一小组进行的浊度免疫测定分析Apo AI未证实这个蛋白质在患有CRC的患者血清中不够富集²⁸。Hachem等²⁹在结直肠癌转移之后患有肝癌的患者血清中测定Apo AI。本申请人令人惊奇地示出通过免疫测定进行测定可以证实这个蛋白质在患有结直肠癌的患者中浓度降低，与先前Engwegen等²⁷所述相反，Engwegen等能证实这种降低仅通过实施SELDI-TOF技术实现。通过免疫测定在生物药品中测定Apo AI是诊断结直肠癌的良好方法，所述样品远离所述肿瘤，通过免疫测定进行的测定不是Zhang等²⁸研究小组使用的浊度测定法。

载脂蛋白AII标记物(Swiss Prot No.P02652，也称作ApoA II、Apo-AII和Apo A2)是17380-Da的蛋白质，由两条多肽链组成，每条链具有77个氨基酸，通过二硫键连接。与载脂蛋白AI相同，载脂蛋白AII基本上由肝和肠合成。Hachem等²⁹除了Apo AI之外，也测定了在结直肠癌转移后出现肝癌的患者血清中的Apo AII。然而，结果不明显，不能推断查找的病变。本申请人令人惊奇地揭示了这个蛋白质的浓度在结直肠癌患者中降低，使其在取白患有结直肠癌的患者的生物样品中是良好的标记物，所述样品远离所述肿瘤。

I-丝束蛋白(plastin)标记物(Swiss Prot No.Q14651，也称作小肠特异性丝束蛋白或者丝束蛋白1)属于人丝束蛋白家族，已知其三个代表性成员：I-丝束蛋白、L-丝束蛋白和T-丝束蛋白。一些作者将丝束蛋白(plastin)称作“丝束蛋白(fimbrin)”，另一些作者将丝束蛋白(fimbrin)命名为I-丝束蛋白。丝束蛋白是结合肌动蛋白以形成细胞骨架(细胞骨架)的蛋白质。他们是70kDa蛋白质，在真核生物进化中相对保守。它们呈现出强组织特异性，每次仅一种同种型存在于正常组织中³⁰。丝束蛋白关于癌症方面的应用在专利US-A-5 360 715中描述，其提议一种确定细胞是否是血细胞生成或者瘤形成的细胞、即癌性细胞的方法。这种方法主张在细胞水平测定L-丝束蛋白和T-丝束蛋白，更特别是测定其mRNA。然而，尽管具有这些性质，但是先前未进行使用血清或者粪便样品评估丝束蛋白在诊断结直肠癌中的重要性。此外，从未设想I-丝束蛋白是潜在的癌症标记物³¹。本申请人令人惊奇地揭示了这个蛋白质在取自患有结直肠癌患者的生物样品中是良好的标记物，所述样品远离或者未远离所述肿瘤。

选自A组的肿瘤标记物在实施本发明方法的生物样品中的浓度与针对健康个体确定的参考值相比增加或者降低。

本发明的方法也可以通过组合检测PDI与选自B组的一种其它肿瘤标记物而改良，所述B组标记物是β2-微球蛋白，蛋白酶体20S，半乳凝集素-3，L-乳酸脱氢酶B链，钙网蛋白，再生胰岛衍生蛋白3α，肿瘤相关的钙信号转导蛋白1，角蛋白类型II细胞骨架8，角蛋白类型I细胞骨架18，角蛋白类型I细胞骨架19，上皮钙粘蛋白，CEA，绒毛蛋白，CA19-9，CA242，CA 50，CA 72-2，睾酮，TIMP-1，Cripto-1，Intelectin-1，细胞角蛋白20，翻译控制的肿瘤蛋白质，(前)防御素-A5，检测血液中其甲基化模式具有特异性改变的DNA片段，例如AXL4基因的甲基化DNA(aristaless-样同源框-4基因甲基化)或者Septin-9基因的甲基化DNA，检测粪便DNA片段中特异性改变，如粪便DNA的特异性突变或者粪便DNA的甲基化模式的特异性改变，以及检测人粪便血红蛋白。当然，本发明的方法也可以在同一测定中实施PDI、选自B组的至少一种肿瘤标记物以及选自A组的至少一种其它肿瘤标记物的检测。

β2-微球蛋白标记物(Swiss Prot No.P61769，也称作β2-微球蛋白，β2M)是低分子量(11-12kDa)蛋白质，在大多数人有核细胞的表面发现。在患有癌症的某些患者血清中β2-微球蛋白水平增加，这种增加不具有特异性或者与肿瘤的性质、疾病的阶段或者严重性相关。在其它疾病中也观测到显著增加，如在红斑狼疮、类风湿性关节炎、干燥综合征、淋巴系统恶性肿瘤(多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤)、某些病毒性疾病(肝炎或者AIDS)以及在血友病患者中。由于β2-微球蛋白通过肾小球过滤且由近曲小管重吸收，因此其在血液中的浓度在肾病变情况中可以改变。因此测定β2-微球蛋白是最常用于肾病变的诊断或者获得性免疫缺陷病毒感染的随访。然而，已知这种标记物是肿瘤标记物，特别是针对结肠癌的标记物。

蛋白酶体20S标记物(也称作前体)是蛋白酶体的中心结构，其自身是与遍在蛋白的细胞内降解相关的分子复合物³²。蛋白酶体是700kDa的分子复合物，由28个亚基组成，7个亚基组成一个环，共4个环。在人体中，已知有7个α单位(α1、α2、α3、α4、α5、α6和α7)和10个β单位(β1、β2、β3、β4、β5、β6、β7、β1I、β2i和β5i)。通过其催化性质，蛋白酶体在细胞增殖、生长、调控和凋亡及因此在癌化途径中起重要作用。使用Bortezomib(Velcade)抑制蛋白酶体是一种公认的多发性骨髓瘤治疗方法。对于血液癌症或肿瘤正在进行II期或者III三期治疗实验。Lavabre-Bertrand等³³揭示了蛋白酶体的血清水平在某些病变中可以增高，特别是在癌症中(骨髓瘤、淋巴瘤和实体瘤)。

所述半乳凝集素-3标记物(Swiss Prot No.P17931，也称作Gal-3，半乳糖特异性凝集素3，MAC-2抗原，IgE-结合蛋白，35kDa凝集素，碳水化合物结合蛋白35，CBP 35，层粘蛋白结合蛋白，凝集素L-29，L-31，半乳糖苷结合蛋白或者GALBP)是能结合N-乙酰乳糖胺类型β-半乳糖苷结构的凝集素。其是具有参与多种生物功能的多功能蛋白质，所述功能包括肿瘤细胞粘附、增殖、分化、血管发生、凋亡、转移癌进展³⁴。多项研究已经示出Gal-3可以与多种分子组成复合物：CEA、IgE、层粘蛋白、粘蛋白、Mac-2BP、LAMP1、LAMP2、纤连蛋白等。Gal-3的血清测定已经由I.Iurisci等描述³⁵。Gal-3被捕获在用Mac-2-结合蛋白(Gal-3-结合蛋白)包被的微滴定平板上，然后用抗-Gal-3大鼠抗体揭示。这项研究表明在胃肠道癌症、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑素瘤和非霍奇金淋巴瘤的情况中，Gal-3的血清水平增加。

L-乳酸脱氢酶B链标记物(Swiss Prot No.P07195，也称作LDH-B，LDH心肌亚单位(heart unit)或者LDH-H)是可以形成同源四聚体形式复合物的蛋白质。这种蛋白质也可以与L-乳酸脱氢酶A链蛋白质(Swiss Prot No.P00338，也称作LDH-A，LDH肌单位或者LDH-M)形成异源四聚体形式复合物。在一些实体瘤中，称作LDH的四聚体复合物在血流中的血清剂量和/或血清酶活性与肿瘤的大小成比例地增加。推荐其与人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)和胎盘碱性磷酸酶组合用于精囊癌的治疗随诊中。LDH被认为是预后淋巴瘤、白血病和结肠癌的重要标记物³⁶。

钙网蛋白标记物(Swiss Prot No.P27797，也称作CRP55，calregulin，HACBP，ERp60或者grp60)是一种多功能蛋白质。其是能与实际上内质网的所有单糖基化蛋白质瞬时相互作用的凝集素。D.J.McCool等³⁷因此揭示了钙网蛋白参与结肠粘蛋白MUC2的成熟。专利申请WO 03/065003中描述了一种诊断CRC的方法，该方法使用测定组织、粪便或者体液中的钙网蛋白。

再生胰岛衍生蛋白3α标记物(Swiss Prot No.Q06141，也称作Reg III-α，胰腺炎-相关蛋白1或者胰腺炎相关蛋白I(PAP 1))是在健康胰腺中弱表达的蛋白质。其在急性胰腺炎期间及在某些慢性胰腺炎患者中过表达。在这种情况中，其在胰液及在血流中出现³⁸。Y.Motoo等³⁹通过ELISA示出血液中PAP 1的水平在某些患有结肠癌、胃癌、肝癌或者胰腺癌的患者中增加，以及在肾功能不全的患者中也增加。为此，使用由Dynabio公司(La Gaude，France)销售的ELISA(PANCEPAP)。

肿瘤相关的钙信号转导蛋白1标记物(Swiss Prot No.P16422，也称作主要胃肠道肿瘤相关蛋白GA733-2，上皮细胞表面抗原，EpCAM，上皮细胞糖蛋白，EGP，腺癌相关抗原，KSA，KS 1/4抗原，细胞表面糖蛋白Trop-1或者CD326抗原)，在1979年由于其被结直肠癌细胞的抗体识别的能力而被鉴定⁴⁰。这种蛋白质有许多如上述的名称，但是最常用的是EpCAM。其是在某些上皮和一些癌症的细胞基底外侧表面表达的跨膜蛋白质⁴¹。在早如1982年，Herlyn等⁴²揭示了在结直肠癌患者中注射抗-EpCAM单克隆抗体可以抑制肿瘤生长。这些结果使得可以基于称作edrecolomab的抗-EpCAM抗体开发抗肿瘤治疗方式。这种治疗方式以Panorex^TM名称销售。此外，Abe等⁴³通过ELISA测定示出称作MK-1的可溶形式的EpCAM在进行研究的10％癌症患者的血流中增加。

细胞角蛋白是组成上皮细胞细胞骨架的中间丝的蛋白质的一部分。目前已经鉴别了超过20种人细胞角蛋白。细胞角蛋白8(Swiss Prot No.P05787，也称作细胞角蛋白-8，CK-8，角蛋白-8或者K8)、18(Swiss Prot No.P05783，也称作细胞角蛋白-18，CK-18，角蛋白-18或者K18)和19(Swiss ProtNo.P08727，也称作细胞角蛋白-19、CK-19、角蛋白-19或者K19)在上皮细胞中最富集，是诊断癌症病变的有效工具⁴⁴。这种临床重要性与细胞凋亡或者增殖阶段中上皮细胞释放细胞角蛋白相关。在细胞凋亡中，这种释放以可溶的片段形式发生，其似乎在caspases的蛋白酶解作用下出现。血流中未降解的细胞角蛋白形式从未描述。临床最常用的三种细胞角蛋白测定是组织多肽抗原(TPA)测定，组织多肽特异性抗原(TPS)测定以及CYFRA21-1测定。TPA是广谱检测，其测量细胞角蛋白8、18和19。TPS和CYFRA21-1测定更具特异性，分别测量细胞角蛋白18和细胞角蛋白19的片段。这三个测定检测可能以自身或者蛋白质复合物形式存在的可溶的细胞角蛋白片段。TPA、TPS或者CYFRA-21-1已经用于结直肠癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和某些ENT癌的治疗随诊。测定血液中可溶的细胞角蛋白片段在筛查复发疾病或者评估所用治疗(放疗、化疗、激素治疗)的作用中具有临床价值。定期测定特别可以评估肿瘤体进展。可溶的血液细胞角蛋白的量对于肿瘤阶段以及转移的形成具有预测意义。目前最常用的细胞角蛋白血液测定是CYFRA21-1。其被高度推荐为患有小细胞肺癌的患者的治疗随诊中。目前对于TPA(AB Sangtec Medical Co.，Byk-Roland等)、TPS(IDL Biotech AB，BEKI Diagnostics等.)和CYFRA-21-1(Roche Diagnosiss，CIS Bio-International，Fujirebio Diagnostics等)有各种可商购的测定。此外，H.Kim等⁴⁵已经示出测定粪便细胞角蛋白19(DiNonAInc.)组合便潜血测定可用于筛查胃肠道疾病。最后，使用细胞角蛋白20(Swiss Prot No.P35900，也称作角蛋白，I型细胞骨架20，CK-20，角蛋白-20，K20或者IT蛋白)在结直肠癌中作为标记物在专利申请US2002/0160382中描述。

上皮钙粘蛋白标记物(Swiss Prot No.P12830，也称作E-钙粘蛋白，uvomorulin，钙粘蛋白-1，CAM 120/80或者CD324抗原)是一种跨膜蛋白，其介导钙依赖性细胞粘附。其在上皮细胞中特异性表达，在此其参与维持其表型。E-钙粘蛋白的胞质结构域结合β-连环蛋白，所述β-连环蛋白自身结合细胞骨架的肌动蛋白丝网。这种E-钙粘蛋白/β-连环蛋白结合在稳定上皮组织中细胞/细胞粘附中起重要作用。E-钙粘蛋白的丧失因此可降低细胞粘附并因此增加癌细胞的侵润能力。E-钙粘蛋白或者β-连环蛋白表达降低通常与肿瘤特别是胃肠道癌症的更大的侵润性和去分化相关。F.Roca等⁴⁶因此示出患有结直肠癌且低表达E-钙粘蛋白的患者与具有正常表达水平的患者相比具有更不佳的预后。在早如1983年，Damsky等⁴⁷揭示了可溶形式的E-钙粘蛋白可以由MCF-7乳腺癌细胞系释放。这种可溶形式相应于E-钙粘蛋白胞外部分的裂解。随后，Katayama等⁴⁸揭示了在癌症患者中可溶形式的E-钙粘蛋白可以被释放进入血流中，Willmanns等⁴⁹揭示了结直肠癌患者血液中E-钙粘蛋白的量增加与肿瘤阶段相关。此外，TakaraBioChemicals公司(Tokyo，Japan)提供了可商购的试剂盒。

在1965年由P.Gold和S.Freedman⁵⁰提议测定CEA(癌胚抗原)诊断结直肠癌，但是在血液中测定这个标记物对于诊断相对未进展(nonadvanced)阶段结直肠癌的灵敏性不佳。因此特别推荐测定血清CEA以评估肝癌转移的危险⁵¹以及治疗随诊。此外，其对于结直肠癌不是非常具有特异性的标记物；事实上其在许多其它癌症(肺癌、乳腺癌等)中也增加。另一方面，测定粪便CEA看起来比测定血清CEA或者比测定便潜血更灵敏且更具特异性⁵²。然而，这种测定仍未被常规提议。

反应性抗原性决定簇1116-NS-19-9，更通常被称作CA19-9(碳水化合物抗原19.9)是由高分子量蛋白质携带⁵³。测定血液中CA 19-9比CEA更具有特异性。在结直肠癌、胰腺癌和肝癌(肝胆管型肝癌)中，血液CA 19-9水平增加，但是在一些非癌病变(胆管炎)中也增加。在癌症诊断及病变治疗随诊中推荐其与CEA组合使用。

J.Holmgren等⁵⁴揭示了在结直肠癌中血液CA 50抗原的量增加。CA 50抗原通过其被特异性单克隆抗体识别的能力界定。

关于CA 72标记物，T.L.Klug等⁵⁵揭示了在结直肠癌中血清CA 72抗原的量增加。CA 72抗原通过其被特异性单克隆抗体识别的能力界定。

相似地，P.Kuusela等⁵⁶揭示了在结直肠癌中血清CA 242抗原的量增加。CA 242抗原通过其被特异性单克隆抗体识别的能力界定。

在男性中测定睾酮用以诊断结直肠癌已经由M.Holland等⁵⁷提议。这些作者揭示了在结直肠癌中血液睾酮水平降低。

关于TIMP-1，或者1型基质金属蛋白酶的组织抑制剂标记物，专利申请US 2007/0020707描述了通过在体液中测定TIMP-1用以诊断结直肠癌。

F.Model等⁵⁸在2006年7月在世界胃肠道癌症代表大会(WorldCongress on Gastrointestinal Cancer)期间提出可以检测结直肠癌患者血浆中甲基化形式的Septin-9基因。

M.P.Ebert等⁵⁹揭示了ALX4基因或者aristaless-样同源框-4基因在结直肠癌患者血清中比在对照血清中通常更甲基化(P＜0.0001)。使用41.4pg/mL阈值，获得灵敏性为83.3％及特异性为70％。

绒毛蛋白在专利申请FR2581456中被描述为是诊断结直肠癌的血液标记物。

C.Bianco等⁶⁰揭示了在结直肠癌中血清Cripto-1的量增加。

专利申请US 2003/0082533描述了测定Intelectin-1(Swiss Prot No.Q8WWA0，也称作肠乳铁蛋白受体，呋喃半乳糖-结合凝集素，内皮细胞凝集素HL-1或者omentin)诊断结直肠癌。

使用翻译控制的肿瘤蛋白(Swiss Prot No.P13693，也称作TCTP，p23，组胺释放因子，HRF或者fortilin)以及前防御素-A5(Swiss Prot No.Q01523)在结直肠癌中作为标记物分别在专利申请US 2003/0172388和US 2006/0179496中描述。术语“(前)防御素”是指前体，即裂解之前的前防御素，前肽，即在前防御素裂解之后的N-末端部分，成熟蛋白质，即防御素，相应于裂解之后C-末端部分。

最后，测定人粪便血红蛋白是一项已知技术，可以如先前所述实施。

与针对健康个体确定的参考值相比，对其实施本发明方法的生物样品中选自B组的肿瘤标记物的浓度增加或者降低。

优选地，B组肿瘤标记物选自：标记物：β2-微球蛋白，蛋白酶体20S，半乳凝集素-3，L-乳酸脱氢酶B链，钙网蛋白，再生胰岛衍生蛋白3α，肿瘤相关的钙信号转导蛋白1，上皮钙粘蛋白，CEA，CA19-9，睾酮，TIMP-1，Intelectin-1，细胞角蛋白20，翻译控制的肿瘤蛋白，(前)防御素-A5，以及检测人粪便血红蛋白。

当然，本发明的方法也可以包括检测本领域技术人员已知的结直肠癌的任何其它标记物。

与总是以蛋白质形式被检测的PDI相反，除了PDI之外的感兴趣的肿瘤标记物以蛋白质形式或者以信使RNA形式检测，或者通过相应DNA的改变(突变或者甲基化修饰)而检测。

确定生物样品中感兴趣的“蛋白质”肿瘤标记物的存在可以通过本领域技术人员已知的确定样品中蛋白质存在的任何方法进行，例如生物化学检测方法，包括免疫测定，或者通过质谱分析。

所述生物化学检测可以是本领域技术人员已知的任何检测，包括分子相互作用，即所述肿瘤标记物与特异于或者非特异于所述肿瘤标记物的一或多个结合配体之间的反应。

优选地，所述生物化学检测是本领域技术人员已知的免疫测定，包括肿瘤标记物(抗原)与一或多个更特异性的结合配体(即这种抗原的抗体)之间的免疫反应。

特异于或者非特异于本发明方法中的肿瘤标记物的结合配体是能结合该标记物的任何配体。当其能以高特异性或者甚至100％特异性结合这些标记物时，称其为是特异性的。当其结合这些标记物的特异性较低以及其能结合其它配体如蛋白质时，称其为非特异性的。例如，可以提及的是抗体、抗体部分、受体及能结合这种标记物的任何其它分子。

所述结合配体抗体例如是多克隆抗体或者单克隆抗体。

多克隆抗体可以通过用所述肿瘤标记物免疫接种动物，随后回收纯化形式的希望的抗体，通过从所述动物中取血清，使所述抗体与其它血清组成成分分离，特别是在附着由所述抗体、特别是所述标记物特异性识别的抗原的层析柱上通过亲和性层析而分离。

所述单克隆抗体可以通过杂交瘤技术获得，这种技术的一般原理在后文复述。

首先，用感兴趣的肿瘤标记物对动物通常是小鼠进行免疫接种，然后所述动物的B淋巴细胞能产生所述抗原的抗体。这些产生抗体的淋巴细胞随后与“无限增殖化”的骨髓瘤细胞(在实施例中是小鼠细胞)融合，以产生杂交瘤。使用由此获得的细胞的异源混合物，选择能产生特定抗体及能无限繁殖的细胞。每个杂交瘤以克隆形式繁殖，导致单克隆抗体产生，可以检测所述肿瘤标记物识别性质，例如通过ELISA、一维或者二维Western印迹、免疫荧光或者利用生物传感器进行。随后纯化由此选择的单克隆抗体，特别是根据上述亲和性层析技术进行。

单克隆抗体也可以是利用本领域技术人员熟知的技术通过遗传工程获得的重组抗体。

抗蛋白质二硫化物异构酶抗体的实例是已知的，且特别可在Abcam目录中获得，抗-PDI单克隆抗体，克隆RL77，Cat.No.Ab5484以及兔抗-PDI多克隆抗体，Cat.No.Ab3672。

抗-白细胞弹性蛋白酶抑制剂抗体的实例是已知的，且特别可得自Abcam目录，兔抗-LEI多克隆抗体，Cat.No.Ab47731。抗-LEI单克隆抗体，克隆ELA-1，已经由Yasumatsu等⁶¹在文章中描述。

抗-埃兹蛋白抗体的实例是已知的，且特别可得自Abcam目录，抗-埃兹蛋白单克隆抗体，克隆3C12，Cat.No.Ab4069，以及兔抗-埃兹蛋白多克隆抗体，Cat.No.Ab47418。

抗-酰化氨基酸水解酶1抗体的实例是已知的，且特别可得自Abnova目录，抗-酰化氨基酸水解酶1单克隆抗体，克隆4F1-B7，Cat.No.H00000095-M01，以及Abcam目录，鸡抗-酰化氨基酸水解酶1多克隆抗体，Cat.No.Ab26173。

抗-肝脂肪酸结合蛋白抗体的实例是已知的，且特别可得自Abcam目录，抗-L-FABP单克隆抗体，克隆6B6，Cat.No.Ab10059，以及兔抗-L-FABP多克隆抗体，Cat.No.Ab7807。

抗-肠脂肪酸结合蛋白抗体的实例是已知的，且特别可得自R&DSystems目录，抗-I-FABP单克隆抗体，克隆323701，Cat.No.MAB3078，以及Abcam目录，兔抗-I-FABP多克隆抗体，Cat.No.Ab7805。

抗-载脂蛋白AI抗体的实例是已知的，且特别可得自Biodesign MeridianLife Sciences目录，抗-Apo AI单克隆抗体，克隆4A90，Cat.No.H45402M，以及山羊抗-Apo AI多克隆抗体，Cat.No.K45252P。

抗-载脂蛋白AII抗体的实例是已知的，且特别可得自US Biological目录，抗-Apo AII单克隆抗体，克隆1402，Cat.No.A2299-31C，以及BiodesignMeridian Life Sciences目录，山羊抗-Apo AII多克隆抗体，Cat.No.K74001P。

抗-I-丝束蛋白多克隆抗体的实例是已知的，且特别可得自Santa CruzBiotechnology目录。兔多克隆抗体H-300(Cat.No.sc-28531)与I-、L-和T-丝束蛋白反应。本申请人揭示了抗I-丝束蛋白的单克隆抗体。

抗-β2-微球蛋白、抗-CEA、抗-CA19-9和抗-睾酮抗体的实例是已知的，且特别是用于本申请人测定试剂盒中的那些，分别是Vidasβ2-微球蛋白、VidasCEA、VidasCA19-9^TM和Vidas睾酮。

抗-蛋白酶体20S抗体的实例是已知的，特别是Affinity ResearchProducts目录中那些。

抗-半乳凝集素-3、抗-L-乳酸脱氢酶B链、抗-钙网蛋白、抗-肿瘤相关的钙信号转导蛋白1、抗-角蛋白类型II细胞骨架8、抗-角蛋白类型I细胞骨架18、抗-角蛋白类型I细胞骨架19、抗-上皮钙粘蛋白、抗-绒毛蛋白以及抗-TIMP-1抗体的实例是已知的，特别是Abcam目录中那些。

抗-再生胰岛衍生蛋白3抗体的实例是已知的，特别是用于Dynabio测定试剂盒(La Gaude，France)中的那些。

抗-CA 242、抗-CA 50和抗-CA 72-4抗体的实例是已知的，特别是在Fujirebio目录中那些。

抗-Intelectin-1抗体的实例是已知的，特别是Alexis Biochemicals目录，抗-Intelectin-1单克隆抗体，克隆Saly-1，Cat.No.ALX-804-850-C100，以及兔抗-Intelectin-1多克隆抗体，Cat.No.ALX-210-941。

抗-细胞角蛋白20抗体的实例是已知的，且特别可得自Abcam目录，抗-细胞角蛋白20单克隆抗体，克隆Ks20.8，Cat.No.Ab962，以及兔抗-细胞角蛋白20多克隆抗体，Cat.No.Ab36756。

抗-TCTP抗体实例是已知的，且特别可得自Abnova目录，抗-TCTP单克隆抗体，克隆3C7，Cat.No.157H00007178-M01和抗-TCTP多克隆抗体，Cat.No.157H00007178-A01。

抗-防御素-A5抗体的实例是已知的，且特别可得自Santa CruzBiotechnology目录，抗-防御素-A5单克隆抗体，克隆8C8，Cat.No.sc-53997，以及Alpha Diagnosis International Inc.目录，兔抗-防御素-A5多克隆抗体，Cat.No.HDEFA51-A。

特异于或者非特异于本发明方法中肿瘤标记物的结合配体可以用作捕获试剂，作为检测试剂或者作为捕获和检测试剂。

免疫反应，即肿瘤标记物/结合配体的结合，可以通过任何检测方式观测，如直接或者间接方式。

在直接检测中，即不包含标记的检测中，通过例如表面离子共振法或者通过在具有传导聚合物的电极上循环伏安法观测所述免疫反应。

间接检测是通过“显示试剂”结合配体或者感兴趣的肿瘤标记物自身标记进行。在后者中，这种方法被称作竞争方法。

术语“标记”是指能直接或者间接产生可检测信号的标记试剂的附着。这些标记试剂非限制性地包括：

·酶，其产生可以例如通过比色、荧光或者发光检测的信号，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或者葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，

·生色团，如荧光或者发光化合物或者染料，

·放射性分子，如³²P、³⁵S或者¹²⁵I，以及

·荧光分子，如Alexa或者藻蓝蛋白。

也可以使用间接检测系统，例如能与抗配体反应的配体。成对的配体/抗配体为本领域技术人员熟知，可以是例如如下配对：生物素/链霉抗生物素蛋白，半抗原/抗体、抗原/抗体、肽/抗体、糖/凝集素、多核苷酸/与该多核苷酸互补的序列。在这种情况中，其是携带结合配对体的配体。抗配体可以通过先前段落中描述的标记试剂直接检测，或者可以通过配体/抗配体自身检测。

这些间接检测系统在一定条件下可以导致信号放大。这种信号放大技术为本领域技术人员熟知，参见本申请人先前的专利申请FR98/10084或者WO-A-95/08000以及Chevalier等⁶²的文章。

根据使用标记的类型，本领域技术人员加入试剂以可以观测所述标记。

举例而言，上述免疫测定可以提及的是“夹心”方法，如ELISA、IRMA和RIA，“竞争”方法和直接免疫检测方法如免疫组织化学、免疫细胞化学、Western印迹以及斑点印迹。

质谱分析也可以用于在生物样品中检测本发明方法中的肿瘤标记物。质谱分析的原理为本领域技术人员已知，在例如Patterson，S.⁶³中描述。

为此，使已经预处理或者未预处理的生物样品经过质谱分析仪，并将获得的质谱与本发明方法中的肿瘤标记物的质谱对比。举例而言，样品预处理包括使其经过免疫捕获支持物，所述免疫捕获支持物包含本发明方法中肿瘤标记物的结合配体之一，例如本发明方法中肿瘤标记物的抗体。样品预处理的另一实例可以是对所述生物样品进行预分级分离，以使样品蛋白质彼此分离。在本领域技术人员熟知的技术中，样品的主要蛋白质可例如首先被耗竭。

当本发明的方法是“夹心”方法时，可以使用两种单克隆抗体或者一种单克隆抗体和一种多克隆抗体。当然，在后者情况中，单克隆抗体至少是抗PDI表位的抗-PDI单克隆抗体，所述表位选自序列SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2和在PDI的三维结构中与之接近的芳族氨基酸、以及SEQ ID No.3所示的表位。

已知抗-蛋白质二硫化物异构酶抗体的实例，特别是Abcam目录，例如兔抗-PDI多克隆抗体，Cat.No.Ab3672。

另一方面，抗-PDI抗体特异性结合选自序列SEQ ID No.1、SE ID NO.2或者SEQ ID No.3所示的表位，由此其特异性结合PDI且不结合PDIs A3和A6，所述抗体是新的抗体，且构成本发明的另一主题。

根据本发明的一个实施方案，本发明的方法使用两种单克隆抗体，优选序列SEQ ID No.3所示表位的至少一种抗-PDI单克隆抗体以及选自序列SEQ ID No.1以及SEQ ID No.2和在PDI的三维结构中与之接近的芳族氨基酸所示PDI表位的至少一种其它单克隆抗体。更优选地，本发明的方法使用序列SEQ ID No.1所示表位的至少一种抗PDI抗体以及序列SEQ ID No.3所示表位的至少一种其它抗体。

在生物样品中确定感兴趣的“mRNA”肿瘤标记物的存在可以通过确定样品中mRNA存在的任何方法进行，即mRNA的直接检测方法或者mRNA的间接检测方法，或者通过确定样品中RNA存在的任何其它方法进行，这些方法为本领域技术人员已知。

术语“mRNA的直接检测”是指证实mRNA自身存在于所述生物样品中。

生物样品中mRNA的直接检测可以通过本领域技术人员已知的任何方式进行，例如通过与特异于该mRNA的结合配体杂交，在适当情况中是在通过PCR或者NASBA技术扩增之后进行。

术语“杂交‘是指这样的过程，在此期间在合适条件下，两个核苷酸片段彼此通过稳定和特异性氢键结合，以形成双链复合体。这些氢键在互补的碱基腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)(或者尿嘧啶(U))(称作A-T键)之间形成，或者在互补的碱基鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)(称作G-C键)之间形成。两个核苷酸片段的杂交可以是完全的(互补核苷酸片段或者序列)，即在这个杂交期间获得的双链复合体仅包含A-T键和C-G键。这种杂交可以是部分杂交(充分互补的核苷酸片段或者序列)，即获得的双链复合体包含可以形成双链复合体的A-T键和C-G键，但是也包含于互补碱基不键合的碱基。在两个核苷酸片段之间的杂交依赖于使用的运行条件，特别是严格性。所述严格性特别定义为与两个核苷酸片段的碱基成分成函数关系，与两个核苷酸片段之间的错配程度也相关。所述严格性也依赖于反应参数，如杂交溶液中存在的离子的浓度和类型，变性剂的性质和浓度和/或杂交温度。所有这些数据均为本领域技术人员熟知，且其可以确定合适的条件。通常地，根据希望杂交的核苷酸片段的长度，杂交温度在大约20-70℃之间，特别是在35-65℃之间，盐溶液浓度为大约0.5-1M。特异于或者非特异于mRNA的结合配体是能结合该mRNA的任何配体。例如可以提及的是核酸探针、扩增引物，以及能结合该mRNA的任何其它分子。

术语“杂交”探针是指包含5-100个核苷酸单位、特别是10-35个核苷酸单位的核苷酸片段，在指定条件下具有杂交特异性以与特异于感兴趣的靶基因的材料形成杂交复合物。所述杂交探针可包含使其得以检测的标记。

对于本发明，术语“扩增引物”是指包含5-100个核苷酸单位、优选15-30个核苷酸单位的核苷酸片段，使得酶聚合作用特别是如酶扩增反应起始。术语“酶扩增反应”是指通过至少一种酶的作用而产生核苷酸片段的多个拷贝的过程。这种扩增反应为本领域技术人员熟知，可特别提及的是如下技术：

-PCR(聚合酶链反应)，如专利US 4 683 195、US 4 683 202和US4 800 159所述，

-NASBA(基于核酸序列的扩增)，见专利申请WO 91/02818所述，

-TMA(转录介导的扩增)，见专利US 5 399 491所述。

术语“检测”是指物理方法，或者使用嵌入染料如SYBRGreen I或者溴化乙锭的化学方法，或者使用标记的检测方法。现有许多检测核酸的检测方法⁶⁴。合适的标记如上所述。

对于本发明，杂交探针可以是“检测”探针。在这种情况中，“检测”探针通过使用上述标记进行标记。借助于这个标记的存在，可以检测指定的检测探针与被检测的转录体之间的杂交反应的存在。

所述检测探针可特别是“分子信标”检测探针⁶⁵。这些“分子信标”在杂交期间成为荧光的。它们具有茎环结构，且含有荧光团和猝灭基团。特异性环序列与其互补靶核酸序列的结合导致所述茎的不折叠，且在以合适波长激发期间发射荧光信号。

所述杂交探针也可以是“捕获”探针。在这种情况中，所述“捕获”探针可以通过任何适当方式即直接或者间接固定在或者可以固定在固体支持物上，例如通过共价或者吸附方式固定。合适的固体支持物为本领域技术人员熟知，例如可以提及的是合成材料或者天然材料、乳胶、磁性颗粒、金属衍生物、凝胶等。所述固体支持物可以使微滴定平板形式，如专利申请WO-A-94/12670所述的膜，或者颗粒。也可以将一些不同的捕获探针固定在支持物上，每个捕获探针特异于靶转录体。特别地，可以使用其上固定了大量探针的生物芯片作为支持物。

探针固定在支持物上也为本领域技术人员已知，可以提及的是通过直接转移、微沉积、原位合成及光刻法(photolithography)固定探针。

在生物样品中证实编码感兴趣的肿瘤标记物的基因中的DNA修饰或者异常可以通过确定样品中DNA改变的任何方法进行，即直接检测突变，或者证实感兴趣的基因座的甲基化模式的改变，或者确定样品中DNA改变的任何其它方法，这些方法为本领域技术人员已知。

所述突变可包括一个核苷酸由另一核苷酸的点取代，缺失一或多个核苷酸以及插入一或多个核苷酸。所述突变可位于感兴趣的肿瘤标记物基因的编码部分，或者在5’和3’非编码部分，如转录启动子区域或者转录终止区域。

证实突变的策略基于分子生物学技术，包括DNA提取、PCR扩增或者另一扩增技术、杂交和/或测序步骤。在结直肠癌的情况中，如下方法已经成功用于检测粪便DNA中的突变：通过沉淀浓缩DNA，使用捕获寡核苷酸在磁珠上富集所述靶，通过PCR扩增感兴趣的基因，固相测序以鉴别点突变⁶⁶。针对预期的参考片段与突变片段之间大小的不同鉴别缺失。Imperiale等⁶⁶描述了位于K-ras、APC和p53基因中的一组21个突变，使得可以检测16/31的扩散的癌症。

使用的其它DNA标记物是BAT-26缺失，其是的微卫星DNA和称作长DNA(L-DNA)的可高度扩增的DNA的不稳定性的标志，其不是特异性标记物，但是似乎反映结肠腔内脱落的肿瘤细胞紊乱凋亡⁶⁷。这些标记物在灵敏性或者特异性方面不令人满意。

如先前指出，DNA改变也可以相应于感兴趣的肿瘤标记物的相应基因甲基化模式的修饰。甲基化模式的修饰可相应于低甲基化(hypomethylation)(甲基化数目降低)或者高甲基化(hypermethylation)(甲基化数目增加)。改变的单位可以位于感兴趣的肿瘤标记物基因的编码部分，或者位于5’和3’非编码部分，如转录启动子区域或者转录终止区域。

DNA甲基化的分析可以使用基于定性和/或定量PCR技术进行，如MSP(甲基化特异性PCR)，亚硫酸氢盐测序，用甲基化敏感的限制酶消化结合PCR，COBRA(组合的亚硫酸氢盐限制分析)和Ms-SNuPE(甲基化敏感性单一核苷酸引物延伸)。对比参考所有这些技术，在方法学文献中详细描述⁶⁸。

在文献中，已经报道了结直肠癌基因中的一些高甲基化的基因。例如，可以提及的是ALX4(aristaless-样同源框-4)基因⁵⁹，TPEF/HHP1(含有表皮生长因子的跨膜蛋白和卵泡抑素(follistatin)结构域)基因⁶⁹的启动子区域或者Septin-9基因⁷⁰。

在本发明方法中，当检测至少两个标记物时，可以通过单独例如使用不同的免疫测定测量法或者同时在多元测定中证实。

在本发明方法中，当检测不同性质的两个标记物时，例如蛋白质标记物和mRNA标记物，可以使用选自上述那些方法的两种不同检测方法。也可以在同一检测介质及在相同反应条件下同时检测，如专利申请WO 03/104490所述。本专利申请中描述的检测方法包括同时检测样品中杂交和免疫反应，所述样品可含有由至少一种核酸及不同性质的至少一种其它配体组成的靶分析物，所述方法的步骤包括：

(i)将在反应缓冲液中稀释的已知体积量的样品沉积在用所述靶分析物的捕获配体预包被的捕获表面上，所述捕获配体包含至少一种核酸探针和至少一种抗配体，

(ii)在15℃-60℃温度之间进行反应，以及

(iii)观测因此获得的杂交和免疫反应。

所述生物样品可需要特殊处理，因为其也许含有本发明方法中的肿瘤标记物，或者其也许含有具有本发明方法中的标记物的循环肿瘤细胞和/或能分泌本发明方法中的标记物的循环肿瘤细胞。

因此，根据本发明的一个实施方案，对所述生物样品进行预处理以分离所述液体中含有的循环肿瘤细胞。

短语“分离循环肿瘤细胞”是指获得富含循环肿瘤细胞的细胞组份。

对所述生物样品进行处理以分离循环肿瘤细胞可以通过在流式细胞仪中进行细胞淘选、通过在Ficoll上富集、通过涌特异性抗体覆盖的磁珠富集，或者通过本领域技术人员已知的任何其它特异性富集方法进行。

在血液作为生物样品的情况中，循环肿瘤细胞可以通过在Ficoll上细胞分离技术组合使用与磁珠结合的抗-CD45抗体耗竭血细胞而分离(DynalBiotech ASA，Norway)。

然后可以进行本发明方法中的肿瘤标记物的检测，使用分离自生物样品的循环肿瘤细胞进行，例如在通过细胞离心涂片器(cytospin)使循环肿瘤细胞沉积在载玻片上之后，用本发明方法中的肿瘤标记物的抗体对这些细胞进行免疫细胞化学标记。本发明方法中的肿瘤标记物的检测也可以通过直接在循环肿瘤细胞中使用如Métézeau等⁷¹所述流式细胞计量术进行。

在这些条件下，所述循环细胞可以在使本发明方法中的肿瘤标记物封闭的条件下在所述细胞内部处理。这种处理如Mathieu等⁷²所述。

本发明方法中的肿瘤标记物的检测在使得所述细胞膜通透之后进行，以使得特异于本发明方法中的标记物的结合配体进入。

基于循环细胞直接检测本发明方法中使用的肿瘤标记物也可以通过ELISPOT方法进行，例如通过由本申请人申请的专利申请WO 03/076942中描述的方法进行。这种方法是检测和/或量化生物样品的循环肿瘤细胞的方法，所述循环肿瘤细胞在体外能释放或者分泌一或多种肿瘤标记物，所述方法包括如下步骤：

(i)使一定量的所述细胞沉积在附着了特异于所述肿瘤标记物的至少一种结合配体的培养表面的底部，

(ii)在使所述细胞释放或者分泌所述肿瘤标记物的条件下培养所述细胞，所述肿瘤标记物被免疫捕获在培养表面的底部，

(iii)通过洗涤除去所述细胞，

(iv)加入特异于所述肿瘤标记物的至少一种标记的缀合物，

(v)观测由此获得的标记。

在肿瘤细胞中直接检测本发明方法中使用的肿瘤标记物可以在使肿瘤细胞分泌本发明方法中使用的肿瘤标记物的条件下培养所述肿瘤细胞，之后在所述细胞的培养基中进行检测。

释放或者表达所述肿瘤标记物的培养条件是常规条件，如37℃在湿润环境及在5％CO₂中。

当生物样品是固体样品时，肿瘤标记物的存在也可以在体内、肿瘤原位示出。

为了示出体内肿瘤标记物的存在，可以使用本领域技术人员已知的任何显影方法。为此，可以将所述肿瘤标记物的结合配体与显影示踪剂结合。

术语“结合配体与显影示踪剂的结合”是指能通过本领域技术人员已知的任何显影方法检测的以及能直接或者间接产生可检测信号的示踪剂的附着。因此，所述示踪剂可以是放射性示踪剂如锝-99。在这种情况中，具有原发癌或者转移癌的器官将结合肿瘤标记物及其示踪剂。可以用专业相机例如-相机使该器官发射的射线成像。该设备收集由放射性物质产生的闪烁(scintillations)，并因此可以观测该器官。

在本发明另一方法中，示踪剂可包含发射正电子的放射性物质(氟18)。然后通过正电子发射X线断层摄影系统获取图像。

在本发明的另一优选方法中，肿瘤标记物的配体可以与纳米粒子结合，所述纳米粒子可以是超磁性(supramagnetic)纳米粒子，例如用于直接细胞标记和通过核磁共振显影的体内检测中的阴离子磁性纳米粒子。它们也可以是金纳米粒子。

通过本发明的可以在体内检测肿瘤标记物的方法，可以观测到机体的结合肿瘤标记物的结合配体的区域，产生肿瘤标记物的癌症、特别是结直肠癌，以及其远离的转移癌和涉及的淋巴结。

本发明的方法可用于结直肠癌的早期诊断及筛查、治疗随诊、预后和复发诊断，因为仅癌细胞分泌PDI，且这种产生依赖于癌症的阶段，所述方法构成本发明的另一主题。

此外，本申请书中描述的具有序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQID No.3的表位是新的表位，构成本发明另一主题。

本发明通过如下实施例以及附图1-22得以更清晰地理解，所述实施例只是举例说明本发明而无限制本发明之意，其中：

-图1是通过ELISA测定PDI(A1)、PDI A3和PDI A6的示意图，提供信号(OD)与PDI(A1)、PDI A3和PDI A6的浓度(ng/ml)相关。

-图2是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的血清中PDI(ng/ml)的图示。

-图3是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的血清中LEI(ng/ml)的图示。

-图4是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的血清中埃兹蛋白(ng/ml)的图示。

-图5是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的血清中酰化氨基酸水解酶1(ng/ml)的图示。

-图6是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的血清中L-FABP(ng/ml)的图示。

-图7是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的血清中I-FABP(pg/ml)的图示。

-图8是关于通过微量培养板ELISA(图8A)或者使用Lincoplex试剂盒(图8B)经ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的血清中载脂蛋白AI(μg/ml)的图示。

-图9是使用Linco multiplex试剂盒测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的血清中载脂蛋白AII(μg/ml)的图示。

-图10是通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的血清中I-丝束蛋白(RFV，相对荧光值)的图示。

-图11是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的血清中β2-微球蛋白(ng/ml)的图示。

-图12是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的血清中CEA(ng/ml)的图示。

-图13是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的血清中CA 19-9(U/ml)的图示。

-图14是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的血清中睾酮(ng/ml)的图示。

-图15是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的血清中E-钙粘蛋白(ng/ml)的图示。

-图16是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的血清中PAP1(ng/ml)的图示。

-图17是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的血清中半乳凝集素-3(RFV1)的图示。

-图18是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的血清中LDH(ng/ml)的图示。

-图19是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的血清中蛋白酶体20S(ng/ml)的图示。

-图20是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的粪便中酰化氨基酸水解酶1(ng/ml)的图示。

-图21是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的粪便中半乳凝集素-3(RFV)的图示。

-图22是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的粪便中蛋白酶体20S(RFV)的图示。

-图23通过ELISPOT测定LEI、埃兹蛋白和半乳凝集素-3的示意图，单位是斑点数目/10⁶个Caco-2、HT-29和HT29-B6细胞系的癌细胞。

实施例1：编码肿瘤标记物的基因的克隆及重组蛋白的表达

1.cDNA扩增和克隆

Caco-2结直肠癌细胞系在不含FCS(胎牛血清)但含有2mM L-谷氨酰胺的DMEM培养基(均Gibco)中培养。

为克隆LEI、L-FABP和Gal-3基因，用Invitrogen FastTrack 2.0试剂盒(Cat.No.45-0019)根据厂商方案从10⁸Caco-2细胞的沉淀中提取信使RNA。用Superscript III One Step RT-PCR System试剂盒(Invitrogen Cat.No.12574-018)使用Platinum Taq DNA聚合酶根据厂商方案用450ng Caco-2mRNA在单个步骤中进行逆转录和PCR步骤。用于基因扩增的PCR引物在表1中给出。

表1

在用Bsm BI和Xba I消化后，用TA克隆试剂盒(Invitrogen Cat.No.K4520-01)将获得的DNA片段克隆进载体pCR2.1TOPO中(LEI和Gal-3)，或者来自Origene的载体pCMV6-XL4中(L-FABP)。测序质粒以验证cDNA确实符合预期序列。

为克隆编码酰化氨基酸水解酶1的基因，用来自Qiagen的RNA Easy Mini试剂盒根据厂商方案从10⁸Caco-2细胞的沉淀提取总RNA。用Superscript II酶(Invitrogen)根据厂商方案使用10ng Caco-2RNA进行逆转录。逆转录引物是寡(dT)。

来自这个反应的cDNA在PCR反应中用作模板，所述PCR反应使用AccuPrime Pfx试剂盒(Invitrogen Cat.No.12344-024)根据厂商方案进行。PCR引物是：ACY-1Fwd2(SEQ ID No.10：5’-GCGAATTCTTTAAGAAGGAGATATACATATGACGAGCAAAGGTCCGGAAGAGGAGCACCCATCG-3’)和ACY-1Rev(SEQ ID No.11：5’-GCAAGCTTCAGCTGTCACTGGGCAGGGC-3’)。

在这些条件下，可以扩增出1.3kb片段，其克隆进Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒类型(Invitrogen Cat.No.K2820-20)的克隆载体中。测序这个质粒以验证cDNA确实符合预期序列。

通过由Geneart公司进行的化学合成获得含有I-FABP开放读框的下述DNA片段(SEQ ID No.12)。

SEQ ID No.12：GGTACCGAATTCCGCGTTTGACAGCACTTGGAAGGTAGACCGGAGTGAAAACTATGACAAGTTCATGGAAAAAATGGGTGTTAATATAGTGAAAAGGAAGCTTGCAGCTCATGACAATTTGAAGCTGACAATTACACAAGAAGGAAATAAATTCACAGTCAAAGAATCAAGCGCTTTTCGAAACATTGAAGTTGTTTTTGAACTTGGTGTCACCTTTAATTACAACCTAGCAGACGGAACTGAACTCAGGGGGACCTGGAGCCTTGAGGGAAATAAACTTATTGGAAAATTCAAACGGACAGACAATGGAAACGAACTGAATACTGTCCGAGAAATTATAGGTGATGAACTAGTCCAGACTTATGTGTATGAAGGAGTAGAAGCCAAAAGGATCTTTAAAAAGGATTCTAGAGTCGACGAGCTC.

2.表达载体构建

编码LEI和半乳凝集素-3的基因亚克隆进原核表达载体pMR78⁷³中，L-FABP基因克隆进载体pET3d(New England Biolabs)中。克隆所需限制位点使用质粒pCR2.1TOPO-LEI，pCR2.1TOPO-Gal-3和pCMV6-LFABP作为模板经PCR导入。PCR酶是Promega Pfu DNA聚合酶，PCR反应根据厂商指导使用表2引物进行。

表2

含有编码LEI或半乳凝集素-3的开放读框的PCR产物用Eco RI和Hind III限制酶消化。片段导入用相同酶限制的pMR78载体中(质粒pMR-LEI和pMR-Gal-3)。载体pMR78含有符合待表达蛋白质的读框的6-组氨酸序列，其使得能用金属-螯合物亲和层析纯化。L-FABP PCR产物克隆进载体pET3d的Nco I和Bam HI限制位点。

对于酰化氨基酸水解酶1，TOPO克隆载体直接用Eco RI和Hind III限制酶消化以产生含有acy1开放读框的1.3kb片段，所述片段被克隆进载体pStaby1(Eurogentec)中。重组质粒称为pStaby1-ACY。

对于I-FABP，Geneart提供的克隆载体用Eco RI和Sal I限制酶消化以产生含有编码序列的大约400bp片段，所述片段导入载体pMRCH79(源自载体pMR78，bioMérieux)中。重组质粒称为pMRCH-IFABP。

对于PDIs A3和A6，编码蛋白质的cDNA分别得自Invitrogen和Origene公司。从这些载体起始，基因亚克隆进载体pMRCH79(源自载体pMR78，来自bioMérieux)。重组质粒称为pMRCH-PDI A3和pMRCH-PDI A6。

使得分别表达与GST(谷胱甘肽S-转移酶)融合的埃兹蛋白和I-丝束蛋白的质粒pGEX-Ezrine和pGEX-丝束蛋白e-I由Institut Curie提供。

3.重组蛋白表达和纯化

用于产生重组肿瘤标记物的表达质粒导入E.coli BL21细菌和衍生物(Stratagene)中。培养在环境温度振荡进行。每种蛋白质的精确培养条件见表3。IPTG是异丙基-β-D-1硫代半乳糖苷酶。

细菌沉淀吸收于PBS(磷酸盐缓冲盐水)2X缓冲液中并穿过1.5kbar的细胞粉碎机(Constant System)。裂解物在3000g、4℃离心30分钟。上清含有可溶性蛋白。沉淀含有包涵体。用于溶解包涵体的缓冲液依赖于蛋白质。

对于LEI，用可溶性组份在含有5mL Ni-NTA-Sepharose树脂(Qiagen)的柱上进行纯化，蛋白质用含有450mM咪唑的2X PBS，pH 7.5洗脱。

对于半乳凝集素-3，包涵体溶解在含有1M尿素的2X PBS中，并通过5mLNi-NTA-Sepharose树脂(Qiagen)，Gal-3蛋白用含有450mM咪唑和1M尿素的2X PBS，pH 7.5洗脱。

对于L-FABP，PDI A3和PDI A6，用来自Macherey-Nagel的Ni-IDA试剂盒用可溶性组份进行纯化。

表3

对于GST-埃兹蛋白，用溶解在含有8M尿素和10mM DTT的100mM Tris缓冲液中的包涵体经GST亲和层析进行纯化。使用含有5mL谷胱甘肽Sepharose 4fast flow gel(Amersham)的柱。平衡和洗涤缓冲液是含有0.05％Tween 20的2x PBS。洗脱缓冲液是含有20mM还原型谷胱甘肽的50mMTris-HCl，pH 8。

对于酰化氨基酸水解酶1，培养物的可溶性部分通过Amersham HiTrapQ FF柱，ACY-1蛋白用pH7.5的0.3M NaCl洗脱。因为一些其它蛋白质在这些条件下共洗脱，所以继续在疏水相互作用柱(HIC Phenyl HP，Amersham)上纯化。ACY-1蛋白用pH7的0.5M NaCl洗脱。

重组GST-I-丝束蛋白由Institut Curie以纯化形式提供。

重组钙网蛋白和蛋白质二硫化物异构酶蛋白由公司Proteus Services forIndustry(Dijon，France)生产。编码序列经化学合成获得。

实施例2：抗肿瘤标记物的单克隆抗体的产生

1.动物模型

免疫接种实验在第一次免疫接种时为6-8周的雌性BALB/c(H-2^d)小鼠中进行。

2.免疫原和免疫接种

为了增加小鼠中获得的免疫应答及能够产生单克隆抗体，以根据实施例1所述程序产生的重组蛋白形式产生肿瘤标记物。LDH蛋白得自SciPac公司(Cat.No.103-133)。这些蛋白质与弗氏佐剂(Sigma)体积与体积混合，其制备成油包水乳液形式并且已知具有良好免疫原性能力。针对每个肿瘤标记物免疫接种3只小鼠。小鼠在0、2或4周接受3个连续剂量的10μg免疫原。所有注射均皮下进行。第一次注射以与完全弗氏佐剂混合物给予，随后两次以与不完全弗氏佐剂混合物给予。在第一次注射后D50和D70之间，用静脉内注射100μg重组蛋白再刺激体液应答。

3.监测体液应答的出现

为了监测抗体出现，定期从小鼠取血样。用ELISA测试抗肿瘤标记物抗体的存在。感兴趣的蛋白质用于捕获(1μg/孔)；饱和后，抗原与各种稀释度的测试血清反应(在37℃保温1小时)。血清中存在的特异性抗体用缀合于碱性磷酸酶的AffiniPure山羊抗小鼠IgG抗体(H+L，Jackson Immunoresearch，Cat no.115-055-146)揭示，所述抗体结合被寻找的抗体(0.1μg/孔)。

4.单克隆抗体的产生

最后一次注射后3天，对于每个肿瘤标记物，牺牲一只免疫接种小鼠。取血及脾。根据and Milstein^74，75所述方法，得自脾的脾细胞用Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞培养以使它们融合并变为永生化。保温12-14天后，使用本实施例第3点描述的ELISA测定筛选获得的杂交瘤上清以确定抗肿瘤标记物抗体的存在。当GST融合蛋白用作免疫原时，通过用未偶联GST捕获进行ELISA筛选而消除抗GST的克隆。根据本领域技术人员公知的有限稀释技术，将阳性杂交瘤集落亚克隆两次。

5.经免疫印迹鉴定单克隆抗体

抗各种肿瘤标记物的单克隆抗体列表见表4。这些单克隆抗体经Western印迹技术分析。

表4

肿瘤标记物单克隆抗体名称

白细胞弹性蛋白酶抑制剂(LEI) 21B10A5和10E1H1

埃兹蛋白 4A7A6C1和4A9H5

酰化氨基酸水解酶1 2A7F6和11H7D9

I-丝束蛋白 3D11D10，8C8C5，3A3H2，8G2D2

钙网蛋白 5C10H10和11B6D11

蛋白质二硫化物异构酶 12H3B6，3B5C12和16D9F6

L-乳酸脱氢酶B链(LDH) 3F11E11和12F10G8

半乳凝集素-3 12F8A12和14A5G1

5.1.方法学

Caco-2和HT-29细胞系细胞培养提取物通过用600μl 8.3M尿素、2M硫脲、4％3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙烷磺酸酯(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propane sulfonate，CHAPS)、100mM DTT、2％Servalyte 4-9(Serva，Heidelberg，Germany)和0.1g/lOrange G的水溶液直接裂解细胞沉淀而制备，然后根据NuPAGE Novex凝胶样品制备方案(Invitrogen)处理。为获得组织提取物，患者GHBD001，GHBD004和CLSP109的肿瘤和粘膜生物活检用手术刀解剖，然后在Medimachine系统(Becton Dickinson)中用50-μm Medicons用1ml含有2.5mM EDTA和蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液(片剂，Roche)进行10轮提取。合并这些10ml细胞悬浮液，组成25ml，然后在600g离心15分钟。上清相应于组织提取物，其根据NuPAGE Novex凝胶样品制备方案处理。使用总蛋白终浓度为0.4mg/ml的减少的样品。放置体积是每孔20μl，在NuPAGENovex Bis-Tris 4-12％凝胶上，使用MOPS电泳缓冲液。在迁移(200V，1小时)并转移到PVDF膜(400mA，45分钟)后，用酰胺黑染色评估转移质量。

膜用在TNT溶液(15mM Tris，0.14M NaCl，0.5％Tween 20，pH 8)中的5％脱脂乳(Régilait)在环境温度饱和1小时。饱和后，膜与在饱和溶液中稀释至10μg/ml的各种测试抗体保温1小时。用TNT洗涤后，膜与在饱和溶液中稀释至1∶5000的抗小鼠辣根过氧化物酶缀合物(Cat No.115-035-062，Jackson Immunoresearch)在环境温度保温1小时。洗涤后，用SubstrateSupersignal West Dura Extended试剂盒(Cat No.34076，Pierce)根据推荐使用信息进行显色。

在膜上的化学发光信号用来自Biorad的VersaDoc成像系统测量。基于Western印迹的图像，相应于各种肿瘤标记物的条带的体积用QuantityOne软件(Bio-Rad)评估。所述体积相应于化学发光信号密度乘以条带表面积。

5.2.结果

Western印迹结果见表5，其给出针对各种测试样品的相应于用于Western印迹分析的感兴趣的肿瘤标记物的条带体积。这些结果显示测试的肿瘤标记物确实由Caco-2和HT-29结肠癌细胞系表达，并且也在组织中表达，如用得自患者的肿瘤和粘膜的提取物所示。用抗体在样品中获得的信号强度可以与用其它样品和相同抗体获得的信号相比。所用技术使得可以证实标记物在组织(非远离样品)中的存在或不存在及抗体对标记物的特异性。这个技术在本实施例中没有用在远离样品中，因为其不能使得得出肿瘤标记物在远离样品中存在或不存在的结论，也不能确定所述肿瘤标记物浓度是否在所述样品中增加或降低。另外，使用的实验方案不能将一个抗体的反应性与另一个相比。

表5

NT：未测试

5.3.抗I-丝束蛋白的单克隆抗体

在患者GHBD004中，8C8C5抗体不显示或仅非常弱地显示相应于I-丝束蛋白的条带。I-丝束蛋白在这些样品中的存在可以用例如8G2D2抗体证实，所述抗体对印迹中的I-丝束蛋白有更好亲和性。

因为I-丝束蛋白是包含2个其它同种型(丝束蛋白L和T)的蛋白质家族成员，其具有70％同源性，我们测试了获得的所有单克隆抗体克隆对GST-丝束蛋白-L和GST-丝束蛋白-T(由Institut Curie提供)的反应性。在这个筛选结束时，我们选择了克隆3D11D10，8C8C5，3A3H2和8G2D2，它们不显示与该家族其它成员的任何交叉反应性。这些抗体确实特异于I-丝束蛋白同种型。

6.用斑点扫描(Spotscan)和噬菌体展示肽文库筛选技术鉴定由单克隆抗体识别的表位

6.1.方法学

根据Frank and适应的斑点扫描技术使得可以同时合成大量附着于纤维素膜的肽。这些肽以8-12个氨基酸、重叠1-4个残基的肽形式再现靶抗原序列。这些肽然后在印迹类型的比色测试中与待研究的抗体接触，免疫反应性肽的鉴别使得可以推导抗体表位的最小序列并精确将其定位在抗原上。

在均匀携带长度为8-10个单位的聚乙二醇(PEG)臂、在链末端具有游离NH₂官能的纤维素膜上进行合成。其从肽的C末端到N末端发生。氨基酸的氨基官能用Fmoc(9-芴甲氧羰基)基团保护，能在合成期间发生反应的所述氨基酸的侧链也用三苯甲基、叔丁基或叔丁基醚基团保护。氨基酸原液制备成在含有0.5M of HOBt(羟基苯并三唑)的NMP(N-甲基吡咯烷酮)中浓度为0.33M。氨基酸用ASP 222自动化装置(Abimed，Langenfeld，Germany)沉积，其由Spot XL软件控制。使用这种自动化装置使得可以同时产生高达4个96个斑点的膜，即384个肽。

对于一个氨基酸偶联循环，自动化装置将0.7μl临时活化的氨基酸的溶液(每3体积氨基酸原液1体积在NMP中稀释的1.1M二异丙基碳二亚胺溶液)沉积在膜上。这个沉积重复1次，然后膜在DMF(N，N-二甲基甲酰胺)中洗涤。未反应的NH₂基团然后通过在10％乙酐于DMF中的溶液中保温4-6次每次10分钟而乙酰化，以防止出现失败的(abortive)或截短的肽。在DMF中洗涤3次每次2分钟后，保护氨基酸的氨基官能的Fmoc基团通过在20％哌啶于DMF中的溶液中保温5分钟而裂解。在DMF中洗涤4次后，斑点用1％溴酚蓝于DMF中的溶液中着色，膜然后在甲醇中洗3次，并在空气中干燥，之后进行下一个偶联循环。

重复该方案以添加每个新氨基酸。在偶联最后一个氨基酸之后，肽被乙酰化以使得可以封闭所有游离NH₂基团，由此防止添加另一个氨基酸。所有肽的侧链然后通过将膜在三氟乙酸/二氯甲烷/三异丁基硅烷(5∶5∶0.3)浴保温1小时而脱保护。膜然后在二氯甲烷中洗4次、在DMF中洗3次和在甲醇中洗3次，之后空气干燥，并储存在-20℃直至免疫揭示。

为了用单克隆抗体免疫揭示斑点，膜先在甲醇中漂洗，然后在TBS(50mM Tris-HCl，pH 8.0，140mM NaCl，3mM KCl)中洗涤，之后在环境温度下于饱和溶液(10X浓缩的基于酪蛋白的溶液(Western Blocking reagent，Roche)，在TBS-0.05％Tween 20(TBS-T)中稀释并含有5％蔗糖)中保温过夜。在TBS-T中洗涤10分钟后，膜与在饱和溶液中稀释至20μg/ml的单克隆抗体在37℃保温1小时30分钟。膜随后在TBS-T中洗3次，然后与在饱和溶液中稀释至1/2000的碱性磷酸酶偶联的抗小鼠缀合物(JacksonImmunoresearch)保温。在TBS-T中洗涤2次每次10分钟，然后在CBS(10mM柠檬酸，pH 7，140mM NaCl，3mM KCl)中洗涤2次后，临时制备的揭示剂(600μM，5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，720μM thiazolyl blue tetrazolium bromide，和5mM MgCl₂于CBS中)与膜在黑暗中接触30-45分钟。免疫反应性肽呈现蓝紫色。在蒸馏水中漂洗3次后，扫描膜，然后在水中储存直至再生。

再生使得可以消除与肽结合的抗体和缀合物，由此使得可以进行针对另一个抗体的免疫反应性的进一步的测试。膜进行一系列洗涤，每次10分钟：在蒸馏水中洗涤1次，在DMF中洗涤6次，在再生缓冲液A(8M尿素、35mMSDS(十二烷基硫酸钠)、0.1％β-巯基乙醇)中洗涤3次，在再生缓冲液B(蒸馏水/乙醇/乙酸4∶5∶1)中洗涤3次，任何在甲醇中洗涤2次。膜然后空气干燥，之后储存在-20℃。

用来自New England Biolabs的商业PhD12噬菌体展示肽文库试剂盒(Cat.No.E#8110S)根据试剂盒提供的指导，2007年11月方案版本2.7，经噬菌体展示肽文库筛选鉴定表位。

6.2.结果

表6示出由3个所研究抗体识别的表位。

表6

^aPDI结合测试抗体的区域的氨基酸序列

括号中的数字相应于表位在PDI氨基酸序列上的位置，编号起自最初的甲硫氨酸

3个抗PDI单克隆抗体识别蛋白质的3个表位，在表6中所述表位编号为1-3。抗体12H3B6的表位不能用斑点扫描技术确定，说明其不是线性的。肽文库筛选使得可以选择4个序列DRAFFESMLW，DRALAESGLW，DVAWHESRKW和PRAMAESLRW，它们与抗体反应。这4个序列的对比及在PDI序列上的检索可以鉴别区域DGAAAESL(142-149)，下划线氨基酸对于抗体结合是关键的。最后的色氨酸(W)存在于每个筛选的基序中，表面需要芳香氨基酸(F、W、Y)以使抗体与其表位结合。在蛋白质的三维结构中接近的任何芳香氨基酸均可以起这个作用。根据可获得的3D模型，涉及的氨基酸可以是209位的苯丙氨酸，206位的苯丙氨酸或者195位的酪氨酸。

7.经夹心ELISA检测PDI

7.1.方法学

PDI经夹心免疫测定检测。为此，将96孔板用作为捕获抗体的待测抗PDI单克隆抗体(3B5C12或12H3B6，bioMérieux)at以1μg/孔包被。用PBS-0.05％Tween 20(PBS-T)洗涤3次后，平板用10％奶粉于PSB-T中在37℃饱和1小时。平板在PBS-T中再洗涤3次，将0.1μg/孔在PBS-T 1％BSA中稀释的重组PDI蛋白沉积在平板上，在37℃保温平板2小时。用PBS-T洗涤3次后，以各种稀释度加入生物素化检测抗体16D9F6(浓度＝1.16mg/ml，bioMérieux)，平板在37℃保温2小时。用PBS-T再洗涤3次，之后加入辣根过氧化物酶偶联的链霉抗生物素蛋白(Jackson Immunoresearch Cat.No.016-030-084，稀释度1/20000于PBS-T 3％BSA中，100μl/孔)。在37℃保温1小时及用PBS-T洗涤3次后，加入100μl/孔底物OPT EIA(BD)。20分钟后，当颜色显现时，用5N硫酸终止反应，测量450nm吸光度。结果在减去背景噪声(无PDI抗原的测定)后以粗值形式获得。

7.2.结果

表7示出各种组合的抗体对0.1μg/孔重组PDI的反应性。可以用表位No.1和3或者No.2和3的组合检测PDI。表位No.1和3的组合使得可以获得最高ELISA信号。

表7^a

^a在450nm的吸光度

8.本发明抗体和方法的特异性

8.1.方法学

重复上述7.1的程序，例外是10、2.5、0.6、0.1和0ng/孔的重组PDI(也已知为PDI A1)、重组PDI A3或者重组PDI A6沉积在平板上，并且仅3B5C12抗体用作捕获抗体。

8.2.结果

PDI A3和PDI A6测定结果与PDI A1测定的比较示于图1。

图1结果示出未观测到对于PDI A3或PDI A6的交叉反应性，即使在高PDI A3和PDI A6浓度下。

本发明的测定方法及所用抗体因此对于PDI(A1)是非常特异的。

实施例3：肿瘤标记物的血清测定

1.患者和标本

根据2Huriet-law方案，从遍布于法国的8个临床中心网络收集血样。

为了获得血清，血样采集在干燥试管中。为了获得血浆，血样采集在EDTA试管中。在凝血后，试管在1000g离心10分钟，取血清，等分并储存在-80℃。血浆试管直接在1000g离心10分钟，取血浆，等分并储存在-80℃。样品完整记录患者的临床史。

2.PDI肿瘤标记物的血清测定

用微滴定板夹心ELISA根据实施例2的7.1段所述方案测定PDI标记物。抗PDI捕获抗体3B5C12(bioMérieux)以1μg/孔使用。饱和剂含有额外3％FCS。标准范围通过在PBS-T、3％BSA中稀释重组PDI蛋白而制备(1.56-100ng/ml)。血清样品在这个相同缓冲液中稀释至1/2。生物素化检测抗体16D9F6(bioMérieux)以0.1μg/孔加入。结果在减去背景噪声(无PDI抗原的测定)后以粗值形式获得。校正曲线的绘制是x轴为肿瘤标记物浓度，y轴是吸光度单位(OD，光密度)表示的信号读取值。待测体液(血液，血清，血浆，粪便)中存在的肿瘤标记物的浓度通过记录相应于ELISA的OD读取值的浓度而计算。

夹心ELISA测定的患者中血清PDI的结果见表8。

表8

a：CRC+：具有结直肠癌的患者/CRC-：健康个体

分析的患者获得的量见图2。注意到在该图中，来自具有II期结直肠癌的1个患者血清和来自具有III期结直肠癌的2个患者血清显示它们的血清PDI量明显增加。

3.LEI肿瘤标记物的血清测定

用实施例2所述抗体及使用Vidas自动化装置的ELISA测定(bioMérieux)测定LEI蛋白。为此，用VidasHBs Ag Ultra试剂盒(bioMérieux，Cat.No.30315)的试剂构建ELISA测定。根据相应说明书(ref.11728D-FR-2005/05)所述进行以下改变而使用试剂：

1.离心管(cones)用浓度为10μg/ml的捕获抗体10E1H1敏化。

2.HBs Ag Ultra cartridge的第二个孔的内容物用300μl揭示抗体21B10A5置换，所述抗体偶联于生物素，在VidasHBs Ag Ultra试剂盒的第二个孔的缓冲液(具有山羊血清和1g/l叠氮化钠的缓冲液)中稀释至1μg/ml。

3.血清、血浆或粪便样品(50μl)直接在HBs Ag Ultra cartridge的第二个孔中稀释，其是纯的或者先前在VidasHBs Ag Ultra试剂盒的第二个孔的缓冲液(山羊血清和1g/l叠氮化钠的缓冲液)中稀释至1/20之后。

4.用Vidas自动化装置及HBs Ag Ultra试剂盒方案进行ELISA反应。

5.结果在减去背景噪声(反应前底物读数)后以粗值形式获得。

通过测定重组蛋白形式的一系列浓度的肿瘤标记物而建立标准曲线。标准曲线的绘制是x轴为报道的肿瘤标记物浓度，y轴是Vidas读取的信号(RFV或相对荧光值)。待测体液(血液，血清，血浆，粪便)中存在的肿瘤标记物的浓度通过报道相应于RFV signal read by Vidas读取的RFV信号的浓度而计算。

分析的患者获得的量见图3。注意到在该图中，来自具有IV期结直肠癌的3个患者血清和来自具有III期结直肠癌的2个患者血清显示它们的血清LEI量明显增加。

4.埃兹蛋白肿瘤标记物的血清测定

用实施例2所述抗体及使用Vidas自动化装置的ELISA测定(bioMérieux)测定埃兹蛋白。为此，用VidasHBs Ag Ultra试剂盒(bioMérieux，Cat.No.30315)的试剂构建ELISA测定。根据相应说明书(ref.11728D-FR-2005/05)所述进行以下改变而使用试剂：

1.离心管用浓度为30μg/ml的捕获抗体4A9H5敏化。

2.HBs Ag Ultra cartridge的第二个孔的内容物用300μl揭示抗体4A7A6C1置换，所述抗体偶联于生物素，在VidasHBs Ag Ultra试剂盒的第二个孔的缓冲液(具有山羊血清和1g/l叠氮化钠的缓冲液)中稀释至1μg/ml。

3.血清、血浆或粪便样品(50μl)直接在HBs Ag Ultra cartridge的第二个孔中稀释。

4.用Vidas自动化装置及HBs Ag Ultra方案进行ELISA反应，其中样品与捕获及揭示抗体的保温步骤进行100个循环。

5.结果在减去背景噪声(反应前底物读数)后以粗值形式获得。

待测体液(血液，血清，血浆，粪便)中存在的肿瘤标记物的浓度根据LEI测定的第2段中描述的程序进行。

分析的患者获得的量见图4。注意到在该图中，来自具有IV期结直肠癌的3个患者血清显示它们的血清埃兹蛋白量明显增加。

5.酰化氨基酸水解酶1肿搐标记物的血清测定

用实施例2所述抗体及使用Vidas自动化装置的ELISA测定(bioMérieux)测定酰化氨基酸水解酶1蛋白。为此，用VidasHBs Ag Ultra试剂盒(bioMérieux，Cat.No.30315)的试剂构建ELISA测定。根据相应说明书(ref.11728D-FR-2005/05)所述进行以下改变而使用试剂：

1.离心管用浓度为20μg/ml的捕获抗体2A7F6敏化。

2.HBs Ag Ultra cartridge的第二个孔的内容物用300μl揭示抗体11H7D9置换，所述抗体偶联于生物素，在VidasHBs Ag Ultra试剂盒的第二个孔的缓冲液(具有山羊血清和1g/l叠氮化钠的缓冲液)中稀释至1μg/ml。

3.血清、血浆或粪便样品(100μl)直接在HBs Ag Ultra cartridge的第二个孔中稀释。

5.结果在减去背景噪声(反应前底物读数)后以粗值形式获得。

分析的患者获得的量见图5。注意到在该图中，来自具有II期结直肠癌的1个患者血清和来自具有IV期结直肠癌的2个患者血清显示它们的血清血清酰化氨基酸水解酶1量明显增加。

6.L-FABP肿瘤标记物的血清测定

我们使用Hycult Biotechnology公司出售的ELISA试剂盒测定人L-FABP蛋白(Cat.No.HK404)。这个试剂盒可以定量细胞培养上清或者血清、血浆或尿中的L-FABP蛋白，以确定肝脏损害的存在。我们按照厂商推荐程序，有2项改变：保温在37℃而非环境温度进行，血清在测定前稀释至1/10。L-FABP蛋白的测定可以通过本领域技术人员公知的其它技术进行。

图6给出这个测定的结果。在我们测试的血清组中，具有结直肠癌的141名患者中的41名患者具有大于17ng/ml的血清L-FABP浓度，而在对照组中，没有个体超过这个值。在这41名患者中，8名具有I期结直肠癌，8名具有II期结直肠癌，13名具有III期结直肠癌，12名具有IV期结直肠癌。具有结直肠癌的141名患者观测到的平均血清L-FABP浓度是6.6±1.3ng/ml。112个健康个体(阴性对照)的平均值是6.6±0.2ng/ml。这个差异是统计学显著的(P＜0.0001，具有不等方差的Welch校正的单侧t-检验)。

7.I-FABP肿瘤标记物的血清测定

我们使用Hycult Biotechnology公司出售的ELISA试剂盒测定人I-FABP蛋白(Cat.No.HK406)。这个试剂盒可以定量细胞培养上清或者血清、血浆或尿中的I-FABP蛋白，以确定小肠中缺血性损害的存在。我们按照厂商推荐程序进行。I-FABP蛋白的测定可以通过本领域技术人员公知的其它技术进行。

图7给出这个测定的结果。在我们测试的血清组中，具有结直肠癌的40名患者中的15名患者具有大于40pg/ml的血清I-FABP浓度，而在对照组中，24个个体中仅2个个体超过这个值。更清楚地，3个具有I期结直肠癌患者血清、2个具有III期结直肠癌患者血清及1个具有IV期结直肠癌患者血清的血清I-FABP浓度大于100pg/ml。在CRC-对照组中没有发现高于这个值的浓度。

8.载脂蛋白AI肿瘤标记物的血清测定

血清载脂蛋白AI的测定通过两种不同免疫测定技术进行.首先，我们使用微滴定板夹心ELISA。96孔板用抗Apo AI单克隆抗体克隆用1404(Biodesign Cat.No.H45404)以1μg/孔包被。用PBS-0.05％Tween 20(PBS-T)洗涤3次后，平板用10％奶粉于PBS-T中在37℃保温1小时。平板进一步在PBS-T中洗涤3次，将100μl标准范围的稀释液或者100μl测试血清样品的1/100000稀释液沉积在平板上，平板在37℃保温2小时。标准范围通过将ApoAI蛋白(Biodesign Cat.No.A50620H)在PBS-T，BSA 1％中稀释而制备(1.6-100ng/ml)。在用PBS-T洗涤3次后，以0.1μg/孔加入与辣根过氧化物酶偶联的多克隆检测抗体(Biodesign Cat.No.K45452P)，平板在37℃保温2小时。用PBS-T进一步洗3次，之后以100μl/孔加入OptEIA底物(BD)。20分钟后，当发生显色时，反应用2N硫酸终止，测量在450nm的吸光度。

图8A给出这个测定的结果。我们正式在具有结直肠癌的个体中Apo AI血清浓度的降低。在具有I-IV期CRC的38个个体中的平均浓度是675±36μg/ml，而在27个健康个体(对照)中高得多：1040±39μg/ml。这个差异是统计学非常显著的(P＜0.0001，单侧t-检验)。相比之下，在13个具有肝癌的个体中，用夹心ELISA技术，Apo AI的平均血清浓度是1175±87μg/ml。血清浓度的降低正式Apo AI因此是结直肠癌的特异性标记物，这种降低可以通过免疫测定证实。

所用的第二种测定技术是由Linco公司上市的多重测定，其使得可以在同一样品中同时测定几种载脂蛋白，包括AI和AII(Cat.No.APO-62K)。应用厂商推荐的程序。

图8B给出这个测定的结果。在具有CRC的患者中Apo AI的血清浓度的降低用这种第二种技术证实。在具有I-IV期CRC的34个个体中Apo AI的平均浓度是768±30μg/ml，而在13个健康个体(对照)中高得多：1194±51μg/ml。这个差异是统计学非常显著的(P＜0.0001，单侧t-检验)。

9.载脂蛋白AII肿瘤标记物的血清测定

用Linco多重试剂盒进行血清载脂蛋白AII的测定。图9给出这个测定的结果。我们正式在具有结直肠癌的个体中Apo AII的血清浓度的降低。在具有I-IV期CRC的34个个体中Apo AII的平均浓度是170±11μg/ml，而在17个健康个体(对照)中高得多：277±16μg/ml。这个差异是统计学非常显著的(P＜0.0001，单侧t-检验)。

10.I-丝束蛋白肿瘤标记物的血清测定

用实施例2所述抗体及使用Vidas自动化装置的ELISA测定(bioMérieux)测定I-丝束蛋白。为此，用VidasHBs Ag Ultra试剂盒(bioMérieux，Cat.No.30315)的试剂构建ELISA测定。根据相应说明书(ref.11728D-FR-2005/05)所述进行以下改变而使用试剂：

1.离心管用浓度为15μg/ml的捕获抗体3D11D10敏化。

2.HBs Ag Ultra cartridge的第二个孔的内容物用300μl揭示抗体8C8C5置换，所述抗体偶联于生物素，在VidasHBs Ag Ultra试剂盒的第二个孔的缓冲液(具有山羊血清和1g/l叠氮化钠的缓冲液)中稀释至1μg/ml。

4.用Vidas自动化装置及HBs Ag Ultra方案进行ELISA反应。

5.结果在减去背景噪声(反应前底物读数)后以粗值形式获得。

分析的患者获得的量见图10。具有结直肠癌的2个被测患者的血清显示它们的血清I-丝束蛋白量明显增加。

11.B组肿瘤标记物的血清测定

β2-微球蛋白、CEA、CA19-9和睾酮肿瘤标记物分别用申请人的测定试剂盒Vidasβ2-微球蛋白、VidasCEA，VidasCA19-9^TM和Vidas睾酮根据每个试剂盒特异的程序测定。

E-钙粘着蛋白用E-钙粘着蛋白EIA试剂盒(Takara Biochemicals，Tokyo，Japan)根据试剂盒程序测定。

再生胰岛衍生的蛋白3α蛋白，也已知为胰腺炎相关蛋白(PAP1)用PANCREPAP ELISA试剂盒(DynaBio，Marseille，France)根据试剂盒程序测定。

半乳凝集素-3和LDH蛋白用实施例2所述抗体测定。蛋白酶体20S用专利EP 0434670中描述的抗体测定。为此，用Vidas自动化装置(bioMérieux)和VidasHBs Ag Ultra试剂盒(bioMérieux，Cat.No.30315)的试剂构建ELISA测定。根据相应说明书(ref.11728D-FR-2005/05)所述进行以下改变而使用试剂。

1.离心管用浓度为5-30μg/ml的捕获抗体敏化。

2.HBs Ag Ultra cartridge的第二个孔的内容物用300μl揭示抗体置换，所述抗体偶联于生物素，在具有山羊血清和1g/l叠氮化钠的缓冲液中稀释至1μg/ml。

3.如果需要，在第二个孔的缓冲液中稀释后，血清、血浆或粪便样品(100μl)直接在HBs Ag Ultra cartridge的第二个孔中稀释。

4.用Vidas自动化装置及HBs Ag Ultra方案进行ELISA反应。样品与捕获及揭示抗体的保温步骤进行14-100个循环。

5.结果在减去背景噪声(反应前底物读数)后以粗值形式获得。

待测体液(血液，血清，血浆，粪便)中存在的肿瘤标记物的浓度根据LEI测定的第2段中描述的程序进行。各种肿瘤标记物的测定条件见表9。

表9

蛋白质	半乳凝集素-3	LDH-B	蛋白酶体20S
				捕获抗体	12F8A12，15μg/mL	3F11E11，10μg/mL	GD6，30μg/mL
揭示抗体	14A5G1	12F10G8	7A11
				在稀释缓冲液中的血清	具有	具有	不具有
粪便体积	50μL	50μL	200μL
				血清体积	50μL	50μL	100μL
样品沉积	第2个孔	第2个孔	第1个孔
				保温时间	100个循环	14个循环	14个循环

用β2-微球蛋白、CEA、CA19-9、睾酮、E-钙粘着蛋白、再生胰岛衍生的蛋白3α、半乳凝集素-3、LDH和蛋白酶体20S肿瘤标记物分析的患者获得的量分别见图11-19。

3个具有结直肠癌患者血清显示它们的血清β2-微球蛋白量的增加。

10个具有结直肠癌患者的血清显示它们的血清CEA量增加。更清楚地，1个具有III期结直肠癌的患者的血清和7个具有IV期结直肠癌的患者的血清显示它们的血清CEA量的显著增加。

9个具有结直肠癌患者的血清显示它们的血清CA 19-9量增加。更清楚地，1个具有III期结直肠癌的患者的血清和7个具有IV期结直肠癌的患者的血清显示它们的血清CA 19-9量的显著增加。

10个具有结直肠癌患者的血清显示它们的血清睾酮量降低。更清楚地，1个具有II期结直肠癌的患者的血清、1个具有III期结直肠癌的患者的血清和2个具有IV期结直肠癌的患者的血清显示它们的血清睾酮量的降低(fall)。

2个具有结直肠癌的患者的血清显示它们的血清再生胰岛衍生的蛋白3α量的增加。

4个具有IV期结直肠癌患者的血清、2个具有III期结直肠癌的患者的血清和1个具有II期结直肠癌的患者的血清显示它们的血清血清半乳凝集素-3量的明显增加。

实施例4：组合肿瘤标记物的血清测定应用

申请人在实施例3中示出异常升高或异常降低量的肿瘤标记物可以在具有结直肠癌的一些患者血流中观测到。令人惊奇地，两个给定标记物在血液中量的增加或降低在相同患者中未系统观测到。结果，一些肿瘤标记物的组合使得可以增加鉴别为具有结直肠癌的患者数。因此，患者A可能存在一或多个肿瘤标记物(组X)的增加或降低，组X的所述标记物在患者B中可能是正常的；在这个患者B中，一或多个其它肿瘤标记物(组Y)可能是升高或降低的，组Y的所述标记物在患者A中可能是正常的。

因此申请人测定的各种肿瘤标记物可以通过本领域技术人员公知的各种数学算法组合。举例而言，并且这个实施例是非限制性的，进行下述方法：

1.对每个肿瘤标记物设定阈值。

2.当在结直肠癌情况中肿瘤标记物在血液中的量增加时，针对给定患者获得的血液中的量除以其阈值。当在结直肠癌情况中肿瘤标记物在血液中的量降低时，针对给定患者获得的血液中的量取倒数，然后乘以其阈值。

3.当“血液中的量除以阈值”比率大于1时，该比率乘以系数例如10。由此获得的值称为对于所研究患者的所考虑的肿瘤标记物的“评分”。

4.加入针对各种肿瘤标记物获得的评分，它们被特异于每个标记物的因子加权。在下述例子中，所有加权因子设为1。

5.评分之和除以加入的评分的总数，由此获得值称为“总评分”。

6.当他或她的总评分相对于阈值评分增加时，患者被诊断为具有结直肠癌。

包含PDI的所选择的3、4、5和9个标记物的总评分见表10。

PDI、埃兹蛋白和Gal-3肿瘤标记物的组合因此使得可以针对同一组30个患者在具有结直肠癌的16个患者中获得增加的总评分“3”，而单独测定PDI、埃兹蛋白或Gal-3显示分别仅在3、4和12个患者中增加。

PDI、CEA、埃兹蛋白和Gal-3肿瘤标记物的组合因此使得可以针对同一组30个患者在具有结直肠癌的25个患者中获得增加的总评分“4b”，而单独测定PDI、CEA、埃兹蛋白或Gal-3显示分别仅在3、19、4和12个患者中增加。

PDI、CA19-9、E-钙粘着蛋白和LEI肿瘤标记物的组合因此使得可以针对同一组30个患者在具有结直肠癌的18个患者中获得增加的总评分“4c”，而单独测定PDI、CA19-9、E-钙粘着蛋白或LEI显示分别仅在3、12、3和7个患者中增加。

PDI、L-FABP、蛋白酶体20S和绒毛蛋白肿瘤标记物的组合因此使得可以针对同一组30个患者在具有结直肠癌的25个患者中获得增加的总评分“4d”，而单独测定PDI、L-FABP、蛋白酶体20S或绒毛蛋白显示分别仅在3、18、12和4个患者中增加。

PDI、L-FABP、蛋白酶体20S、绒毛蛋白和Gal-3肿瘤标记物的组合因此使得可以针对同一组30个患者在具有结直肠癌的26个患者中获得增加的总评分“5”，而单独测定PDI、L-FABP、蛋白酶体20S、绒毛蛋白或Gal-3显示分别仅在3、18、12、4和12个患者中增加。

PDI、CA 19-9、ACY、L-FABP、埃兹蛋白、LEI、蛋白酶体20S、绒毛蛋白和Gal-3肿瘤标记物的组合因此使得可以针对同一组30个患者在具有结直肠癌的28个患者中获得增加的总评分“4d”，而单独测定PDI、CA 19-9、ACY、L-FABP、埃兹蛋白、LEI、蛋白酶体20S、绒毛蛋白或Gal-3显示分别仅在3、12、4、18、4、7、12、4和12个患者中增加。

PDI、CEA、CA 19-9、ACY、L-FABP、埃兹蛋白、LEI、蛋白酶体20S和绒毛蛋白肿瘤标记物的组合因此使得可以针对同一组30个患者在具有结直肠癌的30个患者中获得增加的总评分“9g”，而单独测定PDI、CEA、CA19-9、ACY、L-FABP、埃兹蛋白、LEI、蛋白酶体20S和绒毛蛋白显示分别仅在3、19、12、4、18、4、7、12和4个患者中增加。

表10

病理状况	样品标识符	期	PDI ng/ml	总评分3^a	总评分4^b	总评分4^c	总评分4	总评分5^e	总评分9^f	总评分9^g
											健康个体	N491044	10.28	0.24	0.27	0.23	0.34	0.37	0.27	0.25
健康个体	N491124		1.35	0.31	0.38	0.23	0.23	0.25	0.29	0.32
											健康个体	N491239	0.00	0.09	0.21	0.20	0.33	0.32	0.25	0.28
健康个体	N491677		56.88	0.33	0.34	0.46	0.57	0.46	0.41	0.45
											健康个体	N491685	9.18	0.35	0.37	0.20	0.32	0.44	0.29	0.24

a：PDI，埃兹蛋白和Gal-3的组合

b：PDI，CEA，埃兹蛋白和Gal-3的组合

c：PDI，CA 19-9，E-cadhrin和LEI的组合

d：PDI，L-FABP，蛋白酶体20S和绒毛蛋白的组合

e PDI，L-FABP，蛋白酶体20S，绒毛蛋白和Gal-3的组合

f：PDI，CA 19-9，ACY，L-FABP，埃兹蛋白，LEI，蛋白酶体20S，绒毛蛋白和Gal-3的组合

f：PDI，CEA，CA 19-9，ACY，L-FABP，埃兹蛋白，LEI，蛋白酶体20S和绒毛蛋白的组合

实施例5：粪便肿瘤标记物测定

用重约1g的一块粪便提取，向其中加入10ml含有1g/L叠氮化物的100mM磷酸钠缓冲液pH7.2。混合物涡旋均质1分钟。样品然后在冰上进行4轮7秒超声。在2000g、4℃离心10分钟除去未溶解部分。上清储存在-30℃直至测定。

如果需要，在将粪便在HBs Ag Ultra cartridge第一个孔的缓冲液中合适稀释后，使用实施例3描述的ELISA测定以搜索粪便中的肿瘤标记物。

图20-22分别示出试验测定酰化氨基酸水解酶1、半乳凝集素-3和蛋白酶体20S。酰化氨基酸水解酶1、半乳凝集素-3和蛋白酶体20S的量的增加分别在具有结直肠癌的患者的10、14和8个粪便中观察到。

实施例6：经ELISPOT技术检测肿瘤标记物

1.细胞培养

LnCAP前列腺癌细胞系在补加2mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES、1mM丙酮酸钠和10％FCS(均来自Gibco)的RPMI 1640培养基中培养。细胞用作阴性对照。

Caco-2结直肠癌细胞系在含有2mM L-谷氨酰胺不含FCS的DMEM培养基(均来自Gibco)中培养。

HT-29结直肠癌细胞系在含有2mM L-谷氨酰胺和10％FCS的MEM培养基(均来自Gibco)中培养。

HT-29/B6结直肠癌细胞系在含有4mM L-谷氨酰胺不含FCS的DMEM培养基(均来自Gibco)中培养。

细胞在具有5％CO₂的温箱中保持于37℃。

2.ELISPOT技术

这个方法使得可以确定分泌蛋白质的细胞数。具有PVDF膜的96孔ELISPOT平板(Multiscreen IP，Millipore)用在无菌PBS中的10μg/mL的小鼠抗肿瘤标记物单克隆抗体(捕获抗体，见下表11，其给出ELISPOT中使用的抗体)在+4℃过夜包被，每孔100μl。平板然后用PBS洗涤，并用含有10％FCS的培养基饱和。平行地，细胞胰蛋白酶化，计数，然后稀释至10⁵细胞/mL。每孔分配200μl这个细胞悬液及这个原液的级联稀释液。平板然后在潮湿气氛下在5％CO₂于37℃保温20小时，然后用含有0.05％Tween-20的PBS洗涤。剩余细胞然后经冰冷的水处理10分钟而裂解，然后再次洗涤平板。揭示抗体是针对待测定的肿瘤标记物的生物素化单克隆抗体(表11)，其然后以0.1μg/孔加入(在环境温度保温2小时)。斑点通过加入extravidin-碱性磷酸酶(Sigma)和底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/nitro blue tetrazolium(BCIP/NBT，Biorad)而揭示。背景噪声相应于在LnCap孔中测量的斑点数并在所用阅读条件下在0-8个斑点之间变化。非特异性斑点的平均数从特异性信号中减去。

表11

3.结果

每百万保温细胞中分泌感兴趣肿瘤标记物的Caco-2，HT-29和HT-29/B6细胞数示于图23。ELISPOT能够证实肿瘤标记物被结肠癌细胞系的释放或分泌。可以根据申请人的专利申请WO03/076942的方法用这种技术搜索患者中循环肿瘤细胞。

实施例7：用结肠组织进行肿瘤标记物的免疫组织化学检测

1.方法学

首先，将组织-微阵列玻片脱石蜡。为此，它们相继在下述浴中保温10分钟：甲基环己烷(两次)、100％乙醇、95％乙醇、70％乙醇和水。然后玻片用含有0.1％Tween 20的TBS(TBS-T)中搅拌下洗10分钟。抗原在10mM柠檬酸盐缓冲液pH6中通过加热至90℃40分钟然后冷却至环境温度30分钟而再活化。内源过氧化物酶通过在含有3％H₂O₂的TBS-T中保温5分钟而抑制。玻片然后在恒湿箱中用在TBS-T中的3％BSA在37℃饱和1小时。

玻片然后用抗白细胞弹性蛋白酶抑制剂(克隆3D9C2)或抗I-丝束蛋白(克隆8D6A3)一抗保温2小时(保温在恒湿箱中于37℃进行)，所述抗体在含有3％BSA的TBS-T中稀释至10μg/ml。在TBS-T中洗涤3次每次10分钟后，玻片在在恒湿箱中在37℃与辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠二抗(Cat.No.115-035-003Jackson Immunoresearch)保温2小时，所述二抗在饱和溶液中稀释至1/400。玻片在TBS-T中洗涤3次每次10分钟，然后在PBS中洗3次每次10分钟。玻片用Sigma Fast底物(Cat.No.D-4168，Sigma-Aldrich)显色5分钟。在PBS中洗涤而终止染色。用Harris苏木精(Cat.No.MHS 16，Sigma-Aldrich)复染30秒。用水及用PBS洗涤后，玻片封固，用于在显微镜下观测。

用于免疫组织化学标记的抗体针对这种应用特异性选择，不依赖于它们在ELISA或在Western印迹中的反应性。

2.白细胞弹性蛋白酶抑制剂的免疫组织化学检测

使用组织-微阵列玻片筛查大量样品。这些样品是点印在玻片上的结肠组织。患者的特征(存在于结直肠癌组织-微阵列上的结肠组织斑点的特征)以及用抗白细胞弹性蛋白酶抑制剂抗体进行的免疫标记的结果在表12中示出。

表12

表中结果证实，在健康结肠粘膜生物活检中无标记(10个阴性)。在腺瘤中标记也是阴性的(1/1)。标记在结肠腺癌的上皮细胞中是阳性的(在8/11患者中是+)。在基质中无标记。

3.I-丝束蛋白的免疫组织化学检测

使用组织-微阵列玻片筛查大量样品。这些样品是点印在玻片上的结肠和直肠组织。患者的特征(存在于结直肠癌组织-微阵列上的结肠组织斑点的特征)以及用抗I-丝束蛋白抗体进行的免疫标记的结果在表13中示出。

表13

表中结果证实：

-在健康结肠粘膜生物活检中，标记在8个样品中是弱的(+)，在2个样品中是++。标记在结肠腺瘤中也是弱的(+)(1/1)。标记在结肠腺癌的上皮细胞中是强阳性++(++在6/9患者中，3个是弱+，包括结肠胶体腺癌)。在基质(stroma)中无标记；

-在健康直肠粘膜生物活检中，标记以非特异性方式存在于表面上皮中(3/4)，在一个样品中是++水平。标记在直肠腺瘤中是强阳性++(5/9)或者谨慎(discreet)+(4/9)。标记在直肠腺癌的上皮细胞中也是强阳性++(在3/4患者中为++，1个患者为弱+)。在基质中无标记。

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Claims

1.至少一种抗蛋白质二硫化物异构酶(PDI)单克隆抗体在制备用于通过确定取自怀疑患有结直肠癌的患者的生物样品中PDI标记物的存在来体外诊断结直肠癌的试剂盒中的用途，其中所述单克隆抗体针对的PDI表位选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和在PDI的三维结构中与SEQ ID No.2接近的芳族氨基酸、以及SEQ ID No.3所示的表位。

2.权利要求1的用途，特征在于所述生物样品是远离肿瘤的样品。

3.权利要求1或2的用途，特征在于使用针对序列SEQ ID No.3所示表位的至少一种抗PDI单克隆抗体，以及针对PDI表位的至少一种其它单克隆抗体，所述PDI表位选自序列SEQ ID No.1、以及SEQ ID No.2和在PDI的三维结构中与之接近的芳族氨基酸。

4.权利要求3的用途，特征在于使用针对SEQ ID No.1所示表位的至少一种抗PDI单克隆抗体以及针对SEQ ID No.3所示表位的至少一种其它抗体。

5.权利要求1的用途，特征在于所述体外诊断还包括确定选自如下标记物的至少一种其它肿瘤标记物的存在：白细胞弹性蛋白酶抑制剂、埃兹蛋白、酰化氨基酸水解酶1、肝脂肪酸结合蛋白、肠脂肪酸结合蛋白、载脂蛋白AI、载脂蛋白AII和I-丝束蛋白。

6.权利要求1的用途，特征在于所述体外诊断还包括确定至少一种其它肿瘤标记物的存在，所述其它肿瘤标记物选自如下标记物：β2-微球蛋白、蛋白酶体20S、半乳凝集素-3、L-乳酸脱氢酶B链、钙网蛋白、再生胰岛衍生蛋白3α、肿瘤相关的钙信号转导蛋白1、角蛋白类型II细胞骨架8、角蛋白类型I细胞骨架18、角蛋白类型I细胞骨架19、上皮钙粘蛋白、CEA、绒毛蛋白、CA19-9、CA242、CA50、CA72-2、睾酮、TIMP-1、Cripto-1、Intelectin-1、细胞角蛋白20、翻译控制的肿瘤蛋白、前防御素-A5、防御素-A5；血液中甲基化DNA的检测；粪便DNA片段中特异性改变的检测；以及粪便人血红蛋白的检测。

7.权利要求6的用途，特征在于所述血液中甲基化DNA的检测为AXL4基因的甲基化DNA的检测或者Septin-9基因的甲基化DNA的检测。

8.权利要求6的用途，特征在于所述粪便DNA片段中特异性改变的检测为粪便DNA的特异性突变的检测或者粪便DNA的甲基化模式的特异性改变的检测。

9.权利要求1的用途，特征在于所述体外诊断包括涉及结直肠癌的早期诊断、筛查、治疗随诊、预后以及复发诊断。

10.序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或者SEQ ID No.3所示的表位。

11.抗-PDI抗体，其特异性结合权利要求10的表位。