ES2579238T3 - Procedimiento de análisis de la proteína disulfuro isomerasa para el diagnóstico in vitro del cáncer colorrectal - Google Patents

Abstract

Procedimiento de diagnóstico in vitro del cáncer colorrectal por determinación de la presencia del marcador proteína disulfuro isomerasa (PDI) en una muestra biológica procedente de un paciente sospechoso de estar afectado de cáncer colorrectal utilizando al menos un anticuerpo monoclonal anti-PDI dirigido contra un epítopo de la PDI seleccionado entre los epítopos de las secuencias SEQ ID n°1, SEQ ID n°2 con un aminoácido aromático próximo a la estructura tridimensional de la PDI y SEQ ID n°3.

Description

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(DiNonA Inc.) podía ser útil para la detección de enfermedades digestivas en asociación con un análisis de sangre oculta en las heces. Finalmente, la utilización de la citoqueratina 20 (nº Swiss Prot P35900, también denominado Queratina tipo I, citoesqueleto 20, CK-20, Queratina-20, K20, o Proteína IT) como marcador en el cáncer colorrectal está descrita en la solicitud de patente US2002/0160382.

El marcador cadherina epitelial (nº Swiss Prot P12830, también denominado E-cadherina, Uvomorulina, Cadherina1, CAM 120/80 o antígeno CD324) es una proteína transmembranaria mediadora de la adhesión celular calciodependiente. Está expresada específicamente en las células epiteliales, en las que está implicada en el mantenimiento de su fenotipo. El dominio citoplásmico de E-cadherina se une a la -catenina, que está ella en sí misma unida a las redes de filamentos de actina del citoesqueleto. Esta unión E-cadherina/-catenina desempeña un papel crítico para estabilizar las adhesiones células/células del tejido epitelial. La pérdida de E-cadherina puede por lo tanto reducir la adhesión celular y aumentar el poder invasivo de las células cancerosas. Una reducción de expresión de E-cadherina o de -catenina está generalmente asociada con una desdiferenciación y una agresividad más importante del tumor, en particular para los cánceres digestivos. Es así que F. Roca et al.46 han mostrado que los pacientes que padecen un cáncer colorrectal y que sub-expresan la E-cadherina tenían un pronóstico más peyorativo que los pacientes que tienen un nivel de expresión normal. A partir de 1983, Damsky et al.47 han mostrado que una forma soluble de E-cadherina podía ser liberada por la línea celular del cáncer de mama MCF-7. Esta forma soluble corresponde a la escisión de la parte extracelular de E-cadherina. Más tarde, M. Katayama et al.48 han mostrado que la forma soluble de E-cadherina podía ser liberada en la circulación sanguínea en caso de cáncer, y C. Willmanns et al.49 han mostrado que el aumento de la dosis de E-cadherina sanguínea estaba correlacionado con la fase tumoral para los cánceres colorrectales. Por otro lado, la compañía Takara BioChemicals (Tokio, Japón) propone un kit comercial.

El análisis de ACE (antígeno carcino-embrionario) para el diagnóstico del cáncer colorrectal se ha propuesto desde 1965 por P. Gold y S. Freedman50, pero el análisis sanguínea de este marcador tiene una sensibilidad mediocre para el diagnóstico de cánceres colorrectales en una fase poco avanzada. Es por eso que el análisis del ACE sérico está especialmente recomendado para evaluar el riesgo de metástasis hepáticas51 y para el seguimiento terapéutico. Además, es un marcador poco específico del cáncer colorrectal; en efecto, puede estar aumentado en muchos otros cánceres (pulmón, mama, etc.). Por el contrario, el análisis de ACE en las heces parece más sensible y más específico que el análisis de ACE sérico o que el análisis de sangre en las heces52. No obstante, no se propone todavía este análisis de forma rutinaria.

Los determinantes antigénicos 1116-NS-19-9 reactivos, más comúnmente denominados CA19-9 (Carbohydrate Antigen 19.9), son llevados por unas proteínas de peso molecular elevado53. El análisis sanguíneo de CA 19-9 es más específica que la de ACE. El porcentaje de CA 19-9 sanguíneo aumenta en caso de cáncer colorrectal, de páncreas y de hígado (colangiocarcinoma), pero también en caso de patologías no cancerosas (colangitis, etc.). Su uso en asociación con ACE está recomendado tanto en el momento del diagnóstico de un cáncer como para el seguimiento de la patología.

J. Holmgren et al.54 han mostrado que la dosis sérica de antígeno CA 50 aumentaba en caso de cáncer colorrectal. El antígeno CA 50 está definido por su facultad para ser reconocido por un anticuerpo monoclonal específico.

Tratándose del marcador CA 72, T.L. Klug et al.55 han mostrado que la dosis sérica de antígeno CA 72 aumentaba en caso de cáncer colorrectal. El antígeno CA 72 está definido por su facultad para ser reconocido por un anticuerpo monoclonal específico.

Asimismo, P. Kuusela et al.56 han mostrado que la dosis sérica de antígeno CA 242 aumentaba en caso de cáncer colorrectal. El antígeno CA 242 está definido por su facultad para ser reconocido por un anticuerpo monoclonal específico.

La análisis de la testosterona para el diagnóstico del cáncer colorrectal se ha propuesto en el hombre por M. Holland et al.57. Estos autores han mostrado una caída del porcentaje de testosterona en caso de cáncer colorrectal.

Tratándose del marcador TIMP-1, o Inhibidor Tisular de la Matriz Metaloproteinasa de Tipo 1, la solicitud de patente US 2007/0020707 describe en particular el análisis de TIMP-1 para el diagnóstico del cáncer colorrectal con la ayuda de un análisis en un fluido corporal.

F. Model et al.58 han mostrado en julio de 2006, durante el congreso "World Congress on Gastrointestinal Cancer", que era posible detectar unas formas metiladas del gen de la septina-9 en el plasma de pacientes que padecen cáncer colorrectal.

M.P. Ebert et al.59 han mostrado que el gen ALX4, o homeocaja-4 de tipo Aristaless, estaba más a menudo metilado en los sueros de pacientes que padecen cáncer colorrectal que en los sueros control (P < 0,0001). Utilizando un valor límite de 41,4 pg/ml, han obtenido una sensibilidad del 83,3% y una especificidad del 70%.

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La espectrometría de masas puede también ser utilizada para la detección en el fluido biológico del o de los marcadores tumorales buscados en el procedimiento de la invención. El principio de la espectrometría es ampliamente conocido por el experto en la materia y está descrito por ejemplo en Patterson, S.63.

Para ello, la muestra biológica previamente tratada o no se pasa en un espectrómetro de masas y se compara el espectro obtenido con el del o de los marcadores tumorales buscados en el procedimiento de la invención. Un ejemplo de tratamiento previo de la muestra consiste en hacerlo pasar sobre un soporte de inmunocaptura, que comprende una de las parejas de unión del o de los marcadores tumorales buscados en el procedimiento de la invención, por ejemplo un anticuerpo dirigido contra el o los marcadores tumorales buscados en el procedimiento de la invención. Otro ejemplo de tratamiento previo de la muestra puede ser el pre-fraccionamiento de la muestra biológica, a fin de separar entre sí las proteínas de la muestra. En unas técnicas bien conocidas por el experto en la materia, se pueden agotar, por ejemplo, en primer lugar, las proteínas predominantes de la muestra.

Cuando el procedimiento de la invención es un método "sándwich", éste puede utilizar dos anticuerpos monoclonales, o bien un anticuerpo monoclonal y un anticuerpo poloclonal. Por supuesto, en este último caso, el anticuerpo monoclonal es al menos un anticuerpo monoclonal anti-PDI dirigido contra un epítopo de la PDI seleccionado entre los epítopos de las secuencias SEQ ID n°1, SEQ ID n°2 con un aminoácido aromático cerca de la estructura tridimencional de la PDI y SEQ ID n°3.

Se conocen algunos ejemplos de anticuerpo anti-Proteína Disulfuro Isomerasa y están disponibles en particular en el catálogo Abcam, como por ejemplo el anticuerpo policlonal de conejo anti-PDI, Cat. nº Ab3672.

Por el contrario, los anticuerpos anti-PDI que se unen específicamente a un epítopo seleccionado de entre los epítopos de las secuencias SEQ ID n°1, SEQ ID n°2 o SEQ ID n°3, de manera que se unen específicamente a la PDI y no a las PDI A3 y A6, son nuevos y constituyen otro objeto de la invención.

Según un modo de realización de la invención, el procedimiento de la invención utiliza dos anticuerpos monoclonales, preferentemente al menos un anticuerpo monoclonal antiPDI dirigido contra un epítopo de la secuencia SEQ ID n°3 y al menos otro anticuerpo monoclonal dirigido contra un epítopo de la PDI seleccionado entre los epítopos de las secuencias SEQ ID n°1 y SEQ ID n°2 con un aminoácido aromático próximo a la estructura tridimensional de la PDI. Más preferentemente, el procedimiento de la invención utiliza al menos un anticuerpo anti-PDI dirigido contra un epítopo de la secuencia SEQ ID n° 1 y al menos otro anticuerpo dirigido contra un epítopo de la secuencia SEQ ID n°3.

La determinación de la presencia, en la muestra biológica, del marcador tumoral de interés "ARNm" se puede realizar mediante cualquier procedimiento de determinación de la presencia de ARNm en una muestra, a saber o bien la detección directa del ARNm, o bien la detección indirecta del ARNm, o cualquier otro procedimiento de determinación de la presencia de un ARN en una muestra, conocido por el experto en la materia.

Por detección directa del ARNm, se entiende la puesta en evidencia del ARNm en sí mismo en la muestra biológica.

La detección directa del ARNm en la muestra biológica se puede realizar mediante cualquier medio conocido por el experto en la materia, como por ejemplo por hibridación con una pareja de unión específica del ARNm, llegado el caso después de la amplificación mediante la técnica PCR o NASBA.

Por hibridación, se entiende el proceso durante el cual, en condiciones apropiadas, dos fragmentos nucleotídicos, se unen con unos enlaces hidrógeno estables y específicas para formar un complejo bicatenario. Estos enlaces hidrógeno se forman entre las bases complementarias Adenina (A) y Timina (T) (o Uracilo (U)) (se habla de enlace A-T) o entre las bases complementarias Guanina (G) y Citosina (C) (se habla de enlace G-C). La hibridación de dos fragmentos nucleotídicos puede ser total (se habla entonces de fragmentos nucleotídicos o de secuencias complementarias), es decir que el complejo bicatenario obtenido durante esta hibridación comprende únicamente unos enlaces A-T y unos enlaces C-G. Esta hibridación puede ser parcial (se habla entonces de fragmentos nucleotídicos o de secuencias suficientemente complementarias), es decir que el complejo bicatenario obtenido comprende unos enlaces A-T y unos enlaces C-G que permiten formar el complejo bicatenario, pero también unas bases no enlazadas a una base complementaria. La hibridación entre dos fragmentos nucleotídicos depende de las condiciones de realización utilizadas, y en particular de la astringencia. La astringencia se define en particular en función de la composición de bases de dos fragmentos nucleotídicos, así como por el grado de desparejamiento entre dos fragmentos nucleotídicos. La astringencia puede estar también en función de los parámetros de la reacción, tales como la concentración y el tipo de especies iónicas presentes en la solución de hibridación, la naturaleza y la concentración de agentes desnaturalizantes y/o la temperatura de hibridación. Todos estos datos son bien conocidos y las condiciones apropiadas pueden ser determinadas por el experto en la materia. En general, según la longitud de los fragmentos nucleotídicos que se desean hibridar, la temperatura de hibridación está comprendida entre aproximadamente 20 y 70ºC, en particular entre 35 y 65ºC en una solución salina a una concentración de aproximadamente 0,5 a 1M. Las parejas de unión específicas o no del ARNm son cualquier pareja

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susceptible de unirse a este ARNm. A título de ejemplo, se pueden citar las sondas nucleicas, los cebadores de amplificación, y cualquier otra molécula capaz de unirse a este ARNm.

Por sonda de hibridación, se entiende un fragmento nucleotídico que comprende de 5 a 100 unidades nucleicas, en particular de 10 a 35 unidades nucleicas, que posee una especificidad de hibridación en condiciones determinadas para formar un complejo de hibridación con el material específico del gen diana de interés. La sonda de hibridación puede comprender un marcador que permita su detección.

En el sentido de la presente invención, se entiende por cebador de amplificación, un fragmento nucleotídico que comprende de 5 a 100 unidades nucleicas, preferiblemente de 15 a 30 unidades nucleicas que permite la iniciación de una polimerización enzimática, tal como en particular una reacción de amplificación enzimática. Por reacción de amplificación enzimática, se entiende un proceso que genera múltiples copias de un fragmento nucleotídico por la acción de al menos una enzima. Tales reacciones de amplificación son bien conocidas por el experto en la materia y se pueden citar en particular las técnicas siguientes:

-PCR (Polymerase Chain Reaction), tal como se describe en las patentes US 4,683,195, US 4,683,202 y US 4,800,159,

-NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) con la solicitud de patente WO 91/02818, y

-TMA (Transcription Mediated Amplification) con la patente US 5,399,491.

Por detección, se entiende o bien un método físico, o bien un método químico con un agente colorante intercalante tal como SYBR® Green I o el bromuro de etidio, o bien un método de detección con la ayuda de un marcador. Existen numerosos métodos de detección para la detección de los ácidos nucleicos64. Los marcadores apropiados son tales como se han definido anteriormente.

En el sentido de la presente invención, la sonda de hibridación puede ser una sonda denominada de detección. En este caso, la sonda denominada de detección está marcada mediante un marcador tal como se ha definido anteriormente. Gracias a la presencia de este marcador, se puede detectar la presencia de una reacción de hibridación entre una sonda de detección dada y el transcrito a detectar.

La sonda de detección puede ser en particular una sonda de detección "molecular beacons"65. Estas "molecular beacons" se vuelven fluorescentes durante la hibridación. Poseen una estructura de tipo tallo-bucle y contienen un fluoróforo y un grupo "quencher" (inhibidor de la fluorescencia). La fijación de la secuencia de bucle específica con su secuencia complementaria de ácido nucleico diana provoca un desenrollado del tallo y la emisión de una señal fluorescente durante la excitación a la longitud de onda conveniente.

La sonda de hibridación puede ser también una sonda denominada de captura. En este caso, la sonda denominada de captura está inmovilizada o es inmovilizable sobre un soporte sólido, mediante cualquier medio apropiado, es decir directa o indirectamente, por ejemplo por covalencia o adsorción. Los soportes sólidos apropiados son conocidos por el experto en la materia, y se pueden citar a título de ejemplos los materiales de síntesis o los materiales naturales, los látex, las partículas magnéticas, los derivados metálicos, los geles, etc. El soporte sólido puede estar en forma de una placa de microtitulación, de una membrana como se describe en la solicitud WO-A94/12670, de una partícula. Se puede también inmovilizar sobre el soporte varias sondas de captura diferentes, siendo cada una específica de un transcrito diana. En particular, se puede utilizar como soporte un biochip en el que pueden ser inmovilizadas un gran número de sondas.

La inmovilización de las sondas sobre el soporte es también conocida por el experto en la materia, y se puede citar un depósito de sondas por transferencia directa, la micro-deposición, la síntesis in situ y la fotolitografía.

La puesta en evidencia, en la muestra biológica, de las modificaciones o anomalías de ADN a nivel del gen que codifica para el marcador tumoral de interés se puede realizar mediante cualquier procedimiento de determinación de las alteraciones del ADN en una muestra. A saber, o bien la detección directa de mutaciones, o bien la puesta en evidencia de alteraciones en el perfil de metilación de los locus de interés, o cualquier otro procedimiento de determinación de alteraciones del ADN en una muestra, conocido por el experto en la materia.

Las mutaciones pueden incluir unas sustituciones puntuales de un nucleótido por otro, unas deleciones de uno o varios nucleótidos y unas inserciones de uno o varios nucleótidos. Las mutaciones pueden estar situadas en la parte que codifica el gen del marcador tumoral de interés, o en las partes 5' y 3' no codificantes como la región promotora

o la región terminadora de transcripción.

Las estrategias de puesta en evidencia de mutación se apoyan en las técnicas de la biología molecular y comprenden unas etapas de extracción de ADN, de amplificación por PCR u otra técnica de amplificación, de hibridación y/o de secuenciación. En el caso del cáncer colorrectal, se ha utilizado el procedimiento siguiente con éxito para realizar la detección de mutaciones en el ADN de las heces: concentración del ADN por precipitación,

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En el caso de la sangre como muestra biológica, las células tumorales circulantes se pueden aislar gracias a una técnica de separación celular sobre Ficoll asociada a una depleción de las células sanguíneas que utilizan unos anticuerpos anti-CD45 acoplados a perlas magnéticas (Dynal Biotech ASA, Noruega).

La detección del o de los marcadores tumorales buscados en el procedimiento de la invención se puede efectuar entonces directamente a partir de células tumorales circulantes aisladas de la muestra biológica, por ejemplo por marcado inmunocitoquímico de estas células con un anticuerpo anti-marcador(es) tumoral(es) buscado(s) en el procedimiento de la invención, después de haber depositado las células tumorales circulantes en una lámina por Cytospin. La detección del o de los marcadores tumorales buscados en el procedimiento de la invención se puede efectuar asimismo directamente en las células tumorales circulantes utilizando el método de citometría de flujo, tal como se describe en Métézeau et al.71.

En estas condiciones, dichas células circulantes pueden ser tratadas en condiciones que permiten el bloqueo del o de los marcadores tumorales buscados en el procedimiento de la invención en el interior de dichas células. Tal tratamiento está descrito por Mathieu et al.72.

La detección del o de los marcadores tumorales buscados en el procedimiento de la invención se realiza después de haber hecho que la membrana de las células sea permeable para hacer entrar las parejas de unión específicas del o de los marcadores buscados en el procedimiento de la invención.

La detección directa del o de los marcadores tumorales utilizados en el procedimiento de la invención a partir de las células circulantes puede también ser efectuado con la ayuda de un procedimiento ELISPOT, por ejemplo con la ayuda del procedimiento descrito en la solicitud de patente WO03/076942 depositada por la solicitante. Este procedimiento es un procedimiento de detección y/o cuantificación de células tumorales circulantes de una muestra biológica, las cuales son capaces de liberar o segregar in vitro uno o varios marcadores tumorales, que comprende las etapas que consisten en:

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depositar una cantidad de dichas células en el fondo de una superficie de cultivo sobre la cual se fija al menos una pareja de unión específica de dicho o dichos marcadores tumorales,

(ii)

cultivar dichas células en condiciones tales que liberan o segregan dichos marcadores tumorales que están inmunocapturados en el fondo de la superficie de cultivo,

(iii) eliminar las células por lavado,

(iv)

añadir al menos un conjugado marcado específico de dichos marcadores tumorales,

(v)

visualizar el marcado así obtenido.

La detección directa del o de los marcadores tumorales utilizados en el procedimiento de la invención en las células tumorales se puede también realizar en el medio de cultivo de dichas células después de haberlas cultivado en condiciones tales que segregan uno o unos marcadores tumorales utilizados en el procedimiento de la invención.

Las condiciones de cultivo para la liberación o la expresión de los marcadores tumorales son unas condiciones clásicas tales como 37ºC bajo atmósfera húmeda y al 5% de CO2.

Cuando la muestra biológica es una muestra sólida, la presencia del o de los marcadores tumorales puede también ser mostrada in vivo, in situ en los tumores.

Para mostrar la presencia de un marcador tumoral dentro de un tumor in vivo, se puede utilizar cualquier método de diagnóstico por imágenes conocido por el experto en la materia. Para ello, se puede acoplar una pareja de unión de dicho marcador tumoral a un trazador de diagnóstico por imagen.

Por acoplamiento de las parejas de unión a un trazador de diagnóstico por imágenes, se entiende la fijación de un trazador capaz de ser detectado mediante cualquier método de diagnóstico por imágenes, conocido por el experto en la materia y generar directa o indirectamente una señal detectable. Así, el trazador puede ser un trazador radioactivo como el tecnetio-99. En este caso, el órgano que padece cáncer primitivo o metástasis fijará el marcador tumoral y su trazador. La radiación emitida por el órgano puede ser grabada por una cámara especial, por ejemplo una cámara gamma. El aparato recoge los centelleos generados por la sustancia radioactiva y permite así visualizar el órgano.

En otro procedimiento de la invención, el trazador puede comprender un cuerpo radioactivo que emite positrones (Fluor 18). Las imágenes serán adquiridas después por un sistema de tomografía por emisión de positrones.

En otro procedimiento preferido de la invención, la pareja del o de los marcadores tumorales puede estar acoplada a nanopartículas. A título de ejemplo, puede tratarse de nanopartículas supramagnéticas. Por ejemplo unas

nanopartículas magnéticas aniónicas para la aplicación al marcado celular directo y la detección in vivo por diagnóstico por imágenes por resonancia magnética nuclear. Puede también tratarse de nanopartículas de oro.

Gracias a los procedimientos de la invención que permiten la detección del marcador tumoral in vivo, se podrá

5 visualizar las zonas del organismo en las que hubo fijación de la pareja de unión del marcador tumoral, los cánceres que producen el marcador tumoral, y en particular el cáncer colorrectal, así como sus localizaciones de sus metástasis a distancia y las afecciones ganglionarias.

El procedimiento de la invención se puede utilizar tanto para el diagnóstico precoz, como para la detección, el

10 seguimiento terapéutico, el pronóstico y el diagnóstico de las recaídas en el ámbito del cáncer colorrectal ya que sólo las células cancerosas segregan PDl y que esta producción depende del grado del cáncer, lo que constituye otro objeto de la invención.

Por otro lado, los epítopos descritos en esta solicitud, de secuencia SEQ ID n°1, SEQ ID n°2 y SEQ ID n°3, son 15 nuevos, y constituyen otro objeto de la invención.

La invención se entenderá mejor con la ayuda de los ejemplos siguientes dados a título ilustrativo y no limitativo, así como con la ayuda de las figuras 1 a 22 anexas, en las que:

20 -la figura 1 es una representación gráfica del análisis por ELISA de la PDI (A1), la PDI A3 y PDI A6 que da la señal (DO) en función de la concentración en ng/ml de PDI (A1), la PDI A3 y PDI A6,

-la figura 2 es un gráfico relativo al ensayo por ELISA de la PDL, en ng/ml, en el suero de pacientes que presentan un cáncer colorrectal (CCR+) y de pacientes sanos (CCR-),

25 -la figura 3 es un gráfico relativo al análisis por ELISA de LEI, en ng/ml, en el suero de pacientes que presentan un cáncer colorrectal (CCR+) y de pacientes sanos (CCR-),

-la figura 4 es un gráfico relativo al análisis por ELISA de la Ezrina, en ng/ml, en el suero de pacientes que 30 presentan un cáncer colorrectal (CCR+) y de pacientes sanos (CCR-),

-la figura 5 es un gráfico relativo al análisis por ELISA de la Aminociclasa 1, en ng/ml, en el suero de pacientes que presentan un cáncer colorrectal (CCR+) y de pacientes sanos (CCR-),

35 -la figura 6 es un gráfico relativo al análisis por ELISA de L-FABP, en ng/ml, en el suero de pacientes que presentan un cáncer colorrectal (CCR+) y de pacientes sanos (CCR-),

-la figura 7 es un gráfico relativo al análisis por ELISA de I-FABP, en pg/ml, en el suero de pacientes que presentan un cáncer colorrectal (CCR+) y de pacientes sanos (CCR-),

40 -la figura 8 es un gráfico relativo al análisis por ELISA de la Apolipoproteína AI, en µg/ml, en el suero de pacientes que presentan un cáncer colorrectal (CCR+) y de pacientes sanos (CCR-), o bien en microplaca ELISA (figura 8A), bien con el kit Lincoplex (figura 8B),

45 -la figura 9 es un gráfico relativo al análisis por el kit multiplex de Linco de la Apolipoproteína AII, en µg/ml, en el suero de pacientes que presentan un cáncer colorrectal (CCR+) y de pacientes sanos (CCR-),

-la figura 10 es un gráfico relativo al análisis por ELISA de la Plastina-I, en RFV (Valor de Fluorescencia Relativa), en el suero de pacientes que presentan un cáncer colorrectal (CCR+) y de pacientes sanos (CCR-),

50 -la figura 11 es un gráfico relativo al análisis por ELISA de la beta2-Microglobulina, en ng/ml, en el suero de pacientes que presentan un cáncer colorrectal (CCR+) y de pacientes sanos (CCR-),

-la figura 12 es un gráfico relativo al análisis por ELISA de ACE, en ng/ml, en el suero de pacientes que presentan 55 un cáncer colorrectal (CCR+) y de pacientes sanos (CCR-),

-la figura 13 es un gráfico relativo al análsis por ELISA de CA 19-9, en U/ml, en el suero de pacientes que presentan un cáncer colorrectal (CCR+) y de pacientes sanos (CCR-),

60 -la figura 14 es un gráfico relativo al análsis por ELISA de la Testosterona, en ng/ml, en el suero de pacientes que presentan un cáncer colorrectal (CCR+) y de pacientes sanos (CCR-),

-la figura 15 es un gráfico relativo al análsis por ELISA de la E-Cadherina, en ng/ml, en el suero de pacientes que presentan un cáncer colorrectal (CCR+) y de pacientes sanos (CCR-), 65

-la figura 16 es un gráfico relativo al análisis por ELISA de la PAP1, en ng/ml, en el suero de pacientes que presentan un cáncer colorrectal (CCR+) y de pacientes sanos (CCR-),

-la figura 17 es un gráfico relativo al análisis por ELISA de la Galectina-3, en RFV, en el suero de pacientes que 5 presentan un cáncer colorrectal (CCR+) y de pacientes sanos (CCR-),

-la figura 18 es un gráfico relativo al análisis por ELISA de la LDH, en ng/ml, en el suero de pacientes que presentan un cáncer colorrectal (CCR+) y de pacientes sanos (CCR-),

10 -la figura 19 es un gráfico relativo al análisis por ELISA del Proteasoma 20S, en ng/ml, en el suero de pacientes que presentan un cáncer colorrectal (CCR+) y de pacientes sanos (CCR-),

-la figura 20 es un gráfico relativo al análisis por ELISA de Aminociclasa 1, en ng/ml, en las heces de pacientes que presentan un cáncer colorrectal (CCR+) y de pacientes sanos (CCR-),

15 -la figura 21 es un gráfico relativo al análisis por ELISA de Galectina-3, en RFV, en las heces de pacientes que presentan un cáncer colorrectal (CCR+) y de pacientes sanos (CCR-),

-la figura 22 es un gráfico relativo al análisis por ELISA de Proteasoma 20S, en RFV, en las heces de pacientes que 20 presentan un cáncer colorrectal (CCR+) y de pacientes sanos (CCR-), y

-la figura 23 es una representación gráfica de un análisis ELISPOT de LEI, de Ezrina y de Galectina-3, en número de puntos por 106 células cancerígenas de las líneas Caco-2, HT-29 y HT29-B6.

25 Ejemplo 1: Clonación de los genes que codifican para los marcadores tumorales y expresión de las proteínas recombinantes

1. Amplificación del ADNc y clonación

30 Se cultiva la línea de cáncer colorrectal Caco-2 en el medio DMEM que contiene 2 mM de L-Glutamina, sin SVF (suero fetal de ternera) (todos de Gibco).

Para la clonación de los genes LEI, L-FABP y Gal-3, se han extraído los ARN mensajeros a partir del residuo de 108 células Caco-2 utilizando el kit FastTrack 2.0 de Invitrogen (Cat. nº 45-0019), siguiendo el protocolo proporcionado

35 por el fabricante. La etapas de transcripción inversa y de PCR se realizan de una sola vez a partir de 450 ng de ARNm Caco-2, con el kit Superscript III One Step RT-PCR System (Invitrogen Cat. nº 12574-018) utilizando la enzima Platinum Taq DNA polimerasa, siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante. Los cebadores de PCR utilizados para la amplificación de los genes se dan en la Tabla 1.

40 Tabla 1

Genes y Cebadores

Oligonucleótidos

LEI

OL215 (SEQ ID 4)

5'-ATGGAGCAGCTGAGCTCAGCAAAC-3'

OL216 (SEQ ID 5)

5'-CTAAGGGGAAGAAAATCTCCCCAA-3'

L-FABP

Sentido (SEQ ID 6)

5'-CGGAGCGTCTCCCATGAGTTTCTCCGGCAAGTA-3'

antisentido (SEQ ID 7)

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Gal-3

OL217 (SEQ ID 8)

5'-ATGGCAGACAATTTTTCGCTCC-3'

OL218 (SEQ ID 9)

5'-TTATATCATGGTATATGAAGCACTGG-3'

Los fragmentos de ADN obtenidos se clonaron en el vector pCR2.1 TOPO (LEI y Gal-3) con el TA Cloning kit (Invitrogen Cat. nº K4520-01) o el vector pCMV6-XL4 de Origene (L-FABP) después de la digestión por Bsm BI y

45 Xba I. Se secuenciaron los plásmidos a fin de verificar que el ADNc es conforme a la secuencia esperada.

Para la clonación del gen que codifica para la Aminociclasa 1, los ARN totales se extrajeron a partir de un residuo de 108 células Caco-2 utilizando el kit RNA Easy Mini de Qiagen, siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante. La transcripción inversa se realiza a partir de 10 ng de ARN Caco-2, con la enzima Superscript II (Invitrogen)

50 siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante. El cebador de transcripción inversa es un oligo(dT).

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escalpelo, después sufrieron 10 ciclos de extracción en el sistema Medimachine (Becton Dickinson) utilizando unos Medicons 50 m con 1 ml de tampón PBS, 2,5 mM EDTA, inhibidores de proteasas (pastillas Roche). Estos 10 ml de suspensión celular se agrupan, se completan a 25 ml y después se centrifugan durante 15 min a 600g. El sobrenadante corresponde al extracto de tejido que se trata según el protocolo de preparación de muestra de los geles NuPAGE Novex. Se utilizan unas muestras reducidas, a una concentración final en proteína total de 0,4 mg/ml. El volumen de depósito es de 20 l por pocillo, en un gel NuPAGE Novex Bis-Tris 4-12%, tampón de migración MOPS. Después de la migración (bajo 200V, durante 1 hora) y transferencia sobre membrana de PVDF (bajo 400 mA, durante 45 min.), la calidad de la transferencia se aprecia por una coloración con negro amido.

Las membranas son saturadas con el 5% de leche desnatada (Régilait) en una solución de TNT (Tris 15 mM, NaCl 0,14M, Tween 20 0,5% pH8) a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la saturación, las membranas se incuban durante 1 hora con los diferentes anticuerpos a ensayar diluidos a 10 µg/ml en la solución de saturación. Después del aclarado con TNT, las membranas se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente con un conjugado anti-ratón-peroxidasa de rábano picante diluido al 1:5000, (Cat No. 115-035-062, Jackson Immunoresearch) en la solución de saturación. Después del aclarado, se realiza la revelación con el kit Substrat Supersignal West Dura Extended (Cat No. 34076, Pierce) según los datos de utilización recomendados.

La señal de quimioluminiscencia sobre las membranas se midió con el sistema de diagnóstico por imágenes VersaDoc de Biorad. A partir de la imagen de la transferencia Western, los volúmenes de las bandas que corresponden a los diferentes marcadores tumorales se evaluaron con el programa QuantityOne (Bio-Rad). El volumen corresponde a la intensidad de la señal de quimioluminiscencia multiplicada por la superficie de la banda.

5.2. Resultados

Los resultados de la transferencia Western se recogen en la Tabla 5, que da el volumen de las bandas que corresponden al marcador tumoral de interés sobre los análisis mediante transferencia Western, en función de las diferentes muestras ensayadas. Estos resultados muestran que los marcadores tumorales ensayados están bien expresados por las líneas de cáncer de colon Caco-2 y HT-29, así como en los tejidos, como se muestra con los extractos de tumor y mucosa, obtenidos a partir de pacientes. La intensidad de la señal obtenida con un anticuerpo sobre una muestra se puede comparar con las señales obtenidas con las otras muestras y el mismo anticuerpo. La técnica utilizada permite confirmar la presencia o la ausencia del marcador en el tejido (muestra no distante) y la especificidad de los anticuerpos frente a marcadores. Esta técnica no se ha realizado en este ejemplo en las muestras distantes, ya que no permitiría deducir la presencia o no del marcador tumoral en las muestras distantes, ni determinar si su concentración sería aumentada o disminuida en estos. Además, el esquema experimental utilizado no permite comparar la reactividad de un anticuerpo con el otro.

Tabla 5

Marcador

Caco-2 HT-29 Lavado Lavado Lavado Lavado Lavado

tumoral

y tumor mucosa tumor mucosa tumor

anticuerpo

GHBD001 GHBD004 GHBD004 CLSP109 CLSP109

LEI

21B10A5

8365 7678 NT 60200 36506 NT NT

10E1H1

0 0 NT 13357 6893 NT NT

Ezrina

4A9H5

7066 4742 NT NT NT 1588 2446

4A7A6C1

123436 116448 42480 15303 67439 NT NT

Amiroacilasa 1

2A7F6

10687 4787 NT NT NT 4477 7238

11H7D9

217664 232005 36093 10513 30233 NT NT

Plastina-I

3D11D10

136725 NT NT NT NT 275477 246564

8C8C5

557 1110 4364 77 0 NT NT

PDI

12H3B6

3961 2738 NT NT NT 2724 4075

3B5C12

4464 2695 NT NT NT 2558 4317

16D9F6

568 421 NT NT NT 610 100

Calreticulina

5C10H10

2842 3040 NT NT NT 2503 3294

11B6D11

3261 2937 NT NT NT 2070 2764

LDH

3F11E11

45391 NT NT NT NT 30411 13942

12F10G8

122907 154593 11841 15811 53285 NT NT

Galectina-3

12F8A12

245712 65790 18262 12961 7307 NT NT

14A5G1

254531 120010 79833 98361 45872 NT NT

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

NT: no ensayado.

5.3. Anticuerpos monoclonales dirigidos contra la Plastina-I

En el paciente GHBD004, el anticuerpo 8C8C5 no enciende, o enciende muy débilmente, la banda que corresponde a la Plastina-I. La presencia de Plastina-I en estas muestras puede ser demostrada utilizando por ejemplo el anticuerpo 8G2D2, que presenta una mejor afinidad para la Plastina-I en transferencia.

Como la Plastina-I es miembro de una familia de proteínas que comprende otras 2 isoformas (Plastinas L y T) con las que presenta más del 70% de homología, se ha ensayado el conjunto de los clones de anticuerpos monoclonales obtenidos para su reactividad frente a proteínas GST-Plastina-L y GST-Plastina-T (proporcionadas por el Institut Curie). Al final de este cribado, se han seleccionado los clones 3D11D10, 8C8C5, 3A3H2 y 8G2D2 que no presentan reactividad cruzada con los otros miembros de la familia. Estos anticuerpos son muy específicos de la isoforma Plastina-I.

6. Caracterización de los epítopos reconocidos por los anticuerpos monoclonales utilizando las técnicas de "Spotscan" y del cribado de banco de péptidos portados por fagos

6.1. Metodología

La técnica del "Spotscan", adaptada según Frank y Döring76, permite sintetizar de manera simultánea un gran número de péptidos sobre membrana de celulosa. Estos péptidos reproducen la secuencia del antígeno diana en forma de péptidos de 8 a 12 aminoácidos, solapándose de 1 a 4 residuos. Estos péptidos son después puestos en contacto con el anticuerpo a estudiar en un ensayo colorimétrico de tipo Blot, y la identificación de los péptidos inmunorreactivos permite deducir la secuencia mínima del epítopo del anticuerpo y localizarlo precisamente sobre el antígeno.

La síntesis se efectúa sobre una membrana de celulosa que lleva uniformemente unos brazos de polietilenglicol (PEG) de una longitud de 8 a 10 unidades, que presenta una función NH2 libre al final de la cadena. Se desarrolla desde el extremo C-terminal hacia el extremo N-terminal de los péptidos. Los aminoácidos tienen su función aminada protegida por un grupo Fmoc (9-fluoremetiloxicarbonilo), y sus cadenas laterales, susceptibles de reaccionar durante la síntesis, son asimismo protegidas por unos grupos tritilo, t-butilo o t-butil-éter. Las soluciones madres de aminoácidos se preparan a una concentración de 0,33 M en NMP (N-metil-pirrolidona) que contiene 0,5 M de HOBt (hidroxibenzotriazol). El depósito de los aminoácidos se efectúa con la ayuda del robot ASP 222 (Abimed, Langenfeld, Alemania), controlado por medio del programa AutoSpot XL. La utilización de este robot permite realizar simultáneamente hasta 4 membranas de 96 pocillos, es decir 384 péptidos.

Para un ciclo de acoplamiento de un aminoácido, el robot deposita 0,7 µl de la solución de aminoácido activado extemporáneamente (un volumen de solución de diisopropil-carbodiimida 1,1 M diluido en NMP para 3 volúmenes de solución madre de aminoácido) sobre las membranas. Este depósito se repite una segunda vez, después la membranas son aclaradas en DMF /N,N-dimetilformamida). Los grupos NH2 que no han reaccionado son después acetilados por 4 a 6 incubaciones de 10 minutos en una solución de anhídrido acético 10% en DMF, a fin de evitar la aparición de péptidos abortivos o truncados. Después de 3 lavados de 2 minutos en DMF, los grupos Fmoc que protegen la función aminada de los aminoácidos son escindidos por una incubación de 5 minutos en una solución de piperidina al 20% en DMF. Después de 4 lavados en DMF, los puntos son teñidos con la ayuda de una solución de azul de bromofenol 1% en DMF, después la membrana se aclara 3 veces en metanol y se seca al aire libre antes del ciclo de acoplamiento siguiente.

Este protocolo se repite para la adición de cada nuevo aminoácido. Después del acoplamiento del último aminoácido, los péptidos son acetilados a fin de permitir el bloqueo de todos los grupos NH2 libres, impidiendo así la adición de otro aminoácido. Después, las cadenas laterales de todos los péptidos son desprotegidas por la incubación de las membranas en un baño ácido trifluoroacético/diclorometano/triisobutilsilano (5:5:0,3) durante 1 hora. Las membranas son después aclaradas 4 veces en diclorometano, 3 veces en DMF y 3 veces en metanol antes de ser secadas al aire libre y conservadas a -20°C hasta la inmunorrevelación.

Para inmunorrevelar los puntos con un anticuerpo monoclonal, las membranas se aclaran en primer lugar en metanol, después se lavan en TBS (Tris-GCl 50 mM pH 8,0, NaCl 140 mM, KCl 3 mM) antes de ser incubadas durante una noche a temperatura ambiente en la solución de saturación (solución concentrada 10X a base de caseína (Western Blocking reagent, Roche) diluida en TBS-Tween 20 0,05% (TBS-T) y que contiene un 5% de sacarosa). Después de un lavado de 10 minutos en TBS-T, las membranas se incuban durante 1h30 a 37ºC con el anticuerpo monoclonal diluido a 20 g/ml en solución de saturación. Las membranas son después lavadas 3 veces en TBS-T, después se incuban con el conjugado anti-ratón acoplado a la fosfatasa alcalina (Jacksin Immunoresearch), diluida al 1/2000ª en solución de saturación. Después 2 lavados de 10 minutos en TBS-T, después 2 lavados en CBS (ácido cítrico 10 mM pH 7, NaCl 140 mM, KCl 3 mM), el revelador, preparado extemporáneamente (5-bromo, 4-cloro, 3-indol, fosfato 600 M, bromuro de tetrazolio tiazolil blue 720 M, y MgCl2 5

imagen16

imagen17

CCR+

CLSP088/F0 GP 1 5 6C Plasma II 23,84

CCR+

CLSP105/F0 GS 1 10 7C Suero II 4,32

CCR+

CLSP115/F0 GS 2 3 7C Suero II 0,36

CCR+

CBSE005/F0 GP 3 2 3C Plasma III 107,57

CCR+

CBSE006/F0 GP 2 4 6C Plasma III 69,45

CCR+

CBSE007/F0 GP 2 2 4C Plasma III 50,12

CCR+

CBSE010/F0 GP 2 3 2C Plasma III 34,08

CCR+

CLSP072/F0 GS 2 10 4C Suero III 2,96

CCR+

CLSP089/F0 GS 1 9 2C Suero III 12,30

CCR+

CLSP123/F0 GS 3 1 2C Suero III 0,00

CCR+

CLSP138/F0 GS 1 4 7C Suero III 37,34

CCR+

CLSP153/F0 GS 3 2 7C Suero III 1,11

CCR+

GHBD019/F0 GS 1 6 2C Suero III 3,52

CCR+

GHBD059/F0 GS 1 2 7C Suero III 8,03

CCR+

CBSE012/F0 GS 4 3 3C Suero IV 0,88

CCR+

CBSE021/F0 GS 3 4 2C Suero IV 1,26

CCR+

CBSE026/F0 GS 4 6 1C Suero IV 9,66

CCR+

CBSE027/F0 GS 3 4 1C Suero IV 5,10

CCR+

CLSP042/F0 GP 1 2B Plasma IV 12,14

CCR+

CLSP057/F0 GS 1 3C Suero IV 5,52

CCR+

CLSP068/F0 GS 3 4 7C Suero IV 25,28

CCR+

CLSP079/F0 GS 1 7 7C Suero IV 2,35

CCR+

CLSP109/F0 GS 4 1 7C Suero IV 0,00

CCR+

CLSP132/F0 GS 2 3 2C Suero IV 0,00

CCR+

CLSP156/F0 GS 4 7B Suero IV 0,00

CCR

N491044/F0 HS 2 2 2C Suero 10,28

CCR

N491124/F0 HS 1 2 1C Suero 1,35

CCR

N491239/F0 HS 1 1 3C Suero 0,00

CCR

N491677/F0 HS 1 1 5C Suero 56,88

CCR

N491685/F0 HS 1 2 7C Suero 9,18

CCR

N511447/F0 HS 1 1 5C Suero 4,24

CCR

N511463/F0 HS 1 2 2C Suero 7,52

CCR

N511471/F0 HS2 1 4C Suero 8,28

CCR

N511498/F0 HS 2 2 2C Suero 11,33

CCR

N518059/F0 HS 1 2 2C Suero 4,15

CCR

N518518/F0 HS 1 2 7C Suero 1,26

CCR

N518542/F0 HS 1 2 1C Suero 0,00

CCR

N519043/F0 HS 1 1 7C Suero 10,71

CCR

N519078/F0 HS 1 1 7C Suero 14,48

CCR

N557680/F0 HS 2 1B Suero 3,86

CCR

N557699/F0 HS 1 1 7C Suero 4,18

CCR

N557701/F0 HS 1 1 3C Suero 15,06

CCR

N55771-/F0 HS 1 1 6C Suero 4,63

CCR

N557760/F0 HS 2 1B Suero 5,84

CCR

N748268/F0 HS 2 1B Suero 55,67

CCR

N835886/F0 HS 1 3 2C Suero 0,00

CCR

N835966/F0 HS 1 1 6C Suero 0,00

CCR

N836141/F0 HS 1 2 3C Suero 3,78

CCR

N83615-/F0 HS 1 3 2C Suero 4,45

CCR

N836205/F0 HS 2 1B Suero 1,69

CCR

N836213/F0 HS 2 1 7C Suero 3,07

CCR

N857552/F0 HS 2 1B Suero 1,96

CCR

N858037/F0 HS 2 1 1C Suero 10,81

CCR

N858045/F0 HS 2 1 1C Suero 5,26

CCR

N518067/F0 HS 1 2 2C Suero 12,71

a: CCR+: pacientes que padecen cáncer colorrectal / CCR-: sujeto sano

Las dosis obtenidas para los pacientes analizados se detallan en la figura 2. Se puede señalar en esta figura que 1 suero de paciente que tiene cáncer colorrectal de fase II y 2 sueros de pacientes que tienen cáncer colorrectal de fase III muestran un claro aumento de su dosis de PDI sérico.

3. Análisis sérico del marcador tumoral LEI

imagen18

5

15

25

35

45

55

65

1.

Se sensibilizaron los conos con el anticuerpo de captura 2A7F6 a una concentración de 20 g/ml.

2.

El contenido del segundo pocillo del cartucho HBs Ag Ultra se sustituyó por 300 l de anticuerpo de revelación 11H7D9, acoplado a la biotina, diluido a 1 g/ml en el tampón del segundo pocillo del kit Vidas® HBs Ag Ultra (tampón con suero de cabra y azida de sodio a 1 g/l).

3.

Las muestras de suero, de plasma o de heces (100 l) se diluyeron directamente en el segundo pocillo del cartucho HBS Ag Ultra.

4.

La reacción ELISA se realizó con la ayuda del autómata Vidas® y del protocolo HBS AG ULTRA cuya etapa de incubación de la muestra con los anticuerpos de captura y de revelación fue llevada a 100 ciclos.

5.

Los resultados se han obtenido en forma de valores brutos después de la sustracción del ruido de fondo (lectura del sustrato antes de la reacción).

La concentración del marcador tumoral presente en el fluido corporal a analizar (sangre, suero, plasma, heces) se ha calculado según el modo de realización descrito en el párrafo 2, que se refiere al análisis de LEI.

Las dosis obtenidas para los pacientes analizados se detallan en la figura 5. Se puede señalar en esta figura que 1 suero de pacientes que tienen cáncer colorrectal de fase II, 1 suero de pacientes que tienen cáncer colorrectal de fase III y 2 sueros de pacientes que tienen cáncer colorrectal de fase IV muestran un claro aumento de su dosis de Aminoacilasa 1 sérica.

6. Análisis sérico del marcador tumoral L-FABP

Se ha utilizado un kit ELISA comercializado por la compañía Hycult biotechnology para analizar la proteína L-FABP humana (Cat. nº HK404). Este kit permite cuantificar la proteína L-FABP en los sobrenadantes de cultivo celular, en el suero, el plasma o la orina, a fin de determinar la presencia de lesiones a nivel hepático. Se ha seguido el modo de realización recomendado por el fabricante con 2 modificaciones: las incubaciones se efectuaron a 37ºC y no a temperatura ambiente, los sueros se diluyeron al 1/10 antes del análisis. El análisis de la proteína L-FABP se puede efectuar mediante técnicas alternativas, bien conocidas por los expertos en la materia.

La figura 6 presenta los resultados de este análisis. En el grupo de suero que se ha ensayado, 41 pacientes de 141 que tienen cáncer colorrectal tiene una concentración sérica de L-FABP superior a 17 ng/ml, mientras que en el grupo control, ningún sujeto supera este valor. Entre estos 41 pacientes, se encuentran 8 pacientes que tienen cáncer colorrectal de fase I, 8 que tienen cáncer colorrectal de fase II, 13 que tienen cáncer colorrectal de fase III y 12 que tienen cáncer colorrectal de fase IV. La concentración media de L-FABP sérica observada para 141 pacientes con un cáncer colorrectal es de 16,6 ± 1,3 ng/ml. El valor medio es de 6,6 ± 0,2 ng/ml para 112 individuos sanos (control negativo). Esta diferencia es estadísticamente significativa (P<0,0001, t.ensayo unilateral con corrección de Welch para varianzas desiguales).

7. Análisis sérico del marcador tumoral I-FABP

Se utilizó un kit ELISA comercializado por la compañía Hycult biotechnology para analizar la proteína I-FABP humana (Cat. nº HK406). Este kit permite cuantificar la proteína I-FABP en los sobrenadantes de cultivo celular, en el suero, el plasma o la orina, a fin de determinar la presencia de lesiones isquémicas a nivel del intestino delgado. Se ha seguido el modo de realización recomendado por el fabricante. El análisis de la proteína I-FABP se puede efectuar mediante técnicas alternativas, bien conocidas por el experto en la materia.

La Figura 7 presenta los resultados de este análisis. En el grupo de suero ensayado, 15 pacientes de 40 que padecen un cáncer colorrectal tienen una concentración sérica de I-FABP superior a 40 pg/ml, mientras que en el grupo control únicamente 2 sujetos de 24 superan este valor. Más claramente, 3 sueros de pacientes que tienen cáncer colorrectal de fase I, 2 sueros de pacientes que tienen cáncer colorrectal de fase III y 1 suero de paciente que tiene cáncer colorrectal de fase IV tienen una concentración sérica de I-FABP superior a 100 pg/ml. No se ha encontrado ninguna concentración superior a este valor en el grupo control CCR.

8. Análisis sérico del marcador tumoral Apolipoproteína AI

El análisis de la Apolipoproteína AI sérica se ha realizado mediante dos técnicas diferentes de inmunoensayo. En primer lugar, se ha utilizado un ELISA sándwich en microplaca. Las placas de 96 pocillos se han recubierto con el anticuerpo monoclonal anti-Apo AI Clon 1404 (Biodesign Cat. nº H45404) a 1g por pocillo. Después de 3 lavados en PBS-Tween 20 0,05% (PBS-T), las placas se saturan con un 10% de leche en PBS-T durante 1h a 37ºC. Se lava de nuevo 3 veces en PBS-T, se deposita en placas de 100 l unas diluciones del intervalo estándar o 100 l de la dilución al 1/100 000 de las muestras de suero a ensayar, y se incuba durante 2h a 37 C. El intervalo estándar se realiza diluyendo la proteína Apo AI (Biodesign Cat. nº A50620H) en PBS-T, BSA 1% (1,6 a 100 ng/ml). Después de

3 lavados en PBS-T, el anticuerpo de detección policlonal se acopla con peroxidasa de rábano picante (Biodesign Cat. nº K45452P) se añade a 0,1 g por pocillo y se incuba durante 2h a 37ºC. Se efectúa de nuevo 3 lavados en PBS-T, antes de añadir el sustrato OPT EIA (BD), 100 l/pocillo. Al final de 20 min., cuando el desarrollo de la coloración tiene lugar, se para la reacción mediante ácido sulfúrico 2N y se mide la absorbancia a 450 nm.

5 La Figura 8A presenta los resultados de este análisis. Se ha puesto en evidencia una disminución de la concentración sérica de Apo AI en los sujetos que tienen cáncer colorrectal. La concentración media en 38 sujetos que tienen CCR de fase I a IV es de 675 ± 36 g/ml mientras que es mucho más elevada en 27 sujetos sanos (controles): 1040 ± 39 µg/ml. Esta diferencia es estadísticamente muy significativa (P<0,0001, t-ensayo unilateral). A

10 título de comparación, en 13 sujetos que tienen cáncer de hígado, la concentración sérica media de Apo AI es de 1175 ± 87 g/ml con la técnica ELISA sándwich utilizada. La disminución de la concentración sérica demuestra que Apo AI es por lo tanto un marcador específico del cáncer colorrectal, pudiendo esta disminución ser puesta en evidencia por un análisis por inmunoensayo.

15 La segunda técnica de análisis utilizada es un análisis multiplex comercializado por la compañía Linco que permite analizar varias Apolipoproteínas, incluyendo AI y AII, simultáneamente en la misma muestra (Cat. nº APO-62K). Se ha aplicado el modo de realización recomendado por el fabricante.

La Figura 8B presenta los resultados de este análisis. Se confirma mediante esta segunda técnica la disminución de

20 la concentración sérica de Apo AI en los pacientes que tienen CCR. La concentración media de Apo AII en 34 sujetos que padecen CCR de fase I a IV es de 768 ± 30 g/ml mientras que es mucho más elevada en 17 sujetos sanos (controles): 1194 ± 51 µg/ml. Esta diferencia es estadísticamente muy significativa (P<0,0001, t-ensayo unilateral).

25 9. Análisis sérico del marcador tumoral Apolipoproteína AII

El análisis de la Apolipoproteína AII sérico se ha realizado con el kit multiplex de Linco. La Figura 9 presenta los resultados de este análisis. Se ha demostrado una disminución de la concentración sérica de Apo AII en los sujetos que tienen cáncer colorrectal. La concentración media de Apo AII en 34 sujetos que padecen CCR de fase I a IV es

30 de 170 ± 11 g/ml mientras que es mucho más elevada en 17 sujetos sanos (controles): 277 ± 16 g/ml. Esta diferencia es estadísticamente muy significativa (P<0,0001, t-ensayo unilateral).

10. Análisis sérico del marcador tumoral Plastina-I

35 La proteína Plastina-I se ha analizado con la ayuda de los anticuerpos descritos en el ejemplo 2 y de un ensayo ELISA utilizando el autómata Vidas® (bioMérieux). Para hacer esto, se ha construido el ensayo ELISA utilizando los reactivos del kit Vidas® HBs Ag Ultra (bioMérieux, Cat. nº 30315). Los reactivos se han utilizado tal como se describen en las instrucciones correspondientes (ref. 11728 D -FR -2005/05), con las siguientes modificaciones:

40 1. Los conos se han sensibilizado con el anticuerpo de captura 3D11D10 a una concentración de 15 µg/ml.

2. El contenido del segundo pocillo del cartucho HBs Ag Ultra se ha sustituido con 300 µl de anticuerpo de revelación 8C8C5, acoplado a la biotina, diluido a 1 µg/ml en el tampón del segundo pocillo del kit Vidas® HBs Ag Ultra (tampón con suero de cabra y azida de sodio a 1 g/l).

45

3. Las muestras de suero, de plasma o de heces (100 l) se diluyeron directamente en el segundo pocillo del cartucho HBs Ag Ultra.

4. La reacción ELISA se ha realizado con la ayuda del autómata Vidas® y del protocolo HBS AG ULTRA. 50

5. Los resultados se han obtenido en forma de valores brutos después de la sustracción del ruido de fondo (lectura del sustrato antes de la reacción).

La concentración del marcador tumoral presente en el fluido corporal a analizar (sangre, suero, plasma, heces) se ha 55 calculado según el modo de realización descrito en el párrafo 2, que se refiere al análisis de LEI.

Las dosis obtenidas para los pacientes analizados se detallan en la figura 10. Los 2 sueros de pacientes que tienen cáncer colorrectal ensayados muestran un claro aumento de su dosis de Plastina-I sérica.

60 11. Análisis sérico de los marcadores tumorales del Grupo B

Los marcadores tumorales Beta2 Microglobulina, ACE, CA19-9 y Testosterona se han analizado con la ayuda de los equipamientos de análisis de la solicitante, respectivamente Vidas® β2 Microglobulina, Vidas® ACE, Vidas® CA199™ y Vidas® Testosterona, siguiendo el protocolo de realización propio a cada equipamiento.

65

La proteína E-Cadherina se ha analizado con la ayuda del kit E-Cadherina EIA kit (Takara Biochemicals, Tokyo, Japon) siguiendo el protocolo de realización del kit.

La proteína 3 alfa derivada del islote regenerador, denominada de otra forma Proteína Asociada a la Pancreatitis 5 (PAP1), se ha analizado con la ayuda del kit ELISA PANCREPAP (DynaBio, Marsella, Francia) siguiendo el protocolo de realización del kit.

Las proteínas Galectina-3 y LDH se han analizado con la ayuda de los anticuerpos descritos en el ejemplo 2. El Proteasoma 20 S se ha analizado con la ayuda de los anticuerpos descritos en la patente EP0434670. Para hacer

10 esto, los ensayos ELISA se han construido utilizando el autómata Vidas® (bioMérieux) y los reactivos del kit Vidas® HBs Ag Ultra (bioMérieux, Cat. nº 30315). Los reactivos se han utilizado tal como se describen en las instrucciones correspondientes (ref. 11728 D -FR -2005/05), con las siguientes modificaciones:

1.

Los conos se han sensibilizados con el anticuerpo de captura a una concentración de entre 5 y 30 g/ml. 15

2. El contenido del segundo pocillo del cartucho HBs Ag Ultra se ha sustituido por 300 µl de anticuerpos de revelación, acoplado a la biotina, diluido a 1 µg/ml en un tampón con suero de cabra y azida de sodio a 1 g/l.

3.

Las muestras de suero, de plasma o de heces se diluyeron directamente en el segundo pocillo del cartucho HBs 20 Ag Ultra después, si es necesario, una dilución en tampón del segundo pocillo.

4. La reacción ELISA se ha realizado con la ayuda del autómata Vidas® y del protocolo HBS Ag Ultra. La etapa de incubación de la muestra con los anticuerpos de captura y de revelación estaba comprendida entre 14 y 100 ciclos.

25 5. Los resultados se han obtenido en forma de valores brutos después de la sustracción del ruido de fondo (lectura del sustrato antes de la reacción).

La concentración del marcador tumoral presente en el fluido corporal a analizar (sangre, suero, plasma, heces) se ha calculado según el modo de realización descrito en el párrafo 2, que se refiere al análisis de LEI. Las condiciones de

30 análisis para diferentes marcadores tumorales se han recogido en la Tabla 9.

Tabla 9

Proteína

Galectina-3 LDH-B Proteasoma 20 S

Anticuerpo de captura

12F8A12 a 15 µg/ml 3F11E11 a 10 µg/ml GD6 a 30 µg/ml

Anticuerpo de revelación

14A5G1 12F10G8 7A11

Suero de cabra en el tampón de dilución

Con Con Sin

Volumen de heces

50 µl 50 µl 200 µl

Volumen de suero

50 µl 50 µl 100 µl

Depósito de muestra

2º pocillo 2º pocillo 1º pocillo

Duración de la incubación

100 ciclos 14 ciclos 14 ciclos

Las dosis obtenidas para los pacientes analizados con los marcadores tumorales Beta2 Microglobulina, ACE, CA1935 9, Testosterona, E-Cadherina, proteína 3 alfa derivada del islote regenerador, Galectina-3, LDH y Proteasoma 20S se han detallado respectivamente en las figuras 11 a 19.

Tres sueros de pacientes que tienen cáncer colorrectal muestran un aumento de su dosis de β2-Microglobulina sérica.

40 Diez sueros de pacientes que tienen cáncer colorrectal muestran un aumento de su dosis de ACE sérica. Más claramente, 1 suero de paciente que tiene cáncer colorrectal de fase III y 7 sueros de pacientes que tienen cáncer colorrectal de fase IV muestran una elevación importante de su dosis de ACE sérica.

45 Nueve sueros de pacientes que tienen cáncer colorrectal muestran un aumento de su dosis de CA 19-9 sérica. Más claramente, 1 suero de paciente que tiene cáncer colorrectal de fase III y 7 sueros de pacientes que tienen cáncer colorrectal de fase IV muestran una elevación importante de su dosis de CA 19-9 sérica.

Diez sueros de pacientes que tienen cáncer colorrectal muestran una disminución de su dosis de Testosterona

50 sérica. Más claramente, 1 suero de paciente que tiene cáncer colorrectal de fase II, 1 suero de paciente que tiene cáncer colorrectal de fase III y 2 sueros de pacientes que tienen cáncer colorrectal de fase IV muestran una caída de su dosis de Testosterona sérica.

Dos sueros de pacientes que tienen cáncer colorrectal muestran un aumento de su dosis de proteína 3 alfa derivada 55 del islote regenerador sérico.

imagen19

La asociación de los marcadores tumorales PDI, CA 19-9, ACY, L-FABP, Ezrine, LEI, Proteasoma 20S, Villina, Gal-3 permite así obtener para el mismo grupo de 30 pacientes unos resultados totales "9f" aumentados en 28 pacientes que padecen cáncer colorrectal, mientras que el análisis sólo de la PDI, de CA19-9, de ACY, de L-FABP, de ezrina, de LEI, de Proteasoma 20S, de Villina o de Gal-3 era incrementado respectivamente en 3, 12, 4, 18, 4, 7, 12, 4 y 12

5 pacientes sólo.

La asociación de los marcadores tumorales PDI, ACE, CA 19-9, ACY, L-FABP, Ezrina, LEI, Proteasoma 20S y Villina permite así obtener para el mismo grupo de 30 pacientes unos resultados totales "9g" aumentados en 30 pacientes que padecen cáncer colorrectal, mientras que el análisis sólo de la PDI, de ACE, de CA19-9, de ACY, de L-FABP, de

10 ezrina, de LEI, de Proteasoma 20S y de Villina era incrementado respectivamente en 3, 19, 12, 4, 18, 4, 7, 12 y 4 pacientes sólo.

33

Tabla 10

Patología

Identificador de lamuestra Fase PDI ng/ml Resultado total3 a Resultado total4 b Resultado total4 c Resultadototal 4 Resultadototal 5e Resultado total 9f Resultado total 9g

Sujeto sano

N491044 10,28 0,24 0,27 0,23 0,34 0,37 0,27 0,25

Sujeto sano

N491124 1,35 0,31 0,38 0,23 0,23 0,25 0,29 0,32

Sujeto sano

N491239 0,00 0,09 0,21 0,20 0,33 0,32 0,25 0,28

Sujeto sano

N491677 56,88 0,33 0,34 0,46 0,57 0,46 0,41 0,45

Sujeto sano

N491685 9,18 0,35 0,37 0,20 0,32 0,44 0,29 0,24

Sujeto sano

N511447 4,24 0,36 0,34 0,25 0,38 0,51 0,36 0,28

Sujeto sano

N511463 7,52 0,25 0,22 0,27 0,35 0,40 0,30 0,25

Sujeto sano

N511471 8,28 0,16 0,22 0,31 0,45 0,43 0,32 0,33

Sujeto sano

N511498 11,33 0,13 0,22 0,14 0,20 0,19 0,13 0,17

Sujeto sano

N518059 4,15 0,32 0,31 0,28 0,33 0,44 0,33 0,27

Sujeto sano

N518067 12,71 0,18 0,37 0,33 0,43 0,41 0,31 0,38

Sujeto sano

N518518 1,26 0,04 0,28 0,31 0,28 0,24 0,24 0,34

Sujeto sano

N518542 0,00 0,09 0,16 0,15 0,16 0,18 0,15 0,16

Sujeto sano

N519043 10,71 0,16 0,21 0,33 0,39 0,37 0,29 0,30

Sujeto sano

N519078 14,48 0,27 0,21 0,34 0,41 0,44 0,33 0,27

Sujeto sano

N557680 3,86 0,27 0,34 0,35 0,29 0,38 0,32 0,30

Sujeto sano

N557699 4,18 0,19 0,35 0,48 0,36 0,39 0,37 0,40

Sujeto sano

N557701 15,06 0,33 0,35 0,41 0,42 0,48 0,37 0,33

Sujeto sano

N55771 4,63 0,16 0,27 0,55 0,29 0,32 0,35 0,37

Sujeto sano

N557760 5,84 0,32 0,34 0,17 0,39 0,48 0,31 0,26

Sujeto sano

N748268 55,67 0,35 0,38 0,44 0,55 0,46 0,29 0,34

Sujeto sano

N835886 0,00 0,50 0,33 0,43 0,34 0,34 0,42 0,36

Sujeto sano

N835966 0,00 0,00 0,00 0,00 0,08 0,08 0,12 0,12

Sujeto sano

N836141 3,78 0,10 0,10 0,37 0,32 0,30 0,28 0,27

Sujeto sano

N83615 4,45 0,13 0,18 0,29 0,46 0,43 0,33 0,33

Sujeto sano

N836205 1,69 0,01 0,02 0,39 0,36 0,28 0,29 0,29

Sujeto sano

N836213 3,07 0,16 0,16 0,31 0,55 0,52 0,39 0,38

Sujeto sano

N857552 1,96 0,12 0,29 0,12 0,38 0,37 0,24 0,29

Sujeto sano

N858037 10,81 0,38 0,36 0,32 0,31 0,44 0,33 0,26

Sujeto sano

N858045 5,26 0,22 0,19 0,36 0,30 0,35 0,31 0,25

CCR +

CLSP104 0 5,61 0,28 0,35 4,44 7,73 6,33 4,99 4,97

CCR +

CBSE001 I 13,33 0,23 0,23 0,23 10,02 10,02 10,02 10,02

CCR +

GHBD011 I 0,00 0,00 0,00 0,00 5,86 5,86 5,86 5,86

CCR +

CBSE004 II 189,12 16,62 15,18 31,78 20,00 20,00 17,76 17,16

CCR +

CLSP086 II 8,57 0,19 146,97 0,19 0,21 0,25 0,19 65,40

CCR +

CLSP088 II 23,84 0,14 12,08 4,91 3,01 2,41 2,93 8,25

CCR +

CLSP105 II 4,32 4,77 24,08 0,46 0,31 3,10 1,86 9,39

CCR +

CLSP115 II 0,36 4,51 3,62 0,19 8,77 9,72 5,47 4,06

CCR +

CBSE005 III 107,57 14,32 10,76 16,09 38,45 32,85 48,48 47,33

Patología

Identificador de lamuestra Fase PDI ng/ml Resultado total3 a Resultado total4 b Resultado total4 c Resultadototal 4 Resultadototal 5e Resultado total 9f Resultado total 9g

CCR +

CBSE006 III 69,45 6,11 4,18 15,28 12,86 12,86 41,35 36,79

CCR +

CBSE007 III 50,12 0,44 0,43 4,06 10,83 10,83 30,57 27,22

CCR +

CBSE010 III 34,08 0,30 7,40 30,38 4,18 4,18 13,50 14,40

CCR +

CLSP072 III 2,96 0,48 5,21 5,60 2,79 2,38 3,25 5,33

CCR +

CLSP089 III 12,30 3,72 25,01 0,48 2,67 4,21 2,53 11,26

CCR +

CLSP123 III 0,00 5,16 4,00 0,30 10,32 11,36 6,41 4,74

CCR +

CLSP138 III 37,34 0,44 8,48 0,33 3,07 2,59 1,48 5,02

CCR +

CLSP153 III 1,11 0,29 17,57 7,28 10,72 8,57 6,94 14,65

CCR +

GHBD019 III 3,52 0,33 6,21 0,24 0,38 0,39 0,31 2,91

CCR +

GHBD059 III 8,03 0,14 0,14 0,14 7,71 7,71 7,71 7,71

CCR +

CBSE012 IV 0,88 0,01 6,61 7,39 0,24 0,24 2,89 4,77

CCR +

CBSE021 IV 1,26 4,46 216,65 2,82 6,85 5,62 5,73 100,46

CCR +

CBSE026 IV 9,66 12,12 179,93 59,66 8,00 6,57 32,03 107,87

CCR +

CBSE027 IV 5,10 4,93 156,29 15,95 14,27 14,36 12,95 87,41

CCR +

CLSP042 IV 12,14 6,23 138,69 10,63 4,11 6,99 11,57 69,08

CCR +

CLSP057 IV 5,52 4,17 16,45 0,34 5,72 7,05 4,02 8,56

CCR +

CLSP068 IV 25,28 93,80 364,47 60,07 31,52 28,69 70,80 199,59

CCR +

CLSP079 IV 2,35 0,27 0,27 15,76 0,32 0,41 5,48 6,07

CCR +

CLSP109 IV 0,00 3,73 3,73 5,86 17,13 15,94 10,81 10,76

CCR+

CLSP132 IV 0,00 5,06 6,34 0,30 7,59 9,11 5,16 4,60

CCR+

CLSP156 IV 0,00 9,50 46,83 11,13 5,46 9,90 10,50 25,07

Umbral Determinado (%) Sensibilidad (%)

56,88 0,50 0,38 0,55 0,57 0,52 0,42 0,45

100,00

100,00

100,00

100,00

100,00

100,00

100,00

100,00

10,00

53,33 83,33 60,00 86,67 86,67 93,33 100,00

a: Asociación PDI, Ezrina, Gal-3b: Asociación PDI, ACE, Ezrina, Gal-3c: Asociación PDI, CA 19-9, E-caderina, LEId: Asociación PDI, L-FABP, Proteasoma 20S, Villinae: Asociación PDI, L-FABP, Proteasoma 20S, Villina, Gal-3f: Asociación PDI, CA 19-9, ACY, L-FABP, Ezrina, LEI, Proteasoma 20S, Villina, Gal-3f: Asociación PDI, ACE, CA 19-9, ACY, L-FABP, Ezrina, LEI, Proteasoma 20S, Villina

34

imagen20

tumorales circulantes en los pacientes utilizando esta técnica, según el procedimiento de la solicitud de patente WO03/076942 depositada por la solicitante.

Ejemplo 7: Detección de los marcadores tumorales a partir de tejidos cólicos por inmunohistoquímica 5

1. Metodología

En primer lugar, se desparafinan de las láminas de microarray de tejido. Para ello, se incuban sucesivamente en los baños siguientes durante 10 minutos: meticiclohexano (2 veces), etanol al 100%, etanol al 95%, etanol al 70% y

10 agua. Las láminas son después aclaradas con TBS 0,1% Tween 20 (TBS-T), durante 10 min, bajo agitación. Los antígenos se reactivan en el tampón citrato 10 mM pH6, calentando hasta 90ºC durante 40 min, después dejando enfriarse hasta temperatura ambiente durante 30 min. Las peroxidasas endógenas se inhiben por incubación en TBS-T que contiene un 3% de H2O2, durante 5 min. Las láminas se saturan después mediante un 3% de BSA en TBS-T, durante 1h a 37ºC, en cámara húmeda.

15 Después, se incuban las láminas durante 2h con el anticuerpo primario anti-Inhibidor de la elastasa de leucocitos (clon 3D9C2), o anti-Plastina-I (clon 8D6A3) diluido a 10g/ml en TBS-T que contiene un 3% de BSA (incubación a 37ºC en cámara húmeda). Después de 3 lavados de 10 minutos en TBS-T, las láminas se incuban durante 2h a 37 C en cámara húmeda con el anticuerpo secundario anti-ratón acoplado a la peroxidasa de rábano picante (Cat. nº 115

20 035-003 Jackson Immunoresearch) diluido al 1/400 en la solución de saturación. Las láminas se lavan 3 veces durante 10 minutos en TBS-T, después de nuevo 3 veces durante 10 minutos en PBS. La revelación se realiza con el sustrato Sigma Fast (Cat. nº D-4168, Sigma-Aldrich) durante 5 min. La coloración se detiene por lavado en PBS. Se efectúa una contra-coloración con hematoxilina de Harris (Cat. nº MHS16, Sigma-Aldrich) durante 30 s. Después del lavado con agua y PBS, se montan las láminas para la observación en microscopio.

25 Los anticuerpos utilizados para el marcado por inmunohistoquímica se han seleccionado específicamente para esta aplicación, independientemente de su actividad en ELISA o en transferencia Western.

2. Detección del Inhibidor de la Elastasa de los leucocitos por inmunohistoquímica

30 Se han utilizado unas láminas de microarray de tejido para cribar un gran número de muestras. Se trata de tejidos cólicos punteados sobre láminas. Las características de los pacientes (características de los puntos de tejido cólico presentes en el microarray de tejido de cancer colorrectal), así como los resultados de los inmunomarcados por el anticuerpo anti-Inhibidor de la Elastasa de los leucocitos se recogen en la Tabla 12.

35 Tabla 12

Diagnóstico

Histología y caracterización genética Marcado en las células epiteliales Marcado en el estroma

Tumor maligno

Adenocarnicoma conservado Positivo Negativo

Tumor maligno

Adenocarnicoma conservado Positivo Negativo

Normal

Mucosa normal Negativo Negativo

Normal

Mucosa normal Negativo Negativo

Normal

Mucosa normal Negativo Negativo

Normal

Mucosa normal Negativo Negativo

Tumor benigno

Adenoma Negativo Negativo

Tumor maligno

Adenocarnicoma conservado Positivo Negativo

Tumor maligno

Adenocarnicoma LOH Positivo Negativo

Tumor maligno

Adenocarnicoma LOH Positivo Negativo

Normal

Mucosa normal Negativo Negativo

Normal

Mucosa normal Negativo Negativo

Normal

Mucosa normal Negativo Negativo

Normal

Mucosa normal Negativo Negativo

Tumor maligno

Adenocarnicoma LOH Negativo Negativo

Tumor maligno

Adenocarnicoma LOH Positivo Negativo

Tumor maligno

Adenocarnicoma MSI alta Positivo Negativo

Tumor maligno

Adenocarnicoma MSI alta Positivo Negativo

Tumor maligno

Adenocarnicoma Coloide Negativo Negativo

Tumor maligno

Adenocarnicoma Coloide Negativo Negativo

Normal

Mucosa normal Negativo Negativo

Normal

Mucosa normal Negativo Negativo

Los resultados en la tabla ponen en evidencia que, en las biopsias de mucosas cólicas sanas, no hay marcado (10 negativos). El marcado es asimismo negativo en el adenoma (1/1). El marcado es positivo en las células epiteliales 40 de las adenocarnicomas cólicas (+ en 8/11 pacientes). No hay marcado en el estroma.

3. Detección de la Plastina-I por inmunohistoquímica

Se han utilizado unas láminas de microarray de tejido para cribar un gran número de muestras. Se trata de tejidos cólicos y rectales punteados sobre las láminas. Las características de los pacientes (características de los puntos del tejido cólico presentes en el microarray de tejido de cáncer colorrectal), así como los resultados de los inmunomarcados por el anticuerpo anti-Plastina-I se recogen en la Tabla 13.

Tabla 13

Diagnóstico

Histología y caracterización genética Marcado en las células epiteliales Marcado en el estroma

Tumor maligno de colon

Adenocarnicoma conservado ++ Negativo

Tumor maligno de colon

Adenocarnicoma conservado ++ Negativo

Colon normal

Mucosa normal + Negativo

Colon normal

Mucosa normal + Negativo

Colon normal

Mucosa normal + Negativo

Tumor benigno de colon

Adenoma + Negativo

Tumor maligno de colon

Adenocarnicoma conservado + Negativo

Tumor maligno de colon

Adenocarnicoma LOH ++ Negativo

Tumor maligno de colon

Adenocarnicoma LOH ++ Negativo

Colon normal

Mucosa normal + Negativo

Colon normal

Mucosa normal + Negativo

Colon normal

Mucosa normal + Negativo

Tumor maligno de colon

Adenocarnicoma LOH ++ Negativo

Tumor maligno de colon

Adenocarnicoma LOH ++ Negativo

Tumor maligno de colon

Adenocarnicoma MSI alto + Negativo

Colon normal

Mucosa normal + Despegado

Colon normal

Mucosa normal + Despegado

Tumor maligno de colon

Adenocarnicoma coloide + Negativo

Colon normal

Mucosa normal ++ Negativo

Colon normal

Mucosa normal ++ Negativo

Recto normal

Mucosa recto normal ++ Negativo

Recto normal

Mucosa recto normal No específico Negativo

Recto normal

Mucosa recto normal No específico Negativo

Recto normal

Mucosa recto normal No específico Negativo

Tumor maligno del recto

Adenocarnicoma LOH + Negativo

Tumor maligno del recto

Adenocarnicoma LOH ++ Negativo

Tumor maligno del recto

Adenocarnicoma LOH ++ Negativo

Tumor maligno del recto

Adenocarnicoma LOH ++ Negativo

Tumor benigno del recto

Adenoma displasia de bajo grado ++ Negativo

Tumor benigno del recto

Adenoma displasia de bajo grado ++ Negativo

Tumor benigno del recto

Adenoma displasia de bajo grado + Negativo

Tumor benigno del recto

Adenoma displasia de bajo grado + Negativo

Tumor benigno del recto

Adenoma displasia de bajo grado + Negativo

Tumor benigno del recto

Adenoma displasia de bajo grado + Negativo

Tumor benigno del recto

Adenoma displasia de bajo grado ++ Negativo

Tumor benigno del recto

Adenoma displasia de bajo grado ++ Negativo

Tumor benigno del recto

Adenoma displasia de bajo grado ++ Negativo

10 Los resultados en la tabla muestran que:

-en las biopsias de mucosas colónicas sanas, el marcado es bajo en 8 extracciones (+) y 2 extracciones son a ++. El marcado es también bajo a + en el adenoma colónico (1/1). El marcado es positivo fuerte ++ en las células

15 epiteliales de los adenocarnicomas colónicos (++ en 6/9 pacientes y 3 bajos +, incluyendo los adenocarnicomas coloides colónicos). No hay ningún marcado en el estroma.

5

15

25

35

45

55

65

-en las biopsias de mucosas rectales sanas, el marcado está presente a nivel del epitelio de superficie de manera no específica (3/4) y a ++ en una extracción. El marcado es positivo fuerte a ++ en los adenomas rectales (5/9) o discreto a + (4/9). El marcado es asimismo fuerte ++ en las células epiteliales de los adenocarnicomas rectales (++ en 3/4 pacientes, 1 bajo +). No hay ningún marcado en el estroma.

Referencias bibliográficas

1: J.D. Potter, 1999, J Natl Cancer Inst, 91, 916-32

2: J. Faivre, 2001, Epidémiologie y dépistage du cancer colorectal, Ed. Springer

3: B.K. Shin et al., 2003, J Biol Chem, 7607-7616

4: T. Tomonaga et al., 2004, Clin Canc Res, 2007-2014

5: R. Stierum et al., 2003, Biochimica y Biophysica Acta, 73-91

6: E. Remold-O'Donnell et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA, 89, 563-5639

7: J. Cooley et al., 2001, Biochemistry, 15762-15770

8: M. Algrain et al., 1993, J Cell Biol, 120, 129-139

9: W.G. Jiang y S. Hiscox, 1996, Anticancer Res, 16, 861-865

10: S. Hiscox y W.G. Jiang, 1999, J Cell Sci, 112, 3081-3090

11: T. Xiao et al, 2005, Mol Cell Proteomics, 4, 1480-1486

12: M. Anders y W. Dekant, 1994, Advances in Pharmacology, 431-448

13: K. Lorentz et al., 1975, Clinica Chimica Acta, 263-269

14: K. Lorentz y B. Flatter, 1975, Clinica Chimica Acta, 271-274

15: R.M. Cook et al., 1993, J Biol Chem, 17010-17017

16: Y.E. Miller et al., 1989, J Clin Invest, 2120-2124

17: S. Balabanov et al., 2001, Eur J Biochem, 5977-5980

18: E. Chan et al., 1985, J Biol Chem, 260, 2629-2632

19: R. Das et al., 2001, Clin Cancer Res, 7, 1706-1715

20: J. Stulik et al., 2001, Electrophoresis, 22, 3019-3025

21: T. Yamazaki et al., 1999, J Surg Oncol, 72, 83-87

22: D.A. Sweetser et al., 1987, J Biol Chem, 266, 16060-16071

23: M. Pelsers et al., 2003, Clin Biochem, 36, 529-535

24: R. Xiao, et al., 2005, Molecular Cancer, 4, 1-17

25: E.E. Niederkofler et al., 2003, J Lipid Res, 44, 630-639

26: G.L. Hortin, 2006, Clinical Chemistry, 52(7), 1223-1237

27: J.Y. Engwegen et al., 2006, World J Gastroenterol, 12(10), 1536-1544

28: Z. Zhang et al., 2004, Cancer Research, 64, 5882-5890

29: H. Hachem et al., 1986, J Chem Clin Biochem, 24, 161-166

30: C.S. Lin, et al., 1993, J Biol Chem, 268, 2781-92 38

5

15

25

35

45

55

65

31: V. Delanote et al., 2005, Acta Pharama Sinica, 769-779

32: A.P. Arrigo et al., 1988, Nature, 331, 192-194

33: T. Lavabre-Bertrand et al., 2001, Cancer, 92, 2493-2500

34: S. Nakahara et al., 2005, Apoptosis, 10, 267-275

35: I. Iurisci et al., 2000, Clin Can Res, 6, 1389-1393

36: M.K. Schwartz, 2006, Clin Chim Acta, 1992, 77-82

37: D.J. McCool et al., 1999, Biochem J, 593-600

38: J.L. Iovanna et al., 1994, Gastroenterology, 106, 728-734

39: Y. Motoo et al., 1999, Dig Dis Sci, 44, 1142-1147

40: M. Herlyn et al., 1979, Proc Natl Acad Sci USA, 76, 1438-1442

41: A. Armstrong y S. Eck, 2003, Cancer Biol Ther, 2, 320-325

42: D. Herlyn et al., 1982, Proc Natl Acad Sci USA, 79, 4761-4765

43: H Abe et al., 2002, J Immunol Methods, 270, 227-233

44: V. Barak et al., 2004, Clin Biochem, 37, 529-540

45: H. Kim et al., 2006, Ann Clin Lab Sci, 36, 294-298

46: F. Roca et al., 2006, J Surg Oncol, 151-160

47: C.H. Damsky et al., 1983, Cell, 455-466

48: M. Katayama et al., 1994, Br J Cancer, 580-585

49: C. Willmanns et al., 2004, Clin Exp Metastasis, 75-78

50: P. Gold y S. Freedman, 1965, J Exp Med, 467-481

51: M. Duffy, 2001, Clin Chem, 624-630

52: Y. Kim et al., 2003, Ann Clin Lab Sci, 32-38

53: J.L. Magnani et al., 1983, Cancer Research, 43, 5489-5492

54: J. Holmgren et al., 1984, Br Med J (Clin. Re. Ed.), 288, 1479-1482

55: T.L. Klug et al., 1986, Int J Cancer, 38, 6661-669

56: P. Kuusela et al., 1991, Br J Cancer, 63, 636-640

57: M. Holland et al., 1993, Medicina (B. Aires), 53(2), 117-23

58: F. Model et al., juillet 2006, World Congress on Gastrointestinal Cancer, "Détection of Methylated DNA in Plasma from Colorectal Cancer Patients and Controls by Real-Time PCR Analysis of Septin 9"

59: M.P. Ebert et al., 2006, Gastroentrology, 131(5), 1418-1430

60: C. Bianco et al., 2006, Clin Cancer Res, 12, 5158-5164

61: R. Yasumatsu et al., 2006, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 291, L619-L627

62: J. Chevalier et al., 1997, J Histochem Cytochem, 45, 481-491

Claims (1)

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