JP2011512842A - ゲル状マイクロドロップ組成物およびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本特許出願は、2008年3月4日に提出された米国仮出願第61/033,461号の利益を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に援用される。
「判断する」、「測定する」、「評価する」、「査定する」、および「検定する」という用語は、本明細書において、測定の任意の形態を指すように同義的に使用され、要素が存在するか否かの判断を含む。これらの用語は、定量および/または定性測定法の双方を含む。査定とは、相対的または絶対的であってもよい。「〜の存在を判断する」とは、存在する何かの量を判断する、ならびにそれが存在するか不在かを判断することを含む。
「蛍光タンパク質」という用語は、発現が、タンパク質によって生成される蛍光信号の存在により検出され得るタンパク質を意味する。蛍光信号は、例えば、タンパク質が、特定の光波長によって励起されることが可能であり、検出可能な別の光波長を発生させる時、タンパク質によって生成される。
「核酸」という用語は、DNA、RNA、単一鎖または二重鎖およびそれらの化学的修飾を包含する。「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において、同義的に使用される。
本明細書で使用する際、「画像化」という用語は、ゲル状マイクロドロップから発生する光学的に検出可能な信号の存在を検出する方法を指す。画像化は、ゲル状マイクロドロップの2Dならびに3D画像を提供するために使用されてもよい。
プロモータに関して、「誘発される」という用語は、下流核酸配列の転写開始、ならびに非誘発状態と比較して、既に転写された下流核酸配列の転写速度の増加の双方を包含するように意図される。
「組換え」という用語は、宿主細胞で自然に発生しないポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。組換え分子は、自然に発生しない方法で一緒に連結される2つ以上の自然に発生する配列を含んでもよい。組換え細胞は、組換えポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む。
「選択マーカ」という用語は、導入された核酸またはベクターを含むこれらの宿主の選択を容易にさせる宿主で発現できるタンパク質を指す。選択マーカの例は、抗菌物質(例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、またはクロラムフェニコール)に抵抗性を与えるタンパク質、宿主細胞への栄養効果等、代謝効果を与えるタンパク質、ならびに細胞に機能性または表現型効果(例えば、細胞分裂)を与えるタンパク質を含むが、これに限定されない。
核酸配列を細胞内に挿入するという状況における「導入される」という用語は、「形質移入」、または「形質転換」、または「形質導入」を指し、核酸配列の真核細胞または原核細胞への組み込みへの言及を含み、該核酸配列は、細胞のゲノム(例えば、染色体、プラスミド、色素体、またはミトコンドリアDNA)へ組み込まれてもよい、自主的なレプリコンへ変換されてもよい、または過渡的に発現(例えば、形質転換されたmRNA)されてもよい。
「コード配列」という用語は、一度転写されたおよび翻訳された核酸配列が、適切な調節要素の制御下に設置される時、例えば、生体内でタンパク質を生成することを指す。本明細書で使用する際、コード配列は、連続性ORFを有してもよい、またはイントロンもしくは非コード配列の存在によって中断されるORFを有する場合がある。本実施形態において、非コード配列は、成熟mRNAを生成するように、前駆体RNAからスプライスされる。
認識される免疫グロブリンポリペプチドは、カッパおよびラムダ軽鎖ならびにアルファ、ガンマ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、デルタ、イプシロン、およびミュー重鎖または他種の同等物を含む。(約25kDaまたは約214アミノ酸の)完全長免疫グロブリン「軽鎖」は、NH2末端の約110アミノ酸の可変領域、およびCOOH末端のカッパまたはラムダ定常領域を含む。(約50kDaまたは約446アミノ酸の)完全長免疫グロブリン「重鎖」は、同様に、(約116アミノ酸の)可変領域および前述の重鎖定常領域の1つ、例えば、(約330アミノ酸の)ガンマを含む。
本発明の方法によって設計および生成されるヒト化抗体は、抗原結合または他の抗体機能に実質的に影響がない、さらなる保存アミノ酸置換を有することを理解されたい。保存置換により、以下の群からのもの等の組み合わせは意図される:gly、ala;val、ile、leu;asp、glu;asn、gln;ser、thr;lys、arg;およびphe、tyr。同一群に存在しないアミノ酸は、「実質的に異なる」アミノ酸である。
特定の実施形態において、捕捉物質/分析物複合体で特異的に結合する時、捕捉物質と分析物との間の親和性は、10−6M未満、10−7M未満、10−8M未満、10−9M未満、10−9M未満、10−11M未満、または約10−12M未満もしくは以下のKD(解離定数)により特徴付けされる。
本発明がさらに説明される前に、本発明は、説明される特定の実施形態に制限されず、したがって、当然ながら、変形されてもよいことを理解されたい。また、本発明の目的は、添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるため、本明細書で使用する用語は、単に、特定の実施形態を説明するための目的であり、制限することを意図しないことも理解されたい。
値の範囲が提供される場合、特に文脈で明確に記載されない限り、下限の10分の1単位に至るその値の上限と下限との間の各中間値、および任意の他の状態値またはその状態値における中間値は、本発明内に包含されることを理解されたい。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される際、単数形「a」、「and」および「the」は、特に文脈で明確に記載されない限り、複数の対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「a cell」は複数の細胞を含み、「a candidate agent」の対象は、1つ以上の候補物質および当該技術分野の当事者に既知のその等価物の対象等を含む。特許請求の範囲は、あらゆる任意の要素を排除するように作成され得ることをさらに留意されたい。このように、本記述は、特許請求の範囲の要素に関連する「solely」、「only」等のような非包括的用語の使用、または「否定的」制限の使用の先行詞としての役割を果たすように意図される。
本明細書で引用される全ての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が、参照により援用されるために具体的かつ個別に示されるように、参照により本明細書に援用され、引用される刊行物に関連する方法および/または材料を開示し、説明するために、参照により本明細書に援用される。任意の刊行物の引用は、出願日前の開示においてであり、本発明が従来の発明のこのような刊行物に先行する権利が与えられない是認として解釈されるものではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行日と異なる場合があり、これは、個別に確認される必要がある場合がある。
上述のように、ゲル状マイクロドロップ組成物を提供する。特定の実施形態において、ゲル状マイクロドロップ組成物は、高分子マトリックスと、高分子マトリックス中にエフェクタ分子を放出するエフェクタ粒子と、第1の光学的に検出可能な信号を発生させる第1のリポータ粒子と、第1の光学的に検出可能な信号から識別可能な第2の光学的に検出可能な信号を発生する第2のリポータ粒子とを含み、該エフェクタ粒子ならびに第1および第2リポータ粒子は、高分子マトリックスによって包含される。ゲル状マイクロドロップ組成物を利用するスクリーニングの方法、およびゲル状マイクロドロップ組成物を作製する方法も開示する。
エフェクタ分子は、例えば、ポリヌクレオチド(例えば、siRNAまたはアンチセンスRNA等のオリゴヌクレオチド)、ポリペプチド(例えば、ポリペプチドの細胞内への取り込みを促進する配列に連結されてもよい、もしくはされなくてもよいペプチド)、小分子(大きさが最大2500ダルトン)、または抗体等の、任意の種類の分子であってもよい。
特定の実施形態において、対象とするマイクロドロップは、マイクロドロップのライブラリのメンバであってもよく、該ライブラリの各マイクロドロップは、異なるエフェクタ粒子(すなわち、異なるエフェクタ粒子が異なるエフェクタ分子を生成するように)と、同じ第1および第2のリポータ粒子とを含む。このようなマイクロドロップのライブラリは、各メンバのマイクロドロップが異なるエフェクタ粒子を含み、異なるエフェクタ粒子が異なるエフェクタ分子を生成する、少なくとも10、少なくとも100、少なくとも1,000、少なくとも10,000、または少なくとも100,000から最大100万以上のメンバを含んでもよい。特定の実施形態において、マイクロドロップライブラリのメンバは、単一容器中にマイクロドロップの混合物として含まれてもよい。他の実施形態において、マイクロドロップライブラリは、マイクロタイタープレートのウェル等、複数の異なる容器に存在してもよく、各容器は、少なくとも、1から最大10,000(例えば、5〜100、または10〜50)のマイクロドロップを含む。これらの実施形態において、単一容器中のマイクロドロップは、約1,000〜100,000マイクロドロップ/mlの密度で存在してもよく、マイクロドロップの沈殿を防止する培地中で懸濁されてもよい。代替的に、マイクロドロップは、遠心分離もしくは単一層のウェルの底に沈殿され得るか、または、高密度アレイが望まれる時は、複数層に沈殿できる。多くの場合において、マイクロドロップは、埋没粒子の組成物と混合可能である流体または培地に浸漬される。例えば、生細胞が粒子として使用される場合、適切な成長培地への浸漬は、細胞生存率を保持するために必要な場合がある。一実施形態において、マイクロドロップは、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、pH7.5で懸濁される。マイクロドロップが生細胞を含む特定の実施形態において、マイクロドロップは、細胞の長期生存を可能にする培地中で懸濁されてもよい。
上述のように、エフェクタ粒子は、例えば、細胞またはビーズであってもよい。エフェクタ粒子が細胞エフェクタ粒子の場合、エフェクタ分子は、細胞により分泌されたポリペプチド、すなわち、エフェクタポリペプチドであってもよい。特定の実施形態において、マイクロドロップのライブラリの異なるメンバは、該マイクロドロップライブラリの各メンバが、平均して1つのエフェクタ粒子を含み、ライブラリの各エフェクタ粒子が、異なるポリペプチドを生成する、異なるエフェクタポリペプチドを分泌する細胞を含んでもよい。
例示的な一実施形態において、エフェクタ分子は、細胞により分泌されたポリペプチドであってもよい。ポリペプチドは、任意の配列(例えば、ランダム配列、またはcDNAによってコードされてもよい)、任意の長さ(例えば、10〜1,000の範囲、またはそれ以上のアミノ酸)、任意の供給源(例えば、哺乳類または細菌起源)であってもよい。特定の実施形態において、細胞ライブラリを作製するように、発現ライブラリ(すなわち、ポリペプチドの発現および分泌を提供する発現ベクターのライブラリ)を細胞の集団に導入することによって作製されてもよい。
次いで、任意に、抗体産生細胞を、沈積された後に、当該技術分野の当事者に既知の方法により、培養する(すなわち、細胞の少なくとも1つ、少なくとも5つ、または少なくとも10以上の細胞分裂を支持する培地での成長)(例えば、国際特許第WO01/55216号を参照のこと)。このように、マイクロドロップ組成物は、単一の抗体産生細胞の後代から得てもよい。しかしながら、特定の実施形態において、抗体産生細胞は、マイクロドロップに使用される前に培養されない。
マイクロドロップのエフェクタ細胞は、哺乳類、細菌、真菌、植物、鳥類、魚類、両生類、および爬虫類の細胞を含む、任意の細胞種類であってもよい。
別の例示的な実施形態において、エフェクタ粒子は、エフェクタ分子が切断可能リンカーを介してビーズに連結されてもよい、ビーズである。リンカーを切断する状態にエフェクタ粒子を曝露すると、エフェクタ分子は、ビーズから放出され、リポータ粒子に拡散できる。
対象とするエフェクタビーズに採用される切断可能リンカーは、求電子的に切断可能なリンカー、求核的に切断可能なリンカー、光切断可能なリンカー、金属切断可能なリンカー、電解的に切断可能なリンカー、および還元および酸化条件下で切断可能なリンカーを含む。このようなリンカーは、Guillier et al(Chem.Rev.2000 1000:2091−2157)に非常に詳細に記載されており、該開示は、その全体が参照により援用される。
切断可能な結合捕捉物質は、例えば、1.2mW/cm2等の適切な輝度で、例えば、365nm等の300〜370nm波長の光に基質を曝露することによって、基質から切断されてもよい。
エフェクタ分子は、合成、半合成、自然に発生する無機および有機分子を含む、任意の分子であってもよい。候補物質は、合成または天然化合物の多数のライブラリで見出されるものを含む。例えば、合成化合物ライブラリは、Maybridge Chemical Co.(Trevillet,Cornwall,UK)、ComGenex(South San Francisco,CA)、およびMicroSource(New Milford,CT)から商業的に入手可能である。代替的に、細菌、真菌、植物および動物止抽出物の形態での天然化合物のライブラリは、Pan Labs(Bothell,WA)から入手可能であるか、または容易に生成可能である。
上述のように、対象とするマイクロドロップの第1および第2リポータ粒子は、スペクトル識別可能な信号を生成し、異なる分子を少なくとも1つ含有するため、1つのリポータ粒子は、エフェクタ分子の作用が特異であるかを判断するための、他の粒子の正または負の対照となる。上述のように、第1および第2のリポータ粒子は、例えば、ビーズまたは細胞であってもよい。
第1および第2のリポータ粒子がビーズである場合、例えば、量子点等の他の標識化システムが採用さるが、識別可能な蛍光色素を使用して標識化されてもよい。
対象とするマイクロドロップを用いるスクリーニングの方法を提供する。一般的な用語において、スクリーニング方法とは、同じエフェクタ粒子を含有しない対照ゲル状マイクロドロップと比べ、対象とするゲル状マイクロドロップ組成物の第1および第2のリポータ粒子の1つと局在される光学的に検出可能な信号の変化の検出に関与する。特定の実施形態において、該方法は、第1または第2の光学的に検出可能な信号の1つへのエフェクタ分子の作用の検出に関与する。他の実施形態において、該方法は、第1および第2の光学的に検出可能な信号と区別でき、リポータ粒子の1つと局在される、第3の光学的に検出可能な信号へのエフェクタ分子の作用の検出に関与してもよい。第3の光学的に検出可能な信号は、例えば、a)(例えば、変化が、第1または第2のリポータ粒子との標識化されたエフェクタ分子によって生成される第3の光学的に検出可能な信号の共局在であり、エフェクタ分子が、第1または第2のリポータ粒子の1つと結合することを示唆する場合)、第3の光学的に検出可能な信号を用いた、エフェクタ分子を標識化することによって、またはb)(例えば、変化が、細胞によって生成された蛍光リポータタンパク質の発現もしくは局在の変更、または細胞によって取り込まれた蛍光色素の増加である場合)、細胞リポータ粒子のリポータによって、生成されてもよい。つまり、変化は、リポータ粒子の1つとの第3の光学的に検出可能な信号の共局在として、(特定の実施形態において、抗体が、リポータ粒子に結合されることを示唆してもよい)リポータ粒子の1つまたは両方と局在される第3の光学的に検出可能な信号の変化として、または変化が、信号の増加、信号の減少、信号の細胞レベル下の分布の変化、信号領域の増大または減少等であってもよい場合の、第1または第2の光学的に検出可能な信号の変化として検出されてもよい。
多構成要素ゲル状マイクロドロップの組成物の管理
37℃で、1インチの攪拌棒を用いて、2000rpmで30mlのビーカー中で16mlのジメチルポリシオロキサン(200cSt,Sigma)を攪拌することによって、Gray et al(JIM 1995)に記載されるプロトコルに従い、マイクロドロップを作製した。攪拌中、37℃で、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)および2%の低ゲル化点アガロース(Sigma Type IX)中の粒子の600μl懸濁液を添加し、乳濁液を作製した。2分間攪拌した後、攪拌を2分間継続しながら、乳濁液を氷上で冷却した。本ステップは、マイクロドロップを凝固させる。次いで、50mlの三角管の20mlのPBS上に乳濁液を上塗りし、10分間、1000rpmで遠心分離した。これらの条件下で、マイクロドロップを管の底でペレット状にし、PBSで、2回、再洗浄する。次いで、マイクロドロップを、1mlのPBSで再懸濁し、分析のため、チャンバスライドまたはマイクロウェルに移動する。
単一のエフェクタおよび複数のリポータを含有するマイクロドロップ
2×104ハイブリドーマ細胞、1×105赤色ビーズ、および1×105青色ビーズを用いて、実施例1で記載するように、マイクロドロップを調製した。図3に示す全ての画像は、Leica DMI6000顕微鏡で捕捉した同じ視野である。赤および緑蛍光チャネルのzスタックを収集し、平坦化し、グレースケール画像として表示した。明視野zスタックも収集され、図3.1、図3.2、および3.3に示す単一ハイブリドーマ細胞を含有するスライスは、それぞれ、リポータ1を表す、赤色チャネル上の3つの共被包ビーズ、およびリポータ2を表す、青色ビーズ上の7つの共被包ビーズを示す。
マイクロドロップ内の抗体特異性アッセイの例証
ヒトカッパ免疫グロブリン軽鎖を結合することで知られる抗体を生成する、マウスハイブリドーマであるクローン141PF11(ATCC)を、2つのリポータビーズ種類と共に、マイクロドロップに共被包する。リポータ1は、4.0μm赤色ポリスチレンビーズ(Invitrogen,F8858)を精製したヒト軽鎖(Sigma,K3388)で被覆することにより調製され、リポータ2は、精製したヒトラムダ鎖(Sigma,L0665)で被覆される青色4.0μmポリスチレン(Invitrogen F8854)ビーズである。マイクロドロップを2時間、組織培養培地中で、37℃でインキュベートし、ハイブリドーマから抗体を分泌させ、リポータに結合する。マイクロドロップを洗浄し、抗体を検出し、ヤギ抗マウスFITC(Invitrogen, F−2761)を1時間で20μg/mlのマイクロドロップ懸濁液を添加する。マイクロドロップを洗浄し、画像化のため、マイクロウェルに設置する。ハイブリドーマ141PF11から分泌された抗体は、リポータ2ではなく、リポータ1に結合する。本結合事象は、ヤギ抗マウスIgG(FITC)ポリクローナル抗体によって検出される。本ハイブリドーマを含有するマイクロドロップは、青色および緑色信号の共局在と比べ、赤色および緑色信号の強化された共局在によって区別される。カッパ鎖ではなく、ラムダに結合する抗体を生成し、上述のように同じマイクロドロップ調製および条件に従う、別のハイブリドーマであるクローンHP6054(ATCC)は、赤色ではなく青色ビーズとの緑色信号の共局在を示す。カッパともラムダとも結合しない抗体を生成する、第3のハイブリドーマは、いずれのビーズ種類との緑色信号の共局在を示さない。
新規種におけるアイソタイプ特異的モノクローナル抗体の生成
ヒトカッパ鎖でニワトリを免疫化する。2週間後、抗原で追加免疫する。4日後、1000万の末梢血リンパ球を単離し、実施例3で記載するように、リポータビーズを用いてマイクロドロップに共被包する。ヤギ抗ニワトリIg(FITC)を用いてマイクロドロップをインキュベートし、背景より上の有意な任意の緑色信号を低倍率でスクリーニングする。これらの位置を記録し、リポータビーズ上の共局在を解析するために高倍率下で再画像化する。所望の抗カッパプロファイル(赤色+緑色共局在のみ)を生成するリンパ球を含有するマイクロドロップを、手動分注器を用いて画像化プレートから除去し、新しいウェルに移動する。ゲル状マトリックスをアガラーゼを用いて溶解し、解放されたリンパ球を適切なニワトリサイトカインの存在下で、1〜2週間、培養した。これらの培養した細胞からcDNAを作製し、V遺伝子をPCRにより増幅し、発現ベクターにクローン化する。プラスミドDNAをCHO細胞に形質移入し、組換え抗体を発現させ、精製し、ヒトカッパ鎖と反応することを確認する。
脾臓胚中心細胞からのモノクローナル抗体の生成
1mgのヒトカッパ軽鎖の静脈注射により、ニワトリを免疫化する。6日後、脾臓を採取し、5mlの氷冷組織培養培地を含むプラスチックのペトリ皿に胚中心を単離する。微細なピンセットを使用して、脾臓部から脾膜をそっと剥離し、髄組織を周囲培地に引き出す。次いで、動脈骨組みおよび関連する胚中心を採取して、B細胞を得る。実施例3に記載するように、リポータビーズを用いて、B細胞をマイクロドロップに共被包し、ニワトリB細胞の増殖を誘発するCD40L等のサイトカインの存在下で、10日間、成長させる。次いで、ヤギ抗ニワトリIg(FITC)を用いて、マイクロドロップをインキュベートし、背景より上の有意な任意の緑色信号を低倍率でスクリーニングする。所望の抗カッパプロファイル(赤色+緑色共局在のみ)を生成するリンパ球を含有するマイクロドロップを、手動分注器を用いて画像化プレートから除去する。これらの選択されたエフェクタ細胞からcDNAを作製し、それらのV遺伝子をPCRにより増幅し、次いで発現ベクターにクローン化する。プラスミドDNAをCHO細胞に形質移入し、組換え抗体を発現させ、精製し、ヒトカッパ鎖と反応することを確認する。
アポトーシス標的に対するアゴニスト抗体の同定
アポトーシス経路の誘発に関与することで知られるタンパク質である、精製された組換えDR4(デスレセプタ4、またはTRAIL−R1)を用いて、ニワトリを免疫化する。特定の腫瘍由来細胞株において、DR4は、天然リガンド、TRAILを通して、または該リガンドを模倣する抗体を通して係合され得る。DR4免疫化ニワトリからのリンパ球は、リポータ1、ヒトリンパ種細胞株B9、およびリポータ2、正常ヒト血管内皮細胞(VEC)を用いて共被包される。リポータ1およびリポータ2は、それぞれ、赤色および青色生存色素を用いて標識化される。明るい蛍光緑に染色する細胞不透過色素であるSYTOX色素を含有する培地で、DNAをインキュベートする。非アポトーシス細胞は色素を吸収しないが、アポトーシス細胞は色素を吸収する。したがって、癌細胞で選択的にアポトーシスを誘発する、所望の作用を有する抗体は、リポータ1と共局在する緑色信号を発生するが、リポータ2は発生しない。このようなマイクロドロップからの抗体遺伝子は、実施例4のように回収される。
新規標的に対する生理活性抗体の同定
リンパ腫細胞株B9の全細胞または膜画分を用いて、ウサギを免疫化する。アポトーシスアッセイに基づくマイクロドロップを実施例6のように実施する。アポトーシス促進性抗体を回収し、標的細胞表面分子を同定する。
GPCRに対するアゴニスト抗体
ニワトリを免疫化するために、ドーパミン受容体DRD1を過剰発現する形質移入293細胞を使用し、リポータ細胞を用いて免疫化したリンパ球を共被包するように生成した。リポータ1は、DRD1およびCRE反応性要素に作動可能に連結されるGFP遺伝子を発現する293細胞である。リポータ2は、同じGFPを含有するが、DRD1を発現しない293細胞である。リポータ1および2は、それぞれ、赤色および青色生存色素によって区別される。DRD1受容体が活性化される時、信号形質導入は、GFP導入遺伝子を含む、CRE連結遺伝子を最終的に活性化する、アルファ−s Gタンパク質サブユニットを通して生じる。したがって、DDR1の特異的アゴニストとして作用する抗体が生成される時、リポータ1は、緑色蛍光を発生し、リポータ2は、緑色チャネルで暗い。異なる機構を通して信号伝達できる非DDR1抗体の場合において、リポータ1および2の双方が、緑色蛍光を発生する。非反応性抗体は、いずれのリポータにおいても緑色信号を生成しない。
細菌性発現セクレトームライブラリ
神経幹細胞から単離されるヒト遺伝子のライブラリは、ニューロンの成長を促進できる新規因子を発見する目的で、大腸菌発現ベクターにクローン化される。本ライブラリのメンバは、マイクロドロップ当り<1細菌細胞で、微小マイクロドロップ(例えば30μm)中に植え付けられる。マイクロドロップを細菌成長培地中に設置し、各マイクロドロップを内に小さなコロニーを形成するように拡大させる。これらのマイクロドロップは、これで、リポータ1として赤色生存色素で充填される非分裂神経細胞、およびリポータ2として青色色素で充填される非分裂線維芽細胞を含有するより大きなマイクロドロップのエフェクタ粒子として使用される。マイクロドロップは、FITC−dNTPの存在下で、哺乳類細胞培養培地で培養される。マイクロドロップは、青色および緑色ではなく、赤色および緑色信号の共局在をスクリーニングする。このようなプロファイルは、潜在的な神経特異的成長因子が、共被包細菌コロニーによって生成されることを示唆する。本コロニーを回収し、発現遺伝子を特徴付けする。
3:高分子マトリックス
5:エフェクタ粒子
7:エフェクタ分子
9:第1のリポータ粒子
11:第2のリポータ粒子
13:変化した第1のリポータ粒子13
Claims (21)
- ゲル状マイクロドロップ組成物であって、
高分子マトリックスと、
前記高分子マトリックス中にエフェクタ分子を放出するエフェクタ粒子と、
第1の光学的に検出可能な信号を発生する第1のリポータ粒子と、
前記第1の光学的に検出可能な信号と区別できる、第2の光学的に検出可能な信号を発生する第2のリポータ粒子と、を含み、
前記エフェクタ粒子ならびに前記第1および第2のリポータ粒子は、前記高分子マトリックスによって被包される、組成物。 - 前記ゲル状マイクロドロップは、単一エフェクタ粒子と、少なくとも5つの第1のリポータ粒子と、少なくとも5つの第2のリポータ粒子と、を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記エフェクタ粒子は細胞であり、前記エフェクタ分子は、前記細胞によって分泌されるポリペプチドである、請求項1に記載の組成物。
- 前記ポリペプチドは抗体である、請求項3に記載の組成物。
- 前記エフェクタ粒子はビーズである、請求項1に記載の組成物。
- 前記エフェクタ分子は、切断可能なリンカーを介して前記エフェクタ粒子に付着する、請求項5に記載の組成物。
- 前記第1および第2のリポータ粒子は、第1および第2の細胞である、請求項1に記載の組成物。
- 前記第1および第2の細胞は、それぞれ、前記第1および第2の光学的に検出可能な信号を生成するフルオロフォアを含む、請求項7に記載の組成物。
- 前記第1および第2の細胞は、前記第1および第2の光学的に検出可能な信号を生成する蛍光タンパク質を含む、請求項8に記載の組成物。
- 前記蛍光タンパク質は、前記蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、前記ポリヌクレオチドと作動可能に連結される誘導性プロモータとを含む、発現カセットによってコードされる、請求項8に記載の組成物。
- スクリーニング方法であって、
前記エフェクタ粒子を含有しない対照ゲル状マイクロドロップ組成物に対して、請求項1に記載のゲル状マイクロドロップ組成物の前記第1および第2のリポータ粒子のうちの1つを用いて局在化される、光学的に検出可能な信号の変化を検出するステップを含む、方法。 - 前記方法は、前記第1または第2の光学的に検出可能な信号における前記エフェクタ分子の作用を検出するステップを含む、請求項11に記載の方法。
- 前記方法は、第3の光学的に検出可能な標識を用いて、前記エフェクタ分子を標識化するステップをさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 前記変化は、前記エフェクタ分子によって生成される前記第3の光学的に検出可能な信号の、前記第1または第2のリポータ粒子との共局在であり、前記エフェクタ分子が、前記第1または第2のリポータ粒子に結合することを示唆する、請求項11に記載の方法。
- 前記第1または第2のリポータ粒子は、第3の光学的に検出可能な信号を生成し、前記変化は、前記第3の光学的に検出可能な信号における変化である、請求項11に記載の方法。
- 前記方法は、蛍光顕微鏡を使用して行われる、請求項11に記載の方法。
- 前記エフェクタ分子を同定するステップをさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 請求項1に記載のゲル状マイクロドロップ組成物を生成するように、
a)i.高分子の単量体と、
ii.エフェクタ分子を放出するエフェクタ粒子と、
iii.第1の光学的に検出可能な信号を発生する第1のリポータ粒子と、
iv.粒子含有組成物を生成するように、前記第1の光学的に検出可能な信号と区別できる第2の光学的に検出可能な信号を発生する第2のリポータ粒子と、を混合するステップと、
b)前記粒子含有組成物の液滴を作製するステップと、
c)前記液滴の単量体を重合するステップと、を含む、方法。 - 前記エフェクタ粒子、ならびに前記第1および第2のリポータ粒子は細胞である、請求項18に記載の方法。
- 前記方法は、前記液滴中で前記細胞を培養するステップを含む、請求項18に記載の方法。
- 前記エフェクタ粒子、ならびに前記第1および第2のリポータ粒子はビーズである、請求項18に記載の方法。
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