JP2021029134A - ギャップ結合機能制御剤のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
Description
一方で、コネキシン26が癌転移と密接に関わり、コネキシン26の機能を生化学的に抑制することにより癌の転移が抑制されることが報告されている(特許文献1)。
(a)断片化されたギャップ結合プラークを形成し得る細胞をマルチウェルプレート上で培養する工程
(b)前記工程で培養された培養細胞に被験物質を接触させる工程
(c)ギャップ結合プラーク、細胞膜及び細胞核を可視化する工程
(d)前記ギャップ結合プラークを含む領域の画像を取得する工程
(e)該取得画像から1細胞の細胞領域に接するギャップ結合プラークの直径、面積又は真円度を測定し、その中から最大径、最大面積又は最小真円度を選択して記録する工程
(f)前記最大径、最大面積又は最小真円度を基準値と比較し、ギャップ結合プラーク断片化制御剤又はギャップ結合機能制御剤を評価又は選択する工程
(a)断片化されたギャップ結合プラークを形成し得る細胞をマルチウェルプレート上で培養する工程
(b)前記工程で培養された培養細胞に被験物質を接触させる工程
(c)ギャップ結合プラーク、細胞膜及び細胞核を可視化する工程
(d)前記ギャップ結合プラークを含む領域の画像を取得する工程
(e)該取得画像から1細胞の細胞領域に接するギャップ結合プラークの直径、面積又は真円度を測定し、その中から最大径、最大面積又は最小真円度を選択して記録する工程
(f)前記最大径、最大面積又は最小真円度を基準値と比較し、ギャップ結合プラーク断片化制御剤又はギャップ結合機能制御剤を評価又は選択する工程
「ギャップ結合プラーク」は、隣接する細胞膜上のコネクソン(connexon)同士が接合したギャップ結合チャネル(gap junctional channel)が数千個集合した複合体を指す。ここで、コネクソンは、コネキシン(connexin;Cx)のホモ6量体を意味する。
各組織において発現するコネキシンを以下に示す。同じ組織内に複数のコネキシンが共存し、協同してギャップ結合の形成を担う場合もある。
・血管(内皮:Cx40、Cx37、平滑筋:Cx43)
・肝臓(Cx32、Cx26)
・膵臓(β細胞:Cx36、外分泌腺:Cx32)
・水晶体(上皮:Cx43、線維:Cx46、Cx50)
・内耳(蝸牛:Cx26、Cx30)
・心臓(洞房結節:Cx45、心房筋:Cx43、Cx45、Cx40、房室結節:Cx45、ヒス束:Cx40、プルキンエ線維:Cx40、Cx43、心室筋:Cx43、Cx45)
・神経系(星状膠細胞:Cx43、Cx30、Cx26、希突起膠細胞:Cx32、Cx29、Cx47、ミエリン鞘:Cx32、上衣細胞:Cx43、ニューロン:Cx36)
断片化されたギャップ結合プラークを形成するように遺伝子工学的に操作された組換え細胞としては、例えば、Cx30のみを強制発現するHela細胞(非特許文献1)や正常なギャップ結合形成機能を喪失したコネキシン変異体を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞が挙げられる。
コネキシン変異体としては、コネキシンを構成するアミノ酸において少なくとも1つのアミノ酸残基の欠失、他のアミノ酸残基への置換、他のアミノ酸残基の付加又は挿入が為され、正常なギャップ結合形成機能を喪失したコネキシン分子が挙げられ、好ましくはアミノ酸残基が他のアミノ酸残基へ置換された変異体である。アミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の1つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。変異の数は少なくとも1つであればよく、好ましくは1〜50個、1〜30個、1〜20個、1〜10個又は1〜5個であり得る。
例えば、Cx26のアミノ酸配列(配列番号1)の75番目のアルギニン残基をトリプトファン残基に置換(R75W)したCx26変異体、75番目のアルギニン残基をグルタミン残基に置換(R75Q)したCx26変異体、143番目のアルギニン残基をグルタミン残基に置換(R143Q)したCx26変異体、179番目のアスパラギン酸残基をアスパラギン残基に置換(D179N)したCx26変異体、184番目のアルギニン残基をグルタミン残基に置換(R184Q)したCx26変異体、235番目のシステイン残基を欠失(235delC)させたCx26変異体、45番目のグリシン残基をグルタミン酸残基に置換し且つ136番目のチロシン残基を他のアミノ酸酸残基に置換(G45E/Y136X)したCx26変異体等が挙げられる。
ここで、断片化されたギャップ結合プラークを形成し得る細胞の播種時の細胞濃度は、例えば96ウェルプレートを使用した場合、5000〜20000cells/ウェルとするのが好ましい。また、被験物質の添加濃度は、10〜1000nMとするのが好ましい。
これらの試薬による細胞の染色は、例えば、対応する細胞染色試薬を細胞に添加し、室温〜37℃で所定の時間インキュベートすることにより行われる。
ギャップ結合プラークの可視化は、抗コネキシン抗体と蛍光標識二次抗体による免疫蛍光染色法を用いることにより行うことできる。
細胞膜は、スフィンゴ糖脂質GM1を特異的に認識する蛍光標識コレラ毒素Bサブユニット(CtxB)等を用いて標識することや、膜貫通タンパク質であるカドヘリンを抗カドヘリン抗体を用いて標識することにより、可視化することが可能である。
細胞核の可視化は、公知の核染色試薬、例えばDAPI、プロピジウムヨージド(PI)、ヘキスト33342などを用いることにより行うことが可能である。
すなわち、前工程で可視化された、ギャップ結合、細胞膜、細胞核、更にはアポトーシスマーカーの可視化画像が取得される。画像の取得は、全自動イメージングサイトメーター(GE社、IN Cell Analyzer 2200など)を用いて行うことができる。
例えば、ギャップ結合に関してはコネキシンを標識した緑色蛍光の焦点の合う部分を自動認識し、その焦点を中心にZ軸方向に4μm程度の厚みの合成画像(2.5D)を取得する。これによりギャップ結合プラーク全体について表層側から基底部側までの全体像が得られる。細胞境界(細胞膜)を識別する赤色蛍光、核を識別するDAPIの蛍光も同様に画像取得される(図1参照)。画像は、1ウェルにつき10〜50視野取得するのがよい。
画像の解析は、画像解析ソフトウェア(GE社、IN Cell Investigatorなど)を用い、以下に示す手順で、ギャップ結合プラークの形状データが取得される。
先ず、細胞膜情報画像から個々の単一細胞の細胞領域を認識させる。具体的には、赤色蛍光の示す範囲全体をCell−Preとして認識させ、その中で蛍光強度が周囲より強い部分をMembraneとして認識させる。細胞核情報は単一細胞の指標として認識させる。Cell−PreからMembraneを差し引いたときに囲まれる範囲で内部に細胞核情報が一点のみ存在するものを1細胞単位として解析する。
ここで、ギャップ結合プラークの直径とは、コネキシン免疫染色で標識された対象物の最大径であり、面積とは同対象物の面積であり、真円度とは対象物が真円に近いほど1に近く、反対に正円から変形して楕円、扁平、線状に近くなるほど0に近い値を示す(図2参照)。
この測定により、一度に多数の細胞のギャップ結合サイズのデータを得ることが可能である。例えば96ウェルプレートの1ウェルの中で1視野100細胞の測定を10視野で行う。これにより1ウェル1000細胞以上の数値データを得ることができる。
後記実施例に示すように、ギャップ結合プラーク断片化制御剤の添加により、ギャップ結合プラークの最大径及び最大面積の値は増大し、最小真円度の値は減少する。
よって、最大径、最大面積又は最小真円度のレベルの判定は、被験物質を添加した細胞における当該ギャップ結合プラークの最大径、最大面積の値が、所定の基準値と比較して増加している、最小真円度が所定の基準値と比較して減少していれば、当該被験物質をギャップ結合プラーク断片化抑制剤ひいてはギャップ結合機能向上剤として評価又は選択することができ、被験物質を添加した細胞における当該ギャップ結合の最大径、最大面積の値が、所定の基準値と比較して減少している、最小真円度が所定の基準値と比較して増加していれば、当該被験物質をギャップ結合プラーク断片化促進剤ひいてはギャップ結合機能抑制剤として評価又は選択することができる。
例えば、予め測定して決定された、断片化したギャップ結合プラークのサイズ値(x(0))と正常なギャップ結合プラークのサイズ値(x(1))と、被験物質接触後のギャップ結合プラークのサイズ値(x)から、下記式のようにギャップ結合回復率を算出することによってギャップ結合プラーク断片化抑制剤又はギャップ結合機能向上剤を評価することができる。
この場合には、標識されたアポトーシスマーカー(例えば、活性型カスパーゼ3)が、核標識との共局在により死細胞として測定される。死細胞率として核の総数に対する死細胞の率(アポトーシスマーカー陽性率)を算出する。例えば、得られる死細胞率をギャップ結合の回復率から差し引いた値をギャップ結合回復・毒性評価指数(Gap junction Restoration and Toxicity Index;GRT値)とし、副作用を考慮したギャップ結合プラーク断片化抑制剤又はギャップ結合機能向上剤の判定が可能となる。すなわち、被験物質無添加時の死細胞率をy(0)、被験物質添加後の死細胞率をyとすると、下記式に示すように被験物質誘導性死細胞率が算出され、
GRT値=(ギャップ結合回復率)−(被験物質誘導性死細胞率)
例えば、ギャップ結合回復率が0.95(95%回復)であっても、被験物質誘導性死細胞率が0.5(被験物質により50%が細胞死)だった場合はGRT値=0.95−0.5=0.45となる。それに対しギャップ結合回復率が0.78(78%回復)、被験物質誘導性死細胞率が0.08(被験物質により8%が細胞死)だった場合はGRT値=0.78−0.08=0.7となる。すなわち後者の被験物質または投与濃度の方が有効性・安全性が高いまたは投与条件であると考えられる。
この指数を用いて安全で効果的な薬剤を大規模にスクリーニングし、ギャップ結合プラーク断片化抑制剤又はギャップ結合機能向上剤を選抜することが可能となる。
細胞イメージング用の96wellプレート、Lumox multi−well 96well plate(Sarstedt社)にCx30、Cx26又はCx26変異体をそれぞれ安定発現させたHela細胞を播種した。
Cx30、Cx26又はCx26変異体(R75W)をコードする遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子を持つプラスミドをリポフェクション法によりHela細胞へ遺伝子導入し、その後、ネオマイシン等の薬剤を添加し、遺伝子導入されてない細胞を死滅させ、遺伝子導入された細胞だけが生存するように培養した。具体的には、6cm dishで遺伝子導入を行った24時間後、増殖速度に応じて1/10〜1/40で10cm dishにまき直した。さらに24時間後、発現ベクターに入っている選択マーカーにあわせた薬剤入り培地に培地交換し、1週間に2回、コロニーが成長するまで培地交換した。薬剤を加えてから14−16日目くらいにコロニーが出現するのを確認してコロニーを単離し、ワセリンをキャップの底面に押しつけ、コロニーが中に入るようにした。キャップの中に培地を入れ、pipettingで剥離し24穴のdishに移した。遺伝子が導入されているかはPCR法等により確認した。
9600細胞/ウェルの各細胞を播種した後、10%ウシ胎児血清入りのD-MEM培地により37℃、5%CO2下で3日間培養した。コンフルエント(飽和状態)に対し、60−80%程度の均一な細胞密度になることを確認した後、被験薬剤を、50、100、500及び1000nM濃度で添加した。添加から24〜48時間後、4%パラホルムアルデヒドで(PFA)で15分間固定し、その後PBSへ液交換し4℃で保管した。
2−1.ギャップ結合、細胞膜、アポトーシスマーカーの可視化
1)固定した細胞の透過処理:0.1% TritonX−100(10%液 10μl/ml PBS)(50ul/well)5min。
2)洗浄:PBS 5分 2回(洗浄は一回150μl程度)。
3)ブロッキング:2%BSA 30分(50ul/well)。
4)一次抗体反応:以下の抗体を1次抗体として反応させる。(希釈液は1%BSA溶液とする)
・抗Cx26抗体(Rb Invitrogen) 1:600
・抗Cx30抗体(Rb Invitrogen) 1:600
・抗抗活性型カスパーゼ3抗体(Rb Promega) 1:400
5)パラフィルムをかけて冷蔵庫内のシェーカーで一晩反応させる。
6)洗浄:PBS共洗い1回+PBS 10分 2回。
7)二次抗体反応及び細胞膜の染色:以下の抗体を1%BSAで反応させる。常温1時間。同時に、CxtBによる細胞膜の可視化処理を行った。
・二次抗体:Alexa488−Rb 1:1000
・細胞膜の可視化:CxtB−Alexa555 1:400
8)洗浄:PBS 10分 2回。
1)細胞核の染色:DAPI(Dojindo) 1:3000 in PBS 約3分。
2)封入:液を除き、1回PBSで洗浄してFluoSaveで封入。
3)保存:プレートシールを貼り冷蔵庫で遮光保存。
上記で染色したイメージングプレートを全自動イメージングサイトメーター(GE社、IN Cell Analyzer 2200など)で染色したギャップ結合、細胞膜、アポトーシスマーカーの標識蛍光を画像取得した。ギャップ結合に関してはコネキシン30またはコネキシン26を標識した緑色蛍光の焦点の合う部分を自動認識し、その焦点を中心にZ軸方向に約4μmの厚みの合成画像(2.5D)を取得する。これによりギャップ結合プラーク全体について表層側から基底部側までの全体像を可視化できる画像を得る。
細胞境界を識別する赤色蛍光、核を認識するDAPIの蛍光も同様に画像取得する。同様に1ウェルにつき10視野の画像を取得する。
尚、抗活性型カスパーゼ3抗体による染色では死細胞全体が緑に染色され、細胞死を計数するために使用される。
取得した画像を画像解析ソフトウェア(GE社、IN Cell Investigatorなど)を用い、以下の解析方法によりギャップ結合プラークの形成や回復を解析した。
1)細胞の認識
まず、Alexa555標識CtxB等細胞膜情報を示す赤色蛍光の画像から個々の単一細胞の細胞領域を解析プログラムに自動認識させる。赤色蛍光の示す範囲全体をCell−Preして認識し、その中で蛍光強度が周囲より強い部分をMembraneとして認識する。核染色のDAPIの蛍光は単一細胞の指標として認識する。Cell−PreからMembraneを差し引いたときに囲まれる範囲で内部にDAPIの各標識が一点のみ存在するものを1細胞単位として解析する。
次に緑色蛍光情報からギャップ結合プラークの領域をTargetとして認識させる。
上記解析で認識した1細胞と上記Targetが含まれる或いは接点のあるギャップ結合プラークの直径、面積、真円度を測定した。その中で最大のプラーク径、最大のプラーク面積及び最小真円度の測定値を1細胞のデータとして記録した。この測定により、一度に複数(例えば100細胞)のギャップ結合サイズのデータを得た。
薬剤を添加していない断片化したCx30ギャップ結合の数値(1−2μm程度)をx(0)、Cx26ギャップ結合のような集積したギャップ結合の平均値(3−5μm程度)をx(1)、薬剤添加後の数値(ギャップ結合プラークの最大径、最大面積、最小真円度)の平均をxとすると、下記式よりギャップ結合回復率を算出することができる。
活性型カスパーゼ3抗体等を用いて標識された緑色蛍光は、DAPIによる核標識との共局在により死細胞として測定される。死細胞率として核の総数に対する死細胞の率(活性型カスパーゼ3陽性率)を算出する。得られる死細胞率をギャップ結合の回復率から差し引くことにより、副作用を考慮した最適濃度の判定が可能となる。薬剤無添加時の死細胞率をy(0)薬剤添加後の死細胞率をyとすると、下記式より薬剤誘導性死細胞率を算出することができる。
上記3)のギャップ結合回復率から、4)の薬剤誘導性死細胞率を差し引くことにより((ギャップ結合回復率)−(薬剤誘導性死細胞率))、ギャップ結合回復・毒性評価指数(GRT値)を算出することができる。
1)予めコネキシン分子の免疫染色による顕微鏡観察によってギャップ結合プラークの断片化を修復すること、及びNeurobiotin tracerを用いた染料輸送試験(Dye transfer assay)によるギャップ結合の機能亢進が確認された2種の薬剤(プロテアソーム阻害剤)A、Bと、ギャップ結合プラークの断片化の修復とギャップ結合の機能亢進を示さないことが確認された薬剤Cを添加した場合のギャップ結合プラークの最大径(Target Length)、最大面積(Target Area)、最小真円度(Form Factor)の測定結果を図3に示す。また、比較として、薬剤A又はBを添加した場合について、全てのギャップ結合プラークの直径、面積、真円度のそれぞれの平均値を1細胞のデータとして記録した場合の測定結果の比較を図4に示す。
図3より、薬剤Cでは効果は見られないが、薬剤AとBでは概ね濃度依存的にギャップ結合プラークの最大径と最大面積が増加し、最小真円度が減少した。高濃度(1000nM)ではAよりもBの効果が顕著であった。しかし低濃度(50nM)では、BよりもAの効果が高かった。副作用を考慮した場合には低濃度で効果のあるAが薬剤としてより適切であると考えられる。
一方、1細胞のデータとして、最大径、最大面積又は最小真円度を用いなかった場合には濃度依存性の変化は全く反映されなかった(図4右)。
薬剤無添加のCX30のプラーク最大径x(0)と測定値が同等で薬剤によるプラーク最大径の増加が全く見られない場合は0付近となり、CX26のギャップ結合のプラーク最大径と同程度まで回復した場合は+1付近の値となる。もしCX26よりもさらに最大径が増加した場合は1を超える値になる。つまり低濃度では50mMでの薬剤Aの回復率1.31は薬剤Bの回復率0.43よりも高いため、低濃度ではAの方がBより効果が高いことが分かる。
GRT値(A50)=1.31−0.0015=1.3085
GRT値(B50)=0.43−0.0177=0.4123
これによりいずれも効果の見られた薬剤Aと薬剤Bのうち、50nMの低濃度で使用した場合に効果と安全性の高い薬剤はAであると判定できる。
Claims (6)
- 以下の工程(a)〜(f)を含む、ギャップ結合プラーク断片化制御剤又はギャップ結合機能制御剤の評価又は選択方法。
(a)断片化されたギャップ結合プラークを形成し得る細胞をマルチウェルプレート上で培養する工程
(b)前記工程で培養された培養細胞に被験物質を接触させる工程
(c)ギャップ結合プラーク、細胞膜及び細胞核を可視化する工程
(d)前記ギャップ結合プラークを含む領域の画像を取得する工程
(e)該取得画像から1細胞の細胞領域に接するギャップ結合プラークの直径、面積又は真円度を測定し、その中から最大径、最大面積又は最小真円度を選択して記録する工程
(f)前記最大径、最大面積又は最小真円度を基準値と比較し、ギャップ結合プラーク断片化制御剤又はギャップ結合機能制御剤を評価又は選択する工程 - 工程(a)において、断片化されたギャップ結合プラークを形成し得る細胞が、Cx26変異体又はCx30野生型を発現させた細胞である、請求項1記載の方法。
- Cx26変異体が、Cx26のアミノ酸配列の75番目のアルギニン残基をトリプトファン残基又はグルタミン残基に置換した変異体である、請求項2記載の方法。
- 工程(e)において、1視野100細胞の測定を10視野で行う、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(f)において、ギャップ結合プラークの最大径を基準値と比較する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- さらに、アポトーシスマーカーを用いて死細胞率を算出し、被験物質による毒性評価を併せて行う、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
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WO2017146035A1 (ja) * | 2016-02-22 | 2017-08-31 | 学校法人順天堂 | 内耳細胞の製造法 |
JP2017526687A (ja) * | 2014-08-22 | 2017-09-14 | オークランド ユニサービシーズ リミティド | チャネル調節剤 |
-
2019
- 2019-08-19 JP JP2019149966A patent/JP7393780B2/ja active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2011507860A (ja) * | 2007-12-21 | 2011-03-10 | コーダ セラピューティクス, インコーポレイテッド | 異常瘢痕または過剰瘢痕の治療のための抗コネキシンポリヌクレオチドおよび抗コネキシンペプチドの使用 |
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Non-Patent Citations (2)
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Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP7393780B2 (ja) | 2023-12-07 |
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