CN113950375A - 使用微毛细管阵列筛选的方法和系统 - Google Patents

使用微毛细管阵列筛选的方法和系统 Download PDF

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Abstract

提供了用于筛选大的变异蛋白群的高通量方法。所述方法利用了大规模的微毛细管阵列，其中每个微毛细管包含含有变异蛋白、固定化靶分子和报告子元件的溶液。固定化靶分子可以包括任何目的分子，其包括蛋白、核酸、碳水化合物和其它生物分子。通过测量来自报告子元件的信号来评估变异蛋白与分子靶标的缔合。可以分离测定中鉴定为含有目的变异蛋白的微毛细管的内容物，并且可以表征表达目的变异蛋白的细胞。还提供了用于进行所公开的筛选方法的系统。

Description

使用微毛细管阵列筛选的方法和系统
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年4月8日提交的美国临时申请第62/830,978号的权益，出于所有目的，其通过引用整体明确地并入。
技术领域
本公开提供了使用微毛细管阵列筛选的方法和系统。
发明背景
生物样品的分析(包括蛋白质、核酸、碳水化合物和其它重要生物分子的鉴定、表征和再工程化)已经从样品数量的放大和样品尺寸的缩小中获得了很大的益处。例如，生物材料的二维微阵列(如DNA微阵列)已经使得能够开发涉及用于处理样品和检测结果的多重方法的高通量筛选方法。
在一些情况下，上述方法受益于它们与光学传感技术的组合，以使用荧光或其它相应的特异的和灵敏的标记方法来鉴定目的样本。
尽管此类技术提供了关于特定样品的分析信息(例如溶液中特定生物分子的存在和可能的量，或特定核酸或多肽的序列)，但是它们通常不允许在不使目的样品失活或不以其它方式损害目的样品的情况下回收通过测定鉴定的生物样品。
因此，一直需要开发具有高通量能力的改进的微尺度筛选和分析的方法及系统，特别是能够使用用所要求保护的系统进行的另外的测定(包括钙染料测定、T细胞激活测定、B细胞测定和GFP测定)，回收筛选和分析中鉴定的样品的方法和系统。
发明概述
在一方面，本公开通过提供筛选变异蛋白群的方法来解决这些和其它需要，所述方法包括以下步骤：
提供包含多个微毛细管的微毛细管阵列，每个微毛细管包含变异蛋白、固定化靶分子和报告子元件，其中所述变异蛋白以特定亲和力与所述固定化靶分子缔合；和
在报告子测定中，测量来自至少一种报告子元件的信号，所述信号指示至少一种变异蛋白与至少一种固定化靶分子的缔合以鉴定至少一个目的微毛细管，其中所述报告子测定选自：钙染料测定、T细胞激活测定、B细胞测定和GFP测定。
在一些实施方案中，所述方法还包括分离目的微毛细管的内容物的步骤。
在另一方面，提供了用于筛选变异蛋白群的系统，其包括：
包含多个微毛细管的阵列，每个微毛细管包含变异蛋白、固定化靶分子和报告子元件，其中所述变异蛋白以特定的亲和力与所述固定化靶分子缔合。
在一些实施方案中，所述系统还包括显微镜。
在一些实施方案中，所述系统还包括光源和检测器。
在一些实施方案中，所述系统还包括提取装置。
在一些实施方案中，所述系统还包括两阶段样品回收元件。
在一些实施方案中，本发明提供了筛选变异蛋白群的方法，其包括以下步骤：
提供包含多个微毛细管的微毛细管阵列，每个微毛细管包含变异蛋白、固定化靶分子和报告子元件，其中所述变异蛋白以特定亲和力与所述固定化靶分子缔合；和
测量来自至少一种报告子元件的信号，所述信号指示至少一种变异蛋白与至少一种固定化靶分子的缔合以鉴定至少一个目的微毛细管。
在一些实施方案中，所述变异蛋白由表达系统表达。
在一些实施方案中，所述表达系统为无细胞表达系统。
在一些实施方案中，所述表达系统为细胞表达系统。
在一些实施方案中，所述细胞表达系统为动物系统、禽类系统、真菌系统、细菌系统、昆虫系统或植物系统。
在一些实施方案中，所述细胞表达系统为禽类系统。
在一些实施方案中，所述禽类表达系统为鸡类系统。
在一些实施方案中，所述变异蛋白为可溶性蛋白。
在一些实施方案中，所述靶分子为靶抗体、靶蛋白或多肽、靶核酸、靶碳水化合物或上述每一种的组合。
在一些实施方案中，所述靶分子被固定在表面上。
在一些实施方案中，所述表面为细胞的表面。
在一些实施方案中，所述靶分子为天然蛋白。
在一些实施方案中，所述表面为珠的表面。
在一些实施方案中，所述表面为微毛细管壁的表面。
在一些实施方案中，所述表面为被配置为通过重力沉降而沉积在所述微毛细管中的表面。
在一些实施方案中，所述报告子元件为标记的抗体或其它结合分子。
在一些实施方案中，所述标记的抗体或其它结合分子为荧光标记的抗体或其它结合分子。
在一些实施方案中，所述标记的抗体为一级或二级抗体。
在一些实施方案中，所述标记的抗体或其它结合分子为酶联抗体或其它结合分子。
在一些实施方案中，所述报告子元件在细胞内被激活，并且所述靶分子被固定在所述细胞的表面上。
在一些实施方案中，所述报告子元件包含绿色荧光蛋白或变体。
在一些实施方案中，所述信号为荧光信号、吸光度信号、明场信号或暗场信号。
在一些实施方案中，所述微毛细管阵列中的每个微毛细管包含来自所述变异蛋白群的0至5个变异蛋白。
在一些实施方案中，所述微毛细管阵列包含至少100,000个、至少300,000个、至少1,000,000个、至少3,000,000个或至少10,000,000个微毛细管。
在一些实施方案中，每个微毛细管还包含提高细胞表达系统的存活力的试剂。
在一些实施方案中，所述试剂为甲基纤维素、右旋糖酐普兰尼克F-68、聚乙二醇或聚乙烯醇。
在一些实施方案中，所述试剂为生长培养基。
在一些实施方案中，所述信号通过光学检测器测量。
在一些实施方案中，所述信号通过显微镜测量。
在一些实施方案中，所述方法还包括分离所述目的微毛细管的内容物的步骤。
在一些实施方案中，所述目的微毛细管的内容物通过用激光脉冲所述目的微毛细管来分离。
在一些实施方案中，激光器为二极管泵浦的Q开关激光器。
在一些实施方案中，所述激光对准所述微毛细管壁与包含在所述微毛细管中的样品之间的水-玻璃界面。
在一些实施方案中，使用两阶段样品回收元件分离所述目的微毛细管的内容物。
在一些实施方案中，所述微毛细管不包含能够抑制电磁辐射传输的微粒、磁性微粒、磁珠或电磁辐射吸收材料。
本发明还提供了用于筛选变异蛋白群的系统，其包括：
包含多个微毛细管的阵列，每个微毛细管包含变异蛋白、固定化靶分子和报告子元件，其中所述变异蛋白以特定的亲和力与所述固定化靶分子缔合。
在一些实施方案中，所述变异蛋白由表达系统表达。
在一些实施方案中，所述表达系统为无细胞表达系统。
在一些实施方案中，所述表达系统为细胞表达系统。
在一些实施方案中，所述细胞表达系统为动物系统、禽类系统、真菌系统、细菌系统、昆虫系统或植物系统。
在一些实施方案中，所述细胞表达系统为禽类系统。
在一些实施方案中，所述禽类表达系统为鸡类系统。
在一些实施方案中，所述变异蛋白为可溶性蛋白。
在一些实施方案中，所述靶分子为靶蛋白或多肽、靶核酸、靶碳水化合物或上述每一种的组合。
在一些实施方案中，所述靶分子被固定在表面上。
在一些实施方案中，所述表面为细胞的表面。
在一些实施方案中，所述靶分子为天然蛋白。
在一些实施方案中，所述表面为珠的表面。
在一些实施方案中，所述表面为微毛细管壁的表面。
在一些实施方案中，所述表面为被配置为通过重力沉降而沉积在所述微毛细管中的表面。
在一些实施方案中，所述报告子元件为标记的抗体或其它结合分子。
在一些实施方案中，所述标记的抗体或其它结合分子为荧光标记的抗体或其它结合分子。
在一些实施方案中，所述标记的抗体为一级或二级抗体。
在一些实施方案中，所述标记的抗体或其它结合分子为酶联抗体或其它结合分子。
在一些实施方案中，所述报告子元件在细胞内被激活，并且所述靶分子被固定在细胞的表面上。
在一些实施方案中，所述报告子元件包含绿色荧光蛋白或变体。
在一些实施方案中，所述信号为荧光信号、吸光度信号、明场信号或暗场信号。
在一些实施方案中，所述微毛细管阵列中的每个微毛细管包含来自所述变异蛋白群的0至5个变异蛋白。
在一些实施方案中，所述微毛细管阵列包含至少100,000个、至少300,000个、至少1,000,000个、至少3,000,000个或至少10,000,000个微毛细管。
在一些实施方案中，每个微毛细管还包含提高细胞表达系统的存活力的试剂。
在一些实施方案中，所述试剂为甲基纤维素、右旋糖酐普兰尼克F-68、聚乙二醇或聚乙烯醇。
在一些实施方案中，所述试剂为生长培养基。
在一些实施方案中，所述系统还包括光源和检测器。
在一些实施方案中，所述系统还包括显微镜。
在一些实施方案中，所述系统还包括提取装置。
在一些实施方案中，所述提取装置包括二极管泵浦的Q开关激光器。
在一些实施方案中，所述系统还包括两阶段采样回收元件。
在一些实施方案中，所述微毛细管不包含能够抑制电磁辐射传输的微粒、磁性微粒、磁珠或电磁辐射吸收材料。
本发明还提供了筛选变异蛋白群的方法，其包括以下步骤：
提供包含多个微毛细管的微毛细管阵列，每个微毛细管包含表达变异蛋白的细胞表达系统、固定在细胞表面上的靶分子和报告子元件，其中所述变异蛋白与固定化靶分子在所述微毛细管中以特定亲和力缔合，其中所述细胞表达系统为禽类系统；和
在报告子测定中，测量来自至少一种报告子元件的信号，所述信号指示至少一种变异蛋白与至少一种固定化靶分子的缔合以鉴定至少一个目的微毛细管。
在一些实施方案中，所述禽类系统为鸡系统。
在一些实施方案中，所述靶分子为靶蛋白或多肽、靶核酸、靶碳水化合物、或靶抗体、或上述每一种的组合。
在一些实施方案中，所述靶分子为靶抗体。
在一些实施方案中，所述报告子测定选自：钙染料测定、T细胞激活测定、B细胞测定和GFP测定。
在一些实施方案中，所述报告子元件为标记的抗体或其它结合分子，其中所述标记的抗体或其它结合分子定位于所述变异蛋白上的表位。
在一些实施方案中，所述标记的抗体或其它结合分子为荧光标记的抗体或其它结合分子。
在一些实施方案中，所述B细胞测定包括来源于脾脏的B细胞。
在一些实施方案中，所述T细胞激活测定被用于评估抗体对细胞信号传导的诱导能力。
在一些实施方案中，所述T细胞激活测定被用于测量抗体对内部信号传导或细胞表面标记物的诱导能力。
在一些实施方案中，所述T细胞激活测定被用于评估抗体对细胞扩增的诱导能力。
在一些实施方案中，所述T细胞激活测定被用于评估抗体对细胞因子分泌的诱导能力。
在一些实施方案中，所述T细胞激活测定测量了CD25的表达以确定抗体的激活能力。
在一些实施方案中，用荧光标记的抗CD25抗体测量所述CD25表达。
在一些实施方案中，所述T细胞激活测定测量钙信号传导以确定抗体的激活能力。
在一些实施方案中，所述T细胞激活测定使用钙敏感性荧光团来测量所述钙信号传导。
在一些实施方案中，所述钙敏感性荧光团选自Fluo-4AM、Fura-2AM和Indo-1AM。
在一些实施方案中，所述T细胞激活测定包括T细胞和抗体分泌细胞(ASC)的混合物。
在一些实施方案中，所述T细胞和ASC的混合物的比例为2:1至12:1。
在一些实施方案中，所述T细胞和ASC的混合物的比例为5:1。
在一些实施方案中，所述ASC为B细胞。
在一些实施方案中，所述T细胞和ASC的混合物还包含T细胞激活珠和抗体捕获珠。
在一些实施方案中，所述T细胞纯化自外周血。
在一些实施方案中，用于鉴定所述至少一个目的微毛细管的信号相比基线和/或对照样品的信号增加至少10％至10,000％或更多。
在一些实施方案中，用于鉴定所述至少一个目的微毛细管的信号相比基线和/或对照样品的信号增加至少10％或更多。
在一些实施方案中，与基线和/或对照相比，用于鉴定所述至少一个目的微毛细管的信号的增加代表统计学上的显著增加。
附图简述
图1A-图1C示意性地示出了示例性微毛细管筛选测定的步骤。在每个图中左边的图示为从单个微毛细管的侧面观察的横截面视图。在每个图中右边的图示为微毛细管阵列的一个子部分的仰视图。在每种情况下的阴影旨在说明电磁信号(如荧光)。
图2A-图2C显示了说明针对哺乳动物细胞的杂交瘤筛选的微毛细管阵列的子部分的仰视图，其中细胞使用明场(图2A)、LiveGreen(图2B)或荧光抗小鼠二级抗体(图2C)对细胞成像。
图3显示了在4小时孵育过程中含有A431靶细胞和杂交瘤细胞的微毛细管的图像。
图4A-图4B显示了针对哺乳动物细胞突出表达和不表达酵母细胞的微毛细管阵列的子部分的图像，其中细胞使用明场(图2A)或荧光抗体(图4B)对细胞成像。
图5A-图5G示出了在6天的过程中在微毛细管阵列中永生化的人细胞的生长。
图6A-图6E为设计用于进行本公开的筛选方法的显微镜系统的不同视图。
图7显示了使用本发明的细胞(包括哺乳动物或酵母)的表达和与哺乳动物细胞结合的示例性实施方案。四幅图中的每一幅都代表随时间变化的一个微毛细管微腔。
图8A-图8B显示了使用本发明的细胞(包括哺乳动物或酵母)的表达和与2种或更多种哺乳动物细胞类型结合的示例性实施方案。8A)四幅图中的每一幅都代表随时间变化的一个微毛细管微腔。8B)提供来自示例性测定实施方案的潜在的读出。
图9显示了通过实施例6中所述的示例性测定产生的示例性荧光和明场场数据。
图10显示了使用本发明的细胞(包括哺乳动物或酵母)的表达和与固体支持物(如珠)上的固定化靶标结合的示例性实施方案。四幅图中的每一幅都代表随时间变化的一个微毛细管微腔。
图11显示了使用本发明的细胞(包括哺乳动物或酵母)的表达和功能性报告子应答的示例性实施方案。四幅图中的每一幅都代表随时间变化的一个微毛细管微腔。报告子可以包括任何可检测的报告子，包括例如GFP、YFP和/或RFP，以及本文所述或本领域已知的任何荧光团。
图12提供了IgG1、IgG2、IgG3和IgG4序列的实例。
图13A-图13B。数据提供了A)来自实施例7的滴定实验的珠的图像。B)显示最佳信号范围的图为约1:500-1:5000(制造商推荐范围的较低范围)。
图14.筛选针对细胞表面靶标的全长可溶性抗体的总结。
图15.来自高通量形态学和荧光筛选的数据。
图16.用于本发明系统的三种功能筛选。
图17.数据表明本文所述的集成平台系统能够精确识别稀有细胞。
图18.来自单OmniChicken的抗原特异性B细胞分析的数据。OmniChicken完全表达人类高度多样化的抗体库。来自人和小鼠的遗传差异允许更多的不同表位覆盖。允许深度免疫分布，这将潜在地导致一组更多样的功能性抗体。所示的示例性测定：在用颗粒蛋白前体免疫后对抗原特异性抗体库进行分析。
图19.B细胞测定。顶部：测定条件。底部：示例性数据/读出。
图20.与B细胞测定有关的结合分析。
图21.涉及B细胞测定的定量和分选。
图22.单细胞VH/VK分离和测序。每个细胞的串接的HCDR3-LCDR3之间的成对距离。
图23.更深刻的表征鉴定了新的克隆型家族。筛选鉴定了大多数通过GEM测定鉴定的克隆。鉴定了多个新的克隆型家族。
图24.抗原特异性克隆具有高亲和力和广泛的表位覆盖。已发现克隆的子集将配体表达为scFv-Fc。通过Carterra LSA(亲和力和表位结合数据)进行表征。簇映射到颗粒蛋白前体的不同子域，具有7个子域的广泛覆盖。正在对新发现的克隆簇进行进一步验证。
图24.抗原特异性克隆具有高亲和力和广泛的表位覆盖。已发现克隆的子集将配体表达为scFv-Fc。通过Carterra LSA(亲和力和表位结合数据)进行表征。簇映射到颗粒蛋白前体的不同子域，具有7个子域的广泛覆盖。正在对新发现的克隆簇进行进一步验证。
图25.代表性的B细胞筛选结果。
图26.常规的xPloration T细胞激活测定类别。
图27.用B细胞激活T细胞(CD25的表面表达)。
图28.用B细胞激活T细胞(钙信号传导)。当通过钙信号传导测量时，人T细胞激活。
发明详述
微毛细管阵列最近被用于具有大量生物样品的高通量分析和蛋白质工程化的方法中，例如被称为“微毛细管单细胞分析和激光提取”或“μ规模(μSCALE)”的方法中。参见Chen等人，(2016)Nature Chem.Biol.12:76-81；DOI:10.1038/NCHEMBI0.1978。这种方法依赖于微毛细管阵列内的单细胞的空间分隔，并因此能够对微毛细管阵列的每个微毛细管内的单独样品进行重复成像、细胞生长和蛋白表达。因此，该技术能够对微毛细管阵列内的百万或数百万个样品进行大量平行、定量的生物化学和生物物理测量，例如，在分析从酵母、细菌或分布在整个阵列中的其它合适细胞表达的百万或数百万个蛋白质变体中。有利的为，该方法允许对多个样品同时进行时间分辨动力学分析，以及基于靶向的表型特征对那些细胞进行分选。
用于生物变体群的定量生物化学和生物物理学分析的μ规模方法和设备的发展也已报道于美国专利申请公开第2016/0244749A1号中，其通过引用整体并入本文。然而，根据μ规模方法提取所期望的微毛细管的内容物需要在每个样品中包含辐射吸收材料并将电磁辐射从脉冲激光器引导至该材料中，从而增加了提取方法的复杂性。此外，微腔阵列中生物变体筛选的早期方法依赖于向阵列样品中加入微粒以部分或完全抑制电磁辐射进入和离开样品，从而使从缺乏所期望结合活性的微腔发射的信号最小化。参见美国专利申请公开第U.S.2014/0011690A1号。在本公开的一些方面，筛选方法不依赖于这些附加的样本组件或操作，从而简化和提高了筛选技术的效率。
在这些方法的具体应用中，并且如本文将更详细公开的，靶分子可以被固定在表面(如颗粒(例如，磁性颗粒)、细胞或微毛细管壁的表面)上。然后，在这些方法中，变异蛋白和靶分子之间的相互作用可以通过几种方法测量，包括利用可检测抗体的方法和测量在靶细胞内产生的可检测信号的方法。应当理解，此类方法可以被用于高通量筛选以发现与靶分子(例如细胞或其它表面上的靶分子)结合的蛋白质变体。
筛选的方法
因此，在一些方面，本公开提供了筛选变异蛋白群的方法，其包括以下步骤：
提供包含多个微毛细管的微毛细管阵列，每个微毛细管包含变异蛋白、固定化靶分子和报告子元件，其中所述变异蛋白以特定亲和力与所述固定化靶分子缔合；和
测量来自至少一种报告子元件的信号，所述信号指示至少一种变异蛋白与至少一种固定化靶分子的缔合以鉴定至少一个目的微毛细管。
在这些方法中，微毛细管阵列优选包括多个纵向熔接毛细管(例如熔接二氧化硅毛细管)，尽管在阵列中可以使用任何其他合适材料，尽管在阵列中可以利用任何其它合适的材料。参见例如PCT国际专利公开第WO2012/007537号和第WO2014/008056号，其公开内容通过引用整体并入本文。此类阵列可以例如通过将数百万或数十亿的二氧化硅毛细管捆扎在一起并通过热处理将它们熔接在一起来制造，尽管也可以采用其它合适的制造方法。熔接过程可以包括例如以下步骤：i)加热在张力下被拉制成单包层光纤的毛细管单拉制玻璃；ii)通过捆扎、加热和拉制由所述单拉制玻璃产生毛细管多拉制单毛细管；iii)通过另外的捆扎、加热和拉制由多拉制单毛细管产生毛细管多-多拉制多毛细管；iv)通过堆叠在压制块中由多-多拉制多毛细管产生拉制玻璃的块组件；v)通过用热和压力处理由所述块组件产生块压块；以及vi)通过以精确的长度(例如1mm)切割块压制块来产生块成形块。
在一些实施方案中，制造方法还包括对二氧化硅毛细管进行切片，从而形成非常高密度的玻璃微毛细管阵列。在一些实施方案中，微毛细管阵列可以被切割至约1毫米的高度，但甚至可以预期更短的微毛细管阵列，包括10μm高度或甚至更短的阵列。在一些实施方案中，预期甚至更长的微毛细管阵列，包括10mm或甚至更长的阵列。
此类方法形成非常高密度的微毛细管阵列，其适用于本发明的方法。在示例性的阵列中，每个微毛细管具有大约5μm的直径和大约66％的开放空间(即，表示每个微毛细管的腔)。在一些阵列中，开放阵列的比例为约50％至约90％的范围内(例如约60％至75％)，诸如由Hamamatsu提供的具有约67％的开放面积的微毛细管阵列。在一个具体实例中，具有5μm直径微毛细管和大约66％开放空间的10×10cm阵列具有总共约3.3亿个微毛细管。
在各种实施方案中，阵列中的每个微毛细管的内径为大约1μm至500μm的范围。在一些阵列中，每个微毛细管的内径可以为大约1μm至300μm范围；任选地为大约1μm至100μm；进一步任选地为大约1μm至75μm；进一步任选地为大约1μm至50μm；并且进一步任选地为大约5μm至50μm。
在一些微毛细管阵列中，阵列的开口面积占开口面积(OA)的至多90％，使得当孔径在1μm至500μm变化时，每cm阵列的微毛细管的数量在大约460个至1100万个以上变化。在一些微毛细管阵列中，阵列的开口面积占开口面积的约67％，使得当孔径在1μm至500μm变化时，每平方cm阵列的微毛细管的数量在大约340个至800,000个以上变化。
在一些实施方案中，孔径为1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、250μm、350μm或500μm。在一些实施方案中，孔径为5μm至500μm。
在一些实施方案中，孔径为10μm至450μm。在一些实施方案中，孔径为50μm至500μm。在一些实施方案中，孔径为100μm至500μm。在一些实施方案中，孔径为250μm至500μm。在一些实施方案中，孔径为350μm至500μm。在一些实施方案中，孔径为100μm至450μm。
在一些实施方案中，孔径为250μm至450μm。
在一些实施方案中，每平方cm阵列的微毛细管的数量为大约400；500；1000；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；7,000；8,000；9,000；10,000；20,000；50,000；100,000；200,000；300,000；400,000；500,000；600,000；700,000；或800,000个。在一些实施方案中，每平方cm阵列的微毛细管的数量在大约500至800,000个变化。在一些实施方案中，每平方cm阵列的微毛细管的数量在大约1000至700,000个变化。在一些实施方案中，每平方cm阵列的微毛细管的数量在大约2000至600,000个变化。在一些实施方案中，每平方cm阵列的微毛细管的数量在大约10,000至800,000个变化。在一些实施方案中，每平方cm阵列的微毛细管的数量在大约10,000至700,000个变化。在一些实施方案中，每平方cm阵列的微毛细管的数量在大约50,000至800,000个变化。在一些实施方案中，每平方cm阵列的微毛细管的数量在大约50,000至700,000个变化。在一些实施方案中，每平方cm阵列的微毛细管的数量在大约100,000至700,000个变化。在一些实施方案中，每平方cm阵列的微毛细管的数量在大约100,000至600,000个变化。在一些实施方案中，每平方cm阵列的微毛细管的数量在大约100,000至500,000个变化。在一些实施方案中，每平方cm阵列的微毛细管的数量在大约500,000至800,000个变化。
在一个具体实施方案中，可以通过将数十亿个二氧化硅毛细管结合，然后通过热处理将它们熔接在一起来制造微毛细管阵列。在此之后，切出薄片(0.5mm或更大)以形成非常高长径比的玻璃微毛细管阵列。阵列也可以商购，诸如从Hamamatsu Photonics K.K.(日本)、Incom有限公司(马萨诸塞州)、Photonis technologies、S.A.S.(法国)有限公司以及其它。在一些实施方案中，阵列的微毛细管在一端用附接于阵列的固体基底封闭。
本发明筛选方法的微毛细管阵列可以包括阵列内的任何数量的微毛细管。在一些实施方案中，微毛细管阵列包括至少100,000、至少300,000、至少1,000,000、至少3,000,000、至少10,000,000个或甚至更多个微毛细管。在一些实施方案中，阵列包括至少100,000、至少200,000、至少300,000、至少400,000、至少500,000、至少600,000、至少700,000、至少800,000、至少1,000,000、至少1,500,000、至少2,000,000、至少2,500,000、或至少3,000,000个或更多个微毛细管。阵列内微毛细管的数量优选根据待筛选的变异蛋白库的大小来选择。
如上所述，在本发明筛选方法中使用的微毛细管阵列中的每个毛细管包含变异蛋白、固定化靶分子和报告子元件，其中变异蛋白为进行筛选方法的变异蛋白群中的一种。变异蛋白群可以为可以适当地分布在微毛细管阵列内的任何蛋白群。理想地，变异蛋白群分布在微毛细管阵列中，使得每个微毛细管包含少量不同的变异蛋白，优选每个微毛细管仅包含单个不同的变异蛋白。重要的是，选择与固定化靶分子组合的变异蛋白群，使得群中的至少一些蛋白可以以特定的亲和力与固定化靶分子缔合，使得通过测量来自报告子元件的信号可以检测该缔合。
如本文所用的术语“蛋白质”是指全长蛋白质或多肽序列及其片段。此类片段可以包括保留功能活性(如例如结合活性)的片段。术语“蛋白质”和“多肽”在本公开全文中可互换使用，并且包括通过肽键共价连接的氨基酸链，其中多肽中的每个氨基酸可以被称为“氨基酸残基”。术语“蛋白质”或“多肽”的使用不应被认为受限于任何特定长度的多肽(例如任何特定数量的氨基酸残基)。主题蛋白可以包括具有非肽修饰(诸如翻译后修饰，其包括糖基化、乙酰化、磷酸化、硫酸化等)或其它化学修饰(如烷基化、乙酰化、酯化、PEG化等)的蛋白。另外的修饰(如多肽序列中包含非天然氨基酸或氨基酸残基之间的非肽键)也应被认为在术语“蛋白质”或“多肽”的定义范围内。
变异蛋白群优选为具有微小变化的蛋白群，例如每其中个蛋白具有稍微不同的氨基酸序列的蛋白群。因此，筛选测定可以鉴定具有所期望性质的变异蛋白序列。因为可以在显微镜下以如此大的数量进行筛选，所以可以在相对短的时间内分析大量的变异蛋白。
术语“抗体”以最广泛的意义使用，并且包括，例如完整的免疫球蛋白或抗原结合部分。抗原结合部分可以通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割产生。因此，术语抗体包括两条重链和两条轻链的常规四聚抗体，以及抗原结合片段(如Fv、Fab和scFv)。在一些情况下，本发明提供了包括本文概述的至少一个抗原结合结构域的双特异性抗体。
变异蛋白和/或变异多肽可以包括但不限于分泌的蛋白。在一些实施方案中，分泌的蛋白来自重组蛋白和/或多肽库。在一些实施方案中，分泌的蛋白来自重组蛋白和/或多肽库。在一些实施方案中，分泌的蛋白来自哺乳动物细胞系的重组蛋白和/或多肽库。在一些实施方案中，重组蛋白和/或多肽库包括全长哺乳动物抗体。在一些实施方案中，重组蛋白和/或多肽库包括全长哺乳动物抗体，其包括IgG1、IgG2和IgG4抗体及其变体。在一些实施方案中，重组蛋白和/或多肽库包含全长人抗体。在一些实施方案中，重组蛋白和/或多肽库包括全长人抗体，其包括IgG1、IgG2和IgG4抗体。在一些实施方案中，重组蛋白和/或多肽库包括全长小鼠抗体。在一些实施方案中，重组蛋白和/或多肽库包括全长小鼠抗体，包其括IgG1、IgG2和IgG4抗体。在一些实施方案中，重组蛋白和/或多肽库包括全长大鼠抗体。在一些实施方案中，重组蛋白和/或多肽库包括全长大鼠抗体，其包括IgG1、IgG2和IgG4抗体。在一些实施方案中，重组蛋白和/或多肽库包括抗体片段(Fab)。在一些实施方案中，重组蛋白和/或多肽库包含单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，重组蛋白和/或多肽库包括天然蛋白配体。在一些实施方案中，重组蛋白和/或多肽库包括针对确定的靶蛋白和/或多肽的天然蛋白配体。在一些实施方案中，重组蛋白和/或多肽库包括靶抗体和/或其片段。在一些实施方案中，重组蛋白和/或多肽库包括靶抗体重链和/或其片段，诸如可变重链。在一些实施方案中，重组蛋白和/或多肽库包括靶抗体轻链和/或其片段，诸如可变轻链。在一些实施方案中，本发明的系统允许VH/VL(可变重链和可变轻链)的精确配对。
在一些实施方案中，微毛细管阵列中的每个微毛细管包含与变异蛋白群不同的0至5个变异蛋白。在具体的实施方案中，微毛细管阵列中的每个微毛细管与变异蛋白群不同的包含0至4、0至3、0至2或甚至0至1个变异蛋白。应当理解，变异蛋白群中的不同变异蛋白在它们的分子结构上是不同的，无论是在它们的氨基酸序列上还是在蛋白的一些其它化学修饰上都是不同的。
应当理解，每个微毛细管将通常包含许多拷贝的相同变异蛋白，这取决于特定变异蛋白的来源和表达水平(见下文)。在一些实施方案中，每个微毛细管将包含数千、数万、数十万、数百万、数十亿、或甚至更多的特定变异蛋白分子，这取决于变异蛋白如何递送到微毛细管或在微毛细管内表达。在一些实施方案中，变异蛋白可以结合一个、两个、三个或四个或更多个靶分子。在一些实施方案中，变异蛋白可以结合一个靶分子。在一些实施方案中，变异蛋白可以结合两个靶分子。在一些实施方案中，变异蛋白可以结合三个靶分子。在一些实施方案中，变异蛋白可以结合四个靶分子。在一些实施方案中，变异蛋白可以结合多于四个靶分子。在一些实施方案中，该测定可以可替代地用于筛选结合靶蛋白的小鼠和人(或动物的其它组合)变体的抗体，即发现“交叉反应性”抗体。例如，微毛细管内染色的细胞的存在和染色的珠的存在表明抗体的存在，所述抗体结合“靶蛋白”(例如，鼠靶标)并且还结合“靶蛋白类似物”(例如，人靶标)，以便鉴定结合小鼠和人靶标的抗体。例如，微毛细管内染色细胞的存在和染色珠的存在表明存在与“靶蛋白”(例如食蟹猴靶标)结合并且还与“靶蛋白类似物”(例如人靶标)结合的抗体，以便鉴定与食蟹猴和人靶标结合的抗体。
变异蛋白群通常使用生物表达系统中的遗传库产生，例如在体外(即，无细胞)表达系统中或在体内或细胞表达系统中。示例性的细胞表达系统包括例如动物系统(例如哺乳动物系统)、真菌系统(例如酵母系统)、细菌系统、昆虫系统或植物系统。在具体的实施方案中，表达系统为哺乳动物系统或酵母系统。在具体的实施方案中，表达系统为禽类系统(例如，鸡类系统)。表达系统，无论是细胞的还是无细胞的，通常包含编码变异蛋白群的遗传物质的库。细胞表达系统提供了具有所期望表型的细胞(例如表达特定的目的变异蛋白的细胞)的优点，诸如能够与高亲和力的固定化靶分子结合的变异蛋白可以生长和增殖，从而促进和简化细胞表达的目的蛋白的鉴定和表征。在一些实施方案中，生物表达系统包括哺乳动物细胞系。在一些实施方案中，哺乳动物细胞系选自CHO-K1、CHO-S、HEK293T和/或这些细胞类型的任何衍生物。在一些实施方案中，哺乳动物细胞系为CHO-K1。在一些实施方案中，哺乳动物细胞系为CHO-S。在一些实施方案中，哺乳动物细胞系为HEK293T。在一些实施方案中，哺乳动物细胞系选自人、小鼠和/或大鼠杂交瘤细胞系。在一些实施方案中，哺乳动物细胞系为人杂交瘤细胞系。在一些实施方案中，哺乳动物细胞系为小鼠杂交瘤细胞系。在一些实施方案中，哺乳动物细胞系为大鼠杂交瘤细胞系。
编码大的变异蛋白群的遗传库在生物工程化领域为众所周知的。这种库通常用于依赖于定向进化过程的系统中，以鉴定具有有利性质的蛋白质，所述性质为如与靶分子的高亲和性结合、稳定性、高表达或特定的光谱(例如荧光)、或酶活性。通常，库包括与来自宿主表达系统的序列的遗传融合，例如指导亚细胞定位的蛋白片段，其中为了变异蛋白群的活性筛选的目的，表达的变异融合蛋白群被靶向片段引导至细胞或病毒颗粒的特定位置。如本领域所熟知的，可以使用常规生物工程化技术产生大量变异蛋白(例如，106个变体、108个变体、1010个变体、1012、个变体、或甚至更多个变体)。此类库可以包括本文所述的任何变异蛋白，其包括抗体、抗体片段、单链可变片段或天然蛋白配体。在一些实施方案中，本发明的系统允许VH/VL(可变重链和可变轻链)的精确配对。
因此，在一些实施方案中，变异蛋白为可溶性蛋白，例如由细胞表达系统分泌的可溶性蛋白。示例性可溶性变异蛋白包括抗体和抗体片段、可替代蛋白支架(如二硫键键合肽支架)、细胞表面受体蛋白的细胞外结构域、受体配体(如例如G-蛋白偶联受体配体)、其它肽激素、凝集素等。有利地，在本发明方法中筛选的结合活性的变异蛋白不需要与表达它们的细胞或病毒共价连接，以便在筛选测定后鉴定，因为具有所期望结合活性的变异蛋白和表达它的细胞在整个测定中保持共定位在相同的微毛细管中。分离所期望微毛细管的内容物，随后增殖负责表达所期望变异蛋白的细胞或病毒克隆，从而能够鉴定和表征该蛋白。与筛选测定不同，其中通过蛋白质与细胞或病毒颗粒表面上的分子的融合来展示目的变异蛋白质，在本发明的筛选方法中鉴定的变异蛋白质不需要在鉴定后以任何方式被改变。因此，在筛选中观察到的变异蛋白的活性更可能代表那些蛋白在其后续应用中的实际活性。
然而，在其它实施方案中，可能期望变异蛋白为膜相关蛋白，例如与表达系统中的细胞或病毒颗粒表面保持缔合的蛋白。当变异蛋白及其靶分子介导生物组织内两个细胞之间的相互作用时，可能期望细胞相关变异蛋白的筛选。在筛选中，针对细胞相关变异蛋白与常规的“非可药化的”蛋白靶标(如例如，G-蛋白偶联受体或离子通道)相互作用的能力筛选也是可期望的。
除了变异蛋白之外，本发明筛选方法的微毛细管阵列中的每个微毛细管还包含固定化靶分子。固定化靶分子用作筛选测定的变异蛋白的潜在结合配偶体。与变异蛋白群不同，其中每个微毛细管理想地含有具有稍微不同序列的变异蛋白，固定化靶分子理想地在阵列的每个微毛细管中具有相同的分子结构。在一些实施方案中，在将变异蛋白添加至微毛细管之前，变异蛋白与另一试剂或分子(例如，靶分子)之间不存在结合或其它相互作用。在一些实施方案中，变异蛋白与靶分子之间的相互作用发生在微毛细管和/或微腔内。
在一些实施方案中，靶分子为靶蛋白或多肽、靶核酸、靶碳水化合物、靶脂质或这些靶分子中两种或更多种的组合。例如，在一些实施方案中，靶分子可以为脂质修饰的或糖基化的蛋白。在一些实施方案中，靶分子被固定在表面上。在更具体的实施方案中，靶分子被固定在细胞(如靶细胞)的表面、珠的表面、微毛细管壁的表面、或其它合适的表面上。在其它更具体的实施方案中，靶分子为天然蛋白，例如被固定在细胞表面上的天然蛋白。在其它更具体的实施方案中，靶分子被固定在被配置为通过重力沉降而沉积在微毛细管中的表面上。在一些实施方案中，采用一个、两个、三个或四个或更多个靶分子，以鉴定与一个、两个、三个或四个或更多个靶分子结合的变体。在一些实施方案中，靶分子被分别包含在单独的和不同的微毛细管中。在一些实施方案中，靶分子被分别包含在单个阵列中的单独的和不同的微毛细管中。在一些实施方案中，靶分子被分别包含在一个或多个阵列内的单独的和不同的微毛细管中。在一些实施方案中，靶分子一起被包含在单个微毛细管中。在一些实施方案中，靶分子一起被包含在单个阵列内的单个微毛细管中。在一些实施方案中，变异所结合的一个、两个、三个或四个或更多个靶分子为原始靶分子的衍生物或变体，其包括化学修饰、二级翻译后修饰或序列同一性变体(包括例如与原始核酸或氨基酸靶序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的变体)。
如前所述的，在本公开的方法中，变异蛋白与固定化靶分子在微毛细管中以特定亲和力缔合。重要的是，对于目的变异蛋白，这种亲合性应该足够强，使得可以通过来自报告子元件的信号来测量该缔合。如本领域普通技术人员所熟知的，结合亲和力通常通过解离常数(Kd)来评估，其中解离常数越低，亲和力越高。在一些实施方案中，目的变异蛋白和固定化靶分子之间的缔合显示在毫摩尔至微摩尔范围内的解离常数。在具体的实施方案中，缔合显示从微摩尔至高纳摩尔的解离常数(即，10-6M至10-8M)。在更具体的实施方案中，缔合显示从低纳摩尔至高皮摩尔的解离常数(即，10-8M至10-10M)。在甚至更具体的实施方案中，缔合显示在皮摩尔范围内(即，10-10M至10-12M)或甚至更低的解离常数。在一些实施方案中，第一细胞表达并分泌变异蛋白或多肽，并且第二细胞包含靶标，使得第一细胞结合第二细胞。在一些实施方案中，第二细胞表达靶标。在一些实施方案中，用靶标标记第二细胞。在一些实施方案中，第一细胞与第二细胞在微毛细管中结合。在一些实施方案中，第一细胞与第二细胞在微毛细管和/或微腔中结合。
除了变异蛋白和固定化靶分子之外，本发明筛选方法的微毛细管阵列中的每个微毛细管还包含报告子元件。重要的时，报告子元件提供指示变异蛋白与固定化靶分子缔合的可测量信号，并因此用于鉴定含有目的变异蛋白的微毛细管。
在一些实施方案中，报告子元件为标记的抗体或能够结合变异蛋白群中的每个变异蛋白的其它分子。更具体地，报告子元件为荧光标记的抗体或其它结合分子。
在一些实施方案中，标记的抗体为标记的一级抗体或标记的二级抗体。为了本公开的目的，一级抗体通常被认为为直接结合目的抗原的抗体，而二级抗体通常被认为是为了标记一级抗体而结合一级抗体上的恒定区的抗体。因此，二级抗体经常用荧光团或其它可检测的标记物标记，或者用能够产生可检测信号的酶标记。它们通常对来自不同物种的一级抗体具有特异性。例如，如本领域普通技术人员所理解的，山羊或其它动物物种可用于产生抗小鼠、鸡、兔或几乎不同于来自该动物物种的抗体的任何一级抗体的二级抗体。在具体的实施方案中，标记的抗体为荧光抗体或酶联抗体。
在一些方法实施方案中，例如在图11A-1C所示筛选方法中，变异蛋白介导报告子元件与靶分子的缔合，在本实例中，靶分子为靶细胞表面上的靶分子。如图1B所示的，其中变异蛋白(这里被称为“分泌的蛋白”)对其靶细胞上的靶分子具有足够的亲和性，使得变异蛋白在微毛细管溶液的条件下与靶细胞缔合。如图1C所示的，报告子元件(这里被称为“荧光检测抗体”)与变异蛋白结合，理想地在不影响变异蛋白对靶分子的亲和力的表位结合。
如本领域普通技术人员将理解的，当在本发明的筛选方法中使用可溶性报告子元件(如荧光抗体)时，由微毛细管内的溶液中保持游离的任何过量报告子元件所发射的信号(即，不与变异蛋白结合或与不与靶分子结合的变异蛋白结合)不应太高以至于它淹没了通过变异蛋白与靶分子缔合的报告子元件(参见例如，图1C中所示的未缔合的荧光检测抗体)的信号。然而，此类背景信号可以通过限制标记的抗体或其它报告子元件在微毛细管溶液中的浓度而最小化。此外，在使用荧光显微镜测量来自筛选方法的信号的情况下，配置显微镜以成像较窄的限制靶分子的位置景深(例如，当靶细胞通过重力沉降已经在那里沉积时的微毛细管的底部)可以最小化来自不与靶分子缔合的报告子元件的背景信号。
在其它实施方案中，报告子元件为细胞内报告子元件，其产生与结合事件有关的可检测信号，所述结合事件如例如变异蛋白与固定化靶分子(例如细胞表面上的受体或其它靶分子)的缔合。在这些实施方案中，报告子元件可以包括完整的细胞通路，如例如细胞内信号传导通路。此类通路应该包括或被工程化为包括可检测信号作为该通路的下游读出。与图1A-1C中所示的测定相反，其中可检测信号与靶细胞的外表面结合，这些实施方案中的可检测信号通常在靶细胞内产生。
已经开发了许多细胞内信号传导通路用于高通量筛选测定，特别为用于药物发现筛选，并且可以适用于本发明的测定。参见，例如Michelini等人，(2010)Anal.Bioanal.Chem.398:227-38。特别地，其中与细胞表面上的靶分子的结合事件导致产生可测量信号(特别是荧光信号)的任何细胞测定可以被用作本发明测定中的报告子元件。优选地，可将细胞工程化以在其表面上表达目标靶分子，使得特定变异蛋白与靶分子的结合以及随后的细胞内信号传导通路的激活导致从报告子元件产生可检测信号，从而使得能够将微毛细管鉴定为阳性命中。绿色荧光蛋白(GFP)或各种变异荧光蛋白中的任一种的表达通常在此类细胞测定中被用作读出，并且在本方法中可以被用作报告子元件终点。可替代地，如本领域普通技术人员所熟知的，信号读出可以由产生生物发光信号的萤光素酶或其它相关酶提供。参见例如，Kelkar等人，(2012)Curr.Opin.Pharmacol.12:592-600。报告子元件还可以包括RFP(红色荧光蛋白)以及YFP(黄色荧光蛋白)及其变体。来自细菌和植物系统的其它公知的酶促报道子包括β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、β-葡萄糖醛酸酶(GUS)等，其可适用于具有合适的显色底物的本发明法人筛选测定。使用萤火虫荧光素酶和GFP的转录报告子已经被广泛用于研究转录因子的功能和调控。它们同样可适用于本发明的筛选测定。示例性细胞内信号传导系统可商购获得，例如来自Qiagen的CignalTM报告子测定试剂盒(参见，例如，www.sabiosciences.com/reportorassays.php)，其可利用萤光素酶或GFP读出获得。此类系统可以被适当地被重新工程化以用于本发明的筛选方法。
应当理解，在表达变异蛋白之前和/或在将测定混合物递送到微毛细管阵列中之前，变异蛋白表达系统(特别是在表达系统为细胞表达系统的情况下)可以与固定化靶分子以及报告子元件(或负责产生固定化靶分子和/或报告子元件的合适的组分，诸如细胞组分)组合。在现有技术的微毛细管筛选系统中，通常将筛选测定的所有组分混合并以静态形式加载到微毛细管中，与现有技术的微毛细管筛选系统相比，此类方法有利地允许灵活和控制组分之间相互作用的时机。相反，本发明的方法通过允许细胞组分的生长、遗传组分的表达或两者，使结合测定的一些或全部组分能够在微毛细管内原位产生。在一些实施方案中，采用细胞培养基和/或生长剂以便在测定过程中维持细胞的健康。在一些实施方案中，包括促进细胞的代谢健康的组分。
还应该理解的是，在微毛细管内的筛选测定的每种组分的浓度(包括变异蛋白的浓度、固定化靶分子的浓度和报告子元件的浓度)可以根据测定所期望的进行调节，以便获得最佳的结果。具体地，可能期望调节变异蛋白和/或固定化靶分子的浓度以实现这些组分之间所期望的缔合水平。缔合水平也将取决于这些组分之间的特定亲和力，其中对于给定浓度的组分，较高的亲和力导致较高的缔合水平，而对于给定浓度，较低的亲和力导致较低的组分缔合水平。如本领域普通技术人员所理解的，可以同样调节报告子元件的浓度以获得最佳的信号输出水平。在一些实施方案中，所采用的报告子元件包括二级抗体，其包括可商购的那些抗体。在一些实施方案中，稀释范围为1:200-1:2000。在一些实施方案中，稀释范围为1:300-1:2000。在一些实施方案中，稀释范围为1:300-1:1500。在一些实施方案中，稀释范围为1:400-1:1500。在一些实施方案中，稀释范围为1:500-1:1500。在一些实施方案中，稀释范围为1:200-1:1000。在一些实施方案中，稀释范围为1:500-1:1000。在一些实施方案中，稀释范围为1:1000-1:2000。在一些实施方案中，稀释范围为1:1500-1:2000。在一些实施方案中，稀释为1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1000、1:1500或1:2000。在一些实施方案中，荧光团可以包括但不限于AlexaFluor3、AlexaFluor5、AlexaFluor350、AlexaFluor405、AlexaFluor430、AlexaFluor488、AlexaFluor500、AlexaFluor514、AlexaFluor532、AlexaFluor546、AlexaFluor555、AlexaFluor568、AlexaFluor594、AlexaFluor610、AlexaFluor633、AlexaFluor647、AlexaFluor660、AlexaFluor680、AlexaFluor700和AlexaFluor750(分子探针AlexaFluor染料，可从LifeTechnologies有限公司(USA))。在一些实施方案中，荧光团可以包括但不限于Cy染料，其包括Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7(可从GE Life Sciences或Lumiprobes获得)。在一些实施方案中，荧光团可以包括但不限于DyLight350、DyLight405、DyLight488、DyLight550、DyLight594、DyLight633、DyLight650、DyLight680、DyLight750和DyLight800(可从Thermo Science(USA)获得)。在一些实施方案中，荧光团可以包括但不限于FluoProbes390、FluoProbes488、FluoProbes532、FluoProbes547H、FluoProbes594、FluoProbes647H、FluoProbes682、FluoProbes752和FluoProbes782、AMCA、DEAC(7-二乙基氨基香豆素-3-羧酸)；7-羟基-4-甲基香豆素-3；7-羟基香豆素-3；MCA(7-甲氧基香豆素-4-乙酸)；7-甲氧基香豆素-3；AMF(4’-(氨甲基)荧光素)；5-DTAF(5-(4,6-二氯三嗪基)氨基荧光素)；6-DTAF(6-(4,6-二氯三嗪基)氨基荧光素)；6-FAM(6-羧基荧光素)、5(6)-FAM尸胺；5-FAM尸胺；5(6)-FAM乙二胺；5-FAM乙二胺；5-FITC(FITC异构体I；荧光素-5-异硫氰酸酯)；5-FITC尸胺；荧光素-5-马来酰亚胺；5-IAF(5-碘乙酰氨基荧光素)；6-JOE(6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素)；5-CR110(5-羧基罗丹明110)；6-CR110(6-羧基罗丹明110)；5-CR6G(5-羧基罗丹明6G)；6-CR6G(6-羧基罗丹明6G)；5(6)-羧基罗丹明6G尸胺；5(6)-羧基罗丹明6G乙二胺；5-ROX(5-羧基-X-罗丹明)；6-ROX(6-羧基-X-若丹明)；5-TAMRA(5-羧基四甲基罗丹明)；6-TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明)；5-TAMRA尸胺；6-TAMRA尸胺；5-TAMRA乙二胺；6-TAMRA乙二胺；5-TMR C6马来酰亚胺；6-TMR C6马来酰亚胺；TR C2马来酰亚胺；TR尸胺；5-TRITC；G异构体(四甲基罗丹明-5-异硫氰酸酯)；6-TRITC；R异构体(四甲基罗丹明-6-异硫氰酸酯)；丹酰尸胺(5-二甲基氨基萘-1-(N-(5-氨基戊基))磺酰胺)；EDANS C2马来酰亚胺；荧光胺；NBD；以及吡咯亚甲基及其衍生物。在一些实施方案中，所用的报告子元件可以为用AlexaFluor633标记的驴抗山羊IgG二级抗体。
在一些实施方案中，本发明筛选方法的微毛细管阵列中的每个微毛细管还包含用于改善细胞表达系统的存活力的一种或多种试剂。具体地，包括一种或多种试剂以防止在分离目的微毛细管的内容物的步骤期间(例如通过激光脉冲(见下文))的细胞损伤。在优选的实施方案中，试剂为甲基纤维素(例如0.001至10wt％)、右旋糖酐(例如0.5至10wt％)、普朗尼克F-68(例如0.01至10wt％)、聚乙二醇(“PEG”)(例如0.01至10wt％)、聚乙烯醇(“PVA”)(例如0.01至10wt％)等等。可替代地或此外，本发明筛选方法的微毛细管阵列中的每个微毛细管还可以包含生长添加剂，如例如50％条件生长培养基、25％标准生长培养基或25％血清。在一些实施方案中，将条件生长培养基处于条件下24小时。在一些实施方案中，添加的试剂为胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、硒、胰岛素样生长因子、或这些试剂或上述任何试剂的组合。
本公开的筛选方法优选包括测量来自至少一种报告子元件的信号的另外的步骤，所述信号指示至少一种变异蛋白与至少一种固定化靶分子的结合以鉴定至少一个目的微毛细管。在一些实施方案中，所测量的信号为荧光信号、吸收度信号、明场信号、暗场信号、相衬信号等。因此，测量步骤可以由适当的检测器装置(例如能够检测电磁辐射或任何其它适当信号的装置)进行。在具体实施方案中，测量步骤由显微镜(例如荧光显微镜或被配置为检测上述信号的任何其它显微镜)进行。
应当理解，在优选的实施方案中，在本发明的筛选方法中使用的微毛细管不包含能够抑制电磁辐射传输的微粒。换句话说，微毛细管优选地对入射在微毛细管阵列上的电磁辐射为完全透过的，特别是沿着微毛细管的纵轴。在其它优选的实施方案中，本发明筛选方法的微毛细管不包括磁性微粒或珠。在其它优选的实施方案中，本发明筛选方法的微毛细管不包含能够抑制电磁辐射传输的微粒、磁性微粒或磁珠。
在其它优选的实施方案中，本发明筛选方法中使用的微毛细管不包括电磁辐射吸收材料。然而，应当理解，在筛选方法中负责产生可测量信号的报告子元件的组分，例如荧光团抗体上的荧光团不应被认为是用于本发明该方面的电磁辐射吸收材料。
在一些实施方案中，本发明的方法还包括分离目的微毛细管的内容物的步骤。在具体的实施方案中，通过用激光脉冲目的微毛细管来分离目的微毛细管的内容物。更具体地，激光器可以为二极管激光器或二极管泵浦的Q开关Nd:YLF激光器。在一些实施方案中，激光可以对准微毛细管壁与包含在微毛细管中的样品之间的水玻璃界面。不希望受理论的束缚，据信在该界面处发射UV激光可以破坏通常将样品保持在微毛细管中的弯月面/水表面张力，从而允许样品通过重力从阵列中掉出。在其它实施方案中，通过激光触发的蒸汽力膨胀来分离目的微毛细管的内容物。在一些实施方案中，通过破坏微毛细管本身的玻璃来分离微毛细管的内容物。
在一些实施方案中，本发明的微毛细管筛选方法允许在向微毛细管添加组分的几分钟内筛选在变异蛋白与靶分子之间发生的反应和/或相互作用(包括结合相互作用)。在一些实施方案中，变异蛋白与靶分子之间的反应和/或相互作用在约1分钟至约10分钟内发生和/或可检测到。在一些实施方案中，变异蛋白与靶分子之间的反应和/或相互作用在约1小时至约6小时内发生和/或可检测到。在一些实施方案中，反应和/或相互作用在以下时间内发生：约1小时、约2小时、约4小时、约6小时、约10小时、约12小时、约16小时、约24小时、约36小时、或约48小时、小时分钟至约10分钟。在一些实施方案中，变异蛋白与靶分子之间的反应和/或相互作用在一段时间内发生和/或可检测到，使得微毛细管内的细胞为活的和健康的。在一些实施方案中，变异蛋白与靶分子之间的反应和/或相互作用在一段时间内发生和/或可检测到，使得微毛细管内的细胞为存活的。在一些实施方案中，细胞在从微毛细管和/或微腔去除后可以生长。在一些实施方案中，细胞在从微毛细管和/或微腔去除后为存活的。在一些实施方案中，变异蛋白与靶分子之间的反应和/或相互作用在微毛细管内发生。
用于筛选的系统
根据本发明的另一方面，提供了用于筛选变异蛋白群的系统，其包括：
包含多个微毛细管的阵列，每个微毛细管包含变异蛋白、固定化靶分子和报告子元件，其中所述变异蛋白以特定的亲和力与所述固定化靶分子缔合。以上详细描述了这些筛选装置的组件，并且可以将这些组件中的任何一个并入到用于筛选的系统中。
在一些实施方案中，筛选系统还包括光源和检测器。根据筛选系统中使用的特定报告子元件来选择光源和检测器。例如，在报告子元件产生荧光信号的情况下，光源提供适当波长的激发光以激发荧光探针。同样，检测器被选择为对由荧光探针发射的光的波长敏感的检测器。如本领域普通技术人员所理解的，光源和检测器例如可以为显微镜(如荧光显微镜)的组件，或者它们可以为单独的装置。
在一些实施方案中，筛选系统还包括提取装置，例如二极管激光器、二极管泵浦的Q开关激光器、或用于分离目的微毛细管的内容物的其它适当组件。
根据本发明方法的筛选变异蛋白群的示例性显微镜示于图6A-6E的附图中。图6A显示了从显微镜上方观察的透视图，示出了阵列保持阶段和样品回收阶段。图6B显示出了该装置的前视图。图6C显示了右侧视图。在图6D中提供了装置右侧的放大视图，详细示出了阵列保持阶段和样本回收阶段之间的关系。图6E提供了适用于本发明筛选系统的多阶段样品回收显微镜的各种组件的分解图。
对于相关领域的普通技术人员显而易见的为，在不脱离本发明的范围或其任何实施方案的情况下，可以对这里描述的方法和应用进行其它适当的修改和改编。现在已经详细描述了本发明，通过参考以下实施例将更清楚地理解本发明，所述实施例仅出于说明的目的而被包括在本文中，并且不旨在限制本发明。在一些实施方案中，在上述方法部分中所公开的任何方面也为容易的适用于本发明的系统。本发明的系统可以与本文所述的任何方法一起使用。
微腔阵列
在这些方法中，微腔阵列包括任何阵列，其包括单独的腔室，并且允许光透射通过阵列并到达检测器。在一些实施方案中，所述阵列为微毛细管阵列。在一些实施方案中，微毛细管阵列包括多个纵向熔接的毛细管(例如熔接的二氧化硅毛细管)，尽管在阵列中可以使用任何其它合适的材料。参见例如，2016年12月12日提交的美国申请第62/433,210号，2016年12月12日提交的美国申请第15/376,588号，PCT国际专利公开第WO2012/007537号和第WO2014/008056号，其全部公开内容通过引用整体并入本文。
此类阵列可以例如通过将数百万或数十亿的二氧化硅毛细管捆扎在一起并通过热处理将它们熔接在一起来制造，尽管也可以采用其它合适的制造方法。熔接过程可以包括例如以下步骤：i)加热在张力下被拉制成单包层光纤的毛细管单拉制玻璃；ii)通过捆扎、加热和拉制由所述单拉制玻璃产生毛细管多拉制单毛细管；iii)通过另外的捆扎、加热和拉制由多拉制单毛细管产生毛细管多拉制多毛细管；iv)通过堆叠在压制块中由多-多拉制多毛细管产生拉制玻璃的块组件；v)通过用热和压力处理由所述块组件产生块压块；以及vi)通过以精确的长度(例如1mm)切割块压制块来产生块成形块。
在一些实施方案中，制造方法还包括对二氧化硅毛细管进行切片，从而形成非常高密度的玻璃微毛细管阵列。在一些实施方案中，微毛细管阵列可以被切割至大约1毫米的高度，但是甚至可以预期更短的微毛细管阵列，其包括10μm高度或甚至更短的阵列。在一些实施方案中，预期甚至更长的微毛细管阵列，其包括10mm或甚至更长的阵列。
此类方法形成非常高密度的微毛细管阵列，其适用于本发明的方法中。在示例性的阵列中，每个微毛细管具有大约5μm的直径和大约66％的开放空间(即，表示每个微毛细管的腔)。在一些阵列中，开放阵列的比例为约50％至约90％的范围内(例如约60％至75％)，诸如由Hamamatsu提供的具有约67％的开放面积的微毛细管阵列。在一个具体实例中，具有5μm直径微毛细管和大约66％开放空间的10×10cm阵列具有总共约3.3亿个微毛细管。
在各种实施方案中，阵列中的每个微毛细管的内径为大约1μm至500μm的范围。在一些阵列中，每个微毛细管的内径可以为大约1μm至300μm范围；任选地为大约1μm至100μm；进一步任选地为大约1μm至75μm；进一步任选地为大约1μm至50μm；并且进一步任选地为大约5μm至50μm。
在一些微毛细管阵列中，阵列的开口面积占开口面积(OA)的至多90％，使得当孔径在1μm至500μm变化时，每cm阵列的微毛细管的数量在大约460个至1100万个以上变化。在一些微毛细管阵列中，阵列的开口面积占开口面积的约67％，使得当孔径在1μm至500μm变化时，每平方cm阵列的微毛细管的数量在大约340个至800,000个以上变化。在一些实施方案中，每平方cm阵列的微毛细管的数量为大约400；800；1000；2000；4000；5000；10,0000；25,000；50,000；75,000；100,000；200,000；300,000；400,000；500,000；600,000；700,000；800,000；900,000；1,000,000个或更多个。
在一个具体实施方案中，可以通过结合数十亿个二氧化硅毛细管，然后通过热处理将它们熔接在一起来制造微毛细管阵列。在此之后，切出薄片(0.5mm或更大)以形成非常高长径比的玻璃微毛细管阵列。阵列也可以商购，诸如从Hamamatsu Photonics K.K.(日本)、Incom有限公司(马萨诸塞州)、Photonis technologies、S.A.S.(法国)有限公司以及其它。在一些实施方案中，阵列的微毛细管在一端用附接于阵列的固体基底封闭。
本发明筛选方法的微毛细管阵列可以包括阵列内的任何数量的微毛细管。在一些实施方案中，微毛细管阵列包括至少100,000、至少300,000、至少1,000,000、至少3,000,000、至少10,000,000个或甚至更多个微毛细管。在一些实施方案中，微毛细管阵列包括至少100,000个。在一些实施方案中，微毛细管阵列包括至少200,000个微毛细管。在一些实施方案中，微毛细管阵列包括至少300,000个微毛细管。在一些实施方案中，微毛细管阵列包括至少400,000个微毛细管。在一些实施方案中，微毛细管阵列包括至少500,000个微毛细管。在一些实施方案中，微毛细管阵列包括至少600,000个微毛细管。在一些实施方案中，微毛细管阵列包括至少7500,000个微毛细管。在一些实施方案中，微毛细管阵列包括至少800,000个微毛细管。在一些实施方案中，微毛细管阵列包括至少900,000个微毛细管。在一些实施方案中，微毛细管阵列包括至少1,000,000个微毛细管。在一些实施方案中，微毛细管阵列包括至少2,000,000个微毛细管。在一些实施方案中，微毛细管阵列包括至少3,000,000个微毛细管。在一些实施方案中，微毛细管阵列包括至少4,000,000个微毛细管。在一些实施方案中，微毛细管阵列包括至少5,000,000个微毛细管。在一些实施方案中，微毛细管阵列包括至少10,000,000个微毛细管。在一些实施方案中，微毛细管阵列包括至少15,000,000个微毛细管。在一些实施方案中，微毛细管阵列包括至少120,000,000个微毛细管。微毛细管阵列内微毛细管的数量优选根据待筛选的变异蛋白库的大小来选择。
微腔阵列的厚度为约0.2mm(200μm)至约1mm且直径为约50μm至约200μm。在一些实施方案中，微腔阵列的厚度为约1.5mm且直径为约150μm。在一些实施方案中，微腔阵列的厚度为约2mm且直径为约200μm。在一些实施方案中，微腔阵列的厚度为约1mm且直径为约100μm。在一些实施方案中，微腔阵列的厚度为约1mm且直径为约10μm。在一些实施方案中，微腔阵列的直径为约1μm、5μm和/或10μm。在一些实施方案中，微腔阵列的直径为约10μm。
在本发明的方法中可以使用多种微腔阵列。本文提供了示例性的微腔阵列尺寸。在一些实施方案中，阵列内的微腔直径为约50μm至约200μm。在一些实施方案中，阵列内的微腔直径为约75μm至约150μm。在一些实施方案中，阵列内的微腔直径为约75μm至约125μm。在一些实施方案中，阵列内的微腔直径为约75μm至约110μm。在一些实施方案中，阵列内的微腔直径为约80μm至约110μm。在一些实施方案中，阵列内的微腔直径为约75μm至约150μm。在一些实施方案中，阵列内的微腔直径为约80μm、约90μm、约100μm或约110μm。在一些实施方案中，阵列内的微腔直径为约100μm。
在本发明的方法中可以使用多种微腔阵列。本文提供了示例性的样品体积。在一些实施方案中，每个微腔中的样品体积小于约500nL。在一些实施方案中，每个微腔中的样品体积为约5nL至约500nL。在一些实施方案中，每个微腔中的体积为约5nL至约400nL。在一些实施方案中，每个微腔中的体积为约5nL至约300nL。在一些实施方案中，每个微腔中的体积为约5nL至约200nL。在一些实施方案中，每个微腔中的体积为约5nL至约100nL。在一些实施方案中，每个微腔中的体积为约5nL至约90nL。在一些实施方案中，每个微腔中的体积为约5nL至约80nL。在一些实施方案中，每个微腔中的体积为约5nL至约70nL。在一些实施方案中，每个微腔中的体积为约5nL至约60nL。在一些实施方案中，每个微腔中的体积为约5nL至约50nL。在一些实施方案中，每个微腔中的体积为约5nL至约40nL。在一些实施方案中，每个微腔中的体积为约5nL至约30nL。在一些实施方案中，每个微腔中的体积为约5nL至约20nL。在一些实施方案中，每个微腔中的体积为约5nL至约10nL。在一些实施方案中，每个微腔中的体积为约5nL至约8nL。在一些实施方案中，每个微腔中的体积为约7nL至约8nL。在一些实施方案中，每个微腔中的体积为约7.8nL。在一些实施方案中，每个微腔中的体积为约70pL至约100pL。在一些实施方案中，每个微腔中的体积为约70pL至约90pL。在一些实施方案中，每个微腔中的体积为约70pL至约80pL。在一些实施方案中，每个微腔中的体积为约78.5pL。在一些实施方案中，每个微腔中的体积为约150fL至约1000fL。在一些实施方案中，每个微腔中的体积为约200fL至约1000fL。在一些实施方案中，每个微腔中的体积为约300fL至约1000fL。在一些实施方案中，每个微腔中的体积为约400fL至约900fL。在一些实施方案中，每个微腔中的体积为约500fL至约800fL。在一些实施方案中，每个微腔中的体积为约150fL至200fL。在一些实施方案中，每个微腔中的体积为约157fL。
在一些实施方案中，当使用细胞表达测定时，本发明筛选方法的微腔阵列中的每个微腔还包含改善细胞表达系统存活力的一种或多种试剂。具体地，包括一种或多种试剂以防止在分离目的微毛细管的内容物的步骤期间(例如通过激光脉冲(见下文))的细胞损伤。在优选的实施方案中，试剂为甲基纤维素(例如0.001wt％至10wt％)、右旋糖酐(例如0.5wt％至10wt％)、普朗尼克F-68(例如0.01wt％至10wt％)、聚乙二醇(“PEG”)(例如0.01wt％至10wt％)、聚乙烯醇(“PVA”)(例如0.01wt％至10wt％)等等。可替代地或此外，本发明筛选方法的微毛细管阵列中的每个微毛细管还可以包含生长添加剂，如例如50％条件生长培养基、25％标准生长培养基或25％血清。在一些实施方案中，将条件生长培养基处于条件下24小时。在一些实施方案中，添加的试剂为胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、硒、胰岛素样生长因子、或这些试剂或上述任何试剂的组合。
还应该理解的是，在微腔内的筛选测定的每种组分的浓度可以根据测定中的所期望的进行调节，以便获得最佳结果。具体地，可能期望调节蛋白、多肽、核酸、小分子和/或细胞的浓度以实现这些组分之间所期望的缔合水平。缔合水平也将取决于这些组分之间的特定亲和力，其中对于给定浓度的组分，较高的亲和力导致较高的缔合水平，而对于给定浓度，较低的亲和力导致较低的组分缔合水平。如本领域普通技术人员所理解的，可以同样调节各种组分的浓度以获得最佳的信号输出水平。
样品和/或库组分
可以根据本发明方法筛选的库包括包含多种分子以及它们的混合物和/或组合的任何库。在一些实施方案中，库包括包含生物材料的样品。在一些实施方案中，库包括包含多个一种或多种分子和/或细胞以及它们的混合物和/或组合的样品。在一些实施方案中，库包括包含多个一种或多种蛋白(包括抗体)、多肽、核酸、小分子、染料和/或细胞以及它们的混合物和/或组合的样品。在一些实施方案中，分子包括任何分子。在一些实施方案中，分子包括但不限于蛋白、多肽、核酸、小分子和/或染料以及它们的混合物和/或组合。在一些实施方案中，库包括包含生物材料的样品，所述生物材料包含多肽、核酸、小分子和/或细胞以及它们的混合物和/或组合。在一些实施方案中，库包含样品。在一些实施方案中，样品包括但不限于包含多肽、核酸、小分子、染料和/或细胞以及它们的混合物和/或组合的生物材料。在一些实施方案中，样品含有至少一个待筛选的分子和/或细胞。在一些实施方案中，样品含有至少一个至十个待筛选的分子和/或细胞以及它们的混合物和/或组合。在一些实施方案中，样品含有待筛选的多个分子和/或细胞以及它们的混合物和/或组合。在一些实施方案中，待筛选的分子被称为靶分子。在一些实施方案中，待筛选的细胞被称为靶细胞。
本文所提供的阵列允许由蛋白、多肽、核酸、小分子、染料和/或细胞以及它们的混合物和/或组合组成的库的筛选。在一些实施方案中，待筛选的靶分子为蛋白、多肽、核酸、小分子、染料、碳水化合物、脂质或这些靶分子中两种或更多种的组合。在一些实施方案中，蛋白和/或多肽选自酶、配体和受体。例如，在一些实施方案中，靶分子可以为脂质修饰的或糖基化的蛋白。在一些实施方案中，靶分子为天然蛋白。
如上所述的，在本发明筛选方法中使用的微腔阵列中的每个毛细管将含有不同的样品组分。此类样品组分可以包括但不限于蛋白、多肽、核酸、小分子、染料和/或细胞(即，靶分子和/或靶细胞)以及它们的混合物和/或组合。在一些实施方案中，用于筛选的库包含展现出区别特性的变异蛋白、变异多肽、变异核酸、变异小分子、变异染料和/或变异细胞。在一些实施方案中，变异蛋白、变异多肽、变异核酸、变异小分子、变异染料和/或变异细胞展现出区别特性，使得每个微腔包含含有与阵列内的其它微腔中的每个发现的样品不同的靶分子和/或靶细胞的样品。在一些实施方案中，阵列内的一个或多个微腔包含样品含有与阵列内的至少一个其它微腔中发现的样品相同的靶分子和/或靶细胞的样品(例如，作为用于比较的复制品)。
在一些实施方案中，在微腔阵列中待筛选的库中的蛋白质和/或多肽可以为变异蛋白和/或多肽。变异蛋白包括基于至少一种特性或特征可彼此区分的蛋白和多肽。在一些实施方案中，变异蛋白和/或多肽展现出不同的氨基酸序列，展现出不同的氨基酸序列长度，通过不同的方法产生/生成，展现出不同的活性，展现出不同的化学修饰，和/或展现出不同的翻译后修饰。在一些实施方案中，变异蛋白和/或多肽展现出不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，变异蛋白和/或多肽展现出不同的氨基酸序列长度。在一些实施方案中，变异蛋白和/或多肽通过不同的方法产生/生成。在一些实施方案中，变异蛋白和/或多肽展现出不同的活性。在一些实施方案中，变异蛋白和/或多肽展现出不同的化学修饰。在一些实施方案中，变异蛋白和/或多肽展现出不同的翻译后修饰。在一些实施方案中，变异蛋白为变异蛋白和/或多肽群中的一种，其经受筛选方法并使用本文所公开的微腔阵列进行分析。变异蛋白和/或多肽群可以为可以合适地分布在微毛细管阵列内的任何蛋白群。
在一些实施方案中，在微腔阵列中的待筛选库中核酸可以为变异核酸。变异核酸包括基于至少一种特性或特征可彼此区分的核酸。在一些实施方案中，变异核酸具有不同的核苷酸序列，具有不同的核苷酸序列长度，已经通过不同的方法产生/生成，具有不同的甲基化模式，具有不同的化学修饰，和/或展现出其它不同的修饰。在一些实施方案中，变异核酸具有不同的核苷酸序列。在一些实施方案中，变异核酸具有不同的核苷酸序列长度。在一些实施方案中，变异核酸已经通过不同的方法产生/生成。在一些实施方案中，变异核酸具有不同的甲基化模式。在一些实施方案中，变异核酸具有不同的化学修饰。在一些实施方案中，变异核酸展现出其它不同的修饰。在一些实施方案中，所述核酸为变异核酸群中的一种，其经受筛选方法并使用本文所公开的微腔阵列进行分析。变异核酸群可以为可以适当地分布在微毛细管阵列内的任何核酸群。
在一些实施方案中，在微腔阵列中待筛选的库中的小分子可以为变异和/或不同的小分子。变异小分子包括基于至少一种特性或特征可彼此区分的小分子。在一些实施方案中，变异小分子具有不同的结构，已经通过不同的方法产生/生成，具有不同的化学修饰，和/或展现出其它不同的特征。在一些实施方案中，变异小分子具有不同的结构。在一些实施方案中，变异小分子已经通过不同的方法产生/生成。在一些实施方案中，变异小分子具有不同的化学修饰。在一些实施方案中，变异小分子展现出其它区别不同的特征。在一些实施方案中，小分子为彼此的衍生物。在一些实施方案中，小分子为小分子群中的一种，其经受筛选方法并使用本文所公开的微腔阵列进行分析。小分子群可以为可以适当地分布在微毛细管阵列内的任何小分子群。
在一些实施方案中，在微腔阵列中待筛选的库中的细胞可以为变异细胞和/或不同类型的细胞。变异细胞包括基于至少一种特性或特征可彼此区分的细胞。在一些实施方案中，细胞来源于不同的样品，来源于不同的患者，来源于不同的疾病，具有不同的化学修饰，和/或已经被遗传修饰。细胞可以包括真核和原核细胞。在一些实施方案中，细胞来源于不同的样品。在一些实施方案中，细胞来自不同的患者。在一些实施方案中，细胞来源于不同的疾病。在一些实施方案中，细胞具有不同的化学修饰。在一些实施方案中，细胞已经被遗传修饰。在一些实施方案中，细胞可以包括人细胞、哺乳动物细胞、细菌细胞、禽类细胞(包括鸡类细胞)和真菌细胞(包括酵母细胞)。在一些实施方案中，细胞可以包括人细胞。在一些实施方案中，细胞可以包括哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞可以包括禽类细胞。在一些实施方案中，细胞可以包括鸡类细胞。在一些实施方案中，细胞可以包括细菌细胞。在一些实施方案中，细胞可以包括真菌细胞。在一些实施方案中，细胞可以包括酵母细胞。在一些实施方案中，细胞可以包括鸡类细胞。在一些实施方案中，细胞为细胞群中的一种，其经手筛选方法并使用本文所公开的微腔阵列进行分析。细胞群可以为可以适当地分布在微毛细管阵列内的任何细胞群。
在一些实施方案中，蛋白、多肽、核酸和/或细胞群分布在微腔阵列中，使得每个微腔包含少量不同的变异蛋白、变异多肽、变异核酸和/或细胞。在一些实施方案中，每个微腔包含单个不同的变异蛋白、变异多肽、变异核酸、和/或每个微腔的细胞。在一些实施方案中，每个微腔包含单个不同的变异蛋白。在一些实施方案中，每个微腔包含单个不同的变异多肽。在一些实施方案中，每个微腔包含单个不同的变异核酸。在一些实施方案中，每个微腔包含单个不同的细胞。选择变异蛋白、变异多肽、变异核酸和/或细胞群与组合物中的其它组分组合。
在一些实施方案中，微腔阵列中的每个微腔包含来自变异蛋白群的0至5种不同的变异蛋白、变异多肽、变异核酸和/或细胞。在一些实施方案中，微腔阵列中的每个微腔包含来自变异蛋白、变异多肽、变异核酸和/或细胞群的0至4、0至3、0至2、或甚至0至1种不同变异蛋白。因此，在一些实施方案中，变异蛋白为可溶性蛋白，例如由细胞表达系统分泌的可溶性蛋白。示例性可溶性变异蛋白包括抗体和抗体片段、可替代的蛋白支架(如二硫键键合肽支架)、细胞表面受体蛋白的细胞外结构域、受体配(如例如G-蛋白偶联受体配体)、其它肽激素、凝集素等。在一些实施方案中，使用本发明方法筛选的变异蛋白不需要与表达它们的细胞或病毒共价连接，以便在筛选测定后鉴定。分离所期望微毛细管的内容物，随后增殖负责表达所期望变异蛋白的细胞或病毒克隆，从而能够鉴定和表征该变异蛋白。与筛选测定不同，其中通过蛋白与细胞或病毒颗粒表面上的分子的融合来展示目的变异蛋白质，在本发明的筛选方法中鉴定的变异蛋白在其鉴定之前或之后不需要以任何方式改变。因此，在筛选中观察到的变异蛋白的活性更可能代表那些蛋白在其后续应用中的实际活性。在筛选之前不需要改变变异蛋白或多肽也允许更有效的筛选，节省了库制备的成本和时间。
在一些实施方案中，待筛选的变异蛋白为膜相关蛋白，例如通常与表达系统中的细胞或病毒颗粒表面缔合的蛋白。当变异蛋白及其靶分子介导生物组织内两个细胞之间的相互作用时，可能期望细胞相关变异蛋白的筛选。在筛选中，针对细胞相关变异蛋白与常规的“非可药化的”蛋白靶标(如例如，G-蛋白偶联受体或离子通道)相互作用的能力筛选也是可期望的。同样，在筛选之前不需要改变变异蛋白或多肽也允许更有效的筛选，节省了库制备的成本和时间。
在一些实施方案中，待筛选的变异核酸包括任何核酸或多核苷酸，其包括与蛋白结合或相互作用的核酸或多核苷酸。同样，在筛选之前不需要改变核酸或多核苷酸也允许更有效的筛选，节省了库制备的成本和时间。
在一些实施方案中，待筛选的蛋白质为抗体、抗体片段(如Fc)或抗体融合物(包括例如Fc融合物)。在一些实施方案中，抗体或抗体片段可以被标记。
在一些实施方案中，所述方法使用抗体结合待筛选的靶分子。在一些实施方案中，抗体为用于结合靶分子的标记的一级抗体或标记的二级抗体。一级抗体通常被认为为直接结合目的抗原的抗体，而二级抗体通常被认为是结合一级抗体上的恒定区的抗体，以用于标记一级抗体。因此，二级抗体经常用荧光团或其它可检测标记物标记，或者用能够产生可检测信号的酶标记。它们通常对来自不同物种的一级抗体具有特异性。例如，如本领域普通技术人员所理解的，山羊或其它动物物种可用于产生针对小鼠、鸡、兔或几乎任何不同于来自该动物物种的抗体的一级抗体的二级抗体。在一些实施方案中，标记的抗体为一级抗体或二级抗体。在一些实施方案中，标记的抗体为荧光抗体或酶联抗体。
如本领域普通技术人员将理解的，当荧光抗体例如被用于本发明的筛选方法时，由微腔内的溶液中保持游离的任何过量的报告子元件(即，不与变异蛋白结合或与不与靶分子结合的变异蛋白结合)发射的信号不应太高以致它淹没经由变异蛋白与靶分子缔合的报告子元件(参见例如，未缔合的荧光抗体)的信号。然而，此类背景信号可以通过限制在微毛细管溶液中的标记抗体或其它报告子元件的浓度而最小化。此外，在使用荧光显微镜测量来自筛选方法的信号的情况下，配置显微镜以成像相对窄的景深，该景深限制靶分子的位置(例如，当靶细胞通过重力沉降已经在那里沉积时的微毛细管的底部)可以最小化来自不与靶分子缔合的报告子元件的背景信号。
在一些实施方案中，报告子元件为报告子测定的一部分。在一些实施方案中，报告子测定可以包括但不限于钙染料测定、T细胞激活测定、B细胞测定和GFP测定。在一些实施方案中，报告子测定选自钙染料测定、T细胞激活测定、B细胞测定和GFP测定。在一些实施方案中，报告子测定为钙染料测定。在一些实施方案中，报告子测定为T细胞激活测定。在一些实施方案中，报告子测定为B细胞测定。在一些实施方案中，报告子测定为GFP测定。
在一些实施方案中，纯化的或富集的细胞群可以被用于报告子测定。在一些实施方案中，细胞源可以为来自动物(包括但不限于人)的器官、组织、肿瘤或液体。细胞源可以来自每种动物偏好不同的来源。在一些实施方案中，细胞为免疫细胞。在一些实施方案中，细胞为T细胞。在一些实施方案中，细胞为B细胞。在一些实施方案中，细胞为T细胞的亚型。在一些实施方案中，细胞为B细胞的亚型。在一些实施方案中，细胞为NK细胞。在一些实施方案中，细胞为吞噬细胞。在一些实施方案中，细胞为巨噬细胞。在一些实施方案中，细胞为嗜中性粒细胞。在一些实施方案中，细胞为肥大细胞。在一些实施方案中，细胞为单核细胞。在一些实施方案中，细胞为本文所列的任何细胞类型的亚型。细胞群的纯化或富集可以使用多种方法进行，包括但不限于密度梯度分离、免疫密度细胞分离、免疫磁性细胞分离、荧光激活细胞分选(FACS)和微流控细胞分选。其它形式的纯化或富集可以包括用改变一种细胞类型相对于另一种细胞类型的细胞生长或增殖的因子处理异质细胞群。在一些实施方案中，例如，在从组织或肿瘤中分离细胞时，可能需要对组织进行分解、匀浆和/或过滤以帮助纯化的先前步骤。
例如，在一个实施方案中，通过使用商购试剂盒分离CD138+细胞从小鼠脾细胞中富集B细胞。将脾细胞与CD138包被的磁性微珠一起孵育。在一些实施方案中，将混合物加载到磁性柱上并洗出未结合的细胞。然后将磁性标记的细胞从柱中洗脱，并用温热的PBMC培养基洗涤。洗涤的CD138+细胞立即用于结合筛选。在一些实施方案中，可使用泛B细胞试剂盒(a Pan B cell kit，可商购自Miltenyi Biotec)。
在一些实施方案中，报告子测定为B细胞测定。在一些实施方案中，B细胞的来源可以为来自动物(包括但不限于人)的器官、组织、肿瘤或液体。用于为B细胞测定提供细胞的B细胞源可以来自每种动物偏好不同的来源。在一些实施方案中，为B细胞测定提供B细胞的来源为脾脏。在图25中发现来自B细胞测定的一个实例的代表性命中。
在一些实施方案中，报告子测定为T细胞激活测定。在一些实施方案中，T细胞的来源可以为来自动物(包括但不限于人)的器官、组织、肿瘤或液体。用于提供用于T细胞激活测定的细胞的T细胞源可以来自每种动物不同偏好的多种来源。在一些实施方案中，为T细胞测定提供T细胞的来源为外周血。在一些实施方案中，提供T细胞的来源可以包括但不限于脾脏、扁桃体、骨髓或扩增的淋巴样祖细胞以及诱导的多能干细胞(iPSC)衍生的T淋巴细胞。在一些实施方案中，提供T细胞的来源选自脾脏、扁桃体、骨髓或扩增的淋巴样祖细胞，以及诱导的多能干细胞(iPSC)衍生的T淋巴细胞。在一些实施方案中，提供T细胞的来源为脾脏。在一些实施方案中，提供T细胞的来源为扁桃体。在一些实施方案中，提供T细胞的来源为骨髓。在一些实施方案中，提供T细胞的来源为扩增的淋巴样祖细胞。在一些实施方案中，提供T细胞的来源为诱导的多能干细胞(iPSC)衍生的T淋巴细胞。T细胞激活测定的一些实施方案见图26、图27和图28。在一些实施方案中，T细胞激活测定被用于评估抗体对细胞信号传导的诱导能力。在一些实施方案中，通过观察与基线相比抗体诱导的应答来确定能力。在一些实施方案中，通过观察与对照相比抗体诱导的应答来确定能力。在一些实施方案中，使用阴性对照确定基线。在一些实施方案中，阴性对照为没有刺激的对照。在一些实施方案中，阴性对照为非功能性抗体。在一些实施方案中，抗体诱导的应答增加约10％或更多。在一些实施方案中，抗体诱导的应答增加大于或等于10％。在一些实施方案中，与基线和/或对照相比，抗体诱导的应答增加大于或等于10％。在一些实施方案中，与基线和/或对照相比，抗体诱导的应答增加大于或等于20％。在一些实施方案中，与基线和/或对照相比，抗体诱导的应答增加大于或等于30％。在一些实施方案中，与基线和/或对照相比，抗体诱导的应答增加大于或等于40％。在一些实施方案中，与基线和/或对照相比，抗体诱导的应答增加大于或等于50％。在一些实施方案中，与基线和/或对照相比，抗体诱导的应答增加大于或等于60％。在一些实施方案中，与基线和/或对照相比，抗体诱导的应答增加大于或等于70％。在一些实施方案中，与基线和/或对照相比，抗体诱导的应答增加大于或等于80％。在一些实施方案中，与基线和/或对照相比，抗体诱导的应答增加大于或等于90％。在一些实施方案中，与基线和/或对照相比，抗体诱导的应答增加大于或等于100％。在一些实施方案中，与基线和/或对照相比，抗体诱导的应答增加大于或等于200％。在一些实施方案中，与基线和/或对照相比，抗体诱导的应答增加大于或等于300％。在一些实施方案中，与基线和/或对照相比，抗体诱导的应答增加大于或等于400％。在一些实施方案中，与基线和/或对照相比，抗体诱导的应答增加大于或等于500％。在一些实施方案中，与基线和/或对照相比，抗体诱导的应答增加大于或等于600％。在一些实施方案中，与基线和/或对照相比，抗体诱导的应答增加大于或等于700％。在一些实施方案中，与基线和/或对照相比，抗体诱导的应答增加大于或等于800％。在一些实施方案中，与基线和/或对照相比，抗体诱导的应答增加大于或等于900％。在一些实施方案中，与基线和/或对照相比，抗体诱导的应答增加大于或等于1000％。在一些实施方案中，与基线和/或对照相比，抗体诱导的应答增加大于或等于2,000％。在一些实施方案中，与基线和/或对照相比，抗体诱导的应答增加大于或等于3,000％。在一些实施方案中，与基线和/或对照相比，抗体诱导的应答增加大于或等于4,000％。在一些实施方案中，与基线和/或对照相比，抗体诱导的应答增加大于或等于5,000％。在一些实施方案中，与基线和/或对照相比，抗体诱导的应答增加大于或等于6,000％。在一些实施方案中，与基线和/或对照相比，抗体诱导的应答增加大于或等于7,000％。在一些实施方案中，与基线和/或对照相比，抗体诱导的应答增加大于或等于8,000％。在一些实施方案中，与基线和/或对照相比，抗体诱导的应答增加大于或等于9,000％。在一些实施方案中，与基线和/或对照相比，抗体诱导的应答增加大于或等于10,000％。在一些实施方案中，当与基线和/或对照相比时，抗体诱导的应答增加10％至10,000％。在一些实施方案中，当与基线和/或对照相比时，抗体诱导的应答增100％至1,000％的。在一些实施方案中，当与基线和/或对照相比时，抗体诱导的应答增加10％至100％。在一些实施方案中，当与基线和/或对照相比时，抗体诱导的应答增加100％至5,000％。在一些实施方案中，抗体诱导的应答增加10％至1000％。在一些实施方案中，当与基线和/或对照相比时，用于鉴定至少一个目的微毛细管的信号的增加代表统计学上显著的增加。在一些实施方案中，如使用例如单向方差或T检验或其它标准统计参数所测量的并且当与基线和/或对照比较时，应答为统计学上显著的应答。在一些实施方案中，T细胞激活测定被用于测量抗体对内部信号传导或细胞表面标记物的诱导能力。在一些实施方案中，T细胞激活测定被用于评估抗体诱导细胞扩增的能力。在一些实施方案中，T细胞激活测定被用于评估抗体对细胞因子分泌的诱导能力。在一些实施方案中，T细胞激活测定测量CD25的表达以确定激活。在一些实施方案中，T细胞激活测定使用荧光标记的抗CD25抗体来测量CD25的表达。在一些实施方案中，T细胞激活测定测量钙信号传导以确定抗体的激活能力。在一些实施方案中，T细胞激活测定使用钙敏感性荧光团来测量钙信号传导。钙敏感性荧光团的一些实例包括Fluo-4AM、Fura-2AM和Indo-1AM。在一些实施方案中，钙染料测定具有1:20000的动态范围。在一些实施方案中，钙染料测定具有1:5000的动态范围。在一些实施方案中，钙染料测定具有1:10000的动态范围。在一些实施方案中，钙染料测定具有1:15000的动态范围。在一些实施方案中，T细胞激活测定包括T细胞和抗体分泌细胞(ASC)的混合物。在一些实施方案中，T细胞和ASC的混合物的比例为2:1至12:1。在一些实施方案中，T细胞和ASC的混合物的比例为5:1。在一些实施方案中，从外周血纯化T细胞。在一些实施方案中，ASC为B细胞。在一些实施方案中，T细胞和ASC的混合物还包含T细胞激活珠和抗体捕获珠。
示例性实施方案：
本申请提供了筛选变异蛋白群的方法，其包括以下步骤：
提供包含多个微毛细管的微毛细管阵列，每个微毛细管包含变异蛋白、固定化的靶分子和报告子元件，其中所述变异蛋白与固定化靶分子以特定亲和力缔合；和
测量来自至少一种报告子元件的信号，所述信号指示至少一种变异蛋白与至少一种固定化靶分子的缔合以鉴定至少一个目的微毛细管。
在一些实施方案中，所述变异蛋白由表达系统表达。
在一些实施方案中，所述表达系统为无细胞表达系统。
在一些实施方案中，所述表达系统为细胞表达系统。
在一些实施方案中，所述细胞表达系统为动物系统、禽类系统、真菌系统、细菌系统、昆虫系统或植物系统。
在一些实施方案中，所述细胞表达系统为禽类系统。
在一些实施方案中，所述细胞表达系统为鸡类系统。
在一些实施方案中，所述变异蛋白为可溶性蛋白。
在一些实施方案中，所述靶分子为靶蛋白或多肽、靶核酸、靶碳水化合物或上述每一种的组合。
在一些实施方案中，所述靶分子被固定在表面上。
在一些实施方案中，所述表面为细胞的表面。
在一些实施方案中，所述靶分子为天然蛋白。
在一些实施方案中，所述表面为珠的表面。
在一些实施方案中，所述表面为微毛细管壁的表面。
在一些实施方案中，所述表面为被配置为通过重力沉降而沉积在微毛细管中的表面。
在一些实施方案中，所述报告子元件为标记的抗体或其它结合分子。
在一些实施方案中，所述标记的抗体或其它结合分子为荧光标记的抗体或其它结合分子。
在一些实施方案中，所述标记的抗体为一级抗体或二级抗体。
在一些实施方案中，所述标记的抗体或其它结合分子为酶联抗体或其它结合分子。
在一些实施方案中，所述报告子元件在细胞内被激活，并且所述靶分子被固定在细胞的表面上。
在一些实施方案中，所述报告子元件包含绿色荧光蛋白或变体。
在一些实施方案中，所述信号为荧光信号、吸光度信号、明场信号或暗场信号。
在一些实施方案中，所述微毛细管阵列中的每个微毛细管包含来自所述变异蛋白群的0至5个变异蛋白。
在一些实施方案中，微毛细管阵列包含至少100,000个、至少300,000个、至少1,000,000个、至少3,000,000个或至少10,000,000个微毛细管。
在一些实施方案中，每个微毛细管还包含提高细胞表达系统的存活力的试剂。
在一些实施方案中，所述试剂为甲基纤维素、甲基纤维素、右旋糖酐普兰尼克F-68、聚乙二醇或聚乙烯醇。
在一些实施方案中，所述试剂为生长培养基。
在一些实施方案中，所述信号通过光学检测器测量。
在一些实施方案中，所述信号通过显微镜测量。
在一些实施方案中，所述方法还包括分离目的微毛细管的内容物的步骤。
在一些实施方案中，所述目的微毛细管的内容物通过用激光脉冲所述目的微毛细管来分离。
实施例
实施例1.筛选分泌的EGFR结合蛋白
图1A-图1C示出了能够与细胞表面蛋白(例如，表皮生长因子受体(“EGFR”))缔合作为固定化靶分子(在这种情况下为固定化的靶蛋白)的可溶性蛋白的示例性筛选方法。图1A(左图)显示了靶细胞，在其表面上表达EGFR。还显示了“库表达细胞”，其在微毛细管溶液中表达变异蛋白群和许多“荧光检测抗体”。在右图中示出了微毛细管阵列的仰视图。
根据该筛选测定的每个微毛细管的组分：
1.分泌目的变异蛋白的细胞(“库表达细胞”)。目的变异蛋白优选为变异蛋白群的成员，即蛋白库。
2.固定在“靶细胞”表面上的靶蛋白。在该实施例中，靶蛋白为天然的细胞表面受体(即，EGFR)。然而，可替代地，靶蛋白可以被固定在另一个表面上，如珠表面或微毛细管本身的表面。
3.报告子元件
a.在该实施例中，报告子元件对应于特异性针对分泌蛋白的荧光标记的抗体(即，“荧光检测抗体”)。抗体特异性定位于分泌蛋白上的表位，但理想地不干扰分泌蛋白与靶细胞上的靶蛋白的结合。
b.可替代地，报告子元件可以为表达靶蛋白的细胞内的信号传导通路。如果分泌的变异蛋白结合细胞表面上的靶蛋白并激活靶细胞内的信号传导通路，则结合相互作用将在细胞内产生荧光信号(未显示)。
4.反应缓冲液：
a.可以为用于库表达细胞或用于靶细胞的培养基(例如，此类培养基可以为杂交瘤培养基：如可商购的杂交瘤培养基，其包括例如来自ThermoFIshcer，参见thermofisher.com/order/catalog/product/11279023的万维网；CD杂交瘤培养基)。
b.可以为哺乳动物成像溶液(例如，此类成像溶液可以为光学透明的，用pH7.4的HEPES缓冲的生理溶液)。
方法说明：
步骤1：将所有组分加入到微毛细管中(参见图1A)。
步骤2：特定的“分泌蛋白”由库表达细胞表达到微毛细管中。能够与靶蛋白结合的分泌蛋白变体定位于所示的靶细胞表面(参见图1B)。
步骤3：观察到与结合的分泌蛋白变体缔合的荧光检测抗体与特异性微毛细管中的靶细胞相关(参见图1C)。
详细描述和样品数据：
为了证明这种方法，建立了表达被设计为与人癌细胞上的EGFR结合的蛋白的酵母载体库。在该库中，一些酵母变体能够表达该蛋白，而其它变体不能表达该蛋白。将酵母细胞、癌细胞和针对表达的蛋白质的荧光抗体加入到微毛细管中。18小时后，对微毛细管阵列成像。在下面的实施例3中提供了筛选的进一步细节和结果。
实施例2.针对哺乳动物细胞的杂交瘤筛选
一般背景
目前筛选蛋白或其它靶分子之间的结合相互作用的方法通常依赖于使用“展示”方法，例如噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、哺乳动物展示或病毒展示。在展示方法中，在细胞或噬菌体的表面表达编码蛋白变体的基因库。将蛋白变体与可溶性形式的靶分子一起孵育，以鉴定能够与靶结合的蛋白变体。可以通过淘选或通过荧光激活细胞分选(“FACS”)筛选库。此类测定具有两个主要限制：1)工程化的蛋白通常系在展示平台上；和2)通常有利的为存在可溶性形式的靶分子。因此，很难开发用于与许多靶分子结合的变异蛋白(特别为膜蛋白，如G蛋白偶联受体和其它此类受体)的可靠测定。
针对哺乳动物细胞的杂交瘤筛选
为了鉴定与靶分子特异性结合的抗体变体，向表达高水平EGFR作为靶分子的癌细胞系中加入杂交瘤(其分泌抗体变体)。然后加入特异型针对分泌的抗体的标记抗体。
材料：
细胞：
小鼠杂交瘤
A431靶细胞(表达高水平EGFR的人癌细胞系)
检测抗体：
用Alexa488(荧光团)标记的抗小鼠二级抗体。
用于细胞培养的培养基：
DMEM-10％胎牛血清
DMEM-10％马血清
细胞系生长和制备。在完全培养基(含有10％马血清的Dulbecco改良的Eagle培养基)中培养小鼠杂交瘤细胞。用PBSA洗涤杂交瘤细胞两次，并以600个细胞/μL悬浮在完全培养基中。将A431细胞在完全培养基(含有10％胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培养基)中培养。用PBSA洗涤A431细胞两次并用LiveGreen荧光信号染色。然后将A431细胞以1800个细胞/μL的最终浓度悬浮在含有杂交瘤的完全培养基中。
测定设置。在混合两种细胞类型后，将检测抗体加入到反应混合物中：1:100稀释的二级(抗小鼠Alexa488)。然后将该反应混合物加载到乙醇灭菌的电晕处理的微毛细管阵列(40μm的直径，1mm的厚度)中。将2mm厚的1％重量/体积琼脂糖板置于阵列上以帮助防止蒸发。每小时后，在荧光和明场显微镜下对样品成像。
样品数据：
图2A-2C显示了显示所有细胞的微毛细管阵列的子部分的图像(图2A，明场信号)、A431靶细胞(图2B，LiveGreen信号)，或用荧光抗小鼠二级抗体标记的细胞(图2C，Ab-A555信号)。含有表达特异性针对EGFR的抗体的杂交瘤细胞的微毛细管在每幅图像中用两个箭头指示。
图3显示了在4小时孵育过程中含有A431靶细胞和杂交瘤细胞的微毛细管的图像，其中随着产生特异性针对EGFR的小鼠抗体(中间列)，在测定的时间过程中对A431靶细胞的抗体结合信号增加。A431靶细胞的LiveGreen染色在相同时间段内下降(右列)。
实施例3.针对哺乳动物细胞的酵母库筛选
为了确定最佳的分泌酵母质粒载体，建立了表达设计用于与癌细胞表面上的EGFR结合的支架蛋白的酵母载体库。该库含有具有各种可溶性表达水平的支架蛋白的酵母细胞。使用所述测定，筛选变体表达库以回收高表达所期望支架蛋白的质粒载体。在该实验中，分泌的支架具有c-Myc标签，其可以用荧光标记的抗体标记。
材料：
细胞：
支架蛋白酵母分泌库
A431细胞(表达高水平EGFR的人癌细胞系)
检测抗体：
鸡抗c-Myc
用Alexa488标记的抗鸡二级抗体
用于细胞培养的培养基：
DMEM-10％FBS
SD-CAA基本酵母培养基
反应缓冲液：
SD-CAA基本酵母培养基
方法：
细胞系生长和制备。酵母库在SD-CAA基本酵母培养基(20g右旋糖；6.7g Difco酵母氮碱基；5g Bacto酪蛋白氨基酸；5.4g Na2HPO4；8.56g NaH2PO4·H2O；溶解在去离子H2O中至1升的体积)。生长后，酵母细胞用PBSA(磷酸盐缓冲盐水+1mg/ml BSA)洗涤两次，并以2,400个细胞/μL的终浓度悬浮在SD-CAA中。
将A431细胞在完全培养基(含有10％胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培养基)中培养。将A431细胞用PBSA洗涤两次，并以600个细胞/μL的终浓度悬浮在含有酵母细胞的SD-CAA中。
测定设置。混合两种细胞类型后，向反应混合物中加入两种抗体：1:250稀释的未标记的一级抗体(鸡抗c-Myc)和1:200稀释的标记的二级抗体(抗鸡Alexa488)。然后将该反应混合物加载到乙醇灭菌的电晕处理的微毛细管阵列(40μm的直径，1mm的厚度)中。将2mm厚的1％重量/体积琼脂糖板置于阵列上以帮助防止蒸发。生长18小时后，在荧光和明场显微镜下对样品成像。
微毛细管阵列提取。Triton UV激光器被用于提取所期望的毛细管的内容物。激光器工作18±2ms(n＝5次测量)，递送2.5kHz的具有大约100μJ的总能量的一系列脉冲。将微毛细管内容物提取到玻璃盖玻片上，然后将其置于酵母生长培养基(液体培养基或琼脂板)中以增殖提取的细胞。
样品数据：
图4A和图4B显示了微毛细管阵列的一个子部分的图像，其使用明场成像(图4A)和荧光成像(图4B)来鉴定具有表达细胞和非表达细胞的微毛细管。
实施例4.微毛细管阵列中培养的人细胞的生长
图5A-5G证明了K562细胞(人永生化骨髓性白血病细胞系)在生长培养基中在6天的过程中在微毛细管阵列内的生长。每24小时拍摄阵列的相同部分的明场图像。图5A：第0天；图5B：第1天；图5C：第2天；图5D：第3天；图5E：第4天；图5F：第5天；和图5G：第6天。在每幅图像中显示了40μm的标尺。
实施例5.针对哺乳动物报告细胞的杂交瘤筛选
为了鉴定激活特异性信号传导通路的抗体变体，将分泌不同抗体变体的杂交瘤加入到具有报告细胞的微毛细管阵列中。例如，报告细胞可以来自Qiagen(参见http://www.sabiosciences.com/reporter_assay_product/HTML/CCS-013L.html)。如果蛋白变体结合报告细胞并激活信号传导通路，则报告细胞表达荧光蛋白。在含有所期望的蛋白变体的微毛细管中观察到激活细胞的信号荧光，并且被用于分离这些微毛细管的内容物。
实施例6.用于多靶标结合的样品数据
研究目标：
鉴定分泌杂交瘤的抗体，所述抗体将特异性结合靶蛋白，但不结合类似结构的蛋白。参见例如，图9。该方法允许并将继续允许筛选抗体库。
材料：
杂交瘤库。
靶蛋白将被展示在癌细胞类型上。参见例如，图9。
将靶蛋白类似物固定在珠上。参见例如，图9。
方案：
1.在表面上展示靶蛋白A的培养细胞。
2.标记的蛋白Dynabeads生物素结合剂与靶蛋白B按照生产说明进行。
3.培养的大鼠杂交瘤库。
4.稀释细胞、珠和杂交瘤，使得每个微毛细管平均有1个杂交瘤、～2个靶蛋白A细胞的细胞和被靶蛋白B覆盖的～10个珠。
5.向制备的细胞样品中加入抗大鼠二级抗体(报告子元件)。
6.将样品加载到阵列中。
7.在成像前孵育1小时。
8.回收细胞，其与靶蛋白A结合的细胞，但不回收与靶蛋白B结合的珠。
样品结果：
鉴定出具有适当染色的细胞但没有染色的珠的微毛细管。微毛细管中染色细胞的存在和染色珠的不存在表明存在与靶蛋白结合但不与靶蛋白类似物结合的抗体。
在一些实施方案中，在本实施例中测试的测定可以可替代地用于筛选结合靶蛋白的小鼠和人(或动物的其它组合)变体的抗体，即发现“交叉反应性”抗体。例如，在微毛细管内的染色细胞的存在和染色珠的存在表明抗体的存在，所述抗体结合“靶蛋白”(例如，小鼠靶标)并且还结合“靶蛋白类似物”(例如，人靶标)，以便鉴定结合小鼠和人靶标两者的抗体。例如，微毛细管内染色细胞的存在和染色珠的存在表明存在与“靶蛋白”(例如食蟹猴靶标)结合并且还与“靶蛋白类似物”(例如人靶标)结合的抗体，以便鉴定与食蟹猴和人靶标结合的抗体。
实施例7.滴定报告子元件以获得最佳信号输出
使用的频繁报告子元件为荧光标记的二级抗体。在该测定形式中，在测定开始时加入二级抗体，并且随着时间的推移，该抗体与分泌的抗体(变异蛋白)结合，所述分泌的抗体与靶蛋白结合。
关键的考虑因素为使用的二级抗体的量。如果存在太多的二级抗体，则背景噪声将太高。如果使用太少的二级抗体，信号将太低。在该实验中，用一级抗体标记珠子，然后用不同水平的二级抗体滴定，以确定最佳的信噪比。
所用的报告子元件为用AlexaFluor633标记的驴抗山羊IgG二级抗体。
制造商推荐使用范围：1:200-1:2000的稀释范围。
测试的稀释系列为1:100、1:200、1:500、1:1000、1:2000、1:5000。在图13中显示了来自实验的珠的图像。
实施例8.报告细胞测定
钙染料测定
在37℃，用在含有10％FBS的IMDM中的10μM Fluo-4AM加载Jurkat细胞25min，并用成像缓冲液(含有1mM MgCl2、1mM CaCl2、1mM HEPES和0.1％BSA的PBS)洗涤两次。将细胞以5×106个/mL重悬于成像缓冲液中。通过加入α-CD28(28.2)和α-CD3(OKT3)激活加载染料的细胞，这两者都为通过与山羊抗小鼠IgG预孵育而交联的小鼠IgG抗体。抗体的最终浓度分别为5μg/mL、2.5μg/mL和5μg/mL。将激活的细胞立即加载到40μm的μ孔(μPore)阵列上，并用PBS 1％琼脂糖凝胶覆盖样品，用于Ca2+信号传导的成像。
T细胞激活测定
通过MACS(泛T细胞分离试剂盒，人，Miltenyi Biotec)从外周血单个核细胞(PBMC)分离人T细胞。将细胞与包被有激动抗体的珠混合。在这种情况下，我们使用了用抗CD3/CD28包被的Dynabead人T激活剂珠。将珠和细胞混合物加载到40μm的μ孔阵列中，并用1％琼脂糖凝胶(含有培养基)覆盖样品。T细胞被抗体激活并在其表面上表达激活标志物。在24-72小时后，用荧光标记的抗体通过我们的流式细胞系统针对激活标记物对细胞进行染色并成像。
GFP报告细胞
用cAMP应答元件(CRE)报告子转染GLP-1受体表达细胞，当CRE信号传导通路被激活时，该报告子表达GFP。将这些GLP-1报告细胞与10μM其同源配体：GLP-1一起置于40μm的μ孔阵列中。24小时后，对细胞进行荧光成像。在实际的筛选中，我们将GLP-1 CRE报告细胞与抗体分泌细胞共孵育在μ孔阵列中。抗体分泌细胞将分泌结合并激活GLP-1报告细胞，激活GFP或其它荧光蛋白变体信号的抗体。
在一些情况下，报告细胞测定可以使用鸡类细胞。
实施例9.鸡类细胞测定
OmniChicken完全表达人类高度多样化的抗体库。来自人和小鼠的遗传差异允许更多的不同表位覆盖。深度免疫图谱分析可以导致一组更多样性的功能性抗体。也可以被称为B细胞测定。
测试用例：
分析用颗粒蛋白前体免疫后的抗原特异性抗体库。参见图18-19。
测定条件-参见图19。
方案：
结合mAb分泌器和靶珠。将细胞+检测抗体加载到阵列中(均相测定)。孵育3小时。成像并量化数据。
实施例10.用B细胞激活T细胞(CD25的表面表达)
目标：如通过在T细胞表面上诱导CD25的表达所测定的，寻找可以激活T细胞的抗体。参见图27。
方案：
1.按照供应商的程序使用MACS泛T细胞分离试剂盒从人外周血单个核细胞(PBMC)分离CD3+T细胞。
2.按照供应商的方案用CellTrace Far Red标记抗体分泌细胞(ASC)。
3.制备CD3 T细胞激活珠和抗体捕获珠的1:1混合物并用PBMC培养基洗涤该混合物。
4.用PBMC培养基洗涤Dynabeads MyOne硅烷珠。
5.将珠合并并在PBMC培养基中与1:200抗人CD25 Alexa Fluor 488检测抗体重悬。
6.以5:1(可以为2:1至12:1)的比例混合T细胞和ASC。
7.用PBMC培养基洗涤细胞混合物。用珠混合物沉淀并重悬细胞。
8.将该测定混合物加载到40μM的μ孔阵列，用1％RPMI琼脂糖凝胶覆盖样品，并在37℃和湿度下孵育2天。
9.孵育2天后，在Xploration上对芯片成像，并筛选用αCD25标记的激活T细胞。
B细胞分离方案：
通过使用商购试剂盒分离CD138+细胞从小鼠脾细胞中富集B细胞。将脾细胞与CD138包被的磁性微珠一起孵育。将混合物加载到磁性柱上并洗出未结合的细胞。然后将磁性标记的细胞从柱中洗脱，并用温热的PBMC培养基洗涤。洗涤的CD138+细胞立即用于结合筛选。
使用泛B细胞珠也可以获得B细胞。例如，使用来自Miltenyi Biotec的泛B细胞分离试剂盒。
实施例11.用B细胞激活T细胞(钙信号传导)
目标：如通过钙信号传导的诱导所测量的，发现可以激活T细胞的抗体。参见图28。
协议：
1.按照供应商的程序使用MACS泛T细胞分离试剂盒从人外周血单个核细胞(PBMC)分离CD3+T细胞。
2.按照供应商的方案用CellTrace Far Red标记抗体分泌细胞(ASC)。
3.在37℃下，在含有10％FBS的AIMV培养基中，用10μM钙敏感性荧光团(如Fluo-4AM、Fura-2AM、Indo-1AM)将T细胞染色25min。
4.用成像缓冲液(含有1mM MgCl2、1mM CaCl2、1mM HEPES和0.1％BSA的BPS)洗涤T细胞两次。
5.以5:1(可以为2:1至12:1)的比例混合T细胞和ASC。
6.用PBMC培养基洗涤细胞混合物。用珠混合物沉淀并重悬细胞。
7.将该测定混合物加载到40μM的μ孔阵列，用1％RPMI琼脂糖凝胶覆盖样品，并在37℃孵育0-6小时。
8.通过钙信号传导在xPloration上对激活的T细胞进行成像和筛选。
本文所提及的所有专利、专利出版物和其它公开的参考文献通过引用整体并入本文，就好像各自通过引用单独且具体地并入本文。
虽然已经提供了具体的实施例，但是上述描述为说明性的而不是限制性的。前述实施例的任何一个或多个特征可以以任何方式与本发明中任何其它实施方案的一个或多个特征组合。此外，在阅读说明书后，本发明的许多变化对于本领域技术人员将变得显而易见。因此，本发明的范围应当通过参考所附权利要求以及它们的等同物的全部范围来确定。
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在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本申请进行许多修改和变化，这对于本领域技术人员来说为显而易见的。本文所述的具体实施方案和实施例仅通过实施例的方式提供，并且本申请仅由所附权利要求以及权利要求所赋予的等同物的全部范围来限定。

Claims (95)

1.筛选变异蛋白群的方法，其包括以下步骤：
提供包含多个微毛细管的微毛细管阵列，每个微毛细管包含变异蛋白、固定化靶分子和报告子元件，其中所述变异蛋白以特定亲和力与所述固定化靶分子缔合；和
在报告子测定中，测量来自至少一种报告子元件的信号，所述信号指示至少一种变异蛋白与至少一种固定化靶分子的缔合以鉴定至少一个目的微毛细管，其中所述报告子测定选自：钙染料测定、T细胞激活测定、B细胞测定和GFP测定。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述变异蛋白由表达系统表达。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述表达系统为无细胞表达系统。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述表达系统为细胞表达系统。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述细胞表达系统为动物系统、禽类系统、真菌系统、细菌系统、昆虫系统或植物系统。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述细胞表达系统为禽类系统。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述禽类表达系统为鸡类系统。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述变异蛋白为可溶性蛋白。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述靶分子为靶蛋白或多肽、靶核酸、靶碳水化合物或上述每一种的组合。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述靶分子被固定在表面上。
11.如权利要求9所述所述的方法，其中所述表面为细胞的表面。
12.如权利要求9所述的方法，其中所述靶分子为天然蛋白。
13.如权利要求9所述的方法，其中所述表面为珠的表面。
14.如权利要求9所述的方法，其中所述表面为微毛细管壁的表面。
15.如权利要求9所述的方法，其中所述表面为被配置为通过重力沉降而沉积在所述微毛细管中的表面。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述报告子元件为标记的抗体或其它结合分子。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述标记的抗体或其它结合分子为荧光标记的抗体或其它结合分子。
18.如权利要求15所述的方法，其中所述标记的抗体为一级或二级抗体。
19.如权利要求15所述的方法，其中所述标记的抗体或其它结合分子为酶联抗体或其它结合分子。
20.如权利要求1所述的方法，其中所述报告子元件在细胞内被激活，并且所述靶分子被固定在所述细胞的表面上。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述报告子元件包含绿色荧光蛋白或变体。
22.如权利要求1所述的方法，其中所述信号为荧光信号、吸光度信号、明场信号或暗场信号。
23.如权利要求1所述的方法，其中所述微毛细管阵列中的每个微毛细管包含来自所述变异蛋白群的0至5个变异蛋白。
24.如权利要求1所述的方法，其中所述微毛细管阵列包含至少100,000个、至少300,000个、至少1,000,000个、至少3,000,000个或至少10,000,000个微毛细管。
25.如权利要求1所述的方法，其中每个微毛细管还包含提高细胞表达系统存活力的试剂。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述试剂为甲基纤维素、右旋糖酐普兰尼克F-68、聚乙二醇或聚乙烯醇。
27.如权利要求25所述的方法，其中所述试剂为生长培养基。
28.如权利要求1所述的方法，其中所述信号通过光学检测器测量。
29.如权利要求1所述的方法，其中所述信号通过显微镜测量。
30.如权利要求1所述的方法，其还包括分离所述目的微毛细管的内容物的步骤。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述目的微毛细管的内容物通过用激光脉冲所述目的微毛细管来分离。
32.如权利要求31所述的方法，其中激光器为二极管泵浦的Q开关激光器。
33.如权利要求31所述的方法，其中所述激光对准所述微毛细管壁与包含在所述微毛细管中的样品之间的水-玻璃界面。
34.如权利要求30所述的方法，其中使用两级样品回收元件分离所述目的微毛细管的内容物。
35.如权利要求1所述的方法，其中所述微毛细管不包含能够抑制电磁辐射传输的微粒、磁性微粒、磁珠或电磁辐射吸收材料。
36.用于筛选变异蛋白群的系统，其包括：
包含多个微毛细管的阵列，每个微毛细管包含变异蛋白、固定化靶分子和报告子元件，其中所述变异蛋白以特定的亲和力与所述固定化靶分子缔合。
37.如权利要求36所述的筛选系统，其中所述变异蛋白由表达系统表达。
38.如权利要求37所述的筛选系统，其中所述表达系统为无细胞表达系统。
39.如权利要求38所述的筛选系统，其中所述表达系统为细胞表达系统。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述细胞表达系统为动物系统、禽类系统、真菌系统、细菌系统、昆虫系统或植物系统。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述细胞表达系统为禽类系统。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述禽类表达系统为鸡类系统。
43.如权利要求36所述的筛选系统，其中所述变异蛋白为可溶性蛋白。
44.如权利要求36所述的筛选系统，其中所述靶分子为靶蛋白或多肽、靶核酸、靶碳水化合物或上述每一种的组合。
45.如权利要求36所述的筛选系统，其中所述靶分子被固定在表面上。
46.如权利要求45所述的筛选系统，其中所述表面为细胞的表面。
47.如权利要求46所述的筛选系统，其中所述靶分子为天然蛋白。
48.如权利要求45所述的筛选系统，其中所述表面为珠的表面。
49.如权利要求45所述的筛选系统，其中所述表面为微毛细管壁的表面。
50.如权利要求45所述的筛选系统，其中所述表面为被配置为通过重力沉降而沉积在所述微毛细管中的表面。
51.如权利要求36所述的筛选系统，其中所述报告子元件为标记的抗体或其它结合分子。
52.如权利要求51所述的筛选系统，其中所述标记的抗体或其它结合分子为荧光标记的抗体或其它结合分子。
53.如权利要求51所述的筛选系统，其中所述标记的抗体为一级或二级抗体。
54.如权利要求51所述的筛选系统，其中所述标记的抗体或其它结合分子为酶联抗体或其它结合分子。
55.如权利要求36所述的筛选系统，其中所述报告子元件在细胞内被激活，并且所述靶分子被固定在所述细胞的表面上。
56.如权利要求55所述的筛选系统，其中所述报告子元件包含绿色荧光蛋白或变体。
57.如权利要求36所述的筛选系统，其中所述信号为荧光信号、吸光度信号、明场信号或暗场信号。
58.如权利要求36所述的筛选系统，其中所述微毛细管阵列中的每个微毛细管包含来自所述变异蛋白群的0至5个变异蛋白。
59.如权利要求36的所述筛选系统，其中所述微毛细管阵列包含至少100,000个、至少300,000个、至少1,000,000个、至少3,000,000个或至少10,000,000个微毛细管。
60.如权利要求36所述的筛选系统，其中每个微毛细管还包含提高细胞表达系统存活力的试剂。
61.如权利要求60所述的筛选系统，其中所述试剂为甲基纤维素、右旋糖酐普兰尼克F-68、聚乙二醇或聚乙烯醇。
62.如权利要求60所述的筛选系统，其中所述试剂为生长培养基。
63.如权利要求36所述的筛选系统，其中所述系统还包括光源和检测器。
64.如权利要求36所述的筛选系统，其中所述系统还包括显微镜。
65.如权利要求36所述的筛选系统，其中所述系统还包括提取装置。
66.如权利要求65所述的筛选系统，其中所述提取装置包括二极管泵浦的Q开关激光器。
67.如权利要求36所述的筛选系统，其中所述系统还包括两阶段采样回收元件。
68.如权利要求36所述的筛选系统，其中所述微毛细管不包含能够抑制电磁辐射传输的微粒、磁性微粒、磁珠或电磁辐射吸收材料。
69.筛选变异蛋白群的方法，其包括以下步骤：
提供包含多个微毛细管的微毛细管阵列，每个微毛细管包含表达变异蛋白的细胞表达系统、固定在细胞表面上的靶分子和报告子元件，其中所述变异蛋白与固定化靶分子在所述微毛细管中以特定亲和力缔合，其中所述细胞表达系统为禽类系统；和
在报告子测定中，测量来自至少一种报告子元件的信号，所述信号指示至少一种变异蛋白与至少一种固定化靶分子的缔合以鉴定至少一个目的微毛细管。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述禽类系统为鸡类系统。
71.如权利要求69所述的方法，其中所述靶分子为靶蛋白或多肽、靶核酸、靶碳水化合物、或靶抗体、或上述每一种的组合。
72.如权利要求69所述的方法，其中所述靶分子为靶抗体。
73.如权利要求69所述的方法，其中所述报告子测定选自：钙染料测定、T细胞激活测定、B细胞测定和GFP测定。
74.如权利要求69所述的方法，其中所述报告子元件为标记的抗体或其它结合分子，其中所述标记的抗体或其它结合分子定位于所述变异蛋白上的表位。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述标记的抗体或其它结合分子为荧光标记的抗体或其它结合分子。
76.如权利要求75所述的方法，其中所述信号为荧光信号、吸光度信号、明场信号或暗场信号。
77.如权利要求73-76中任一项所述的方法，其中所述B细胞测定包括来源于脾脏的B细胞。
78.如权利要求73-76中任一项所述的方法，其中所述T细胞激活测定被用于评估抗体对细胞信号传导的诱导能力。
79.如权利要求73-76中任一项所述的方法，其中所述T细胞激活测定被用于测量抗体对内部信号传导或细胞表面标记物的诱导能力。
80.如权利要求73-76中任一项所述的方法，其中所述T细胞激活测定被用于评估抗体对细胞扩增的诱导能力。
81.如权利要求73-76中任一项所述的方法，其中所述T细胞激活测定被用于评估抗体对细胞因子分泌的诱导能力。
82.如权利要求73-76中任一项所述的方法，其中所述T细胞激活测定测量了CD25的表达以确定抗体的激活能力。
83.如权利要求82所述的方法，其中用荧光标记的抗CD25抗体测量所述CD25的表达。
84.如权利要求73-76中任一项所述的方法，其中所述T细胞激活测定测量钙信号传导以确定抗体的激活能力。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述T细胞激活测定使用钙敏感性荧光团来测量所述钙信号传导。
86.如权利要求85所述的方法，其中所述钙敏感性荧光团选自Fluo-4AM、Fura-2AM和Indo-1 AM。
87.如权利要求73-76和78-86中任一项所述的方法，其中所述T细胞激活测定包括T细胞和抗体分泌细胞(ASC)的混合物。
88.如权利要求87所述的方法，其中所述T细胞和ASC的混合物的比例为2:1至12:1。
89.如权利要求88所述的方法，其中所述T细胞和ASC的混合物的比例为5:1。
90.如权利要求87-89中任一项所述的方法，其中所述ASC为B细胞。
91.如权利要求87-90中任一项所述的方法，其中所述T细胞和ASC的混合物还包含T细胞激活珠和抗体捕获珠。
92.如权利要求87-91中任一项所述的方法，其中所述T细胞纯化自外周血。
93.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中用于鉴定所述至少一个目的微毛细管的信号相比基线和/或对照样品的信号增加至少10％至10,000％或更多。
94.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中用于鉴定所述至少一个目的微毛细管的信号相比基线和/或对照样品的信号增加至少10％或更多。
95.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中与基线和/或对照相比，用于鉴定所述至少一个目的微毛细管的信号的增加代表统计学上的显著增加。
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