JP2011504371A - 抗第xi因子モノクローナル抗体およびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、止血を妨害せずに血栓症を抑制するための組成物および方法に関するものである。組成物は、ヒトFXIの重鎖のエピトープ、特にヒトFXIの重鎖のA3ドメインへ結合可能である抗第XI因子モノクローナル抗体(aXIMab)を含む。組成物はまた、モノクローナル抗体のエピトープ結合断片、変異体、および誘導体、これらの抗体組成物を産生する細胞株、ならびに抗体のアミノ酸配列をコードする単離核酸分子も含む。本発明は、医薬的に許容され得る担体中に本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合断片、変異体、もしくは誘導体を含む医薬組成物をさらに含む。本発明の方法は、血栓症を抑制する目的でその必要がある対象に上述の組成物を投与すること、血栓症の処置において抗血栓剤の必要な用量を減少させること、転移性癌を処置すること、または急性炎症反応を処置することを含む。
Description
本発明は、第XI因子に結合可能である抗体およびその使用方法、特に止血を妨害しない抗血栓剤としての使用方法に関するものである。
止血は、出血を停止させて、血液循環の完全性を分子レベルと巨視的レベルの両方で保護する生体機能である。止血は、伝統的に3つの部分:1)第Vlla凝固因子の関与を伴わずに第IXa凝固因子の生成を引き起こす血液凝固タンパク質の相互作用を含む、内因性経路;2)トロンボプラスチン前駆体(第XI因子)の関与を伴わずに第Xaおよび/または第IXa凝固因子の生成を引き起こす血液凝固タンパク質の相互作用を含む、外因性経路;および3)トロンビン(第IIa因子)の生成を引き起こす血液凝固タンパク質II、V、VIII、IXおよびXの相互作用を含む、共通凝固経路;に分けられる、連続的に活性化可能な酵素の凝固カスケードを含む。トロンビンは血小板を活性化して、フィブリンを生成するが、そのどちらも血管の損傷のシーリングに関与する止血栓の必須構築要素である。トロンビンまたは血小板が全く存在しないと、止血は麻痺状態となり、致死的な出血を引き起こす。
血栓症は、止血と同様に、血小板およびトロンビン依存プロセスである。血栓症は、重合フィブリンおよび活性化血小板の病的な静脈内トロンビン依存性の進行性沈着であり、各種器官での血管の閉塞を引き起こす。健康な哺乳動物では、静脈内凝固は止血部位に局在化している。管腔内での血栓への進行は、活性化タンパク質C、プラスミン、およびアンチトロンビンなどの天然抗血栓酵素および阻害剤によって効率的に遮断される。血栓症は、抗血栓系が静脈内トロンビンのさらなる生成を制御できないときに発症する。罹患率および死亡率における大血管および/または微小血管血栓症の因果関係は、深部静脈血栓症、肺血栓塞栓症、末梢動脈血栓症および塞栓症、網膜静脈血栓症はもちろんのこと、心筋梗塞(非特許文献1;非特許文献2)、虚血性脳卒中(非特許文献3)、炭疽敗血症および髄膜炎菌性敗血症(非特許文献4)、またはヘパリン起因性血小板減少症(非特許文献5)も含む各種の疾患で直接記録されている。血栓性閉塞および低酸素に起因する器官損傷の証拠は、他の疾患群、たとえば出血熱(非特許文献6;非特許文献7;非特許文献8)、糖尿病性血管症(非特許文献9;非特許文献10)、腎臓病(非特許文献11;非特許文献12)、および複数の他の状態でも入手できる。
血栓症および止血は同一の分子プロセスではないが、それらは十分に似ているので、今日までに開発された抗血栓薬が意図せずに両方を標的としている。血栓症は抗血小板剤、線維素溶解促進剤、および抗凝固剤によって処置されるが、これらの薬剤の大半は、その最大有効用量で投与されたときに、血栓症と止血の両方を完全に遮断する可能性がある。抗血栓薬は、血栓の構築ブロック(フィブリンおよび血小板)を標的とするか、または分子(凝固因子)および細胞(血小板)が血栓形成プロセスに関与するのを抑制するかのどちらかである。抗血栓剤が止血を遮断できなければ、血栓症で作用しないであろうということが、医師や研究者の間で広く考えられている。
最古の抗凝固抗血栓剤の1つのヘパリンはいまだに、世界で最も広く投与される注射である。十分に高用量のヘパリンは、ほぼ100%の有効性を達成できるが、ただしこのような用量では止血を無効にすることと引き換えである。都合の悪いことに、分画ヘパリンまたは直接トロンビン阻害剤などのさらに新しい抗血栓剤では、はるかにうまく行くというわけではない。結果として、抗血栓剤、特に抗凝固薬および線維素溶解促進剤は、その最大有効用量未満で投与する必要があり、血栓症は処置不十分な疾患のままである。効力の改善の見込みに基づいているが、止血安全性の改善の見込みのない新たな化合物の導入は筋が通らない。今日までに、抗血栓化合物は安全性の改善の見込みが不十分である。理想的な抗血栓剤は、止血に悪影響を及ぼさずに、循環血の凝固を阻止するであろう。
それゆえ、止血を麻痺させることなく血管内血栓生成を遮断する、安全であるが有効な薬剤の開発に対する差し迫った医療上の要求が、なお存在する。
Meadows(1965)Med.J.Aust.4:409−411
Harland(1966)Lancet 26:1158−1160
Carmon(1966)J.Neurol.Sci.4:111−119
Dalldorf(1977)Arch.Pathol.Lab.Med.101:6−9
Rhodes(1973)Surg.Gynecol.Obstet.136:409−416
Dennis(1969)Br.J.Haematol.17:455−462
Gear(1979)Rev.Infect.Dis.1:571−591
Ignatiev(2000)Immunol.Lett.71:131−140
Ishibashi(1981)Diabetes 30:601−606
Boeri(2001)Diabetes 50:1432−1439
Miller(1980)Kidney Int.18:472−479
McCutcheon(1993)Lupus 2:99−103
止血を妨害せずに血栓症を抑制するための組成物および方法が提供される。組成物は、ヒトFXIの重鎖のエピトープ、特にヒトFXIの重鎖のA3ドメインへ結合可能である抗第XI因子モノクローナル抗体(aXIMab)を含む。組成物は、モノクローナル抗体のエピトープ結合断片、変異体、および誘導体、これらの抗体組成物を産生する株化細胞、ならびに抗体のアミノ酸配列をコードする単離核酸分子も含む。本発明は、製薬的に許容される担体中に本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合断片、変異体、もしくは誘導体を含む製薬組成物をさらに含む。本発明の方法は、上述の組成物を血栓症を抑制する目的で組成物の投与の必要がある対象に投与すること、抗血栓剤の必要な用量を減少させること、転移性癌を処置すること、または急性炎症反応を処置することを含む。抗第XI因子モノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合断片、変異体、もしくは誘導体を作製する方法も提供される。
I.概要
本発明は、止血を妨害せずに血栓症を抑制するための、抗第XI因子モノクローナル抗体(aXIMab)に関連する組成物および方法に関するものである。より十分に後述するように、認識され、霊長類(特に)ヒト第XI因子(FXI)の重鎖、特にヒトFXIの重鎖のアップル3(A3)ドメインに結合した1A6と呼ばれるマウス株化細胞からのモノクローナル抗体が調製された。ポリクローナル抗FXI抗体は研究および診断用途のために市販されているが、これらのポリクローナル抗体は、制御が不可能であり、その産生は生きている動物の利用可能性に依存しているために、安全に使用できない(たとえばGruber & Hanson(2003)Blood 102:953−955参照)。対照的に、モノクローナル抗体は、細胞培養物中で一貫して製造され、それらは合成できるか、または真菌から植物、動物に及ぶことがあるトランスジェニック生物の副生成物から精製できる。さらに、マウスモノクローナル抗FXI抗体は現在、研究用途で利用できるが、インビボでの安全な抗血栓剤として使用するための特異的な抗第XI因子モノクローナル抗体は産生されていない。
本発明は、止血を妨害せずに血栓症を抑制するための、抗第XI因子モノクローナル抗体(aXIMab)に関連する組成物および方法に関するものである。より十分に後述するように、認識され、霊長類(特に)ヒト第XI因子(FXI)の重鎖、特にヒトFXIの重鎖のアップル3(A3)ドメインに結合した1A6と呼ばれるマウス株化細胞からのモノクローナル抗体が調製された。ポリクローナル抗FXI抗体は研究および診断用途のために市販されているが、これらのポリクローナル抗体は、制御が不可能であり、その産生は生きている動物の利用可能性に依存しているために、安全に使用できない(たとえばGruber & Hanson(2003)Blood 102:953−955参照)。対照的に、モノクローナル抗体は、細胞培養物中で一貫して製造され、それらは合成できるか、または真菌から植物、動物に及ぶことがあるトランスジェニック生物の副生成物から精製できる。さらに、マウスモノクローナル抗FXI抗体は現在、研究用途で利用できるが、インビボでの安全な抗血栓剤として使用するための特異的な抗第XI因子モノクローナル抗体は産生されていない。
本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合断片、変異体、または誘導体の利点の1つは、抗凝固剤としてのその優れた安全性である。本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体は、FXIに対して単一特異的であり、そのままの形でまたは分解したときに、必須タンパク質を抑制せず、または重要な分子および経路と相互作用しない。これは他の抗血栓剤と比較したときに、特に安全上の利点である。とりわけ、最大有効用量を著しく超えた(たとえば最大有効用量の数倍の場合)抗第XI因子モノクローナル抗体は、対象においていずれの有害な出血または他の毒性副作用を生じなかった。対照的に、他のすべての抗血栓剤、たとえばビタミンKアンタゴニスト、必須凝固酵素の間接および直接阻害剤、血小板阻害剤、線維素溶解剤などは、その最大有効用量で投与されるときには、最終的に危険であり、致死性でさえある。
本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体の他の安全性の利点は、他の抗血栓剤、たとえば小型分子酵素阻害剤または血小板阻害剤と比較して、本発明のモノクローナル抗体が毒性代謝中間体を生成することなく代謝および排除され、その代謝が肝臓および腎臓機能の完全性と実質的に無関係であることである。さらに、本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体は、他の抗血栓剤とは対照的に、他の薬理化合物と相互作用せず、他の薬物の活性または代謝に直接影響を及ぼさない。
本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体は、強力な薬剤としても有用である。さらに十分に後述するように、抗第XI因子モノクローナル抗体の投与によって、FXI活性が病態の原因である疾患を予防または処置することができる。本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体は、出血を引き起こすことなく血栓形成を抑制して、それゆえ対象、特にヒトにおける血栓閉塞性疾患の安全な処置選択肢を提供する。他の抗血栓剤と比較した抗第XI因子モノクローナル抗体の別の利点は、単回用量が安全であり、1週間以上にわたって有効であることである。大半の抗血栓剤は、作用期間がより短い。
II.定義
「1つの(a)」または「1つの(an)」実体という用語は、その実体の1つ以上を指すことに注意するものとする;たとえば「抗第XI因子モノクローナル抗体(an anti−factor XI monoclonal antibody)」は1つ以上の抗第XI因子モノクローナル抗体を表すと理解される。そのようなものとして、用語「1つの(a)」(または「1つの(an)」)、「1つ以上の(one or more)および「少なくとも1つの(at least one)」は、本明細書で互換的に使用されうる。
「1つの(a)」または「1つの(an)」実体という用語は、その実体の1つ以上を指すことに注意するものとする;たとえば「抗第XI因子モノクローナル抗体(an anti−factor XI monoclonal antibody)」は1つ以上の抗第XI因子モノクローナル抗体を表すと理解される。そのようなものとして、用語「1つの(a)」(または「1つの(an)」)、「1つ以上の(one or more)および「少なくとも1つの(at least one)」は、本明細書で互換的に使用されうる。
「止血」という用語は本明細書で使用するように、血管系の損傷後に血液循環の完全性を維持する協調機構を指す。血管損傷のない正常循環において、血小板は活性化されず、自由に循環する。血管損傷によって、血小板が付着できる内皮下組織が露出される。付着性の血小板は、他の循環中の血小板を誘引して、毛細血管または他の小血管の漏出を閉止するのに特に有用である予備の栓を形成するであろう。このような事象は、1次止血と呼ばれる。この後には、通例、血漿凝固を引き起こして1次血小板栓を補強する一連の連鎖酵素反応を含む、2次止血が迅速に起こる。したがって止血剤は、血管の収縮、形成された血液要素の付着および凝集、および血液または血漿凝固を含む、止血に関与する生理学的プロセスのいずれも促進または強化することによって、出血を低速化または停止させる任意の薬剤である。
「凝固」という用語は本明細書で使用するように、血液または血漿の液体からゲル相への変換を生じる、フィブリンモノマーの重合プロセスを指す。液体血液の凝固は、インビトロで、静脈内で、または露出および損傷した組織表面で起こり得る。インビトロ血液凝固は、フィブリノゲン含量が減少して、フィブリンが対応して増加することを除いて、非凝固血液中に見出されるのと本質的に同じ相対比率で細胞および他の血液成分を保持するゲル化血液を生じる。「血餅」とは、液体血液で見出されるのと同じ相対比率ですべての血液成分で形成される、およびすべての血液成分を含有する粘性ゲルを意味する。
「凝固カスケード」という用語は本明細書で使用するように、たとえば参照によりその全体が本明細書に組み入れられている、Manolin in Wilsonら(eds):Harrison’s Principle of Internal Medicine,14th Ed.New York.McGraw−Mill,1998,p.341によって記載されているように、3つの相互関連する酵素経路を指す。内因性凝固経路は、第VIIIa因子および第X因子、リン脂質およびCa2+と併せて第Xa因子を与える、第IXa因子の形成を引き起こす。外因性経路は、組織因子および第VII因子の組合せの後に、第Xa因子および第IXa因子を与える。共通凝固経路は、血液凝固第V因子、第VIII因子、第IX因子および第X因子と相互作用して、プロトロンビンを切断してトロンビン(第IIa因子)にして、トロンビンは次にフィブリノゲンを切断してフィブリンにする。本明細書で使用するように、「ポリペプチド」という用語は、単数形の「ポリペプチド」はもちろんのこと、複数形の「ポリペプチド」を含むことを意図して、アミド結合(ペプチド結合としても公知)によって直鎖状に結合されたモノマー(アミノ酸)で構成された分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、2つ以上のアミノ酸の任意の鎖を指し、特定の長さの生成物を指すわけではない。それゆえペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または2つ以上のアミノ酸の鎖を指すために使用される他の任意の用語は、「ポリペプチド」の定義に含まれ、「ポリペプチド」の定義、および「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれの代わりにも、またはこれらの用語のいずれとも互換的に使用され得る。「ポリペプチド」という用語は、制限なく、グリコシル化、アセチル化、ホスホリル化、アミド化、公知の保護基/遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、または非天然発生型アミノ酸による修飾を含む、ポリペプチドの発現後修飾の生成物を指すことも意図する。ポリペプチドは、天然生物源から誘導され得るか、または組換え技術によって産生され得るが、指定された核酸配列から必ずしも翻訳されるわけではない。ポリペプチドは、化学合成を含む任意の方式で産生され得る。
本発明のポリペプチドは、約3以上の、5以上の、10以上の、20以上の、25以上の、50以上の、75以上の、100以上の、200以上の、500以上の、1,000以上の、または2,000以上のアミノ酸のサイズであり得る。ポリペプチドは定義された3次元構造を有し得るが、必ずしもこのような構造を有するわけではない。定義された3次元構造を有するポリペプチドは折畳まれたと呼ばれ、定義された3次元構造を有さずに、多数の異なる立体配座を取ることができるポリペプチドは、折畳まれていないと呼ばれる。「単離」ポリペプチドまたはその断片、変異体、もしくは誘導体とは、その本来の環境にないポリペプチドを意図する。特定のレベルの精製は必要ない。たとえば単離ポリペプチドは、その発生した環境または本来の環境から除去できる。宿主細胞中で発現された組換え産生ポリペプチドおよびタンパク質は、本発明の目的では、任意の好適な技法によって分離、分画、または部分的もしくは実質的に精製された未変性または組換えポリペプチドと同様に、単離されたと見なされる。
本発明のポリペプチドとしては、上述のポリペプチドの断片、誘導体、類似体、または変異体、ならびにその任意の組合せも含まれる。本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体または抗体ポリペプチドを指すときの「断片」、「変異体」、「誘導体」、および「類似体」という用語は、対応する抗体または本発明の抗体ポリペプチドの抗原結合特性の少なくともいくつかを保持する任意のポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドの断片は、本明細書の別の箇所で議論する特異的抗体断片に加えて、タンパク質分解断片はもちろんのこと、欠失断片も含む。本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体および抗体ポリペプチドの変異体は、上述の断片と、アミノ酸置換、欠失、または挿入のために改変されたアミノ酸配列を持つポリペプチドも含む。変異体は、自然発生型または非自然発生型であり得る。非自然発生型変異体は、当分野で公知の突然変異誘発技法を使用して産生され得る。変異体ポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失、または付加を含み得る。本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体および抗体ポリペプチドの誘導体は、参照抗体または本発明の抗体ポリペプチドには見出されないさらなる特徴を示すように改変されたポリペプチドである。例は、融合タンパク質を含む。変異体ポリペプチドは本明細書では、「ポリペプチド類似体」とも呼ばれ得る。本明細書で使用するように、抗第XI因子モノクローナル抗体および抗体ポリペプチドの「誘導体」は、官能性側基の反応によって化学的に誘導体化された1つ以上の残基を有する対象ポリペプチドを指す。20の標準アミノ酸の1つ以上の天然発生型アミノ酸誘導体を含有するペプチドも、「誘導体」として含まれる。たとえば、4−ヒドロキシプロリンは、プロリンを置換し得る;5−ヒドロキシリジンは、リジンを置換し得る;3−メチルヒスチジンは、ヒスチジンを置換し得る;ホモセリンは、セリンを置換し得る;およびオルニチンは、リジンを置換し得る。
「ポリヌクレオチド」という用語は、単数の核酸はもちろんのこと、複数の核酸も含むことを意図しており、単離核酸分子または構築物、たとえばメッセンジャRNA(mRNA)またはプラスミドDNA(pDNA)を指す。ポリヌクレオチドは、慣習的なホスホジエステル結合または非慣習的な結合(たとえばペプチド核酸(PNA)に見出されるようなアミド結合)を含み得る。「核酸」という用語は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の1つ以上の核酸セグメント、たとえばDNAまたはRNA断片を指す。「単離」核酸またはポリヌクレオチドとは、その本来の環境から除去された核酸分子、DNAまたはRNAを意図する。たとえば、ベクターに含有される抗第XI因子モノクローナル抗体をコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されたと見なされる。単離ポリヌクレオチドのさらなる例は、異種宿主細胞中に保持された組換えポリヌクレオチドまたは溶液中の(部分的または実質的)精製ポリヌクレオチドを含む。単離RNA分子は、本発明のポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロRNA転写物を含む。本発明による単離ポリヌクレオチドまたは核酸は、合成的に産生されたこのような分子をさらに含む。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターなどの調節要素であるか、または調節要素を含み得る。
本明細書で使用するように、「コード化領域」は、アミノ酸に翻訳されたコドンから成る核酸の部分である。「停止コドン」(TAG、TGA、またはTAA)はアミノ酸に翻訳されないものの、コード化領域の一部と見なされ得るが、任意のフランキング配列、たとえばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどはコード化領域の一部ではない。本発明の2つ以上のコード化領域は、単一のポリヌクレオチド構築物に、たとえば単一のベクターに、または別個のポリヌクレオチド構築物に、たとえば別個の(異なる)ベクターに存在することができる。さらに、任意のベクターは単一のコード化領域を含有し得るか、または2つ以上のコード化領域を含み得る、たとえば単一のベクターは免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を別個にコードし得る。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、抗第XI因子モノクローナル抗体またはその断片、変異体、もしくは誘導体をコードする核酸に融合または非融合のどちらかの異種コード化領域をコードし得る。異種コード化領域は制限なく、分泌シグナルペプチドまたは異種機能ドメインなどの特殊化要素またはモチーフを含む。
ある実施形態において、ポリヌクレオチドまたは核酸はDNAである。DNAの場合、通常ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、1つ以上のコード化領域と作動可能に結合されたプロモーターおよび/または他の転写もしくは翻訳制御要素を含み得る。作動可能な結合は、遺伝子産物、たとえばポリペプチドのコード化領域が1つ以上の調節配列と、遺伝子産物の発現を調節配列の影響または制御下に置くような方法で結合されている場合である。2つのDNA断片(ポリペプチドコード化領域およびそれに結合したプロモーターなど)は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするmRNAの転写を引き起こす場合に、および2つのDNA断片間の結合の性質が、発現調節配列が遺伝子産物の発現を指示する能力を妨害しない、またはDNAテンプレートが転写される能力を妨害しない場合に、「作動可能に結合されている」。それゆえプロモーター領域は、ポリペプチドをコードする核酸と、プロモーターがその核酸の転写を生じることができる場合に、作動可能に結合されるであろう。プロモーターは、所定の細胞のみにおいてDNAの実質的な転写を指示する細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーター以外の他の転写制御要素、たとえばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終結シグナルは、細胞特異的転写を指示するポリヌクレオチドと作動可能に結合することができる。好適なプロモーターならびに他の転写および翻訳制御領域は、当分野で周知である。
本発明は、ある抗第XI因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体、または誘導体に関する。天然発生型抗体などのフルサイズ抗体に特に言及しない限り、「抗第XI因子モノクローナル抗体」という用語は、フルサイズ抗体はもちろんのこと、このような抗体の抗原結合断片、変異体、類似体、または誘導体、たとえば天然発生型抗体もしくは免疫グロブリン分子または改変抗体分子もしくは抗体分子と同様の方式で抗原を結合する断片を含む。
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書で互換的に使用される。抗体または免疫グロブリンは、重鎖の可変ドメインを少なくとも含む、ならびに通常は重鎖および軽鎖の可変ドメインを少なくとも含む。脊椎動物系の基本的な免疫グロブリン構造は、比較的に十分に理解されている。たとえばHarlowら(1988)Antibodies:A Laboratory Manual(2nd ed.;Cold Spring Harbor Laboratory Press)を参照。
以下でさらに詳細に議論されるように、「免疫グロブリン」という用語は、生化学的に識別できる各種の広範なクラスのポリペプチドを含む。当業者は、重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン(γ、μ、α、δ、ε)と、その中のいくつかのサブクラス(たとえばγ1〜γ4)として分類されることを認識するであろう。抗体の「クラス」をIgG、IgM、IgA、IgD、またはIgEとしてそれぞれ判定することは、この鎖の性質である。免疫グロブリンサブクラス(アイソタイプ)、たとえばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1などは、特徴が明らかであり、機能特化を付与することが公知である。これらのクラスおよびアイソタイプそれぞれの修飾形は、本開示に照らして当業者によってただちに識別可能であり、したがって本発明の範囲内である。すべての免疫グロブリンクラスは明らかに本発明の範囲内にあるが、以下の議論は一般に、免疫グロブリン分子のIgGクラスに関するものであろう。IgGに関して、標準免疫グロブリン分子は、分子量約23,000ダルトンの2つの同一の軽鎖ポリペプチドと、分子量53,000〜70,000ダルトンの2つの同一の重鎖ポリペプチドとを含む。4本の鎖は通例ジスルフィルド結合によって「Y」配置で連結され、そこでは「Y」の入口から開始して、可変領域を通じて続く重鎖を軽鎖が包囲している。
軽鎖は、カッパまたはラムダ(κ、λ)として分類される。各重鎖クラスは、カッパまたはラムダ軽鎖のどちらかと結合し得る。一般に、軽鎖および重鎖は相互に共有結合され、免疫グロブリンがハイブリドーマ、B細胞、または遺伝子改変宿主細胞のいずれかによって産生されるときに、2本の重鎖の「尾」部は共有ジスルフィド結合によって相互に結合される。重鎖において、アミノ酸配列は、Y配置のフォーク型端部のN末端から各鎖下端のC末端まで続いている。
軽鎖および重鎖はどちらも、「定常領域」および「可変領域」と呼ばれる構造的および機能的に相同の領域に分けられる。「定常」および「可変」という用語は、機能的に使用される。この点で、軽鎖(VL)および重鎖(VH)部分の両方の可変ドメインが抗原認識および特異性を決定することが認識されるであろう。反対に、軽鎖(CL)および重鎖(CH1、CH2、またはCH3)の定常領域は、分泌、経胎盤移動性、Fc受容体結合、補体結合などの重要な生物特性を与える。慣習により、定常領域ドメインのナンバリングは、定常領域ドメインが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより遠くなるにつれて大きくなる。N末端部分は可変領域であり、C末端部分では定常領域である;CH3およびCLドメインは、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端それぞれを実際に含む。
上で指摘したように、可変領域によって、抗体は抗原のエピトープを選択的に認識して、特異的に結合することができる。すなわち、抗体のVLドメインおよびVHドメイン、またはこれらの可変ドメイン内の相補性決定領域(CDR)のサブセットは結合して、3次元抗原結合部位を定義する可変領域を形成する。この4次抗体構造は、Yの各アーム端に存在する抗原結合部位を形成する。さらに詳細には、抗原結合部位は、VHおよびVL鎖それぞれの3つのCDRによって定義される。
天然発生型抗体において、各抗原結合ドメインに存在する6つの「相補性決定領域」すなわち「CDR」は、抗体が水性環境においてその3次元配置をとるときに、抗原結合ドメインを形成するために特異的に位置決めされているアミノ酸の短い非隣接配列である。「フレームワーク」領域と呼ばれる、抗原結合ドメイン内のアミノ酸の残りの部分は、より低い分子内可変性を示す。フレームワーク領域は主にβシート立体配座をとり、CDRはβシート構造を結合するループを形成し、場合によってはβシート構造の一部を形成する。それゆえ、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合相互作用によって、正しい向きでのCDRの位置決めを与える足場を形成するように作用する。位置決めされたCDRによって形成された抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原のエピトープに相補的な表面を定義する。この相補的表面は、抗体のその同族エピトープへの非共有結合を促進する。CDRおよびフレームワーク領域をそれぞれ含むアミノ酸が、当業者によって任意の重鎖または軽鎖可変領域についてただちに識別可能であるのは、それらが明確に定義されているためである(参照によりその全体が本明細書に組み入れられている“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”Kabatら(1983)U.S.Department of Health and Human Services;およびChothia and Lesk(1987)J Mol.Biol.,196:901−917を参照)。
当分野で使用されている、および/または受け入れられている用語の定義が2つ以上ある場合、用語の定義は本明細書で使用するように、反対のことが明示的に示されていない限り、すべてのこのような意味を含むことを意図する。詳細な例は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見出される非隣接抗原結合部位を説明する、「相補性決定領域」(「CDR」)という用語の使用である。この特定の領域は、参照によって本明細書に組み入れられているKabatら(1983)U.S.Dept.of Health and Human Services,“Sequences of Proteins of Immunological Interest”およびChothia and Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901−917によって記載されており、その定義は、相互に比較したときのアミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。それにもかかわらず、抗体またはその変異体のCDRを指すどちらの定義の利用も、本明細書で定義および使用するような用語の範囲内であることを意図する。当業者は、抗体の可変アミノ酸配列を与えた特定のCDRを含む残基を日常的に判定することができる。
Kabatらは、任意の抗体に適用できる可変ドメイン配列のナンバリング系も定義した。当業者は、配列自体を超える任意の実験データに依存することなく、この「Kabatナンバリング」系を任意の可変ドメイン配列に明確に割当てることができる。本明細書で使用するように、「Kabatナンバリング」は、Kabatら(1983)U.S.Dept.of Health and Human Services,“Sequence of Proteins of Immunological Interest.”によって記載されたナンバリング形を指す。別途規定しない限り、本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体における特異的アミノ酸残基位置のナンバリングは、Kabatナンバリング系に従う。
本発明の抗体または抗体結合断片、変異体、もしくは誘導体は、これに限定されるわけではないが、モノクローナル、ヒト、ヒト化、霊長類化、またはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、たとえばFab、Fab’およびF(ab’)2、Fd、Fvs、単鎖Fvs(scFv)、単鎖抗体、ジスルフィド結合Fvs(sdFv)、VLまたはVHドメインのどちらかを含む断片、Fab発現ライブラリによって産生された断片、および抗イディオタイプ(抗Id)抗体(たとえば本明細書で開示される抗第XI因子モノクローナル抗体に対する抗Id抗体)を含む。ScFv分子は当分野で公知であり、たとえばU.S.Patent No.5,892,019に記載されている。本発明の免疫グロブリンまたは抗体分子は、免疫グロブリン分子の任意の種類(たとえばIgG、IgE、IgM、IgD、IgA、およびIgY)、クラス(たとえばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2など)、またはサブクラスであり得る。
単鎖抗体を含む抗体断片は、単独のまたは次の:ヒンジ領域、CH1、CH2、およびCH3ドメインの全部または一部と組合せた可変領域を含み得る。可変領域とヒンジ領域、CH1、CH2、およびCH3ドメインとの任意の組合せも含む抗原結合断片も、本発明に含まれる。
本明細書で使用するように、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、以下で、およびたとえばKucherlapatiらによるU.S.Patent No.5,939,598に記載されたような、ヒト免疫グロブリンライブラリからまたは1つ以上のヒト免疫グロブリンに対してトランスジェニックである動物から単離されて、内因性免疫グロブリンを発現しない抗体を含む。
本明細書で使用するように、「重鎖部分」という用語は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。重鎖部分を含むポリペプチドは:CH1ドメイン、ヒンジ(たとえば上部、中間、および/または下部ヒンジ領域)ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン、またはその変異体もしくは断片の少なくとも1つを含む。たとえば、本発明で使用するための結合ポリペプチドは、CH1ドメインを含むポリペプチド鎖;CH1ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびCH2ドメインを含むポリペプチド鎖;CH1ドメインおよびCH3ドメインを含むポリペプチド鎖;CH1ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびCH3ドメインを含むポリペプチド鎖、またはCH1ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含むポリペプチド鎖を含み得る。別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、CH3ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本発明で使用するための結合ポリペプチドは、CH2ドメインの少なくとも一部(たとえばCH2ドメインの全部または一部)を欠失し得る。上述のように、当業者によって、これらのドメイン(たとえば重鎖部分)が、天然発生型免疫グロブリン分子によるアミノ酸配列とそれらが異なるように修飾され得ることが理解されるであろう。
本明細書で開示する抗第XI因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、それらが特異的に結合する抗原のエピトープまたは部分、たとえば標的ポリペプチド(配列番号1で記載される、ヒト第XI因子)について記載または規定され得る。抗体の抗原結合ドメインと特異的に相互作用する標的ポリペプチドの部分は、「エピトープ」または「抗原決定基」と呼ばれる。標的ポリペプチドは、単一のエピトープを含み得るが、通例は少なくとも2個のエピトープを含み、抗原のサイズ、立体配座、および種類に応じて任意の数のエピトープを含むことができる。さらに、標的ポリペプチドの「エピトープ」が非ポリペプチド要素であり得るか、非ポリペプチド要素を含み得る、たとえばエピトープが炭水化物側鎖を含み得ることに注目すべきである。
抗体のペプチドまたはポリペプチドエピトープの最小サイズは、約4〜5アミノ酸と考えられる。ペプチドまたはポリペプチドエピトープは、好ましくは少なくとも7の、さらに好ましくは少なくとも9のおよび最も好ましくは少なくとも約15〜約30のアミノ酸を含有する。CDRは抗原ペプチドまたはポリペプチドをその3次形で認識できるため、エピトープを含むアミノ酸は隣接している必要はなく、いくつかの場合には、同じペプチド鎖上になくてもよい。本発明において、本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体によって認識されるペプチドまたはポリペプチドは、ヒト第XI因子の重鎖に位置して、ヒト第XI因子の少なくとも4の、少なくとも5の、少なくとも6の、少なくとも7の、さらに好ましくは少なくとも8の、少なくとも9の、少なくとも10の、少なくとも15の、少なくとも20の、少なくとも25の、または約15〜約30の隣接または非隣接アミノ酸の配列(配列番号1)を含有する。
「特異的に結合する」とは、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合することと、結合が抗原結合ドメインとエピトープとの間に多少の相補性を含むこととを一般に意味する。この定義に従って、抗体がエピトープに「特異的に結合する」と言われるのは、抗体がそのエピトープにランダムな無関係のエピトープよりも容易に、その抗原結合ドメインを介して結合するときである。「特異性」という用語は本明細書では、ある抗体があるエピトープに結合する際の相対的親和性を制限するために使用する。たとえば、抗体「A」が所与のエピトープに対して抗体「B」よりも高い特異性を有すると見なすことができ、または抗体「A」は、それが関連エピトープ「D」に対して有するよりも高い特異性でエピトープ「C」に結合すると言うことができる。
「優先的に結合する」とは、抗体が関連する、同様の、相同の、または類似のエピトープに結合するよりも容易に、抗体がエピトープに特異的に結合することを意味する。それゆえ、所与のエピトープに「優先的に結合する」抗体は、そのような抗体が関連するエピトープと交差反応することができても、関連するエピトープよりもそのエピトープに結合しやすい。
非制限的な例としては、抗体が第1のエピトープに優先的に結合すると見なされ得るのは、抗体が前記第1のエピトープを、第2のエピトープに対する抗体の解離定数(KD)よりも低いKDで結合する場合である。別の非制限的な例において、抗体が第1の抗原に優先的に結合すると見なされ得るのは、抗体が第1のエピトープを、第2のエピトープに対する抗体のKDよりも少なくとも1桁小さい親和性で結合する場合である。別の非制限的な例において、抗体が第1のエピトープに優先的に結合すると見なされ得るのは、抗体が第1のエピトープを、第2のエピトープに対する抗体のKDよりも少なくとも2桁小さい親和性で結合する場合である。
別の非制限的な例において、抗体が第1のエピトープに優先的に結合すると見なされ得るのは、抗体が第1のエピトープを、第2のエピトープに対する抗体の解離速度(k(off))よりも小さいk(off)で結合する場合である。別の非制限的な例において、抗体が第1のエピトープに優先的に結合すると見なされ得るのは、抗体が第1のエピトープを、第2のエピトープに対する抗体のk(off)よりも少なくとも1桁小さい親和性で結合する場合である。別の非制限的な例において、抗体が第1のエピトープに優先的に結合すると見なされ得るのは、抗体が第1のエピトープを、第2のエピトープに対する抗体のk(off)よりも少なくとも2桁小さい親和性で結合する場合である。
本明細書で開示される抗体または抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、本明細書で開示される標的ポリペプチドまたはその断片もしくは変異体を5×10−2sec−1、10−2sec−1、5×10−3sec−1、または10−3sec−1以下の解離速度(k(off))で結合すると言うことができる。さらに好ましくは、本発明の抗体は、本明細書で開示される標的ポリペプチドまたはその断片もしくは変異体を5×10−4sec−1、10−4sec−1、5×10−5sec−1、または10−5sec−1、5×10−6sec−1、10−6sec−1、5×10−7sec−1、または10−7sec−1、以下の解離速度(k(off))で結合すると言うことができる。
本明細書で開示される抗体またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、本明細書で開示される標的ポリペプチドまたはその断片もしくは変異体を103M−1sec−1、5×103M−1sec−1、104M−1sec−1、または5×104M−1sec−1以上の会合速度(k(on))で結合すると言うことができる。さらに好ましくは、本発明の抗体は、本明細書で開示される標的ポリペプチドまたはその断片もしくは変異体を105M−1sec−1、5×105M−1sec−1、106M−1sec−1、5×106M−1sec−1、または107M−1sec−1以上の会合速度(k(on))で結合すると言うことができる。
抗体が参照抗体の所与のエピトープへの結合を競合的に阻害すると言われるのは、抗体がそのエピトープに、抗体が参照抗体のエピトープへの結合をある程度まで遮断する範囲で優先的に結合する場合である。競合的阻害は、当分野で公知の任意の方法、たとえば競合的ELISAアッセイによって判定され得る。抗体は、参照抗体の所与のエピトープへの結合を少なくとも90%、少なくとも80%、少なくとも70%、少なくとも60%、または少なくとも50%競合的に阻害すると言うことができる。
本明細書で使用するように、「親和性」という用語は、個々のエピトープの免疫グロブリン分子のCDRとの結合の強度の尺度を指す。たとえばHarlowら(1988)Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.)27〜28頁を参照。本明細書で使用するように、「アビディティ」という用語は、免疫グロブリンの集合と抗原との間の複合体の全体的な安定性、すなわち免疫グロブリン混合物と抗原との機能的結合強度を指す。たとえばHarlowの29〜34頁を参照。アビディティは、集合の中の個々の免疫グロブリン分子と特異的エピトープとの親和性、および免疫グロブリンおよび抗原の価数の両方に関連する。たとえば2価モノクローナル抗体とポリマーなどの高い反復エピトープ構造を備えた抗原との間の相互作用は、アビディティの高い相互作用であろう。
本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、本発明のポリペプチドに対するその結合親和性によっても記載または規定され得る。好ましい結合親和性は、5×10−2M、10−2M、5×10−3M、10−3M、5×10−4M、10−4M、5×10−5M、10−5M、5×10−6M、10−6M、5×10−7M、10−7M、5×10−8M、10−8M、5×10−9M、10−9M、5×10−10M、10−10M、5×10−11M、10−11M、5×10−12M、10−12M、5×10−13M、10−13M、5×10−14M、10−14M、5×10−15M、または10−15M未満の解離定数すなわちKdを持つ結合親和性を含む。
本明細書で使用するように、「キメラ抗体」は、免疫反応性領域または部位が第1の種から得られまたは由来して、(本発明に従って無処置、部分または修飾であり得る)定常領域が第2の種から得られる任意の抗体を意味すると考えられる。好ましい実施形態において、標的結合領域または部位は非ヒト源(たとえばマウスまたは霊長類)からであり、定常領域はヒトである。
本明細書で使用するように、「改変抗体」という用語は、重鎖もしくは軽鎖どちらかまたは両方の可変ドメインが公知の特異性の抗体からの1つ以上のCDRの少なくとも部分的な置換によって、ならびに必要ならば、部分的なフレームワーク領域の置換および配列変化によって改変された抗体を指す。CDRは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラスの抗体、またはサブクラスの抗体にさえ由来し得るが、CDRは異なるクラスの抗体から、および好ましくは異なる種による抗体から由来することが考えられる。公知の特異性の非ヒト抗体からの1つ以上の「ドナー」CDRがヒト重鎖または軽鎖フレームワーク領域内に移植された改変抗体は、本明細書では「ヒト化抗体」と呼ばれる。1つの可変ドメインの抗原結合能力を別の可変ドメインに伝達するために、CDRのすべてをドナー可変ドメインからの完全CDRで置換することは必要でないことがある。むしろ、標的結合部位の活性を維持するために必要である残基を転移することのみが必要であり得る。
ヒト化抗体の重鎖もしくは軽鎖、または両方の可変ドメイン内のフレームワーク領域がヒト起源の残基のみを含み得ることがさらに認識され、この場合にヒト化抗体のこれらのフレームワーク領域は「完全ヒトフレームワーク領域」と呼ばれる。または、ドナー可変ドメインのフレームワーク領域の1つ以上の残基は、適正な結合を維持するために、またはヒト第XI抗原への結合を向上させるために必要な場合には、ヒト化領域の重鎖もしくは軽鎖、または両方の可変ドメインのヒトフレームワーク領域の対応する位置内で改変することが可能である。それゆえこの方式で改変されたヒトフレームワーク領域は、ヒトおよびドナーフレームワーク残基の混合物を含み、本明細書では「部分ヒトフレームワーク領域」と呼ばれる。たとえばU.S.Patent Nos.5,585,089、5,693,761、5,693,762、および6,180,370に記載された説明を考えると、所定の実験を実施すること、または機能性改変もしくはヒト化抗体を得るための試行錯誤試験のどちらかによって、それは当業者の能力の十分に範囲内であろう。
たとえば抗第XI因子モノクローナル抗体のヒト化は、Winterおよび共同研究者の方法(Jonesら(1986)Nature 321:522−525;Riechmannら(1988)Nature 332:323−327;Verhoeyenら(1988)Science 239:1534−1536)に従って、げっ歯類または突然変異げっ歯類CDRまたはCDR配列をヒト抗第XI因子モノクローナル抗体の対応する配列の代わりに使用することによって本質的に実施できる。参照により本明細書に組み入れられているU.S.Patent Nos.5,225,539;5,585,089;5,693,761;5,693,762;5,859,205も参照。得られたヒト化抗第XI因子モノクローナル抗体は、ヒト化抗体の重鎖および/または軽鎖の可変ドメインの完全ヒトフレームワーク領域内に少なくとも1つのげっ歯類または突然変異げっ歯類CDRを含むであろう。いくつかの例において、ヒト化抗第XI因子モノクローナル抗体の1つ以上の可変ドメインのフレームワーク領域内の残基は、対応する非ヒト(たとえばげっ歯類)残基によって置換され(たとえばU.S.Patent Nos.5,585,089;5,693,761;5,693,762;および6,180,370を参照)、この場合、得られたヒト化抗第XI因子モノクローナル抗体は、重鎖および/または軽鎖の可変ドメイン内に部分ヒトフレームワーク領域を含むであろう。
さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに向上させるために(たとえば所望の親和性を得るために)行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つの、通例は2つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここでCDRのすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのCDRに対応して、フレームワーク領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のフレームワーク領域に対応する。ヒト化抗体は場合により、免疫グロブリン定常領域(Fc)、通例はヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部も含むであろう。さらなる詳細事項については、参照により本明細書に組み入れられている、Jonesら、Nature 331:522−525(1986);Riechmannら、Nature 332:323−329(1988);およびPresta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593−596(1992)を参照。したがって、このような「ヒト化」抗体は、無処置ヒト可変ドメインよりも実質的に小さい部分が非ヒト種からの対応する配列によって置換されている抗体を含み得る。実際に、ヒト化抗体は通例、一部のCDR残基およびおそらく一部のフレームワーク残基がげっ歯類抗体中の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。たとえばU.S.Patent Nos.5,225,539;5,585,089;5,693,761;5,693,762;5,859,205を参照。ヒト化抗体および所定の抗原に対して改良された親和性を有するヒト化抗体を産生する技法が開示されている、U.S.Patent No.6,180,370、およびInternational Publication No.WO 01/27160も参照。
本明細書で使用するように、「適正に折畳まれたポリペプチド」という用語は、ポリペプチドを含む機能性ドメインのすべてが明確に活性であるポリペプチド(たとえば抗第XI因子モノクローナル抗体)を含む。本明細書で使用するように、「不適正に折畳まれたポリペプチド」という用語は、ポリペプチドの機能性ドメインの少なくとも1つが活性でないポリペプチドを含む。一実施形態において、適正に折畳まれたポリペプチドは、少なくとも1つのジスルフィド結合によって結合されたポリペプチド鎖を含み、反対に、不適正に折畳まれたポリペプチドは、少なくとも1つのジスルフィド結合によって結合されていないポリペプチド鎖を含む。
本明細書で使用するように、「改変された」という用語は、合成手段(たとえば組換え技法、インビトロペプチド合成による、ペプチドの酵素もしくは化学結合またはこれらの技法のある組合せによる)による核酸またはポリペプチド分子の操作を含む。
「発現」という用語は本明細書で使用するように、遺伝子が生化学物質、たとえばポリペプチドを産生するプロセスを指す。プロセスは、制限なく、遺伝子ノックダウンはもちろんのこと、一過性発現および安定発現も含む、細胞内の遺伝子の機能的存在の何らかの顕在化を含む。プロセスは制限なく、遺伝子のメッセンジャRNA(mRNA)中への制限転写、およびこのようなmRNAのポリペプチドへの翻訳を含む。所望の最終生成物が生化学物質である場合、発現はその生化学物質および任意の前駆体の生成を含む。遺伝子の発現は、「遺伝子産物」を産生する。本明細書で使用するように、遺伝子産物は、核酸、たとえば遺伝子の転写によって産生されたメッセンジャRNA、または転写物から翻訳されたポリペプチドのどちらかであり得る。本明細書に記載する遺伝子産物は、翻訳後修飾、たとえばポリアデニル化を有する核酸、または翻訳後修飾、たとえばメチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットの結合、タンパク質分解的切断などを有するポリペプチドをさらに含む。
本明細書で使用するように、「処置する」および「処置」という用語は、治療的処置および予防的または防止的方策の両方を指し、目的は望ましくない生理学的変化または障害、たとえば疾患状態の進行を予防または減速(減少)することである。有益なまたは所望の臨床結果は、これに限定されるわけではないが、検出可能または検出不能にかかわらず、症状の軽減、疾患の程度の減弱、安定した(すなわち悪化していない)疾患の状況、疾患進行の遅延または減速、疾患状況の改善または緩和、および寛解(一部または完全にかかわらず)を含む。「処置」は、処置を受けていない場合に予想される生存と比較した、延長する生存も意味することができる。処置を必要とする人々は、すでに状態または障害を持つ人々はもちろんのこと、状態または障害を有しやすい人々または状態または障害が予防される人々を含む。
「対象」または「個人」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」は、診断、予後、または治療が所望される任意の対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象は、ヒト、非ヒト霊長類、家畜、牧畜、ならびに動物園、競技、またはペット用動物、たとえばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、肉牛、乳牛などを含む。
本明細書で使用するように、「抗第XI因子モノクローナル抗体の投与から恩恵を受けるであろう対象」および「処置が必要な動物」などの句は、たとえば抗第XI因子モノクローナル抗体によって血栓症を抑制するために使用された抗第XI因子モノクローナル抗体の投与から恩恵を受けるであろう哺乳動物対象などの対象を含む。
本発明の常法は、別途指摘しない限り、当分野の技術の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子導入生物学、微生物学、組み換えDNA、および免疫学の従来技法を利用するであろう。このような技法は、文献で十分に説明されている。たとえば
抗体工学の一般原理は、Borrebaeck,ed.(1995)Antibody Engineering(2nd ed.;Oxford Univ.Press)に記載されている。タンパク質工学の一般原理は、Rickwoodら、eds.(1995)Protein Engineering,A Practical Approach(IRL Press at Oxford Univ.Press,Oxford,Eng.)に記載されている。抗体および抗体−ハプテン結合の一般原理は:Nisonoff(1984)Molecular Immunology(2nd ed.;Sinauer Associates,Sunderland,MA);およびSteward(1984)Antibodies,Their Structure and Function(Chapman and Hall,New York,NY)に記載されている。さらに、当分野で公知であり、特に記載されていない免疫学の標準方法は一般に、Current Protocols in Immunology,John Wiley & Sons,New York;Stitesら、eds.(1994)Basic and Clinical Immunology(8th ed;Appleton & Lange,Norwalk,CT)およびMishell and Shiigi(eds)(1980)Selected Methods in Cellular Immunology(W.H.Freeman and Co.,NY)にあるように従った。
免疫学の一般原理について記載している標準参考研究は、
III.ヒト第XI因子
ヒト第XI因子は、分子量が約160,000ダルトンの2本鎖糖タンパク質である。2本の鎖は、分子量が約80,000ダルトンの同じジスルフィド結合ポリペプチドである。第XI因子は、第XIIa因子によって活性化されて、第XIa因子となる。ヒト第XI因子のアミノ酸配列は決定されており(たとえばFujikawaら(1986)Biochemistry 25:2417−2424を参照)、配列番号1として与えられている。ヒトでは、FXIの遺伝子は、染色体4(4q35.2)の遠位端に位置しており、ゲノムDNAの〜25kbにわたって広がる15エキソンを含有する(Asakiら(1987)Biochemistry 26:7221−7228;Katoら(1989)Cytogenet.Cell Genet.52:77)。
ヒト第XI因子は、分子量が約160,000ダルトンの2本鎖糖タンパク質である。2本の鎖は、分子量が約80,000ダルトンの同じジスルフィド結合ポリペプチドである。第XI因子は、第XIIa因子によって活性化されて、第XIa因子となる。ヒト第XI因子のアミノ酸配列は決定されており(たとえばFujikawaら(1986)Biochemistry 25:2417−2424を参照)、配列番号1として与えられている。ヒトでは、FXIの遺伝子は、染色体4(4q35.2)の遠位端に位置しており、ゲノムDNAの〜25kbにわたって広がる15エキソンを含有する(Asakiら(1987)Biochemistry 26:7221−7228;Katoら(1989)Cytogenet.Cell Genet.52:77)。
第XI因子の第XIIa因子による活性化のための切断部位は、各ペプチド鎖のArg−369とIle−370との間の内部ペプチド結合である(Fujikawaら(1986)Biochemistry 25:2417−2424)。第XIa因子の各重鎖(369アミノ酸)は、アップルドメインと呼ばれる90〜91アミノ酸の4つのタンデム反復(A1〜A4と呼ばれる)に加えて短い接続ペプチドを含有する(Fujikawaら(1986)Biochemistry 25:2417−2424;Sunら(1999)J.Biol.Chem.274:36373−36378)。第XIa因子の軽鎖(それぞれ238アミノ酸)は、セリンプロテアーゼのトリプシンファミリに特有である配列を持つ酵素の触媒部分を含有する(Fujikawaら(1986)Biochemistry 25:2417−2424)。XIaは、第XI因子A3ドメインを必要とする相互作用において、その基質である第IX因子をタンパク質分解によって切断する(Sun,Y.,and Gailani,D.(1996)J.Biol.Chem.271,29023−29028)。
IV.抗第XI因子モノクローナル抗体
一実施形態において、本発明は、その抗原結合断片、変異体、または誘導体を含む、抗第XI因子モノクローナル抗体に関する。本明細書で使用するように、「抗第XI因子モノクローナル抗体」という用語は、ヒト第XI因子、特にヒトFXIの重鎖のA3ドメイン(配列番号1の位置182〜265)内のエピトープを特異的に認識する抗体である。一実施形態において、エピトープは、ヒトFXIのA3ドメインの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、またはそれ以上のアミノ酸を含む。別の実施形態において、エピトープは:a)配列番号1のアミノ酸183〜197;b)配列番号1のアミノ酸203〜204;c)配列番号1のアミノ酸234〜236;d)配列番号1のアミノ酸241〜243;e)配列番号1のアミノ酸252〜254;およびf)配列番号1のアミノ酸258〜260から成る群より選択される。詳細な実施形態において、エピトープは:a)配列番号1のアミノ酸183〜197;b)配列番号1のアミノ酸252〜254;およびc)配列番号1のアミノ酸258〜260から成る群より選択される。
別の実施形態において、本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体は、ヒトFXIの重鎖のA3ドメイン(配列番号1の位置182〜265)からの2以上のアミノ酸を含むペプチドである抗原に対して結合特異性を有する。また別の実施形態において、本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体は:a)配列番号1のアミノ酸183〜197;b)配列番号1のアミノ酸203〜204;c)配列番号1のアミノ酸234〜236;d)配列番号1のアミノ酸241〜243;e)配列番号1のアミノ酸252〜254;およびf)配列番号1のアミノ酸258〜260から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドである抗原に対して結合特異性を有する。詳細な実施形態において、本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体は:a)配列番号1のアミノ酸183〜197;b)配列番号1のアミノ酸252〜254;およびc)配列番号1のアミノ酸258〜260から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドである抗原に対して結合特異性を有する。
その抗原結合断片、変異体、または誘導体を含む、本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体は生物活性である。「生物活性」という用語は本明細書で使用するように、本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体の抗血栓活性に関連する次の生理学的活性:1)活性化第XI因子の凝固活性の抑制;2)第XI因子の活性化の予防;および3)対象の循環系からの第XI因子のクリアランスの促進の1つ以上を指す。
一実施形態において、「生物活性」という用語は、活性化ヒト第XI因子の凝固活性を抑制することを指す。「凝固活性を抑制する」という句は本明細書で使用するように、活性化第XI因子が血餅形成を生じさせる能力を低下させることを指す。凝固活性が抑制されたか否かを判定する方法は、血漿または全血サンプル中での血餅強度および/または血餅形成までの時間の長さを測定するアッセイの使用を含む。したがって、凝固活性の抑制は本明細書で使用するように、少なくとも5%の逆転、少なくとも10%の逆転、少なくとも20%の逆転、少なくとも30%の逆転、少なくとも40%の逆転、少なくとも50%の逆転、少なくとも60%の逆転、少なくとも70%の逆転、少なくとも80%の逆転、少なくとも90%の逆転、および最大100%の逆転(100%を含む)を含む、凝固薬の効果を少なくとも部分的に逆転させることを指す。「逆転」という用語は本明細書で使用するように、血餅形成開始までの時間を延長することまたは血餅強度を低下させることを指す。血餅形成開始および血餅強度を測定するアッセイは、当分野で周知であり、活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)、トロンボエラストグラフィー(TEG(登録商標)、およびThrombinoscope(登録商標)システムを使用するトロンビン生成の連続監視(たとえばBanezら(1980)Am.J.Clin.Pathol.,74:569−574;van den Besselaarら(1990)Thromb.Haemost.,63:16−23;Kawasakiら(2004)Anesthesia & Analgesia,99:1440−1444;Hemkerら(2003)Pathophysiology of Haemostasis & Thrombosis,33:4−15を参照)を含む。
一実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ株化細胞1A6によって産生される。
本発明は、ヒト第XI因子に結合するヒト化抗第XI因子抗体にも関する。いくつかの実施形態において、本発明の抗第XI因子抗体は、少なくとも1つの最適化相補性決定領域(CDR)を含む。「最適化CDR」とは、CDRが、最適化CDRを含む抗第XI因子抗体に与えられている、持続もしくは改善された結合親和性および/または抗第XI因子活性に基づいて選択された、修飾および最適された配列であったことを意図する。「抗第XI因子活性」または「第XI因子遮断活性」は、本明細書の別の箇所で記載するように、次の生理学的活性:1)活性化第XI因子の凝固活性の抑制;2)第XI因子の活性化の予防;および3)対象の循環系からの第XI因子のクリアランスの促進;の1つ以上を含むことができる。
修飾は、抗第XI因子抗体が第XI因子抗原に対する特異性を保持して、改善された結合親和性および/または改善された抗第XI因子活性を有するような、CDR内のアミノ酸残基の置換を含む。本発明の抗第XI因子抗体の抗第XI因子活性は、本明細書に記載するような機能アッセイにおいて、aXIMab(1A6)と比較して改善されている。本発明の新規抗第XI因子抗体およびその好適な抗体結合断片、変異体、および誘導体も、標準アッセイで測定されたように、aXIMab(1A6)によって示される活性に少なくとも類似した抗第XI活性を示す。本発明の最適化CDRは、抗第XI因子抗体の重鎖および軽鎖それぞれのVHおよびVLドメインに利用される。本発明の例示的な抗第XI因子抗体は、配列番号3および7から成る群より選択されるVHドメイン、もしく/または配列番号5および9から成る群より選択されるVLドメインを含む。
本発明の抗第XI因子抗体は、少なくとも1つの最適化相補性決定領域(CDR)を含む。「最適化CDR」とは、CDRが、最適化CDRを含む抗第XI因子抗体に与えられている改善された結合親和性および/または改善されたCDC活性に基づいて選択された、修飾および最適化された配列であったことを意図する。修飾は、抗第XI因子抗体が第XI因子抗原に対する特異性を保持して、改善もしくは持続された結合親和性および/または抗第XI因子活性を有するような、CDR内のアミノ酸残基の置換を含む。本発明の抗第XI因子抗体の抗第XI因子活性は、本明細書に記載するような機能アッセイにおいて、aXIMab(1A6)と比較して改善または持続されている。本発明の最適化CDRは、抗ヒト第XI因子抗体の重鎖および軽鎖それぞれのVHおよびVLドメインに利用される。本発明の例示的な抗第XI因子抗体は、配列番号3および7から成る群より選択されるVHドメイン、ならびに/または配列番号5および9から成る群より選択されるVLドメインを含む。
いくつかの実施形態において、本発明の抗第XI因子抗体は、最適化CDRを含む。すなわち、本発明の抗第XI因子抗体は、配列番号10〜15から成る群より選択された少なくとも1つの最適化CDRアミノ酸配列または配列番号10〜15から成る群より選択された配列に少なくとも約65%の、約70%の、約75%の、約80%の、約85%の、約90%の、約95%の、約96%の、約97%の、約98%の、約99%の、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。すなわち、最適化CDRは、配列番号10〜15で示した配列および関与するCDRに応じて、少なくとも1、2、3、4、または5のアミノ酸置換を有する配列番号10〜15の配列を含む。
それゆえ、いくつかの実施形態において、本発明の抗第XI因子抗体は:
a)配列番号:10、11、または12で示すアミノ酸配列を含むCDR;および
b)配列番号:10、11、または12で示すアミノ酸配列に少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR;
から成る群より選択される、少なくとも1つの最適化CDRを有するVHドメインを含む。
a)配列番号:10、11、または12で示すアミノ酸配列を含むCDR;および
b)配列番号:10、11、または12で示すアミノ酸配列に少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR;
から成る群より選択される、少なくとも1つの最適化CDRを有するVHドメインを含む。
他の実施形態において、本発明の抗第XI因子抗体は:
a)配列番号13、14、または15で示すアミノ酸配列を含むCDR;および
b)配列番号13、14、または15で示すアミノ酸配列に少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR;
から成る群より選択される、少なくとも1つの最適化CDRを有するVLドメインを含む。
a)配列番号13、14、または15で示すアミノ酸配列を含むCDR;および
b)配列番号13、14、または15で示すアミノ酸配列に少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR;
から成る群より選択される、少なくとも1つの最適化CDRを有するVLドメインを含む。
他の実施形態において、本発明の抗第XI因子抗体は、VHドメインおよびVLドメインを含み、前記VHドメインは、配列番号10、11、または12で示すアミノ酸配列を含む少なくとも1つの最適化CDRを有し、前記VLドメインは、配列番号13、14、または15で示すアミノ酸配列を含む少なくとも1つの最適化CDRを有する。
いくつかの実施形態において、本発明の最適化CDRの少なくとも1つを含む抗第XI因子抗体は、IgGカッパ免疫グロブリンである。このような実施形態において、IgGカッパ免疫グロブリンは、免疫グロブリンの重鎖内のヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4定常領域および免疫グロブリンの軽鎖内のヒトカッパ定常領域を含むことができる。詳細な実施形態において、IgGカッパ免疫グロブリンは、重鎖の可変ドメイン内および軽鎖の可変ドメイン内に完全または部分ヒトフレームワーク領域を含む。他の実施形態において、IgGカッパ免疫グロブリンは、重鎖の可変ドメイン内および軽鎖の可変ドメイン内にマウスフレームワーク領域を含む。
本発明のさらなる実施形態において、本発明の抗第XI因子抗体は、配列番号3もしくは7で示すアミノ酸配列を有するVHドメインおよび/または配列番号5もしくは9で示すアミノ酸配列を有するVLドメイン、または配列番号3、5、7、および9で示す配列に少なくとも約80%、85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明のまた他の実施形態において、本発明の抗第XI因子抗体はVHドメインを含み、VHドメインは:
a)配列番号3または7で示されるアミノ酸配列を含むVHドメイン;および
b)配列番号3または7で示されるアミノ酸配列に少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン;
から成る群より選択される。
a)配列番号3または7で示されるアミノ酸配列を含むVHドメイン;および
b)配列番号3または7で示されるアミノ酸配列に少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン;
から成る群より選択される。
本発明の別の実施形態において、本発明の抗第XI因子抗体はVLドメインを含み、VLドメインは:
a)配列番号5または9で示されるアミノ酸配列を含むVLドメイン;および
b)配列番号5または9で示されるアミノ酸配列に少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
から成る群より選択される。
a)配列番号5または9で示されるアミノ酸配列を含むVLドメイン;および
b)配列番号5または9で示されるアミノ酸配列に少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン;
から成る群より選択される。
抗第XI因子抗体結合特異性を測定する方法は、これに限定されるわけではないが、標準競合的結合アッセイ、T細胞またはB細胞による免疫グロブリン分泌を監視するアッセイ、T細胞増殖アッセイ、アポトーシスアッセイ、ELISAアッセイなどを含む。たとえばWO 93/14125;Shiら(2000)Immunity 13:633−642;Kumanogohら(2002)J Immunol 169:1175−1181;Watanabeら(2001)J Immunol 167:4321−4328;Wangら(2001)Blood 97:3498−3504;およびGiraudonら(2004)J Immunol 172(2):1246−1255に開示されているようなアッセイを参照、このすべては参照により本明細書に組み入れられている。
抗第XI因子抗体の好適な生物活性変異体は、本発明の方法で使用できる。このような変異体は、親抗第XI因子抗体の所望の結合特性を保持するであろう。抗体変異体を作製する方法は、当分野で一般に利用できる。たとえば、第XI因子抗体、抗体領域、または重鎖もしくは軽鎖の抗体可変ドメインのアミノ酸配列変異体は、興味のあるアミノ酸配列をコードするクローン化DNAにおける突然変異によって調製できる。突然変異誘発およびヌクレオチド配列改変の方法は、当分野で周知である。たとえば、参照により本明細書に組み入れられている、Walker and Gaastra,eds.(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company,New York);Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82:488−492;Kunkelら(1987)Methods Enzymol.154:367−382;Sambrookら(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor,New York);U.S.Patent No.4,873,192;およびそこで引用された参考文献を参照。興味のあるポリペプチドの生物活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関する案内は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている、Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.),pp.345−352におけるDayhoffら(1978)のモデルに見出され得る。Dayhoffらのモデルは、受容点突然変異(PAM)アミノ酸類似性マトリクス(PAM 250マトリクス)を使用して、好適な保存的アミノ酸置換を決定する。保存的置換、たとえば1つのアミノ酸を同様の特性を有する別のアミノ酸と交換することが好ましいことがある。DayhoffらのモデルのPAM250マトリクスによって教示されるような保存的アミノ酸置換の例は、これに限定されるわけではないが、Gly⇔Ala、Val⇔Ile⇔Leu、Asp⇔Glu、Lys⇔Arg、Asn⇔Gln、およびPhe⇔Trp⇔Tyrを含む。
興味のある抗第XI因子抗体ポリペプチドの変異体を構築するには、変異体が所望の特性を持ち続けるように、すなわちヒト細胞の表面で発現されたまたはヒト表面によって分泌されたヒト第XI因子抗原に特異的に結合可能であり、第XI因子遮断活性を有することができるように、修飾は本明細書に記載されているように行われる。明らかに、変異体ポリペプチドをコードするDNAにて行われた任意の突然変異は、読み枠からの配列を置換してはならず、好ましくは、第2のmRNA構造を産生できる相補領域を生成しないであろう。たとえばEP Patent Application Publication No.75,444を参照。
さらに、抗第XI因子抗体の定常領域は、変異されていくつかの方法でエフェクタ機能を改変することができる。たとえば、Fc受容体に結合する抗体を最適化するFc突然変異を開示する、U.S.Patent No.6,737,056B1およびU.S.Patent Application Publication No.2004/0132101A1を参照。
好ましくは、参照抗第XI因子抗体の変異体は、参照第XI因子抗体分子のアミノ酸配列に、または参照抗体分子のより短い部分に少なくとも約80%の、約85%の、約88%の、約90%の、約91%の、約92%の、約93%の、約94%の、または約95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。さらに詳細には、分子は、少なくとも約96%の、約97%の、約98%の、または約99%の配列同一性を共有する。本明細書で議論するとき、本明細書で開示する定常領域、CDR、VHドメイン、およびVLドメインを含む、任意の特定のポリペプチドが別のポリペプチドと少なくとも約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、またはなお約100%同一であるか否かは、当分野で公知の方法およびコンピュータプログラム/ソフトウェア、たとえばこれに限定されるわけではないが、BESTFITプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8 for Unix(登録商標),Genetics Computer Group,University Research Park,575 Science Drive,Madison,WI 53711)を使用して判定することができる。BESTFITは、Smith and Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482−489の局所的相同性アルゴリズムを使用して、2つの配列間の相同性の最良のセグメントを発見する。BESTFITまたはその他の配列アラインメントプログラムを使用して特定の配列がたとえば、本発明による参照配列に95%同一であるか否かを判定するときに、パラメータはもちろん、同一性のパーセンテージが参照ポリペプチド配列の全長にわたって計算されるように、および参照配列内のアミノ酸の総数の最大5%までの相同性におけるギャップが許容されるように設定される。
本発明の目的では、配列同一性パーセントは、12のギャップ・オープン・ペナルティおよび2のギャップ伸長ペナルティ、62のBLOSUMマトリクスでのアフィンギャップ検索を用いたSmith−Waterman相同性検索アルゴリズムを使用して決定される。Smith−Waterman相同性検索アルゴリズムは、Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.(1981)2:482−489に教示されている。変異体はたとえば、参照抗第XI因子抗体とは、わずか1〜15アミノ酸残基、わずか1〜10アミノ酸残基、たとえば6〜10、わずか5、わずか4、3、2、またはなお1アミノ酸残基だけ異なり得る。
2つのアミノ酸配列の最適アラインメントに関して、変異体アミノ酸配列の隣接セグメントは、参照アミノ酸配列と比較して付加アミノ酸残基または欠失アミノ酸残基を有し得る。参照アミノ酸配列との比較に使用する隣接セグメントは、少なくとも20隣接アミノ酸残基を含むであろうし、30、40、50、またはそれ以上のアミノ酸残基であり得る。保存的残基置換またはギャップと関連する配列同一性の補正を行うことができる(Smith−Waterman相同性検索アルゴリズムを参照)。
任意の2つのポリペプチド配列が比較のために最適に整列されたとき、アラインメント内で互いに対向して出現する残基が、互いに対応するその各ポリペプチド内の位置を占有することが認識される。このような位置は本明細書で「対応位置」と呼ばれ、対応位置に存在する残基は、「対応残基」または互いに「対応する」残基と呼ばれる。それゆえたとえば、興味のあるポリペプチドが、たとえば10残基を有する参照ポリペプチド配列に対して最適に整列されている場合、参照配列の残基5に対向して出現する興味のあるポリペプチド内の残基は、参照配列の「残基5に対応する位置における残基」と呼ばれる。
第XI因子を特異的に結合して、所望の第XI因子遮断活性を保持することができるポリペプチドの正確な化学構造は、いくつかの因子に依存している。イオン化アミノ基およびカルボキシル基が分子内に存在するとき、特定のポリペプチドは酸性塩もしくは塩基性塩として、または中性形で得ることができる。好適な環境条件に配置されたときにその生物活性を保持する、このようなすべての調製物は、本明細書で使用するような抗第XI因子抗体の定義に含まれる。さらに、ポリペプチドの1次アミノ酸配列は、糖部分を使用する誘導体化(グリコシル化)によって、または脂質、リン酸塩、アセチル基などの他の補助分子によって増大され得る。それはサッカライドとの結合によっても増大され得る。このような増大のある態様は、産生宿主の翻訳後処理系によって達成される;他のこのような修飾は、インビトロで導入され得る。いずれにしても、このような修飾は、抗第XI因子抗体の所望の特性が破壊されない限り、本明細書で使用する抗第XI因子抗体の定義に含まれる。このような修飾は、各種のアッセイにおいて、ポリペプチドの活性の増強または低下のどちらかによって、活性に対して定量的または定性的に影響を及ぼし得る。さらに、鎖内の個々のアミノ酸残基は、酸化、還元、または他の誘導体化によって修飾することができ、ポリペプチドは切断されて活性を保持する断片を得ることができる。所望の特性(すなわち第XI因子に対する結合特異性および第XI因子遮断活性)を破壊しない、このような改変によって、本明細書で使用するような興味のある抗第XI因子抗体の定義からポリペプチド配列は排除されない。
当分野は、ポリペプチド変異体の調製および使用に関する実質的な指針を提供する。抗第XI因子抗体変異体の調製において、当業者は、本発明の方法で使用する製薬組成物の治療活性成分として使用するのに好適である変異体を生じるであろう、未変性タンパク質ヌクレオチドまたはアミノ酸配列に対する修飾をただちに決定できる。
ある抗第XI因子抗体において、Fc部分は、当分野で公知の技法を使用して、エフェクタ機能を低下させるために突然変異され得る。たとえば、定常領域ドメインの欠失または不活性化(点突然変異または他の手段による)は、循環する修飾抗体のFc受容体結合を減少させて、それにより腫瘍局在化を増加させることがある。他の場合では、本発明と一致する定常領域修飾が補体結合を抑制して、それゆえ結合した細胞毒の血清半減期および非特異的会合を低減するということがあり得る。定常領域のまた他の修飾を使用して、抗原特異性または抗体柔軟性の上昇のために局在化が増強されるジスルフィド結合またはオリゴサッカライド部分が修飾され得る。修飾の得られた生理学的特性、生物学的利用能および他の生化学的効果、たとえば腫瘍局在化、体内分布および血清半減期は、過度の実験を伴わずに、周知の免疫学的技法を使用して容易に測定および定量され得る。
本発明の抗第XI因子抗体は、共有結合によって抗体がその同族エピトープに特異的結合することが防止されないように、たとえば任意の種類の分子の抗体への共有結合によって修飾される誘導体も含む。たとえば、しかし制限なく、抗体誘導体は、たとえばグリコシル化、アセチル化、ペグ化、ホスホリル化、アミド化、公知の保護基/遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への結合などによって修飾された抗体を含む。多数の化学修飾のいずれも、これに限定されるわけではないが、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化などを含む、公知の技法によって実施され得る。さらに、誘導体は1つ以上の非古典的アミノ酸を含有し得る。
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の電荷の側鎖を持つアミノ酸残基によって置換されるものである。同様の電荷を持つ側鎖を有するアミノ酸残基のファミリは、当分野で定義されている。これらのファミリは、塩基性側鎖(たとえばリジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(たとえばアスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(たとえばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(たとえばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ分枝側鎖(たとえばトレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(たとえばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を持つアミノ酸を含む。または、突然変異は、たとえば飽和突然変異誘発によってコード化配列の全部または一部に沿ってランダムに導入することが可能であり、得られた突然変異を生物活性についてスクリーニングして、活性(たとえば抗第XI因子ポリペプチドに結合する能力)を保持する突然変異を同定することができる。
たとえば、抗体分子のフレームワーク領域のみに、またはCDR領域のみに突然変異を導入することができる。導入された突然変異は、サイレントまたは中立的ミスセンス突然変異であり得る、すなわち抗体が抗原を結合する能力に全くまたはほとんど影響がない。これらの種類の突然変異は、コドン使用頻度を最適化するために、またはハイブリドーマの抗体産生を改善するために有用であり得る。または、非中立的ミスセンス突然変異は、抗体が抗原を結合する能力を改変し得る。大半のサイレントおよび中立的ミスセンス突然変異の位置は、フレームワーク領域内にあると考えられるのに対して、大半の非中立的ミスセンス突然変異の位置はCDR内にあると考えられるが、このことは絶対要件ではない。当業者は、抗原結合活性の改変なしまたは結合活性の改変(たとえば抗原結合活性の改善または抗体特異性の変化)などの所望の特性を備えた突然変異分子を設計および試験することができるであろう。突然変異誘発の後に、コード化タンパク質が通常発現され得て、コード化タンパク質の機能および/または生物活性(たとえば第XI因子ポリペプチドの少なくとも1つのエピトープを免疫特異的に結合する能力)は、本明細書に記載した技法を使用して、または当分野で公知の通常の修飾技法によって決定できる。
V.融合タンパク質および抗体コンジュゲート
本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体はさらに、NもしくはC末端にて異種ポリペプチドに組換えによって融合され得るか、またはポリペプチドまたは他の組成物に化学的に結合され得る(共有または非共有結合を含む)。たとえば、抗第XI因子モノクローナル抗体は、検出アッセイで標識として有用な分子および異種ポリペプチド、薬物、放射性核種、または毒素などのエフェクタ分子に組換えによって融合または結合され得る。たとえばPCT publications WO 92/08495;WO 91/14438;WO 89/12624;U.S.Patent No.5,314,995;およびEP 396,387を参照。
本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体はさらに、NもしくはC末端にて異種ポリペプチドに組換えによって融合され得るか、またはポリペプチドまたは他の組成物に化学的に結合され得る(共有または非共有結合を含む)。たとえば、抗第XI因子モノクローナル抗体は、検出アッセイで標識として有用な分子および異種ポリペプチド、薬物、放射性核種、または毒素などのエフェクタ分子に組換えによって融合または結合され得る。たとえばPCT publications WO 92/08495;WO 91/14438;WO 89/12624;U.S.Patent No.5,314,995;およびEP 396,387を参照。
本発明は、抗第XI因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体、および異種ポリペプチドを含む融合タンパク質も提供する。たとえば、抗体が融合される異種ポリペプチドは、機能に有用であり、ポリペプチドのインビボ半減期を延長して、または精製もしくは検出を容易にするマーカー配列であり得る(たとえばLeongら(2001)Cytokine 16:106;Adv.in Drug Deliv.Rev.(2002)54:531;Weirら(2002)Biochem.Soc.Transactions 30:512;Gentzら(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821−824;Wilsonら(1984)Cell 37:767を参照)。
融合タンパク質は、当分野で周知である方法を使用して調製できる(たとえばU.S.Patent Nos.5,116,964および5,225,538を参照)。融合が作製される正確な部位は経験的に選択されて、融合タンパク質の結合特徴が最適化され得る。融合タンパク質をコードするDNAは次に、発現のために宿主細胞内にトランスフェクトされる。
本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、分子の治療特性を改善するために、標的検出を容易にするために、または対象の撮像もしくは治療のために、非結合形で使用され得るか、または各種の分子の少なくとも1つに結合され得る。詳細には、本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物応答調節剤、薬剤、またはPEGに結合され得る。各種の部分を抗第XI因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体に結合する技法は周知であり、たとえば
VI.抗第XI因子抗体をコードするポリヌクレオチド
本発明は、本発明の抗第XI因子抗体、またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体をコードする核酸分子も提供する。
本発明は、本発明の抗第XI因子抗体、またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体をコードする核酸分子も提供する。
一実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖ドメイン(VHドメイン)をコードする核酸を含む、同核酸より本質的に成る、または同核酸より成る単離ポリヌクレオチドを提供し、該VHドメインのCDRの少なくとも1つは、配列番号10〜12のいずれか1つに少なくとも約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、または同一であるアミノ酸配列を有する。
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖ドメイン(VLドメイン)をコードする核酸を含む、同核酸より本質的に成る、または同核酸より成る単離ポリヌクレオチドを提供し、該VLドメインのCDRの少なくとも1つは、配列番号13〜15のいずれか1つに少なくとも約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、または同一であるアミノ酸配列を有する。
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号3および7から成る群より選択される参照VHドメインポリペプチド配列に少なくとも約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、または100%同一であるアミノ酸配列を有するVHドメインをコードする核酸核酸を含む、同核酸より本質的に成る、または同核酸より成る単離ポリヌクレオチドを含み、コード化VHドメインを含む抗第XI因子抗体は、第XI因子に特異的または優先的に結合する。
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号5および9から成る群より選択される参照VLドメインポリペプチド配列に少なくとも約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、または100%同一であるアミノ酸配列を有するVLドメインをコードする核酸を含む、同核酸より本質的に成る、または同核酸より成る単離ポリヌクレオチドを含み、コード化VLドメインを含む抗第XI因子抗体は、第XI因子に特異的または優先的に結合する。
別の実施形態において、本発明は、配列番号2、4、6、および8から成る群より選択される参照ポリヌクレオチド配列に少なくとも約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、または100%同一である核酸を含む、同核酸より本質的に成る、または同核酸より成る単離ポリヌクレオチドを提供する。
上述のポリヌクレオチドのいずれかはさらに、たとえばコード化ポリペプチドの分泌を指示するシグナルペプチド、本明細書に記載する抗体定常領域、または本明細書に記載する他の異種ポリペプチドをコードするさらなる核酸を含み得る。また、本明細書の別の箇所でさらに詳細に記載するように、本発明は、上述のポリヌクレオチドの1つ以上を含む組成物を含む。一実施形態において、本発明は、第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドを含む組成物を含み、前記第1のポリヌクレオチドは本明細書に記載するVHドメインをコードして、前記第2のポリヌクレオチドは本明細書に記載するVLドメインをコードする。特に、配列番号3および7から成る群より選択されるVHドメイン、ならびに/または配列番号5および9から成る群より選択されるVLドメインを含む、同ドメインから本質的に成る、または同ドメインから成る組成物。
本発明は、別の箇所で記載されているように、本発明のポリヌクレオチドの断片も含む。さらに、本明細書に記載するように、融合ポリポリペプチド、Fab断片、および他の誘導体をコードするポリヌクレオチドも本発明で検討される。
ポリヌクレオチドは、当分野で公知の任意の方法によって産生または製造され得る。たとえば、抗体のヌクレオチド配列が公知である場合、抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学合成オリゴヌクレオチドから構築されることがあり(たとえばKutmeierら(1994)BioTechniques 17:242に記載されているように)、これは簡潔には、抗体をコードする配列の部分を含有する重複オリゴヌクレオチドの合成と、これらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび結合と、次いで結合したオリゴヌクレオチドのPCRによる増幅とを含む。
または、抗第XI因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、好適な供給源からの核酸から生成され得る。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンは入手できないが、抗体分子の配列が公知である場合は、抗体をコードする核酸は、化学的に合成され得るか、または好適な供給源(たとえば抗体cDNAライブラリ、または抗体または他の抗第XI因子抗体を発現する任意の組織または細胞、たとえば抗体を発現させるために選択されたハイブリドーマから、生成されたcDNAライブラリ、もしくは単離された核酸、特にポリA+RNA)から、配列の3’および5’端にハイブリダイズ可能な合成プライマを使用するPCR増幅によって、または抗体もしくは他の抗第XI因子抗体をコードするcDNAライブラリから、たとえばcDNAクローンを同定するために、特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって入手され得る。PCRによって産生された増幅核酸は次に、当分野で周知の任意の方法を使用して複製可能なクローニングベクター内にクローニングされ得る。
抗第XI因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、そのヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作のための当分野で周知の方法、たとえば組換えDNA技法、部位特異的突然変異誘発、PCRなど(たとえば、どちらもその全体が参照により本明細書に組み入れられている、Sambrookら(1990)Molecular Cloning,A Laboratory Manual(2nd ed.;Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)およびAusubelら、eds.(1998)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons,NY)に記載された技法を参照)を使用して操作されて、たとえばアミノ酸置換、欠失、および/または挿入を形成するために異なるアミノ酸配列を有する抗体が生成され得る。
第XI因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、未修飾RNAもしくはDNAまたは修飾RNAまたはDNAであり得る、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドで構成することができる。たとえば、第XI因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、単鎖および2本鎖DNA、単鎖および2本鎖領域の混合物であるDNA、単鎖および2本鎖RNA、ならびに単鎖および2本鎖領域の混合物であるRNA、単鎖または、さらに通例は2本鎖または1本鎖領域および2本鎖領域の混合物であるDNAおよびRNAを含むハイブリッド分子で構成することができる。さらに、第XI因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、RNAもしくはDNAまたはRNAおよびDNAの両方を含む3本鎖領域で構成することができる。第XI因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、1つ以上の修飾塩基または安定性のためにもしくは他の理由で修飾されたDNAもしくはRNA主鎖も含有し得る。「修飾」塩基はたとえば、トリチル化塩基およびイノシンなどの普通ではない塩基を含む。DNAおよびRNAには、多様な修飾を作製できる;それゆえ「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、または代謝的修飾形を含む。
免疫グロブリンに由来するポリペプチドの非天然型変異体をコードする単離ポリヌクレオチド(たとえば免疫グロブリン重鎖部分または軽鎖部分)は、1つ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失がコード化タンパク質内に導入されるように、1つ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を免疫グロブリンのヌクレオチド配列内に導入することによって形成できる。突然変異は、部位特異的突然変異誘発およびPCR媒介突然変異誘発などの標準技法によって導入され得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、1つ以上の非必須アミノ酸残基にて作製される。
VII.抗体ポリペプチドの発現
抗体の軽鎖および重鎖をコードするDNA配列は、周知の方法に従って逆転写酵素およびDNAポリメラーゼを使用して、同時にまたは個別にのどちらかで作製され得る。PCRは、公開された重鎖および軽鎖DNAならびにアミノ酸配列に基づいて、コンセンサス定常領域プライマによって、またはさらに特異的なプライマによって開始され得る。上述のように、PCRは、抗体軽鎖および重鎖をコードするDNAクローンを単離するためも使用され得る。この場合、ライブラリは、コンセンサスプライマまたはマウス定常領域プローブなどのより大きい異種プローブによってスクリーニングされ得る。
抗体の軽鎖および重鎖をコードするDNA配列は、周知の方法に従って逆転写酵素およびDNAポリメラーゼを使用して、同時にまたは個別にのどちらかで作製され得る。PCRは、公開された重鎖および軽鎖DNAならびにアミノ酸配列に基づいて、コンセンサス定常領域プライマによって、またはさらに特異的なプライマによって開始され得る。上述のように、PCRは、抗体軽鎖および重鎖をコードするDNAクローンを単離するためも使用され得る。この場合、ライブラリは、コンセンサスプライマまたはマウス定常領域プローブなどのより大きい異種プローブによってスクリーニングされ得る。
DNA、通例プラスミドDNAは、当分野で公知の技法を使用して細胞から単離され、たとえば組換えDNA技法に関する上述の参考文献で詳細に記載されている標準の周知の技法によって、制限マッピングおよび配列決定が行われ得る。もちろんDNAは、本発明に従って、単離プロセスまたは次の分析の間の任意の時点にて合成され得る。
本発明の第XI因子抗体、またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体を提供するための単離遺伝物質の操作の後に、抗第XI因子抗体をコードするポリヌクレオチドは通例、所望の量の抗第XI因子抗体を産生するのに使用され得る宿主細胞内への導入のために発現ベクターに挿入される。
抗体、またはその断片、誘導体もしくは類似体、たとえば本明細書に記載する標的分子、たとえば第XI因子に結合する抗体の重鎖または軽鎖の組換え発現には、抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築が含まれる。本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖をコードするポリヌクレオチド、または(好ましくは重鎖または軽鎖可変ドメインを含有する)その部分が得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当分野で周知の技法を使用する組換えDNA技術によって産生され得る。それゆえ、抗体コード化ヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現することによってタンパク質を調製する方法は、本明細書に記載されている。当業者に周知の方法は、抗体コード化配列ならびに転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築するために使用できる。これらの方法はたとえば、インビトロ組換えDNA技法、合成技法、およびインビボ遺伝子組換えを含む。それゆえ本発明は、プロモーターに作動可能に結合された、本発明の抗体分子、またはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖または軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。このようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド範囲を含むことがあり(たとえばPCT Publication WO 86/05807;PCT Publication WO 89/01036;およびU.S.Patent No.5,122,464を参照)、抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖全体の発現のためにこのようなベクター内にクローニングされ得る。
「ベクター」または「発現ベクター」という用語は本明細書では、宿主細胞内に導入して所望の遺伝子を発現させるためのビヒクルとして、本発明に従って使用されるベクターを意味するために使用される。当業者に公知であるように、このようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルスおよびレトロウイルスから成る群より容易に選択され得る。一般に、本発明に適合するベクターは、選択部位、所望の遺伝子のクローニングを促進する適切な制限部位ならびに真核生物細胞または原核生物細胞中へ進入および/または同細胞中で複製する能力を含むであろう。
本発明の目的では、多数の発現ベクター系が利用され得る。たとえば、1つのクラスのベクターは、ウシパピローマウイルスなどの動物ウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス(RSV、MMTVまたはMOMLV)またはSV40ウイルスに由来するDNA要素を利用する。その他は、内部リボソーム結合部位のあるポリシストロン系の使用を含む。さらに、その染色体内にDNAを組込んだ細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする1つ以上のマーカーを導入することによって選択され得る。マーカーは、栄養要求性宿主に対する原栄養性、殺生物剤耐性(たとえば抗生物質)または銅などの重金属に対する耐性を提供し得る。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるDNA配列に直接結合すること、または同時形質転換によって同じ細胞内に導入されることのどちらかが可能である。mRNAの最適合成には、さらなる要素も必要であり得る。これらの要素は、シグナル配列、スプライスシグナルはもちろんのこと、転写プロモーター、エンハンサー、および終結シグナルを含み得る。
特に好ましい実施形態において、クローン化可変領域遺伝子は、発現ベクター内に上述のように合成された重鎖および軽鎖定常領域遺伝子(好ましくはヒト)と共に挿入される。もちろん、真核生物細胞中で発現を誘発することができるいずれの発現ベクターも、本発明で使用され得る。好適なベクターの例は、これに限定されるわけではないが、プラスミドpcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER−HCMV、pUB6/V5−His、pVAX1、およびpZeoSV2(Invitrogen,San Diego,CAより入手可能)、ならびにプラスミドpCI(Promega,Madison,WIより入手可能)を含む。一般に、多数の形質転換細胞を、好適な高レベルの免疫グロブリン重鎖および軽鎖を発現するものに関してスクリーニングすることは、たとえばロボットシステムによって実施可能な日常的な実験である。
さらに一般に、抗第XI因子抗体のモノマーサブユニットをコードするベクターまたはDNA配列が調製されると、発現ベクターは好適な宿主細胞内に導入され得る。プラスミドの宿主細胞内への導入は、当業者に周知の各種の技法によって達成可能である。これらは、これに限定されるわけではないが、トランスフェクション(電気泳動および電気穿孔を含む)、原形質体融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープDNAとの細胞融合、微量注入、および未処置ウイルスによる感染を含む。Ridgway(1988)“Mammalian Expression Vectors”in Vectors,ed.Rodriguez and Denhardt(Butterworths,Boston,Mass.),Chapter 24.2,pp.470−472を参照。通例、宿主細胞内へのプラスミド導入は、電気穿孔による。発現構築物を持つ宿主細胞は、軽鎖および重鎖の産生に適切な条件下で培養して、重鎖および/または軽鎖タンパク質合成についてアッセイする。例示的なアッセイ技法は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、または蛍光標識細胞分取分析(FACS)、免疫組織化学などを含む。
発現ベクターは慣習的な技法によって宿主細胞に移転され、トランスフェクトされた細胞は次に慣習的な技法によって培養されて、本明細書に記載した方法で使用するための抗体を産生する。それゆえ、本発明は、異種プロモーターに作動可能に結合された、本発明の抗体、またはその重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を含む。2本鎖抗体の発現の好ましい実施形態において、重鎖および軽鎖の療法をコードするベクターは、以下で詳説するように、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞において同時発現され得る。
本明細書で使用するように、「宿主細胞」は、組換えDNA技法を使用して構築され、少なくとも1つの異種遺伝子をコードするベクターを持つ細胞を指す。組換え宿主から抗体を単離するプロセスの説明では、「細胞」および「細胞培養物」という用語は、別途明確に規定しない限り、抗原の供給源を指すために互換的に使用される。言い換えれば、「細胞」からのポリペプチドの回収は、遠沈させた全細胞から、または培地および懸濁細胞の両方を含有する細胞培養物からのどちらかを意味し得る。
多様な宿主発現ベクター系は、本明細書に記載した方法で使用するための抗体分子を発現するのに使用され得る。このような宿主発現系は、興味のあるコード化配列がそれによって産生され、続いて精製され得るビヒクルを示すが、適切なヌクレオチドコード化配列によって形質転換またはトランスフェクトされたときに、本発明の抗体分子をインサイチューで発現し得る細胞も示す。これらは、これに限定されるわけではないが、微生物、たとえば抗体コード化配列を含有する組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターによって形質転換された細菌(たとえばE.coli、B.subtilis);抗体コード化配列を含有する組換え酵母発現ベクターによって形質転換された酵母(たとえばSaccharomyces、Pichia);抗体コード化配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(たとえばバキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系;組換えウイルス発現ベクター(たとえばカリフラワー・モザイク・ウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)に感染した、もしくは抗体コード化配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター(たとえばTiプラスミド)によって形質転換された植物細胞系;または哺乳動物細胞のゲノム(たとえばメタロチオネインプロモーター)もしくは哺乳動物ウイルス(たとえばアデノウイルス後期プロモーター;ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)に由来するプロモーターを含有する組換え発現構築物を持つ哺乳動物細胞系(たとえばCOS、CHO、BLK、293、3T3細胞)を含む。好ましくは、Escherichia coliなどの細菌細胞、およびさらに好ましくは、特に全組換え抗体分子の発現のための真核生物細胞は、組換え抗体分子の発現に使用される。たとえば、ヒトサイトメガロウイルスからの主要中間初期遺伝子プロモーター要素などのベクターと併用した、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)などの哺乳動物細胞は、抗体の有効な発現系である(Foeckingら(1986)Gene 45:101;Cockettら(1990)Bio/Technology 8:2)。
タンパク質発現に使用される宿主株化細胞は、哺乳動物起源であることが多い;当業者は、その中で発現される所望の遺伝子産物に最も適した特定の宿主株化細胞を優先的に決定する能力を備えていると見なされる。例示的な宿主株化細胞は、これに限定されるわけではないが、CHO(チャイニーズハムスター卵巣)、DG44およびDUXB11(チャイニーズハムスター卵巣株、DHFRマイナス)、HELA(ヒト子宮頸癌)、CVI(サル腎臓株)、COS(CVIのSV40 T抗原による誘導体)、VERY、BHK(ベビーハムスター腎臓)、MDCK、293、WI38、R1610(チャイニーズハムスター線維芽細胞)BALBC/3T3(マウス線維芽細胞)、HAK(ハムスター腎臓株)、SP2/O(マウス骨髄腫)、P3x63−Ag3.653(マウス骨髄腫)、BFA−lclBPT(ウシ内皮細胞)、RAJI(ヒトリンパ球)および293(ヒト腎臓)を含む。宿主株化細胞は通例、商用サービスのAmerican Tissue Culture Collectionから、または公開された文献から入手できる。
さらに、挿入配列の発現を調節するか、または所望の特定の方法で遺伝子産物を修飾および処理する宿主株化細胞が選択され得る。タンパク質生成物のこのような修飾(たとえばグリコシル化)および処理(たとえば切断)は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。各種の宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後処理および修飾のための特徴的および特異的な機構を有する。発現された異種タンパク質の修飾および処理を確実にするために適切な株化細胞または宿主系を選択できる。このために、遺伝子産物の1次転写、グリコシル化、およびホスホリル化の適正な処理のための細胞機械を有する真核生物宿主細胞が使用され得る。
組換えタンパク質の長期の高収率での産生のためには、安定な発現が好ましい。たとえば、抗体分子を安定に発現する株化細胞が改変され得る。宿主細胞は、ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを使用するよりも、適切な発現制御要素(たとえばプロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)、および選択可能マーカーによって制御されるDNAによって形質転換することができる。外来DNAの導入後に、改変細胞は富化培地で1〜2日増殖させることができ、次に選択培地に切替えられる。組換えプラスミド中の選択可能マーカーは、選択に対する耐性を与えて、細胞にプラスミドをその染色体内に安定に組込んで増殖させ、次に株化細胞へのクローニングおよび増殖を可能にする増殖巣を形成する。この方法は、抗体分子を安定的に発現する株化細胞を改変するために好都合に使用され得る。
これに限定されるわけではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wiglerら(1977)Cell 11:223)、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska and Szybalski(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:202)を含むいくつかの選択系が使用され得て、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowyら(1980)Cell 22:817)遺伝子はtk−、hgprt−またはaprt−細胞それぞれで利用され得る。また、代謝拮抗物質耐性は、次の遺伝子:メトトレキセートに耐性を与えるdhfr(Wiglerら(1980)Natl.Acad.Sci.USA 77:357;O’Hareら(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527);ミコフェノール酸に耐性を与えるgpt(Mulligan and Berg(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072);アミノグリコシドG−418に耐性を与えるneo Clinical Pharmacy 12:488−505;Wu and Wu(1991)Biotherapy 3:87−95;Tolstoshev(1993)Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573−596;Mulligan(1993)Science 260:926−932;およびMorgan and Anderson(1993)Ann.Rev.Biochem.62:191−217(1993);TIB TECH 11(5):155−215(May,1993);およびハイグロマイシンに耐性を与えるhygro(Santerreら(1984)Gene 30:147 の選択の基準として使用できる。使用可能である組換えDNA技術の分野で一般に公知の方法は、その全体が参照により本明細書に組み入れられている、Ausubelら(1993)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons,NY);Kriegler(1990)“Gene Transfer and Expression” in A Laboratory Manual(Stockton Press,NY);Dracopoliら(eds)(1994)Current Prolocols in Human Genetics(John Wiley & Sons,NY)Chapters 12 and 13;Colberre−Garapinら(1981)J.Mol.Biol.150:1に記載されている。
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって上昇させることができる(総説については、Bebbington and Hentschel(1987)“The Use of Vectors Based on Gene Amplification for the Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells in DNA Cloning”(Academic Press,NY)Vol.3を参照 。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが増幅可能であるとき、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルの上昇によって、マーカー遺伝子のコピー数が増加するであろう。増幅領域は抗体遺伝子と関連しているため、抗体の産生も増加するであろう(Crouseら(1983)Mol.Cell.Biol.3:257)。
インビトロ産生によって、スケールアップが可能となり、大量の所望のポリペプチドが得られる。組織培養条件下での哺乳動物細胞培養の技法は、当分野で公知であり、たとえばエアリフトリアクタもしくは連続撹拌リアクタ内の均質懸濁培養物、またはたとえば中空ファイバ、マイクロカプセル内の、アガロースマイクロビーズまたはセラミックカートリッジ上の固定化または捕捉細胞培養物を含む。必要および/または所望ならば、ポリペプチドの溶液は、慣習的なクロマトグラフィー法、たとえばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、DEAEセルロースによるクロマトグラフィーまたは(免疫)親和性クロマトグラフィーによって、たとえば合成ヒンジ領域ポリペプチドの生合成の後に、または本明細書に記載するHICクロマトグラフィーのステップの前、または同ステップに続いて精製することができる。
本発明の抗第XI因子抗体、またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体をコードする遺伝子は、細菌または酵母または植物細胞などの非哺乳動物細胞中でも発現できる。核酸をただちに取込む細菌は、大腸菌(Escherichia coli)またはサルモネラ菌(Salmonella)の菌株などの腸内細菌(enterobacteriaceae);枯草菌(Bacillus subtilis)などのバシラス(Bacillaceae);肺炎球菌(Pneumococcus);連鎖球菌(Streptococcus)、およびインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)のメンバを含む。細菌中で発現されるとき、異種ポリペプチドは通例、封入体の一部となることがさらに認識されるであろう。異種ポリペプチドは単離、精製、および次に機能分子内へ構築する必要がある。抗体の4価形が所望である場合、サブユニットは次に4価抗体内へ自己構築されるであろう(WO 02/096948A2)。
細菌系において、発現される抗体分子に意図される用途に応じて、いくつかの発現ベクターが好都合に選択され得る。たとえば、抗体分子の医薬組成物の生成のために大量のこのようなタンパク質が産生されるときには、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を指示するベクターが所望であり得る。このようなベクターは、これに限定されるわけではないが、融合タンパク質が産生されるように、抗体コード化配列がベクター中にインフレームでlacZコード化領域と個別に結合される、E.coli発現ベクターpUR278(Rutherら(1983)EMBO J.2:1791);pINベクター(Inouye and Inouye(1985)Nucleic Acids Res.13:3101−3109;Van Heeke and Schuster(1989)J.Biol.Chem.24:5503−5509);などを含む。外来ポリペプチドをグルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として発現させるために、pGEXベクターも使用され得る。一般に、このようなタンパク質は可溶性であり、マトリクス・グルタチオン−アガロース・ビーズへの吸収および結合と、続いての遊離グルタチオンの存在下での溶離によって、溶解細胞から容易に精製できる。pGEXベクターは、トロンビンまたは第Xa因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計されているので、クローン化標的遺伝子産物はGST部分から遊離することができる。
原核生物に加えて、真核生物微生物も使用され得る。Saccharomyces cerevisiae、すなわち通常のパン酵母は、真核生物微生物の中で最も一般に使用されるが、いくつかの他の菌株、たとえばPichia pastorisが一般に使用される。
Saccharomycesでの発現では、たとえばプラスミドYRp7(Stinchcombら(1979)Nature 282:39;Kingsmanら(1979)Gene 7: 141;Tschemperら(1980)Gene 10:157)が一般に使用される。このプラスミドはTRP1遺伝子をすでに含有しており、TRP1遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力に欠ける酵母の突然変異菌株、たとえばATCC No.44076またはPEP4−1の選択マーカーを提供する(Jones(1977)Genetics 85:12)。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのtrp1病巣の存在は次に、トリプトファンの非存在下での増殖による形質転換を検出するのに有効な環境を与える。
昆虫系では、Autographa californica核多核体病ウイルス(AcNPV)は通例、外来遺伝子を発現するベクターとして使用される。ウイルスはSpodoptera frugiperda細胞中で増殖する。抗体コード化配列は、ウイルスの非必須領域(たとえばポリヘドリン遺伝子)内に個別にクローニングされて、AcNPVプロモーター(たとえばポリヘドリンプロモーター)の制御下に配置され得る。
本発明の抗体分子がいったん組換え発現されると、それは免疫グロブリン分子の精製について当分野で公知の任意の方法によって、たとえばクロマトグラフィー(たとえばイオン交換、特にタンパク質Aの後の特異的抗原に対する親和性による、親和性、およびサイジングカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、溶解度差によって、またはタンパク質精製のその他の標準技法によって精製され得る。または、本発明の抗体の親和性を上昇させる好ましい方法は、U.S.Patent Application Publication No.2002 0123057 Alに開示されている。
VIII.抗第XI因子モノクローナル抗体の使用方法
本発明の方法は、その抗原結合断片、変異体、および誘導体を含む、抗第XI因子モノクローナル抗体の、血栓症の抑制の必要がある対象での血栓症の抑制のための使用に関する。以下の議論は、本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体による各種の疾患および障害の方法および処置に言及するが、本明細書に記載する方法は、本発明抗第XI因子モノクローナル抗体の所望の特性を保持する、すなわちヒト第XI因子を特異的に結合可能であり、およびヒト第XI因子の凝固活性を抑制することができる、これらの抗第XI因子モノクローナル抗体の抗体結合断片、変異体、および誘導体にも適用される。
本発明の方法は、その抗原結合断片、変異体、および誘導体を含む、抗第XI因子モノクローナル抗体の、血栓症の抑制の必要がある対象での血栓症の抑制のための使用に関する。以下の議論は、本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体による各種の疾患および障害の方法および処置に言及するが、本明細書に記載する方法は、本発明抗第XI因子モノクローナル抗体の所望の特性を保持する、すなわちヒト第XI因子を特異的に結合可能であり、およびヒト第XI因子の凝固活性を抑制することができる、これらの抗第XI因子モノクローナル抗体の抗体結合断片、変異体、および誘導体にも適用される。
本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体は、血栓症の抑制が有益であろう任意の対象に投与され得る。特に、本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体は、止血を妨害しない抗血栓剤として、および在来の抗血栓剤の優れた代替物である抗血栓剤として、特に有用である。
一実施形態において、本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体は、血栓形成の結果として発生するものなどの、血管閉塞を特徴とする状態を処置するために使用され得る。血管閉塞を特徴とし、本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体を使用する処置または予防が正当であるとされる状態は、動脈血管系、毛細血管系、および静脈血管系と関係する状態を含む。
冠状動脈において、動脈硬化プラークの破裂の後に閉塞性血栓形成が続くことが多い。この閉塞は、急性心筋梗塞および不安定狭心症の主な原因である。冠状動脈閉塞は、感染症、炎症、血栓溶解療法、血管形成術、および移植片配置の後にも発生する可能性がある。同様の原理は、動脈血管系の他の部分にも当てはまり、特に、一時的または永久脳虚血および脳卒中の主な原因である、頸動脈における血栓形成を含む。
静脈血栓症は、うっ血、感染症、炎症反応、および下肢または腹部の大手術の後に起こることが多い。深部静脈血栓症は、血栓より遠位の部位からの血流低下を引き起こし、肺塞栓症の素因となる。肺塞栓症は、術後死亡の主要な原因である。本発明のモノクローナル抗体が有用である播種性血管内凝固症候群(DIC)および急性呼吸促迫症候群(ARDS)は、細菌性敗血症、たとえば外傷および分娩後の血流への異物の侵入、免疫応答、炎症、あるウイルス感染症、ある血小板障害、および癌の間にあらゆる血管系で一般に発生する。播種性血管内凝固症候群は、多くの疾患状態およびたとえばヘパリンを含む一部の薬物処置の重篤な合併症である。凝固因子および血小板の血栓による消費、および全身性凝固によって、微小血管系に発生する生命を脅かす血栓の形成が引き起こされて、局所的または広汎性の低酸素症および臓器不全につながる。
それゆえ、一実施形態において、有効量の本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体を対象に投与するステップを含む、血栓症を抑制するの必要がある対象の血栓症を抑制する方法が提供され、特にここで血栓症は:1)急性冠症候群、たとえば心筋梗塞、不安定狭心症、難治性狭心症、血栓溶解療法後または冠動脈血管形成術の後に発生する閉塞性冠動脈血栓症;2)塞栓性脳卒中、血栓性脳卒中、または一過性脳虚血発作を含む虚血性脳血管症候群;3)肺血栓塞栓症を含む、自発的または悪性腫瘍、外傷、または手術の状況のどちらかで発生する血管系にて発生する血栓症;4)敗血症または他の感染症、手術、妊娠、外傷、または悪性腫瘍の状況での、多臓器不全と関連する、または関連しない、ARDSおよびDIC、血栓性血小板減少性紫斑病、閉塞性血栓性血管炎、またはヘパリン誘発性血小板減少症に関連する血栓症を含む凝固障害;5)体外循環に関連する血栓性合併症(たとえば腎臓透析、心肺バイパスまたは他の酸素投与処置、およびプラスマフェレーシス);6)器具使用に関連する血栓性合併症(たとえば心臓または他の静脈内カテーテル法、大動脈内バルーンポンプ、および冠動脈ステントまたは心臓弁)および7)人工補装具の装着に関連する合併症に関連している。
本明細書の別の箇所で記載するように、在来の抗血栓剤は、その最大有効用量で投与されるときに危険であるか、または致死的でさえある。したがって、別の実施形態において、対象に有効量の本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体を投与するステップを含む、血栓症の処置の必要がある対象の血栓症の処置において必要な用量を減少するまたは抗血栓剤の効果を補完する方法が提供される。在来の抗血栓剤は、直接もしくは間接トロンビン阻害剤、第X因子阻害剤、第IX因子阻害剤、第XII因子阻害剤、第V因子阻害剤、第VIII因子阻害剤、第XIII因子阻害剤、第VII因子阻害剤、組織因子阻害剤、線維素溶解促進剤、線維素溶解もしくはフィブリノゲン溶解剤、カルボキシペプチダーゼB阻害剤、血小板阻害剤、選択的血小板数減少剤、または第XI因子阻害剤を含む。
直接トロンビン阻害剤は、アルガトロバンおよびその誘導体または類似体、ヒルジンおよびその組換え体または合成誘導体または類似体、トリペプチドPhe−Pro−Argの誘導体、クロロメチルケトン誘導体、キシメラガトランおよびその誘導体、代謝産物または類似体、アニオン結合エキソサイト阻害剤、ならびにRNA/DNAアパタマーを含む。
間接トロンビン阻害剤は、ヘパリン、クマリン、デルマタン、およびトロンボモジュリンを含む。
第X因子阻害剤は、直接第Xa因子阻害剤、リバロキサバン、第X因子に対する抗体、不活性化第Xa因子、またはその類似体もしくは誘導体を含む。
第IX因子阻害剤は、第IX因子に対する抗体、直接第IXa因子阻害剤、または不活性化第IXa因子、またはその類似体もしくは誘導体を含む。
第XII因子阻害剤は、直接第XII因子阻害剤、トウモロコシトリプシン阻害剤、FXIIに対する抗体、または不活性化第XIIa因子またはその類似体もしくは誘導体を含む。
第V因子阻害剤は、第V因子に対する抗体、活性化タンパク質C、タンパク質S、またはその類似体および誘導体を含む。
第VIII因子阻害剤は、FVIIIに対する抗体、活性化タンパク質C、タンパク質S、またはその類似体および誘導体を含む。
第XIII因子阻害剤は、第XIII因子に対する抗体、直接第XIIIa因子阻害剤、または不活性化第XIIIa因子を含む。
第VII因子阻害剤は、第VII因子に対する抗体、組織因子経路阻害剤、不活性化第VIIa因子、または直接第VIIa因子阻害剤またはその類似体および誘導体を含む。
組織因子阻害剤は、組織因子経路阻害剤、組織因子に対する抗体、またはその類似体および誘導体を含む。
線維素溶解促進剤は、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子またはその誘導体を含む。
線維素溶解またフィブリノゲン溶解剤は、プラスミン、マイクロプラスミン、アンクロド、またはその誘導体を含む。
血小板阻害剤は、アスピリン、クロピドグレル、ジピリダモール、またはその誘導体を含む。
選択的血小板数減少剤は、ヒドロキシ尿素、アナグレリド、またはその誘導体を含む。
第XI因子阻害剤は、直接第XIa因子阻害剤、第XI因子に対する他の抗体、不活性化第XIa因子、またはその類似体もしくは誘導体を含む。
別の実施形態において、対象に有効量の本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体を投与するステップを含む、転移癌を処置する必要がある対象の転移癌を処置する方法が提供される。
また別の実施形態において、対象に本発明の有効量の抗第XI因子モノクローナル抗体を投与するステップを含む、急性炎症反応を処置する必要がある対象の急性炎症反応を処置する方法が提供される。
本発明のさらなる実施形態において、抗第XI因子モノクローナル抗体が主活性剤であり、追加の活性剤と共に投与の必要がある対象に投与される併用療法が提供される。このような併用療法は、単一の組成物中での異なる活性剤の投与によって、異なる組成物中での異なる活性剤の同時投与によって、または異なる活性剤の連続投与によって実施され得る。併用療法は、抗第XI因子モノクローナル抗体が患者にすでに投与されていて、追加の活性剤が患者の投薬計画に追加される状況はもちろんのこと、異なる個人(たとえば医師または他の医療専門家)が併用の別々の成分を患者に投与している状況も含み得る。
追加の活性剤は一般に、必ずではないが、血栓症を抑制するのに有効である活性剤であろう。好ましい実施形態において、追加の活性剤は、止血剤、すなわち止血を促進する薬剤である。本発明の併用療法で使用するための特に好ましい止血剤は、活性化第VII因子(FVIIa)または活性化プロトロンビン複合体濃縮物(APCC)を含む。FVIIaおよびAPCCはどちらも、阻害剤誘発血友病患者の出血を処置するための止血剤として開発された(Scharrer(1999)Haemophilia,5:253−259;Shapiroら(1998)Thromb. Haemost.,80:773−778;Lusherら(1980)N.Engl.J.Med.,303:421−425;Sjamsoedinら(1981)N.Engl.J.Med.,305:717−21;Νegrierら(1997)Thromb.Haemost.,77:1113−1119)。APCCの主活性成分は、止血および血栓成長の両方に寄与するプロトロンビンである(Akhavanら(2000)Thromb.Haemost.,84:989−997;Xiら(1989)Thromb.Haemost.,62:788−791)。対照的に、FVIIaの血漿濃度を上昇させることは、TF/FVIIa複合体が第IX因子および第X因子を活性化する組織因子(TF)依存性経路を主に通じて、トロンビンの生成を増加させることと考えられる(Hoffman and Monroe(2001)Thromb.Haemost.,85:958−965)。
IX.製薬組成物および投与方法
本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、製薬的に許容される担体ビヒクルとの混合によってなどの、製薬的に有用な組成物を調製する公知の方法に従って製剤することができる。好適なビヒクルおよびその製剤は、たとえばRemington’s Pharmaceutical Sciences(16th ed.,Osol,A.(ed.),Mack,Easton PA(1980))。有効な投与に好適な製薬的に許容される組成物を形成するために、このような組成物は、有効量の抗第XI因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を、単独で、または好適な量の担体ビヒクルと共に、のどちらかで含有するであろう。
本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、製薬的に許容される担体ビヒクルとの混合によってなどの、製薬的に有用な組成物を調製する公知の方法に従って製剤することができる。好適なビヒクルおよびその製剤は、たとえばRemington’s Pharmaceutical Sciences(16th ed.,Osol,A.(ed.),Mack,Easton PA(1980))。有効な投与に好適な製薬的に許容される組成物を形成するために、このような組成物は、有効量の抗第XI因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を、単独で、または好適な量の担体ビヒクルと共に、のどちらかで含有するであろう。
「製薬的に許容される」という用語は本明細書で使用するように、生物活性であるが、レシピエントのヒトまたは動物の生理機能を、レシピエントの生存能力が損なわれる(comprise)程度までは破壊しない治療剤または化合物を指す。
製薬組成物は、好適な担体、希釈剤、または賦形剤、たとえば滅菌水、生理食塩水、グルコースなどと混合して投与され得る。組成物は、投与経路および所望の調製物に応じて、補助剤、たとえば湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤、アジュバント、ゲル化または増粘添加剤、保存料、着香剤、着色料などを含有することができる。
製薬組成物は、即時放出または制御放出のために製剤され得る。「吸収プール」は、特定の吸収部位にて投与される薬物の溶液を表し、kr、ka、およびkeは1)製剤からの薬物の放出;2)吸収;および3)排出;それぞれの1次反応速度定数である。即時放出投薬形では、薬物放出の反応速度定数krは、吸収速度定数kaよりはるかに大きい。制御放出製剤では反対のことが当てはまり、すなわち、投薬形からの薬物の放出速度が、薬物の標的部位への送達における律速段階であるように、kr<<<kaである。「制御放出」という用語は本明細書で使用するように、これに限定されるわけではないが、持続放出、遅延放出およびパルス放出製剤を含む、任意の非即時放出製剤を含む。
本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体を含む製薬組成物は、特定の対象の年齢、性別、体重、種および状態、ならびに投与経路などの因子を考慮して、医学分野または獣医学分野の当業者に周知の投薬形および技法で投与することができる。投与経路は、安全で、かつ治療的に有効な用量の本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体を、動物またはヒトの血液に送達する任意の経路によることができる。投薬の形式は、これに限定されるわけではないが、全身、局所、経腸、および非経口投与経路を含む。経腸経路は、経口および消化管投与を含む。非経口経路は、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、および経粘膜投与を含む。他の投与経路は、硬膜外またはくも膜下腔内投与を含む。
有効投薬量および投与経路は、化合物の治療範囲および性質によって、および公知の因子、たとえば対象の年齢、体重、および状態はもちろんのこと、LD50および公知であり、過度の実験を必要としない他のスクリーニング手順によっても決定される。
「投薬量」という用語は本明細書で使用するように、動物またはヒトに投与される、本発明の抗第XI因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体の量を指す。治療剤はレシピエントにボーラスとして、または持続(連続的または間欠的)送達によって送達され得る。投薬量の送達が、数分から数日、数週または数ヶ月のオーダーであり得る期間にわたって持続されるときに、または数年の期間にわたって慢性的に投与され得るときに、投薬量は治療剤の重量/kg患者の体重/送達単位時間として表され得る。
「治療的有効用量もしくは量」または「有効量」は、投与時に処置の必要な患者の処置に関して、プラスの治療応答を引き起こす抗第XI因子モノクローナル抗体の量を意図する。本発明のいくつかの実施形態において、抗第XI因子モノクローナル抗体の治療的有効用量は、約0.01mg/kg〜約10mg/kg、約0.1mg/kg〜約10mg/kg、約1mg/kg〜約10mg/kg、約1mg/kg〜約5mg/kg、約0.01mg/kg〜約1mg/kg、または約0.1mg/kg〜約1mg/kgの範囲内である。他の実施形態において、抗第XI因子モノクローナル抗体の治療的有効用量は、約0.01mg/kg、約0.03mg/kg、約0.1mg/kg、約0.3mg/kg、約0.5mg/kg、約1mg/kg、約1.5mg/kg、約2mg/kg、約2.5mg/kg、約3mg/kg、約5mg/kg、約7mg/kg、約10mg/kg、または約0.01mg/kg〜約10mg/kgの範囲内に含まれる他のこのような用量を含む。処置法は治療的有効用量の単回投与または抗第XI因子モノクローナル抗体の治療的有効用量の複数回投与を含み得る。
次の例は、制限のためにではなく、例示のために与える。
(実施例1)
モノクローナル抗体1A6による第XI因子の抑制は、霊長類の実験的血栓症において、トロンビン産生を低下させ、血管閉塞を防止する
霊長類での本試験は、血栓形成におけるFXIの役割の解明を補助するために、およびFXIの抑制が血栓増殖を制限するための比較的安全な血栓症特異的手法に相当するか否かを判定するために設計した。局所的な凝血促進マーカーおよび線維素溶解マーカーを測定することによって、局所的トロンビン産生、血小板活性化および線維素溶解の独自の感受性の時間依存測定値を評価した。FXIの役割を説明するために、FXIに対する強力な単一特異性抗体を使用する試験も実施した。血栓形成デバイスへの血小板および線維素沈着を評価し、血管移植片閉塞試験を実施して、動脈型剪断の下での比較的大規模な実験的血栓の増殖および安定性におけるFXIの重要性を判定した。これらの結果によって、FXIは生成する血栓の流動面での堅調なトロンビン生成および血小板活性化を促進可能であり、これが血栓の成長および安定性に寄与することが初めてインビボで証明される。これらの結果は、線維素溶解のFXIに関連する抑制が、急速に増殖する動脈型血栓の分解の制限において、最大限でもわすかな役割しか果たさないことも示している。
モノクローナル抗体1A6による第XI因子の抑制は、霊長類の実験的血栓症において、トロンビン産生を低下させ、血管閉塞を防止する
霊長類での本試験は、血栓形成におけるFXIの役割の解明を補助するために、およびFXIの抑制が血栓増殖を制限するための比較的安全な血栓症特異的手法に相当するか否かを判定するために設計した。局所的な凝血促進マーカーおよび線維素溶解マーカーを測定することによって、局所的トロンビン産生、血小板活性化および線維素溶解の独自の感受性の時間依存測定値を評価した。FXIの役割を説明するために、FXIに対する強力な単一特異性抗体を使用する試験も実施した。血栓形成デバイスへの血小板および線維素沈着を評価し、血管移植片閉塞試験を実施して、動脈型剪断の下での比較的大規模な実験的血栓の増殖および安定性におけるFXIの重要性を判定した。これらの結果によって、FXIは生成する血栓の流動面での堅調なトロンビン生成および血小板活性化を促進可能であり、これが血栓の成長および安定性に寄与することが初めてインビボで証明される。これらの結果は、線維素溶解のFXIに関連する抑制が、急速に増殖する動脈型血栓の分解の制限において、最大限でもわすかな役割しか果たさないことも示している。
方法
実験動物。合計39回の非ターミナル試験を、体重9〜11kgの正常な若年オスヒヒ(Papio anubis)17頭に対して実施した。実験は、別の箇所で記載したように、長期露出された動静脈(AV)シャントが大腿動脈と静脈との間に以前に配置された非抗凝固剤処置覚醒動物に対して実施した(Hansonら(1993)J.Clin.Invest.92:2003−2012)。基準シャント血流量が、全実験動物で250ml/分を超えた。不安は低用量のケタミン(<2mg/kg/時)で管理した。血小板数、赤血球数、およびヘマトクリットは毎日、実験の前後に測定した。計算した失血量は、いずれの実験日でも総血液量の4%を超えなかった。
実験動物。合計39回の非ターミナル試験を、体重9〜11kgの正常な若年オスヒヒ(Papio anubis)17頭に対して実施した。実験は、別の箇所で記載したように、長期露出された動静脈(AV)シャントが大腿動脈と静脈との間に以前に配置された非抗凝固剤処置覚醒動物に対して実施した(Hansonら(1993)J.Clin.Invest.92:2003−2012)。基準シャント血流量が、全実験動物で250ml/分を超えた。不安は低用量のケタミン(<2mg/kg/時)で管理した。血小板数、赤血球数、およびヘマトクリットは毎日、実験の前後に測定した。計算した失血量は、いずれの実験日でも総血液量の4%を超えなかった。
血栓症モデル。血栓形成は、以前記載されたように、人工血管移植片の血栓形成セグメント(ePTFE,WL Gore & Co.,Flagstaff,AZ)を挿入することによって、ヒヒAVシャント内で開始した(Hansonら(1993)J.Clin.Invest.92:2003−2012)。血小板依存性血栓形成を常に誘発するために、臨床移植片セグメントには固定化コラーゲンでコーティングした。内径(i.d.)が2mmまたは4mmのどちらかの20mm長移植片は、ウマI型コラーゲン(1mg/ml;Nycomed Arzenmittel,Munich,Germany)を15分間充填して、次に滅菌気流下で一晩乾燥させた。この方法は、走査型電子顕微鏡によって決定されたように、移植片管腔内に均一なコラーゲンコーティングを産生した(図1Bおよび1C)。血管形成コラーゲンコート移植片は次に、シリコーンゴムチューブのセグメント間に組み入れて、AVシャント内へ展開させた(図1A)。移植片を血液に最長60分間曝露した。各実験の間に、近位のシリコーンゴムのシャントセグメントをクランプ固定することによって、移植片を通る血液流量を100ml/分に制限して、それにより4mm移植片では265s−1の平均壁剪断速度(MWSR)が生じたのに対して、2mm移植片では初期MWSRは2120s−1であった。流量は、超音波流量計(Transonics Systems,Ithaca,NY)を使用して常に監視した。血栓形成移植片セグメントを60分で除去するまで、4mm移植片は閉塞せず、拍動性流量は100ml/分のままであった。永久シャントを通る基準血流量は、各実験後に回復した。2mm径移植片では、血流量は血栓形成のために次第に減少した。切迫した閉塞を知らせる、流量の100ml/分から20ml/分以下への低下時に、AVシャントから移植片を除去した。血流開始から移植片除去までの時間(<20ml/分血流)を閉塞時間と見なした。
血小板沈着の撮像のために、以前に記載されたように、ヒヒ自己血小板を111In−オキシン1mCiで標識した(Hansonら(1993)J.Clin.Invest.92:2003−2012)。試験を実施する前に、標識血小板を注入して、少なくとも1時間循環させた。血管形成移植片への標識血小板の蓄積は、ガンマ・シンチレーション・カメラを使用して5分間隔で測定した。相同125I−標識ヒヒフィブリノゲン(4μCi、>90%血餅形成性)を各試験の10分前に注入して、血栓への標識フィブリンの包含を、111Inを崩壊させるためにガンマカウンタを使用して30日後に評価した。沈着した放射能(cpm)を、元の試験の時間に採取したサンプルの血餅形成性のフィブリン(フィブリノゲン)放射能(cpm/mg)で割った。
閉塞試験は、高い動脈剪断速度(100ml/分のクランプ固定血流量にて2120s−1)を生じる10mm長2mm i.d.のコラーゲン・コート・デバイスを使用した。2mm血管形成移植片への標識血小板の蓄積は、ガンマ・シンチレーション・カメラを使用して3分間隔で測定した。血流量は、できるだけ長く近位でクランプ固定することによって100ml/分に維持して、次に増殖血栓によりデバイスが閉塞され始めたら減少させた。20ml/分の最終血流量を閉塞のカットオフとして使用したのは、血栓による完全な閉塞とデバイスに血流が通らないと、シャントの閉塞と、動物への著しい失血が起きるおそれがあるためであった。
サンプリング方法。新規の局所サンプリング方法を使用して、増殖実験血栓の表面を灌流する血液をサンプリングすることによって、血栓形成メディエータの局所産生を評価した。血栓マーカーは急速に分解されて循環から排除することができるため、全身サンプリングはより微小な変化を検出する感受性が不足することがあり、このようなマーカー産生の位置を確証することができない。すべての血液サンプルを1/10th体積の3.8%クエン酸抗凝固剤の中に収集した。全身サンプル(各1ml)を血栓症開始前はもちろんのこと、各試験の30および60分にも収集した。合計6つの局所血液サンプルは、末梢血IBLから100μl/分の速度にて10分間隔で、増加する血栓の10mm遠位側に位置する0.64mmポートから採取した(図1A)。サンプルポートの開通性を維持するために、トロンビン、FVIIa、FXa、FXIa、および各種の他のセリンプロテアーゼを直接抑制するPhe−Pro−Arg−クロロメチルケトン(PPACK、0.5mg/ml)抗凝固剤(Anglikerら(1988)Biochem J.256:481−486)を、再度同じ0.64mmポートを使用して、20μl/分の速度ですぐ上流に注入した。注入およびサンプリングは、注射器ポンプ(Harvard Apparatus)によって調節した。局所サンプリングは、本試験では4mm i.d.デバイスによってのみ実施した。PPACKも連続血清サンプル中で測定した全身プロトロンビン時間(PT)または活性化部分トロンボプラスチン時間(aPTT)に影響を及ぼさず、PPACKを用いた局所サンプリングもこのモデルの歴史的結果と比較してコラーゲンコート移植片への血小板またはフィブリン沈着に影響を及ぼさなかった。
対照試験では、通常の長さのシリコーンゴム延長チューブを、血栓形成デバイスを挿入せずに使用した。チューブを切断して、同じ移植片挿入位置に再び取り付けた。サンプルおよび抗凝固剤注入ポートを上述のように位置決めして、血液サンプルを同じ手法を使用して収集した。これにより、この方法が血栓形成デバイスとは無関係に血小板および凝固経路の活性化を産生したか否かを判定する局所サンプリング技法の対照が与えられる。以前の研究と一致して(Savageら(1986)Blood 68:386−393)、シリコンチューブは測定できるほど血栓形成性ではなかった;シリコーンポリマーも利用したサンプリング技法のどちらも、著しい凝固経路または血小板活性化を生じなかった。
血液サンプル分析。血液細胞数は、micro−60自動セルカウンタ(Horiba−ABX Diagnostics)を使用して決定した。血液サンプルを2つの分割量に分けて、特定の試験要件に従って処理した。すべてのサンプルを氷上に10分間置いて、4℃にて12,900gの遠心分離に10分間かけて、血漿を−80℃で保管した。β−トロンボグロブリン(βTG)の決定では、サンプルに4μg/mlプロスタグランジンE1(PGE1)、4.3mg/mlアセチルサリチル酸(ASA)、および50μg/ml PPACKを添加した。交差反応ELISAアッセイを使用して、D−ダイマーレベル(IMUCLONE(登録商標)D−Dimer、American Diagnostica;LOD:35ng/mL)、血小板活性化マーカーβTG(Asserachrom(登録商標)、Diagnostica Stago;LOD:5IU/mL)、およびトロンビン−抗トロンビン複合体(TAT,Enzygnost−TAT、Dade−Behring;LOD:2ng/mL)を決定した。これらの試験に使用したすべてのELISA試験キットは以前に、ヒヒマーカーに対する感受性を示していた。
インビボでの第XI因子および血小板の抑制。以前の研究によって、ヒヒにおけるFXIの抑制を達成するためには、ヒトFXIに対するポリクローナル抗体の非常に高い用量が必要であることが示されたため(Gruberら(2003)Blood 102:953−955)、新たな試薬:ヒヒFXIと交差反応した強力な中和抗ヒトFXIモノクローナル抗体(aXIMab)が生成された。ハイブリドーマは、標準処置を使用して精製ヒトFXIで免疫化したBalb/cマウス由来であった(de StGroth & Scheidegger(1980)J.Immunol.Methods 35:1−21)。ハイブリドーマを固相ELISAを使用してヒトFXIについてスクリーニングして、結合を示したハイブリドーマを限界希釈によって2回サブクローニングした。FXIの活性化およびFXIaの活性の両方を抑制する、最も強力な中和抗体を産生したクローンは、細胞培養物上清によってカルシウム再添加正常ヒト血漿(NHP)および正常ヒヒ血漿(NBP)の凝固時間の延長に基づいて選択した。aXIMabを産生する株化細胞(1A6)をCL1000バイオリアクタで製造者(Integra Biosciences)のプロトコルに従って増殖させて、カチオン交換およびタンパク質Aクロマトグラフィーを使用して抗体を培地から精製した。
血漿中のヒトおよびヒヒFXIは、aXIMabによって、ウェスタンブロットで160kDaに1本のバンドとして認識された(図7A)。抗体は、組換えFXI/プレカリクレインキメラの免疫ブロッティングによって評価されたように、FXI重鎖の第3アップル(A3)ドメインを特異的に認識した(下の実施例2を参照;Sunら(1996)J.Biol.Chem.271:29,023−29,028も参照)。インビトロのaXIMabのIC50およびIC99は、FXI欠失ヒト血漿(George King Bio−Medical)を標準としてのNBPの段階希釈物と共に使用する凝固アッセイで、それぞれ2.5nMおよび10nMであった(Proctorら(1961)Am.J.Clin.Pathol.36:212−219)。濃度範囲0〜40nM内で試験した精製aXIMab(モノクローナル抗体1A6)は、活性化部分トロンボプラスチン時間(aPTT)(HemosilTMSynthASil,Instrumentation Laboratory)をNHPおよびNBPの両方で同様に、プロトロンビン時間(PT)(Innovin(登録商標)、Dade Behring)に影響を及ぼすことなく濃度依存方式で延長した。
インビボでのFXIおよび血小板活性の薬理学的抑制。パイロット実験では、aXIMab(モノクローナル抗体1A6;2mg/kg)をヒヒ1匹に投与して、血液サンプルをクエン酸凝固剤中に4週間にわたって収集して、各サンプルの循環FXI抗原(FXI:Ag)濃度、FXI阻害剤、およびFXI凝血促進活性を測定した。aXIMabのこの用量は、注射後に体重1kg当り血液量60ml中への抗体の初期希釈を前提として、FXIの持続的およびほぼ完全な抑制を達成する目的で選択した。aPTTの達成可能な最大延長は約2.5倍であった。FXI:Agは、ヒFXIおよびaXIMabとのその複合体も認識する、ヤギ抗ヒトFXIポリクローナル捕捉および検出(ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合[HRP])抗体(Affinity Biologicals,Hamilton,Ontario)を使用してELISAによって測定した。標準曲線はNBPの段階希釈によって作成され、FXI濃度はNBPのパーセンテージで決定した。FXIのウェスタンブロットは、7.5%ポリアクリルアミド−SDSゲルによる非還元条件下での血漿の1μlサンプルのサイズ分画と、続いてのPVDF膜への移行によって実施した。検出は、HRPに結合したヤギ抗ヒトFXIポリクローナル抗体および化学発光によってであった。同じサンプルで、ベセスダアッセイ(Kasperら(1975)Thromb.Diath.Haemorrh.34:869−872)を使用して過剰な(非複合)循環FXI阻害剤(aXIMab)活性レベルを決定し、FXI凝血促進活性は、凝固アッセイを使用してアッセイした(Proctorら(1961)Am.J.Clin.Pathol.36:212−219)。
aXIMabは、血栓形成実験の少なくとも24時間前に単回ボーラス(2mg/kg静脈内)として投与した。抗凝固効果(aPTT)を毎日監視して、凝固時間をFXI欠失ヒト血清(George King Bio−Medical)で作成した標準曲線と比較することによって評価されるように、循環血のFXI凝血促進活性は≧99%低下する間に、血栓形成実験を実施した。すべてのヒヒでPTも評価して、群間に差は見られなかった。
我々は以前に、ポリクローナル抗体によるFXIの抑制は、ヒヒにおいて高用量のヘパリンよりも安全であり、それと同じくらい有効であることを示した(Gruber & Hanson(2003)Blood 102:953−955)。アスピリンはヘパリンよりも弱い抗止血剤であり、動脈型血小板依存性血栓症の標準処置に含まれることが多いため、閉塞しやすい2mmi.d.移植片を用いた現在の試験で、ASAを長時間作用性の正の対照として使用した。ASA(32mg/kg)を、以前に記載されたように、各血栓症実験の2〜4時間前に経口投与した(Hansonら(1985)J.Clin.Invest.75:1591−1599)。同じ動物で新たな実験を実施する前に、各aXIMabおよびASAの休薬のために4週間を与えた。
止血評価。ヒヒの1次止血に対するFXI抑制およびアスピリンの効果は、標準テンプレート皮膚出血時間試験(Surgicutt(登録商標)、International Technidyne Corp)を使用して評価した。実験的に、この試験および他の試験(たとえばSimplate出血時間)は、ヒトおよび非ヒト霊長類における治療用凝固剤、抗血小板剤の効果、および凝固異常に感受性であることが示されている(Gruberら(2007)Blood 109:3733−3740;Smithら(1985)Am.J.Clin.Pathol.83:211−215;Payneら(2002)J.Vase.Surg.35:1204−1209)。すべての出血時間測定は、同じ専門技術者が実施した。止血の間接評価のために、aPTTおよびPT測定も実施した。
コンピュータによるモデル化。Xuら((2004)Biorheology 41:113−125)によって紹介されたのと類似の3Dコンピュータ流体力学モデルを使用して、生成する血栓を越えて流れ、隣接する血管壁に沿って遠位側にマーカーを輸送する血栓由来巨大分子の濃度を概算した。モデルは、血液密度および粘度の代表的な値を用いて、図1Aに示す形態に基づいていた(Fung(1993)“Biomechanics:Mechanical Properties of Living Tissues”(ed 2nd).New York:Springer−Verlag)。局所血液サンプリングのモデルは、有限要素ソフトウェアADINA(Watertown,MA)を使用して実装した。さらに、Markouら((1998)Annals Biomed.Engineering 26:502−511)のモデルに似た2D軸対称コンピュータモデルを使用して、流動場内の血栓症マーカー分布を概算した。コンピュータモデル化によって、血栓形成部位で放出または産生された興味のある分子(βTG、フィブリンD−ダイマー、およびTAT)は、すぐ遠位側の血管壁に沿った非常に薄い末梢血境界層(〜0.1mm厚の濃度境界層)内で濃縮される(>99%)であろうことが予測された(データは示さず)。それゆえ、ここで利用するように、局所サンプリング法は、血小板および興味のある凝固マーカーについて、生成する血栓のすぐ遠位側の壁付近の濃度境界層領域全体を効果的にサンプリングした。
フローチャンバ凝固試験。ガラス製毛細管を100μg/ml Hormコラーゲン(Nycomed Arzenmittel,ミュンヘン、ドイツ)でコーティングした。ヒト全血をトウモロコシトリプシン阻害剤(CTI、40μg/ml)中に収集して、コラーゲン経路のいずれの活性化も制限するために最初の1mlを廃棄して、265s−1の剪断速度にて10分間、毛細管を灌流させた。各実験の前に、血液をaXIMab(20μg/ml)、またはPBSビヒクルによってインキュベートした。別の実験では、洗浄した血小板およびRBCを記載されたように処理して(McCartyら(2006)J.Thromb.Haemost.4:1367−1378)、次にFXII欠失ヒト血漿(<1% FXII,Haematologic Technologies,エセックスジャンクション、バーモント州)と混合して、ヘマトクリット40%および血小板数300×l03/μlに到達させた。再構成血液をaXIMab(20μg/ml)またはCTI(40μg/ml)によってインキュベートして、7.5mM CaCl2および3.75mM MgCl2でカルシウム再添加して、次にコラーゲンコート毛細管に直接灌流させた。RBCまたは血小板を含まないカルシウム再添加FXII欠失ヒト血漿もコラーゲンに灌流させた。画像は、修飾Tyrodes緩衝液による3分間の灌流の後に、DIC顕微鏡法によって得た。
データ解析。平均値は±1SEM(平均値の標準誤差)で与えられる。閉塞データはlog−rank検定を使用して比較した。他のすべての一対比較には、両側Studentのt検定を使用した。P値≦0.05は有意と見なされた。
結果
aXIMabによるインビトロでのFXIの抑制によって、FXIIaとは無関係に、フィブリン形成が防止される。FXIIaの機能を遮断するためにCTIによって抗凝固剤処理されたヒト全血を、動脈剪断(265s−1)でコラーゲンに灌流させたときに、血小板は大型の凝集体として沈着して、生成するフィブリン鎖によって包囲されるようになった(図7B)。全く対照的に、CTI血液をaXIMabで処理してFXIを抑制したときに、フィブリン沈着は、血小板粘着の中程度の低下によって著しく減弱された。CTIを含む、または含まない再構成FXII欠失血液を使用したときも、結果は同様であった。再び、フィブリンはFXIIとは無関係に生成され、aXIMabによるFXI抑制によりフィブリン形成が妨害された。カルシウム再添加FXII欠失ヒト血清をコラーゲンに灌流させたときに、フィブリンは形成されなかった。これらの実験では、FXIIaを抑制するためにCTI(40μg/ml)によって抗凝固剤処理されたヒト全血、または再構成されたFXII欠失ヒト血液を、コラーゲンコート毛細管に265s−1の剪断速度で10分間灌流させた。各実験の前に、血液をaXIMab(20μg/ml)、CTI(40μg/ml)(指摘された場合には再構成血液用)、またはPBSビヒクルのいずれかでインキュベートした。Zeiss 63×油浸1.40NAプラン・アポクロマート・レンズを使用したZeiss Axiovert 200M顕微鏡によるKohler−illuminated Nomarski微分干渉コントラスト(DIC)顕微鏡法によって画像を得た。画像は、修飾Tyrodes緩衝液による3分間の灌流後に、Zeiss AxioCam with Slidebook 4.0(Intelligent Imaging Innovations,Inc.,Denver,CO,USA)によって取込んだ。実験はすべて37℃にて実施した。図7Bの各画像は2〜3回の実験の代表値である。
aXIMabによるインビトロでのFXIの抑制によって、FXIIaとは無関係に、フィブリン形成が防止される。FXIIaの機能を遮断するためにCTIによって抗凝固剤処理されたヒト全血を、動脈剪断(265s−1)でコラーゲンに灌流させたときに、血小板は大型の凝集体として沈着して、生成するフィブリン鎖によって包囲されるようになった(図7B)。全く対照的に、CTI血液をaXIMabで処理してFXIを抑制したときに、フィブリン沈着は、血小板粘着の中程度の低下によって著しく減弱された。CTIを含む、または含まない再構成FXII欠失血液を使用したときも、結果は同様であった。再び、フィブリンはFXIIとは無関係に生成され、aXIMabによるFXI抑制によりフィブリン形成が妨害された。カルシウム再添加FXII欠失ヒト血清をコラーゲンに灌流させたときに、フィブリンは形成されなかった。これらの実験では、FXIIaを抑制するためにCTI(40μg/ml)によって抗凝固剤処理されたヒト全血、または再構成されたFXII欠失ヒト血液を、コラーゲンコート毛細管に265s−1の剪断速度で10分間灌流させた。各実験の前に、血液をaXIMab(20μg/ml)、CTI(40μg/ml)(指摘された場合には再構成血液用)、またはPBSビヒクルのいずれかでインキュベートした。Zeiss 63×油浸1.40NAプラン・アポクロマート・レンズを使用したZeiss Axiovert 200M顕微鏡によるKohler−illuminated Nomarski微分干渉コントラスト(DIC)顕微鏡法によって画像を得た。画像は、修飾Tyrodes緩衝液による3分間の灌流後に、Zeiss AxioCam with Slidebook 4.0(Intelligent Imaging Innovations,Inc.,Denver,CO,USA)によって取込んだ。実験はすべて37℃にて実施した。図7Bの各画像は2〜3回の実験の代表値である。
これらのデータは、生理学的に適切な剪断の下で、FXIは、細胞血液成分の存在下でFXIIaとは無関係にフィブリン形成を促進することを示唆している。
aXIMabによるFXIの抑制。aXIMab(1A6;2mg/kg)を投与したヒヒを、注入後4週間にわたって追跡して、FXI抗原(FXI:Ag)、抗凝固活性、および抗体阻害剤レベルを評価した。aXIMab投与の1時間後に測定したFXI:Agレベルは、NBPレベルが110%から40%に低下したが、その後は着実に上昇して、注入後第8日には対照の300%に達した(図8A)。血漿FXI抗原は、第15日まで対照の200%超にとどまっていたが、その後、第27日までに130%までの低下が見られた。FXI活性は、aXIMab投与1時間後に125%から<1%に低下して、投与後の10日間は>99%が抑制されたままであった。FXI活性はその後、ゆっくりと上昇して、第27日までに正常化して136%となった。最高循環FXI阻害剤レベルは、aXIMab注入の1時間後に観察され(72ベセスダ単位[BU])、これは第15日までに<0.6BUに低下した(図8B)。FXI:Ag ELISAデータと一致して、血漿のSDS PAGEおよびウェスタンブロットでFXIホモダイマーを表す160kDaバンドは、第0日と第8日の間に強度が増した(図8C)。これらの結果は、aXIMabの抗凝固効果は、循環中にその存在が持続すること、およびFXI活性化および/または活性を遮断するその能力によるものであり、血漿からの酵素の排除ではないことを示している。aXIMabはSDSゲル電気泳動の間にFXIから分離するので、aXIMabによるFXIの抑制がリバウンド効果(FXI分泌の増加)を引き起こすのか、またはFXI−aXIMab免疫複合体が循環からゆっくりと排除されるのかは不明なままである。
aXIMab(2mg/kg)の単回i.v.ボーラス注入を4匹のヒヒに投与した。FXI凝血促進活性は、注入の1時間後に99.0%(98.8〜99.5%)抑制されて、投与後の8日間にわたって、すべての動物で>95%抑制されたままであった(図2)。抗体に対する有害反応は観察されなかった。aPTT測定は、aXIMab投与後に、対照動物の30.5±0.7秒と比較して65.6±2.0秒まで延長されたのに対して、PT測定は、同じ動物においてPBSビヒクル処置対照値と同等であった(それぞれ9.1±0.1対9.0±0.1秒、各処置でn=11)。アデノシン2リン酸(ADP)およびコラーゲンに応答する多血小板血漿中の血小板凝集は、aXIMab処置動物と対照結果で変わらなかった。
aXIMab処置ヒヒは、コラーゲン誘発血栓発生から防御された。以前の研究によって、ポリクローナル抗体によるFXI抑制が霊長類において組織因子および接触開始表面に対して抗血栓性であることが示された(Gruber & Hanson(2003)Blood.102:953−955)。血管損傷も大量の血小板コラーゲンを流動血に曝露させることができるため、ヒヒにおけるコラーゲン誘発血栓症に対するFXI抑制について調査した。aXIMab処置群とビヒクル処置群との間の血小板蓄積の有意差は、移植片の血流への曝露の早くも10分後に見られた(0.13±0.03×109対0.23±0.03×109の血小板、aXIMab対対照、P<0.05)。差は、血栓増殖の時間経過を通じて統計的に有意なままであった(図3A)。60分における移植片血小板蓄積は、aXIMab処置動物でビヒクル対照よりも63%低かった(1.38±0.26×109対3.68±0.52×109の血小板、aXIMab対対照、それぞれn=6および8、P<0.01;図3A)。血栓症試験前の全身血小板数は、aXIMabおよび対照群の両方で同様であり(それぞれ341±27×103/μl対337±31×103/μl)、血栓症実験後に著しく変化しなかった。エンドポイントのフィブリン沈着は、対照と比較して81%減少した(0.23±0.07mgおよび1.18±0.19mg、aXIMab対対照、P=0.001;図3B)。aXIMabはFXIのA3ドメインに単一特異性であるため、これらのデータによって、FXIが霊長類の動脈型流動条件下で血栓増殖において重要な役割を果たすことが立証される。
FXI抑制の間のトロンビン生成の低下および血小板活性化。FXIの抑制は、トロンビン媒介血小板活性化およびフィブリン形成を制限することによって、および/または血栓溶解を増加させることによって、インビボでの血栓形成を低下させるため、βTG、トロンビン(TAT)、およびD−ダイマーのレベルを測定した。全身前処置βTG、TAT、およびD−ダイマーのレベルは、ビヒクル処置およびaXIMab処置ヒヒで同程度であった(それぞれ19.3±2.6対24.8±3.8IU/ml、6.2±0.4対4.6±0.6μg/L、および2.3±0.2対2.4±0.2μg/ml)。驚くべきことに、我々は、ビヒクル処置ヒヒの血栓形成のすぐ下流の壁付近の領域から局所的に採取したサンプル中で測定されたように、移植片血栓部位からの血流中へのTAT放出で20倍を超える着実な上昇を観察した。ヒヒのaXIMabでの前処置によって、局所TATレベルの上昇が防止され、FXI活性の非存在下でのトロンビン生成のかなりの低下が示唆された(図4A)。局所サンプリングによって得た血漿中のTATレベルは、40分にて98%まで低下したのに対して、全身TATレベルは未処置対照に対して60分にて81%低下した(4.3±0.5対22.1±2.5μg/L、それぞれn=6および7、P<0.001;図4B)。血小板α顆粒βTGの放出によって評価されるように、血栓表面での血小板活性は、aXIMab処置動物における血栓の遠位で採取したサンプルでは、30分にて86%低下した(図4C)。60分にて測定した全身βTGレベルは、ビヒクル処置対照(39.5±5.5IU/ml、n=7;図4D、P<0.05)と比較して、aXIMab(23.0±2.1IU/ml、n=6)によって42%低下した。局所D−ダイマーレベルは60分にて、対照(それぞれ2.3±0.2および2.4±0.4μg/ml、n=7)またはaXIMab処置動物(それぞれ2.4±0.2および2.2±0.2μg/ml、n=6;図4E)のどちらにおいても、基準全身値と比較して変化しなかった。60分にて評価した全身D−ダイマーレベルも、両方の群(2.4±0.3および2.3±0.2μg/ml、対照対aXIMab処置動物)で、基準全身値から変化がなかった。このことによって、血栓溶解剤が投与されなければ、全身D−ダイマーレベルが血栓開始後60分まで上昇しないことを示す、同様のヒヒ研究による以前の報告書が確認される(Sundellら(1997)Circulation 96:941−948;Dichekら(1996)Circulation 93:301−309)。
凝固および血小板の活性化のための局所サンプリング方法を評価するために、シャントループ内にコラーゲンコート血栓形成デバイスを挿入せずに系を試験した。チューブのみでTATおよびβ−TGレベルが全身的および局所的に中程度上昇したが(図4A〜C)、上昇は統計的に有意ではなかった。対照チューブでは、フィブリン形成または血小板沈着は測定されなかった。
これらのデータによって:1)FXIは、急性動脈型血栓形成の間にトロンビン生成および血小板活性化で重要な役割を果たすこと、および2)内因性局所血栓溶解は、FXI活性とは無関係に、これらの試験の時間経過の間に制限されるように思われることが示唆される。
aXIMabは、血管移植片閉塞を防止する。巨視的な血栓が4mm i.d.血管移植片を急速に形成しても、これらの移植片のいずれも60分間の血液灌流中に閉塞しなかった。したがって血栓形成および閉塞に対するFXI活性を抑制することの効果は、より高い剪断条件下(壁剪断速度=2120s−1で血栓を蓄積した、より小径(2mm i.d.)のコラーゲンコート血管グラフトを使用して評価した。初期血小板蓄積速度はaXIMab処置およびビヒクル処置ヒヒで同様であったが、血栓安定性はFXI活性の非存在下で大きく低下した。血液灌流開始後の12〜15分以内に、血小板血栓の成長速度はすべてのaXIMab処置動物で低下して、血栓中の血小板の数が突然減少し、血栓安定性の低下と塞栓形成に対する血栓材料の正味の減少が示唆された(図5)。aXIMabによる処置によって、移植片9個中8個が27.0±3.3分で閉塞したビヒクル処置対照での結果と比較すると、すべての実験で移植片閉塞が60分にわたって防止された(移植片5個中5個が開通性を維持した)(P<0.01;図5および表1)。フィブリン蓄積もaXIMabにより、ビヒクル処置対照に対して減少した(それぞれ0.18±0.02対0.30±0.04mg、P<0.01;表1)。予想した通り、正の抗血栓性対照である、高用量ASAによる処置は、2mm i.d.移植片中の血小板沈着を減少させたが、閉塞性血栓形成を完全に妨害しなかった。移植片閉塞までの時間は、アスピリンによって4個の移植片において平均18分間延長されたが、2個のさらなる移植片は60分間の試験間隔を通じて開通性を維持した。したがって高用量ASAは、aXIMabよりも移植片閉塞を防止するのに有効でなかった(P<0.05、aXIMab対ASA)。これらのデータは、小径血管移植片の急性閉塞を引き起こす血栓形成プロセスにおいて、FXIが重要な役割を果たすことを示唆している。
考察
これらの試験によって、FXIがコラーゲン誘発および増殖血栓の流動面におけるトロンビンの十分な量の産生促進に不可欠であり、トロンビン産生促進によって高動脈流および低動脈流条件下での血小板活性化、フィブリン形成、および血栓安定性が引き起こされることが証明される。FXI抑制の抗血栓/抗閉塞結果は、線維素溶解経路の増加によってではなく、トロンビン産生の実質的な減少によって主に生じた。理論に縛られたくはないが、トロンビンは血小板の最も強力な生理学的アゴニストであるため、FXI抑制の間に観察された血小板活性化の著しい低下は、トロンビン生成の下方制御から生じたという可能性が高い。FXI抑制は低動脈流でのコラーゲンへの血小板沈着を遅延させるが、高流量での早期血栓成長は対照試験の血小板沈着を反映した。これらの結果は、高剪断下での露出コラーゲンのvWFへの血小板GPIb結合の効率上昇と一致しており(Nishiyaら(2002)Blood.100:136−142)、これにより早期血栓成長のためのフィブリンへの依存性が、低剪断条件下よりも低くなる。しかし血栓成長の増殖期において、高剪断流に露出された血栓の安定性は、FXIならびにフィブリン産生および血小板活性化を促進するその能力に強く依存していた。実際に、高動脈流では、遠位血栓塞栓形成の増加が明確に認められ、これによりすべてのaXIMab処置動物における血管移植片閉塞が完全に防止された。これらの発見は、塩化鉄誘発静脈損傷および血栓形成後のFXI欠失マウスで観察された抗血栓性および抗閉塞性表現型と一致している(Rosenら(2002)Thromb.Haemost.87:774−776;Wangら(2005)J.Thromb.Haemost.3:695−702;Wangら、J.Thromb.Haemost.4:1982−1988)。しかし、流れ依存性血栓形成の以前のインビボ試験のいずれも、FXI抑制の基礎を成す抗血栓機構の証拠を与えていない。
これらの試験によって、FXIがコラーゲン誘発および増殖血栓の流動面におけるトロンビンの十分な量の産生促進に不可欠であり、トロンビン産生促進によって高動脈流および低動脈流条件下での血小板活性化、フィブリン形成、および血栓安定性が引き起こされることが証明される。FXI抑制の抗血栓/抗閉塞結果は、線維素溶解経路の増加によってではなく、トロンビン産生の実質的な減少によって主に生じた。理論に縛られたくはないが、トロンビンは血小板の最も強力な生理学的アゴニストであるため、FXI抑制の間に観察された血小板活性化の著しい低下は、トロンビン生成の下方制御から生じたという可能性が高い。FXI抑制は低動脈流でのコラーゲンへの血小板沈着を遅延させるが、高流量での早期血栓成長は対照試験の血小板沈着を反映した。これらの結果は、高剪断下での露出コラーゲンのvWFへの血小板GPIb結合の効率上昇と一致しており(Nishiyaら(2002)Blood.100:136−142)、これにより早期血栓成長のためのフィブリンへの依存性が、低剪断条件下よりも低くなる。しかし血栓成長の増殖期において、高剪断流に露出された血栓の安定性は、FXIならびにフィブリン産生および血小板活性化を促進するその能力に強く依存していた。実際に、高動脈流では、遠位血栓塞栓形成の増加が明確に認められ、これによりすべてのaXIMab処置動物における血管移植片閉塞が完全に防止された。これらの発見は、塩化鉄誘発静脈損傷および血栓形成後のFXI欠失マウスで観察された抗血栓性および抗閉塞性表現型と一致している(Rosenら(2002)Thromb.Haemost.87:774−776;Wangら(2005)J.Thromb.Haemost.3:695−702;Wangら、J.Thromb.Haemost.4:1982−1988)。しかし、流れ依存性血栓形成の以前のインビボ試験のいずれも、FXI抑制の基礎を成す抗血栓機構の証拠を与えていない。
FXIは、フィブリンをタンパク質分解的に修飾してこれをプラスミンに対して耐性とする、メタロプロテイナーゼTAFIのトロンビン媒介活性化により、線維素溶解に対する血餅耐性を促進する(Bajzarら(1996)J.Biol.Chem.271:16,603−16,608;Broze & Higuchi(1996)Blood 88:3815−3823)。さらに、抗凝固薬によるトロンビン生成の抑制は、より低速で生成し、より低密度のフィブリンネットワークのために、血餅の溶解を促進する(Gruberら(1994)Blood 83:2541−2548;Nenciら(1992)Blood Coagul.Fibrinolysis 3:279−285)。どちらのプロセスも、ウサギのクランプ固定された頸静脈中にて抗凝固抗第XI因子抗体の存在下で形成された血餅の溶解促進を、少なくとも一部は説明し得る(Minnemaら(1988)J.Clin.Invest.101:10−14)。ヒヒでの本試験の間に、線維素溶解分解生成物D−ダイマーは、フィブリン、血小板、および白血球が豊富な動脈型血栓の付近での局所血液サンプリングによって測定した(Gruberら(2007)Blood 109:3733−3740)。TATおよびβTGのレベルとは異なり、ビヒクルまたはaXIMab処置ヒヒで局所D−ダイマーの変化は検出されなかった。このような発見により、内因性線維素溶解は、急性動脈血栓形成の間の血栓表面での主要なプロセスでないかもしれないことが示唆され、これは線維素溶解表現型を有することが予想されたTAFI欠失マウスが、損傷誘発動脈血栓形成から防護されなかったという観測と一致している(Nagashimaら(2002)J.Clin.Invest.109:101−110)。本試験は、急速な血栓発生における線維素溶解の役割を証明していないが、FXI活性の非存在下でのより効果的な内因性線維素溶解が、血栓発生および再構成の後期の段階で役割を果たし得る。
aXIMabによるFXI抑制の間の局所TATの劇的な低下によって、フィブリン形成、血小板活性化、および血栓安定性に直接寄与する、コラーゲン誘発および増殖血栓の表面でのトロンビン産生におけるFXIの重要性が示される。
PPACK−トロンビンは上述の酵素イムノアッセイでは検出できないため、すべての局所TATを血栓流動面に、または血栓からPPACK注入ポートまでの1cm以内の距離に生成した(全身的寄与を差し引く)。
他の抗凝固薬に勝るPPACK使用の利点は、活性化血小板におけるプロトロンビナーゼ複合体の一部として、他の凝固薬から遮蔽されて、トロンビン生成を継続できる第Xa因子を含む、凝固経路のいくつかの活性セリンプロテアーゼを迅速に抑制するその能力である。PPACKは、FXIaも抑制して、サンプリング注射器内での望ましくない接触活性化を10分間のサンプリング間隔にわたって制限する。PPACKを注入せずに、局所サンプリングポートは20〜30分以内に閉塞した。利用したCFDモデルに基づいて、注入したPPACKの大部分はサンプリング注射器に内に捕捉された。全身循環中に漏れた少量のPPACKは、履歴データと比較して、4mmコラーゲンコート移植片への血小板または、フィブリン沈着に影響を及ぼさなかった。また、注入したPPACKの総量は、全身的に投与した場合、以前にヒヒでの凝固時間の延長を示した量よりも1桁少ない(Hansonら(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85:3184−188)。
コラーゲン無処置試験での60分近くの局所TATおよびβ−TGレベルの低下は、血小板蓄積速度の低下と関連していた。血栓成長とメディエータ産生との調和をもたらすものは不明であるが、おそらく活性化タンパク質C(APC)生成または他の凝固阻害剤の産生の結果である。
これらの実験による別の興味深い結果によって、循環組織因子(TF)は、血小板または微粒子のどちらを介しても、血栓発生の促進に重要な役割を果たしていないように思われることが示唆される。理論に縛られたくはないが、TF/FVIIa複合体の形成は、接触経路とは無関係にトロンビン産生およびフィブリン形成を補助するはずであるが、FXIの抑制は、コラーゲンにおけるフィブリン産生を著しく制限する。考えられるシナリオは、FXIaがトロンビンの強いフィードバック増幅を促進して、これが循環TFとは無関係にフィブリン形成および血小板活性化を促進するということである(Gailaniら(1991)Science.253:909−912;Brozeら(1993)Thromb.Haemost.70:72−74;Gailaniら(2001)Blood.97:3117−3122;Yunら(2003)J.Biol.Chem.48:48112−48119;Bagliaら(2004)J.Biol.Chem.279:49323−49329)。
第XIIa因子によるFXIの活性化も、コラーゲン誘発血栓発生の間の重要なプロセスであり得る。
ヒヒにおけるFXI抑制の間の局所TAT形成の減少は、より制限された血小板およびフィブリン蓄積と相まって、血栓の増殖におけるFXI依存性トロンビン産生の継続が重要であることを示している。FXI依存性トロンビン産生は、FXIIa、トロンビン、および/または自己活性化によるFXI活性化の継続によって行うことができた(Gailani & Broze(1991)Science 253:909−912;Broze & Gailani(1993)Thromb.Haemost.70:72−74)。FXIIaは、マウスにおける実験的血栓症で重要な役割を果たすように思われる(Renneら(2005)J.Exp.Med.202:271−281)。しかし、このインビトロのフローチャンバのデータは、FXIが、血液細胞の存在下で剪断流条件の間に、FXIIaとは無関係に血栓症を促進する機構を示している。インビトロの静止血漿アッセイでのトロンビン媒介FXI活性化は疑われたが(Pedicordら(2007)PNAS USA 104:12,855−12,860)、我々の流動強化血栓症モデルは、FXIのFXII独立型血栓形成経路を明確に証明している。
興味深いことに、遊離FXI:AgはaXIMab注入後に1週間にわたって1%未満に低下したが、総FXI:Agレベルはヒヒ循環中のFXI活性消失後に、一時的に基準を数倍上回って上昇した。この上昇が循環免疫複合体のより長い半減期またはFXI合成および/もしくは分泌のどちらによるのかは、まだ調査されていない。
FXIの進化的役割は解明するのが困難であったが、これらおよび他の研究は、FXIが一部は、大量のコラーゲンを流動血に暴露する可能性がある経血管損傷の後の止血を促進するように機能するという仮説を裏付けている。FXIの非存在下では、止血促進閉塞性血栓を安定化できずに、増加した、潜在的に致死的な失血を引き起こすことがある。組織因子依存性止血プロセスは大半の出血事象の間に優勢であるため、FXIは、ヒト患者における重篤なFXI欠失の主な臨床徴候である、手術または外傷の後のみに役割を果たす可能性が高い。その上、FXIは増殖血栓の流動面に対してその中心的な効果を有するように思われ、FXI欠乏患者は軽度の出血傾向を有するため、FXIは、大規模な外傷または手術とは無関係に深刻な出血事象を引き起こす可能性がある他の既存の抗血栓方法より、より血栓症に特異的な処置方法であると思われる。
全体的に見て、上で提示した証拠によって、FXIは、トロンビン産生の局所的増加が相当に促進されて、次に強力な血小板活性化およびフィブリン形成の原因となることによる、コラーゲン誘発血栓増殖に不可欠である。しかしFXI抑制は、1次止血を実質的に妨害しない。それゆえ、治療的FXI抑制は、血栓成長および血栓性血管閉塞(すなわち脳卒中、心臓発作、DVT)を制限する例外的に有望な処置方法となり、同時に、他の現在利用可能な抗血栓剤と比較して、類を見ない止血安全性を提供する。
(実施例2)
ヒト第XI因子への1A6モノクローナル抗体の結合
抗第XI因子モノクローナル抗体1A6がヒトおよび非ヒト霊長類血漿における第XI因子を認識することを裏付けるウェスタンブロット試験からの結果を図7Aに示す。
ヒト第XI因子への1A6モノクローナル抗体の結合
抗第XI因子モノクローナル抗体1A6がヒトおよび非ヒト霊長類血漿における第XI因子を認識することを裏付けるウェスタンブロット試験からの結果を図7Aに示す。
モノクローナル抗体1A6の比較結合試験は、FXI、プレカリクレイン(PK)、およびPKドメインによる置換FXIドメイン(図9)またはFXIドメインによるPKドメインの置換(図10)のどちらかを含むFXI/PKキメラを使用して実施した。図9の右パネルに示すように、モノクローナル抗体1A6はFXIを結合したが、PKには結合しなかった。さらに、モノクローナル抗体1A6は、FXIのA3ドメインがPKドメインによって置換されたキメラを除くすべてのFXI/PKキメラを結合した(図9)。異なるFXIドメインによるPKドメインの置換を含むキメラでは、抗体1A6は、FXIのA3ドメインが挿入されたキメラのみに結合することが示された(図10)。これらの機能消失(図9)および機能獲得(図10)試験から、モノクローナル抗体1A6がFXI A3ドメインのエピトープに結合することが決定された。
モノクローナル抗体1A6の結合に重要なアミノ酸を決定するための結合試験も、A3ドメイン内に異なるアミノ酸の突然変異を含む組換えFXIタンパク質を使用して実施した。モノクローナル抗体1A6の25のパネル、たとえばA3ドメイン内の2または3の隣接アミノ酸がアラニンで置換された組換えタンパク質への結合の例を図11に示す。ポリクローナル抗第XI因子抗体はすべてのFXI A3ドメイン突然変異に結合したが、モノクローナル抗体1A6はいくつかの突然変異に結合しなかった(図11を参照)。このような試験に基づいて、モノクローナル抗体1A6のFXI A3ドメインへの結合に重要であるアミノ酸を決定して、図12に示す(配列番号1のアミノ酸183〜197、203〜204、234〜236、241〜243、252〜254、および258〜260)。
(実施例3)
1A6モノクローナル抗体およびコード化配列の配列決定
mRNAを、Aximab(1A6)として公知のマウス抗体を発現するハイブリドーマ株化細胞から抽出して、逆転写し、抗体特異的転写物をPCR増幅した。本抗体の重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を決定するために、PCR産物をクローニングした。
1A6モノクローナル抗体およびコード化配列の配列決定
mRNAを、Aximab(1A6)として公知のマウス抗体を発現するハイブリドーマ株化細胞から抽出して、逆転写し、抗体特異的転写物をPCR増幅した。本抗体の重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を決定するために、PCR産物をクローニングした。
株化細胞を凍結ストックから成功裏に回収した。mRNAをハイブリドーマの細胞ペレットから抽出して、縮重プライマプールの系を使用してRT/PCRを実施した。重鎖可変領域mRNAは、6つの縮重プライマプールのセット(HA〜HF)を使用して増幅して、軽鎖可変領域mRNAは8つの縮重プライマプールのセット(LA〜LH)を使用して増幅した。
Aximab重鎖:ほぼ予想されたサイズの強力なDNAバンドがプライマプールHDで観察された。このバンドからのDNAを精製およびクローニングして、8つのクローンを配列決定した。これらのクローンのうち4つを整列して、機能性再配置重鎖を得た(表2、図13A)
Aximabハイブリドーマからの重鎖および軽鎖可変領域配列を決定した。AximabがマウスIgG/カッパ抗体であることと、本抗体の両方の鎖がフレームワーク領域を通じてヒト抗体データベース内の近接した配列相同体を有することとを確認した(表2)。これによりComposite Human AntibodyTM技術またはCDR移植のどちらかによる、続いてのヒト化が容易になるはずである。各抗体の重鎖および軽鎖クローンが産生され、したがってヒト化に利用できる。例示的なCDR移植重鎖および軽鎖可変領域配列を図13Cおよび13Dに示す。
本明細書で言及したすべての刊行物および特許出願は、本発明が関係する当該技術分野の当業者のレベルを示す。すべての刊行物および特許は、各刊行物または特許出願が参照により組み入れられることが詳細および個別に指示されているのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み入れられている。
理解を明確にする目的で図解および実施例によって上述の発明を多少詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲内で、ある変更および修正が実施され得ることが明らかとなるであろう。
理解を明確にする目的で図解および実施例によって上述の発明を多少詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲内で、ある変更および修正が実施され得ることが明らかとなるであろう。
Claims (34)
- 配列番号1に記載されるヒトFXIの重鎖上のエピトープに特異的に結合する抗第XI因子(FXI)モノクローナル抗体であって、該抗体は、生物学的に活性である、抗体。
- 前記エピトープが、配列番号1のアミノ酸位置182〜265に相当するヒトFXIの重鎖のA3ドメイン内にある、請求項1に記載の抗体。
- 前記エピトープが:a)配列番号1のアミノ酸183〜197;b)配列番号1のアミノ酸203〜204;c)配列番号1のアミノ酸234〜236;d)配列番号1のアミノ酸241〜243;e)配列番号1のアミノ酸252〜254;およびf)配列番号1のアミノ酸258〜260から成る群より選択される、請求項1に記載の抗体。
- 前記エピトープが:a)配列番号1のアミノ酸183〜197;b)配列番号1のアミノ酸252〜254;およびc)配列番号1のアミノ酸258〜260から成る群より選択される、請求項1に記載の抗体。
- 配列番号1に記載されるヒトFXIに特異的に結合する抗第XI因子(FXI)抗体であって、該抗体が少なくとも1つの最適化した相補性決定領域(CDR)を含み、該CDR領域が:
a)配列番号10、11、12、13、14、または15で示されるアミノ酸配列を含むCDR;および
b)配列番号10、11、12、13、14、または15で示されるアミノ酸配列に少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR;
から成る群より選択される抗体。 - 前記抗体が:
a)配列番号3または7で示されるアミノ酸配列;
b)配列番号3または7で示されるアミノ酸配列に少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列;
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖を含む、請求項5に記載の抗体。 - 前記抗体が:
a)配列番号5または9で示されるアミノ酸配列;
b)配列番号5または9で示されるアミノ酸配列に少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列;
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含む、請求項5に記載の抗体。 - 請求項1〜7のいずれか一項に記載の抗体の断片であって、該断片は、生物的に活性である、断片。
- 血栓症を抑制する必要がある対象において止血を妨害せずに血栓症を抑制する方法であって、該対象に有効用量の請求項1〜7のいずれか一項に記載の抗体または断片を投与するステップを含む方法。
- 前記血栓症が心筋梗塞、不安定狭心症、心房細動、脳卒中、腎障害、肺塞栓症、深部静脈血栓症、経皮経管冠動脈形成術、播種性血管内凝固症候群、敗血症、人工臓器、シャントまたはプロテーゼに関連する、請求項9に記載の方法。
- 血栓症を処置する必要がある対象の血栓症の処置において必要な用量を減少させるか、または抗血栓剤の効果を補完する方法であって、該対象に該抗血栓剤と組合せて請求項1〜7のいずれか一項に記載の抗体または断片を投与するステップを含む方法。
- 前記抗血栓剤が直接もしくは間接トロンビン阻害剤、第X因子阻害剤、第IX因子阻害剤、第XII因子阻害剤、第V因子阻害剤、第VIII因子阻害剤、第XIII因子阻害剤、第VII因子阻害剤、組織因子阻害剤、線維素溶解促進剤、線維素溶解もしくはフィブリノゲン溶解剤、カルボキシペプチダーゼB阻害剤、血小板阻害剤、選択的血小板数減少剤、または第XI因子阻害剤である、請求項11に記載の方法。
- 転移性癌を処置する必要がある対象において転移性癌を処置する方法であって、該対象に治療的有効用量の請求項1〜7のいずれか一項に記載の抗体または断片を投与するステップを含む方法。
- 炎症反応を処置する必要がある対象において炎症反応を処置する方法であって、該対象に治療的有効用量の請求項1〜7のいずれか一項に記載の抗体または断片を投与するステップを含む方法。
- 前記対象が哺乳動物である、請求項9〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が非ヒト霊長類である、請求項9〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象がヒトである、請求項9〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体または断片が前記対象に約0.01mg/kg〜約10mg/kgの単回用量で投与される、請求項9〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体または断片が前記対象に約2mg/kgの単回用量で投与される、請求項18に記載の方法。
- 前記抗体または断片が前記対象に全身投与、局所的投与、非経口投与または経腸投与により投与される、請求項9〜19のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の抗体または断片を活性成分として含む製薬組成物。
- 前記抗体または断片の即時放出のために製剤化される、請求項21に記載の製薬組成物。
- 前記抗体または断片の制御放出のために製剤化される、請求項21に記載の製薬組成物。
- a)配列番号1のアミノ酸183〜197;b)配列番号1のアミノ酸203〜204;c)配列番号1のアミノ酸234〜236;d)配列番号1のアミノ酸241〜243;e)配列番号1のアミノ酸252〜254;およびf)配列番号1のアミノ酸258〜260から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチド。
- 請求項24に記載のペプチドを免疫原として使用するステップを含む、抗体を調製する方法。
- 単離ポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが免疫グロブリン重鎖を含む抗体をコードする核酸を含み、該免疫グロブリン重鎖が:
a)配列番号3または7で示されるアミノ酸配列;
b)配列番号3または7で示されるアミノ酸配列に少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列;
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離ポリヌクレオチド。 - a)配列番号2または6で示されるポリヌクレオチド配列;
b)配列番号2または6で示されるポリヌクレオチド配列に少なくとも85%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列;
から成る群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項26に記載の単離ポリヌクレオチド。 - 単離ポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが免疫グロブリン軽鎖を含む抗体をコードする核酸を含み、該免疫グロブリン軽鎖が:
a)配列番号5または9で示されるアミノ酸配列;
b)配列番号5または9で示されるアミノ酸配列に少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列;
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離ポリヌクレオチド。 - a)配列番号4または8で示されるポリヌクレオチド配列;
b)配列番号4または8で示されるポリヌクレオチド配列に少なくとも85%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列;
から成る群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項28に記載の単離ポリヌクレオチド。 - 請求項26〜29のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む組成物。
- 請求項26〜29のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
- 請求項26〜29のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 前記ポリヌクレオチドがプロモーターと作動可能に結合されている、請求項32に記載のベクター。
- 請求項32〜33のいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞。
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