JP2011500602A - Ｎ−アシルエタノールアミン−加水分解酸性アミダーゼを阻害する組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

Ｎ−アシル−エタノールアミン−加水分解酸性アミダーゼ（ＮＡＡＡ）の基質であるパルミトイルエタノールアミド（ＰＥＡ）の濃度を上昇させるように、Ｎ−アシル−エタノールアミン−加水分解酸性アミダーゼ（ＮＡＡＡ）を阻害する化合物及び医薬組成物が企図される。ＮＡＡＡ阻害は、ＰＥＡの低濃度が付随する状態を改善するのに有効であるものである。使用の中でも、様々なＮＡＡＡ阻害剤が、特に、炎症性疾患の治療において、治療剤として企図される。

Description

本発明の分野は、Ｎ−アシルエタノールアミン−加水分解酸性アミダーゼ（ＮＡＡＡ）の阻害に関する組成物及び方法であり、特に、疼痛、炎症及び、脂肪酸エタノールアミド調節が臨床的に関連するその他の疾患の治療及び予防に関する。

疼痛及び／又は炎症を治療するための技術分野で多くの組成物及び方法が知られているが、依然として多くの問題がある。最も重要なこととして、長期の投与期間にわたる及び／又は高投与量による副作用により、このような薬物の使用が奏功しないことが多い。例えば、ある種のＣＯＸ−２阻害剤は、最近、有害な心血管事象に関与するとみなされており、一方で、アスピリン型疼痛薬物治療によって腸出血のリスクが上昇することが多い。その他の例において、イブプロフェン及びアセトアミノフェンは、特に高投与量で、肝機能に悪影響を与える傾向がある。

長鎖脂肪酸のエタノールアミド（Ｎ−アシルエタノールアミン（ＮＡＥ））は、多くの下等生物、高等生物及び哺乳動物において存在し、様々な機能を有する。例えば、アナンダミド（ポリ不飽和脂肪酸型ＮＡＥ）は、大麻類似性の活性を有することが示されており、ＴＲＰＶ１（一過性受容器電位バニロイド型１）のリガンドとして作用するものとして報告された。一方、飽和及びモノ不飽和ＮＡＥは、カンナビノイド受容体のリガンドとしては不活性である。しかし、このような化合物は、様々なその他の生物学的活性を保持することが報告されている。例えば、Ｎ−パルミトイルエタノールアミン（ＰＥＡ）は、抗炎症性活性、抗侵害受容活性、免疫抑制活性、神経保護活性及びまた抗酸化活性も有する。興味深いことに、Ｎ−パルミトイルエタノールアミンの抗炎症性作用には、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体−α（ＰＰＡＲ−α）の活性化が介在し得る。その他の例において、Ｎ−オレオイルエタノールアミンはＰＰＡＲ−αを介して食欲減退性があり（例えば、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（２００６）、Ｖｏｌ．３１８、Ｎｏ．２、ｐ．５６３−５７０）、Ｎ−ステアロイルエタノールアミンはアポトーシス促進効果があり、食欲減退性があることが示された。

ＮＡＥは、触媒活性的にエタノールアミン及び対応する脂肪酸にＮＡＥを加水分解するＮＡＡＡの基質である。注目すべきこととして、ＮＡＡＡの触媒活性は、同様の酵素、ＦＡＡＨ（脂肪酸アミドヒドロラーゼ）とは顕著に異なる。様々なその他の違いの中でも、ＮＡＡＡのある特徴的な性質は、約５．０のｐＨで至適であるその活性である。ＮＡＡＡはまた、その他のＮＡＥよりもＮ−パルミトイルエタノールアミン（ＰＥＡ）を実質的に優先する傾向も示し、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００^ＴＭ（Ｕｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅによる登録商標；４−オクチル−フェノールポリエトキシレート）及びジチオスレイトール（ＤＴＴ）により活性化される。注目すべきことに、ＮＡＡＡは、フッ化フェニルメチルスルホニル及びメチルアラキドニルフルオロホスホネートによる阻害に対して感受性がより低い。ＮＡＡＡに対する遺伝子がクローニングされており、対応するポリペプチドの特徴が比較的よく分かっているが（例えば、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（２００５）、Ｖｏｌ．２８０、Ｎｏ．１２、ｐ．１１０８２−１１０９２参照）、哺乳動物におけるＮＡＡＡの機能的特性はよく分かっていない。

多くのＦＡＡＨ阻害剤が文献において同定されているが（例えば、Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（２００７）、５６５（１−３）；ｐ．２６−３６；Ｊ Ｅｎｚ Ｉｎｈｉｂ ａｎｄ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ（２００３）、１８（１）、ｐ．５５−５８；Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ（１９９９）、３６２（２）、ｐ．１９１−１９６）、ＮＡＡＡに対して阻害剤は現在報告されていない。さらに、ＦＡＡＨ及びＮＡＡＡは構造的に密接な関係がないので、ＦＡＡＨ阻害剤がＮＡＡＡを顕著に阻害するとは予想されない。

従って、疼痛及び炎症の治療及び予防の多くの組成物及び方法が当技術分野で知られている一方で、それらの全て又は殆ど全てが１以上の欠点を有する。結果的に、疼痛及び炎症を治療及び予防するための改善された組成物及び方法を提供することが依然として必要とされている。

Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｖｏｌ．３１８、Ｎｏ．２、２００６年、ｐ．５６３−５７０ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、Ｖｏｌ．２８０、Ｎｏ．１２、２００５年、ｐ．１１０８２−１１０９２ Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、５６５（１−３）、２００７年、ｐ．２６−３６ Ｊ Ｅｎｚ Ｉｎｈｉｂ ａｎｄ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ、１８（１）、２００３年、ｐ．５５−５８ Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ、３６２（２）、１９９９年、ｐ．１９１−１９６

本発明は、発明者らにより企図され同定された様々な化合物を用いた、ＮＡＡＡを阻害する組成物及び方法に関する。最も有利なこととして、このような化合物及び組成物は、パルミトイルエタノールアミドの低レベルが付随する状態、特に炎症性疾患の治療において有用である。

本発明のある好ましい態様において、パルミトイルエタノールアミドの低レベルが付随する状態の治療のための医薬組成物は、式Ｉによる化合物及び医薬的に許容可能な担体を含む。

（式中、
Ａは、Ｏ又はＳであり；ＢはＯ、Ｓ又はＮＲ^ａであり；Ｒ_１及びＲ_２は、独立に、Ｈ、ハロゲン又は場合によっては置換される低級アルキルであり；ｎは、０から３の間の整数であり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、ＮＲ^ｂ、ＣＨＲ^ｂであるか又は存在せず；Ｙは、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｓ）又はＣＨＲ^Ｃであり；Ｚは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ^ｄ又はＣＨＲ^ｄであり；Ｖは、場合によっては置換される低級アルキル又は場合によっては置換される低級アルケニルであり；Ｗは、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル又はＣ（Ｒ_３Ｒ_４Ｒ_５）であり、これらのそれぞれは場合によっては置換され得；ある態様においては、Ｙ及びＶは、５−又は６員環を形成し得；最も典型的には、Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ、Ｒ^Ｃ及びＲ^ｄは、Ｈ、場合によっては置換される低級アルキル又は場合によっては置換される低級チオアルキルからなる群から独立して選択され；Ｒ_３、Ｒ_４及びＲ_５は、Ｈ、場合によっては置換される低級アルキル、場合によっては置換される低級アリール、場合によっては置換される低級シクロヘテロアルキル及び場合によっては置換される低級へテロアリールからなる群から独立して選択される。）。

特に企図される化合物には、Ａ及びＢがＯであり、ＸがＮＲ^ｂであり、ＹがＣ（Ｏ）又はＣ（Ｓ）であり、及び／又はＺがＯ又はＣＨＲ^ｄであり、Ｖが低級アルキルであり、Ｗがアリール又は低級アルキルであるものが含まれる。最も好ましくは、ｎは１であり、Ｒ_１はＨであり、Ｒ_２は低級アルキルであり、及び／又はＷはアリール又は低級アルキルである。さらに好ましい化合物には、ＡがＯであり、ＢがＯ又はＮＲ^ａであり、ＸがＮＲ^ｂであり、ＹがＣ（Ｏ）又はＣ（Ｓ）であるものが含まれる。

従って、細胞、器官又は身体区画におけるパルミトイルエタノールアミドの低レベルが付随する状態を有する患者を治療する方法は、上記の式Ｉによる化合物を含む医薬組成物を投与する段階を含む。最も典型的には、この状態には、炎症性要素（例えば、関節リウマチ、変形性関節症又は喘息）、疼痛及び／又は神経変性の態様が含まれる。次に、本組成物の投与は、患者において炎症を軽減するのに十分なプロトコール及び投与量下で行われる。従って、異なる側面から見ると、企図される方法は、ＮＡＡＡを阻害するために上記式Ｉによる化合物が使用されることも含む。好ましい態様において、ＮＡＡＡを接触させる段階はインビボで行われ、及び／又は本化合物は、２０μＭ未満のＩＣ_５０でＮＡＡＡを阻害する。

本発明の好ましい実施形態の次の詳細な説明から、本発明の、様々な目的、特性、態様及び長所がより明確になろう。

本発明による代表的な化合物及びそれらの個々のＩＣ_５０値である。 本発明による代表的な化合物及びそれらの個々のＩＣ_５０値である。 本発明による代表的な化合物及びそれらの個々のＩＣ_５０値である。 浸潤性好中球の数（Ａ）、内因性細胞ＰＥＡのレベル（Ｂ）における炎症の影響及び、ＰＥＡにおける炎症の影響の経時変化（Ｃ）を示すグラフである。 ＰＥＡ濃度の関数としての浸潤性好中球の数（Ａ）における外因性ＰＥＡの影響及びＰＰＡＲ−α野生型及びヌル変異体マウスにおける浸潤性好中球の数（Ｂ）を示すグラフである。 ＮＡＡＡの活性部位のコンピュータモデルの詳細図である。 本発明による選択された化合物によるＮＡＡＡ阻害を示すグラフである。 浸潤性好中球の数（Ａ）及び内因性ＰＥＡの量（Ｂ）及びＰＰＡＲ−α野生型野生型及びヌル変異マウス（Ｃ）の浸潤性好中球数における代表的ＮＡＡＡ阻害剤の影響を示すグラフである。 ＮＡＡＡ阻害剤及び対照で又はそれらなしで処理した動物の、選択マーカーで染色した、脊髄損傷後の組織切片の顕微鏡写真を示す。

本発明は、ＮＡＡＡ阻害の、化合物、組成物及び方法、及び特に、細胞、器官又はその他の身体構造（又は全身）における低ＰＥＡレベルが付随する様々な疾患の治療に適切な、化合物、組成物及び方法に関する。最も好ましくは、このような調節の結果、疼痛、炎症及び、異常ＮＡＥレベルが疾患に付随するその他の疾患が治療及び／又は予防される。さらなる企図される態様において、本発明による阻害剤及び方法はまた、ＰＥＡが制御又は調節の役割を果たす機構及び経路の究明にも有用であるとみなされる。

企図される化合物
本明細書中で一般に企図される化合物は、競合的、非競合的、アロステリック又はその他の様式でＮＡＡＡを阻害するのに有効である構造を有する。最も好ましくは、本発明による化合物は、比較的低い濃度でＮＡＡＡを阻害する（例えば５０μＭ以下のＩＣ_５０）。適切な選択肢の中でも、特に好ましい化合物は、式Ｉによる構造を有する：

（式中、
Ａは、Ｏ又はＳであり；Ｂは、Ｏ、Ｓ又はＮＲ^ａであり（Ｒ^ａは、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ハロ、ニトロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルケニルオキシ、シアノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、カルボキシアルキル、アミノ、アシルアミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、Ｎ−アルキル、Ｎ−シクロアルキル、アミノ、チオ、アルキルチオ及びハロアルキル（これらは全て、場合によっては置換され得る。）である。）；ｎは０から３の間の整数であり、このように形成される飽和又は不飽和Ｃ１−３は、場合によっては及び独立した位置で、Ｒ_１及びＲ_２により置換され得、Ｒ_１及びＲ_２は、独立して、上記で定義されるとおりのＲ^ａであり；Ｑは、上記で定義されるとおりのＲ^ａであり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、ＮＲ^ｂ又はＣＨＲ^ｂであり（Ｒ^ｂは、上記で定義されるＲ^ａであるか又は存在しない。）；Ｙは、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｓ）又はＣＨＲ^Ｃであり（Ｒ^Ｃは、上記で定義されるＲ^ａであるか又は存在しない。）；Ｚは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ^ｄ又はＣＨＲ^ｄであり（Ｒ^ｄは、上記で定義されるＲ^ａであるか又は存在しない。）；Ｖは、場合によっては置換される低級アルキル又は場合によっては置換される低級アルキレンであるか又は存在せず；ＷはＨ、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル又はＣ（Ｒ_３Ｒ_４Ｒ_５）であり、これらのそれぞれは場合によっては置換され得、Ｒ_３、Ｒ_４及びＲ_５は、独立して、上記で定義されるＲ^ａであり；Ｙ及びＶは、場合によっては置換される５−、６−又は７−員環を場合によっては形成し得る。）。

特に好ましい態様において、Ａ及びＢはＯであり、及び／又はＸはＮＲ^ｂであり、ＹはＣ（Ｏ）又はＣ（Ｓ）である。さらに又はあるいは、ＺがＯ又はＣＨＲ^ｄであり、Ｖが低級アルキルであり、Ｗがアリール又は低級アルキルであること、及び／又はｎが１であり、Ｒ_１がＨであり、Ｒ_２が低級アルキルであることが企図される。またさらに好ましい化合物には、ＡがＯであり、ＢがＯ又はＮＲ^ａであり、ＸがＮＲ^ｂであり、ＹがＣ（Ｏ）又はＣ（Ｓ）であるものが含まれる。本発明のまたさらに企図される態様において、Ｘ−Ｙは、−ＣＨ＝ＣＨ−又はＣＨ＝ＣＪ（Ｊはハロゲンであり、特にＺ＝−ＣＨＲ^ｄ−であるか又は存在しない。）、を一緒になって形成し得る。Ｙ−Ｚ−Ｖは、Ｚ又はＹを除去することにより、Ｚ及びＶを除去することにより、Ｙ−Ｖとなり得ることがさらに企図される。同様に、Ｚ−Ｖ−Ｗは、Ｖを除去することによりＺ−Ｗとなり得る。またさらに企図される化合物には、Ａ＝Ｃ−Ｂ−結合の全ての（例えば、酸性又はアルカリ性）加水分解産物が含まれる。

さらに企図される化合物には、下記で示されるＩＩ及びＩＩによる化合物が含まれる。

（式中、
Ｂは、Ｏ、Ｓ又はＮＲ^ａであり（Ｒ^ａは、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ハロ、ニトロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルケニルオキシ、シアノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、カルボキシアルキル、アミノ、アシルアミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、Ｎ−アルキル、Ｎ−シクロアルキル、アミノ、チオ、アルキルチオ及びハロアルキル（これらの全ては場合によっては置換され得る。）である。）；ｎは、０から３の間の整数であり、このように形成される飽和又は不飽和Ｃ１−３は、場合によっては及び独立した位置で、Ｒ_１及びＲ_２により置換され得、Ｒ_１及びＲ_２は、独立して、上記で定義されるとおりのＲ^ａであり；Ｑは上記で定義されるとおりのＲ^ａであり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、ＮＲ^ｂ又はＣＨＲ^ｂであり（Ｒ^ｂは、上記で定義されるＲ^ａであるか又は存在しない。）；Ｙは、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｓ）又はＣＨＲ^Ｃであり（Ｒ^Ｃは、上記で定義されるＲ^ａであるか又は存在しない。）；Ｚは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ^ｄ又はＣＨＲ^ｄであり（Ｒ^ｄは上記で定義されるＲ^ａであるか又は存在しない。）；Ｖは、場合によっては置換される低級アルキル又は場合によっては置換される低級アルキレンであるか又は存在せず；Ｗは、Ｈ、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル又はＣ（Ｒ_３Ｒ_４Ｒ_５）であり、これらのそれぞれは場合によっては置換され得、Ｒ_３、Ｒ_４及びＲ_５は、独立して、上記で定義されるとおりのＲ^ａであり；Ｙ及びＶは、場合によっては置換される５−、６−又は７−員環を場合によっては形成し得る。）。

またさらに当然のことながら、立体中心が存在する場合、その全ての異性体及び混合物が企図される。同様に、二重結合が存在する場合、二重結合の各側のラジカルの配向はシス又はトランスであり得る。図１Ａ−１Ｄは、本発明による様々な代表的で好ましい化合物を示す。

本明細書中で使用される場合、「ハロゲン」という用語は、フッ素、臭素、塩素又はヨウ素を指し、これらは通常、別の原子（例えば炭素）と共有結合している。さらに本明細書中で使用される場合、「ヒドロキシル」という用語は、−ＯＨ基を指す。さらに本明細書中で使用される場合、「カルボニル原子」という用語は、３個の原子が共有結合している炭素原子を指し、この３個の原子の１個は二重結合を介して炭素原子に結合している（部分的に非局在化され得る。）。従って、特に企図されるカルボニル原子には、オキソ基、アルデヒド基、カルボキサミド基、カルボキサミジン基及びチオカルボキサミド基中の炭素原子が含まれる。

「アルキル」という用語は、本明細書中で使用される場合、炭素−炭素結合の全てが単結合である、環状、分岐又は直鎖炭化水素を指し、「低級アルキル」という用語は、１から１０個の炭素原子の、環状、分岐又は直鎖アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｉ−ブチル（又は２−メチルプロピル）、シクロプロピルメチル、ｉ−アミル、ｎ−アミル、ヘキシルなど）を指す。「アルキレン」という用語は、本明細書中で使用される場合、対応するアルカンより少ない２個の水素原子を有するアルキルを指す（即ちＣ_ｎＨ_２ｎ）。例えば、適切なアルキレンには、メチレン基、エチレン基、プロピレン基などが含まれる。「シクロアルキル」という用語は、本明細書中で使用される場合、３から１５個の炭素を含有する環状又は多環式アルキル基を指す。多環式基の場合、これらは、遠位の環の１つが芳香族であり得る縮合多環式環であり得る（例えば、インダニル、テトラヒドロナフタレンなど）。「アルカリル」という用語は、本明細書中で使用される場合、アリール部分に共有結合しているアルキ（ａｌｋｙ）を指す。例えば、ベンジル基は、本明細書中で提供される定義下で、アルカリルとみなされる。

同様に、「アルケニル」という用語は、本明細書中で使用される場合、少なくとも１つの炭素−炭素結合が二重結合であるアルキルを指す。従って、「低級アルケニル」という用語には、１から１０個の炭素原子を有する全てのアルケニルが含まれる。「シクロアルケニル」という用語は、本明細書中で使用される場合、３から１５個の炭素及び少なくとも１つの二重結合を含有する環状又は多環式基を指す。同様に、「アルキニル」という用語は、本明細書中で使用される場合、少なくとも１つの炭素−炭素結合が三重結合であるアルキル又はアルケニルを指す。従って、「低級アルキニル」という用語には、１から１０個の炭素原子を有する全てのアルキニルが含まれる。

さらに本明細書中で使用される場合、「アルコキシ」という用語は−ＯＲ基を指し、この場合、Ｒは、低級アルキル、置換低級アルキル、アシル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロヘテロアルキル又は置換シクロヘテロアルキルである。同様に、「アリールオキシ」という用語は−ＯＡｒ基を指し、この場合、Ａｒは、アリール、置換アリール、ヘテロアリール又は置換ヘテロアリール基である。

さらに、「アリール」という用語は、少なくとも１個の芳香環（例えばフェニルもしくはビフェニル）又は、少なくとも１個の環が芳香族である縮合多環式環（例えば、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、ナフチル、アントリル又はフェナントリル）を有する芳香族炭素環基を指す。「ヘテロ原子」という用語は、本明細書中で使用される場合、炭素以外の原子（例えば、Ｓ、Ｏ又はＮ）を指し、場合によっては、例えば水素、ハロゲン、低級アルキル、アルコキシ、低級アルキルチオ、トリフルオロメチル、アミノ、アミド、カルボキシル、ヒドロキシル、アリール、アリールオキシ、複素環、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ニトロ、シアノ、アルキルチオ、チオール、スルファミドなどにより置換され得る。

またさらに、「置換される」という用語は、本明細書中で使用される場合、基又は原子に共有結合する水素原子（又は遊離電子対もしくは原子の二重結合の電子対）が、ヒドロキシル、チオール、アルキルチオール、ハロゲン、アルコキシ、アミノ、アミド、ニトロ、カルボキシル、シクロアルキル、複素環、シクロヘテロアルキル、アシル、カルボキシル、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、アルキル、アルケニル、アルクニル（ａｌｋｎｙｌ）及びシアノを含む、共有結合された非水素置換基で置き換えられることを意味する。

「プロドラッグ」という用語は、本明細書中で使用される場合、企図される化合物の修飾物を指し、この場合、修飾化合物が示す薬理学的活性は低く（修飾化合物と比較した場合）、修飾化合物は、標的細胞（例えばＢ細胞）又は標的器官／解剖学的構造（例えば関節）内で修飾形態に戻る。例えば、企図される化合物のプロドラッグへの変換は、安全な全身投与のために活性薬物の毒性が強すぎる場合又は企図される化合物の消化管又はその他の区画又は細胞による吸収性が乏しい場合、又は企図される化合物がその標的に到達する前に身体によって分解される場合、有用であり得る。従って、当然のことながら、本発明による化合物が多くの方式で修飾され得、特に好ましい修飾には、１以上の薬物動態学的及び／又は薬力学的パラメータを改善するものが含まれる。例えば、血清中でのＡＵＣをより高くするために、１以上の置換基が付加又は置換され得る。

一方、及び特に、溶解性を高めることが所望される場合、親水性基が付加され得る。またさらに、企図される化合物は、加水分解（又は開裂）され得る１以上の結合を含有し、反応産物もまた明確に企図される。対応するプロドラッグ形態への企図される化合物の変換のための代表的な適切なプロトコールは、Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｂ．Ｓｌｏａｎによる「Ｐｒｏｄｒｕｇ（Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：ａ Ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ Ｔｅｘｔｂｏｏｋｓ ａｎｄ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ）」（ＩＳＢＮ：０８２４７８６２９７）及びＢｅｒｎａｒｄ Ｔｅｓｔａ、Ｊｏａｃｈｉｍ Ｍ．Ｍａｙｅｒによる「Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ ａｎｄ Ｐｒｏｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（ＩＳＢＮ：３９０６３９０２５Ｘ）（両者とも本明細書中に参照により組み込まれる。）で見出され得る。さらに、特に、企図される化合物が代謝されるとき（例えば、加水分解される、ヒドロキシル化される、グルクロニド化される（ｇｌｕｃｒｏｎｉｄａｔｅｄ）など）に企図される化合物の活性がより高い場合、当然のことながら、企図される化合物の代謝産物もまた本明細書中に明確に企図される。

特定の目的に依存して（例えば、鎮痛剤、抗炎症剤）、企図される化合物が（インビボで又は製剤処方もしくは投与計画中に）少なくとも１個のその他の医薬的に活性のある成分と組み合わせられ得、特に企図されるその他の成分には、様々な鎮痛剤（例えば、オピオイド、イブプロフェン型薬物、アセトアミノフェン型薬物、アスピリン型薬物など）、様々な免疫抑制剤及び／又は抗炎症剤（例えば、ステロイド及びＮＳＡＩＤＳ）などが含まれることが認識される。第二の医薬的に活性のある成分の濃度は、通常、単独投与のために推奨される濃度又は好ましくはそれ未満であるが、しかし、より高い濃度もまた、本明細書中での使用に適切であると見なされる。

従って、企図される医薬組成物には、特に、企図される化合物（及びさらなる医薬的に活性のある成分）が適切な担体とともに提供されるものが含まれ、この場合、企図される化合物は、好ましくは、生物及び／又は標的器官において、脂肪酸エタノールアミドの異常レベルが付随する疾患の兆候及び症状を軽減するために、より好ましくは治療するために有効な程度まで、脂肪酸エタノールアミド濃度を調節するのに有効な濃度で存在する。異なる側面から見ると、企図される化合物は、疼痛及び／又は炎症を軽減するために有効な量で組成物中に存在する。

従って、特定の使用及び構造に依存して、単回投与単位あたり、１μｇから１０００ｍｇ、より典型的には１０μｇから５００ｍｇ、及び最も典型的には５０μｇから５００ｍｇの量で本発明による化合物が組成物中に存在することが企図される。従って、企図される化合物の好ましい濃度は、インビボ又はインビトロで、通常、０．１ｎＭから５００μＭの間、より典型的には５０ｎＭから４００μＭの間、及び最も典型的には１００ｎＭから２００μＭの間となろう。

さらに、当然のことながら、全ての製剤が本明細書中での使用に適切であるとみなされ、これには特に、経口及び非経口製剤が含まれる。例えば、経口投与の場合、企図される組成物は、錠剤、カプセル、縣濁液又は液体の形態であり得る。本医薬組成物は、好ましくは、活性成分の特定の量を含有する投与単位の形態になされる。このような投与単位の例は、錠剤又はカプセルである。活性成分はまた、組成物（例えば、食塩水、デキストロース又は水が適切な担体として使用され得る。）として注射により投与され得る。特に好ましい態様において、製剤が、局所投与、エアロゾルを介した投与及び髄腔内投与に対して適切であることが企図される。結果として、特に適切な製剤は、局所噴霧又は滴下投与又はチンキ剤としての適用のための滅菌水溶液である。あるいは、適切な局所製剤には、クリーム、軟膏、フォーム、ローション、エマルジョンなどが含まれる。さらに、化合物が髄腔内投与用に処方される場合（例えば脊髄損傷の治療において）、注射用の溶液、縣濁液又はエマルジョンとして本化合物が調製されることが好ましい。またさらに企図される製剤において、企図される化合物は、エアロゾル送達用に処方され得る（例えば、微粉化、分散性担体上への被覆、噴霧可能（ａｔｏｍｉｚａｂｌｅ）溶媒中での溶解など）。

当然のことながら、特定の製剤及び担体の選択は、少なくとも部分的には、具体的な使用及び化合物のタイプに依存する。当技術分野で公知の薬物処方の多くの方式があり、それらの全てが本明細書中での使用に適切とみなされる（例えば、Ｍａｒｋ Ｇｉｂｓｏｎによる「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｆｒｏｍ Ｃａｎｄｉｄａｔｅ Ｄｒｕｇ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍ」；Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ、ＩＳＢＮ：１５７４９１１２０１；又はＲｏｂｅｒｔ Ｏ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｄａｖｉｄ Ｒ．Ｔａｆｔ及びＪａｓｏｎ Ｔ．ＭｃＣｏｎｖｉｌｌｅによる「Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄｅｓｉｇｎ ｔｏ Ｏｐｔｉｍｉｚｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ」；Ｉｎｆｏｒｍａ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ；ＩＳＢＮ：１４２００４３８７０）。

投与される治療的に活性のある化合物の量及び、本発明の化合物及び／又は組成物で疾患状態を治療するための投与計画は、対象の年齢、体重、性別及び医学的状態、疾患の重症度、投与の経路及び頻度及び使用される特定の化合物を含む様々な因子に依存し、従って、幅広く変動し得る。しかし、特に適切な量は上記で提供されており、従って、約０．００１（又はそれ未満）から１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０１から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の間、及び最も好ましくは約０．１から２０ｍｇ／ｋｇ体重の１日投与量が可能となり得る。通常、１日用量は、１日１回から４回の投薬で投与され得る。

治療又は予防目的のために、企図される化合物は、通常、指示される投与経路に適切な１以上の賦形剤と組み合わせられる。経口投与される場合、本化合物は、ラクトース、スクロース、デンプン粉末、アルカン酸のセルロースエステル、セルロースアルキルエステル、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸及び硫酸のナトリウム及びカルシウム塩、ゼラチン、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン及び／又はポリビニルアルコールと混合され得、次いで、都合の良い投与のために錠剤化又はカプセル封入され得る。このようなカプセル又は錠剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース中の活性化合物の分散液中で提供され得る場合、制御放出製剤を含有し得る。非経口投与のための製剤は、水性又は非水性の等張の滅菌注射溶液又は縣濁液の形態であり得る。これらの溶液及び縣濁液は、経口投与のための製剤中での使用について言及される１以上の担体又は希釈剤を有する滅菌粉末又は顆粒から調製され得る。本化合物は、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、トウモロコシ油、綿実油、ピーナツ油、ゴマ油、ベンジルアルコール、塩化ナトリウム及び／又は様々な緩衝液中で溶解され得る。その他の賦形剤及び投与方式は、医薬の技術分野で幅広くよく知られている。

企図される使用
ＮＡＥの異常レベル（例えば、対応する試験部位での健常者における平均ＰＥＡレベルに対して少なくとも１０％の逸脱）が付随する何らかの状態及び／又は疾患に影響を与えるために、又は、特定の目的のために、このような化合物の正常レベルの調節が所望される場合、本発明による化合物及び組成物が使用され得ることが通常企図される。従って、及び異なる側面から見ると、企図される化合物は、パルミトイルエタノールアミドレベルの上昇が治療上所望される、疾患又は状態の治療のために使用され得る。従って、特に企図される状態及び疾患には、ＮＡＥの変化に感受性のあるものが含まれる。例えば、企図される化合物及び組成物は、疼痛、炎症、癌及び代謝性疾患の予防及び／又は治療において有用であり得る。さらに企図される疾患には、神経系の疾患、特に神経の炎症、アルツハイマー病、喘息、皮膚炎、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、クローン病及び食欲障害に関するものが含まれる。

従って、企図される化合物及び組成物で治療しようとする状態及び疾患には、特に、疼痛、炎症及び神経変性疾患が含まれる。いくつかの例の中でも特に、このような疾患には、神経因性疼痛、三叉神経痛、ヘルペス後神経痛、糖尿病性神経障害、癌性疼痛、幻肢痛、複合性局所疼痛症候群及び線維筋痛；関節リウマチ、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、腱炎、乾癬、ファーバー病（Ｆａｂｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、鼻炎、皮膚アレルギー、喘息及び、多発性硬化症及びその他の脱髄性疾患などの炎症性要素を伴う自己免疫疾患；アルツハイマー病、外傷性脳損傷が含まれ得る。異常なＮＡＥレベルを特徴とし、企図される化合物が有用であり得るその他の状態及び疾患には、様々な代謝性疾患、食欲制御及び肥満が含まれる。

またさらに企図される使用には、ＮＡＡＡの阻害に関して化合物の構造−機能関係を調べるためにインビトロ及びインビボでの阻害実験に対して本発明による化合物及び組成物が使用されるものが含まれる。あるいは又はさらに、これもまた当然のことながら、企図される化合物及び組成物は、ＮＡＡＡを阻害し及び／又はＰＰＡＲ−αがシグナル伝達又はその他のプロセシングにおけるメンバーである経路でのシグナル伝達を活性化もしくは調節する様々な方法において使用され得る。

代表的な企図される化合物の合成
光延反応において環状化させたＮ−Ｂｏｃ−Ｌ−セリン（１）からＵＲＢ７８３を調製して２を得て、それを脱保護及び塩化処理（ｓａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）することによってトシレート３を得た。後者の化合物を３−フェニルプロピオニルクロリドと反応させて、ＵＲＢ７８３を得た。次に、３と４−ビフェニルカルボニルクロリド（塩化オキサリルで４−フェニル安息香酸を処理することにより得られた。）との間の反応の結果、ＵＲＢ８９４を得た。

（Ｓ）−（２−オキソオキセタン−３−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２）：Ｎ_２下で−５０℃で維持されている乾燥ＣＨ_３ＣＮ中の乾燥ＰＰｈ_３（Ｐ_２Ｏ_５の存在下で真空下で７２時間）（５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液（３１ｍＬ）に、ジメチルアゾジカルボキシレート（５ｍｍｏｌ）と、２０分後にＣＨ_３ＣＮ中の１（４．４７ｍｍｏｌ）の溶液（１０．４ｍＬ）と、を滴下添加した。混合物を−５０／−３５℃で１．５時間撹拌し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シクロヘキサン／ＥｔＯＡＣ ８：２から６：４）による残渣の精製により粗製物２を得て、これを最後に洗浄し、粉砕し、白色固体を得た。Ｍｐ １２０−１２２℃（Ｅｔ_２Ｏ）。［α］_Ｄ ^２０＝−２７°（ｃ０．１、ＣＨ_３ＣＮ）。^１Ｈ ＮＭＲは文献に従う（Ａｒｎｏｌｄら、１９８５）。

（Ｓ）−２−オキソオキセタン−３−イル−アンモニウム−４−トルエンスルホネート（３）：Ｎ_２下で０℃で維持される２（１．３４ｍｍｏｌ）及び無水ｐ−トルエンスルホン酸（Ｐ_２Ｏ_５存在下、真空下で７２時間）（１．４３ｍｍｏｌ）の撹拌混合物に、１０分間にわたりトリフルオロ酢酸（３ｍＬ）を滴下添加した。０℃で１５分間、撹拌しながら溶液を反応させ、室温にして、３０℃以下の温度で濃縮した。油性の残渣を真空化で１時間維持し、得られた白色固体を粉砕し、乾燥ジエチルエーテルで洗浄し、次いで真空下で２４時間維持した。回収率８１％。Ｍｐ及び^１Ｈ ＮＭＲは文献に従う（Ａｒｎｏｌｄら、１９８８）。

（Ｓ）−Ｎ−（２−オキソオキセタン−３−イル）−３−フェニルプロピオンアミド（ＵＲＢ７８３）：Ｎ_２下で０℃で維持されている乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（２ｍＬ）中の３（０．４ｍｍｏｌ）の撹拌混合物に、Ｅｔ_３Ｎ（１．５９ｍｍｏｌ）及び３−フェニルプロピオニルクロリド（０．６ｍｍｏｌ）を滴下添加した。０℃で３０分間及び室温で２時間混合物を反応させ、次いで濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シクロヘキサン／ＥｔＯＡＣ１：１から３：７）による残渣の精製及び再結晶化により、白色固体としてＵＲＢ７８３を得た。回収率６０％。Ｍｐ １０４−１０６℃（アセトン／石油エーテル）。［α］_Ｄ ^２０＝−１３°（ｃ ０．５，ＭｅＯＨ）。ＭＳ（ＥＩ）：ｍ／ｚ２１９（Ｍ^＋）、９１（１００）。ＩＲ（Ｎｕｊｏｌ）３３３３、１８３２、１６２５、１５４１ｃｍ^−１；^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ２．５７（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、２．９９（ｔ，２Ｈ）、４．３４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５Ｈｚ）、４．４３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ_１＝５Ｈｚ，Ｊ_２＝６．５）、５．１４（ｍ，１Ｈ）、５．９６（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、７．１８−７．３６（ｍ，５Ｈ）ｐｐｍ。^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ３１．２（ＣＨ_２）、３７．７（ＣＨ_２）、５８．４（ＣＨ）、６６．１（ＣＨ_２）、１２６．５（ＣＨ）、１２８．３（２ＣＨ）、１２８．７（２ＣＨ）、１４０．２、１６８．４（Ｃ＝０）、１７２．５（Ｃ＝０）ｐｐｍ。

（Ｓ）−Ｎ−（２−オキソオキセタン−３−イル）ビフェニル−４−カルボキサミド（ＵＲＢ８９４）：Ｎ_２下で０℃で維持されている乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（５．３ｍＬ）及び乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）中のビフェニル−４−カルボン酸（２．１ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化オキサリル（０．３ｍＬ、３．１３ｍｍｏｌ）を添加した。０℃で２０分間及び室温で２時間混合物を反応させ、次いで濃縮し、淡黄色の固体として粗製ビフェニル−４−カルボニルクロリドを得た。この試料の量（２ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（２０ｍＬ）中で溶解させ、Ｎ_２下で０℃で３（１．３ｍｍｏｌ）、Ｅｔ_３Ｎ（１．１４３ｍＬ、８．２ｍｍｏｌ）及び乾燥ＴＨＦ（３ｍＬ）を混合することにより得られた縣濁液に、得られた溶液を０℃で滴下添加した。その後の混合物を０℃で３０分間及び室温で３時間反応させ、次に蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィー（シクロヘキサン／ＥｔＯＡＣ １：１）により精製し、再結晶化することによって、アイボリー色の固体として純粋なＵＲＢ８９４を得た。回収率４６％。Ｍｐ ２１８−２２０℃（アセトン／石油エーテル；密封キャピラリー管；変色及び質量低下を伴う試料の分解は、１４６℃から始まることが分かった。）；［α］_Ｄ ^２０＝−２０°（ｃ ０．５５，ＣＨ_３ＣＮ）。ＭＳ（ＥＩ）：ｍ／ｚ２６７（Ｍ^＋）、２２２、１８１、１６７（１００）。ＩＲ（Ｎｕｊｏｌ）３２７０、１８２７、１６４１、１５４０ｃｍ^−１；^１Ｈ ＮＭＲ（ｄ_６−アセトン）δ４．５３−４．６５（ｍ，２Ｈ）、４．５０−４．５９（ｍ，１Ｈ）、７．３８−７．５５（ｍ，３Ｈ）、７．７０−７．８４（ｍ，４Ｈ）、８．００−８．０７（ｍ，２Ｈ）、８．６８（ｂｒ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ）ｐｐｍ。^１３Ｃ ＮＭＲ（ｄ_６−アセトン）：δ５８．８、６５．１、１２６．９、１２７．０、１２８．０、１２８．１、１２９．０、１３１．９、１３９．７、１４４．４、１６６．４、１６９．２ｐｐｍ。

発明者及びその他による先行研究から、炎症及び神経因性疼痛モデルの両方において核受容体ペルオキシソーム増殖活性化受容体α（ＰＰＡＲ−α）を活性化することによってＰＥＡがスペクトルが広い鎮痛効果を急速に生じさせることが示されている。最近の研究から、炎症組織（例えば関節リウマチ及び変形性関節症患者からの滑液）においてＰＥＡレベルが低下することが示されており、このことから、この生物学的活性脂質が炎症反応の調節に関与し得及び／又は慢性炎症状態に寄与し得ることが示唆される。

この可能性を支持するものとして、発明者らは、炎症中にＰＥＡレベルを回復させることにより炎症が強く緩和されることを見出した。これらの結果から、炎症組織において正常ＰＥＡレベルを回復するためのＰＥＡ分解の阻害により炎症及び疼痛を軽減するための新規の機構ストラテジーが示唆される。本願において、発明者らは、ＰＥＡを分解することに関与する酵素であるＮ−アシルエタノールアミン−加水分解酸性アミダーゼ（ＮＡＡＡ）の強力で選択的な阻害剤のクラスを開発した。

炎症は内因性ＰＥＡのレベルを低下させる。

炎症プロセスに対する内因性ＰＥＡの寄与は依然として不明な点が多い。しかし、いくつかの証拠から、内因性ＰＥＡが炎症に関与し得ることが示唆される。発明者らは、以前、炎症性ホルボールエステル、１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）が皮膚の炎症後に皮膚ＰＥＡレベルを低下させることを示した。これらの知見から、炎症中のＰＥＡレベル低下により、炎症プロセスが進行し得る可能性が出てきた。この見解をさらに調べるために、発明者らは、マウスでのＰＥＡレベルにおけるカラギーナン誘導性炎症の影響を評価した。ビヒクル（食塩水中の１０％ＤＭＳＯ）又はカラギーナン（１％）を注入したポリエチレンスポンジをマウスの背面皮膚下に外科的に移植した。３日後、マウスを屠殺し、スポンジを取り出し、炎症性細胞浸潤及び細胞性ＰＥＡ含量を分析した。カラギーナン処理動物において、浸潤細胞の数（主に好中球）は、図２から理解され得るように、およそ３倍増加した。ここで、３日間にわたるＳｗｉｓｓマウスの背面皮膚下でのビヒクル（ｖ）又はカラギーナン（ｃ）浸漬スポンジの外科的移植により、（Ａ）浸潤性好中球の数が増加し、（Ｂ）内因性細胞ＰＥＡのレベルが低下した。（Ｃ）ＰＥＡレベルにおけるビヒクル（白印）又はカラギーン（黒印）の影響の経時変化。^＊＊Ｐ＜０．０１又は^＊＊＊Ｐ＜０．００１対Ｖ、ｔ検定又はＡＮＯＶＡ、続いて必要に応じてダネット事後検定（ｎ＝６）。

さらなる研究から、炎症組織におけるＰＥＡの低下が少なくとも部分的にはＮ−アシルホスファチジル−エタノールアミン特異的ホスホリパーゼＤ（ＮＡＰＥ−ＰＬＤ）の白血球発現の抑制によるものであったことが明らかになった（データは示さず。）。代償性酵素経路を通じてＰＥＡを産生するＮＡＰＥ−ＰＬＤ−欠損マウスは、炎症負荷に反応してＰＥＡレベルを低下させることができず、このような負荷に対して反応が鈍い。Ｎ−アシルエタノールアミン−加水分解酸性アミダーゼ（ＮＡＡＡ）の阻害剤により、ＰＥＡレベルの低下が阻止され、炎症刺激により誘導される反応を鈍くする。この物質の抗炎症効果は、外因性ＰＥＡにより模倣され、ＰＰＡＲ−α欠失により無効になる。従って、注目すべきは、この結果から、白血球におけるＰＰＡＲ−αのＰＥＡ活性化が炎症の進行を妨げるか又は阻害する初期停止シグナルとして働くことが強く示される、ということである。

外因性ＰＥＡでのＰＥＡレベルの回復により炎症が軽減する。

炎症における内因性ＰＥＡの役割の特定の第一段階として、発明者らは、炎症反応におけるＰＥＡの局所適用の効果を調べた。ビヒクル又はカラギーナン（１％）及びビヒクル（食塩水中の１０％ＤＭＳＯ）又はＰＥＡの様々な用量（０．１−５０μｇ）の何れかが注入されたポリエチレンスポンジをマウスの背面皮膚下に外科的に移植した。３日後、マウスを屠殺し、スポンジを取り出し、細胞浸潤について分析した。図３で示されるように、ＰＥＡ用量依存的に浸潤細胞数が減少し、野生型マウスにおいて浮腫が軽減したが（データは示さず。）、ＰＰＡＲ−αヌル動物においては効果がなかった。ここで、パネル（Ａ−Ｂ）は、ビヒクル、カラギーナン（１％）又はＰＥＡが注入され、（Ａ）スイスマウス又は（Ｂ）野生型Ｃ５７ＢＬ６マウス（＋／＋）又はＰＰＡＲ−α／−マウスの背面皮膚下に３日間にわたり移植されたポリエチレンスポンジ（サイズ）への浸潤炎症細胞数としてスコア化した、Ｓｗｉｓｓマウスにおける、ビヒクル（白いバー）、カラギーナン（色付きのバー）又はＰＥＡ（０．１−５０μｇ）、黒いバー；ＰＥＡ（ＰＰＡＲ−α−／−マウスにおける５０μｇ）の効果を示す。^＊＊Ｐ＜０．０１又は^＊＊＊Ｐ＜０．００１対Ｖ、＃＃Ｐ＜０．０１対カラギーナン対照。ＡＮＯＶＡ、続いて、必要に応じてターキー又はダネットの事後検定（ｎ＝６）。従って、当然のことながら、末梢の炎症には、浸潤細胞におけるＰＥＡ合成の低下が付随し、外因性ＰＥＡ投与によるＰＥＡレベルの回復により炎症反応が軽減する。

ＮＡＡＡ阻害剤の設計
ＮＡＡＡは、コロイルグリシンヒドロラーゼファミリーに属し、これは、Ｎｔｎ（Ｎ−末端求核試薬）アミノヒドロラーゼスーパーファミリーのサブグループである。これらの酵素は、直鎖状アミドの切断に特化しており、それらのアミノ酸配列の第一の位置にシステイン、セリン又はスレオニン（触媒的攻撃に関与する求核試薬として作用する。）を有する。ＮＡＡＡの場合、求核残基はおそらくＣｙｓ１３１であると思われる。実験的証拠から、ネイティブＮＡＡＡタンパク質が、その他のＮｔｎヒドロラーゼで一般に観察される事象である、最初の１３０残基のタンパク質分解性切断を含む成熟プロセスを受け、２３２アミノ酸のタンパク質（Ｃｙｓ１３１がＮ−末端となる。）がもたらされることが示唆される。

最近、Ｎｔｎファミリーのメンバーである共役胆汁酸ヒドロラーゼ（ＣＢＡＨ）の構造をＸ線結晶学により解像した。ＮＡＡＡ及びＣＢＡＨのアミノ酸配列のアラインメントから、２つの酵素の結合部位の間の配列ホモロジーの程度が高いことが明らかになった。テンプレートとしてＣＢＡＨの座標を用いて、比較モデリングによりＮＡＡＡモデルを確立した。図４で示されるようなこのモデルに従い、ＰＥＡのカルボニル酸素と、アスパラギン２９２の側鎖アミド及びアスパラギン２０９の骨格アミドにより一部形成される、酵素オキシアニオンホールとの間の静電気的相互作用により、ＰＥＡにおける触媒性求核システイン１３１の攻撃を通じて形成される四面中間体が安定化される。さらに、その他の残基の中でも、チロシン１５１により裏打ちされる疎水性ポケットは、ＰＥＡの柔軟なアシル鎖を収容し得る。

触媒側を裏打ちするこれらのアミノ酸の部位特異的突然変異誘発によって、これらの予想を確認した。例えば、Ｃｙｓ１３１、Ｓｅｒ１３３、Ａｓｐ１５０、Ｔｙｒ１５１又はＡｓｎ２９２のアラニンでの置換によって、インビトロでのＮＡＡＡ活性が完全に妨げられ、一方、外側の残基の突然変異ではこのような影響がなかった（データは示さず。）。これらの結果に基づき、発明者らは、（活性システイン残基を標的とするための）ラクトン頭部基に連結される（ＰＥＡの脂肪族脂肪酸部分を模倣するための）疎水性骨格を含んだ第一の一連のＮＡＡＡ阻害剤を設計した。次に、発明者らは、多くの化合物を合成して試験し、これらのうち２−３種類がマイクロモル以下の強度で組み換えＮＡＡＡを阻害した（図１Ａ−Ｃ、図５）。２種類の最も強力な化合物（ＵＲＢ７８３及びＵＲＢ８９４）は、それぞれ４２０±２０ｎＭ及び１１５±１３ｎＭのＩＣ_５０値でＮＡＡＡを阻害した（図１Ａ−Ｃ、図５）。

ＮＡＡＡ阻害によりＰＥＡレベルが回復し、炎症が軽減する。

発明者らは、マウスカラギーナンモデルを用いて、炎症におけるＮＡＡＡ阻害剤ＵＲＢ７８３の効果を評価した。既に示されているように、カラギーナン曝露刺激された細胞浸潤（図６Ａ）により浮腫が生じ（データは示さず。）、内因性ＰＥＡレベルが顕著に低下した（図６Ｂ）。スポンジに化合物ＵＲＢ７８３を含有させることによりＰＥＡが基底レベルに回復し（図６Ｂ）、浸潤細胞の数（図６Ａ）及び滲出物体積（データは示さず。）の両方が顕著に減少した。明白に、選択的ＦＡＡＨ阻害剤ＵＲＢ５９７は、このモデルにおいて抗炎症効果がなく、このことから、ＦＡＡＨが炎症の際にＰＥＡの制御に関与しないことが示唆される。化合物ＵＲＢ７８３の効果は、これらの効果がＰＰＡＲ−αヌルマウスにおいては存在せず（図６Ｃ）、ＮＡＡＡを阻害しないＵＲＢ７８３のキラル類似体である化合物ＵＲＢ８１８により再生されないので（データは示さず。）、内在性ＰＥＡによるＰＰＡＲ−αの活性化を通じて起こると思われる。

とりわけ、パネル（Ａ、Ｃ）は、炎症細胞数を示し、一方パネル（Ｂ）は、（Ａ−Ｂ）Ｓｗｉｓｓマウス又は（Ｃ）野生型Ｃ５７ＢＬ６マウス（＋／＋）又はＰＰＡＲ−α−ノックアウトマウス（−／−）の背面皮膚下への外科的移植から３日後にマウスから回収されたスポンジ中のＰＥＡレベルを示す。指示されるように、ビヒクル（水１００μＬ：ＤＭＳＯ（９：１）、Ｖ、白いバー）、カラギーナン（１％、黒いバー）、ＵＲＢ５９７（３０μｇ）及びＵＲＢ７８３（３０μｇ）の何れかをポリエチレンスポンジ（１ｃｍ^３）に注入した。^＊＊Ｐ＜０．０１又は^＊＊＊Ｐ＜０．００１対Ｖ、＃＃Ｐ＜０．０１対カラギーナン対照。ＡＮＯＶＡ、続いて、必要に応じて、ターキー又はダネットの事後検定（ｎ＝５−７）。

ＮＡＡＡアッセイ
基質として、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、３ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び５０ｍＭヘプタデセノイルエタノールアミドを含有するリン酸水素ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ５．０）０．２ｍＬ中で３７℃で３０分間、組み換えＮＡＡＡ又はネイティブラット肺ＮＡＡＡを温置した。ヘプタデカノン酸１ｎｍｏｌ（ＨＤＡ、ＮｕＣｈｅｋ Ｐｒｅｐ、Ｅｌｙｓｉａｎ、ＭＮ）を含有する０．２ｍＬ冷メタノールの添加により反応を終了させた。ＬＣ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー／質量分析）により試料を分析した。９５％メタノール及び５％水（両方とも、０．２５％酢酸及び５ｍＭ酢酸アンモニウムを含有する。）の溶媒混合液を用い、定組成で２．２ｍＬ／分で１分間、ＸＤＢ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｃ１８カラムにおいて、ヘプタデカノイン酸を溶出した。カラム温度は５０℃であった。ＥＳＩはネガティブモードであり、キャピラリー電圧は４ｋＶであり、フラグメンター電圧は１００Ｖであった。１３Ｌ／分の流速及び３５０℃の温度で、乾燥ガスとしてＮ２を使用した。ネブライザー圧は６０ｐｓｉに設定した。内部標準としてヘプタデカノイン酸を用いて［Ｍ−Ｈ］−をＳＩＭモードで監視した。市販のヘプタデカノイン酸を用いて較正曲線を作成した（Ｎｕ−Ｃｈｅｋ Ｐｒｅｐ、ｍ／ｚ＝２６７）。

脊髄損傷
脊髄損傷（ＳＣＩ）モデルにおいて、４レベルのＴ５−Ｔ８椎弓切除を介して曝露された脊髄の切片の硬膜外圧迫により、ＳＣＩから２４時間後にマウスから回収した脊髄組織の白質−灰白質の、炎症細胞においてならびにシュワン細胞の核において、ｉＮＯＳ発現が実質的に上昇した。偽手術マウスから得られた脊髄ではｉＮＯＳ染色は検出されなかった。ＳＣＩ後のＮＡＡＡ阻害剤ＵＲＢ７８３の投与により、ｉＮＯＳならびに、プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）、ニトロチロシン、Ｆａｓ−リガンド、Ｂａｘ、Ｂｃｌ−２及び末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ−介在ＵＴＰ末端標識（ＴＵＮＥＬ）を含む、このモデルにより誘導される炎症及び細胞アポトーシスのその他のマーカーの発現が顕著に低下した。代表的な実験プロトコールは下記に記載する。

マウスを無作為に４群に分けた（ｎ＝４０動物／群）。偽手術動物には、動脈瘤クリップを適用しなかったことを除き、外科手術手順を行い、外科手術手順から１から６時間後に脊髄Ｔ５−Ｔ８レベルで局所的にビヒクル（食塩水）又は３（３０μｇ／マウス）により処理した。残りのマウスに対して、ＳＣＩ（下記に記載）を行い、ＳＣＩから１から６時間後に脊髄Ｔ５−Ｔ８レベルで局所的にビヒクル（食塩水）又は３（３０μｇ／マウス）により処理した。下記に記載のようなパラメータの評価用の試料を回収するためにＳＣＩから２４時間後に各群からのマウスを屠殺した。

抱水クロラールを用いてマウスに麻酔をかけた（４００ｍｇ／ｋｇ体重）。発明者らは、Ｒｉｖｌｉｎ及びＴａｔｏｒ（Ｒｉｖｌｉｎ及びＴａｔｏｒ、１９７８）により記載されるクリップ圧迫モデルを使用し、４レベルＴ５−Ｔ８椎弓切除を介して曝露されたＳＣの区域の硬膜外圧迫（Ｔ５の突出した棘突起を手術ガイドとして使用した。）によりＳＣＩを生じさせた。適時の回収を促進し、生化学的試験用に十分なＳＣ組織を得るために、６レベルの椎弓切除を選択した。両方向性の動脈瘤クリップアプリケーターを用いて、２４ｇの閉じ力（ｃｌｏｓｉｎｇ ｆｏｒｃｅ）により動脈瘤クリップをＴ５−Ｔ８レベルで硬膜外に適用した。次に、このクリップをクリップアプリケーターにより急速に緩め、これにより、ＳＣを圧迫した。損傷群において、１分間脊髄を圧迫した。手術後、手術中に喪失した血液体積を置き換えるために食塩水１．０ｍＬを皮下投与した。麻酔からの回復中、マウスを温かい加熱パッド上に置き、温かいタオルを被せた。１０日間の生存期間にわたり、２７℃に温度調節された部屋にこのマウスを１匹ずつ収容した。餌及び水はマウスが自由に摂取できるようにした。この期間中、マウスが正常の膀胱機能を回復できるまで、１日２回、この動物の膀胱を手で空にした。偽損傷動物には椎弓切除のみ行った。

ＰＡＲ、ニトロチロシン、ＦＡＳ−リガンド、Ｂａｘ、Ｂｃｌ−２及びｉＮＯＳの免疫組織化学的局在。ＳＣＩから２４時間後、ＳＣＩ中に生成される「ペルオキシ亜硝酸形成」及び／又はその他の窒素誘導体の局在を調べるために、脊髄切片において免疫組織化学分析により、ニトロソ化ストレスの特異的マーカーであるニトロチロシンを測定した。ＳＣＩから２４時間後に、１０％（ｗ／ｖ）ＰＢＳ−緩衝ホルムアルデヒド中で組織を固定し、パラフィン包埋組織から８ｍｍ切片を調製した。脱パラフィン処理後、６０％（ｖ／ｖ）メタノール中の０．３％（ｖ／ｖ）過酸化水素で３０分間、内因性ペルオキシダーゼを不活性化した。ＰＢＳ中の０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で２０分間、切片を透過処理した。ＰＢＳ中の２％（ｖ／ｖ）正常ヤギ血清で２０分間、切片を温置することによって、非特異的吸着を最小化した。それぞれビオチン及びアビジン（ＤＢＡ）で１５分間連続的に温置することにより内因性ビオチン又はアビジン結合部位を遮断した。抗−ＰＡＲ（Ａｌｅｘｉｓ；ＰＢＳ中１：５００、ｖ／ｖ）、抗−ｉＮＯＳ抗体（ＰＢＳ中１：５００、ｖ／ｖ）、抗−ニトロチロシンウサギポリクローナル抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ、ＰＢＳ中１：５００、ｖ／ｖ）とともに、抗−ＦＡＳ−リガンド抗体（Ａｂｃａｍ、ＰＢＳ中１：５００、ｖ／ｖ）、抗−Ｂａｘ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＰＢＳ中１：５００、ｖ／ｖ）とともに又は抗−Ｂｃｌ−２ポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＰＢＳ中１：５００、ｖ／ｖ）とともに、切片を一晩温置した。ＰＢＳで切片を洗浄し、二次抗体とともに温置した。ビオチン結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ及びアビジン−ビオチンペルオキシダーゼ複合体（ＤＢＡ）を用いて特異的標識を検出した。ニトロチロシン、ＰＡＲ、ｉＮＯＳ、Ｂａｘ及びＢｃｌ−２に対する結合特異性を検証するために、一次抗体のみ（二次なし）又は二次抗体のみ（一次なし）とともにいくつかの切片を温置した。これらの状況において、この切片において陽性染色は見られず、このことから、行われた全ての実験において免疫反応が陽性であったことが示された。

製造者の説明書に従い（Ａｐｏｔａｇ、ＨＲＰキットＤＢＡ、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）、ＴＵＮＥＬ検出キットを使用することによって、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ−介在ＵＴＰ末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイを行った。簡潔に述べると、１５ｍｃｇ／ｍＬプロテイナーゼＫとともに室温で１５分間、切片を温置し、次いでＰＢＳで洗浄した。３％Ｈ_２Ｏ_２により室温で５分間、内因性ペルオキシダーゼを不活性化し、次いでＰＢＳで洗浄した。ＴｄＴ緩衝液中のデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ及びビオチニル化ｄＵＴＰを含有する末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）緩衝液中に切片を浸漬し、３７℃で９０分間、湿潤雰囲気中で温置し、次いでＰＢＳで洗浄した。抗ホースララディッシュペルオキシダーゼ結合抗体とともに室温で３０分間、切片を温置し、ジアミノベンジジンによりシグナルを視覚化した。各コード化スライドに対して５から１０視野において高倍率視野あたりのＴＵＮＥＬ陽性細胞の数を数えた。

光学顕微鏡。外傷後２４時間の時点で脊髄組織を採取した。損傷を含有する組織セグメント（損傷の各側において１ｃｍ）をパラフィン包埋し、５μｍの厚さの切片になるように切り出した。組織切片（厚さ５μｍ）をキシレンにより脱パラフィン処理し、ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）、メチルグリーンピロニン染色により染色し（同時にＤＮＡ及びＲＮＡに対して使用される。）、光学顕微鏡を用いて調べた（Ｄｉａｌｕｘ ２２ Ｌｅｉｔｚ）。

熟練した組織病理学者が各脊髄のセグメントを評価した。

損傷を受けたニューロンを数え、灰白質の組織病理学的変化を６ポイントのスケールでスコア化した（Ｓｉｒｉｎら、２００２）：０、損傷は観察されず、１、灰白質が１から５個の好酸性ニューロンを含有；２、灰白質が５から１０個の好酸性ニューロンを含有；３、灰白質が１０個を超える好酸性ニューロンを含有；４、小さな梗塞（灰白質領域の３分の１未満）；５、中度の梗塞；（灰白質領域の３分の１から２分の１）；６、大きな梗塞（灰白質領域の半分超）。個々のマウスに対する最終スコアを得るために、各脊髄からの切片全てからのスコアの平均を算出した。盲検方式で全ての組織学的実験を行った。図７は、上述の実験からの典型的な結果を示す。

従って、Ｎ−アシルエタノールアミン−加水分解酸性アミダーゼを阻害する具体的な実施形態及び適用を開示した。しかし、当業者にとって当然のことながら、本明細書中の本発明の概念から逸脱することなく、既に記載されたもの以外に、多くのさらなる修飾が可能である。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲の精神を除き、限定されるものではない。さらに、明細書及び特許請求の範囲の両方を解釈することにおいて、全ての用語は、内容に合致する最も広く可能な程度に解釈されるものである。特に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、非排他的に、要素、成分又は段階に言及するものとして解釈されるべきであり、つまり、言及される要素、成分又は段階は、明確には言及されていないその他の要素、成分又は段階とともに存在し得るか又は使用され得るか又は組み合わせられ得る。本明細書中で考察される全ての付帯的な要素は、それらの全体において参照により組み込まれる。組み込まれる参考文献における用語の定義又は使用は、本明細書中で提供されるその用語の定義と合致しないか又は相容れない場合、本明細書中で提供されるその用語の定義が適用され、参考文献におけるその用語の定義は適用されない。

Claims (18)

1. 式Ｉによる化合物及び医薬的に許容可能な担体を含む、パルミトイルエタノールアミドの低レベルを付随するか又はパルミトイルエタノールアミドレベルの上昇が治療上所望される状態の治療のための医薬組成物：
   

   

   （式中、
   Ａは、Ｏ又はＳであり；Ｂは、Ｏ、Ｓ又はＮＲ^ａであり；Ｒ_１及びＲ_２は、独立に、Ｈ、ハロゲン又は場合によっては置換される低級アルキルであり；ｎは、０から３の間の整数であり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、ＮＲ^ｂ、ＣＨＲ^ｂであるか又は存在せず；Ｙは、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｓ）又はＣＨＲ^Ｃであり；Ｚは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ^ｄ又はＣＨＲ^ｄであり；Ｖは、場合によっては置換される低級アルキル又は場合によっては置換される低級アルケニルであり；Ｗは、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル又はＣ（Ｒ_３Ｒ_４Ｒ_５）であり；Ｙ及びＶは、場合によっては５−又は６員環を形成し得；
   Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ、Ｒ^Ｃ及びＲ^ｄは、Ｈ、場合によっては置換される低級アルキル又は場合によっては置換される低級チオアルキルからなる群から独立して選択され；
   Ｒ_３、Ｒ_４及びＲ_５は、独立して、Ｈ、場合によっては置換される低級アルキル、場合によっては置換される低級アリール、場合によっては置換される低級シクロヘテロアルキル又は場合によっては置換される低級へテロアリールである。）。
2. Ａ及びＢがＯである、請求項１に記載の医薬組成物。
3. ＸがＮＲ^ｂであり、ＹがＣ（Ｏ）又はＣ（Ｓ）である、請求項１に記載の医薬組成物。
4. ＺがＯ又はＣＨＲ^ｄであり、Ｖが低級アルキルであり、Ｗがアリール又は低級アルキルである、請求項２又は請求項３に記載の医薬組成物。
5. ｎが１であり、Ｒ_１がＨであり、Ｒ_２が低級アルキルである、請求項２又は請求項３に記載の医薬組成物。
6. ＡがＯであり、ＢがＯ又はＮＲ^ａであり、ＸがＮＲ^ｂであり、ＹがＣ（Ｏ）又はＣ（Ｓ）である、請求項１に記載の医薬組成物。
7. Ｗがアリール又は低級アルキルである、請求項６に記載の医薬組成物。
8. 請求項１に従う式Ｉによる化合物を含む医薬組成物を投与することを含む、パルミトイルエタノールアミドの低レベルが付随するか又はパルミトイルエタノールアミドレベルの上昇が治療上所望される状態を有する患者を治療する方法。
9. パルミトイルエタノールアミドの低レベルが付随する状態が炎症性要素を含み、組成物の投与が患者において炎症を軽減させる、請求項８に記載の方法。
10. 状態が、関節リウマチ、変形性関節症、喘息、アレルギー性皮膚炎、乾癬、炎症性腸疾患又は脊髄損傷である、請求項８に記載の方法。
11. ＡがＯであり、ＢがＯ又はＮＲ^ａであり、ＸがＮＲ^ｂであり、ＹがＣ（Ｏ）又はＣ（Ｓ）である、請求項８に記載の方法。
12. ＺがＯ又はＣＨＲ^ｄであり、Ｖが低級アルキルであり、Ｗがアリール又は低級アルキルである、請求項１１に記載の方法。
13. Ｗがアリール又は低級アルキルである、請求項１１に記載の方法。
14. 式Ｉによる化合物とＮ−アシルエタノールアミン−加水分解酸性アミダーゼ（ＮＡＡＡ）を接触させることを含む、Ｎ−アシルエタノールアミン−加水分解酸性アミダーゼ（ＮＡＡＡ）の阻害の方法：
    

    

    （式中、
    Ａは、Ｏ又はＳであり；Ｂは、Ｏ、Ｓ又はＮＲ^ａであり；Ｒ_１及びＲ_２は、独立に、Ｈ、ハロゲン又は場合によっては置換される低級アルキルであり；ｎは、０から３の間の整数であり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、ＮＲ^ｂ、ＣＨＲ^ｂであるか又は存在せず；Ｙは、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｓ）又はＣＨＲ^Ｃであり；Ｚは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ^ｄ又はＣＨＲ^ｄであり；Ｖは、場合によっては置換される低級アルキル又は場合によっては置換される低級アルケニルであり；Ｗは、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル又はＣ（Ｒ_３Ｒ_４Ｒ_５）であり；Ｙ及びＶは、場合によっては５−又は６員環を形成し得；
    Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ、Ｒ^Ｃ及びＲ^ｄは、Ｈ、場合によっては置換される低級アルキル又は場合によっては置換される低級チオアルキルからなる群から独立して選択され；
    Ｒ_３、Ｒ_４及びＲ_５は、独立して、Ｈ、場合によっては置換される低級アルキル、場合によっては置換される低級アリール、場合によっては置換される低級シクロヘテロアルキル又は場合によっては置換される低級へテロアリールである。）。
15. ＡがＯであり、ＢがＯ又はＮＲ^ａであり、ＸがＮＲ^ｂであり、ＹがＣ（Ｏ）又はＣ（Ｓ）である、請求項１４に記載の方法。
16. ＺがＯ又はＣＨＲ^ｄであり、Ｖが低級アルキルであり、Ｗがアリール又は低級アルキルである、請求項１５に記載の方法。
17. 接触させる段階が、化合物の局所投与、化合物のエアロゾル投与又は化合物の髄膜注射を用いてインビボで行われる、請求項１４に記載の方法。
18. 化合物が２０μＭ未満のＩＣ５０でＮＡＡＡを阻害する、請求項１４に記載の方法。

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