ES2575954T3

ES2575954T3 - Composiciones y métodos de inhibición de la amidasa ácida hidrolizante de la N-aciletanolamina

Info

Publication number: ES2575954T3
Application number: ES08838096.9T
Authority: ES
Inventors: Daniele Piomelli; Giorgio Tarzia; Marco Mor; Andrea Duranti; Andrea Tontini
Original assignee: Degli Studi Di Urbino Carlo Bo, University of; Universita degli Studi di Parma; Universita degli Studi di Urbino "Carlo Bo"; University of California
Current assignee: Degli Studi Di Urbino Carlo Bo, University of; Universita degli Studi di Parma; Universita degli Studi di Urbino "Carlo Bo"; University of California
Priority date: 2007-10-11
Filing date: 2008-10-10
Publication date: 2016-07-04
Anticipated expiration: 2028-10-10
Also published as: CA2711957C; CN101820848B; EP2200564A1; WO2009049238A1; US20100311711A1; US9321743B2; JP5526362B2; AU2008310628B2; CN101820848A; AU2008310628A1; CA2711957A1; US10363237B2; US20160256432A1; JP2011500602A; EP2200564B1; EP2200564A4; NZ583970A; US20140094508A1

Abstract

Un compuesto para su uso en el tratamiento de inflamación, artritis reumatoide, artrosis, asma, dermatitis, psoriasis, enfermedad del intestino irritable o una lesión de la médula espinal, teniendo dicho compuesto una estructura de acuerdo con la Fórmula I**Fórmula** en la que A es O o S; B es O, S o NRa; R1 y R2 son independientemente H, halógeno, o alquilo opcionalmente sustituido de uno a diez carbonos; X es O, S, C(O), NRb, CHRb o cero; Y es C(O), C(S) o CHRc; Z es O, S, NRd o CHRd; V es alquilo opcionalmente sustituido de uno a diez carbonos o alquenilo opcionalmente sustituido de uno a diez carbonos, siendo V opcionalmente metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, 1-butilo, i-butilo, 2-metilpropilo, ciclopropilmetilo, iamilo, n-amilo o hexilo en la que W es arilo, heteroarilo, cicloalquilo, cicloheteroalquilo o C(R3R4R5), cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido; en la que Ra Rb: Rc y Rd son independientemente H, alquilo opcionalmente sustituido de uno a diez carbonos o tioalquilo opcionalmente sustituido de uno a diez carbonos; y en la que R3, R4 y R5 son independientemente H, alquilo opcionalmente sustituido de uno a diez carbonos, arilo opcionalmente sustituido, cicloheteroalquilo opcionalmente sustituido de uno a diez carbonos o heteroarilo opcionalmente sustituido.

Description

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DESCRIPCION

Composiciones y metodos de inhibicion de la amidasa acida hidrolizante de la N-aciletanolamina

Esta solicitud reivindica la prioridad a nuestra solicitud provisional de Estados Unidos en tramite junto con la presente con el numero de serie 60/979304, que fue presentada el 11 de octubre de 2007.

Esta invencion se realizo con apoyo del gobierno segun los terminos de la subvencion n.° DA-12413 concedida por los INH (Institutos Nacionales de Salud). El Gobierno puede tener ciertos derechos sobre la invencion.

Campo de la invencion

El campo de la invencion son las composiciones y metodos relacionados con la inhibicion de la amidasa acida hidrolizante de la N-aciletanolamina (NAAA) y especialmente en lo que se refiere al tratamiento y la prevencion del dolor, la inflamacion y otros trastornos en los que la modulacion de la etanolamida de acido graso es clmicamente relevante.

Antecedentes de la invencion

Si bien existen numerosas composiciones y metodos conocidos en la tecnica para tratar el dolor y/o la inflamacion, siguen existiendo numerosas dificultades. Mas significativamente, los efectos secundarios asociados a periodos largos de administracion y/o dosis mas altas a menudo impiden el uso exitoso de tales farmacos. Por ejemplo, recientemente se ha asociado a ciertos inhibidores de la COX-2 con acontecimientos cardiovasculares adversos, mientras que los medicamentos para el dolor de tipo aspirina aumentan frecuentemente el riesgo de hemorragia intestinal. En otros ejemplos, el ibuprofeno y el acetaminofeno tienden a afectar negativamente a la funcion hepatica, especialmente en dosis altas.

Las etanolamidas de acidos grasos de cadena larga (N-aciletanolaminas (NAE)) estan presentes en numerosos organismos inferiores, organismos superiores y mairnferos con una amplia variedad de funciones. Por ejemplo, se ha demostrado que la anandamida (una NAE de tipo acido graso poliinsaturado) tiene actividad canabimimetica y se ha demostrado que actua como un ligando de TRPV1 (receptor de potencial transitorio vainilloide tipo 1). Por el contrario, las NAE saturadas y monoinsaturadas son inactivas como ligandos de receptores de cannabinoides. Sin embargo, se ha informado que tales compuestos poseen una variedad de otras actividades biologicas. Por ejemplo, la N-palmitoiletanolamina (PEA) tiene actividad anti-inflamatoria, anti-nociceptiva, inmunosupresora, neuroprotectora y tambien actividad antioxidante. Curiosamente, la accion anti-inflamatoria de la N-palmitoiletanolamina podna estar mediada por la activacion del receptor activado por el proliferador de peroxisomas alfa (PPAR-alfa). En otros ejemplos, se ha visto que la N-oleoiletanolamina es anorexica a traves del PPAR-alfa (vease, por ejemplo, The Journal Of Pharmacology And Experimental Therapeutics (2006), Vol. 318, n.° 2, paginas 563-570) y la N- estearoiletanolamina es pro-apoptotica y anorexica.

Las NAE son un sustrato de la NAAA que hidroliza catalfticamente la NAE en etanolamina y en el acido graso correspondiente. Sorprendentemente, la actividad catalttica de las NAAA es significativamente diferente a la de una enzima similar, la FAAH (hidrolasa de amida de acido graso). Entre otras diferencias, un rasgo caractenstico de la NAAA es su optima actividad a un pH de aproximadamente 5,0. La NAAA tambien exhibe una preferencia sustancial por la N-palmitoiletanolamina (PEA) sobre otras NAE, se activa por TRITON X-100™ (marca comercial registrada de Union Carbide; 4-octilfenol polietoxilado) y ditiotreitol (DTT). Sorprendentemente, la NAAA tiene una menor sensibilidad a la inhibicion con fluoruro de fenilmetilsulfonilo y fluorofosfonato de metilaraquidonilo. Aunque se ha clonado el gen de la NAAA y el polipeptido correspondiente esta relativamente bien caracterizado (vease, por ejemplo, J Biol Chem (2005), vol. 280, n.° 12, paginas 11082-11092), las propiedades funcionales de la NAAA en mamfferos no se conocen bien.

Si bien se han identificado numerosos inhibidores de la FAAH en la literatura (vease, por ejemplo, Eur J Pharmacol (2007), 565 (1-3); paginas 26-36; J Enz Inhib and Med Chem (2003), 18 (1), paginas 55-58; Arco Biochem Biophys (1999), 362 (2), paginas 191-196), actualmente no se han descrito inhibidores de la NAAA. Por otra parte, como la FAAH y la NAAA no estan estrechamente relacionadas estructuralmente, no se espera que los inhibidores de la FAAH proporcionen una inhibicion significativa de la NAAA.

Por lo tanto, aunque en la tecnica se conocen numerosas composiciones y metodos de tratamiento y de prevencion del dolor y de la inflamacion, todos o casi todos ellos tienen una o mas desventajas. En consecuencia, todavfa hay una necesidad de proporcionar una mejor composicion y los metodos para tratar y prevenir el dolor y la inflamacion.

Sumario de la invencion

La presente invencion se refiere a composiciones y metodos para inhibir la NAAA utilizando diversos compuestos contemplados e identificados por los inventores. Lo mas ventajosamente, dichos compuestos y composiciones seran utiles en el tratamiento de afecciones asociadas con un nivel reducido de palmitoiletanolamida y especialmente

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enfermedades inflamatorias.

En un aspecto preferido de la materia objeto de la invencion, una composicion farmaceutica para el tratamiento de una afeccion asociada con un nivel reducido de palmitoiletanolamida comprende un compuesto segun la Formula I y un vehuculo farmaceuticamente aceptable

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en la que A es O o S; B es O, S o NR ; R1 y R2 son independientemente H, halogeno o alquilo inferior opcionalmente sustituido; n es un numero entero entre 0 y 3; X es O, S, C(O), NRb, CHRb o cero; Y es C(O), C(S) o CHRc; Z es O, S, NRd o CHRd; V e alquilo inferior opcionalmente sustituido o alquenilo inferior; W es arilo, heteroarilo, cicloalquilo, cicloheteroalquilo, o C(RaR4R5), cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido; en algunos aspectos, Y y V pueden formar un anillo de 5 o 6 miembros; mas generalmente, Ra, Rb, Rc y Rd se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo inferior opcionalmente sustituido o tioalquilo inferior opcionalmente sustituido y R3, R4 y R5 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo inferior opcionalmente sustituido, arilo inferior opcionalmente sustituido, cicloheteroalquilo inferior opcionalmente sustituido y heteroarilo inferior opcionalmente sustituido.

Los compuestos particularmente contemplados incluyen aquellos en los que A y B son O, en los que X es NRb e Y es C(O) o C(S) y/o en el que Z es O o CHRd, V es alquilo inferior, y en el que W es arilo o alquilo inferior. Lo mas preferiblemente, n es 1, R1 es H y R2 es alquilo inferior y/o W es arilo o alquilo inferior. Otros compuestos preferidos incluyen aquellos en los que A es O, B es O o NRa, X es NRb e Y es C(O) o C(S).

Por lo tanto, un metodo para tratar un paciente que tiene una afeccion asociada con niveles reducidos de palmitoiletanolamida en una celula, organo o compartimento corporal incluira una etapa de administrar una composicion farmaceutica que incluye un compuesto de acuerdo con la Formula I anterior. Mas generalmente, la afeccion incluye un componente inflamatorio (por ejemplo, artritis reumatoide, artrosis o asma).

La administracion de la composicion se lleva a cabo a continuacion, en un protocolo y en una dosificacion suficiente para reducir la inflamacion en el paciente. Visto desde una perspectiva diferente, los metodos contemplados incluiran, por lo tanto, tambien aquellos metodos en los que se utilicen los compuestos de acuerdo con la Formula I anterior para inhibir la NAAA. En aspectos preferidos, se realiza la etapa de poner en contacto la NAAA in vivo y/o el compuesto inhibe la NAAA a una CI50 de menos de 20 microM.

Objetos diversos, caractensticas, aspectos y ventajas de la presente invencion seran mas evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada de realizaciones preferidas de la invencion.

Breve descripcion de los dibujos

Las figuras 1A-1C son ejemplos de compuestos de acuerdo con el contenido de la invencion y sus respectivos valores CI50.

Las figuras 2A-2C son graficos que ilustran el efecto de la inflamacion sobre el numero de neutrofilos infiltrantes (A), los niveles de PEA celular endogena (B) y el transcurso temporal del efecto de la inflamacion sobre la PEA (C).

Las figuras 3A-3B son graficos que ilustran el efecto de la PEA exogena sobre el numero de neutrofilos infiltrantes como una funcion de la concentracion de PEA (A) y el numero de neutrofilos infiltrantes en ratones de tipo silvestre y ratones mutantes nulos con PPAR-alfa (B).

La Figura 4 es una vista detallada de un modelo de ordenador del sitio activo de NAAA.

La Figura 5 es un grafico que representa la inhibicion de NAAA por compuestos seleccionados de acuerdo con el contenido de la invencion.

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Las figuras 6A-6C son graficos que ilustran el efecto de un ejemplo de un inhibidor de la NAAA sobre el numero de neutrofilos infiltrantes (A) y la cantidad de PEA endogena (B) y el numero de neutrofilos infiltrantes en ratones de tipo silvestre y ratones mutantes nulos con PPAR-alfa (C).

La Figura 7 representa fotomicrograffas de cortes de tejido despues de la lesion de la medula espinal tenida con marcadores seleccionados de los animales tratados con y sin inhibidor de la NAAA y un control.

Descripcion detallada

La presente invencion se refiere a compuestos, composiciones y metodos de inhibicion de la NAAA, y especialmente a compuestos, composiciones y metodos adecuados para el tratamiento de diversas enfermedades asociadas con niveles reducidos de PEA en una celula, organo, u otra estructura corporal (o incluso el todo el cuerpo). Lo mas preferiblemente, dicha modulacion tendra como resultado el tratamiento y/o prevencion del dolor, la inflamacion y otros trastornos en los que niveles anormales de NAE estan asociados con un trastorno. En otros aspectos adicionales, los inhibidores y metodos de acuerdo con el objeto de la materia de la invencion tambien se consideran utiles para la investigacion de los mecanismos y las vfas en las que la PEA desempena un papel regulador o modulador.

Compuestos contemplados

Los compuestos generalmente contemplados en la presente memoria tendran una estructura que es eficaz para inhibir la NAAA de manera competitiva, no competitiva, alosterica o de otra manera. Lo mas preferiblemente, los compuestos de acuerdo con el contenido de la invencion inhibiran la NAAA a concentraciones relativamente bajas (por ejemplo, CI50 igual o menor que 50 microM). Entre otras opciones adecuadas, los compuestos especialmente preferidos tienen una estructura de acuerdo con la Formula I

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en la que A es O o S; B es O, S, o NR , siendo R H, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, halo, nitro, hidroxi, alcoxi, alqueniloxi, ciano, carboxi, alcoxicarbonilo, carboxialquilo, amino, acilamino, alquilamino, dialquilamino, cicloalquilamino, /V-alquilo, /V-cicloalquilo, amino, tio, alquiltio y haloalquilo (todos los cuales pueden estar opcionalmente sustituidos); n es un numero entero entre 0 y 3, en el que el C1-3 saturado o insaturado asf formado puede estar opcionalmente y en lugares independientes sustituido con R1 y R2 y en la que R1 y R2 son independientemente Ra como se define anteriormente; Q es como Rase ha definido anteriormente; X es O, S, C(O), NRb o CHRb siendo Rb como se ha definido anteriormente Ra o cero; Y es C(O), C(S) o CHRc siendo Rc como se ha definido anteriormente Ra o cero; Z es O, S, NRd o CHRd siendo Rd como se ha definido anteriormente Ra o cero; V es un alquilo inferior opcionalmente sustituido o un alquileno inferior opcionalmente sustituido; W es H, arilo, heteroarilo, cicloalquilo, cicloheteroalquilo o C(R3R4R5), cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido, en la que R3, R4 y R5 son independientemente Ra como se ha definido anteriormente y en la que Y y V pueden formar opcionalmente un anillo opcionalmente sustituido de 5, 6, o 7 miembros.

En aspectos especialmente preferidos, A y B son O, y/o X es NRb e Y es C(O) o C(S). Ademas, o como alternativa, se contempla que Z sea O o CHRd, V sea alquilo inferior y en la que W sea arilo o alquilo inferior y/o que n sea 1, R1 sea H y R2 sea alquilo inferior. Los compuestos aun mas preferidos incluyen aquellos en los que A es O, B es O o NRa, X es NRb e Y es C(O) o C(S). En otros aspectos de la materia objeto de la invencion se contempla que X-Y puedan formar juntos -CH=CH- o CH=CJ, donde J es halogeno, especialmente donde Z = -CHRd- o cero. Todavfa se contempla ademas que Y-Z-V se conviertan en Y-V mediante la eliminacion de Z, o Y, mediante la eliminacion de Z y V. De manera similar, Z-V-W pueden convertirse en Z-W mediante la eliminacion de V. Los compuestos contemplados adicionalmente incluyen todos los productos de escision hidrolttica (por ejemplo, acidos o alcalinos) del enlace A=C-B-.

Otros compuestos contemplados adicionalmente incluyen aquellos de acuerdo con las Formulas II y II como se representa a continuacion

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en las cuales B es O, S o NRa, siendo Ra H, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, halo, nitro, hidroxi, alcoxi, alqueniloxi, ciano, carboxi, alcoxicarbonilo, carboxialquilo, amino, acilamino, alquilamino, dialquilamino, cicloalquilamino, W-alquilo, /V-cicloalquilo, amino, tio, alquiltio y haloalquilo (todos los cuales puede estar opcionalmente sustituidos); n es un numero entero entre 0 y 3, en el que el c1-3 saturado o insaturado as^ formado puede estar opcionalmente y en lugares independientes sustituido con Ri y R2, y en la que R1 y R2 son independientemente como se ha definido anteriormente Ra; Q es como se ha definido anteriormente Ra; X es O, S, C(O), NRb o CHRb siendo Rb como se ha definido anteriormente Ra o cero; Y es C(O), C(S) o CHRc, siendo Rc como se ha definido anteriormente Ra o cero; Z es O, S, NRd o CHRd siendo Rd como se ha definido anteriormente Ra o cero; V es un alquilo inferior opcionalmente sustituido o un alquileno inferior opcionalmente sustituido; W es H, arilo, heteroarilo, cicloalquilo, cicloheteroalquilo o C(R3R4Rs), cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido, en la que R3, R4 y R5 son independientemente Ra como se ha definido anteriormente y en la que Y y V pueden formar opcionalmente un anillo opcionalmente sustituido de 5, 6, o 7 miembros.

Ademas, debe apreciarse que cuando estan presentes estereocentros, se contemplan todos los isomeros y mezclas de los mismos. Asimismo, cuando esta presente un doble enlace, la orientacion de los radicales en cada lado del doble enlace puede ser cis o trans. Las Figuras 1A-1D representan ejemplos de diversos compuestos preferidos de acuerdo con el contenido de la invencion.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino “halogeno” se refiere a un atomo de fluor, bromo, cloro o yodo, que normalmente esta unido covalentemente a otro atomo (por ejemplo, de carbono). Tal como se utiliza adicionalmente en la presente memoria, el termino “hidroxilo” se refiere a un grupo OH. Como se utiliza adicionalmente en la presente memoria, el termino “atomo de carbonilo” se refiere a un atomo de carbono al que estan unidos covalentemente tres atomos, mientras que uno de los tres atomos esta unido al atomo de carbono a traves de un doble enlace (que puede estar parcialmente deslocalizado). Por lo tanto, los atomos de carbonilo particularmente contemplados incluyen atomos de carbono en un grupo oxo, un grupo aldehfdo, un grupo carboxamida, un grupo carboxamidina y un grupo tiocarboxamida.

El termino “alquilo” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un hidrocarburo dclico, ramificado o lineal en el que todos los enlaces carbono-carbono son enlaces sencillos y el termino “alquilo inferior” se refiere a un alquilo dclico, ramificado o de cadena lineal de uno a diez atomos de carbono (por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i- propilo, n-butilo, t-butilo, i-butilo (o 2-metilpropilo), ciclopropilmetilo, i-amilo, n-amilo, hexilo, etc.). El termino “alquileno” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un alquilo que tiene dos atomos de hidrogeno menos que el alcano correspondiente (es decir, CnH2n). Por ejemplo, alquilenos adecuados incluyen grupos metileno, grupos etileno, grupos propileno, etc. El termino “cicloalquilo” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un grupo alquilo dclico o policiclico que contiene de 3 a 15 atomos de carbono. Para los grupos polidclicos, estos pueden ser anillos multiples condensados en los que uno de los anillos distales puede ser aromatico (por ejemplo, indanilo, tetrahidronaftaleno, etc.). El termino “alcarilo” tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un alquilo que esta acoplado de forma covalente a un resto arilo. Por ejemplo, un radical bencilo se considera un alcarilo segun la definicion establecida en la presente memoria.

Del mismo modo, el termino “alquenilo” como se usa en la presente memoria se refiere a un alquilo en el que al menos un enlace carbono-carbono es un doble enlace. Por lo tanto, el termino “alquenilo inferior” incluye todos los alquenilos con uno a diez atomos de carbono. El termino “cicloalquenilo”, como se usa aqrn, se refiere a un grupo dclico o polidclico que contiene 3 a 15 carbonos y al menos un doble enlace. Asimismo, el termino “alquinilo” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un alquilo o alquenilo en el que al menos un enlace carbono- carbono es un triple enlace. Por lo tanto, el termino “alquinilo inferior” incluye todos los alquinilos con uno a diez atomos de carbono.

Como se utiliza adicionalmente en la presente memoria, el termino “alcoxi” se refiere a un grupo OR, en el que R es alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, acilo, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heteroarilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloheteroalquilo, o cicloheteroalquilo sustituido. Del mismo modo, el termino “ariloxi” se refiere a un grupo OAr, en el que Ar es un arilo, arilo sustituido, heteroarilo, o heteroarilo sustituido.

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Ademas, el termino “arilo” se refiere a un grupo carbodclico aromatico que tiene al menos un anillo aromatico (por ejemplo, fenilo o bifenilo) o multiples anillos condensados en los que al menos un anillo es aromatico, (por ejemplo, 1,2, 3,4-tetrahidronaftilo, naftilo, antrilo o fenantrilo). El termino “heteroatomo” como se usa en la presente memoria, se refiere a un atomo distinto al carbono (por ejemplo, S, O, o N), que opcionalmente puede estar sustituido con, por ejemplo, hidrogeno, halogeno, alquilo inferior, alcoxi, alquiltio inferior, trifluorometilo, amino, amido, carboxilo, hidroxilo, arilo, ariloxi, heterociclo, heteroarilo, heteroarilo sustituido, nitro, ciano, alquiltio, tiol, sulfamido y similares.

Adicionalmente, el termino “sustituido” como se usa en la presente memoria significa que un atomo de hidrogeno que esta unido covalentemente a un grupo o atomo (o un par de electrones libres o par de electrones libres de un doble enlace de un atomo) se sustituye por un sustituyente no hidrogeno unido covalentemente, incluyendo hidroxilo, tiol, alquiltiol, halogeno, alcoxi, amino, amido, nitro, carboxilo, cicloalquilo, heterociclo, cicloheteroalquilo, acilo, carboxilo, arilo, ariloxi, heteroarilo, arilalquilo, heteroarilalquilo, alquilo, alquenilo, alquinilo y ciano.

El termino “profarmaco” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una modificacion de los compuestos contemplados, en el que el compuesto modificado exhibe menos actividad farmacologica (en comparacion con el compuesto modificado) y en el que el compuesto modificado se convierte de nuevo dentro de una celula diana (por ejemplo, linfocito B) u organo/estructura anatomica diana (por ejemplo, las articulaciones) en la forma modificada. Por ejemplo, la conversion de los compuestos contemplados en profarmacos puede ser util cuando el farmaco activo es demasiado toxico para la administracion sistemica segura o cuando el compuesto contemplado se absorbe mal por el tracto digestivo o por otro compartimento o celula o cuando el cuerpo descompone el compuesto contemplado antes de alcanzar su diana. Por lo tanto, se debe reconocer que los compuestos de acuerdo con la materia objeto de la invencion pueden ser modificados de numerosas maneras y las modificaciones especialmente preferidas incluyen aquellas que mejoran uno o mas parametros farmacocineticos y/o farmacodinamicos. Por ejemplo, uno o mas sustituyentes pueden ser anadidos o reemplazados para lograr un AUC mas alta en el suero.

Por otra parte, y especialmente cuando se desea una mayor solubilidad, se pueden anadir grupos hidrofilos. Aun mas, cuando los compuestos contemplados contienen uno o mas enlaces que pueden ser hidrolizados (o de otra manera escindidos), los productos de reaccion tambien se contemplan expresamente. Ejemplos de protocolos adecuados para la conversion de los compuestos contemplados en la forma de profarmaco correspondiente se pueden encontrar en “"Prodrugs (Drugs and the Pharmaceutical Sciences: a Series of Textbooks and Monographs)” por Kenneth B. Sloan (ISBN: 0824786297) e “Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism: Chemistry, Biochemistry and Enzymology” por Bernard Testa, Joachim M. Mayer (ISBN: 390639025X), los cuales se incorporan por referencia en la presente memoria. Ademas, especialmente cuando los compuestos contemplados tienen una mayor actividad cuando se metaboliza el compuesto (por ejemplo, se hidroliza, hidroxila, glucuroniza, etc.), debe apreciarse que los metabolitos de los compuestos contemplados tambien se contemplan expresamente en la presente memoria.

Dependiendo de la finalidad particular (por ejemplo, analgesico, anti-inflamatorio), se debe reconocer que los compuestos contemplados pueden ser combinados (in vivo o en una formulacion farmaceutica o regimen de administracion) con al menos un otro principio farmaceuticamente activo, y otros principios activos especialmente contemplados incluyen varios analgesicos (por ejemplo, opioides, farmacos de tipo ibuprofeno, farmacos de tipo paracetamol, farmacos de tipo aspirina, etc.), diferentes farmacos inmunosupresores y/o antiinflamatorios (por ejemplo, esteroides y AINE), etc. Las concentraciones de segundos principios farmaceuticamente activos estan generalmente o preferiblemente por debajo de las recomendadas para la administracion independiente, sin embargo, concentraciones mas altas tambien se consideran adecuadas para su uso en la presente memoria.

Por lo tanto, las composiciones farmaceuticas contempladas especialmente incluiran aquellas en las que los compuestos contemplados (y principios farmaceuticamente activos adicionales) se proporcionan con un vehfculo adecuado, en las que los compuestos contemplados estan presentes preferiblemente en una concentracion eficaz para modular la concentracion de etanolamida de acidos grasos en un organismo y/u organo diana en un grado eficaz para reducir y mas preferiblemente para tratar los signos y smtomas de una enfermedad asociada con un nivel anormal en etanolamida de acido graso. Visto desde una perspectiva diferente, compuestos contemplados estan presentes en una composicion en una cantidad eficaz para reducir el dolor y/o la inflamacion.

Dependiendo del uso y estructura particular, por lo tanto, se contempla que los compuestos de acuerdo con el objeto de la invencion esten presentes en la composicion en una cantidad entre 1 microgramo a 1000 mg, mas generalmente entre 10 microgramos a 500 miligramos y lo mas generalmente entre 50 microgramos a 500 miligramos por unidad de dosificacion unica. Por lo tanto, las concentraciones preferidas de los compuestos contemplados in vivo o in vitro generalmente seran de entre 0,1 nM y 500 microM, mas generalmente entre 50 nM y 400 microM y lo mas generalmente entre 100 nM y 200 microM.

Ademas, se debe reconocer que todas las formulaciones se consideran adecuadas para su uso en la presente memoria y especialmente incluyen formulaciones orales y parenterales. Por ejemplo, para la administracion oral, las composiciones contempladas pueden estar en la forma de un comprimido, capsula, suspension o lfquido. La composicion farmaceutica se elabora preferiblemente en forma de una unidad farmaceutica que contiene una cantidad particular del principio activo. Ejemplos de tales unidades de dosificacion son comprimidos o capsulas. El

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principio activo tambien puede administrate por inyeccion como una composicion en la que, por ejemplo, se puede usar solucion salina, dextrosa o agua como un vetnculo adecuado. En aspectos especialmente preferidos, se contempla que la formulacion sea adecuada para administracion topica, administracion a traves de aerosol y para la administracion intratecal. En consecuencia, formulaciones especialmente adecuadas pueden ser soluciones acuosas esteriles para pulverizacion topica o administracion en gotas o la aplicacion como una tintura. Como alternativa, las formulaciones topicas adecuadas incluyen cremas, pomadas, espumas, lociones, emulsiones, etc. Ademas, cuando se formula el compuesto para la administracion intratecal (por ejemplo, en el tratamiento de la lesion de la medula espinal), se prefiere que el compuesto se prepare como una solucion inyectable, suspension, o emulsion. En otras formulaciones adicionales, los compuestos contemplados pueden ser formulados para la administracion en aerosol (por ejemplo, micropolvo, recubierto sobre un vetnculo dispersable, disuelto en disolvente atomizable, etc.)

Se debe apreciar que la eleccion de la formulacion y del vetnculo en particular dependera al menos en parte del uso espedfico y del tipo de compuesto. Hay numerosas maneras de formulacion del farmaco conocidas en la tecnica y todas se consideran adecuadas para su uso en la presente memoria (vease, por ejemplo, Pharmaceutical Preformulation and Formulation: A Practical Guide from Candidate Drug Selection to Commercial Dosage Form by Mark Gibson; Informa Healthcare, ISBN: 1574911201; or Advanced Drug Formulation Design to Optimize Therapeutic Outcomes by Robert O. Williams, David R. Taft, and Jason T. McConville; Informa Healthcare; ISBN: 1420043870).

La cantidad de compuesto terapeuticamente activo que se administra y el regimen de dosificacion para tratar un estado patologico con los compuestos y/o composiciones de esta invencion depende de una variedad de factores, incluyendo la edad, peso, sexo y estado de salud del sujeto, la gravedad de la enfermedad, la ruta y frecuencia de administracion y el compuesto particular empleado y, por lo tanto, puede variar ampliamente. Sin embargo, se proporcionan mas arriba cantidades especialmente adecuadas, y por lo tanto, se permite una dosis diaria de aproximadamente 0,001 (o incluso menos) a 100 mg/kg de peso corporal, preferiblemente entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal y mas preferiblemente de aproximadamente 0,1 a 20 mg/kg de peso corporal. Generalmente, una dosis diaria puede administrarse en una a cuatro dosis por dfa.

Para fines terapeuticos o profilacticos, los compuestos contemplados se combinan normalmente con uno o mas excipientes apropiados para la ruta de administracion indicada. Si se administra por via oral, los compuestos pueden mezclarse con lactosa, sacarosa, polvo de almidon, esteres de celulosa de acidos alcanoicos, esteres de alquilo de celulosa, talco, acido estearico, estearato de magnesio, oxido de magnesio, sales de sodio y calcio de acidos fosforico y sulfurico, gelatina, goma arabiga, alginato de sodio, polivinilpirrolidona y/o alcohol polivimlico, y despues comprimirse o encapsularse para la administracion conveniente. Tales capsulas o comprimidos pueden contener una formulacion de liberacion controlada que puede proporcionarse en una dispersion de compuesto activo en hidroxipropilmetilcelulosa. Las formulaciones para administracion parenteral pueden estar en forma de soluciones o suspensiones para inyeccion esteriles, isotonicas, acuosas o no acuosas. Estas soluciones y las suspensiones pueden prepararse a partir de polvos o granulos esteriles que tienen uno o mas de los vetnculos o diluyentes mencionados para su uso en las formulaciones para administracion oral. Los compuestos pueden disolverse en agua, polietilenglicol, propilenglicol, etanol, aceite de mafz, aceite de semilla de algodon, aceite de cacahuete, aceite de sesamo, alcohol bendlico, cloruro de sodio y/o diversos tampones. Otros excipientes y modos de administracion son bien y ampliamente conocidos en la tecnica farmaceutica.

Usos contemplados

En general, se contempla que los compuestos y composiciones de acuerdo con la materia objeto de la invencion se puedan emplear para tratar cualquier afeccion y/o enfermedad asociados con niveles anormales (por ejemplo, desviacion de al menos 10 % con respecto al nivel de PEA promedio en una persona sana en el correspondiente sitio de ensayo) de las NAE o cuando se desea la modulacion de los niveles normales de tales compuestos para un proposito particular. Por lo tanto y visto desde una perspectiva diferente, los compuestos contemplados pueden ser utilizados para el tratamiento de enfermedades o afecciones donde la elevacion de los niveles de palmitoiletanolamida son terapeuticamente deseables. Por lo tanto, afecciones y enfermedades particularmente contempladas incluyen aquellas sensibles a los cambios de las NAE. Por ejemplo, los compuestos y composiciones contempladas pueden ser utiles en la prevencion y/o tratamiento del dolor, la inflamacion, el cancer y enfermedades metabolicas. Otras enfermedades contempladas incluyen trastornos del sistema nervioso, y especialmente relacionadas con la neuroinflamacion, la enfermedad de Alzheimer, el asma, la dermatitis, el smdrome del intestino irritable (SII), enfermedad de Crohn y trastornos del apetito.

Por lo tanto, afecciones y enfermedades para ser tratadas con los compuestos y composiciones contempladas incluyen especialmente el dolor, la inflamacion y las enfermedades neurodegenerativas. Entre otros ejemplos, tales enfermedades pueden incluir artritis reumatoide, psoriasis y asma.

Otros usos contemplados adicionales incluyen aquellos en los que los compuestos y composiciones de acuerdo con la materia objeto de la invencion se usan para estudios de inhibicion in vitro e in vivo para determinar la relacion estructura-funcion de un compuesto con respecto a la inhibicion de NAAA. Como alternativa o adicionalmente, se debe apreciar tambien que los compuestos y composiciones contemplados se pueden emplear en diversos metodos

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de inhibicion de NAAA y/o en la activacion o modulacion de la senalizacion en una v^a en la que el PPAR-alfa es un miembro en la transduccion de la senal u otro procesamiento.

Ejemplos de sintesis de los compuestos contemplados

URB783 se preparo a partir de W-Boc-L-serina (1), la cual se ciclo en una reaccion de Mitsunobu para dar 2, cuya desproteccion y salificacion proporciono el tosilato 3. El ultimo compuesto se hizo reaccionar con cloruro de 3- fenilpropionilo para proporcionar URB783. URB894 fue el resultado de la reaccion entre el cloruro 3 y 4- bifenilcarbonilo, que a su vez se obtuvo por tratamiento de acido 4-fenilbenzoico con cloruro de oxalilo.

Ester ferc-butilico del acido (S)-(2-oxooxetan-3-il) carbamico): A una solucion agitada de PPh3 seca (72 h al vado en presencia de P2O5) (5 mmol) en CH3CN seco (31 ml), mantenida a -50 °C bajo N2, se anadieron gota a gota dimetilazodicarboxilato (5 mmol) y despues de 20 min una solucion de 1 (4,47 mmol) en CH3CN (10,4 ml). La mezcla se agito durante 1,5 horas a -50/-35 °C y se concentro. La purificacion del residuo por cromatograffa ultrarrapida (ciclohexano/EtOAc 8:2 a 6:4) dio 2 bruto, que finalmente se lavo y se trituro para dar un solido blanco. Pf 120-122 °C (Et2O). [a]D20 = -27° (c 0.1, CH3CN). La RMN de 1H esta de acuerdo con la literatura (Arnold, et al., 1985).

(S)-2-oxooxetan-3-il-amonio-4-toluenosulfonato (3): A una mezcla agitada de 2 (1,34 mmol) y acido p- toluenosulfonico anhidro (72 h al vado en presencia de P2O5) (1,43 mmol), mantenido a 0 °C en N2, se anadio gota a gota acido trifluoroacetico (3 ml) a lo largo de 10 min. La solucion se hizo reaccionar bajo agitacion a 0 °C durante 15 min, se dejo alcanzar la temperatura ambiente y se concentro a una temperatura por debajo de 30 °C. El residuo oleoso se mantuvo en vado durante 1 h y el solido blanco resultante se trituro y se lavo con eter dietflico seco, despues se mantuvo a vado durante 24 h. Rendimiento 81 %. El pf y la RMN de 1H estan de acuerdo con la literatura (Arnold, et al., 1988).

(S)-W-(2-oxooxetan-3-il)-3-fenilpropionamida (URB783): A una mezcla agitada de 3 (0,4 mmol) en CH2O2 seco (2 ml), mantenida a 0 °C bajo N2, se anadieron gota a gota Et3N (1,59 mmol) y cloruro de 3-fenilpropionilo (0,6 mmol).

La mezcla se hizo reaccionar a 0 °C durante 30 min y a temperatura ambiente durante 2 h, despues se concentro.

La purificacion del residuo por cromatograffa ultrarrapida (ciclohexano/EtOAc 1:1 a 3:7) y la recristalizacion dio URB783 como un solido blanco. Rendimiento 60 %. Pf 104-106 °C (acetona/eter de petroleo). [a]D20 = -13° (c 0,5, MeOH). MS (EI): m/z 219 (M+), 91 (100). IR (Nujol) 3333, 1832, 1625, 1541 cm'1; RMN de 1H (CDCh) 6 2,57 (sa,

1H), 2,99 (t, 2H), 4,34 (t, 1H, J = 5 Hz), 4,43 (dd, 1H, J1 = 5 Hz, J2= 6,5), 5,14 (m, 1H), 5,96 (sa, 1H), 7,18-7,36 (m, 5H) ppm. RMN de 13C (CDCh): 6 31,2 (CH2), 37,7 (CH2), 58,4 (CH), 66,1 (CH2), 126,5 (CH), 128,3 (2CH), 128,7 (2CH), 140,2, 168,4 (C=O), 172,5 (C=O) ppm.

(S)-W-(2-oxooxetan-3-il)bifenil-4-carboxamida (URB 894): A una solucion de acido bifenil-4-carboxflico (2,1 mmol) en CH2Cl2 seco (5,3 ml) y DMF seco (1 ml), mantenida a 0 °C bajo N2, se anadio cloruro de oxalilo (0,3 ml, 3,13 mmol). La mezcla se hizo reaccionar durante 20 min a 0 °Cy 2 horas a temperatura ambiente, despues se concentro para dar cloruro de bifenil-4-carbonilo en bruto como un solido de color amarillo claro. Una cantidad de esta muestra (2 mmol) se disolvio en THF seco (20 ml) y se anadio gota a gota la solucion resultante, a 0 °C, a una suspension obtenida mezclando 3 (1,3 mmol), Et3N (1,143 ml, 8,2 mmol) y THF seco (3 ml) a 0 °C bajo N2. Se hizo reaccionar la mezcla resultante a 0 °C durante 30 min y a temperatura ambiente durante 3 h, despues se evaporo. La purificacion por cromatograffa ultrarrapida (ciclohexano/EtOAc 1:1) y la recristalizacion dio URB894 puro como un solido de color marfil. Rendimiento 46 %. Pf 218-220 °C (acetona/eter de petroleo; tubo capilar sellado; se observo descomposicion de la muestra con cambio de color y reduccion de la masa a partir de 146 °C); [a]D20 = -20° (c 0.55, CH3CN). MS (EI): m/z 267 (M+), 222, 181, 167 (100). IR (Nujol) 3270, 1827, 1641, 1540 cm-1; RMN de 1H (d6-acetona) 6 4,53-4,65 (m, 2H), 4,50-4,59 (m, 1H), 7,38-7,55 (m, 3H), 7,70-7,84 (m, 4H), 8,00-8,07 (m, 2H), 8,68 (d a, 1H, J = 7 Hz) ppm. RMN de 13C (d6-acetona): 6 58,8, 65,1, 126,9, 127,0, 128,0, 128,1, 129,0, 131,9, 139,7, 144,4, 166,4, 169,2 ppm.

Ejemplos

Los estudios previos realizados por los inventores y otros han demostrado que la PEA produce efectos analgesicos rapidos de amplio espectro mediante la activacion del receptor activado por el proliferador de peroxisomas del receptor nuclear (PPAR-a) en ambos modelos de dolor inflamatorio y neuropatico. Un trabajo mas reciente ha mostrado que los niveles de PEA estan reducidos en los tejidos inflamados (por ejemplo, el lfquido sinovial de la artritis reumatoide y los pacientes con artrosis), lo que sugiere que este lfpido bioactivo puede participar en la modulacion de la respuesta inflamatoria y/o contribuir a los estados inflamatorios cronicos.

Como apoyo de esta posibilidad, los inventores han encontrado que la restauracion de los niveles de PEA durante la inflamacion alivia fuertemente la inflamacion. Estos resultados sugieren una estrategia novedosa mecanicista para reducir la inflamacion y el dolor por inhibicion de la degradacion de la PEA para restaurar los niveles normales de PEA en los tejidos inflamados. En la presente solicitud los inventores han desarrollado una clase de inhibidores potentes y selectivos de la amidasa acida hidrolizante de la W-aciletanolamina (NAAA), la enzima responsable de la degradacion de la PEA.

La inflamacion reduce los niveles de PEA endogena.

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La contribucion de la PEA endogena a los procesos inflamatorios permanece en gran medida sin definir. Sin embargo, varias lmeas de evidencia sugieren que la PEA endogena puede participar en la inflamacion. Los inventores han demostrado anteriormente que el ester de forbol proinflamatorio, el 12-0-tetradecanoilforbol-13- acetato (TPA), disminuye los niveles de pEa dermicos despues de la inflamacion de la piel. Estos resultados plantean la posibilidad de que niveles de PEA reducidos durante la inflamacion puedan permitir la progresion del proceso inflamatorio. Para explorar mas esta idea, los inventores evaluaron los efectos de la inflamacion inducida por carragenina sobre los niveles de PEA en el raton. Se implantaron quirurgicamente bajo la piel dorsal de ratones esponjas de polietileno inyectadas con vehmulo (DMSO al 10 % en solucion salina) o carragenina (1 %). Despues de 3 dfas, los ratones fueron sacrificados y las esponjas se extrajeron y se analizaron para determinar la infiltracion de las celulas inflamatorias y el contenido de PEA celular. En los animales tratados con carragenina, el numero de celulas infiltrantes (principalmente neutrofilos) aumento en aproximadamente 3 veces como se puede observar de la Figura 2. En este caso, la implantacion quirurgica de esponjas empapadas del vehmulo (v) o carragenina (c) bajo la piel dorsal de ratones Swiss durante 3 dfas (A) aumento el numero de neutrofilos infiltrantes y (B) disminuyo los niveles de PEA celular endogeno. (C) El transcurso temporal de los efectos del vehmulo (sfmbolos abiertos) o carragenina (sfmbolos cerrados) sobre los niveles de PEA **P <0,01 o ***P <0,001 frente a V, prueba t o ANOVA, seguido de analisis post-hoc de Dunnett segun corresponda (n = 6).

Estudios adicionales revelaron (datos no mostrados) que la reduccion de PEA en el tejido inflamado era en parte debida al menos a la supresion de la expresion de leucocitos de la fosfolipasa D espedfica de N-acilfosfatidil- etanolamina (NAPE-PLD). Los ratones deficientes en NAPE-PLD, que producen pEa a traves de una ruta enzimatica compensatoria, no pueden reducir los niveles de PEA en respuesta a un desaffo inflamatorio y muestran una reactividad amortiguada a tal exposicion. Los inhibidores de la amidasa acida hidrolizante de la N- aciletanolamina (NAAA) evita la disminucion de los niveles de PEA y de esta manera amortigua las respuestas inducidas por estfmulos inflamatorios. Los efectos antiinflamatorios de este agente son imitados por la PEA exogena y abolidos por la eliminacion de PPAR-alfa. Por lo tanto, hay que senalar que los resultados indican claramente que la activacion de PPAR PEA-alfa en los leucocitos sirve como una senal de parada temprana que impide o incluso inhibe el progreso de la inflamacion.

La restauracion de los niveles de PEA con PEA exogena reduce la inflamacion

Como un primer paso en la determinacion de la funcion de la PEA endogena en la inflamacion, los inventores examinaron los efectos de la aplicacion local de PEA sobre las respuestas inflamatorias. Se implantaron quirurgicamente bajo la piel dorsal de ratones esponjas de polietileno inyectadas con vehmulo o carragenina (1 %) y vehmulo (DMSO 10 % en solucion salina) o diversas dosis de PEA (0,1 a 50 |jg). Despues de 3 dfas, se sacrificaron los ratones y las esponjas se extrajeron y se analizaron para determinar la infiltracion de celulas. La PEA redujo de forma dependiente de la dosis el numero de celulas infiltrantes como se muestra en la Figura 3 y el edema (datos no mostrados) en los ratones de tipo silvestre, pero no tuvo ningun efecto en los animales de PPAR-alfa-nulo. Aqrn los paneles (A-B) muestran el efecto del vehroulo (barras blancas), carragenina (barras rellenas) o PEA (0,1-50 jg) en ratones Swiss, barras negras; PEA (50 jg en ratones PPAR-a -/-), puntuado como el numero de celulas inflamatorias infiltrantes en una esponja de polietileno (tamano) inyectada con vehmulo, carragenina (1 %) o PEA, implantada bajo la piel dorsal de (A) ratones Swiss o (B) ratones C57BL6 de tipo silvestre (+/+) o ratones PPAR-a/- durante 3 dfas. **P < 0,01 o *** P <0,001 frente a V, ## P <0,01 frente a control de carragenina. ANOVA, seguido de analisis post-hoc de Tukey o analisis post-hoc de Dunnett segun corresponda (n = 6). Por lo tanto, se debe apreciar que la inflamacion periferica se asocia con la smtesis de PEA disminuida en celulas infiltrantes y que la restauracion de los niveles de PEA por la administracion exogena PEA reduce las respuestas inflamatorias.

Diseno de inhibidores de la NAAA

La NAAA pertenece a la familia de la coloilglicina hidrolasa, que es un subgrupo de la superfamilia de las Ntn (nucleofilo N-terminal) amino hidrolasas. Estas enzimas se especializan en la escision de amidas lineales y tienen una cistema, serina o treonina en la primera posicion de su secuencia aminoaddica, que actua como el agente nucleofilo responsable del ataque catalttico. En el caso de la NAAA, el residuo nucleofilo es probablemente Cis131. La evidencia experimental sugiere que la protema nativa NAAA sufre un proceso de maduracion que implica la escision proteolftica de los 130 primeros residuos, que da una protema de 232 aminoacidos, donde Cis131 se convierte en el extremo N-terminal, un hecho comunmente observado con otras Ntn hidrolasas.

Recientemente, la estructura del conjugado acido biliar hidrolasa (CBAH), un miembro de la familia Ntn, se resolvio por cristalograffa de rayos X. Un alineamiento de las secuencias de aminoacidos de NAAA y CBAH revelo un alto grado de homologfa de secuencia entre los sitios de union de dos enzimas. Usando las coordenadas de CBAH como molde, se construyo un modelo de NAAA por modelado comparativo. De acuerdo con este modelo, como se ilustra en la Figura 4, el intermedio tetraedrico formado por el ataque de la cistema 131 nucleofila catalftica sobre la PEA se estabilizo mediante interacciones electrostaticas entre el oxfgeno del carbonilo de la PEA y el agujero del oxianion de la enzima, que se forma parcialmente por la amida de la cadena lateral de la asparagina 292 y la amida de la cadena principal de la asparagina 209. Ademas, un bolsillo hidrofobo revestido por tirosina 151, entre otros residuos, puede dar cabida a la cadena de acilo flexible de la PEA.

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Estas predicciones se confirmaron mediante mutagenesis dirigida al sitio de estos aminoacidos que recubren el lado catalftico. Por ejemplo, la sustitucion de Cis131, Ser133, Asp150, Tir151 o Asn292 con alanina, abolio completamente la actividad de NAAA in vitro, mientras que las mutaciones de los residuos perifericos no teman tal efecto (datos no mostrados). Basandose en estos resultados, los inventores disenaron una primera serie de inhibidores de la NAAA que inclma una cadena principal hidrofoba (para imitar el resto acido graso alifatico de PEA) unido a un grupo de cabeza lactona (para dirigir el resto de cistema activo). Los inventores sintetizaron y probaron a continuacion una serie de compuestos, algunos de los cuales inhiben la NAAA recombinante con potencias sub- micromolares (Figuras 1A-C, Figura 5). Los dos compuestos mas potentes (URB783 y URB894) inhibieron la NAAA con valores de CI50 de 420 ± 20 nMy 1l5 ± 13 nM, respectivamente (Figuras 1A-C, Figura 5).

Los niveles de PEA restauran la inhibicidn de NAAA y reducen la inflamacion

Los inventores evaluaron los efectos del inhibidor de la NAAA URB783 sobre la inflamacion, utilizando el modelo de carragenina en raton. Como se indico anteriormente, la exposicion a carragenina estimulo el edema producido por la infiltracion de celulas (Figura 6A) (datos no mostrados), y redujo significativamente los niveles endogenos de PEA (Figura 6B). La inclusion del compuesto URB783 en la esponja restauro la PEA hasta los niveles basales (Figura 6B) y redujo significativamente el numero de celulas infiltrantes (Figura 6A) y el volumen de exudados (datos no mostrados). Cabe destacar que el inhibidor selectivo de la FAAH URB597 no tuvo ningun efecto antiinflamatorio en este modelo, lo que sugiere que la FAAH no participaba en la regulacion de la PEA durante la inflamacion. Los efectos del compuesto URB783 es probable que ocurran a traves de la activacion de PPAR-a por la PEA endogena, ya que estos efectos estaban ausentes en ratones nulos para PPAR-alfa (Figura 6C) y no se reprodujeron por el compuesto URB818, un analogo quiral de URB783 que no inhibe NAAA (datos no mostrados).

Mas espedficamente, los paneles (A, C) ilustran el recuento de celulas inflamatorias mientras que el panel (B) muestra los niveles de PEA en esponjas retiradas de ratones despues de 3 dfas de la implantacion quirurgica bajo la piel dorsal de ratones Swiss (A-B) o (C) ratones C57BL6 (+/+) de tipo silvestre o ratones con PPAR-a desactivado (- /-). Las esponjas de polietileno (1 cm3) fueron inyectadas con vetuculo (100 pl de agua: DMSO (9:1), V, barras abiertas), carragenina (1 %, barras rellenas), URB597 (30 pg) y URB783 (30 pg) como se indica. ** P <0,01 o *** P <0,001 frente a V, ## p <0,01 frente a control de carragenina. ANOVA, seguido de analisis post-hoc de Tukey o de analisis post-hoc de Dunnett segun corresponda (n = 5-7).

Ensayo de NAAA

NAAA recombinante o NAAA de pulmon de rata nativa se incubo a 37 °C durante 30 min en 0,2 ml de tampon de hidrogenofosfato de sodio (50 mM, pH 5,0) que contiene Triton X-100 0,1 %, ditiotreitol (DTT) 3 mM) y heptadecenoiletanolamida 50 mM como sustrato. La reaccion se termino por la adicion de 0,2 ml de metanol fno que contema 1 nmol de acido heptadecanoico (HDA, NuChek Prep, Elysian, Mn). Las muestras se analizaron por LC/MS (cromatograffa lfquida/espectrometna de masas). El acido heptadecanoico se eluyo en una columna Eclipse XDB C18 isocratica a 2,2 ml/min durante 1 min con una mezcla disolvente de metanol 95 % y agua 5 %, conteniendo ambos acido acetico 0,25 % y acetato de amonio 5 mM. La temperatura de la columna fue de 50 °C. ESI estaba en el modo negativo, el voltaje capilar era 4 kV y el voltaje del fragmentador fue 100 V. N2 se utilizo como gas de secado a un caudal de 13 litros/min y una temperatura de 350 °C. La presion del nebulizador se fijo en 60 psi. [M-H]- se controlo en el modo de SIM usando acido heptadecanoico como patron interno. Las curvas de calibracion se generaron utilizando acido heptadecenoico comercial (Nu-Chek Prep, m/z = 267).

Lesion de la medula espinal

En el modelo de lesion de la medula espinal (LME), la compresion extradural de un corte de medula espinal expuesta a traves de una laminectoirna T5-T8 de cuatro niveles, causo un aumento sustancial en la expresion de iNOS en las celulas inflamatorias, asf como en los nucleos de las celulas de Schwann en la materia blanca y gris de los tejidos de la medula espinal extrafdos de ratones 24 horas despues de la lesion. No se detecto tincion de iNOS en la medula espinal obtenida de ratones simulados. La administracion del inhibidor de la NAAA URB783 tras la SCI condujo a una reduccion significativa en la expresion de iNOS, asf como otros marcadores de la inflamacion y apoptosis celular inducida por este modelo, incluyendo el receptor activado por proteasa (PAR), nitrotirosina, ligando de Fas, Bax, Bcl-2 y marcado de final de corte de UTP terminal mediado por la desoxinucleotidiltransferasa terminal (TUNEL). A continuacion se describe un protocolo experimental tfpico.

Los ratones fueron aleatorizados en 4 grupos (n = 40 animales/grupo). Los animales simulados se sometieron al procedimiento quirurgico excepto que la pinza de aneurisma no se aplico y se trato localmente en la medula espinal a nivel T5-T8 de la medula con vetuculo (solucion salina) o 3 (30 pg/raton) 1 h y 6 h despues de la intervencion quirurgica. Los ratones restantes se sometieron a la LME (como se describe a continuacion) y se trataron localmente a nivel T5-T8 de la medula espinal con vehfculo (solucion salina) o 3 (30 pg/raton) 1 h y 6 h despues de la lesion. Los ratones de cada grupo fueron sacrificados a las 24 horas despues de la lesion con el fin de recoger muestras para la evaluacion de los parametros tal como se describe a continuacion.

Los ratones fueron anestesiados utilizando hidrato de cloral (400 mg/kg de peso corporal). Se utilizo el modelo de la

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compresion con pinza descrito por Rivlin y Tator (Rivlin y Tator, 1978) y se produjo la LME por la compresion extradural de una seccion de la SC expuesta a traves de una laminectom^a a nivel de T5-T8, en el que se uso el proceso espinoso prominente de T5 como una gma quirurgica. Se eligio una laminectom^a a nivel seis para acelerar la cosecha oportuna y para obtener suficiente tejido SC para el examen bioqmmico. Con el aplicador de pinzas de aneurisma orientada en la direccion bilateral, se aplico una pinza de aneurisma con una fuerza de cierre de 24 g extraduralmente a nivel T5-T8. A continuacion, la pinza fue liberada rapidamente con el aplicador de la pinza, lo que causo la compresion SC. En los grupos de lesionados, la medula se comprimio durante 1 min. Despues de la cirugfa, se administro 1,0 ml de solucion salina por via subcutanea con el fin de reemplazar el volumen de sangre perdida durante la cirugfa. Durante la recuperacion de la anestesia, los ratones fueron colocados en una almohadilla termica y se cubrieron con una toalla caliente. Los ratones fueron alojados individualmente en una habitacion de temperatura controlada a 27 °C durante un penodo de supervivencia de 10 dfas. La comida y el agua se proporcionaron a los ratones ad libitum. Durante este penodo de tiempo, las vejigas de los animales se vaciaron manualmente dos veces al dfa hasta que los ratones fueron capaces de recuperar la funcion normal de la vejiga. Los animales con lesiones simuladas solamente fueron sometidos a laminectoirna.

Localizacion inmunohistoqmmica de PAR, nitrotirosina, ligando de Fas, Bax, Bcl-2 e iNOS. Veinticuatro horas despues de la LME, se midio la nitrotirosina, un marcador espedfico de estres nitrosativo, mediante analisis inmunohistoqmmico en los cortes de la medula espinal para determinar la localizacion de “formacion de peroxinitrito” y/u otros derivados de nitrogeno producidos durante la LME. A las 24h despues de la LME, los tejidos se fijaron en formaldetndo tamponado con PBS (p/v) al 10 % y se prepararon cortes de 8 mm a partir de tejidos embebidos en parafina. Despues de la desparafinacion, la peroxidasa endogena se inactivo con peroxido de hidrogeno 0,3 % (v/v) en metanol 60 % (v/v) durante 30 min. Los cortes se permeabilizaron con Triton X-100 0,1 % (p/v) en PBS durante 20 min. La adsorcion no espedfica se minimizo mediante la incubacion del corte en suero de cabra normal 2 % (v/v) en PBS durante 20 min. La biotina endogena o los sitios de union de avidina se bloquearon por incubacion secuencial durante 15 minutos con biotina y avidina (DBA), respectivamente. Los cortes se incubaron durante la noche con anti-PAR (Alexis; 1:500 en PBS, v/v), anticuerpo anti-iNOS (1:500 en PBS, v/v), anticuerpo policlonal anti- nitrotirosina de conejo (Upstate, 1: 500 en PBS, v v), con anticuerpo anti-FAS-ligando (Abcam, 1 /: 500 en PBS, v/v), anticuerpo anti-Bax (Santa Cruz Biotechnology, 1:500 en PBS, v/v) o con anticuerpo policlonal anti-Bcl-2 (Santa Cruz Biotechnology, 1:500 en PBS, v/v). Los cortes se lavaron con PBS y se incubaron con anticuerpo secundario. El marcado espedfico se detecto con un anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo conjugado con biotina y un complejo avidina-biotina peroxidasa (DBA). Para verificar la especificidad de union para la nitrotirosina, PAR, iNOS, Bax y Bcl- 2, algunos cortes tambien se incubaron solo con el anticuerpo primario (no secundario) o solo con el anticuerpo secundario (no primario). En estas situaciones no se encontro tincion positiva en cortes que indiquen que las inmunorreacciones eran positivas en todos los experimentos llevados a cabo.

El ensayo marcado de final de corte de UTP terminal mediado por la desoxinucleotidiltransferasa terminal (TUNEL) se realizo utilizando un kit de deteccion de TUNEL de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Apotag, kit de HRP DBA, Milan, Italia). Brevemente, los cortes se incubaron con 15 mcg/ml de proteinasa K durante 15 min a temperatura ambiente y despues se lavaron con PBS. La peroxidasa endogena se inactivo mediante H2O2 al 3 % durante 5 min a temperatura ambiente y despues se lavo con PBS. Los cortes se sumergieron en tampon de desoxinucleotidiltransferasa (TdT) terminal que contiene desoxinucleotidil transferasa y dUTP biotinilado en tampon TdT, se incubaron en una atmosfera humeda a 37 °C durante 90 min y despues se lavaron con PBS. Los cortes se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min con anticuerpo anti-conjugado de peroxidasa de rabano picante y las senales se visualizaron con diaminobencidina. El numero de celulas TUNEL positivo/campo de alta potencia se conto en 5 a 10 campos de cada portaobjetos codificados.

Microscopfa de luz. Se extrajeron tejidos de medula espinal a las 24 h siguientes al traumatismo. Los segmentos de tejido que contiene la lesion (1 cm a cada lado de la lesion) fueron embebidos en parafina y se cortaron en cortes de 5 pm de grosor. Las muestras de tejido (espesor de 5 pm) se deaparafinizaron con xileno, se tineron con hematoxilina/eosina (H y E), con tincion de metilo pironina verde (utilizados simultaneamente para ADN y ARN) y se estudiaron mediante microscopfa optica (Dialux 22 Leitz).

Los segmentos de cada medula espinal fueron evaluados por un histopatologo experimentado. Las neuronas danadas se contaron y se anotaron los cambios histopatologicos de la sustancia gris en una escala de 6 puntos (Sirin et al, 2002): 0, sin lesion observada, 1, sustancia gris contema 1 a 5 neuronas eosinofilas; 2, la sustancia gris contema 5 a 10 neuronas eosinofilos; 3, la sustancia gris contema mas de 10 neuronas eosinofilas; 4, pequeno infarto (menos de un tercio del area de la sustancia gris); 5, infarto moderado; (un tercio a la mitad del area de la sustancia gris); 6, infarto grande (mas de la mitad del area de la sustancia gris). Las puntuaciones de todos los cortes de cada medula espinal se promediaron para dar una puntuacion final para ratones individuales. Se realizaron todos los estudios histologicos de una manera ciega. La Figura 7 representa ejemplos de resultados ejemplares de los experimentos descritos anteriormente.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto para su uso en el tratamiento de inflamacion, artritis reumatoide, artrosis, asma, dermatitis, psoriasis, enfermedad del intestino irritable o una lesion de la medula espinal, teniendo dicho compuesto una estructura de acuerdo con la Formula I

imagen1

en la que

A es O o S;

B es O, S o NRa;

Ri y R2 son independientemente H, halogeno, o alquilo opcionalmente sustituido de uno a diez carbonos;

X es O, S, C(O), NRb, CHRb o cero;

V es C(O), C(S) o CHRc;

Z es O, S, NRdoCHRd;

V es alquilo opcionalmente sustituido de uno a diez carbonos o alquenilo opcionalmente sustituido de uno a diez carbonos, siendo V opcionalmente metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, 1 -butilo, Z-butilo, 2-metilpropilo, ciclopropilmetilo, i- amilo, n-amilo o hexilo en la que W es arilo, heteroarilo, cicloalquilo, cicloheteroalquilo o C(R3R4Rs), cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido;

en la que Ra Rb: Rc y Rd son independientemente H, alquilo opcionalmente sustituido de uno a diez carbonos o tioalquilo opcionalmente sustituido de uno a diez carbonos; y

en la que R3, R4 y R5 son independientemente H, alquilo opcionalmente sustituido de uno a diez carbonos, arilo opcionalmente sustituido, cicloheteroalquilo opcionalmente sustituido de uno a diez carbonos o heteroarilo opcionalmente sustituido.
2. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que A y B son O.
3. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en el que X es NRb e Y es C(O) o C(S).
4. El compuesto para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, en el que Z es O o CHRd,

V es alquilo de uno a diez carbonos y en el que W es arilo o alquilo de uno a diez carbonos.
5. El compuesto para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que R1 es H y R2 es alquilo de uno a diez carbonos.
6. El compuesto para su uso segun la reivindicacion 1, en el que A es O, B es O o NRa, X es NRb e Y es C(O) o C(S) y W es arilo o alquilo de uno a diez carbonos.
7. Un compuesto para su uso segun la reivindicacion 1, con la condicion de que cuando V es metilo y W es fenilo, entonces Z es CHRd o NRd.
8. El compuesto para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1,2, o 4, en el que X es NRb e Y es C(O) o C(S).
9. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que A es O, B es O o NRa, X es NRb e Y es C(O) o C(S).
10. Una composicion farmaceutica para su uso en el tratamiento de inflamacion, artritis reumatoide, artrosis, asma, dermatitis, psoriasis, enfermedad del intestino irritable o una lesion en la medula espinal que comprende el compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.