JP2011135892A - ルシフェラーゼバイオセンサー - Google Patents
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Abstract
【解決手段】関心のある分子と相互作用するアミノ酸配列を含む挿入を含み、修飾に寛容性のある親甲虫ルシフェラーゼ配列の残基又は領域において環状置換された甲虫ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチド。前記ポリヌクレオチドによってコードされる修飾された甲虫ルシフェラーゼ。前記ポリヌクレオチドを細胞に形質導入し、細胞内の関心のある分子を検出する方法。
【選択図】なし
Description
本明細書で使用される用語「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」又は「核酸配列」は、ポリペプチド又はタンパク質前駆体の生産のために必要なコード配列を含む核酸、DNA又はRNAを指す。コードされたポリペプチドは完全長ポリペプチド、その断片(完全長より短い)、又は完全長ポリペプチド若しくはその断片と他のポリペプチドとの融合から生じる融合ポリペプチドであってもよい。
破壊されるなど修飾されても転写及び翻訳されたときに所望の、例えば容易に検出可能な遺伝子産物を生成することができるレポータータンパク質遺伝子内の部位及び/又は領域を特定するために、多数の方法が利用できる。例えば、1つ又は複数のアミノ酸残基のヌクレオチドをレポータータンパク質遺伝子に対して削除及び/又は挿入するために、増幅反応を使用することができる。或いは、挿入変異のライブラリーを調製するためにトランスポゾンを使用することができる。トランスポゾンは、原核生物及び真核生物のゲノムで見られる移動性のDNA配列である。トランスポゾン標識は、プライマー結合部位をランダムに分散し、遺伝子「ノックアウト」を作製し、物理的標識又は遺伝標識を大きな標的DNAに導入するための強力な研究手段として、長く認められてきた。本発明の修飾されたレポータータンパク質を調製するために有用なレポーター遺伝子内の挿入は、レポータータンパク質のコード領域内部のインフレーム挿入である。以下の実施例は例示のために示したものにすぎないが、レポーター遺伝子内の挿入に寛容性のある領域を特定するための、Tn5ベースの系(Epicentre、マジソン、ウィスコンシン州からのEZ:TN(商標))及びTn7ベースの系(GPS−M Mutagenesis System、New England Biolabs、Inc.)の使用を記載する。
頻繁に使われる転位系の1つは、グラム陰性菌から単離されたTn5系である。Tn5トランスポザーゼは、クローニングされ、高比活性に精製された小さな、単一のサブユニット酵素であり、宿主細胞因子を必要とせずに転位を実行する。さらに、標的DNAへのTn5トランスポゾンの挿入は非常にランダムであり、また単純な過程で進行する。Tn5トランスポザーゼは、その短い19の塩基対Mosaic End(ME)Tn5トランスポザーゼ認識配列の間に含まれるいかなるDNA配列も転位させる。EZ:TNインフレームリンカー挿入プロトコルの概要を図1に示す。
標的DNAの調製。標的レポーターDNAは、トランスポゾン遺伝子、例えばカナマイシン抵抗性遺伝子によってコードされていないものを選択する。トランスポゾン挿入反応は標的DNA調製物内の高レベルのRNA汚染によってかなり抑制されることはないが、標的DNAが標的転位の直接の競合者である染色体DNAによって高度に汚染されるならば、クローン数は減少する。プラスミド及びコスミドクローンは、標準の微小溶解手法によって精製することが可能であり、挿入反応で標的DNAとして使用することができる。BAC又はコスミドクローンなどの低いコピー数のベクターは、より高いモル比率の大腸菌染色体DNAによってしばしば汚染され、したがってトランスポゾン挿入頻度が低下する。したがって、挿入反応の前に染色体DNAを除去するためにBAC及びコスミドDNAを精製することが好ましい。
1.以下の順序で加えることによってトランスポゾン挿入反応混合物を調製する:
1μl 10×反応緩衝液
0.2μg 標的DNA*
xμl モル当量トランスポゾン
9μlの反応体積にxμlの滅菌水
1μl トランスポザーゼ
10μl 総反応体積
2.反応混合物を37℃で2時間インキュベートする。
3.μl停止液を加えて反応を止める。
混合して70℃で10分間加熱する。
反応混合物は−20℃で保存することができる。
形質転換及び回収。1回の反応で得られるトランスポゾン挿入クローンの数は、とりわけ使用されるコンピテント細胞の形質転換効率によって決まる。コンピテント細胞の形質転換効率がより高いほど、より多くの挿入クローンが得られる。ベクターの多量体形態を生成する可能性をなくすために、大腸菌のrecA−系統が好まれる。また、宿主系統はトランスポゾンで存在するいかなる抗生物質耐性マーカー、例えばカナマイシン抵抗性マーカーを発現してはならない。
1.挿入反応混合物の1μlを使用して、recA−大腸菌、例えばエレクトロコンピテント細胞を形質転換する。
2.エレクトロポレーションの直後にSOC培地を1mlの最終体積までエレクトロポレーションセルに加えることによって、エレクトロポレーションされた細胞を回収する。培地/細胞をピペットで穏やかに混ぜる。管に移して37℃の撹拌機で30〜60分間インキュベートして細胞成長を促進する。
1.細胞の一部を50μg/mlのカナマイシンを含んでいるLBプレート上で平板培養する。
2.トランスポゾン挿入効率を測定するために、形質転換反応の同一の希釈液及び希釈アリコートを、標的DNAを特異的に選択する抗生物質(例えば対照DNAでは100μg/mlのアンピシリン)を含んでいる第2のプレート上で平板培養する。転位頻度は、対照DNAのKanR/AmpRのクローン比率によって与えられる。
3.37℃で一晩プレートを増殖させる。1%のトランスポゾン挿入効率及び高純度の標的DNA(即ち染色体DNAの汚染がほとんど又は全くない)の使用を仮定すると、1プレートにつき約100〜500KanRクローンが存在する。
トランスポゾン挿入のマッピング。Tn5は、ランダムに標的DNAに挿入される。したがって、各クローンにおけるトランスポゾン挿入部位は、3つの方法の1つによって制限酵素消化、例えばNotI消化の前に決定しなければならない:
1.挿入クローンは、順方向及び逆方向のトランスポゾン特異プライマーを使用して二方向に配列決定をすることが可能である。各クローンの挿入部位も、配列決定の前にマッピングすることが可能である。
2.挿入部位は、コロニー微小溶解DNAをテンプレートとして使用して、PCR産物のサイズ分析によってマッピングすることが可能である。挿入部位をマッピングするために、順方向又は逆方向のトランスポゾン特異プライマー及びベクター特異フランキングプライマーを使用してもよい。
3.或いは、挿入部位は制限酵素消化物によってマッピングすることが可能である。
プライマーの考慮。プライマーは、通常使用されるクローニングベクターとの相同性を最小にするように構築されなければならず、また、各プライマーの配列は、ベクターとの配列相同性が極小になるように使用者の特定のクローニングベクターのそれと比較しなければならない。
GPS−M Mutagenesis Systemは、Tn7ベースのトランスポゾンをDNA標的にランダムに挿入するために、TnsABC*トランスポザーゼを使用する。標的DNAは、プラスミド、コスミド、BAC又は精製された染色体DNAであってもよい。挿入部位が翻訳される遺伝子セグメント内にあるならば、これは通常無効な(機能の損失)変異をもたらす。挿入に対しては最小限の部位による好みがあるので、任意の読取り枠の破壊は可能である。標的の免疫性のために、in vivoでは約190kbの範囲でDNA分子1つにつき挿入は1つだけ起こる。したがって、in vitro反応は、それぞれ異なる位置に転位因子を含む標的DNA分子の集団を生じる。
1.以下の試薬を混合する(20μl反応液あたり):
2μl 10×緩衝液
1μl スーパーコイルカスタム供与体(0.02μg)
0.08μg 標的DNA
dH2O
18μl 総体積
ピペット操作を2、3回行ってよく混ぜる。
2.1μlトランスポザーゼを各管に加える。再び混合する。
3.37℃で10分間インキュベートする。これは、集合反応である。
4.1μl開始溶液を各管に加える。ピペット操作を2、3回行ってよく混ぜる。
5.37℃で1時間インキュベートする。これは、鎖転移反応である。
6.75℃で10分間加熱不活化する。注:65℃は十分でない。
7.任意選択のギャップ修復。
8.5μl 10×Pl−SceI緩衝液を加える
0.5μl BSA
18.5μl dH2O
6μl Pl−SceI(VDE)(6単位)
9.37℃で1〜2時間インキュベートする。
10.75℃で10分間インキュベートする。
11.形質転換する。サブクローニング効率細胞(pUC1マイクログラムにつき107)による化学的形質転換のためには、非希釈反応液の1μl及び10μlを形質転換する。エレクトロポレーション(pUC1マイクログラムにつき>109)のためには、dH2Oで10倍に希釈して1μl及び10μlを形質転換する。増殖のためには、1mlのLBに又は製造業者の指示通りに形質転換混合物を希釈し、37℃で1時間通気下でインキュベートする。選択のないこの期間は、薬剤特にカナマイシンに対する耐性の発現のために必要である。
標的の量。標的DNAの推奨質量(1反応につき0.08μg)は、プラスミド標的に対して有効である。コスミド及びBACについては、2:1(供与体対標的)のモル比が有効である。比率を4:1に増やすと、僅かに効率が低下する。
7.フェノール/クロロホルム抽出(50μl)。
8.エタノール沈殿:
6μl 3M NaAcetate
100μl EtOH
−20℃で20分間インキュベートする
微量遠心管で10分間遠心分離する
9.15μl TEで再懸濁する。
10.1μl DNAポリメラーゼI(大腸菌)(10単位)
3μl 10×EcoPol緩衝液
9μl dNTP(各ヌクレオチド100μM;最終濃度それぞれ33μM)
11.室温で15分間インキュベートする。
12.1μl T4 DNAリガーゼ(400単位)及びATPを1mMの最終濃度まで加える。
13.16℃で4時間インキュベートする。
14.フェノール/クロロホルム抽出。
15.アルコール沈殿。
16.20μl TEで再懸濁する。
17.5μl OX Pl−SceI緩衝液を加える
0.5μl BSA
18.5μl dH2O
6μl Pl−SceI(VDE)(6単位)
18.37℃で1〜2時間インキュベートする。
19.75℃で10分間インキュベートする。
20.適当な方法によって形質転換する。
1.トランスポゾン供与体はスーパーコイルでなければならない。弛緩した又は線状の供与体を使用した反応の効率は、約100倍低下する。供与体の調製物は良質でなければならないが、CsCl精製は必要でない。
2.トランスポザーゼに必須の認識要素は必須である。終止コドンはトランスポゾンに読み込まれる全ての枠に存在してもよい。転写は外側から非必須領域へ容易に進行することが可能である。
3.転位効率は、トランスポゾンが長くなるに従い若干減少する可能性がある。
4.最良の結果のために、トランスポゾン供与体プラスミドは単量体であることを確認する。
5.供与体調製物が単量体且つスーパーコイルであり、また、供与体分子が宿主生物内で複製しないならば、Pl−SceI消化工程は省略してもよい。
配列決定をするためのプラスミド標的は、回収を容易にするために環状でなければならない。線状の(例えば、染色体の)DNAは、効率的な基質である。本来形質転換が可能な生物を使用するときは、修復及びライゲーション工程が形質転換の前に必要である。大きなプラスミド、例えばコスミド及びBACは使用可能な標的である。標的DNAは、1×TEのような無塩緩衝液では少なくとも5μg/mlでなければならない。濃度は、公知の濃度のDNAとのアガロースゲル帯強度の比較によって、又は、260における吸光度によって推定することが可能である。
一旦レポータータンパク質における修飾に寛容性のある部位又は領域が特定されるならば、その部位又は領域は1つ又は複数の残基の欠失、1つ又は複数の残基の挿入及び/又は環状置換又はその任意の組み合わせによって修飾することができる。一実施形態では、修飾は加水分解酵素、例えばそれには限定されないがプロテアーゼ、ペプチダーゼ、エステラーゼ(例えばコレステロールエステラーゼ)、ホスファターゼ(例えばアルカリホスファターゼ)などの認識部位の導入であってよい。例えば、加水分解酵素としてはそれには限定されないが、ペプチド結合に作用する酵素(ペプチドヒドロラーゼ)、例えばアミノペプチダーゼ、ジペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ及びトリペプチジルペプチダーゼ、ペプチジルジペプチダーゼ、セリン型カルボキシペプチダーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、システイン型カルボキシペプチダーゼ、ωペプチダーゼ、セリンエンドペプチダーゼ、システインエンドペプチダーゼ、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、トレオニンエンドペプチダーゼ及び未知の触媒メカニズムのエンドペプチダーゼがある。例えば、本発明の修飾された甲虫ルシフェラーゼは、エンテロキナーゼ切断部位、カスパーゼ切断部位、コロナウイルスプロテアーゼ部位(STLQ−SGLRKMA;配列番号10)、キナーゼ部位、HIV−1プロテアーゼ部位(SQNY−PIVQ又はKAVRL−AEAMS;それぞれ配列番号11及び配列番号12)、HCVプロテアーゼ部位(AEDVVCC−SMSYS;配列番号13)(例えばLeeら、2003年を参照)、SARSウイルスプロテアーゼ部位(例えばQTSITSAVLQSGFRKMAFPS;配列番号16又はVRQCSGVTFQGKFKKIVKGT;配列番号17)、ライノウイルスプロテアーゼ部位、例えば、ライノウイルス3Cプロテアーゼ部位、プロホルモンコンベルターゼ部位、インターロイキン16変換酵素部位、CMV集合部位、リーシュマンジシン(leishmandysin)部位、B.アントラシス(B.anthracis)致死因子、ボツリヌス神経毒素軽鎖プロテアーゼ部位、アミロイド前駆体タンパク質のためのβ−セクレターゼ部位(VKM−DAEF;配列番号14)、前立腺特異性抗原配列、トロンビン部位、レニン及びアンジオテンシン変換酵素部位、カテプシンD部位、マトリックスメタロプロテイナーゼ部位、uPA部位、プラスミン部位、カチオンのための結合部位、例えばカルシウム結合ドメイン、カルモジュリン結合ドメイン、セルロース結合ドメイン、キチン質結合ドメイン、マルトース結合タンパク質ドメイン又はビオチン結合ドメインを含むことができる。他の実施形態では、本発明の修飾されたレポータータンパク質は、リガンドによって認識される配列、例えば抗体、又はカルシウムのような金属を含んでもよい。
本発明は検出可能な活性、例えば発光活性を有するポリペプチドを提供する任意のアミノ酸配列を含んでいる修飾されたレポータータンパク質、並びに組換えにより又は合成的に合成されたそのタンパク質断片を含む。修飾されたレポータータンパク質のレポータータンパク質配列は、対応する修飾されていないレポータータンパク質のアミノ酸配列と同じか又は実質的に同じである。実質的に同じ配列を有するポリペプチド又はペプチドは、アミノ酸配列が完全にではないがほとんど同じであり、それと関連する配列の機能的活性を保持することを意味する。一般に、2つのアミノ酸配列は、それらが少なくとも70%同一であるならば、例えば少なくとも80%、90%、95%又はそれ以上の同一性を有する場合は実質的に同じ又は実質的に相同である。
(Wadaら、1990年)。
したがって、本発明の好ましい「ヒト化」合成の核酸分子は、増加した数の好ましいヒトコドンを有することによって野生型核酸配列と異なるコドン組成を有する。例えば、
又はそのいかなる組み合わせがある。例えば、本発明の核酸分子は、野生型核酸配列と比較して増加した数のCTG又はTTGのロイシンエンコーディングコドン、GTG又はGTCのバリンエンコーディングコドン、GGC又はGGTのグリシンエンコーディングコドン、ATC又はATTのイソロイシンエンコーディングコドン、CCA又はCCTのプロリンエンコーディングコドン、CGC又はCGTのアルギニンエンコーディングコドン、AGC又はTCTのセリンエンコーディングコドン、ACC又はACTのトレオニンエンコーディングコドン、GCC又はGCTのアラニンエンコーディングコドン、或いはその任意の組み合わせを有することができる。同様に、植物においてより高頻度に使用されるコドンをより多く有す核酸分子は、増加した数の植物コドンを有することによって野生型核酸配列と異なるコドン組成を有し、このようなコドンとしては、それには限定されないが、
又はその任意の組み合わせがある(Murrayら、1989年)。好ましいコドンは、植物の種類が異なれば異なってもよい(Wadaら、1990年)。
修飾されたレポータータンパク質をコードする本発明のポリヌクレオチドは、他の核酸配列、例えばcDNAなどの未変性の配列、又はN末端、C末端又はN及びC末端の融合タンパク質、例えば選択可能なマーカーを含む異なるレポーター遺伝子によってコードされるタンパク質との融合を調製するためにin vitroで操作されたものと一緒に使用することができる。適当な融合パートナーの多くの例は当技術分野で公知であり、本発明の実施で使用することが可能である。
修飾されたレポータータンパク質又はその融合物をコードする望ましい核酸分子が一旦調製されると、その修飾されたレポータータンパク質又はその修飾されたレポータータンパク質を含んでいる融合タンパク質をコードする発現カセットが調製される。例えば、修飾された甲虫ルシフェラーゼをコードする核酸配列を含んでいる核酸分子は、発現カセットを形成するために任意選択に転写調節配列、例えば1つ又は複数のエンハンサー、プロモーター、転写終結配列又はその組み合わせと作動可能的に結合される。核酸分子又は発現カセットは、プラスミド又はウイルスベクターなどの任意選択に選択可能なマーカー遺伝子を含んでいるベクターに導入し、このベクターを関係する細胞、例えば大腸菌、ストレプトミセス属、バシラス属、スタフィロコッカス属などの原核細胞、並びに植物(双子葉植物又は単子葉植物)、真菌、酵母、例えばピチア、サッカロミセス又はシゾサッカロミセス属、或いは哺乳類細胞などの真核細胞に導入することができる。好ましい哺乳類細胞としては、ウシ、ヤギ、羊、イヌ、ネコ、サルなどヒト以外の霊長類、及びヒトの細胞がある。好ましい哺乳動物細胞系には、それには限定されないが、CHO、COS、293、Hela、CV−1、SH−SY5Y、HEK293及びNIH3T3細胞が含まれる。
修飾されたレポータータンパク質又はその融合物は任意の目的、例えばそれには限定されないが、特定分子の量及び存在の検出(バイオセンサー)、特定分子の単離、特定分子の高次構造の例えば結合、リン酸化又はイオン化による変化の検出、pH又は温度などの条件の検出、高スループット又は低スループットのスクリーニングの促進、タンパク質−タンパク質、タンパク質−DNA又は他のタンパク質ベースの相互作用の検出、或いはバイオセンサーの選択又は開発などのために有用である。例えば、修飾されたレポータータンパク質又はその融合物は以下のために有用である。例えばin vitro又は細胞ベースのアッセイにおける特定のキナーゼ(例えば、キナーゼ部位をレポータータンパク質に挿入することによる)、RNAi(例えば、RNAiによって認識されることが疑われる配列をレポータータンパク質のコード配列に挿入し、次にRNAiを添加した後にレポーター活性を監視することによる)、又はプロテアーゼの量、存在又は活性の検出であり、例えば特定のウイルスプロテアーゼの存在を検出するためのものがあり、これは今度はウイルス又は抗体の存在の指標となる;阻害剤、例えばプロテアーゼインヒビターのスクリーニング;認識部位の特定、又は例えば選択された認識配列を有する修飾されたルシフェラーゼ又は単一の関心のある分子を有する異なる複数の配列若しくは複数の(例えばライブラリー)分子を有する修飾されたルシフェラーゼのライブラリーを使用した基質特異性の検出;バイオセンサー又は関心のある分子、例えばプロテアーゼの選択又は開発;或いは、in vitro又は細胞ベースの方法による相補性又は結合を通したタンパク質−タンパク質相互作用の検出。一実施形態では、挿入を含む修飾された甲虫ルシフェラーゼが分子のランダムなライブラリー又は変異ライブラリーと接触させられ、その挿入と相互作用する分子が特定される。他の実施形態において、複数の挿入を有する修飾されたルシフェラーゼのライブラリーが分子と接触させられ、その分子と相互作用する修飾されたルシフェラーゼが特定される。
A.トランスポゾン挿入反応
標的DNAの調製。コメツキムシルシフェラーゼ遺伝子(cbg69)を大腸菌T7発現ベクターにクローニングし、得られたプラスミド(pJLC1)をトランスポゾン突然変異反応のために標的DNAとして使用した。
In Vitroトランスポゾン挿入反応。複数の挿入事象を最小にしてトランスポゾン挿入の効率を最大にするために、反応条件を最適化した。例えば、等モル量のトランスポゾンをそのモル数の標的DNAに加えた。
1μl 10×反応緩衝液
0.35μg 標的DNA(pJLC1)(7μl)
1μl モル当量トランスポゾン
1μl トランスポザーゼ
10μl 総反応体積
2.反応混合物を37℃で2時間インキュベートする。
3.1μl停止液を加えて反応を止める。
混合して65℃で15分間加熱する。
反応混合物は−20℃で保存した。
形質転換及び回収。1回の反応で得られるトランスポゾン挿入クローンの数は、とりわけ使用されるコンピテント細胞の形質転換効率によって決まる。コンピテント細胞の形質転換効率がより高いほど、より多くの挿入クローンが得られる。大腸菌のrecA−系統(EpicentreからのEC100コンピテント細胞)を形質転換のために使用した。
3.挿入反応混合物の1μlを使用して、EC100エレクトロコンピテント細胞へ形質転換する。
4.エレクトロポレーションの直後にSOC培地を1mlの最終体積までエレクトロポレーションセルに加えることによって、エレクトロポレーションされた細胞を回収する。培地/細胞をピペットで穏やかに混ぜる。管に移して37℃の撹拌機で30〜60分間インキュベートして細胞成長を促進する。
5.細胞の一部を50μg/mlのカナマイシンを含んでいるLBプレート上で平板培養する。
6.37℃で一晩プレートを増殖させる。
luc遺伝子内に挿入を有するクローンは、プラスミド骨格に挿入を有するものから分離する必要がある。このため、全ての形質転換体をプールして、プラスミドDNAを精製した。トランスポゾン挿入を有するcbg69遺伝子を含んでいるDNAフラグメントを放出するために、得られたプラスミドDNAを一対の制限酵素(例えばNdeI及びEcoRI)で消化した。このDNAフラグメントはトランスポゾン挿入を含まない大腸菌T7発現ベクターのそれぞれの制限酵素部位に再クローニングし、Tn5挿入を有するluc遺伝子を含んでいるプラスミドライブラリーを得た。
Tn5トランスポゾンの除去。一旦トランスポゾン挿入を有するluc遺伝子のプラスミドライブラリーが作製されたならば、制限酵素、例えばNotIによる消化によってTn5トランスポゾンを除去した。線状にされたDNAは、アガロースゲル電気泳動によってTn5を含んでいるDNA断片から分離し、次に精製した。
市販のキット(New England Biolabs(NEB)からのGPS(商標)−M GPS Mutagenesis System)を使用して、Tn7ベースのトランスポゾンをホタルルシフェラーゼDNAにランダムに挿入した。この挿入断片の大部分を次に制限酵素消化により切り取り、再連結によって5アミノ酸の挿入を得た。最初に、コロニーを増殖させて切り取りの前にルシフェラーゼ活性の消失についてスクリーニングした。ルシフェラーゼ活性を有していた培養物内のプラスミドを次に切り取り、細胞へ形質転換で戻し、ルシフェラーゼ活性の復活がないかコロニーを調べた。その後、ランダム位置に大きな挿入を含んでいるゲル精製ルシフェラーゼ断片がベクターにクローニングされ、ベクター集団の大量切り取りが実施されたより効率的な方法が使用された。ここで、切り取られたベクターによる形質転換の後にルシフェラーゼ活性を発現したコロニーを選択した。トランスポゾンはカナマイシン耐性を有していたので、挿入を含まないベクター分子を除去することが可能であった。
カナマイシン耐性遺伝子を有するpGPS5(NEB)は供与体プラスミドであり、アンピシリン耐性遺伝子を有するpSP−Luc+(Promega Corp.)は受容体であった。転位が成功すると、受容体プラスミドにカナマイシン耐性カセットが挿入された。反応体をピペット操作で混合し、次にTnsABC Transposaseの1μlを加えて反応体を更に混合した。反応体は、37℃で1時間インキュベートし、75℃で10分間加熱してから氷上に置いた。次に5μlを100μlの高効率コンピテント大腸菌JM109(Promega Corp.)に形質転換した。氷上での10分間のインキュベーションの後、細胞を42℃で45秒間の温熱ショックで処理し、次に氷上で2分間インキュベーションした。1mlのLuria Broth(LB)を次に加え、細胞を37℃で1時間振盪した。次に、40μlずつを100μg/mlのアンピシリン及び25μg/mlのカナマイシンを含んでいるLB寒天プレート上で平板培養した。
インキュベーションは37℃で1時間であった。次に反応体を65℃で20分間加熱して制限酵素を不活性化し、ライゲーション反応を下記のように組み立てた。
1μl 上の反応液
3μl 10×リガーゼ緩衝液(Promega)
1μl 3 U/μl T4 DNAリガーゼ(Promega)
25μl H2O
30μl
ライゲーションは16℃で少なくとも2時間インキュベートし、次に先に述べたように3μlをJM109に形質転換した。各形質転換の50μlをLB/ampプレート又はこれらのプレートの上に重層されたニトロセルロースフィルター上に平板培養した。37℃で一晩増殖させた後に、フィルターを取り出して40℃にセットしたスライドウォーマー(Fisher Scientific)上のpH5.5の100mMクエン酸ナトリウム中の1mMルシフェリン溶液の1mlの上に置いた。部屋を暗くし、フィルターの発光を観察した。輝くのが観察されたピックからのコロニーはLB/ampプレートから成長させ、プラスミドを単離し、次に制限酵素切断及びシークエンシングによって分析した。大きなカナマイシン挿入断片の切り出しの後、単一のPmeI部位が挿入部位に残る。したがって、PmeI及び他の制限酵素による切断は、挿入部位のマッピングを可能にする。
2μl 0.25μg/μl pGEM−3Z−luc−kanライブラリー
2μl 10×緩衝液C(Promega)
1.5μl 10 U/μl PmeI(NEB)
14.5μl H2O
20μl
この反応体を37℃で1時間インキュベートし、次に65℃で20分間加熱して下記のように連結した。
2μl 上記消化液
3μl 10×リガーゼ緩衝液(Promega)
1μl 3 U/μl T4 DNAリガーゼ(Promega)
24μl H2O
30μl
ライゲーション反応体を16℃で一晩インキュベートし、次に個々のコロニーを得るためにコンピテントなJM 109に形質転換した。アンピシリンのみ又はアンピシリンとカナマイシンの両方を含んでいるプレート上に平板培養することによって、アンピシリンプレート上の形質転換体の約90%はカナマイシンに感受性であり、したがって挿入断片の切り取りに成功したと推測することができた。個々のコロニーを3mlのLB+100μg/mlアンピシリンで培養し、培養物のルシフェラーゼ活性を分析した。
第1の方法については、培養物の約20%はルシフェラーゼ活性が大きく低下しており、このことはトランスポゾンがpSP−Luc+プラスミド内のルシフェラーゼコード領域に挿入されていることと一致している。第2の方法については、個々のコロニーからの培養物の約15%でかなりの活性が観察された。プラスミドは活性のある培養物から調製され、PmeI部位挿入断片のおおよその位置を特定するために制限マッピングを実施した。次にこれらの試料に対して、アイオワ大学DNAシーケンシング施設で標準のジデオキシ配列決定法を実施した。活性クローンの約半分は、ルシフェラーゼコード領域の直ぐ外側に挿入断片を含んでいた。残りは、コード領域内の様々な場所に挿入断片を有していた。上で議論した2つの異なる方法からの結果を合わせたものを下で提示するが、挿入の位置及び残存している活性のおおよその割合が示されている。
トランスポゾン突然変異研究によって特定された位置に関係する様々な部位を都合よく挿入するために、コメツキムシルシフェラーゼ遺伝子(cbg69)を修飾して、ヒンジ領域をコードする配列に連続している2つの独特の制限酵素部位、SnaBI(TACGTA)及びSalI(GTCGAC)を生成した。具体的には、2つのオリゴヌクレオチド:
を使用してGeneEditor(Promega)によるcbg69遺伝子の修飾を実施した。得られたコメツキムシルシフェラーゼCbg69ssはIle409のValへの1アミノ酸置換を有し、野生型Cbg69の2倍の活性を示すことが明らかになった。Cbg69ssを有すプラスミド(pJLC1ss)は、ヒンジ領域に修飾を有する他のルシフェラーゼを生成するためのテンプレートとして使用した。
そのために、以下のオリゴヌクレオチド対を合成した:
各オリゴヌクレオチドは、以下の反応条件を使用してリン酸化した。
オリゴヌクレオチド 30pmol
10× T4ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液 2.5μl
10mM ATP 2.5μl
T4オリゴヌクレオチドキナーゼ(1μ/μl) 0.5μl
水 25μlまで
37℃で30分間インキュベートし、70℃で10分間不活性化する。
A.コメツキムシルシフェラーゼを残基400の後で修飾してカスパーゼ−3認識部位(DEVD)を含むようにし、Cbg69DEVDが得られた。Cbg69ss及びCbg69DEVDは細菌宿主で発現された。細菌溶解物をカスパーゼ−3の様々な量(0、6.25、12.5、25、50、100又は200ng)或いは200ngのカスパーゼ−3及び0.1mMカスパーゼ阻害剤Ac−DEVD−CHOと混合し、ルシフェラーゼ活性を監視した。図5Aは、カスパーゼ−3濃度の上昇に従って、Cbg69ssのそれではなくCbg69DEVDの活性が減少したことを示す。さらに、カスパーゼ阻害剤の存在下では活性低下は観察されなかった(図5B)。さらに、ルシフェラーゼ活性は時間と共に低下した(図5C)。
ホタルルシフェラーゼのアミノ酸233及び541の後の5アミノ酸挿入は酵素活性の最大分画を保持していた(実施例2)ので、それらの部位を詳細解析のために選択した。プロテアーゼによる切断の後のルシフェラーゼ活性に対する影響を検討するために、GeneEditor(商標)in vitro Site−Directed Mutagenesis System(Promega Corp.)を使用してin vitro突然変異誘発を行い、これらの部位にプロテアーゼ切断部位を挿入した。先ず、標準の手法を使用してルシフェラーゼ遺伝子を発現ベクターpRSET−B(Invitrogen)のNcoI及びHindIII部位の間にクローニングした。luc+遺伝子(図7Aで示すタンパク質配列をコードする)をNcoI−EcoRV断片上でpSPLuc+から切り取り、HindIII部位を埋めて平滑末端にした後にpRSET−B内のNcoI及びHindIIIの間にクローニングした。この構築物は、ルシフェラーゼアミノ酸配列をアミノ末端6Xヒスチジンタグと融合させる。
のオリゴヌクレオチドを使用した。プラスミドテンプレートを先ず下記のように変性した。
この混合物を室温で5分間インキュベートし、次に2μlの2M酢酸アンモニウム及び75μlの95%エタノールを加え、得られた混合物を−20℃で30分間インキュベートした。次に混合物を最高速度の微量遠心機により4℃で5分間遠心分離した。ペレットを次に−20℃の70%エタノール150μlを用いて洗浄し、2分間遠心分離にかけ、減圧下乾燥し、100μlのTEに溶かした。突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを、変性させたテンプレートに以下の反応でアニールさせた:
10μl 変性テンプレート(上記)
1μl 2.9ng/μl上部鎖選択オリゴヌクレオチド(0.25pmole)
1μl 28ng/μl上記突然変異誘発性オリゴヌクレオチド(1.25pmole)
2μl アニーリング 10×緩衝液
6μl H2O
20μl
このアニーリング反応体を75℃の水200mlを含んでいるビーカーに置き、次にその水の中で37℃に冷却させた。次に以下の成分を添加した。
5μl H2O
3μl 10×合成緩衝液
1μl 7.7 U/μl T4 DNAポリメラーゼ
1μl 3 U/μl T4 DNAリガーゼ
30μl
この反応体を37℃で90分間インキュベートし、その後GeneEditor(商標)技術マニュアルで記載されているように反応体の5μlをコンピテントなBMH 71−18 mutSに形質転換した。その翌日、得られた培養物からプラスミドを調製してJM109に再度形質転換した。得られた個々のコロニーを拾い、増殖させ、プラスミドを調製した。突然変異体のスクリーニングは、BanII及びSphIでプラスミドを消化し、エチジウムブロミドで染色した6%ポリアクリルアミドゲル(Novex、Invitrogen)上で生成物を電気泳動にかけることによって実施した。消化物は野生型遺伝子(WT)の場合は361bpの断片を生じ、エンテロキナーゼ部位を含んでいる挿入突然変異体では376bpの断片を生じる。このようにして特定された突然変異体は、次に配列決定をすることによって確認された。この実験では、7/8のクローンが所望の挿入を含んでいた。
を有する突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを利用して上のように実施した。
エンテロキナーゼ(EKMax)及びその10×緩衝液は、Invitrogenから入手した。反応体は室温でインキュベートし、15分時及び30分時に反応体の1μlを100μlのLuciferase Assay Reagent(Promega Corp.)に加えた。各試料は、次にTurner20/20照度計で読み取った。
これからは、以下のデータが得られた:
Gly(3)Asp(4)LysGly(3)部位を有する修飾されたタンパク質をエンテロキナーゼで処理すると、ルシフェラーゼ活性は50〜100%増加することがわかった(図7B)。対照的に、エンテロキナーゼはWT酵素の活性に対して影響を及ぼさなかった。したがって、修飾されたルシフェラーゼ骨格のニッキングは、酵素活性を破壊しなかった。さらに、挿入断片のアミノ酸配列は修飾されたタンパク質に対してプロテアーゼによるニッキングにより軽減されるストレスを起こすこともあり、その結果酵素活性が増加する。
であった。pRSET−B−Luc+を開始プラスミドとして使用することより、上のように突然変異誘発を実施した。この場合、得られた突然変異体プラスミドは、ウサギ網状赤血球(Promega TnT(登録商標)Coupled Reticulocyte Lysate System)を使用してin vitroで、以下のような反応で翻訳した;
反応体は、30℃で1時間インキュベートしてから、下の通りエンテロキナーゼ(EKMax、Invitrogen)で処理した:
エンテロキナーゼを加える前に、次にプロテアーゼ添加後の様々な時間に室温で、100μlのLuciferase Assay Reagent(LAR)で1μlを分析した。得られたデータは、図7Cで示す。WT酵素の活性はプロテアーゼの影響を受けなかったが、修飾された酵素はプロテアーゼ処理で不活性化された。
in vitro又はin vivoプロテアーゼアッセイで有用なルシフェラーゼチモーゲンを調製するために、また、特定のタンパク質分解、例えばアポトーシスによって引き起こされるかそれに依存する細胞事象を監視する際に、Lys541(550のアミノ酸のうち)の後に挿入された9のアミノ酸を有するホタルルシフェラーゼ突然変異体を構築した。この9つのアミノ酸は5残基のエンテロキナーゼプロテアーゼ部位をコードし、その後に2つのグリシン、次に(DDDDKGGDI;配列番号58)をクローニングするためのEcoRV部位をコードする2つのアミノ酸が続いた。ベクターは、遺伝子の3’末端の外側に、クローニング部位として使用されたEcoRI部位も有していた。この塩基構築物によって特定されたタンパク質がエンテロキナーゼで切断されると、カルボキシ末端の9アミノ酸が除去され、約10%のWT酵素活性を有する酵素が生成された。大腸菌DNAのEcoRV及びEcoRI断片のライブラリーを、基礎ベクター内のこれらの部位の間にクローニングした。100コロニーを選んでルシフェラーゼ活性を分析した。7コロニーは、WTと比較して活性が100〜1000倍低下していることがわかった。これらの7コロニーを培養してプラスミドを調製した。プラスミドは、それぞれ大きさが約0.2から3kbの大腸菌DNAの挿入断片を含むことがわかった。これらのプラスミドをTNTウサギ網状赤血球溶解物内で翻訳すると、分子量のより高いルシフェラーゼをコードすることがわかった。タンパク質の1つのエンテロキナーゼ切断により、ルシフェラーゼ活性が最大で40倍増加することがわかった。最大の活性化を示す修飾されたタンパク質は分子量が約68kDであり、約60の残基がルシフェラーゼに追加されてチモーゲンを形成していることを示している。
Plainkumら(2003年)は、新しいN及びC末端及び元のN及びC末端を連結するプロテアーゼ認識部位を含んでいるペプチドリンカーを有するリボヌクレアーゼAの環状置換形態は、活性部位の位置的閉塞のためにリボヌクレアーゼ活性が低下したことを報告した。Plainkumらは、プロテアーゼによる環状置換リボヌクレアーゼAの切断は、恐らく活性部位の障害を除去することによってタンパク質の活性を増加させることを明らかにした。
頭−尾結合(head to tail)luc+二量体は、次のように構築した。ベクターpSPLuc+(Promega Corp.)をNcoIで消化し、T4 DNAポリメラーゼを使用して末端を埋め、平滑末端線状化ベクターはEcoRIで消化した。受容媒体の役目を果たすために、pSPLuc+はXbaIで消化し、T4 DNAポリメラーゼを使用して末端を埋め、次にEcoRIで消化した。第1の消化物からのルシフェラーゼ断片をこのベクターにクローニングし、同じベクター内の2つのluc+遺伝子の頭−尾結合配列を得た。具体的には、pSPLuc+は次のような反応で消化した。
反応体は、37℃で1時間インキュベートし、65℃で15分間加熱してから氷上で短時間冷却した。次に、5μlの10mM dNTP及び1μlの9U/μl T4 DNAポリメラーゼ(Promega Corp.)を加えて、反応体を37℃で20分間インキュベートした。Wizard Clean−Upキット(Promega Corp.)を使用して反応体を精製した。Clean−Up樹脂からの50μlにおける65℃での溶出の後、混合物を冷却し、DNAは5μlの10×緩衝液H(Promega Corp.)及び1μlの12U/μl EcoRI(Promega Corp.)を加えることによって消化した。反応体は、37℃で1時間インキュベートし、次に65℃で15分間加熱した。受容ベクターは、次に以下のように調製した。
上の反応体を37℃で1時間インキュベートし、次にPromega Wizard Clean−Upキットを使用して精製し、溶出は65℃の50μl中で行った。以下を精製したDNAに加えた。
反応体は、37℃で20分間インキュベートし、次に上で述べたように精製した。5μlの10×緩衝液H及び1μlの12U/μl EcoRIを、Clean−Up樹脂からの溶出液に加えた。反応体は、37℃で1時間インキュベートし、次に65℃で15分間加熱して制限酵素を不活性化した。このDNAを次に下の通り上記の消化したDNAと混合した:
15μl XbaI切断、埋める、EcoRI切断、pSPLuc+加熱
25μl NcoI切断、埋める、EcoRI切断、pSPLuc+加熱
5μl 10×リガーゼ緩衝液(Promega Corp.)
2μl 3U/μl T4 DNAリガーゼ
16℃で一晩のライゲーションの後、1μlを高効率コンピテント大腸菌JM109(Promega Corp.)に形質転換し、細胞をLB/ampプレートに平板培養した。正しい大きさのプラスミドを含んでいる形質転換体を特定した。それらの形質転換体を展開し、そこからプラスミドを単離し、制限酵素消化によってプラスミドの同一性を確認した。
上流側プライマー
下流側プライマー
増幅反応は、次の通りであった。
5μl 10×PfuUltra緩衝液(Stratagene)
1μl 10mM dNTP
1μl 5ng/μl 上のLuc+二量体構築物DNA
1μl 100ng/μl 上流側プライマー
1μl 100ng/μl 下流側プライマー
40μl H2O
49μl
反応体を混合し、鉱油を重層し、95℃のPE480サーマルサイクラーに入れた。この温度で2分後に、1μlの2.5U/μl PfuUltra DNAポリメラーゼ(Stratagene)を加え、95℃で30秒、50℃で30秒、72℃で1分のサイクルを20回繰り返し、その後ブロックを4℃にした。完了した反応体は次にPromegaのWizard PCR Prepsキットを使用して精製し、Wizard樹脂から50μlのH2Oで溶出した。生成物に取り込まれたPCRプライマーは、NdeI(上流側プライマー)又はBamHI(下流側プライマー)のための部位を有する。PCR産物をこれらの酵素で消化し、下の通りT7発現ベクターpET−3a(Novagen)にクローニングした。
5μl 10×リガーゼ緩衝液
20μl 溶出1
10μl 溶出2
2μl 3U/μl T4 DNAリガーゼ
13μl H2O
50μl
ライゲーション反応体を16℃で2時間インキュベートし、次に5μlをコンピテントなJM109に形質転換し、細胞をLB/ampに平板培養した。適当な大きさのプラスミドを含んでいるコロニーを展開し、プラスミドを調製し、正しく挿入されているかについて各調製物を制限消化により確認した。プラスミドはPCR産物の挿入を含んでいるのがわかったので、これは、終止コドンが除かれ2つのルシフェラーゼ遺伝子部分を分けている接合部でC及びN末端を連結している、in vitro突然変異誘発のための基礎ベクターとして使用した。
突然変異誘発手順の第2回目の形質転換からの6コロニーを個々に増殖させて、それらからプラスミドを調製した。これらのプラスミドは、TnTウサギ網状赤血球溶解物(Promega Corp.)内での共役転写/翻訳による突然変異誘発性オリゴヌクレオチドの取り込みについてスクリーニングした。正しい突然変異体は、ルシフェラーゼドメインのC及びN末端が融合し、完全長ルシフェラーゼタンパク質を生成した。翻訳反応は、次のように実施した。
25μl TnTウサギ網状赤血球溶解物
2μl TnT反応緩衝液
1μl T7 RNAポリメラーゼ
1μl 完全アミノ酸配合
1μl Fluorotect Lys tRNA
1μl 40U/μl rRNasin
5μl ミニプレップDNA
14μl
50μl
翻訳反応体は、30℃で60分間インキュベートしてから、下の通りエンテロキナーゼ(EK)(EKMax、Invitrogen)で処理した(又は処理しなかった)。
2μl 10×EKMax緩衝液
5μl 上の翻訳反応体
+/−1μl 1U/μl EKMax
12μl H2O
20μl
これらの消化は室温で30分間行われ、その後1μlを100μlのルシフェラーゼ検定用試薬(Promega Corp.)に加えて検定した。データ収集は、Turner20/20照度計で行った。5μlの4×SDS試料緩衝液を各反応体の残りに加え、試料を65℃で2分間加熱した。次に試料を4〜20%Novexトリス−グリシンゲルで電気泳動にかけ、ゲルは高感度のMolecular Dynamics FluorImagerでスキャンした。結果は、融合した完全長タンパク質は6クローンの内の2つで形成されたことを示し、突然変異誘発が成功したことを示した。さらに、融合した変異タンパク質の活性は、エンテロキナーゼによる処理で約150倍増加した。さらに、ゲルは、プロテアーゼが完全長タンパク質を消化して断片化したことを示した。
10μl 2×カスパーゼ緩衝液
5μl in vitro翻訳タンパク質
1μl 希釈カスパーゼ−3
4μl H2O
20μl
反応体は9.6から2333pgのカスパーゼ−3を含み、これらは室温で90分間インキュベートし、その後1μlを取り出して100μlのルシフェラーゼ検定用試薬に加え、Turner 20/20照度計で読み取った。図9Aは、得られたデータを示す。プロテアーゼの低量点を再プロットすると(図9B)、このアッセイで低ピコグラムのカスパーゼ−3を検出することができることが示される。さらに、インキュベーション時間を90分から一晩に長くすると、アッセイの感度は更に4倍高まった(データは示さず)。
25μl TnT T7 WG抽出物
2μl TnT反応緩衝液
1μl T7 RNAポリメラーゼ
1μl アミノ酸配合
1μl 40U/μl rRNasin
5μl 50ng/μlルシフェラーゼプラスミド
15μl H2O
50μl
反応体は30℃で90分間インキュベートした後、以下の通りプロテアーゼで消化した。
10μl 2×緩衝液(100mM HEPES pH7.5、200mM NaCl、0.2%CHAPS、2mM EDTA、20%グリセリン、20mM DTT)
10μl in vitro翻訳反応体
1μl 1U/μl EKMax又は1μl 100U/μl カスパーゼ−3
A.PSAは、配列Ala−Asn−Lys−Ile−Ser−Tyr−Gln−Ser−Ser−Ser−Thr−Glu(配列番号21)内のGln及びSerの間でSemenogelin Iを切断するプロテアーゼである。PSAの切断基質を有する修飾されたルシフェラーゼを生成するために、関連する12量体ペプチドAla−Asn−Lys−Ala−Ser−Tyr−Gln−Ser−Ala−Ser−Thr−Glu(配列番号22)のオリゴヌクレオチドを、実施例6で記載したプラスミド構築物内のXhoI及びNcoI部位の間にクローニングした。以下の配列
を有するオリゴヌクレオチドを、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした。
ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドはXhoI及びNcoI適合末端を有する二本鎖断片を生成するが、NcoI部位は改造されているのに対してXhoI部位は破壊されている。ベクターをXhoI及びNcoIで消化してアニールしたオリゴヌクレオチドに連結し、次に大腸菌に形質転換した。ミニプレップDNAを個々のコロニーから調製し、プロテアーゼ部位を含んでいるオリゴヌクレオチドの取り込みを示す、XhoIではなくNcoIによる消化についてプラスミドをスクリーニングした。所望の構築物はコムギ胚(WG)翻訳抽出物又はウサギ網状赤血球溶解物内でin vitroで翻訳し、得られたタンパク質は精製PSA(シグマ)で処理した。翻訳を実施した。開裂反応は以下の通り実施した。
反応体は室温で20分又は40分間インキュベートした。各反応の1μlを100μlのルシフェラーゼ検定用試薬(LAR)に加え、光出力をTurner20/0照度計で記録した。下記データを得た。
PSAの添加は、光出力の実質的な増加をもたらした。20分時には、修飾されたルシフェラーゼの活性化倍率はウサギ網状赤血球溶解物内で合成された修飾されたルシフェラーゼの場合は658倍であり、コムギ胚抽出物で合成された修飾されたルシフェラーゼの場合は1,110倍であった。
を有していた。これらのオリゴヌクレオチドのアニーリングはXhoI及びNcoI適合末端を有する二本鎖断片を生成し、XhoI部位は保持されているのに対してNcoI部位は破壊されている。上記の例の場合のように、アニールされたオリゴヌクレオチドは、XhoI及びNcoIで切断されたベクターにクローニングされた。所望のクローンの濃縮のために、形質転換の前にライゲーション混合体をNcoIで再切断した。所望のプラスミドを選択して、前記したようにウサギ網状赤血球溶解物内でin vitro翻訳を行った。消化反応体は、以下の通り調製した。
反応体は室温でインキュベートし、その後様々な時間で1μlを100μlのLARに加え、試料をTurner 20/20照度計で読み取った。以下のデータが生成された。
PreScissionプロテアーゼによるルシフェラーゼの活性化は速やかに起こり、プロテアーゼの存在下で4,000倍を超える発光の増加をもたらした。
5μl 10×PfuUltra緩衝液
1μl 10mM dNTP
1μl 5ng/μlカスパーゼ−3部位プラスミド
1μl 100ng/μl 上流側オリゴヌクレオチド
1μl 100ng/μl 下流側オリゴヌクレオチド
40μl H2O
50μl
1μlの2.5μ/μl PfuUltra DNAポリメラーゼ(Stratagene)を加えてPCRを開始し、95℃で30秒、50℃で30秒、72℃で1分のサイクルを20回繰り返し、その後4℃にした。
下流側オリゴヌクレオチドはEcoRI部位を含み、下記配列を有す
得られたPCR産物はEcoRI及びBamH1で消化し、ベクター内のこれらの部位の間にクローニングすると、GSTとルシフェラーゼとのインフレーム融合がもたらされる。所望のプラスミドを特定し、大腸菌系統Rosetta(Novagen)に形質転換した。細胞をLB培地で増殖させ、IPTGを1mMまで添加することによって誘導した。最良の増殖条件は25〜26℃で一晩の誘導であることが明らかになった。細胞を収集して超音波処理で溶解した。遠心分離による清浄の後、上清を固定化グルタチオンを含んでいるカラムに加え、遊離のグルタチオンを含んでいる緩衝液で溶出した。融合タンパク質の収率は、初期の培養物1リットルにつき約1ミリグラムであった。カスパーゼ−3による活性化は、活性化反応の条件に従い約1,200倍以上で、最高50,000倍(氷上で一晩の活性化)であった。
であり、これは第1のドメインのC末端から6アミノ酸を除去し、第2のドメインのN末端から3アミノ酸を除去する。SARSウイルスN末端の自己切断部位は、SITSAVLQSGFRKMA(配列番号53)である。この配列を規定しているオリゴヌクレオチドは、次のように設計された。
アニールされたオリゴヌクレオチドはNcoI部位を保持し、XhoI部位を欠く。アニールされ消化されたオリゴヌクレオチドは、上記したように基礎ベクターにクローニングした。
得られた構築物は、一般式ANNATGGの最適コザック配列を有していた。DNAは、TransFast形質移入試薬(Promega)を使用してHela細胞に形質移入し、DMEM+10%Cosmic Calf Serum中の1μg/μlのTRAILタンパク質(Biomol)を加えることによりアポトーシスを開始した。一部のウェルを、初期SV40プロモーター/エンハンサーの制御下の天然のホタルルシフェラーゼ遺伝子(非置換)を運ぶプラスミドpGL3−controlで形質移入した。示された時間に100μlのBright−Glo試薬をウェルに加え、Orion照度計(0.5秒の読取り)で発光を記録した。
分子内制御をコードし、カスパーゼ−3活性を検出するベクターを提供するために、本発明の融合タンパク質をコードするベクターを調製した。Renillaルシフェラーゼ(対照)を、残基400の後にDEVDを含んでいる修飾されたコメツキムシルシフェラーゼ(Cbg69DEVD)のN末端又はC末端に融合した。リンカー配列(Gly(2)SerGly(4)SerGly(4)SerGly(2))を2つのタンパク質の間に置いた。
を使用してプラスミドpJLC6から完全長Renillaルシフェラーゼ遺伝子(rLuc)を増幅した。得られたPCR断片をNdeI及びAseIで消化して、Cbg69DEVDをコードするpJLC23のNdeI部位にクローニングした。
を使用してプラスミドpJLC23から完全長Cbg69DEVD遺伝子を増幅した。得られたPCR断片をNdeI及びAseIで消化して、rLucを含んでいるpJLC6のNdeI部位にクローニングした。
一実施形態では、本発明は、ルシフェラーゼの2つの独立した断片が互いに相補して機能性タンパク質を生成することのできる系を提供する。
ルシフェラーゼのN及びC末端の断片の、in vitro及びin vivoで結合して機能性ルシフェラーゼタンパク質を形成する能力を評価するために、3つの構築物が設計された(図15)。ホタルルシフェラーゼ遺伝子のN末端の699ヌクレオチド(アミノ酸1〜233)を、順方向プライマー
及び逆方向プライマー
を使用して以下の条件でpSP−luc+(Promega Corp.)から増幅した。パーキンエルマー2400サーマルサイクラーを使用して、95℃で2分間、1サイクルが95℃で30秒間、50℃で30秒間及び72℃で2分間を25サイクル、その後72℃で10分間。NheI制限部位は順方向プライマーの5’末端へ導入し、BamHI制限部位は逆方向プライマーの5’末端へ導入した。得られたN末端ルシフェラーゼ断片は次に確立された技術(Sambrookら、1989年)を使用してpBINDベクターのNheI及びBamHI制限部位にクローニングし、発現ベクターpJLC62(n luc)を得た。
及び逆方向プライマー5’TTGGCGCGCCGGATCCTTACACGGCGATCTTTCCGCCCTTCTTG3’(配列番号63)を使用して、N末端のクローニングについて前記したのと同じPCR条件下でpSP−luc+から増幅した。NheI及びBamHI制限部位はN末端プライマーについて前記したようにプライマーに導入し、C末端のルシフェラーゼ断片はpBINDベクターのNheI及びBamHIにクローニングして発現ベクターpJLC63(c luc)を得た。
及び、逆方向プライマー
を使用し、また上記同じPCR条件を使用してN及びC末端クローンで使用されたのと同じ方法でpBINDベクターにクローニングした。得られた発現ベクターpJLC64(完全長FF)をタンパク質相補性実験のための対照として使用した。
図15で示す3つの構築物の全ては、正しい大きさのタンパク質を与えた(図16A)。本明細書で先に記載したプロテアーゼ切断後の環状置換ホタルルシフェラーゼの活性化は、ルシフェラーゼの断片が酵素活性を相補し且つ再構成することができることを示唆した。図16B(同じTnT反応におけるルシフェラーゼのN及びC断片)で見られるように、N及びC末端のルシフェラーゼ断片のin vitroタンパク質相補性は、完全長ルシフェラーゼタンパク質と比較して機能性タンパク質を与えた。さらに、in vivoタンパク質相補性は、CHO及び293組織培養細胞の両方で起こった(図17)。たとえ組織培養細胞が溶解しなかった場合でも類似の傾向が見られた(PBS;データは示さず)。
一実施形態では、本発明は、2つの部分の結合を誘発又は強化、或いは抑制する外因性因子(エフェクターA)、及び任意選択に前記2つの部分の結合をそれぞれ解離又は強化する他の外因性因子(エフェクターB)を有するモジュレーター系を提供する。例えば、そのような系は、ルシフェラーゼに融合されたFKBP及びFRBの結合の誘導物質としてラパマイシンを、また結合の解離物質としてFK506を使用することができる。
材料及び方法
ヒトコドン最適化ホタルルシフェラーゼ遺伝子(luc2.0)を、順方向プライマー
及び逆方向プライマー
を使用してポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により以下の条件でpGL4.10(luc2)(Promega Corporation)(配列番号66)から増幅した:95℃で2分間、次に1サイクルが95℃で30秒間、50℃で30秒間及び72℃で2分間のものを25サイクル、72℃で10分間の最終展開。ルシフェラーゼタンパク質とのN末端融合の生成を容易にするために、NcoI及びEcoRV制限酵素部位を順方向プライマーの5’末端に導入した。ルシフェラーゼタンパク質とのC末端融合の生成を容易にするために、SnaBI、NotI及びSacI制限酵素部位を逆方向プライマーの5’に導入した。5’及び3’末端上の更なるクローニング部位を有する増幅されたルシフェラーゼ遺伝子をルシフェラーゼT7対照ベクター(Promega Corp.、Cat No#L4821)のHindIII/SacI部位にクローニングし、対照ベクターに通常存在するルシフェラーゼ遺伝子を置換した。得られたベクターは、pJLC65と呼ばれた。in vitro発現ルシフェラーゼT7対照ベクターへのクローニングの一般的スキームは、図18で見ることができる。
の合成遺伝子を含んでいるBlue Heronからのプラスミドから得られた。FRBは、5’末端のNcoI制限酵素部位及び3’末端のEcoRV制限部位を使用してBlue Heronベクターから切断され、公知の分子生物学的技術(Sambrookら、1989年)を使用してルシフェラーゼ遺伝子のN末端にクローニングした。
の合成遺伝子を含んでいるBlue Heronからのプラスミドから得られた。FKBP断片がルシフェラーゼ遺伝子のC末端にクローニングされるように、FKBPを遺伝子の5’末端のSnaBI制限酵素部位及び3’末端のNotI制限酵素部位を使用してBlue Heronベクターから切断した。二重融合は、FRB及びFKBPをそれぞれN末端及びC末端に含んでいた。
下記4つの構築物を調製した:luc2(ホタルルシフェラーゼをコードする;550アミノ酸)、FRB−luc2(FRB及びホタルルシフェラーゼの融合をコードする;644アミノ酸)、luc2−FKBP(ホタルルシフェラーゼ及びFKBPの融合をコードする;657アミノ酸)及びFRB−luc2−FKBP(二重融合をコードする;771アミノ酸)。4つの構築物(3つは対照、1つは二重融合)は、TnT(登録商標)Coupled Wheat Germ Extract SystemをFluoroTect(商標)GreenLys in vitro Translation Labeling Systemと一緒に使用して、発現されたタンパク質の正しい大きさについて評価した。4つの構築物の全ては、正しい大きさのタンパク質を与えた(図19)。
材料及び方法
クローニングは、以下の例外を除いて先に述べたように実施した。赤色コメツキムシ遺伝子(cbr)は、順方向プライマー
及び、逆方向プライマー
を使用してpCBR−Basic(Promega Corporation)から増幅した。EcoRV部位を順方向プライマーの5’末端に、BglIIを逆方向プライマーの5’末端に導入し、その後、対応する増幅された断片をpJLC68の対応する部位にクローニングした。緑色コメツキムシ遺伝子(cbg)は、順方向プライマー
及び、逆方向プライマー
を使用してpCBG68−Basic(Promega Corporation)から増幅した。赤色コメツキムシでpJLC68ベクターにクローニングしたのと同じ制限部位をこれらのプライマーに導入した。Renillaルシフェラーゼ遺伝子(Rluc)は、順方向プライマー
及び、逆方向プライマー
を使用してphRL−null(Promega Corporation)から増幅した。pJLC68ベクターのEcoRV(SnaBIとの平滑末端ライゲーション)及びBglII上でクローニングするために、SnaBI部位を順方向プライマーの5’末端に、BglII部位を逆方向プライマーの5’末端に導入した。pJLC68へのcbg、cbr及びRlucのクローニングは、FRB−ルシフェラーゼ−FKBP型の二重融合をもたらした。正しいタンパク質の大きさについてクローンを検証した(図21A)。先に述べたように二重融合を転写及び翻訳し、発光を測定したが、例外として、ラパマイシンの実験では0.2μMのラパマイシンだけが使用された。
ホタルルシフェラーゼタンパク質で見られたFRB及びFKBP系の類似した調整が他の種類のルシフェラーゼでも見られるかどうかを決定するために、ホタルルシフェラーゼ遺伝子をPyrophorus plagiophalamからの赤及び緑の2つの修飾されたコメツキムシ遺伝子、並びにRenilla reniformisからのルシフェラーゼ遺伝子で置換した。pJLC68へのcbg、cbr及びRlucのクローニングは、FRB−ルシフェラーゼ−FKBPの二重融合をもたらした。正しいタンパク質の大きさについてクローンを検証した(図21A)。先に述べたように二重融合を転写及び翻訳し、発光を測定した。
実施例X.AからのpJLC68をテンプレートとして使用して、FRBのルシフェラーゼとのN末端融合(FRB−Luc2)の断片、ルシフェラーゼのFKBPとのC末端融合(Luc2−FKBP)、又は二重融合(FRB−Luc2−FKBP)を、95℃で2分間、続いて1サイクルが95℃で30秒、50℃で30秒間及び72℃で2分間のものを25サイクル、また72℃で10分間の最終展開からなるPCRプログラムに従って増幅した。増幅のための全ての順方向プライマーはプライマーの5’末端にNheI制限酵素を含むように設計され、全ての逆方向プライマーはプライマーの5’末端にBamHI制限酵素部位を含むように設計され、それによりpBINDベクターへのクローニングのための5’末端がNheI部位及び3’末端のBamHI部位と連なる増幅断片が形成された。増幅のためのプライマーは、次の通りである:
Luc2:
順方向プライマー:
逆方向プライマー:
FRB−Luc2:
順方向プライマー:
逆方向プライマー:
Luc2−FKBP:
順方向プライマー;
逆方向プライマー;
FRP−Luc2−FKBP:
順方向プライマー:
逆方向プライマー:
順方向プライマー:
逆方向プライマー
FRB−ルシフェラーゼ−FKBPのラパマイシンを介した調整は、in vivoで観察された(図23〜25)。TK又はCMVプロモーター系を使用して、発光シグナルのそれぞれ最高5倍及び2倍の減少が観察された。対照構築物はラパマイシンに反応を示さなかった(図25B〜D)。さらに、FKBPとの結合においてラパマイシンと競合するFK506は、滴定可能な方法でラパマイシンの影響を打ち消す(図24)。
一実施形態では、ルシフェラーゼ活性は、ルシフェラーゼのN又はC末端の融合によって調整することができる。例えば、カルモジュリンとのルシフェラーゼC末端の融合は、カルモジュリンを調整する剤によって調整される。
ヒトカルモジュリン遺伝子(CaM)は、順方向プライマー
及び、逆方向プライマー
を使用して、下記プログラムに従ってベクターpOTB7(ATCC(登録商標)Global Resource Center、MGC−1447)から増幅した:95℃で5分間、次に1サイクルが95℃で30秒間、60℃で30秒間及び72℃で1分間10秒を20サイクル。SnaBI部位は順方向プライマーの5’末端へ導入し、XhoI部位は逆方向プライマーの5’末端へ導入した。CaM遺伝子はLuc2遺伝子(先に述べたように)をSnaBI/XhoI部位に有するルシフェラーゼT7対照ベクターのC末端へクローニングして、Luc2−CaM融合構築物を作製した。融合タンパク質は、TnT(登録商標)Coupled Reticulocyte Lysate System(Promega Corp.)を使用してメーカーのプロトコルに従ってin vitroで発現させた。発光は、Turner20/20照度計で測定した。
カルモジュリンタンパク質はカルシウムに応じて構造が大きく変化し、それによりC末端の融合を通してルシフェラーゼ活性を調整する他の可能性を提供する。EGTA又はCa+2が存在しない場合、CaMはルシフェラーゼ及びその基質の間の相互作用を制限する(図27、「試料」)。しかし、EGTAの添加後、この制限は解放され(図27、「EGTA」)、発光は約9倍増加する。この発光増加は、Ca+2の添加によって逆転される(図27、「CaCl2」)。したがって、CaMの高次構造は、Luc2−CaM融合におけるルシフェラーゼ活性に影響を及ぼすようであった。
Claims (28)
- 修飾された甲虫ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドであって、前記修飾された甲虫ルシフェラーゼは、関心のある分子と相互作用するアミノ酸配列を含む挿入を含み、前記修飾された甲虫ルシフェラーゼは、修飾に寛容性のある親甲虫ルシフェラーゼ配列の残基又は領域において環状置換され、前記修飾された甲虫ルシフェラーゼの活性は、前記関心のある分子と挿入配列が相互作用した後に活性に関して相互作用の前と比べて変化し、前記修飾された甲虫ルシフェラーゼはホタル又はコメツキムシルシフェラーゼであり、前記修飾された甲虫ルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼの場合、ホタルルシフェラーゼの残基2から12、残基116から126、残基228から238、残基262から272、残基289から308、残基356から366又は残基535から546と対応する領域において環状置換されており、前記修飾された甲虫ルシフェラーゼがコメツキムシルシフェラーゼの場合、コメツキムシルシフェラーゼの残基15から30、残基112から122、残基352から362、残基371から384、残基393から414又は残基485から495に対応する領域において環状置換されている、前記ポリヌクレオチド。
- 前記修飾された甲虫ルシフェラーゼのN末端、C末端又はその両方における少なくとも1つのアミノ酸の標識をコードするポリヌクレオチドを更に含んでいる、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 前記修飾された甲虫ルシフェラーゼは挿入に加えて甲虫ルシフェラーゼ残基N末端及び/又はC末端の欠失を更に含む、請求項1又は2に記載のポリヌクレオチド。
- 前記欠失は甲虫ルシフェラーゼ配列の15残基以下である、請求項3に記載のポリヌクレオチド。
- 前記修飾された甲虫ルシフェラーゼは親甲虫ルシフェラーゼのN末端及び/又はC末端と対応する甲虫ルシフェラーゼ残基の欠失を更に含む、請求項1又は2に記載のポリヌクレオチド。
- 前記欠失は甲虫ルシフェラーゼ配列の15残基以下である、請求項5に記載のポリヌクレオチド。
- 前記挿入は親甲虫ルシフェラーゼのN末端及び/又はC末端におけるものである、請求項1又は2に記載のポリヌクレオチド。
- 前記修飾された甲虫ルシフェラーゼは対応する親甲虫ルシフェラーゼの活性の少なくとも約50%を有する、請求項1又は2に記載のポリヌクレオチド。
- 前記修飾された甲虫ルシフェラーゼは対応する親甲虫ルシフェラーゼの活性の少なくとも約1%を有する、請求項1又は2に記載のポリヌクレオチド。
- 前記標識はPEST配列、GST配列、ポリヒスチジン配列又はレポータータンパク質である、請求項2に記載のポリヌクレオチド。
- 前記挿入は約4から約50のアミノ酸残基である、請求項1又は2に記載のポリヌクレオチド。
- 前記甲虫ルシフェラーゼはコメツキムシルシフェラーゼである、請求項1又は2に記載のポリヌクレオチド。
- 前記甲虫ルシフェラーゼはホタルルシフェラーゼである、請求項1又は2に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1又は2に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項14に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチドによってコードされる修飾された甲虫ルシフェラーゼ。
- 請求項2に記載のポリヌクレオチドによってコードされる融合タンパク質。
- 細胞内の関心のある分子を検出する方法であって、a)細胞を請求項14に記載のベクターと接触させ、前記ベクターを前記細胞に形質移入し、前記挿入は前記分子によって認識されるステップと、b)前記ベクターによってコードされる前記修飾された甲虫ルシフェラーゼの活性を検出又は決定し、それによって前記細胞内の前記分子の存在又は量を検出又は決定するステップとを含む方法。
- 前記甲虫ルシフェラーゼはホタルルシフェラーゼである、請求項18に記載の方法。
- 前記甲虫ルシフェラーゼはコメツキムシルシフェラーゼである、請求項18に記載の方法。
- 修飾された甲虫ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドであって、前記修飾された甲虫ルシフェラーゼは対応する親甲虫ルシフェラーゼに対する少なくとも2つの修飾を含み、前記少なくとも2つの修飾のそれぞれは修飾に寛容性のある甲虫ルシフェラーゼ配列の残基又は領域にあり、前記修飾された甲虫ルシフェラーゼは環状置換されており、前記修飾に寛容性のある前記残基又は領域は、ホタルルシフェラーゼの残基2から12、残基116から126、残基228から238、残基262から272、残基289から308、残基356から366又は残基535から546に対応し、又はコメツキムシルシフェラーゼの残基15から30、残基112から122、残基352から362、残基371から384、残基393から414又は残基485から495に対応するものである、前記ポリヌクレオチド。
- プロテアーゼ切断部位を含んでいる環状置換された甲虫ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドであって、前記ルシフェラーゼは対応する非置換の甲虫ルシフェラーゼにおいては修飾に寛容性のある部位で置換されており、前記修飾に寛容性のある部位は、ホタルルシフェラーゼの残基2から12、残基116から126、残基228から238、残基262から272、残基289から308、残基356から366又は残基535から546に対応し、又はコメツキムシルシフェラーゼの残基15から30、残基112から122、残基352から362、残基371から384、残基393から414又は残基485から495に対応するものである、前記ポリヌクレオチド。
- 前記プロテアーゼ切断部位は対応する非置換ルシフェラーゼのN及びC末端と対応している残基の位置又はその近くで挿入される、請求項22に記載のポリヌクレオチド。
- 前記プロテアーゼ切断部位での切断は発光の増加をもたらす、請求項22に記載のポリヌクレオチド。
- 前記プロテアーゼ切断部位はカスパーゼ3切断部位、カスパーゼ8切断部位、エンテロキナーゼ切断部位、前立腺血清抗原切断部位、SARSウイルスプロテアーゼ切断部位、TEVプロテアーゼ切断部位(NLYFQG)、又はライノウイルスプロテアーゼ切断部位である、請求項22に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項22又は23に記載のポリヌクレオチドによってコードされるルシフェラーゼ。
- 請求項22又は23に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項27に記載のベクターを含む宿主細胞。
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