JP2011101846A - エンドトキシンの除去方法及びエンドトキシン吸着体 - Google Patents
エンドトキシンの除去方法及びエンドトキシン吸着体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2011101846A JP2011101846A JP2009257523A JP2009257523A JP2011101846A JP 2011101846 A JP2011101846 A JP 2011101846A JP 2009257523 A JP2009257523 A JP 2009257523A JP 2009257523 A JP2009257523 A JP 2009257523A JP 2011101846 A JP2011101846 A JP 2011101846A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- endotoxin
- collagen
- apatite
- porous body
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
【解決手段】アパタイト/コラーゲン多孔体をエンドトキシン含有溶液と接触させることによりエンドトキシンを吸着除去する方法、及びアパタイト/コラーゲン多孔体からなり、湿潤状態でスポンジ状のブロック体であるエンドトキシン吸着体。
【選択図】なし
Description
本発明ではエンドトキシンの吸着体として、アパタイト/コラーゲン多孔体を使用する。前記多孔体はアパタイト/コラーゲン複合体繊維からなり、気孔率90〜95%、平均気孔径10〜500μm程度であるのが好ましい。
(1) アパタイト/コラーゲン複合体繊維
(a) 原料
アパタイト/コラーゲン複合体繊維は、コラーゲン、リン酸又はその塩、及びカルシウム塩を原料とする。コラーゲンとしては特に限定されず、動物等から抽出したものを使用できる。なお由来する動物の種、組織部位、年齢等は特に限定されない。一般的には哺乳動物(例えばウシ、ブタ、ウマ、ウサギ及びネズミ)や鳥類(例えばニワトリ)の皮膚、骨、軟骨、腱、臓器等から得られるコラーゲンが使用できる。また魚類(例えばタラ、ヒラメ、カレイ、サケ、マス、マグロ、サバ、タイ、イワシ及びサメ)の皮、骨、軟骨、ひれ、うろこ、臓器等から得られるコラーゲン様蛋白を使用してもよい。なおコラーゲンの抽出方法も特に限定されず、一般的な抽出方法によることができる。また動物組織から抽出したものではなく、遺伝子組み替え技術によって得られたコラーゲンを使用してもよい。
リン酸(塩)水溶液及びカルシウム塩水溶液の濃度は、リン酸(塩)とカルシウム塩とが所望の配合比にあれば特に限定されないが、後述する滴下操作の都合上、リン酸(塩)水溶液の濃度は50〜250 mM程度、カルシウム塩水溶液の濃度は200〜600 mM程度であるのが好ましい。コラーゲンは一般的にはリン酸水溶液の状態で、前述のリン酸(塩)水溶液にあらかじめ加える。コラーゲンのリン酸水溶液は、コラーゲンの濃度が0.5〜1質量%及びリン酸の濃度が10〜30 mMであるのが好ましい。さらに好ましくは、コラーゲンの濃度は0.8〜0.9質量%及びリン酸の濃度は15〜25 mMであり、特に好ましくは、コラーゲンの濃度は約0.85質量%及びリン酸の濃度は約20 mMである。
添加すべきカルシウム塩水溶液の量とほぼ同量の(好ましくは添加すべきカルシウム塩水溶液の0.5〜2倍、より好ましくは0.8〜1.2倍)の水をあらかじめ反応容器に入れ、40℃程度に加熱する。そこに、コラーゲンを含有するリン酸(塩)水溶液及びカルシウム塩水溶液を同時に滴下する。滴下条件によって、合成するアパタイト/コラーゲン複合体繊維の長さを制御できる。滴下速度は10〜50 ml/min程度であるのが好ましく、反応溶液は50〜300 rpm程度で撹拌するのが好ましい。滴下中、反応溶液中のカルシウムイオン濃度を3.75 mM以下、かつリン酸イオン濃度を2.25 mM以下に維持するのが好ましい。これにより、反応溶液のpHは8.9〜9.1に保たれる。カルシウムイオン及び/又はリン酸イオンの濃度が上記範囲を超えると、複合体の自己組織化が妨げられる。本明細書中「自己組織化」とは、コラーゲン繊維に沿って、ハイドロキシアパタイト(アパタイト構造を有するリン酸カルシウム)が生体骨特有の配向をしていること、すなわちハイドロキシアパタイトのC軸がコラーゲン繊維に沿うように配向していることを意味する。以上の滴下条件により、アパタイト/コラーゲン複合体繊維は、多孔体の原料として好適な1 mm以下の長さで、自己組織化したものとなる。
アパタイト/コラーゲン複合体繊維に水、リン酸水溶液等を加えて撹拌し、ペースト状の分散物を調製する。この分散物が含有する液体の含有量は、80〜99体積%であるのが好ましく、90〜97体積%であるのがより好ましい。つまり、複合体繊維の含有量は、1〜20体積%であるのが好ましく、3〜10体積%であるのがより好ましい。
P = Y /(X+Y)×100 ・・・ (1)
[ただし、Xは分散物中のアパタイト/コラーゲン複合体繊維の体積、Yは分散物中の液体の体積を示す。]により表される。このため加える液体の量によって、多孔体の気孔率Pを制御することができる。液体を加えた後で分散物を撹拌することにより、アパタイト/コラーゲン複合体繊維が切断され繊維長の分布幅が大きくなるため、製造する多孔体の強度が向上する。
コラーゲンのリン酸(塩)水溶液の添加により酸性となっている分散物に、水酸化ナトリウム溶液を加えてpHを約7に調節する。分散物のpHは6.8〜7.6とするのが好ましく、7.0〜7.4とするのがより好ましい。分散物のpHを6.8〜7.6とすることにより、バインダーとして加えたコラーゲンの繊維化を促進することができる。
アパタイト/コラーゲン複合体繊維を含むゲル体を凍結させる。目的とするアパタイト/コラーゲン多孔体の平均気孔径は、ゲル体の凍結に要する時間に依存する。凍結する温度は−100〜0℃であるのが好ましく、−100〜−10℃であるのがより好ましく、−80〜−20℃であるのが特に好ましい。−100℃未満では、得られるアパタイト/コラーゲン多孔体の平均気孔径が小さ過ぎる。0℃超では、凍結しないか凍結に長時間を要する上、多孔体の平均気孔径が大き過ぎる。
コラーゲンの架橋は物理的架橋(ガンマ線、紫外線、熱脱水、電子線等を用いる方法)、化学的架橋(架橋剤や縮合剤を用いる方法)のいずれを用いてもよい。化学的架橋の場合、架橋剤の溶液に多孔体を浸すことにより行う。架橋剤としては、アルデヒド系架橋剤(グルタールアルデヒド及びホルムアルデヒド等)、イソシアネート系架橋剤(ヘキサメチレンジイソシアネート等)、カルポジド系架橋剤(1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩等)、ポリエポキシ系架橋剤(エチレングリコールジエチルエーテル等)、トランスグルタミナーゼ等が挙げられる。これらの架橋剤のうち、架橋度の制御しやすさや、得られる多孔体の生体適合性の面からグルタールアルデヒドが特に好ましい。
動物由来のコラーゲンを使用したアパタイトコラーゲン多孔体は、それ自体にエンドトキシンを含んでいる可能性があるため、架橋後の多孔体に16〜35 kGy[単位はGy(グレイ)]の線量のガンマ線を照射するのが好ましい。ガンマ線照射によりエンドトキシンの活性を低下させることができる。ガンマ線線量が高ければ高いほど、エンドトキシンの活性を低下させることができるが、アパタイト/コラーゲン多孔体の弾力性がなくなってしまい、ブロック形状を保持できなくなる。そのため、照射線量は35 kGy以下であるのが好ましい。16 kGy未満の場合、エンドトキシンの不活性化が不十分となる。ガンマ線の照射線量は20〜30 kGyであるのがより好ましく、22〜25 kGyであるのがさらに好ましい。線源としてはコバルト60が一般的に用いられる。照射方法としては、ベルトコンベアーによって照射室に入り、一定時間後に外へ出て、そのまま再度照射室に入るという動作を一定の吸収線量になるまで繰り返すインクリメンタル照射や、照射室に置いて照射を受ける静置照射等がある。
(A) アパタイト/コラーゲン複合体の合成
120 mMのリン酸水溶液200 mlに、コラーゲンのリン酸水溶液(コラーゲン濃度:0.56質量%、リン酸濃度:20 mM)を2020 g加えて撹拌し、希釈コラーゲンリン酸水溶液を調製した。他方、400 mMの水酸化カルシウム懸濁液を1123 ml調製した。反応容器に200 mlの純水を入れ、38℃に加熱した。この反応容器に希釈コラーゲンリン酸水溶液と水酸化カルシウム懸濁液とをそれぞれ約30 ml/分の速度で同時に滴下し、得られた反応溶液を200 rpmで撹拌して、アパタイト/コラーゲン複合体繊維を含むスラリーを作製した。滴下中の反応溶液のpHは8.9〜9.1に保持した。アパタイト/コラーゲン複合体を含むスラリーは凍結乾燥した。生成したアパタイト/コラーゲン複合体の繊維長は概ね1 mm以下であった。アパタイト/コラーゲン複合体中のアパタイト/コラーゲンの配合比は、質量基準で8/2であった。
凍結乾燥したアパタイト/コラーゲン複合体1gにPBS(リン酸緩衝生理食塩水)6.3 mlを加えて撹拌し、ペースト状の分散物とした。このペースト状分散物にコラーゲンのリン酸水溶液1.7 gを加えて撹拌した後、1 NのNaOH水溶液をpHがほぼ7になるまで加え分散物を得た。分散物中のアパタイト/コラーゲン複合体の濃度は5体積%であった。
得られたアパタイト/コラーゲン多孔体を10 mm×10 mm×10 mmの大きさのブロックに切り出し、25 kGyの線量のガンマ線を照射した。このブロック体は0.16 g(ハイドロキシアパタイト:0.128 g、コラーゲン:0.032 g)であった。
アパタイト/コラーゲン多孔体のエンドトキシン吸着除去性能を測定した。エンドトキシン標準品を希釈して、1.0 EU/mlの濃度のエンドトキシン含有溶液を調整した。パイロジェンフリーのナイロン製の袋にこのエンドトキシン含有溶液を2 ml入れ、その中に前記ガンマ線照射したアパタイト/コラーゲン多孔体のブロック体を入れた。多孔体にエンドトキシン含有溶液を吸収させた後、袋の外側から多孔体を押しこみ、吸収させた溶液を排出する操作を5回繰り返し(合計時間5分間)、最終的に排出させた溶液を試験液とした。試験液のエンドトキシン濃度を、エンドトキシン測定装置(トキシノメーターET2000:和光純薬)を用いて測定した。結果を表1に示す。
水酸化カルシウムとリン酸とを混合して合成したハイドロキシアパタイトを、700℃で4時間焼成しハイドロキシアパタイト粉末を得た。実施例1と同様にしてガンマ線処理したハイドロキシアパタイト粉末0.128 gを、実施例1と同様にして1.0 EU/mlの濃度に調節したエンドトキシン溶液に入れ、5分間攪拌した。その後、ハイドロキシアパタイト粉末をフィルターで除去し、回収した試験液のエンドトキシン濃度を実施例1と同様にして測定した。ハイドロキシアパタイト粉末を濾過する工程が加わったため、実施例1と比較して作業が煩雑であった。結果を表1に示す。
50 kGyの線量のガンマ線を照射したアパタイト/コラーゲン多孔体(10 mm×10 mm×10 mm)を用いて実施例1と同様にしてエンドトキシン吸着除去試験を実施した。しかし、排出作業時にアパタイト/コラーゲン多孔体が崩壊し、測定不能であった。
Claims (6)
- アパタイト/コラーゲン多孔体をエンドトキシン含有溶液と接触させることによりエンドトキシンを吸着除去する方法。
- 請求項1に記載のエンドトキシンの除去方法において、前記アパタイト/コラーゲン多孔体をエンドトキシン含有溶液に浸漬し、エンドトキシンを前記多孔体に吸着させた後、前記多孔体を取り出すことを特徴とするエンドトキシンの除去方法。
- 請求項1又は2に記載のエンドトキシンの除去方法において、前記アパタイト/コラーゲン多孔体は5 mm×5 mm×5 mm〜50 mm×50 mm×50 mmの大きさを有するブロック体として使用することを特徴とするエンドトキシンの除去方法。
- 請求項1〜3のいずれかに記載のエンドトキシンの除去方法において、前記多孔体はガンマ線を照射されたものであることを特徴とするエンドトキシンの除去方法。
- アパタイト/コラーゲン多孔体からなり、湿潤状態でスポンジ状のブロック体であることを特徴とするエンドトキシン吸着体。
- 請求項5に記載のエンドトキシン吸着体において、前記ブロック体が5 mm×5 mm×5 mm〜50 mm×50 mm×50 mmの大きさを有することを特徴とするエンドトキシン吸着体。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009257523A JP5643938B2 (ja) | 2009-11-10 | 2009-11-10 | エンドトキシンの除去方法及びエンドトキシン吸着体 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009257523A JP5643938B2 (ja) | 2009-11-10 | 2009-11-10 | エンドトキシンの除去方法及びエンドトキシン吸着体 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2011101846A true JP2011101846A (ja) | 2011-05-26 |
JP5643938B2 JP5643938B2 (ja) | 2014-12-24 |
Family
ID=44192446
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009257523A Active JP5643938B2 (ja) | 2009-11-10 | 2009-11-10 | エンドトキシンの除去方法及びエンドトキシン吸着体 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5643938B2 (ja) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004041320A1 (ja) * | 2002-11-06 | 2004-05-21 | National Institute For Materials Science | 自己組織化したアパタイト/コラーゲン複合体を含むアパタイト/コラーゲン架橋多孔体及びその製造方法 |
JP2009133627A (ja) * | 2007-10-29 | 2009-06-18 | Hoya Corp | リン酸カルシウム系化合物、リン酸カルシウム系化合物/コラーゲン複合体及びリン酸カルシウム系細胞培養担体に付着又は吸着したエンドトキシンの抽出方法及び定量方法 |
-
2009
- 2009-11-10 JP JP2009257523A patent/JP5643938B2/ja active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004041320A1 (ja) * | 2002-11-06 | 2004-05-21 | National Institute For Materials Science | 自己組織化したアパタイト/コラーゲン複合体を含むアパタイト/コラーゲン架橋多孔体及びその製造方法 |
JP2009133627A (ja) * | 2007-10-29 | 2009-06-18 | Hoya Corp | リン酸カルシウム系化合物、リン酸カルシウム系化合物/コラーゲン複合体及びリン酸カルシウム系細胞培養担体に付着又は吸着したエンドトキシンの抽出方法及び定量方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP5643938B2 (ja) | 2014-12-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4699759B2 (ja) | 自己組織化したアパタイト/コラーゲン複合体を含むアパタイト/コラーゲン架橋多孔体及びその製造方法 | |
JP2009132601A (ja) | アパタイト/コラーゲン複合体繊維を含む多孔体及びその製造方法 | |
JPWO2006046414A1 (ja) | アパタイト/コラーゲン複合体繊維を含む多孔体の製造方法 | |
KR100842012B1 (ko) | 말뼈를 이용한 골이식재의 제조방법 | |
JP5945380B2 (ja) | 吸収置換型人工骨及びその製造方法 | |
KR100871396B1 (ko) | 생체활성 아파타이트의 제조방법 | |
JP5898399B2 (ja) | 吸収置換型人工骨及びその製造方法 | |
JP6223474B2 (ja) | シルクベースの多孔質スキャフォールド及びその調製方法 | |
KR101348336B1 (ko) | 이종골 유래 골이식재 및 그 제조방법 | |
CN107261199B (zh) | 一种含沸石止血凝胶敷料的制备方法 | |
RU2342162C1 (ru) | Способ получения биоматериалов из костной ткани и полученный этим способом материал для остеопластики и тканевой инженерии | |
JPWO2009122902A1 (ja) | アパタイト/コラーゲン複合体からなる膨張性多孔体、及びその製造方法 | |
JP2005279078A (ja) | アパタイト/コラーゲン複合体繊維を含む多孔体の平均気孔径制御方法 | |
JP4934773B2 (ja) | アパタイト/コラーゲン複合体からなる多孔体及びその製造方法 | |
JP6351008B2 (ja) | 魚骨由来のヒドロキシアパタイト | |
RU2519220C1 (ru) | Местное гемостатическое средство | |
JP5643938B2 (ja) | エンドトキシンの除去方法及びエンドトキシン吸着体 | |
RU2554804C1 (ru) | Способ получения композиционного материала на основе фосфата кальция | |
JP5236894B2 (ja) | アパタイト/コラーゲン複合体繊維を含む多孔体及びその製造方法 | |
JP6018477B2 (ja) | 人工骨−軟骨複合体及びその製造方法 | |
CN112812576B (zh) | 一种新型含锌元素生物源性胶原膜及其制备方法和用途 | |
US10064979B2 (en) | Bone regeneration material | |
JP2011236411A (ja) | 土壌改良材の製造方法 | |
LT6309B (lt) | Trimatis porėtas celiuliozės karkasas kaulo inžinerijai ir jo gavimo būdas | |
JP5589188B2 (ja) | 骨補填材、及び骨補填材の製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20120628 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140128 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140326 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140617 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140806 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20140902 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20140929 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20141021 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5643938 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |