JP2011057607A - ヒアルロン酸およびヒアルロン酸オリゴを含有する組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】このような組成物は、重量平均分子量70万以上150万以下のヒアルロン酸またはその薬学的に許容できる塩およびヒアルロン酸オリゴ糖またはその薬学的に許容できる塩を有効成分として含む組成物を調製することで得られる。
【選択図】なし
Description
(組成物の調製)重量平均分子量80万のヒアルロン酸(商品名FCH、紀文製)100mg/ 9 mL水溶液を70℃に加熱し、50%塩酸を1mL添加し、撹拌し、16時間処理した。その後、10%水酸化ナトリウム水溶液でpH6に調整した。分解した溶液は、高速クロマトグラフィー(HPLC)で測定し、ヒアルロン酸オリゴ糖の含有量をHPLCのチャートの面積ピークの比率を各ピークで求め、ヒアルロン酸4糖(HA4)が該当するピーク面積のが14%重量比以上であることを確認して使用した。ヒアルロン酸オリゴ糖の含有量は、ヒアルロン酸の基本単位であるD−グルクロン酸−β−1,3−D−N−アセチルグルコサミン−β−1を1:1で結合したヒアルロン酸2糖(HA2)と2糖が2つ結合したヒアルロン酸4糖(HA4)を含む分画の配合比を求め、全体のヒアルロン酸量との配合比で計算する。たとえば、HPLCでHA2が15%、HA4が15%の面積ピークが求められた場合は、HA2とHA4の和の30%が収率と計算する。
カラム:ポリアミンカラム(ナカライテスク社製COSMOSIL Sugar−D)
溶離液:リン酸二水素ナトリウム(0 → 0.8M)
流速:1.0mL/min
検出:UV210nm
試料濃度:1mg/mL
分析量100μL
このようにして得られたヒアルロン酸オリゴ糖と、平均重合分子量 80万のヒアルロン酸ナトリウム(商品名 FCH 紀文製)とを、それぞれ、1重量%ずつ含有するように蒸留水で調節した。
実施例1で得られたヒアルロン酸オリゴ糖を、1重量%となるように生理食塩水で調節した。
分子量 80万のヒアルロン酸ナトリウム(商品名 FCH 紀文製)を、1重量%となるように生理食塩水で調節した。
賦活対象細胞
測定対象の細胞としてHT1080(ヒト繊維肉腫細胞)を使用する。HT1080は理化学研究所より入手可能である。
取得したHT1080細胞をトリプシン処理することで剥離した後、以下の条件でMEM培地に播種し、培養する(1×105個/ml、96穴)。
1群 無添加
2群 実施例または比較例で得られた組成物を培地に添加し(ヒアルロン酸および/またはヒアルロン酸オリゴ糖の合計量として1μg/ml)、24時間インキュベート。
レオメータにより、20℃で測定される動的粘弾性を求める。周波数0.1Hzにおける貯蔵弾性率Gは0.01Pa以上であり、損失弾性率が極大を示す周波数が1.0 Hz以上100 Hz以下である。
シャーレ(直径10 cm ガラス製)内にセロハン紙(6cm×6cm、MS(平判) 300、フタムラ化学株式会社製)をおき、その上から実施例1、比較例1、または比較例2で得られた組成物を、5ml用いて、刷毛でなすりつけ、蓋をして乾燥しないように37℃で一定時間おいた後、セロハンを取り除く。シャーレ内に5mlの精製水を入れて60分間震盪し、その洗浄水に含まれるヒアルロン酸量をカルバゾール硫酸法によって定量した。
皮膚組織
東洋紡株式会社製のTESTSKINTMLSEを使用する。TESTSKINTM LSEは、付属のアッセイ培地を用いて、付属の6ウェルプレートを用いて培養することで、ヒト皮膚組織モデルを構築することができる。なお、6ウェルプレートにおける1つのウェルの模式図を図1に示す。図1に示すように、6ウェルプレートにおける個々のウェルは、底面に透過膜1を備えたトランスウェル2から構成されている。TESTSKINTM LSEは、トランスウェル2内及びトランスウェル2の底面の下方空間3にアッセイ培地を充填することによって、トランスウェルの底面上に培養され、ヒト皮膚組織モデル4を形成することとなる。
試験群[実施例および比較例に対応するヒアルロン酸またはヒアルロン酸オリゴ糖を含む]:1μg/mlの濃度でヒアルロン酸オリゴ糖および/またはヒアルロン酸を含むアッセイ培地1.2mlを添加した6wellプレートに、TESTSKINTM LSEの入ったトランスウェルを設置し、トランスウェル内に1μg/mlの濃度で、実施例1に対応する高分子ヒアルロン酸とヒアルロン酸オリゴ糖の混合、比較例1と2にそれぞれ対応する単独の有効成分を含むアッセイ培地1mlを添加する。
実験動物
生後七ヶ月齢の雌の肉用ブタ(LWD種)を使用する。実験動物は、温湿度自然環境下、及び照明時間12時間(午前8時から午後8時)に設定された飼育室内で飼育する。飼育に際して、飲料水は自由摂取とし、飼料(ハイブリード70)は一日二回の制限給餌とし、朝・夕刻時に豚房内を水洗する。
飼育している実験動物の背部皮膚を2cmの間隔で一区画3cm四方に区分けし、上記塗布クリームを一日一回0.1gずつ塗布した。塗布クリームの塗布は7日間行う。最終塗布の翌日に麻酔科にて放血致死させ、背部皮膚を脂肪層ごと摘出し、一部をOCTコンパウンドに包埋し、一部を凍結する。
OTCコンパウンドに包埋したブタ背部皮膚を用い、凍結切片を作製する(厚さ18μm)。切片を4%パラホルムアルデヒド/PBSを用い、室温にて30分固定した、PBSで三回洗浄する。さらに、0.3% H2O2/メタノールを用い、4℃にて30分間処理し、内因性のペルオキシダーゼのブロッキングを行い、PBSで三回洗浄する。次に、内因性のビオチンを内因性アビジンビオチンブロッキングキット(ニチレイ)を用い、プロトコールどおりにブロッキングする。次に、100 mM Sodium acetate bufferを加え、37℃で15分インキュベートした後、陰性コントロール群には、20TRUの放線菌由来ヒアルロニダーゼ(生化学工業)を添加し、60℃で2時間インキュベートする。PBSで三回洗浄した後、1%BSA/PBSを加え、室温で1時間ブロッキングする。ブロッキング剤を除き、1% BSA/PBSで2 ug/mlに希釈したビオチン標識ヒアルロン酸結合性タンパク質(生化学工業)を加え、室温で1時間インキュベートし、PBSで三回洗浄する。1% BSA/PBSで200ng/mlに希釈したストレプトアビジン-HRP(カルビオケム)を添加し、室温で1時間インキュベートし、PBSで三回洗浄した後、DAB(Zymed)で発色させ、顕微鏡下で観察する。
ブタ皮膚を60℃にて一晩乾燥させ、1mgあたり100ulの1%プロナーゼ(Merck)を添加し、40℃で17時間酵素消化する。100℃で10分しプロナーゼを不活化した後、15000rpmで10分遠心し、上清をヒアルロン酸画分とした。
Claims (6)
- 重量平均分子量70万以上150万以下のヒアルロン酸またはその薬学的に許容できる塩およびヒアルロン酸オリゴ糖またはその薬学的に許容できる塩を含有する組成物。
- 前記重量平均分子量70万以上150万以下のヒアルロン酸またはその薬学的に許容できる塩の固形分含量が、0.1重量%以上10重量%以下であり、前記ヒアルロン酸オリゴ糖またはその薬学的に許容できる塩の固形分含量が、0.1重量%以上10重量%以下である、請求項1記載の組成物。
- 前記ヒアルロン酸オリゴ糖が、−D−グルクロン酸−β−1,3−D−N−アセチルグルコサミン−β−1,4−を1単位とし、該1単位を2個含む4糖である、請求項1または2記載の組成物。
- 前記ヒアルロン酸オリゴ糖が、−D−グルクロン酸−β−1,3−D−N−アセチルグルコサミン−β−1,4−を1単位とし、該1単位を1個含む2糖、該1単位を2個含む4糖、該1単位を3個含む6糖、該1単位を4個含む8糖、および該1単位を5個含む10糖からなる群より選択される少なくとも1または2以上の組合せである、請求項1から3までのいずれか1項に記載の組成物。
- B型粘度計により、ローター回転数60rpm、25℃で測定した粘度が1,000 〜 10,000 mPa・sである、請求項1から4までのいずれか1項に記載の組成物。
- 皮膚外用剤である、請求項1から5までのいずれか1項に記載の組成物。
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