JP2010523147A5 - - Google Patents
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Description
pZUFmEaD8Sを含んでなるヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)形質転換体の機能解析
一般方法で述べられるようにして、プラスミドpZUFmEaD8S(配列番号51、図8B)をY4001U株に形質転換した。形質転換体をMMLeuプレート上で選択した。30℃で2日間の生育後、形質転換体を拾って新鮮なMMLeuプレート上に再度画線培養した。ひとたび成長したら、これらの株を個々に3mLの液体MMLeuに30℃で接種して、250rpm/分で2日間振盪した。細胞を遠心分離により収集して脂質を抽出し、エステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製して、引き続いてHewlett−Packard 6890 GCで分析した。
GC分析は7つの形質転換体の全てで、総脂質の約6.5%のDGLAおよび9.4%のEDAが生成されたことを示し、これらの7つ株のEDAからDGLAへの変換効率は約41%と判定された。
一般方法で述べられるようにして、プラスミドpZUFmEaD8S(配列番号51、図8B)をY4001U株に形質転換した。形質転換体をMMLeuプレート上で選択した。30℃で2日間の生育後、形質転換体を拾って新鮮なMMLeuプレート上に再度画線培養した。ひとたび成長したら、これらの株を個々に3mLの液体MMLeuに30℃で接種して、250rpm/分で2日間振盪した。細胞を遠心分離により収集して脂質を抽出し、エステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製して、引き続いてHewlett−Packard 6890 GCで分析した。
GC分析は7つの形質転換体の全てで、総脂質の約6.5%のDGLAおよび9.4%のEDAが生成されたことを示し、これらの7つ株のEDAからDGLAへの変換効率は約41%と判定された。
以上、本発明を要約すると下記のとおりである。
1.(a)Δ8デサチュラーゼ活性を有して、配列番号21、配列番号22、配列番号23、および配列番号24からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較すると、Clustal V法のアラインメントに基づいて少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(b)Δ8デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードして、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、および配列番号39からなる群から選択されるヌクレオチド配列と比較すると、BLASTN法のアラインメントに基づいて少なくとも80%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
(c)Δ8デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードして、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、および配列番号39からなる群から選択されるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、または
(d)(a)、(b)または(c)のヌクレオチド配列の相補体であって、前記相補体および前記ヌクレオチド配列が同数のヌクレオチドからなって100%相補的である、相補体
を含む、単離されたポリヌクレオチドを含んでなる微生物宿主細胞。
2.単離されたポリヌクレオチドが、配列番号21、配列番号22、配列番号23、および配列番号24からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする、上記1に記載の微生物宿主細胞。
3.微生物宿主細胞が、酵母、藻類、細菌、ユーグレナ属、ストラメノパイル、および真菌からなる群から選択される、上記1に記載の微生物宿主細胞。
4.細胞がモルティエレラ属の真菌である、上記3に記載の微生物宿主細胞。
5.細胞が、スラウストキトリウム種、およびシゾキトリウム種からなる群から選択されるストラメノパイルである、上記3に記載の微生物宿主細胞。
6.酵母が油性酵母である、上記3に記載の微生物宿主細胞。
7.油性酵母が、ヤロウィア、カンジダ、ロドトルラ、ロドスポリジウム、クリプトコッカス、トリコスポロン、およびリポマイセスからなる群から選択される、上記6に記載の微生物宿主細胞。
8.a)(i)配列番号21、配列番号22、配列番号23、および配列番号24からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると、Clustal V法のアラインメントに基づいて少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するΔ8デサチュラーゼポリペプチドをコードする組み換えヌクレオチド分子、および
(ii)エイコサジエン酸源
を含んでなる微生物宿主細胞を提供するステップと、
b)Δ8デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸断片が発現されて、エイコサジエン酸がジホモ−γ−リノール酸に変換される条件下で、ステップ(a)の微生物宿主細胞を成長させるステップと、
c)場合によりステップ(b)のジホモ−γ−リノール酸を回収するステップと
を含んでなる、ジホモ−γ−リノール酸を生成する方法。
9.a)(i)配列番号21、配列番号22、配列番号23、および配列番号24からなる
群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると、Clustal V法のアラインメントに基づいて少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するΔ5デサチュラーゼポリペプチドをコードする組み換えヌクレオチド分子、および
(ii)エイコサトリエン酸源
を含んでなる微生物宿主細胞を提供するステップと、
b)Δ8デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸断片が発現されて、エイコサトリエン酸がエイコサテトラエン酸に変換される条件下で、ステップ(a)の微生物宿主細胞を成長させるステップと、
c)場合によりステップ(b)のエイコサテトラエン酸を回収するステップと
を含んでなる、エイコサテトラエン酸を生成する方法。
10.微生物宿主細胞が配列番号39に記載のΔ8デサチュラーゼポリペプチドをコードする組み換えヌクレオチド分子を含んでなるヤロウィア種であり、組み換えヌクレオチド分子がヤロウィア中での発現について最適化された少なくとも208個のコドンを含んでなる、上記8または9に記載の方法。
11.a.)組み換え核酸分子が、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、および配列番号39からなる群から選択される核酸配列を有し、
b.)宿主細胞がヤロウィア・リポリティカである、上記8または9に記載の方法。
12.配列番号39に記載のΔ8デサチュラーゼをコードして、少なくとも208個のコドンがヤロウィア種中での発現のためにコドン最適化されている、単離された核酸分子。
1.(a)Δ8デサチュラーゼ活性を有して、配列番号21、配列番号22、配列番号23、および配列番号24からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較すると、Clustal V法のアラインメントに基づいて少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(b)Δ8デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードして、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、および配列番号39からなる群から選択されるヌクレオチド配列と比較すると、BLASTN法のアラインメントに基づいて少なくとも80%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
(c)Δ8デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードして、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、および配列番号39からなる群から選択されるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、または
(d)(a)、(b)または(c)のヌクレオチド配列の相補体であって、前記相補体および前記ヌクレオチド配列が同数のヌクレオチドからなって100%相補的である、相補体
を含む、単離されたポリヌクレオチドを含んでなる微生物宿主細胞。
2.単離されたポリヌクレオチドが、配列番号21、配列番号22、配列番号23、および配列番号24からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする、上記1に記載の微生物宿主細胞。
3.微生物宿主細胞が、酵母、藻類、細菌、ユーグレナ属、ストラメノパイル、および真菌からなる群から選択される、上記1に記載の微生物宿主細胞。
4.細胞がモルティエレラ属の真菌である、上記3に記載の微生物宿主細胞。
5.細胞が、スラウストキトリウム種、およびシゾキトリウム種からなる群から選択されるストラメノパイルである、上記3に記載の微生物宿主細胞。
6.酵母が油性酵母である、上記3に記載の微生物宿主細胞。
7.油性酵母が、ヤロウィア、カンジダ、ロドトルラ、ロドスポリジウム、クリプトコッカス、トリコスポロン、およびリポマイセスからなる群から選択される、上記6に記載の微生物宿主細胞。
8.a)(i)配列番号21、配列番号22、配列番号23、および配列番号24からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると、Clustal V法のアラインメントに基づいて少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するΔ8デサチュラーゼポリペプチドをコードする組み換えヌクレオチド分子、および
(ii)エイコサジエン酸源
を含んでなる微生物宿主細胞を提供するステップと、
b)Δ8デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸断片が発現されて、エイコサジエン酸がジホモ−γ−リノール酸に変換される条件下で、ステップ(a)の微生物宿主細胞を成長させるステップと、
c)場合によりステップ(b)のジホモ−γ−リノール酸を回収するステップと
を含んでなる、ジホモ−γ−リノール酸を生成する方法。
9.a)(i)配列番号21、配列番号22、配列番号23、および配列番号24からなる
群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると、Clustal V法のアラインメントに基づいて少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するΔ5デサチュラーゼポリペプチドをコードする組み換えヌクレオチド分子、および
(ii)エイコサトリエン酸源
を含んでなる微生物宿主細胞を提供するステップと、
b)Δ8デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸断片が発現されて、エイコサトリエン酸がエイコサテトラエン酸に変換される条件下で、ステップ(a)の微生物宿主細胞を成長させるステップと、
c)場合によりステップ(b)のエイコサテトラエン酸を回収するステップと
を含んでなる、エイコサテトラエン酸を生成する方法。
10.微生物宿主細胞が配列番号39に記載のΔ8デサチュラーゼポリペプチドをコードする組み換えヌクレオチド分子を含んでなるヤロウィア種であり、組み換えヌクレオチド分子がヤロウィア中での発現について最適化された少なくとも208個のコドンを含んでなる、上記8または9に記載の方法。
11.a.)組み換え核酸分子が、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、および配列番号39からなる群から選択される核酸配列を有し、
b.)宿主細胞がヤロウィア・リポリティカである、上記8または9に記載の方法。
12.配列番号39に記載のΔ8デサチュラーゼをコードして、少なくとも208個のコドンがヤロウィア種中での発現のためにコドン最適化されている、単離された核酸分子。
Claims (4)
- (a)Δ8デサチュラーゼ活性を有して、配列番号21、配列番号22、配列番号23、および配列番号24からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較すると、Clustal V法のアラインメントに基づいて少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(b)Δ8デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードして、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、および配列番号39からなる群から選択されるヌクレオチド配列と比較すると、BLASTN法のアラインメントに基づいて少なくとも80%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
(c)Δ8デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードして、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、および配列番号39からなる群から選択されるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、または
(d)(a)、(b)または(c)のヌクレオチド配列の相補体であって、前記相補体および前記ヌクレオチド配列が同数のヌクレオチドからなって100%相補的である、相補体
を含む、単離されたポリヌクレオチドを含んでなる微生物宿主細胞。 - a)(i)配列番号21、配列番号22、配列番号23、および配列番号24からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると、Clustal V法のアラインメントに基づいて少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するΔ8デサチュラーゼポリペプチドをコードする組み換えヌクレオチド分子、および
(ii)エイコサジエン酸源
を含んでなる微生物宿主細胞を提供するステップと、
b)Δ8デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸断片が発現されて、エイコサジエン酸がジホモ−γ−リノール酸に変換される条件下で、ステップ(a)の微生物宿主細胞を成長させるステップと、
c)場合によりステップ(b)のジホモ−γ−リノール酸を回収するステップと
を含んでなる、ジホモ−γ−リノール酸を生成する方法。 - a)(i)配列番号21、配列番号22、配列番号23、および配列番号24からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると、Clustal V法のアラインメントに基づいて少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するΔ5デサチュラーゼポリペプチドをコードする組み換えヌクレオチド分子、および
(ii)エイコサトリエン酸源
を含んでなる微生物宿主細胞を提供するステップと、
b)Δ8デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸断片が発現されて、エイコサトリエン酸がエイコサテトラエン酸に変換される条件下で、ステップ(a)の微生物宿主細胞を成長させるステップと、
c)場合によりステップ(b)のエイコサテトラエン酸を回収するステップと
を含んでなる、エイコサテトラエン酸を生成する方法。 - 配列番号39に記載のΔ8デサチュラーゼをコードして、少なくとも208個のコドンがヤロウィア種中での発現のためにコドン最適化されている、単離された核酸分子。
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