JP2010517659A - コラーゲン/ヒドロキシアパタイト複合骨格及びその生成方法 - Google Patents
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- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/56—Porous materials, e.g. foams or sponges
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
- A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants
Abstract
【選択図】 図2
Description
本発明は、コラーゲン/ヒドロキシアパタイト(HA)複合骨格、及び本発明の方法によって得られるコラーゲン/HA複合骨格の生成方法に関する。そのような骨格は、骨再生及び組織工学への適用で用いることができる。
移植骨片は、世界中で移植される材料のリストで、輸血に次いで2番目である。さらに、移植骨片材料の推定される世界市場は、毎年約650,000,000ユーロである。毎年、移植骨片又は骨格の使用を必要とする最高4,000,000の骨置換処置が、世界中で実施される。最も一般的な臨床治療は、骨を患者自身の体からとって再移植する、自家移植である。しかし、特定のドナー部位から取り出すことができる骨の量は限定され、再移植のためにさらに侵襲性の手術が必要とされる。別の選択肢は、骨を臓器提供者から取り出す、同種異系移植の使用である。この手法に伴う問題点は、骨が別のドナーに由来することから生じる。感染性疾患の伝染のより高いリスクが、そのような材料に付随する。さらに、そのようなドナーの骨は生細胞を含まないので、そこには成長因子が少量しか存在しない。これらの成長因子は、新しい骨の増殖を助ける。耐負荷性を促進しつつ、骨形成を促進する理想的な移植可能な骨格は、同種異系移植又は自家移植の必要性を低減させるであろう。しかし、現在、これらの従来の手法は、全ての骨移植処置の90%以上を構成する。上記の問題点にもかかわらずこの普及率が低い理由は、in vitroで骨を生成するか、in vivoで完全な骨形成を引き起こすために用いることができる、血管形成され、物理的にコンピテントな骨伝導性の骨格が開発されていないことである。そのような製品は、かなりの商業的潜在性を有するであろう。
本発明によれば、コラーゲン/ヒドロキシアパタイト(HA)複合骨格を生成する方法であって、酸性溶液中でコラーゲン及びHAの均質な懸濁液を形成するステップと、所望の最終凍結温度に到達するまで懸濁液を凍結乾燥して複合骨格を生成するステップと、任意選択で複合骨格を架橋するステップとを含み、懸濁液中のHA対コラーゲンの比が少なくとも1:10(w/w)である方法が提供される。
コラーゲンの酸性均質懸濁液を形成するステップと、
その後、混合条件下でHAをコラーゲン懸濁液に加えてコラーゲン懸濁液中で確実にHAの分布が均一になるようにするステップと
によって形成される。
[図2]骨格型の関数としてのEDAC架橋骨格圧縮剛性を示す図である。(コラーゲン=0.5M酢酸に混合したEDAC架橋コラーゲン対照骨格、50HA=0.5M酢酸に混合したEDAC架橋コラーゲン+50重量%HA、100HA=0.5M酢酸に混合したEDAC架橋コラーゲン+100重量%HA、200HA=0.5M酢酸に混合したEDAC架橋コラーゲン+200重量%HA)。
[図3]骨格型の関数としての骨格空隙率を示す図である。(コラーゲン=0.5M酢酸に混合した非EDAC架橋骨格コラーゲン対照骨格、50HA=0.5M酢酸に混合した非EDAC架橋骨格コラーゲン+50重量%HA、100HA=0.5M酢酸に混合した非EDAC架橋骨格コラーゲン+100重量%HA、200HA=0.5M酢酸に混合した非EDAC架橋骨格コラーゲン+200重量%HA)。
[図4]骨格型の関数としてのin vitro生物活性(t=7、14、21、28日)を示す図である。すべての骨格で、2,000,000個の細胞の初期播種密度を用いた。(コラーゲン=0.5M酢酸に混合したEDAC架橋コラーゲン対照骨格、50HA=0.5M酢酸に混合したEDAC架橋コラーゲン+50重量%HA、100HA=0.5M酢酸に混合したEDAC架橋コラーゲン+100重量%HA、200HA=0.5M酢酸に混合したEDAC架橋コラーゲン+200重量%HA)。
[図5]骨格型の関数としてのin vitro生物活性(t=28日−7日)を示す図である。7日目と28日目の間の骨格の新しい生物活性(コラーゲン=0.5M酢酸に混合したEDAC架橋コラーゲン対照骨格、50HA=0.5M酢酸に混合したEDAC架橋コラーゲン+50重量%HA、100HA=0.5M酢酸に混合したEDAC架橋コラーゲン+100重量%HA、200HA=0.5M酢酸に混合したEDAC架橋コラーゲン+200重量%HA)。
[図6]本発明による複合骨格のMicroCTスキャンを示す図である。
[図7]図6の骨格の断面を示す図である。
[図8]均一で相互接続した多孔構造を鮮明に表す50重量%HA骨格SEM画像を示す図である。
[図9]図8で明確にされる関心領域のミネラル粒子分布を示す図である。
[図10及び11]それぞれ10倍及び100倍の倍率による非EDAC架橋50重量%HA複合骨格のSEM画像を示す図である。
[図12]骨格型の関数としての骨格透過性を示す図である。(コラーゲン=0.5M酢酸に混合したEDAC架橋コラーゲン対照骨格、50HA=0.5M酢酸に混合したEDAC架橋コラーゲン+50重量%HA、100HA=0.5M酢酸に混合したEDAC架橋コラーゲン+100重量%HA、200HA=0.5M酢酸に混合したEDAC架橋コラーゲン+200重量%HA)。
[図13]ラット頭蓋冠骨のX線並びに欠損の位置及びCTスキャン画像のためにとった断面位置を示す概略図を示す図である。
[図14]空の欠損を有するラット頭蓋冠骨の断面のMicroCTスキャン画像を示す図である。
[図15及び16]ラットMSC細胞を播種した本発明のEDAC架橋50重量%HA複合骨格で満たされた欠損を有するラット頭蓋冠骨の断面のMicroCTスキャン画像を示す図である。
[図17及び18]ラットMSC細胞を播種した本発明のEDAC架橋200重量%HA複合骨格で満たされた欠損を有するラット頭蓋冠骨の断面のMicroCTスキャン画像を示す図である。
[図19及び20]本発明のEDAC架橋50重量%HA複合骨格(細胞を播種していない)で満たされた欠損を有するラット頭蓋冠骨の断面のMicroCTスキャン画像を示す図である。
[図21及び22]本発明のEDAC架橋200重量%HA複合骨格(細胞を播種していない)で満たされた欠損を有するラット頭蓋冠骨の断面のCTスキャン画像を示す図である。
本発明の製作
コラーゲン対照骨格及び10重量%HA骨格は、実施形態1に記載のプロトコルを用いて、特に0.05Mの初期酢酸濃度を用いて製造した。HAの割合を50重量%HAまで増加させるに従い、2つの主成分(コラーゲン及びHA)の均一な混合がより問題となった。初期酢酸濃度の増加が、この問題を軽減することが見出された。この増加した酢酸濃度の影響を、酢酸濃度の2つの異なる増加、具体的には0.1M及び0.5Mを用いて調査した。これらの実施形態を、それぞれ実施例2及び3に記載する。EDAC架橋コラーゲン対照骨格並びに50重量%、100重量%及び200重量%のHAを有する複合骨格の製造を、実施例4に記載する。
400mlの0.05M酢酸溶液(pH3.05)を、蒸留した脱イオン水(1.16ml氷酢酸を、398.84mlの蒸留した脱イオン水に加えた)を用いて調製した。WK1250水冷系(Lauda、Westbury、NY、USA)を用いて、4℃の一定温度で1時間ガラス反応容器を冷却した。この反応容器を用いて骨格構成要素を混合し、その間、スラリーを4℃の一定温度に維持した。これにより、混合工程の間の発熱の結果としてのコラーゲン線維の変性が避けられた。
400mlの0.1M酢酸溶液(pH2.9)を、蒸留した脱イオン水(2.32ml氷酢酸を、397.68mlの蒸留した脱イオン水に加えた)を用いて調製した。WK1250水冷系(Lauda、Westbury、NY、USA)を用いて、4℃の一定温度で1時間ガラス反応容器を冷却した。1.8gmのミクロフィブリルウシ腱コラーゲン(Collagen Matrix社、NJ、USA)を、320mlの0.1M酢酸溶液に加えた。IKA Ultra Turrax T18オーバーヘッドブレンダー(IKA Works社、Wilmington、NC)を用いて4℃で90分間、15,000rpmでこの懸濁液を混合した。
400mlの0.5M酢酸溶液(pH2.55)を、蒸留した脱イオン水(11.6ml氷酢酸を、388.4mlの蒸留した脱イオン水に加えた)を用いて調製した。WK1250水冷系(Lauda、Westbury、NY、USA)を用いて、4℃の一定温度で1時間ガラス反応容器を冷却した。1.8gmのミクロフィブリルウシ腱コラーゲン(Collagen Matrix社、NJ、USA)を、320mlの0.5M酢酸溶液に加えた。IKA Ultra Turrax T18オーバーヘッドブレンダー(IKA Works社、Wilmington、NC)を用いて4℃で90分間、15,000rpmでこの懸濁液を混合した。
400mlの0.5M酢酸溶液(pH2.55)を、蒸留した脱イオン水(11.6ml氷酢酸を、388.4mlの蒸留した脱イオン水に加えた)を用いて調製した。WK1250水冷系(Lauda、Westbury、NY、USA)を用いて、4℃の一定温度で1時間ガラス反応容器を冷却した。1.8gmのミクロフィブリルウシ腱コラーゲン(Collagen Matrix社、NJ、USA)を、320mlの0.5M酢酸溶液に加えた。IKA Ultra Turrax T18オーバーヘッドブレンダー(IKA Works社、Wilmington、NC)を用いて4℃で90分間、15,000rpmでこの懸濁液を混合した。
本研究の目的で、作製されたすべてのコラーゲン/HA骨格を、本研究室で用いられる標準プロトコルを用いて、特に0.5Mの酢酸溶液で作製され、40℃の最終凍結温度まで一定の冷却速度で凍結乾燥されたコラーゲン製の対照骨格と比較した。
骨欠損部へ移植後に確実に生存するように、移植骨片代替物は、影響を受ける欠損部位内で荷重を通してそれが受ける力に耐えるのに十分な内在性強度を有しなければならない。荷重欠損部への移植を可能にするのに十分な内在性強度を有する骨伝導性の移植骨片代替物を特注製作する能力が、この研究の主要目標であった。両材料の利点のすべてを有するがそれらの欠点のいずれも有しない移植骨片代替物を開発するために、複合技術を用いることにより、極めて生体適合性の高いコラーゲンベースの構築物をより強いセラミックヒドロキシアパタイトと組み合わせる。すべての試験は、リン酸緩衝食塩水(PBS)溶液で水和した骨格で実施した。骨格試料の圧縮試験は、5−N負荷セルを付けたZwick物理試験機を用いて実施した。丸い金属やすりで研いだ革用パンチを用いて、直径8mm(高さ4mm)の試料をシートから切り出した。次に、24ウェル培養プレートでの試験の1時間前に、試料をリン酸緩衝食塩水(PBS)で前水和した。試験プロトコルは、2サイクルから、すなわち、事前調整サイクル及び試験サイクルからなった。どちらのサイクルでも、0.15mNの前負荷を加え、位置を1分間保持した。この力が選択されたのは、それが試験前に試料を圧縮することなく確実に試料と接触させるのに十分に低かった(10%の歪み時に負荷の0.5%)からである。骨格の高さを測定するために、この前負荷時の頭部の位置を用いた。水和された骨格を乾燥プラテン上に置き、次に、頭部を下げる前にそれを沈めた。頭部と骨格の間でバブルを捉えないように注意した。事前調整のために、試料を5%まで負荷した。試験のためには、骨格を10%まで負荷し、脱負荷した。1分につき10%の歪み速度を用いた。試験後、ノギスを用いて試料の直径を3つの別個の位置で測定した。モジュラスは、2〜5%の歪みにわたる応力−歪曲線への線形適合度の傾きと定義された。
多孔性骨格の空隙率は、開放した多孔性空間で構成される骨格体積の割合の、百分率で表される尺度である。より簡略には、それは多孔性構築物の空隙容積率である。in vitro及びin vivoでの、細胞に出入りする栄養素/老廃物の拡散には、高い骨格空隙率が必要とされる。人工組織骨格の開発における主な制約の1つは、栄養送達及び構築物の中央からの老廃物の除去がないことから生じるコア分解の問題である。その結果、骨格中央の無血管壊死のために、移植後、構築物はしばしば失敗する。本発明のコラーゲンベースの骨格の大きい利点の1つは、それらの高い空隙率である。骨格空隙率は、質量秤を用いた、乾燥した8mm、4mmの深さの骨格試料の精密測定によって判定した。円柱の容積の式πr2hを用い、質量を容積で割ることによって各試料の密度を計算した。空隙率は、式100−[100(ρ骨格/p材料)]を用いて計算し、上式で、ρ骨格は所与の試料の密度であり、ρ材料は骨格構成要素の加重密度である(すなわち、ρ10重量%HA骨格=[mコラーゲン+m10重量%HA]/[mコラーゲン/ρコラーゲン+m10重量%HA/ρ10重量%HA])
骨格全体へのミネラル粒子の分布は、定量化が困難なパラメータ/属性である。それは、視覚化する方がずっと簡単な属性であり、したがって、保護する値域を規定するのが困難である。それは、2つの異なる方法を用いて視覚化した。1つ目は、下の図6に示すmicroCTであった。この分析で用いるmicroCTスキャナは、ミネラル組織を検出するためにX線を用いる。したがって、図6は、100重量%HA骨格中のミネラル粒子だけを示す。コラーゲンを可視化できないことがわかると、ミネラル粒子は骨格全体に完全に、均一に分布していることがわかる。骨格が99%空であるならば、この画像は、HAがコラーゲン線維と緊密に関連している確証を示す。図7は、別の視点から見た分布を図示する、同じ骨格の二次元の断片を示す。
孔相互接続性は、生体物質で主に構成される骨格で定量的に規定するのが非常に困難な、別の重要な骨格属性である。しかし、孔相互接続性は、骨格の透過性に強く関係する。透過性については下記で述べるが、流れの伝導度は空隙率、孔径及び孔相互接続性に一緒に依存する。したがって、透過性は、孔径及び空隙率が規定されるときの孔相互接続性の指標を与える。
インキュベーションの7、14、21及び28日後に骨格中のMC3T3E1骨芽細胞の増殖を定量化することによって、コラーゲン骨格へのHAの添加の影響を評価した。骨格へのHAの添加は、細胞活性にいかなる有害な影響も及ぼさないことが見出された。実際、その反対が真であることが、播種から28日後に見出された。200重量%HAにHAの割合を増加させることは、対照の純粋なコラーゲン骨格よりもさらに細胞増殖を促進することが見出された。図4は、骨格上に保持される細胞の絶対数を示す。
多孔性骨格の透過性は、本質的にはその多孔媒体を通しての圧力下のフロー伝導度である。高い骨格透過性はin vivoでの骨格の長期生存度のために必須であるが、その理由は、細胞が骨格中心に移動することをそれが可能にし、in vivoで血管新生を促進するからである。50重量%、100重量%及び200のHA骨格は、対照コラーゲン骨格と比較してかなり増加した平均組織透過性を示した。このことはこの研究の驚くべきことであるがプラスともなる知見であったが、その理由は、HAの添加が骨格全体への流体の流れを実際に支援することをそれが示すからである。多孔性骨格を通してのフロー伝導度のこの増加は、骨格剛性の増大に起因すると考えられる。骨格透過性を定量化するために用いられる実験プロトコルが、参考文献で詳述されている[5](O’Brienら、2007、Section 2.2、7〜10頁)。
骨中の危機的に大きな欠損の骨形成及びミネラル化を促進する本発明の可能性を判定するために、小動物試験を実施した。試験では、9頭のウィスターラットを用いた。危機的に大きな欠損を、ラット頭蓋冠に形成した。対照として、1頭の動物を空の欠損のまま残した。他の8頭の動物を群に分けた。具体的には、欠損のうちの4つには50重量%HA骨格を満たし、そのうちの2つにはラット間葉性幹細胞(MSC)を播種し、2つは播種せずにそのままにした。これは、既製の骨格型に対する組織工学による骨格型の可能性を調査するためであった。残りの4つの欠損試料には200重量%HA骨格を満たし、同じく、播種するものと播種しない骨格にこれらの4つを均等に分割した。ラット頭蓋冠中で28日後に、動物を屠殺し、頭蓋冠骨を取り出した。欠損中の骨格の存在を調査し、治癒過程、骨形成及びミネラルマトリックス生成に及ぼす骨格型の影響を観察するために、microCTを用いてこれらを処理、分析した。以下のセクションの図は、空欠損ラットからとられた二次元の断面を示す。断面は、頭蓋冠骨を通しての冠状断面であった。欠損は直径5mmで、完全に円形であった。microCTデータに示す断面は、図13の下の略図で表す。
空欠損動物のデータは、欠損が治癒過程の一部として線維状軟組織で満たされていることを示した。これは予想されたことであり、本発明者らの組織工学グループで以前に行われた動物試験で見られている。28日間の試験後、欠損全体のいくつかの点で高密度材の小粒子が空の欠損中で観察されたが、これらは滅多に観察されず、空の欠損試料中でかなりの治癒を示すのに十分高密度ではなかった。これらの例を、下記で示すmicroCT X線像に示す。
50重量%HA細胞播種骨格は、より有望な結果を示した。これらの骨格には、移植前にラット間葉性幹細胞を播種した。下の代表的なmicroCT X線像からわかるように、多少ミネラル化した材料の小さな不均一なポケットが、欠損−骨境界面の周辺だけでなく骨格中心にも見られた。空欠損データと比較してこれらのミネラル化ポケットの有意により多くの数の例が見られ、それらは、空欠損で見られる例と比較してそれらの強度はより明るいようであった。
本発明者らの第二の細胞播種50重量%HA骨格は、第一の細胞播種50重量%HA骨格及び、したがって空の欠損と比較して大きく向上した結果を示した。かなりミネラル化した組織のかなりの例が、骨格で満たされた欠損全体を通して数点で見られた。これは、骨格骨境界面の周辺で特に明白であった。ミネラル化のレベルは、周囲の骨で見られるものほど高くなかったが、非常に類似していた。これは、骨格で満たされた欠損中に見られるミネラル化組織、及び周囲の骨のそれのほとんど同一の強度レベルとみなすことができる。
第一の細胞播種200重量%HA骨格は、50重量%HA骨格と比較して、かなり向上した結果を示した。欠損全体で試験したほとんどすべての点において、欠損の周辺から骨格で満たされた欠損中心までずっとかなりのレベルのミネラル化が見られた。この試料では、ミネラル化のレベルは、骨格で満たされた欠損中のミネラル化粒子の画像強度における相対差によって表される、周囲の骨組織のそれほど高くなかった。
第二の細胞播種200重量%HA骨格は、前のすべての骨格と比較して、かなり向上した結果を示した。欠損全体で試験した相当数の領域において、欠損の周辺から骨格で満たされた欠損中心までずっとかなりのレベルのミネラル化が見られた。第一の200重量%HA細胞播種骨格と異なり、形成されたミネラル化組織は本質的に粒子状でなかったが、骨格が満たされた欠損全域にわたって連続的であった。最も興味深いことに、この連続的ミネラル化は、欠損の最も広い部分で見られた。この試料では、ミネラル化のレベルは、骨格で満たされた欠損中のミネラル化物質の類似した画像強度によって表される、周囲の骨組織のそれとほぼ同一であった。
50重量%HA骨格についての無細胞骨格で満たされた欠損の結果は、細胞播種50重量%HA骨格に非常に類似していた。かなりミネラル化した組織が、骨格で満たされた欠損全体に見られたが、本質的に連続的でなかった。しかし、ミネラル化した組織の強度は、細胞播種試料で見られたものよりわずかに高かった。これは、後に続くすべての細胞非播種試料で見られ、無細胞構築物がin vivoでより優れた性能を発揮することができることを示した。
この50重量%HA細胞非播種試料は、他のすべての50重量%HA試料に類似した結果を示した。28日の試験の後、骨格ミネラル化の開始の証拠が骨格で満たされた欠損の周辺及び中心で見られたが、ミネラル化組織は連続的でなかった。しかし、ミネラル化粒子の強度は、周囲の骨のそれに類似したミネラル化を示した。
200重量%HA細胞播種試料で見られたように、非播種200重量%HA試料は欠損全体の相当数の領域において、骨格で満たされた欠損の周辺及び中心でかなりのレベルのミネラル化を示した。このミネラル化組織は、50重量%HA試料で見られたものと異なり、本質的に連続的であった。
前の200重量%HA細胞非播種試料で見られたように、この非播種200重量%HA試料は欠損全体の相当数の領域において、骨格で満たされた欠損の周辺及び中心でかなりのレベルのミネラル化を示した。このミネラル化組織は、50重量%HA試料で見られたものと異なり、本質的に連続的であった。
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Claims (57)
- コラーゲン/ヒドロキシアパタイト(HA)複合骨格を生成する方法であって、酸性溶液中でコラーゲン及びHAの均質な懸濁液を形成するステップと、所望の最終凍結温度に到達して複合骨格を生成するまで懸濁液を一定の冷却速度で凍結乾燥するステップとを含み、懸濁液中のHA対コラーゲンの比が少なくとも1:10(w/w)である方法。
- 酸性溶液が少なくとも0.1Mのモル濃度を有する、請求項1に記載の方法。
- 酸性溶液のモル濃度が0.4M〜0.6Mである、請求項1又は2に記載の方法。
- 懸濁液中のHA対コラーゲンの比が1:10(w/w)〜50:10(w/w)である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 懸濁液中のHA対コラーゲンの比が5:10〜30:10(w/w)である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 懸濁液中のHA対コラーゲンの比が10:10(w/w)〜30:10(w/w)である、請求項5に記載の方法。
- 懸濁液中のコラーゲンの量を酸性溶液中0.5g/Lから50g/Lまで変化させることができる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 懸濁液中のコラーゲンの量が1.0g/L〜10.0g/Lである、請求項6に記載の方法。
- 懸濁液中のコラーゲンの量が3.0g/L〜8.0g/Lである、請求項7に記載の方法。
- コラーゲン/HAの均質な懸濁液が、コラーゲンのゼラチン化を最小にするのに適する条件下で形成される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 均質な懸濁液の生成の間で確実にコラーゲンのゼラチン化を最小にする方法が、懸濁液を1℃〜5℃の温度に維持することを含む、請求項9に記載の方法。
- 凍結乾燥が一定の冷却速度で実施される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 凍結乾燥が0.1℃/分〜10℃/分の間の一定の冷却速度で実施される、請求項11に記載の方法。
- 凍結乾燥が0.5℃/分〜1.5℃/分の間の一定の冷却速度で実施される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 凍結乾燥が0.8℃/分〜1.1℃/分の間の一定の冷却速度で実施される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 所望の最終凍結温度が−10℃〜−70℃の間である、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 所望の最終凍結温度が−30℃〜−50℃の間である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 所望の最終凍結温度が−35℃〜−45℃の間である、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 凍結乾燥ステップが、最終凍結温度に到達した後に実施される乾燥段階を含み、前記ステップが凍結乾燥チャンバーを昇華温度に加熱することを含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 形成された骨格中の氷相を適切な時間の間減圧下で昇華させる最終昇華ステップを含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 凍結乾燥工程が、最終凍結温度に到達した後に凍結乾燥チャンバー内の温度を上昇させることと、上昇させた温度を乾燥段階の開始前にしばらくの間保持することとを含むアニーリングステップを含む、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 本発明で使用されるHAが粉末状である、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- HA粉末が、焼結HA粉末及び非焼結HA粉末からなる群から選択される、請求項21に記載の方法。
- HA粉末が10nm〜100μmの間の粒径を有する、請求項21又は22に記載の方法。
- 本発明で使用されるコラーゲンがコラーゲン線維を含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- コラーゲン/HAの均質な懸濁液が、コラーゲンの酸性均質懸濁液を形成するステップと、その後、混合条件下でHAをコラーゲン懸濁液に加えて、コラーゲン懸濁液中で確実にHAの分布が均一になるようにするステップとによって形成される、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
- HAが酸性HA懸濁液の形で提供される、請求項25に記載の方法。
- コラーゲン懸濁液が遠心分離によって混合され、HAが遠心混合の間に懸濁液の渦に加えられる、請求項25又は26に記載の方法。
- HAが一定分量で加えられる、請求項25〜27のいずれか一項に記載の方法。
- 一定分量が30〜240分間の間隔でコラーゲン懸濁液に加えられる、請求項28に記載の方法。
- HAが2〜5つの一定分量でコラーゲン懸濁液に加えられる、請求項28又は29に記載の方法。
- 複合骨格が架橋される、請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 複合骨格が、脱水熱架橋及び化学架橋からなる群から選択される手段によって架橋される、請求項31に記載の方法。
- 複合骨格が1−エチル−3−[3−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩(EDAC)と架橋される、請求項32に記載の方法。
- 請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法によって得られる、コラーゲン/ヒドロキシアパタイト(HA)複合骨格。
- 多孔性コラーゲンマトリックス内にヒドロキシアパタイトの均一な分布を含むコラーゲン/ヒドロキシアパタイト(HA)複合骨格であって、HA対コラーゲンの比が少なくとも約1:10(w/w)である複合骨格。
- 少なくとも約10:10(w/w)のHA対コラーゲン比を有する、請求項36に記載のコラーゲン/ヒドロキシアパタイト(HA)複合骨格。
- 少なくとも約10:20(w/w)のHA対コラーゲン比を有する、請求項36に記載のコラーゲン/ヒドロキシアパタイト(HA)複合骨格。
- 少なくとも97%(v/v)の空隙率を有する、請求項36〜38のいずれか一項に記載のコラーゲン/ヒドロキシアパタイト(HA)複合骨格。
- 少なくとも98%(v/v)の空隙率を有する、請求項36〜38のいずれか一項に記載のコラーゲン/ヒドロキシアパタイト(HA)複合骨格。
- 少なくとも99%(v/v)の空隙率を有する、請求項36〜38のいずれか一項に記載のコラーゲン/ヒドロキシアパタイト(HA)複合骨格。
- 脱水熱及びEDAC架橋され、少なくとも1.0kPaの圧縮剛性を有する、請求項36〜41のいずれか一項に記載のコラーゲン/ヒドロキシアパタイト(HA)複合骨格。
- 脱水熱及びEDAC架橋され、少なくとも2.0kPaの圧縮剛性を有する、請求項42に記載のコラーゲン/ヒドロキシアパタイト(HA)複合骨格。
- 脱水熱及びEDAC架橋され、少なくとも3.0kPaの圧縮剛性を有する、請求項43に記載のコラーゲン/ヒドロキシアパタイト(HA)複合骨格。
- 複合骨格中のHA対コラーゲンの比が1:10(w/w)〜50:10(w/w)である、請求項36〜44のいずれか一項に記載のコラーゲン/ヒドロキシアパタイト(HA)複合骨格。
- 複合骨格中のHA対コラーゲンの比が5:10(w/w)〜30:10(w/w)である、請求項45に記載のコラーゲン/ヒドロキシアパタイト(HA)複合骨格。
- インキュベーションの28日目の骨格中のMC3T3骨芽細胞の増殖レベルから7日目のレベルを引いたものが少なくとも0.5×106個の細胞であることで特徴づけられる、請求項36〜46のいずれか一項に記載のコラーゲン/ヒドロキシアパタイト(HA)複合骨格。
- 少なくとも1×10−10m4/Nsの、骨格を通る圧力下のフロー伝導度を有することで特徴づけられる、請求項36〜47のいずれか一項に記載のコラーゲン/ヒドロキシアパタイト(HA)複合骨格。
- シート状に生成される、請求項36〜48のいずれか一項に記載のコラーゲン/ヒドロキシアパタイト(HA)複合骨格。
- 骨格の体積500mm3につき少なくとも1×106個の細胞が播種されている、請求項36〜49のいずれか一項に記載のコラーゲン/ヒドロキシアパタイト(HA)複合骨格。
- 架橋されている、請求項36〜50のいずれか一項に記載のコラーゲン/ヒドロキシアパタイト(HA)複合骨格。
- 請求項36〜51のいずれか一項に記載のコラーゲン/ヒドロキシアパタイト複合骨格を含む、骨伝導骨インプラント。
- 請求項36〜51のいずれか一項に記載のコラーゲン/ヒドロキシアパタイト複合骨格を含む、組織工学インプラント。
- 請求項36〜51のいずれか一項に記載のコラーゲン/ヒドロキシアパタイト複合骨格を含む、顎顔面移植骨片代替物。
- 請求項36〜51のいずれか一項に記載のコラーゲン/ヒドロキシアパタイト複合骨格を含む、歯科用移植骨片代替物。
- 請求項36〜51のいずれか一項に記載のコラーゲン/ヒドロキシアパタイト複合骨格を含む、軟骨欠損修復インプラント。
- 請求項36〜51のいずれか一項に記載のコラーゲン/ヒドロキシアパタイト複合骨格を含む、骨軟骨欠損修復インプラント。
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