ES2435192T3

ES2435192T3 - Andamio de material compuesto de colágeno/hidroxiapatita, y procedimiento para la producción del mismo

Info

Publication number: ES2435192T3
Application number: ES08710143T
Authority: ES
Inventors: Fergal O'brien; John Glesson; Niamh Plunkett
Original assignee: Royal College of Surgeons in Ireland
Current assignee: Royal College of Surgeons in Ireland
Priority date: 2007-02-09
Filing date: 2008-02-11
Publication date: 2013-12-16
Anticipated expiration: 2028-02-11
Also published as: NZ579466A; JP5881669B2; PL2117617T3; EP2517738B1; CA2677992C; AU2008212526B2; EP1964583A1; CA2677992A1; EP2117617B1; DK2117617T3; EP2117617A2; JP5527760B2; JP2010517659A; US9138483B2; EP2517738A1; AU2008212526A1; DK2517738T3; WO2008096334A2; PT2117617E; NO2517738T3

Abstract

Un procedimiento para producir un andamio de material compuesto de colágeno/hidroxiapatita (HA), quecomprende la etapa de formar una suspensión homogénea de colágeno y HA en una solución ácida, liofilizar lasuspensión a una velocidad de enfriamiento constante hasta que se alcanza una temperatura de congelación final de-10 °C a -70 °C, y calentar la cámara de liofilización hasta una temperatura de sublimación en la que en el andamioformado sublima una fase de hielo a vacío durante un período de tiempo adecuado para producir el andamio dematerial compuesto, en el que la relación de HA a colágeno en la suspensión es al menos 1:10 (p/p), y la cantidadde colágeno en la suspensión varía de 3 g/l a 8 g/l (p/p), en el que la suspensión homogénea de colágeno/HA seforma por las etapas de formar una suspensión homogénea ácida de colágeno y, a continuación, añadir la HA a lasuspensión de colágeno en condiciones de mezcla para garantizar la distribución homogénea de la HA en lasuspensión de colágeno, en el que la HA se añade en la forma de una suspensión de HA ácida.

Description

Andamio de material compuesto de colágeno/hidroxiapatita, y procedimiento para la producción del mismo

Campo técnico

La invención se refiere a un procedimiento para la producción de un andamio de material compuesto de colágeno/hidroxiapatita (HA), y a andamios de material compuesto de colágeno/HA que pueden obtenerse por el procedimiento de la invención. Tales andamios se pueden usar en la regeneración ósea y en aplicaciones de ingeniería tisular.

Técnica anterior

Los injertos óseos son, después de las trasfusiones de sangre, los segundos en la lista de materiales trasplantados en todo el mundo. Además, el mercado mundial estimado anual para los materiales de injertos óseos es de aproximadamente 650 millones de dólares en todo el mundo. Cada año, se realizan en todo el mundo más de 4 millones de procedimientos de sustitución ósea que requieren el uso de un injerto óseo o andamio. El tratamiento clínico más habitual es un autoinjerto, mediante el cual se toma hueso de cuerpo del propio paciente y se vuelve a implantar. Sin embargo, existe una cantidad limitada de hueso que pueda ser retirado de un sitio de un donante particular y se requiere cirugía invasiva para su reimplantación. Otra opción es el uso de un haloinjerto, mediante el cual se extrae hueso de un donante de órgano. Los problemas con esta técnica se derivan del origen del hueso de un donante distinto. Asociado con dicho material hay un mayor riesgo de transmisión de enfermedades infecciosas. Además, en el hueso de dicho donante están presentes menores factores de crecimiento debido a que no contiene células vivas. Estos factores de crecimiento ayudan al crecimiento de nuevo hueso. Un andamio implantable ideal que promovería la formación de hueso que al mismo tiempo facilite el soporte de carga reduciría la necesidad de haloinjertos y autoinjertos. Sin embargo, en la actualidad estas técnicas tradicionales constituyen más del 90% de todos los procedimientos de injerto óseo. La razón de este déficit, aparte de los problemas descritos antes, es que todavía no se ha desarrollado un andamio vascularizado, mecánicamente competente y osteoconductor que se podría usar para producir hueso in vitro o provocar una osteogénesis in vivo. Dicho producto tendría un potencial comercial significativo.

Se han realizado diversos intentos usando numerosos materiales sintéticos para producir andamios viables para injertos óseos. Ejemplos incluyen poliestireno, titanio, poli(ácido láctico) (PLLA), poli(ácido glicólico) (PGA) y poli(ácido láctico glicólico) (PLGA). Sin embargo, todos estos materiales conllevan problemas asociados e inconvenientes que incluyen el riesgo de infección y dificultan el permitir una adecuada resorción que promueva la vascularización y el crecimiento de nuevo hueso. También se han usado materiales biológicos tales como sustratos basados en colágeno, gelatina, quitosán, agarosa y glucosaminoglucano (GAG). Sin embargo, estos materiales no tienen propiedades mecánicas suficientes que permitan soportar la carga después del implante. El documento WO2006 095154 describe materiales compuestos de colágeno y fosfato de calcio que se producen usando mezcla mecánica o por precipitación in situ de una fase del tipo HA.

Declaraciones de la invención

De acuerdo con la invención, se proporciona un procedimiento para producir un andamio de material compuesto de colágeno/hidroxiapatita (HA) de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 9.

De forma típica, la solución ácida tiene una molaridad de al menos 0,05M. En una realización preferida de la invención, la relación de HA a colágeno en la suspensión es mayor de 1:10 (p/p), y en la que la molaridad de la solución ácida es mayor de 0,05M. De forma típica, la relación de HA a colágeno en la suspensión es al menos 2:10 (p/v), 3:10 (p/p), 4:10 (p/p), 5:10 (p/p). En una realización preferida de la invención, la relación de HA a colágeno varía de 1:10 (p/p) a 50:10 (p/p), de forma adecuada de 5:10 (p/p) a 30:10 (p/p). De forma adecuada, la molaridad de la solución ácida es al menos 0,06M, 0,07M, 0,08M, 0,09M, 0,10M, 0,20M, 0,30M, 0,40M o 0,50M. Lo ideal, la molaridad de la solución ácida varía de 0,4M a 0,6M.

En una realización preferida de la invención, la relación de HA a colágeno en la suspensión es al menos 5:10 (p/p), y en la que la molaridad de la solución ácida es al menos 0,10M. De forma típica, la molaridad de la solución ácida es al menos 0,50M.

En una realización preferida de la invención, la relación de HA a colágeno en la suspensión es al menos 6:10 (p/p),

7:10 (p/p), 8:10 (p/p), 9:10 (p/p) o 1:1 (p/p). En una realización de la invención, la relación de HA a colágeno en la suspensión es mayor de 1:1 (p/p). En general, cuando se emplean tales niveles de HA en la suspensión, la molaridad de la solución ácida será de al menos 0,5M.

En una realización preferida, la cantidad de colágeno en la suspensión puede variar de 4,0 g/l a 6,0 g/l.

De forma típica, la solución ácida comprende una solución de ácido acético. Sin embargo, para formar la solución ácida se pueden emplear otros ácidos orgánicos.

De forma adecuada, la suspensión homogénea de colágeno/HA se forma en condiciones adecuadas para minimizar la gelatinización del colágeno. Un procedimiento para garantizar una mínima gelatinización de colágeno durante la producción de la suspensión homogénea es mantener la suspensión a una temperatura suficientemente baja, en general de 1 °C a 5 °C, adecuadamente a aproximadamente 4°C.

La liofilización se lleva a cabo a una velocidad de enfriamiento constante. Esto significa que la velocidad de enfriamiento durante la liofilización no varía en más de +/-10% de la velocidad de enfriamiento objetivo, es decir, si la velocidad de enfriamiento deseada es de 1,0 °C/min, y la velocidad de enfriamiento real varía de 0,9 °C/min a 1,1 °C/min, esta se consideraría, no obstante, una velocidad de enfriamiento constante. De forma típica, la velocidad de enfriamiento constante varía de 0,1 °C/min a 10 °C/min. Preferiblemente, la liofilización se lleva a cabo a una velocidad de enfriamiento constante de 0,5 °C/min a 1,5 °C/min. Más referiblemente, la liofilización se lleva a cabo a una velocidad de enfriamiento constante de 0,8 °C/min a 1,1 °C/min. De forma típica, la liofilización se lleva a cabo a una velocidad de enfriamiento constante de aproximadamente 0,9 °C/min. La temperatura de la cámara de liofilización al comenzar el procedimiento de liofilización (es decir, cuando la suspensión se coloca en la cámara) normalmente es mayor de 0 °C, preferiblemente a aproximadamente la temperatura ambiente.

La temperatura de congelación final deseada varía de -10 °C a -70 °C. De forma adecuada, la temperatura de congelación final deseada varía de -30 °C a -50 °C. De forma típica, la temperatura de congelación final deseada varía de -35 °C a -45 °C, de forma ideal aproximadamente -40 °C.

El procedimiento de liofilización incluye una etapa de secado, que se lleva a cabo después de que se alcanza la temperatura de congelación final. Esta etapa conlleva calentar la cámara de liofilización hasta una temperatura de sublimación (en general aproximadamente 0 °C), preferiblemente a una velocidad de calentamiento constante. El procedimiento incluye, de forma típica, una etapa de sublimación final en la que sublima una fase de hielo en el andamio formado a vacío durante un período de tiempo adecuado.

En otra realización de la invención, el procedimiento de liofilización comprende una etapa de recocido. De forma típica, esta etapa implica aumentar la temperatura de la cámara de liofilización después de que se ha alcanzado la temperatura de congelación y, de forma típica, mantener la temperatura aumentada durante un período de tiempo antes de iniciar la etapa de secado. Por ejemplo, si la temperatura de congelación final es de -20 °C, la etapa de recocido se puede llevar a cabo aumentando la temperatura en etapas hasta -10 °C, y manteniendo a dicha temperatura durante un tiempo suficiente para permitir que exista crecimiento de cristales de hielo, antes de finalizar el secado del andamio. El tiempo de recocido puede variar de acuerdo con las características de poro deseadas, no obstante, se prefieren tiempos de recocido de 15 minutos a 120 horas.

En general, la HA empleada en la presente invención está en forma de polvo. De forma adecuada, el polvo de HA se selecciona del grupo que consiste en polvo de HA sinterizado; y polvo de HA no sinterizado. Ejemplos de polvos de HA sinterizados y no sinterizados, adecuados para la presente invención serán conocidos por los expertos en la técnica y se proporcionan más adelante.

De forma típica, el polvo de HA tiene un tamaño de partículas de 10 nm a 100 !m.

De forma adecuada, el colágeno empleado en la presente invención comprende fibras de colágeno. Preferiblemente, las fibras de colágeno comprenden colágeno microfibrilar, preferiblemente colágeno de tendón bovino microfibrilar.

De forma adecuada, la suspensión de colágeno se mezcla por centrifugación, y se añade la HA al vórtice de la suspensión durante la mezcla en la centrífuga.

De forma típica, la HA se añade en alícuotas. De forma adecuada, las alícuotas se añaden a la suspensión de colágeno a intervalos de 30 a 240 minutos. Preferiblemente, la HA se añade a la suspensión de colágeno en 2 a 5 alícuotas.

En una realización de la invención, el andamio de material compuesto se reticula. De forma típica, el andamio de material compuesto se reticula por un medio seleccionado del grupo que comprende: reticulación deshidrotérmica y reticulación química. Agentes de reticulación química y procedimientos adecuados serán bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDAC). Cuando se emplea reticulación deshidrotérmica, la temperatura de reticulación varía de 105 °C a 180 °C. De forma adecuada, el proceso de reticulación se lleva a cabo durante al menos 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas o 120 horas. Cuando se emplea reticulación con EDAC, la molaridad de la solución de EDAC es 6 mmol por gramo de material compuesto de colágeno/HA.

La invención también se refiere a un andamio de material compuesto de colágeno/hidroxiapatita (HA) que puede obtenerse por el procedimiento de la invención.

La invención también se refiere a un andamio de material compuesto de colágeno/hidroxiapatita (HA) de acuerdo con las reivindicaciones 10 a 13.

Preferiblemente, el andamio de material compuesto de la invención tiene una porosidad de al menos 99% (v/v),

99,1% (v/v), 99,2% (v/v), 99,3% (v/v). De forma adecuada, el andamio de material compuesto de la invención tiene una porosidad de 98 a 99,5% (v/v), y más preferiblemente de 98,5 a 99,5% (v/v). El procedimiento para determinar el % de porosidad de describe más adelante.

De forma adecuada, el andamio de material compuesto de la invención tiene una rigidez en compresión de al menos 0,5 kPa, 0,6 kPa. De forma adecuada, el andamio de material compuesto de la invención tiene una rigidez en compresión de 1 a 5 kPa, preferiblemente de 1 a 4 kPa. Los andamios de material compuesto de EDAC reticulados tienen una rigidez en compresión de al menos 1 kPa, 1,5 kPa, 2 kPa, 2,5 kPa, 3 kPa, 3,5 kPa, 4 kPa. El procedimiento para determinar la rigidez en compresión se describe más adelante.

De forma típica, la relación de HA a colágeno en el andamio de material compuesto varía de 1:10 a 50:10 (p/p), y preferiblemente al menos 2:10 (p/p, 3:10 (p/p), 4:10 (p/p), 5:10 (p/p), 6: 10 (p/p), 7:10 (p/p), 8:10 (p/p), 9:10 (p/p) o

1:1 (p/p). En una realización particularmente preferida de la invención, la relación de HA a colágeno en el andamio de material compuesto varía de 5:10 a 30:10 (p/v).

La bioactividad in vitro del andamio de material compuesto de la invención se puede caracterizar controlando la actividad de osteoblastos MC3T3 en el andamio después de incubación durante 1 día (para controlar el grado de unión celular inicial), 7 días, 21 días y 28 días (para controlar la proliferación celular). En una realización de la invención, el andamio de material compuesto de la invención se caracteriza por un nivel de proliferación de osteoblastos MC3T3 en el andamio, después de 7 días de incubación, mayor que el número inicial de células sembradas en el andamio. De forma típica, esto es al menos 1 x 106 células por 500 mm3 de volumen del andamio. En una realización preferida de la invención, el andamio de material compuesto se caracteriza por un nivel de proliferación de osteoblastos MC3T3 en el andamio a los 28 días de incubación menos el nivel a los 7 días de al menos 0,5 x 106 células, y adecuadamente de 0,5 x 106 a 1,5 x 106 células. Un procedimiento para determinar el nivel de proliferación de osteoblastos MC3T3 es como sigue: Se siembra una muestra cilíndrica de andamio de material compuesto de 12,7 mm de diámetro con 2 x 106 células MC3T3. Después de 7 días de incubación, se determina el número de células presentes por andamio usando el ensayo de ADN con Hoechst 33258. Esto da una valoración de la unión inicial de las células. Después de 14, 21 y 28 días de incubación, se determina el número de células presentes por andamio usando el ensayo de ADN con Hoechst 33258. El cambio en el número de células presentes por andamio en el tiempo (número de células en el día 28 menos número de células en el día 7) se usa para determinar la proliferación celular.

En una realización, el andamio de material compuesto de la invención se caracteriza por tener una conductividad del bajo presión a través del andamio de al menos 1 x 10-10 m4/Ns, de forma adecuada de 6 x 10-10 m4/Ns a 1,4 x 10-9 m4/Ns, preferiblemente de 8 x 10-10 m4/Ns a 1,2 x 10-9 m4/Ns. De forma típica, una conductividad del flujo bajo presión a través del andamio es de al menos 10 x 10-10 m4/Ns.

Lo ideal es que el andamio de material compuesto de la invención tenga un alto grado de interconectividad de poros. Preferiblemente, el andamio tiene una distribución de poros homogénea. De forma típica, el andamio tiene un tamaño de poros homogéneo. En una realización, el andamio se produce en forma de hoja. De forma típica, la hoja tiene un grosor promedio de al menos 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm o 10 mm.

La invención también se refiere a un andamio de material compuesto de la invención, o que puede obtenerse por un procedimiento de la invención, que se siembra con células. De forma típica, las células son citoblastos que no están diferenciados, están parcialmente diferenciados o están totalmente diferenciados. En una realización, las células se seleccionan del grupo que consiste en: osteoblastos; y citoblastos mesenquimatosos.

La invención también se refiere a un implante óseo osteoconductor que comprende un andamio de material compuesto de acuerdo con la invención.

La invención se refiere también a un implante elaborado por ingeniería tisular que comprende un andamio de material compuesto de acuerdo con la invención. Así, el andamio de la invención puede formar una base sobre la cual se puede obtener tejido por ingeniería tisular. Se prevén diversas formas de tejido para esta invención, incluyendo, aunque sin quedar limitadas a las mismas, cartílago, ligamentos, músculo y órganos.

La invención se refiere también a un sustituto de injerto óseo maxilofacial que comprende un andamio de material compuesto de acuerdo con la invención.

La invención se refiere también a un sustituto de injerto óseo dental que comprende un andamio de material compuesto de acuerdo con la invención.

La invención se refiere también a un implante de reparación de defectos del cartílago que comprende un andamio de material compuesto de acuerdo con la invención.

La invención se refiere también a un implante de reparación de defectos osteocondrales que comprende un andamio de material compuesto de acuerdo con la invención.

La invención propuesta se produce a partir de dos constituyentes principales del hueso, a saber, la fase mineral,

hidroxiapatita (HA) y la fase orgánica, colágeno. Como tal, este es un sustrato mucho más natural que cualquiera de los materiales descritos con anterioridad que promueven la formación de hueso. Además, combinando la elevada rigidez mecánica de la HA con la biocompatibilidad, biodegradabilidad y arquitectura de poros de un andamio de colágeno elaborado usando el procedimiento específico de la invención, se ha desarrollado un producto que cumple todos los criterios requeridos para su uso como un andamio osteoconductor, incluyendo una excelente rigidez en compresión (para facilitar la manipulación y carga in vivo) y un alto grado de porosidad, interconectividad de poros y permeabilidad.

La hidroxiapatita es un material cerámico. Las cerámicas son compuestos inorgánicos, no metálicos que forman enlaces iónicos y covalentes. Estas se caracterizan por una elevada rigidez mecánica, muy baja elasticidad y una superficie quebradiza y dura. En el tejido vivo, la HA se combina con colágeno para formar los constituyentes primarios del hueso. Como material, esta presenta un parecido tanto químico como cristalino con el mineral del hueso. Sin embargo, las construcciones de HA pura no son atractivas por una serie de razones, lo más notable, la rigidez, la naturaleza quebradiza y la baja capacidad de reabsorción del material [1]. Por consiguiente, la estabilidad y el control de la velocidad de degradación de la construcción es problemática [2], inhibiendo gravemente la reabsorción óptima, el posterior recrecimiento del tejido y la restauración de la integridad mecánica del sitio del defecto, los cuales son todos determinantes significativos para una implantación con éxito.

Al contrario que la HA, el segundo constituyente de la presente invención, el colágeno, ya cumple todos los determinantes biológicos requeridos para una implantación con éxito. Es un polímero natural presente en numerosos tejidos en el cuerpo humano, presentando de este modo una excelente biocompatibilidad. Como resultado, el colágeno promueve la adhesión celular, la proliferación y la formación de matriz extracelular (ECM). Su velocidad de degradación puede controlarse in vivo variando la densidad de reticulación. Las reticulaciones son enlaces químicos entre las moléculas de colágeno. Estas proporcionan la resistencia mecánica del colágeno y estabilizan las fibras de colágeno evitando que las moléculas largas de colágeno con forma de bastones resbalen entre sí bajo el esfuerzo [3]. La reticulación también es un medio eficaz para controlar la velocidad de degradación de los andamios de colágeno, puesto que las reticulaciones deben romperse antes de que se degrade el andamio.

Existen diversos procedimientos para aumentar el nivel de reticulación en andamios de colágeno. Otro atributo significativo es la reciente aprobación por parte de la FDA y el éxito clínico de los andamios basados en colágeno usados para regeneración cutánea y nerviosa [4]. El principal inconveniente asociado con el colágeno como andamio es su inherente falta de resistencia mecánica. Por consiguiente, esta invención combina colágeno y HA para formar una construcción tridimensional de material compuesto con las ventajas de ambos constituyentes y ninguna de las desventajas.

Además de los actuales materiales constituyentes por sí mismos, el procedimiento de elaboración del andamio y posterior morfología de la construcción es vital en la determinación del éxito in vivo del implante del andamio. La elaboración de la presente invención implica el uso de una técnica de elaboración de un andamio de colágeno especializada que, de forma típica, incluye liofilización/secado por congelación. Tradicionalmente, la elaboración de andamios porosos usando liofilización implica la congelación rápida o inactivación de los materiales constituyentes del andamio mezclados entre sí en una suspensión. Esto da como resultado una distribución de poros extremadamente irregular y un elevado grado de variación en el tamaño de poros. Adicionalmente, la inactivación altera la relación de aspecto de los poros creados, conduciendo a formas de poro con diferentes magnitudes en las tres dimensiones. El procedimiento de elaboración mediante secado por congelación de la presente invención facilita el control exhaustivo de todos los determinantes morfológicos principales de la viabilidad del andamio. Lo hace controlando de forma precisa la temperatura y presión en la cámara de secado por congelación durante las etapas de congelación y secado del proceso. Se ha demostrado que una congelación o secado no controlado en cualquier punto durante el procedimiento de elaboración conduce a distribuciones de poro, formas y tamaños heterogéneos, los cuales son todos determinantes clave en la viabilidad de las células sembradas. Usando un procedimiento de secado por congelación, se pueden elaborar andamios basados en colágeno porosos, reproducibles y homogéneos de forma repetida con elevadas interconectividad de poros, porosidad y área de la superficie, las cuales son todas clave para el éxito en el transporte masivo de células en el andamio y tejido del huésped circundante y proporciona un espacio para la vascularización y recrecimiento de nuevo tejido. Además, el procedimiento de la invención permite el control extensivo del tamaño de poros de la construcción, facilitando una funcionalidad específica de las células. La presente divulgación describe la elaboración de un andamio de material compuesto, mediante el uso del procedimiento de la invención que da como resultado un andamio poroso, tridimensional que tiene una alta porosidad, alta interconectividad de poros y una distribución homogénea de HA en la matriz de colágeno.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Rigidez en compresión del andamio no reticulado con EDAC como función del tipo de andamio.

(Colágeno = andamio control de colágeno mezclado en ácido acético 0,05M, 10% en peso de HA = colágeno + 10% en peso de HA peso mezclado en ácido acético 0,05M, 50% e peso de HA(L) = colágeno + 50% en peso de HA mezclado en ácido acético 0,1M, 50% en peso de HA = colágeno + 50% en peso de HA mezclado en ácido acético 0,5M).

Figura 2: Rigidez en compresión de andamio reticulado con EDAC como función del tipo de andamio.

(Colágeno = andamio control de colágeno reticulado con EDAC mezclado en ácido acético 0,5M, 50 HA = colágeno reticulado con EDAC + 50% en peso de HA mezclado en ácido acético 0,5M, 100 HA = colágeno reticulado con EDAC + 100% en peso de HA mezclado en ácido acético 0,5M, 200 HA = colágeno reticulado con EDAC + 200% en peso de HA mezclado en ácido acético 0,5M).

Figura 3: Porosidad del andamio en función del tipo de andamio.

(Colágeno = Andamio control de colágeno no reticulado con EDAC mezclado en ácido acético 0,5M, 50 HA = Colágeno del andamio no reticulado con EDAC + 50% en peso de HA mezclado en ácido acético 0,5M, 100 HA = Colágeno del andamio no reticulado con EDAC + HA al 100% en peso mezclado en ácido acético 0,5M, 200 HA = Colágeno del andamio no reticulado con EDAC + 200% en peso de HA mezclado en ácido acético 0,5M).

Figura 4: Bioactividad in vitro en función del tipo de andamio (t = 7, 14, 21, 28 días)

Densidad de siembra inicial de 2 millones de células usadas en todos los andamios. (Colágeno = andamio control de colágeno reticulado con EDAC mezclado en ácido acético 0,5M, 50 HA = colágeno reticulado con EDAC + 50% en peso de HA mezclado en ácido acético 0,5M, 100 HA = colágeno reticulado con EDAC + 100% en peso de HA mezclado en ácido acético 0,5M, 200 HA = colágeno reticulado con EDAC + 200% en peso de HA mezclado en ácido acético 0,5M).

Figura 5: Bioactividad in vitro en función del tipo de andamio (t = 28 días - 7 días)

Nueva bioactividad de andamios entre el día 7 y el día 28 (colágeno = andamio control de colágeno reticulado con EDAC mezclado en ácido acético 0,5M, 50 HA = colágeno reticulado con EDAC + 50% en peso de HA mezclado en ácido acético 0,5M, 100 HA = colágeno reticulado con EDAC + 100% en peso de HA mezclado en ácido acético 0,5M, 200 HA = colágeno reticulado con EDAC + 200% en peso de HA mezclado en ácido acético 0,5M).

Figura 6: Imagen de escáner de MicroTC del andamio de material compuesto de acuerdo con la invención.

Figura 7: Sección del andamio de la Figura 6.

Figura 8: Imagen SEM del andamio con 50% en peso de HA que destaca la estructura de poros homogéneos e interconectados.

Figura 9: Distribución de partículas minerales de la región de interés definida en la Figura 8.

Figuras 10 y 11: Imágenes SEM de un andamio de material compuesto con 50% en peso de HA no reticulado con EDAC conforme a un aumento de 10 veces y 100 veces, respectivamente.

Figura 12: Permeabilidad del andamio en función del tipo de andamio.

Figura 13: Rayos X de un hueso de la bóveda craneal de rata y dibujo esquemático adjunto que muestra la posición del defecto y las posiciones de las secciones tomadas de las imágenes del escáner de TC.

Figura 14: Imágenes de escáner de MicroTC de un hueso de la bóveda craneal de rata que tiene un defecto vacío.

Figuras 15 y 16: Imágenes de escáner de MicroTC de un hueso de la bóveda craneal de rata que tiene un defecto relleno con un andamio de material compuesto de 50% en peso de HA reticulado con EDAC de la invención sembrado con células MSC de rata.

Figuras 17 y 18: Imágenes de escáner de MicroTC de un hueso de la bóveda craneal de rata que tiene un defecto relleno con un andamio de material compuesto de 200% en peso de HA reticulado con EDAC de la invención sembrado con células MSC de rata.

Figuras 19 y 20: Imágenes de escáner de MicroTC de un hueso de la bóveda craneal de rata que tiene un defecto relleno con un andamio de material compuesto de 50% en peso de HA reticulado con EDAC de la invención (sin sembrar).

Figuras 21 y 22: Imágenes de escáner de MicroTC de un hueso de la bóveda craneal de rata que tiene un defecto relleno con un andamio de material compuesto de 200% en peso de HA reticulado con EDAC de la invención (sin sembrar).

Descripción detallada de la invención

Elaboración de la invención. Se elaboraron andamios control de colágeno y andamios con 10% en peso de HA usando el protocolo descrito en la Realización 1, de forma específica, usando una concentración inicial de ácido acético de 0,05M. A medida que aumentaba la relación de HA hasta un 50% en peso de HA, la mezcla homogénea de los dos constituyentes principales (colágeno y HA) se hacía más problemática. Se encontró que un aumento en la concentración inicial de ácido acético aliviaba este problema. El efecto de este aumento en la concentración de ácido acético se investigó usando dos aumentos diferentes en la concentración de ácido acético, específicamente 0,1M y 0,5M. Estas realizaciones se describen en los Ejemplos 2 y 3, respectivamente. La elaboración de andamios control de colágeno reticulados con EDAC y andamios de material compuesto que tienen 50% en peso, 100% en peso y 200% en peso de HA, se describe en el Ejemplo 4.

Ejemplo 1

Se prepararon 400 ml de una solución de ácido acético 0,05M (pH 3,05) usando agua destilada, desionizada (se añadieron 1,16 ml de ácido acético glacial a 398,84 ml de agua destilada, desionizada).

Se usó un sistema de enfriamiento de agua WKI250 (Lauda, Westbury, NY, EEUU) para enfriar un recipiente de reacción de vidrio hasta una temperatura constante de 4 °C durante una hora. Este recipiente de reacción se usó para mezclar los constituyentes del andamio mientras se mantenía la suspensión a una temperatura constante de 4 °C. Esto evitaba la desnaturalización de las fibras de colágeno como resultado de la generación de calor durante el proceso de mezcla. Se añadieron 1,8 g de colágeno de tendón bovino microfibrilar (Collagen Matrix Inc., NJ, EEUU) a 320 ml de la solución de ácido acético 0,05 M. Se mezcló esta suspensión usando un mezclador superior Ultra Turrax T18 de IKA (IKA Works Inc., Wilmington, NC) a 15.000 rpm durante 90 minutos a 4 °C. Se mezclaron 40 ml de la solución de ácido acético con polvo de hidroxiapatita (HA) (Biotal, Reino Unido), específicamente 10% en peso de colágeno (0,18 g de HA). Se añadió una alícuota de 10 ml de esta solución de ácido acético/HA a la suspensión de colágeno/ácido acético en el recipiente de reacción enfriado a los 90 minutos. El procedimiento de suministro de la suspensión de HA implicaba una agitación vigorosa de la suspensión inmediatamente antes de la inyección (garantizando una suspensión homogénea de las partículas minerales) en el centro del vórtice del mezclador mediante una jeringa. Se conectó un tubo de caucho a la boquilla de la jeringa para facilitar la inyección directamente en el centro del vórtice del mezclador. Se añadieron a continuación alícuotas de 10 ml (tres en total) a la suspensión cada hora. Después de añadir la alícuota final de solución de HA en ácido acético, la suspensión se mezcló durante los siguientes 60 minutos, llevando a un tiempo total de mezcla de 330 minutos (cinco horas y media).

Una vez completada la etapa de mezcla, se transfirió la suspensión a un matraz cónico limpio y se desgasificó a vacío a una presión de aproximadamente 4000 mTorr durante otros 60 minutos. Esta etapa eliminó todas las burbujas de aire no deseadas en la suspensión ya que estas tendrían un efecto perjudicial sobre el posterior proceso de secado por congelación. El andamio se produjo usando un proceso de liofilización (secado por congelación). Se colocó una alícuota de 67,5 ml de la suspensión de colágeno/HA en una bandeja de muestras de una cámara liofilizadora suministrada por el fabricante del liofilizador (VirTis Co., Gardiner, NY, EEUU) y realizada en acero inoxidable calidad 304. Las dimensiones internas de la bandeja de muestras eran 127 mm de anchura x 127 mm de longitud x 38 mm de altura. El grosor de la placa base de la bandeja es de 3 mm. La bandeja de muestras se colocó en la cámara de liofilización y se colocó en el estante de enfriamiento del liofilizador a una temperatura de 20 °C.

El proceso de secado por congelación implicó el enfriamiento de la cámara de liofilización y el estante de enfriamiento a una velocidad de enfriamiento constante (0,9 °C/min), basándose en un estudio previo, hasta la temperatura de congelación final (40 °C). La variable principal de la morfología del cristal de hielo durante el proceso de secado por congelación es la temperatura de congelación final. La temperatura del estante y de la cámara se mantuvo entonces constante a la temperatura de congelación final durante 60 minutos hasta completar el proceso de congelación. La temperatura del estante se incrementó entonces hasta 0 °C durante 160 minutos. La fase de hielo sublimó entonces a un vacío de aproximadamente 200 mTorr a 0 °C durante 17 horas para producir el andamio poroso de colágeno/HA.

La construcción porosa de colágeno/HA se colocó entonces en un horno de vacío (Fisher IsoTemp 201, Fisher Scientific, Boston, MA) para reticular el colágeno mediante un proceso de reticulación deshidrotérmico. Los andamios se colocaron en el horno de vacío a una temperatura de 120 °C bajo un vacío de 50 mTorr durante 24 horas.

Ejemplo 2

Se prepararon 400 ml de una solución de ácido acético 0,1M (pH 2,9) usando agua destilada, desionizada (se añadieron 2,32 ml de ácido acético glacial a 397,68 ml de agua destilada, desionizada). Se usó un sistema de enfriamiento de agua WKI250 (Lauda, Westbury, NY, EEUU) para enfriar un recipiente de reacción de vidrio hasta una temperatura constante de 4 °C durante una hora. Se añadieron 1,8 g de colágeno de tendón bovino microfibrilar (Collagen Matrix Inc., NJ, EEUU) a 320 ml de la solución de ácido acético 0,1 M. Se mezcló esta suspensión usando un mezclador superior Ultra Turrax T18 de IKA (IKA Works Inc., Wilmington, NC) a 15.000 rpm durante 90 minutos a 4°C.

Se mezclaron 40 ml de la solución de ácido acético con polvo de hidroxiapatita (HA) (Biotal, Reino Unido), específicamente 50% en peso de colágeno (0,9 g de HA). Se añadió una alícuota de 10 ml de esta solución de ácido acético/HA a la suspensión de colágeno/ácido acético en el recipiente de reacción enfriado a los 90 minutos. Se añadieron a continuación alícuotas de 10 ml (tres en total) a la suspensión cada hora. Después de añadir la alícuota final de solución de HA en ácido acético, la suspensión se mezcló durante los siguientes 60 minutos, llevando a un tiempo total de mezcla de 330 minutos (cinco horas y media). Una vez completada la etapa de mezcla, se transfirió la suspensión a un matraz cónico limpio y se desgasificó a vacío a una presión de aproximadamente 4000 mTorr durante otros 60 minutos.

El andamio se produjo usando un proceso de liofilización (secado por congelación). Se colocó una alícuota de 67,5 ml de la suspensión de colágeno/HA en una bandeja de muestras de una cámara liofilizadora suministrada por el fabricante del liofilizador (VirTis Co., Gardiner, NY, EEUU) y realizada en acero inoxidable calidad 304. Las dimensiones internas de la bandeja de muestras eran 127 mm de anchura x 127 mm de longitud x 38 mm de altura. El grosor de la placa base de la bandeja es de 3 mm. La bandeja de muestras se colocó en la cámara de liofilización y se colocó en el estante de enfriamiento del liofilizador a una temperatura de 20 °C.

El proceso de secado por congelación implicó el enfriamiento de la cámara de liofilización y el estante de enfriamiento a una velocidad de enfriamiento constante (0,9 °C/min), hasta la temperatura de congelación final (40 °C). La temperatura del estante y de la cámara se mantuvo entonces constante a la temperatura de congelación final durante 60 minutos. La temperatura del estante se incrementó entonces hasta 0 °C durante 160 minutos. La fase de hielo sublimó entonces a un vacío de aproximadamente 200 mTorr a 0 °C durante 17 horas.

Ejemplo 3

Se prepararon 400 ml de una solución de ácido acético 0,5M (pH 2,55) usando agua destilada, desionizada (se añadieron 11,6 ml de ácido acético glacial a 388,4 ml de agua destilada, desionizada). Se usó un sistema de enfriamiento de agua WKI250 (Lauda, Westbury, NY, EEUU) para enfriar un recipiente de reacción de vidrio hasta una temperatura constante de 4 °C durante una hora. Se añadieron 1,8 g de colágeno de tendón bovino microfibrilar (Collagen Matrix Inc., NJ, EEUU) a 320 ml de la solución de ácido acético 0,5 M. Se mezcló esta suspensión usando un mezclador superior Ultra Turrax T18 de IKA (IKA Works Inc., Wilmington, NC) a 15.000 rpm durante 90 minutos a 4°C.

Se mezclaron 40 ml de la solución de ácido acético con polvo de hidroxiapatita (HA) (Biotal, Reino Unido), específicamente 50%, 100% y 200% en peso de colágeno (0,9, 1,8 y 3,6 g de HA). Se añadió una alícuota de 10 ml de esta solución de ácido acético/HA a la suspensión de colágeno/ácido acético en el recipiente de reacción enfriado a los 90 minutos. Se añadieron a continuación alícuotas de 10 ml (tres en total) a la suspensión cada hora. Después de añadir la alícuota final de solución de HA en ácido acético, la suspensión se mezcló durante los siguientes 60 minutos, llevando a un tiempo total de mezcla de 330 minutos (cinco horas y media). Una vez completada la etapa de mezcla, se transfirió la suspensión a un matraz cónico limpio y se desgasificó a vacío a una presión de aproximadamente 4000 mTorr durante otros 60 minutos.

El proceso de secado por congelación implicó el enfriamiento de la cámara de liofilización y el estante de enfriamiento a una velocidad de enfriamiento constante (0,9 °C/min), hasta la temperatura de congelación final (40 °C). La temperatura del estante y de la cámara se mantuvo entonces constante a la temperatura de congelación final durante 60 minutos. La temperatura del estante se incrementó entonces hasta 0 °C durante 160 minutos. La fase de hielo sublimó entonces a un vacío de aproximadamente 200 mTorr a 0 °C durante 17 horas para producir el andamio poroso de colágeno/HA.

Ejemplo 4

Se prepararon 400 ml de una solución de ácido acético 0,5M (pH 2,55) usando agua destilada, desionizada (se

añadieron 11,6 ml de ácido acético glacial a 388,4 ml de agua destilada, desionizada). Se usó un sistema de enfriamiento de agua WKI250 (Lauda, Westbury, NY, EEUU) para enfriar un recipiente de reacción de vidrio hasta una temperatura constante de 4 °C durante una hora. Se añadieron 1,8 g de colágeno de tendón bovino microfibrilar (Collagen Matrix Inc., NJ, EEUU) a 320 ml de la solución de ácido acético 0,5 M. Se mezcló esta suspensión usando un mezclador superior Ultra Turrax T18 de IKA (IKA Works Inc., Wilmington, NC) a 15.000 rpm durante 90 minutos a 4°C.

Después del procedimiento de reticulación DHT, se reticularon los andamios químicamente usando clorhidrato de etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDAC) como agente reticulante. Se mezcló EDAC a una concentración de 6 mmol de EDAC por gramo de andamio en una relación molar de 5:2 con N-hidroxisuccinimida (EDAC:NHS = 5:2). Los andamios se sumergieron en esta solución de EDAC/NHS y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. A continuación, se aclararon los andamios dos veces usando solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se incubó en PBS durante dos horas usando un agitador orbital para agitar el PBS.

Caracterización de los andamios de material compuesto

Para los propósitos de este estudio, todos los andamios de colágeno/HA elaborados se compararon con un andamio control realizado en colágeno, elaborado usando el protocolo convencional usado en este laboratorio de investigación, de forma específica, en solución de ácido acético 0,5M y se liofilizaron a una velocidad de enfriamiento constante hasta una temperatura de congelación final de 40 °C.

1. Rigidez mecánica

Para garantizar la supervivencia una vez implantado en un defecto óseo, un sustituto de injerto óseo debe poseer suficiente resistencia intrínseca para soportar las fuerzas a las que se ve sometido al soportar cargas en el sitio del defecto afectado. La capacidad para elaborar de forma personalizada un sustituto de injerto óseo osteoconductor con suficiente resistencia intrínseca para permitir su implantación en un defecto que soporta carga fue el objetivo principal de este estudio. Mediante el uso de tecnología de materiales compuestos, se combina una construcción a base de colágeno extremadamente biocompatible con la hidroxiapatita cerámica más resistente para desarrollar un sustituto de injerto óseo con todas las ventajas de ambos materiales y ninguna de sus desventajas. Todos los ensayos se llevaron a cabo en andamios hidratados con solución salina tamponada con fosfato (PBS). El ensayo de compresión en muestras de andamios se llevó a cabo usando una máquina de ensayos mecánicos Zwick provista de una célula de carga de 5-N. Se cortaron muestras de 8 mm de diámetro (4 mm de altura) de las hojas usando un punzón de cuero afilado con una lima metálica redondeada. Las muestras se hidrataron entonces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) una hora antes del ensayo en una placa de cultivo de 24 pocillos. El protocolo de ensayo consistía en dos ciclos: un ciclo de preacondicionamiento y un ciclo de ensayo. Para ambos ciclos se aplicó una carga previa de 0,15 nM y se mantuvo la posición durante un minuto. Esta fuerza se seleccionó puesto que es suficientemente baja (0,5% de la carga a una deformación del 10%) para garantizar el contacto con la muestra sin compresión suficiente de la muestra antes del ensayo. La posición de la platina superior en esta carga previa se usó

para medir la altura del andamio. Se colocaron andamios hidratados en una platina seca que se había sumergido antes de bajar la platina superior. Se puso cuidado en garantizar que no quedaban burbujas atrapadas entre la platina superior y el andamio. Para el preacondicionamiento, se cargaron las muestras hasta un 5%. Para el ensayo, se cargaron las muestras hasta un 10% y se descargaron. Se usó una velocidad de deformación del 10% por minuto. Después del ensayo se midió el diámetro de las muestras en tres posiciones separadas usando un calibre Vernier. Se definió el módulo como la pendiente de un ajuste lineal a la curva de tensión-deformación a una deformación de 2-5%.

La Figura 1 muestra el efecto de añadir HA al andamio reticulado sin EDAC sobre la rigidez en compresión. Se encontró que la adición de un 50% en peso de HA aumentó significativamente la rigidez en compresión medida por ensayo mecánico en compresión no confinada. Se apreció un aumento en la rigidez en compresión de casi un 300% relativo a productos control de andamios de colágeno. De particular interés fue el efecto de la concentración de ácido acético sobre la eficacia de incorporación de HA en la construcción. Se cree que explica el aumento relativamente grande de la rigidez incorporando un 10% en peso de HA en la suspensión de colágeno convencional sin aumentar correspondientemente la concentración de ácido acético. En conclusión, con una adición de tan solo un 50% en peso de HA, se consigue un aumento mayor de la rigidez de más del triple y mediante ligeros ajustes en la concentración de ácido acético, se pueden conseguir máximos aumentos en la rigidez de la construcción con la adición de cantidades relativamente pequeñas de HA. Por consiguiente, esto permitirá aumentos significativos en la relación de HA añadido alterando correspondientemente la concentración inicial de ácido acético en futuros estudios.

La Figura 2 muestra el efecto de añadir HA al andamio reticulado con EDAC sobre la rigidez en compresión. El andamio de partida, colágeno, aumenta su rigidez de 0,2 kPa en la Figura 1 a aproximadamente 1,5 kPa en la Figura

2. La adición de HA aumenta aun la rigidez de los andamios como se pretende, pero en menores cantidades de HA, tales como 50% en peso de HA, el efecto de la reticulación con EDAC eclipsa esto. Sin embargo, a un 200% en peso de HA, se aprecia un aumento significativo en la rigidez como antes. La adición de pequeñas cantidades de HA mostró que aumentaba significativamente aspectos de biocompatibilidad de los andamios reticulados y esto se describe más adelante en las secciones 5 y 7.

2. Porosidad de la invención

La porosidad de un andamio poroso es una medida de la proporción del volumen de andamio compuesto de espacio poroso, abierto, expresado como porcentaje. En términos más sencillos, es el porcentaje de volumen de poros de una construcción porosa. Se requiere una elevada porosidad del andamio para la difusión de nutrientes/materiales de desecho hacia/desde las células tanto in vitro como in vivo. Una de las limitaciones principales en el desarrollo de andamios de tejido preparados por ingeniería tisular ha sido el problema de la degradación del núcleo, que se produce por la falta de suministro de nutrientes y de eliminación de materiales de desecho desde el centro de la construcción. Como resultado, las construcciones fallan con frecuencia una vez implantadas debido a necrosis avascular en el centro del andamio. Una de las grandes ventajas de los andamios basados en colágeno de la presente invención en su alta porosidad. La porosidad del andamio se determinó por la medición precisa de una muestra de andamio seca de 8 mm, 4 mm de profundidad usando un balance de masas. Usando la fórmula para el volumen de un cilindro, ∀r2h, se calculó la densidad de cada muestra dividiendo la masa por el volumen. La porosidad se calculó usando la fórmula 100 -[100(ρandamio / ρmaterial)] donde ρandamio es la densidad de una muestra dada y ρmaterial es la densidad determinada de los constituyentes del andamio (es decir, ρandamio con 10% en peso de HA =

[mcolágeno + m10% en eso de HA]/ [mcolágeno/ρcolágeno + m10% en peso de HA/ρ10% en peso de HA]).

La adición de HA a las construcciones dio como resultado una disminución en la porosidad del andamio pero esta fue despreciable en términos absolutos como puede apreciarse en la Figura 3. Por tanto, los andamios de la invención incorporan HA en la construcción pero reteniendo una porosidad muy alta para mejorar la migración celular en el centro del andamio para estimular la proliferación celular. Se demuestra que esto se cumple en los datos del estudio en animales in vivo mostrado más adelante.

De forma específica, nuestro intervalo de porosidades en andamios producidos realmente varió de un 99,5% para colágeno puro hasta un 99% para andamios con un 200% en peso de HA.

3. Estructura mineral

La distribución de partículas de mineral a lo largo de los andamios es un parámetro/atributo difícil de cuantificar. Es un atributo mucho más fácil de visualizar y, por tanto, es difícil definir un intervalo de valores a proteger. Esta se visualizó usando dos procedimientos diferentes. El primero fue microTC que se muestra en la Figura 6 más adelante. El escáner de microTC usado en este análisis usa rayos X para detectar tejido mineralizado. Por consiguiente, la Figura 6 muestra solo las partículas minerales en un andamio con 100% de HA. Sabiendo que el colágeno no es visible, se puede observar que las partículas minerales están distribuidas de forma completa y uniforme en todo el andamio. Dado que el andamio está vacío en un 99%, esta imagen muestra la evidente conclusión de que el HA está íntimamente asociado con las fibras de colágeno. La Figura 7 muestra una loncha en dos dimensiones del mismo andamio que ilustra la distribución desde otro punto de vista.

Las Figura 8 y 9 ilustran la distribución de las partículas minerales en todo el andamio con 50% en peso de HA

usando una herramienta de visualización diferente, Microscopía Electrónica de Barrido (SEM). Ambas imágenes muestran la misma región de interés en un andamio con 50% en peso de HA. La Figura 8 muestra ambas fases de colágeno y HA. Las partículas minerales no pueden distinguirse a simple vista. Sin embargo, usando el Análisis de rayos X con dispersión de energía, se pueden detectar las partículas minerales para la región idéntica de interés (ROI). Esto se muestra en la Figura 9 como píxeles blancos que representan partículas minerales. Junto con los datos de microTC, estas imágenes demuestran de forma concluyente que las partículas minerales están distribuidas de forma uniforme y homogénea en todo el andamio y que están íntimamente asociadas con los soportes de colágeno.

4. Interconectividad de poros

La interconectividad de poros es otro atributo importante de los andamios que es muy difícil definir de forma cuantitativa en andamios compuestos principalmente de material biológico. Sin embargo, la interconectividad de poros está fuertemente relacionada con la permeabilidad del andamio. La permeabilidad se define más adelante pero la conductividad del flujo depende conjuntamente de la porosidad, el tamaño de poros y la interconectividad de poros. Por consiguiente, la permeabilidad aporta una indicación de la interconectividad de poros cuando se definen el tamaño de poros y la porosidad.

Se proporcionan imágenes SEM de andamios de la invención para ilustrar los niveles extremadamente elevados de interconectividad de poros que se pueden apreciar fácilmente. La Figura 10 muestra un andamio con un 50% en peso de HA a 10 aumentos y la estructura obviamente interconectada en la superficie. Se puede apreciar que es idéntica usando secciones delgadas tomadas de tales muestras. La Figura 11 muestra el mismo andamio con un 50% en peso de HA a 100 aumentos. Esta imagen ilustra la interconectividad de poros. A este aumento, se concluye que la estructura de poros está interconectada.

5. Bioactividad In-Vitro

El efecto de la adición de HA al andamio de colágeno se determinó cuantificando la proliferación de osteoblastos MC3T3E1 en los andamios después de 7, 14, 21 y 28 días de incubación. Se encontró que la adición de HA a los andamios no tenía efectos perjudiciales sobre la actividad celular. De hecho, se encontró lo contrario a los 28 días después de la siembra. Se encontró que aumentar la proporción de HA hasta 200% en peso de HA estimulaba la proliferación celular incluso más que el andamio de colágeno puro control. La Figura 4 muestra los valores absolutos de células retenidas en los andamios.

Como se puede apreciar, los andamios con 50% en peso de HA retuvieron un número significativamente menor de células debido a restricciones empíricas. Por consiguiente, la Figura 4 no da la mejor indicación de la bioactividad. Por consiguiente, la Figura 5 ilustra el número medio de células neto que quedan en los tipos de andamios a los 28 días. Se aprecia una disminución neta de 0,5 millones en la proliferación celular en las construcciones de colágeno puro (aproximadamente un 20% de disminución), que no es sorprendente puesto que la construcción de colágeno puro es favorable pero no está optimizada para células osteoblastos. Sin embargo, la adición de 50% en peso, 100% en peso y 200% en peso de HA da como resultado una mayor proliferación celular de aproximadamente 500%, 50% y 30%, respectivamente (Figura 4).

6.: Permeabilidad de la invención

La permeabilidad de un andamio poroso es esencialmente la conductividad del flujo a presión a través de dicho medio poroso. Una elevada permeabilidad del andamio es fundamental para la viabilidad a largo plazo del andamio in vivo puesto que permite la migración de las células al centro del andamio y facilita la vascularización in vivo. Los andamios con 50% en peso, 100 % en peso y 200% en peso de HA presentaron una permeabilidad del tejido media significativamente aumentada con respecto a los andamios de colágeno control. Esto fue un hallazgo sorprendente pero positivo de este estudio y muestra que la adición de HA realmente ayuda al flujo de fluido por todo el andamio. Se cree que este aumento en la conductividad del flujo por el andamio se debe a la mayor rigidez del andamio. El protocolo empírico usado para cuantificar la permeabilidad del andamio se describe con detalle en la referencia [5] (O’Brien et al, 2007, Sección 2,2, páginas 7-10).

7.: Ensayo en animales in vivo

Se llevó a cabo un pequeño ensayo clínico en animales para determinar el potencial de esta invención para estimular la osteogénesis y mineralización de un defecto de un tamaño de gravedad en el hueso. Durante el ensayo se usaron nueve ratas Wistar. Se creó un defecto de un tamaño de gravedad en la bóveda del cráneo de la rata. Se dejó un animal con un defecto vacío como control. Los otros ocho animales se dividieron en grupos. Concretamente, se llenaron cuatro de los defectos con andamios con 50% en peso de HA, dos de los cuales se sembraron con citoblastos mesenquimatosos (MSC) de rata y dos de los cuales se dejaron sin sembrar. Esto fue así para investigar el potencial del tejido creado por ingeniería tisular frente a los tipos de andamios comerciales. Los defectos de las cuatro muestras restantes se llenaron con andamios con 200% en peso de HA y, de nuevo, estos se dividieron homogéneamente entre andamios sembrados y no sembrados. Después de 28 días en las bóvedas del cráneo de las ratas, los animales se sacrificaron y se extirparon las bóvedas del cráneo. Estas se procesaron y analizaron usando microTC para investigar la presencia de andamio en el defecto y observar el efecto de los tipos de andamio

sobre el proceso de cicatrización, osteogénesis y producción de matriz mineral. Las figuras en las siguientes secciones muestran lonchas en dos dimensiones tomadas de la rata con defecto vacío. Las lonchas eran secciones de corona del hueso de la bóveda del cráneo. Los defectos tenían 5 mm de diámetro y eran perfectamente circulares. Las secciones mostradas en los datos de microTC se representan en forma esquemática más adelante en la Figura 13.

Defecto varío (Fig. 14)

Los datos de animales con defecto vacío mostraron que el defecto se rellenó con tejido fibroso blanco como parte del proceso de cicatrización. Esto era de esperar y se había apreciado en ensayos en animales llevados a cabo con anterioridad en el grupo de ingeniería tisular de los autores. En algunos puntos del defecto después del ensayo de 28 días, se observaron pequeñas partículas de material denso en el defecto vacío pero estos se observaban pocas veces y no fueron suficientemente densos para indicar una cicatrización significativa en la muestra con defecto vacío. Más adelante se muestran ejemplos de estos en las imágenes de rayos X de microTC.

Siembra 1 con 50 % en peso (Fig. 15)

Los andamios sembrados con células con 50% en peso de HA mostraron resultados más prometedores. Estos andamios se sembraron con citoblastos mesenquimatosos de rata antes de implantarlos. Como se puede apreciar de las siguientes imágenes de rayos X de microTC representativas, se apreciaron pequeñas bolsas heterogéneas de material mediadamente mineralizado no solo en la periferia de la interfase defecto-hueso, sino también en el centro de los andamios. Hubo un número significativamente mayor de casos de estas bolsas de mineralización con respecto a los datos del defecto vacío y aparecían con intensidad más brillante con respecto a los casos observados en el defecto vacío.

Siembra 1 con 50 % en peso (Fig. 16)

Los andamios sembrados con células con 50% en peso de HA de la invención mostraron resultados mucho más mejorados con respecto al primer andamio sembrado con células al 50% en peso de HA y, por consiguiente, respecto al defecto vacío. Se apreciaron casos significativos de tejido fuertemente mineralizado en puntos en todo el defecto relleno con andamio. Esto era especialmente evidente en la periferia de la interfase andamio-hueso. El nivel de mineralización no fue tan alto como el observado en el hueso circundante pero era muy similar. Esto puede apreciarse como niveles de intensidad casi idéntica del tejido mineralizado observado en el defecto relleno con andamio y del hueso circundante.

Siembra 1 con 200 % en peso (Fig. 17)

El primer andamio sembrado con células con 200% en peso de HA mostró resultados significativamente mejorados al comparar con los andamios con 50% en peso de HA. Casi en todos los puntos examinados por todo el defecto se observaron niveles significativos de mineralización desde la periferia del defecto en todas direcciones hacia el centro del defecto relleno con andamio. En esta muestra, el nivel de mineralización no fue tan alto como el del tejido óseo circundante indicado por la diferencia relativa en la intensidad de la imagen de las partículas mineralizadas en el defecto relleno de andamio.

Siembra 2 con 200 % en peso (Fig. 18)

El segundo andamio sembrado con células con 200% en peso de HA mostró resultados significativamente mejorados al comparar con todos los andamios anteriores. En un número significativo de áreas examinadas en todo el defecto se observaron niveles significativos de mineralización desde la periferia del defecto en todas direcciones hacia el centro del defecto relleno con andamio. A diferencia de los primeros andamios sembrados con células con 200% en peso de HA, el tejido mineralizado formado no era de una naturaleza en partículas sino continua en todo el defecto relleno con andamio. Lo más interesante es que esta mineralización continua se observó en la parte más ancha del defecto. En esta muestra, el nivel de mineralización fue casi idéntico al del tejido óseo circundante indicado por la intensidad de imagen similar del material mineralizado en el defecto relleno con andamio.

No sembrado 1 con 50% en peso (Fig. 19)

Los resultados del defecto relleno de andamio exento de células para andamios con 50% en peso de HA fueron muy similares a los de andamios sembrados con células con 50% en peso de HA. Se observó en todo el defecto relleno con andamio tejido significativamente mineralizado pero no de naturaleza continua. Sin embargo, la intensidad del tejido mineralizado fue marginalmente mayor que la observada en muestras sembradas con células. Esto se observó en toda las muestras no sembradas que siguen e indicó que una construcción exenta de células puede comportarse mejor in vivo.

No sembrado 2 con 50% en peso (Fig. 20)

Esta muestra no sembrada con 50% en peso de HA mostró resultados similares a las otras muestras con 50% en peso de HA. Después del ensayo de 28 días, se observó evidencia de comienzo de mineralización del andamio tanto

en la periferia como en el centro del defecto relleno con andamio pero el tejido mineralizado no fue continuo. Sin embargo, la intensidad de las partículas mineralizadas indicó una mineralización similar a la del hueso circundante.

No sembrado 1 con 200% en peso (Fig. 21)

Como se observó en las muestras sembradas con células con 200% en peso de HA, la muestra no sembrada con 200% en peso de HA mostró niveles significativos de mineralización en la periferia y en el centro del defecto relleno con andamio en un número significativo de áreas por todo el defecto. Este tejido mineralizado era de naturaleza continua, a diferencia del observado en las muestras con 50% en peso de HA.

No sembrado 2 con 200% en peso 2 (Fig. 22)

Como se observó en la muestra no sembrada con 200% en peso de HA anterior, esta muestra no sembrada con 200% en peso de HA mostró niveles significativos de mineralización en la periferia y en el centro del defecto relleno con andamio en un número significativo de áreas por todo el defecto. Este tejido mineralizado era de naturaleza continua, a diferencia del observado en las muestras con 50% en peso de HA.

La invención no queda limitada a las realizaciones descritas en el presente documento. Como tales, las tres realizaciones de la invención descritas en el presente documento representan una pequeña proporción del número total de variantes de andamios posibles usando el mismo protocolo de elaboración principal. Cualquiera de los constituyentes en sí mismos o etapas de realización o etapas de proceso específicas se pueden modificar para producir una gama de construcciones variada, optimizada para usos específicos de aplicación. Las posibles variaciones incluyen.

Concentración de ácido acético: La concentración de ácido acético en la suspensión inicial de colágeno se puede alterar para adecuarse a aplicaciones específicas. Aumentar la concentración estimula una integración más rápida y homogénea de las partículas de HA en la suspensión de mezcla. Además, esta concentración tiene también un efecto significativo tanto sobre las propiedades mecánicas como sobre la biocompatibilidad del andamio. Estos efectos se describen con detalle en la sección anterior de "Caracterización de la invención". De forma adecuada, la concentración de ácido acético se puede variar de 0,05M a 5M.

Cantidad de colágeno: La cantidad de colágeno se puede variar en la suspensión inicial de colágeno. Aumentar la cantidad de colágeno da como resultado un aumento en la rigidez mecánica del andamio resultante. Esto también tiene un efecto significativo sobre la biocompatibilidad del andamio. De forma adecuada, la cantidad de colágeno puede variar de 0,5 g/l hasta 50 g/l de la solución de ácido acético (1/10 y 10 veces la concentración de colágeno convencional, respectivamente).

Cantidad de hidroxiapatita: La cantidad de HA se puede variar en un intervalo especificado con respecto a la proporción de colágeno en la suspensión de andamio antes de la elaboración. De forma específica, la cantidad de HA puede variar de forma adecuada de 10 a 1000 por ciento en peso de la cantidad de colágeno usada. Se encontró que aumentar el contenido de HA aumentaba significativamente la rigidez mecánica del andamio elaborado.

Tipo de hidroxiapatita: La presente invención se puede elaborar usando las formas sinterizada, no sinterizada y otras formas de polvo de HA.

Adición de hidroxiapatita: Tanto el volumen de la alícuota de HA como el intervalo de inyección pueden variarse para facilitar la mezcla de los dos constituyentes principales de la suspensión. En general, el intervalo de inyección se puede variar de 30 minutos hasta 240 minutos. Además, el volumen de alícuota se puede variar adecuadamente de 1 ml hasta 100 ml. Esta libertad facilita la optimización de cualquier realización particular de la invención.

Tamaño de partículas de hidroxiapatita: De forma típica, el tamaño de partículas de la HA se puede variar de 10 nm hasta 100 !m para adaptarse a aplicaciones específicas.

Temperatura de congelación final: La temperatura de congelación final alcanzada durante el proceso de secado por congelación determina el tamaño medio de poro en los andamios elaborados. Esta temperatura de congelación final se puede variar para producir andamios con diversos tamaños de poro específicos para una aplicación o tipo de célula específica. De forma adecuada, la temperatura de congelación final se puede variar de -10 °C hasta -70 °C.

Interfase de congelación: La interfase de congelación colocada entre la suspensión de la realización y el estante de enfriamiento del secador por congelación se puede variar. El tipo de interfase de congelación afecta a la transmisión de energía térmica hacia/desde la suspensión/andamio y puede alterar la estructura de poro del andamio final. Están disponibles cuatro opciones principales, en especial un recipiente con paredes de interfase definida realizado en metal (1), plástico (2), una membrana polimérica (3) o sin interfase (4).

Velocidad de congelación: La velocidad de congelación determina la velocidad de nucleación de cristales de hielo en la suspensión colágeno/HA durante el proceso de secado por congelación y controla la homogeneidad del proceso de formación de poros. La velocidad de enfriamiento se varía para optimizar el proceso de congelación para diversos tipos de interfases disponibles entre la suspensión y el estante de enfriamiento del secador por congelación (por

ejemplo, metal, plástico, ninguna). De forma típica, la velocidad de congelación se puede variar de 0,01 °C/min hasta 10 °C/min.

Recocido: Se puede emplear una etapa de recocido durante el proceso de secado por congelación y permite la creación de poros con un diámetro medio significativamente mayor que los tamaños de poros que pueden obtenerse variando únicamente la temperatura de congelación final. El tiempo de recocido se puede variar de 15 minutos a 36 horas. A mayor tiempo de recocido, mayor es el tamaño medio de poro final.

Procedimiento de reticulación del andamio: El procedimiento de reticulación puede ser uno de una serie posible de técnicas, de naturaleza bien deshidrotérmica o química. Además, ambas técnicas se pueden emplear de forma consecutiva. Opciones de reticulación específicas incluyen glutaraldehído, carbodiimidas (EDAC), transglutaminasa microbiana (mTgasa), reticulación deshidrotérmica (DHT) y radiación ultravioleta (UV).

Temperatura/concentración de reticulación del andamio: El colágeno del andamio secado por congelación se puede reticular por medios deshidrotérmicos para aumentar la rigidez mecánica del andamio.

La temperatura de reticulación se puede variar de 105 °C hasta 180 °C con un aumento correspondiente en la rigidez de la realización. Además, cuando se usan procedimientos de reticulación química, la concentración de la solución de reticulación se puede variar para alterar el grado de reticulación química.

Duración de la reticulación del andamio: El tiempo de exposición a la reticulación se puede variar para alterar el grado del proceso de reticulación en el andamio. Este se puede variar de 24 a 120 horas para alterar las especificaciones mecánicas finales del andamio.

Referencias

[1] Tancred D.C., Carr A.J., and McCormack B.A. Development of a new synthetic bone graft. Journal of Materials Science: Materials in Medicine, 9(12): 819-823, 1998.

[2] Dong J.K., Luthy H., Wohlwend A., and Scharer P. Heatpressed ceramics: technology and strength. International Journal of Prosthodontics, 5(1):9-16, 1992.

[3] Bailey A.J., Light N.D., and Atkins E.D.T. Chemical crosslinking restrictions on models for the molecular organisation of the collagen fibre. Nature, 288:408-410, 1980.

[4] Yannas I.V. Tissue and Organ Regeneration in Adults. New York: Springer, 2001.

[5] O’Brien F.J., Harley B.A., Yannas I.V., and Gibson L.J. The effect of pore size on cell adhesion in collagen gag scaffolds. Biomaterials, 26:433-441, 2005.

[6] O’Brien, F.J.; Harley, B.A.; Waller, M.A.; Yannas, I.V; Gibson, L.J and Prendergast, P.J. (2007) The effect of pore size on permeability and cell attachment in collagen scaffolds for tissue engineering. Technology and Healthcare Invited Article (15):3-17.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un procedimiento para producir un andamio de material compuesto de colágeno/hidroxiapatita (HA), que comprende la etapa de formar una suspensión homogénea de colágeno y HA en una solución ácida, liofilizar la suspensión a una velocidad de enfriamiento constante hasta que se alcanza una temperatura de congelación final de -10 °C a -70 °C, y calentar la cámara de liofilización hasta una temperatura de sublimación en la que en el andamio formado sublima una fase de hielo a vacío durante un período de tiempo adecuado para producir el andamio de material compuesto, en el que la relación de HA a colágeno en la suspensión es al menos 1:10 (p/p), y la cantidad de colágeno en la suspensión varía de 3 g/l a 8 g/l (p/p), en el que la suspensión homogénea de colágeno/HA se forma por las etapas de formar una suspensión homogénea ácida de colágeno y, a continuación, añadir la HA a la suspensión de colágeno en condiciones de mezcla para garantizar la distribución homogénea de la HA en la suspensión de colágeno, en el que la HA se añade en la forma de una suspensión de HA ácida.
2.

Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la HA en suspensión ácida se añade en alícuotas.
3.

Un procedimiento según la reivindicación 2, en el que las alícuotas se añaden a la suspensión de colágeno a intervalos de 30 a 240 minutos.
4.

Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la solución ácida tiene una molaridad de al menos 0,1 M.
5.

Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la relación de HA a colágeno en la suspensión varía de 1:10 (p/p) a 50:10 (p/p).
6.

Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la liofilización se lleva a cabo a una velocidad de enfriamiento constante de 0,5 °C/min a 1,5 °C/min.
7.

Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la temperatura de congelación final varía de -30 °C a -50 °C.
8.

Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende además una etapa de recocido que comprende aumentar la temperatura en la cámara de liofilización después de que se ha alcanzado la temperatura de congelación final, y mantener la temperatura incrementada durante un período de tiempo antes de iniciar la etapa de secado.
9.

Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el andamio de material compuesto se reticula por un medio seleccionado del grupo que consiste en: reticulación deshidrotérmica; y reticulación química.
10.

Un andamio de material compuesto de colágeno/hidroxiapatita (HA) que comprende una distribución homogénea de polvo de hidroxiapatita en una matriz de colágeno porosa, en el que la relación de HA a colágeno es al menos de aproximadamente 1:10 (p/p), y en el que el andamio de material compuesto tiene una porosidad de al menos 98% (v/v) y una rigidez en compresión de al menos 0,4 kPa.
11.

Un andamio de material compuesto de colágeno/hidroxiapatita (HA) según la reivindicación 10 que tiene un tamaño de poros homogéneo.
12.

Un andamio de material compuesto de colágeno/hidroxiapatita (HA) según la reivindicación 10 u 11, que se reticula por medios deshidrotérmicos y con EDAC y tiene una rigidez en compresión de al menos 1,0 kPa.
13.

Un andamio de material compuesto de colágeno/hidroxiapatita (HA) según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 en el que el andamio de material compuesto está caracterizado por tener una conductividad del flujo a presión a través del andamio de al menos 1 x 10-10 m4/Ns.
14.

Un andamio de material compuesto de colágeno/hidroxiapatita (HA) según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 para su uso como un implante óseo osteoconductor, un implante elaborado por ingeniería tisular, un sustituto de injerto óseo maxilofacial, un sustituto de injerto óseo dental, un implante de reparación de defectos del cartílago, o un implante de reparación de defectos osteocondrales.